JP2000507596A - How to prevent HIV-1 infection of CD4 の +＋ cells - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、HIV-1とCD４+細胞との融合を阻害する方法であって、CD４+細胞に対して、ケモカイン・レセプターと結合できる非ケモカイン作用剤を、HIV-1のCD４+細胞への融合が阻害される量および条件下で接触させることを具備した方法を提供する。また本発明は、CD４+細胞のHIV-1感染を阻害する方法であって、CD４+細胞に対して、ケモカイン・レセプターと結合できる非ケモカイン作用剤を、HIV-1のCD４+細胞に対する融合が阻害される量および条件下で接触させることにより、HIV-1感染を阻害することを具備する方法を提供する。また本発明は、ケモカイン・レセプターと結合できかつHIV-1のCD４+細胞への融合を阻害できる非ケモカイン作用剤を提供する。本発明は、HIV-1のCD４+細胞に対する融合を抑制するに有効な量の、ケモカイン・レセプターと結合できかつHIV-1のCD４+細胞への融合を阻害する非ケモカイン作用剤と、薬学的に許容可能な担体とを含む薬学的組成物を提供する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for inhibiting fusion between HIV-1 and CD4 + cells, which comprises providing a non-chemokine agent capable of binding to a chemokine receptor to CD4 + cells. The method comprises contacting under conditions and in amounts and conditions that inhibit fusion of CD4 + to CD4 + cells. This invention also provides a method of inhibiting HIV-1 infection of CD4 + cells, relative to CD4 + cells, the non-chemokine agent capable of binding to a chemokine receptor, is fused against CD4 + cells of HIV-1 A method comprising inhibiting HIV-1 infection by contacting under conditions and under conditions of inhibition. The present invention also provides a non-chemokine agent capable of binding to a chemokine receptor and inhibiting fusion of HIV-1 to CD4 + cells. The present invention includes a non-chemokine agent which inhibits fusion of an amount effective to suppress the fusion to CD4 + cells HIV-1, can bind to the chemokine receptor and the CD4 + cells of HIV-1, a pharmaceutical A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
Description
【発明の詳細な説明】 ＣＤ４+細胞のHIV-1感染を防ぐ方法 本願は、1996年６月25日に出願された親出願である合衆国出願番号08/673,682 の一部継続出願であり、この親出願はまた、1996年６月14日に出願された祖父出 願である合衆国出願番号08/663,616号の一部継続出願であり、この祖父出願は更 に、1996年４月２に出願された合衆国出願番号08/627,684号の一部継続出願であ る。これら先の出願の内容は、ここでの引用により、本明細書の一部として本願 に取り込まれる。 本出願の全体を通して、様々な参照文献が括弧内に引用されている。これら刊 行物の開示は、本発明の族ずる技術の状態をより完全に記載するために、その全 体が本明細書の一部をなすものとして本願に組み込まれる。これら引用の完全な 書誌的引用は各実験シリーズの末尾に列記してある。 〔発明の背景〕 ケモカイン(chemokines)類は、リンパ球および他の細胞によって分泌される分 子量8-10 KDaの関連した可溶性蛋白のファミリーであって、標的細胞表面のレセ プターに結合して、例えば、炎症過程にある白血球を活性化し流動化させる。近 年、コッチら(Cocchiet al.)によって、ケモカイン類のRANTES、MIP-1α及びMIP -1βはＣＤ８+Ｔリンパ球によって産生される因子であって、それらはHIV-1のマ クロファージ向性初代単離物による感染を阻害するが、HIV-1ウイルスの実験室 適用株による感染は阻害しない事が実証された（1）。これらのケモカインは、 ケモカイン類のc-c群の一員である。このように名づけたのは、それらが隣り合 うシステイン残基を担持しているからであって、システイン残基が一つのアミノ 酸で分離されているc-x-c群とは異なる（2）。コッチらは、HIV-1 RNAの発現が ケモカインによる処置で抑制される事を発見したが、これらの分子の活性部位を 特定していない。 HIV-1エンベローブ糖蛋白に媒介された膜融合の共鳴エネルギー転移（RET）分 析を使用して、HIV-1JR-FLの初代マクロファージ向性単離物から得られるエンベ ロープ糖蛋 白によって媒介される融合がケモカインによって特異的に阻害されるかどうかを 、実験室順応Ｔリンパ球親和性株HIV-1LAI由来のエンベロープ糖蛋白に媒介され る融合と比較して決定した。以下で説明するように、これはまさにその通りであ る事が実証された。この事によって、いくつかのケモカインのレセプターは、HI V-1感染に必要とされる融合補助分子であることが実証された。以前の研究にお いて、当該ウイルスが侵入するためには、HIV-1レセプターCD4に加えて、未確認 の細胞表面分子が必要である事が指摘されている。CD4がHIV-1の付着に必要であ るのに対して、この補助分子は、侵入の膜融合工程で必要とされる。これらの補 助分子は、一般にヒト細胞上にのみ発現される。それゆえ、HIV-1は非ヒトＣＤ ４+細胞に感染しないのである（3−6）。更に、これらを（ポリエチレングリコ ールを使用して）ヒトＣＤ４+細胞と融合する事によって、非ヒトＣＤ４+細胞を 補完し、HIV-1エンベロープ介在膜融合に対して応答能のあるターゲットである ヘテロカリオン（異核共存体）を生じさせることが可能である（7、8）。これら の研究は、該ウイルスの実験室順応Ｔリンパ球親和性株を使用して行なわれてき た。 ある場合には、融合補助分子がヒトＣＤ４+細胞のサブセット上に見られ、特 殊な向性を持つHIV-1単離物による感染に必要のようにみえる。例えば、HIV-1JR -FL のようなHIV-1のマクロファージ向性初代株は、HIV-1LAIのような実験室順応 Ｔリンパ球親和性株と比較すると、補助分子に対しては異なる要求性を有するか もしれない。この現象によって、HIV-1株の間の向性の相違を説明できるであろ う。 本発明は、HIV-1感染の一連の新治療法を包含する。ケモカインは、HIV-1侵 入の融合工程で働き、該ウイルスの実験室順応Tリンパ球親和性株によってでは なく、マクロファージ向性初代ウイルス単離物のエンベロープ糖蛋白により媒介 される膜融合を特異的に阻害することが初めて実証された。該ウイルスの初代マ クロファージ向性単離物は、ウイルスの伝染に通常関わる株であり、HIV-1感染 の病因において特に重要性を持ち得るため、特に重要である。 これらの結果は、HIV-1のエンベロープに媒介された膜融合の共鳴エネルギー転 移（RET）分析を使用して得られた。更に、この分析を使用して、HIV-1のエンベ ロープ糖蛋白媒介性膜融合を阻害し、それによってウイルスを中和し、かつ炎症 性反応を誘導しな い、ケモカイン断片および修飾ケモカインを含む非ケモカイン類を特定した。 〔発明の概要〕 本発明は、HIV-1とCD4+との融合を阻害する方法を提供する。該方法は、CD4+ 細胞と、ケモカイン・レセプターに結合できる非ケモカイン作用剤とを、HIV-1 のCD4+細胞に対する融合を阻害できるような量と条件下で接触させる事からなる 。 本発明はまた、CD4+細胞のHIV-1感染を阻害する方法を提供する。該方法は、C D4+細胞と、ケモカイン・レセプターに結合できる非ケモカイン作用剤とを、HIV -1のCD4+細胞に対する融合を阻害できるような量と条件下で接触させ、それによ ってHIV-1感染を阻害する事からなる。 本発明は更に、ケモカイン・レセプターと結合する事ができ、かつHIV-1のCD4+ 細胞に対する融合を阻害できるような非ケモカイン剤を提供する。 本発明は、フュージン（fusin）と結合する事ができ、かつ感染を阻害する事 ができる作用剤を提供する。一つの態様において、該作用剤はオリゴペプチドで ある。別の態様において、該作用剤はポリペプチドである。また別の態様におい て、該作用剤は抗体又は抗体の一部である。別の態様において、該作用剤は非ペ プチジル剤である。 加えて、本発明は、HIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害するのに有効な量の 、上記非ケモカイン作用剤又はフュージンと結合できる作用剤と、薬学的に許容 できる担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、ケモカイン・レセプターと結合して、HIV-1のCD4+細胞に対する融 合を阻害することができる物質を提供する。該組成は、ケモカイン・レセプター 以外のCD4+細胞細胞表面レセプターと結合できるリガンドに連結された非ケモカ イン剤を含み、該非ケモカイン剤がケモカイン・レセプターに結合しても、他の レセプターに対する前記リガンドの結合は阻害されない。 本発明はまた、HIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害するに有効な量の上記組 成物と、薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明はケモカイン・レセプターに結合する事ができ、かつHIV-1のCD4+細胞 に対 する融合を阻害する物質であって、非ケモカイン作用剤のインビボでの半減期を 増大させる事ができる化合物に連結された非ケモカイン剤を含む物質を提供する 。 本発明はまた、HIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害するのに有効量の、非ケ モカイン作用剤のインビボでの半減期を増大させる事ができる化合物に連結され た非ケモカイン剤と、薬学的に挙用可能な担体とを含有する薬学的組成物を提供 する。 本発明は、対象におけるHIV-1感染の可能性を減らす方法であって、当該対象 に対して、上記の薬学的組成物を投与する事を具備した方法を提供する。本発明 はまた、上記の薬学的組成物を投与することを具備した、対象におけるHIV-1感 染を治療する方法を提供する。 本発明はまた、非ケモカイン剤がHIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害できる かどうかを決定する方法を提供する。該方法は、（a）第一の色素で標識されたC D4+細胞（i）と、細胞表面にHIV-1エンベロープ糖蛋白を発現する第二の色素で 標識された細胞(ii)とを、前記作用剤の過剰存在下において、表面にHIV-1エン ベロープ糖蛋白を発現する細胞とCD4+細胞との融合を前記作用剤の不存在下で可 能にする条件のもとで接触させる工程（ここで、前記第一及び第二の色素は、こ れら色素間での共鳴エネルギーの転移を可能にするように選択される）と；（ｂ ）工程（a）の産物を、融合が起ったときに共鳴エネルギー転移を生じる条件に 曝す工程と；（ｃ）前記作用剤の不存在下での共鳴エネルギー転移と比較して共 鳴エネルギー転移の減少があるかどうかを決定し、該エネルギー転移の減少によ って、該作用剤がHIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害できる事が示される工程 とを具備する。 〔図面の詳細な説明〕 図１ HIV-1JR-FLエンベロープ糖蛋白によって媒介される膜融合は、RANTES、 MIP-1α及びMIP-1βによって阻害される。 PM1細胞とHeLa-envJR-FL(■)又はHeLa-envLAI（◆）との融合から得ら れそ%RETを、組換えヒト・ケモカインの存在下および不存在下で、濃度 範囲：RANTS（80-2.5 ng/ml），MIP-1α(400-12.5 nq/ml)，MIP-1β (200-6.25ng/ml)で、指示されたように測定した。 ケモカインおよび細胞は、４時間のインキュベーションの開始時に同 時に添加した。データは、二重に行われた三回以上の独立した実験を 示す。RETの%阻害は、下記記載のように規定される。 ％阻害 = 100・[（最大RET−最小RET）−（実験RET−最小RET）] /（最大RET−最小RET） この場合、最大RETは、阻害化合物の不存在下において、HeLa−env細 胞及びCD発現細胞を用いて４時間目に得られた%RET値である。実験RE Tは、阻害化合物の存在下で、同じ細胞の組合せについて得られた%RE T値である。最小RETは、HeLaエンベロープ発現細胞の代わりにHela細 胞を使用して得られたバックグラウンド％RET値である。 図２ CD4：ヒト・ケモカインの存在下におけるHIV−1gp120結合 可溶性ヒトCD4のHIV−1LAI及びHIV−1JR-FLgp120に対する結合を、モ ノクローナル抗体OKT4A又は組換えヒト・ケモカインの存在下および 不存在下に、図１のRET阻害研究で使用したものと同様の濃度範囲：O KT4A（62−0.3nM），RANTS（10.3-0.3)，MIP-1α(53.3-2.9nM)，MIP- 1β(25.6-0.8nM)で，エリザ分析によって決定した。阻害剤は、ビオ チン化HIV-1 gp120と共に、マイクロタイター皿(Dynatech Laborato ries，Inc.，Chantilly，vA)に塗布された可溶性CD4に同時に添加さ れた。２時間の室温でのインキュベーション、広範囲洗浄後、ストレ プトアビジン・ホースラデイッシュ・パーオキシダーゼによる１時間 の室温でのインキュベーションを行った。更に複数回洗浄を行なった 後、基質を加え、492nmでの光学密度（OD）をエリザ・プレート・リ ーダーにて測定した。データは、４重に行なわれた二つの独立した実 験を示している。 図３ 特異性:HIV-1複製のβケモカインの阻害の時間変化とステージ （a）pM1細胞（１ｘ１０6）をRANTES+MIP-1α +MIP−１β（R/Mα/Mβ，夫々100ng/ml）で、24時間（-24h）又は二 時間（-2h）インキュベーションし、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二回洗浄し た。HIV-1（BaL env-相補）ウイルス（p24が50ng、表１の説明を参照）を二時間 添加し、細胞を洗浄し、前述したように細胞溶融物中で、ルシフェラーゼ活性を 測定する前に、48時間インキュベーションした（10、11）。又は、ウイルス及び R/Mα/Mβを細胞に同時に加え、指示時間点（１時間、３時間等）にて、細胞をP BS中で二回洗浄し、培養基中に再懸濁し、ルシフェラーゼ分析の前に48時インキ ュベーションした。時間０は、陽性対照を示し、ここにはβケモカインを添加し てはいない。＋２時間は、PBSで二回洗浄前の２時間のウイルスと細胞の混合物 を示す。R/Mα/Mβの添加及び、ルシフェラーゼ分析前に更に48時間培養を継続 する。 （b）PM1細胞（1x106）にCEM細胞（NL4／3、レーン１−４）で中で生育させ たHIV-1（500pg p24）又はマクロファージ（ADA；レーン５−8）を、500nq/mlの RANTES（レーン１及び５）、MIP-1β（レーン２と６）又は無βケモカイン（レ ーン４と８）の存在下で、感染させた。レーン３と７は陰性対照（無ウイルス） である。PCR分析に使用したウイルスの全ストックは、DNAseで30分37℃で処理さ れ、使用前にDNA汚染についてテストした。２時間後、該細胞を洗浄し、同じβ ケモカインを含む培地中でさらに８時再懸濁した。次にDNA/RNA単離キット(US b iochemical)を使用してDNAを感染細胞より抽出した。初回のネステッドPCRは、 プライマー： 号２）を用い、またび第二ラウンドは、プライマー： 用して、パーキン・エルマー2400サイクラー中で下記増幅サイクル:94℃5分、94 ℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、７２℃7分を35サイクルで実行した。Ｍは、1Kb DNAラダーを示し、1、10、100、1000は、参照プラスミド （pAD8）のコピー数を示す。この分析によって、逆転写物100コピー を検出した。 図４ C-C CKR-5を一時的に発現するHIV-1 env媒介膜融合 HeLa細胞中で発現されるβケモカイン・レセプターによって媒介され る膜融合は下記の様に実証された。対照のプラスミドpcDNA3.1又はプ ラスミドpcDNA3.1-CKR構築物を、リポフェクチン（Gibco BRL）を使 用して細胞にトランスフェクトした。pcDNA3.1プラスミドは、Ｔ７ポ リメラーゼ・プロモータを保持しており、βケモカイン・レセプター の一時的発現が、Ｔ７ポリメラーゼ(vFT7.3)をコードしている1x107p fuのワクチンで細胞を感染させる事によってリポフェクチン投与後（ 9）４時間目に増大した。次に細胞をR18を含む培地中で一晩培養し、 HeLa-JR-FL細胞(黒塗りカラム)又はHeLa-BRU細胞(斜線を付したカラ ム)と融合するその能力についてテストした。対照HeLa細胞について の該％RETは、トランスフェクトされたブラスミドに無関係に3%及び4 %であった。 図５ HIVLAIエンベロープ糖蛋白によって媒介される膜融合は、SDF-1によっ て阻害される PM1細胞とHela−envJR-FL又はHela−envLAI細胞の融合から得られる ％RET（グラフ上に示したように）を、組換えSDF-1α（Gryphon Scie nce，SanFrancisco）の存在下、指示された濃度で測定した。実験方 法は、図１についての説明に記載された通りである。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、HIV-1とCD４+細胞との融合を阻害する方法であって、CD４+細胞に 対して、ケモカイン・レセプターと結合できる非ケモカイン作用剤を、HIV-1のC D４+細胞への融合が阻害される量および条件下で接触させることを具備した方法 を提供する。 本発明はまた、CD４+細胞のHIV-1感染を阻害する方法であって、CD４+細胞に 対して、ケモカイン・レセプターと結合できる非ケモカイン作用剤を、HIV-1のC D４+細胞 に対する融合が阻害される量および条件下で接触させることにより、HIV-1感染 を阻害することを具備する方法を提供する。 本発明において、ケモカインとは、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、又はHIV-1感 染を阻止する他のケモカインを意味する。ケモカイン・レセプターとは、RANTES 、MIP-1α、MIP-1β、又はHIV-1感染を阻止する他のケモカインを結合する事が 可能なレセプターを意味する。 本出願を通して、レセプターの「フュージン」はまた、CXCR4とも名づけられ 、ケモカイン・レセプターC-C CKR5もCCR5と命名される。 本出願で使用されるHIV-1は、特定しない限りは、その臨床的特徴を保持して いるHIV-1ウイルスの臨床的単離物、または初代もしくはフィールド単離物を意 味するものである。HIV-1の臨床的単離物は初代末梢血単核細胞中で継代させて も良い。該HIV-1の臨床学的単離物は、マクロファージ向性である。 本発明の非ケモカイン作用剤は、ケモカイン・レセプターと結合できかつHIV- 1のCD４+細胞に対する融合を阻害できる。該非ケモカイン作用剤には、ケモカイ ンの断片、誘導体および類縁体が含まれるが、これには制限されない。しかしな がら天然のケモカインは含まれない。該非ケモカイン作用剤には、ケモカインの 断片、誘導体および類縁体、あるいは、他の分子と連結されているケモカインの 断片、誘導体および類縁体を含む融合分子の多様な形態が含まれる。 本発明の一つの態様においては、該非ケモカイン作用剤はオリゴペプチドであ る。別の態様では、該非ケモカイン作用剤はポリペプチドである。また別の態様 では、該非ケモカイン作用剤は抗体又は抗体の一部である。ケモカイン・レセプ ターに対する抗体は、手順の決まった実験によって簡単に生成できる。ケモカイ ン・レセプターに結合する事ができる抗体の断片を合成することも、当該技術レ ベルの範囲内である。さらに別の態様では、該非ケモカイン作用剤は非ペプチジ ル作用剤である。 純ペプチジル組成である非ケモカイン作用剤は、固相法(Merrifield，1966)に よって化学的に合成されるか、或いは原核菌又は真核菌系のいづれかにおいて組 み替え技術を使用して産生できる。該合成および組み替え方法は、従来技術で既 知である。 ビオチン又は他のペプチジル基を含む非ケモカイン作用剤は、合成又は組換え ケモカイン作用剤又は非ケモカイン作用剤を化学的に修飾することによって調製 できる。化学的修飾の一つの方法には、そのＮ末端アミノ酸としてセリン又はス レオニンを有するケモカイン又は非ケモカイン作用剤に存在する、２−アミノア ルコールの過ヨウ素酸塩酸化があげられる(Geophegan and Stroh，1992)。その 結果得られるアルデハイド基を使用して、ペプチジル又は非ペプチジル基を、還 元性アミノ化、ヒドラジン化又はほかの当該技術者に既知の化学技法によって、 酸化されたケモカイン又は非ケモカイン作用剤に連結することができる。 ここで使用する蛋白質のＮ末端とは、プロセッシングされた後の蛋白の末端を 意味する。開裂可能なシグナル配列を含む分泌性蛋白の場合、分泌性蛋白のＮ末 端は、シグナルペプチドの開裂後の末端になるべきである。 本発明は、これらの非ケモカイン作用剤を特定する方法を提供する。ケモカイ ン・レセプターに結合し、HIV-1のCD４+細胞に対する融合を阻害する非ペプチジ ル作用剤を含むこのような作用剤を特定する一いつの方法として、次の分析方法 の使用が挙げられる：１）可溶性CD4を、HIV-1JR-FL又はHIV-1LAIから得られる ビオチン化されたgp120と共にインキュベーションする；２）この複合体を、CD4 を発現しないCCR5又はCXCR4（夫々、HIV-1JR-FL又はHIV-1LAI gp120sに対して） と共に、候補阻害剤の存在又は不存在下でインキュベートする；３）洗浄し、次 にストレプトアビジン・フィコエリスリンと共にインキュベートし、４）洗浄し 、その後gp120と結合した量をフロー・サイトメトリ−又はフルオロメータを使 用して測定し、阻害剤による結合阻害の程度を計算する。 上記のビオチン化されたgp120-ストレプトアビジン・フィコエリスリン方法に 代って、結合gp120を検出する幾つかの代替方法も使用可能である。例えば、ビ オチン化されたgp120の代りに、パーオキシダーゼ接合gp120が使用可能であり、 結合はペルオキシダーゼのための適切な発色性基質を使用して、スペクトロメー タの読み出しによって検出できる。 本発明はさらに、上記幾つかの方法によって特定される非ケモカイン作用剤を提 供する。 本発明は、ケモカイン・レセプターに結合でき、HIV-1のCD４+細胞に対する融合 を阻害する事ができる非ケモカイン作用剤を提供する。一つの態様では、非ケモ カイン作用剤は、ポリペプチドである。さらに別の態様では、このポリペプチド は、ケモカインRANTES(Gong et al.，1996)の断片である。さらに別の態様では 、該ポリペプチドは、その配列のN末端アミノ酸を欠くRANTES配列からなってい てもよい。該欠失は、RANTES配列（配列認識番号5）の最初の８つのN末端アミノ 酸でも良い。 別の態様では、該ポリペプチドは、その配列のN末端アミノ酸を欠くMIP-1β配 列からなっていてもよい。該欠失は、MIP-1β配列の最初の7、8、9、10つのN末 端アミノ酸でも良い。 非ケモカイン作用剤のもう一つの態様では、該ポリペプチドは、アミノ酸又は オリゴペプチドを付加する事によって修飾されたＮ末端配列を持つMIP-1β配列 からなる。別の態様では、N末端のアラニンを除去し、それをセリンあるいはス レオニン、および別のアミノ酸、又はオリゴペプチドあるいは非ペプチジル成分 で置換する事で修飾されたN末端配列を有するMIP-1β配列からなる。さらに別の 態様では、該別のアミノ酸はメチオニンである。 下記の実験の詳細のセクションで述べる様に、HIV-1融合および侵入の共ファ クターが特定され、「フユージン」と命名された(Feng etal，1996)。この発明 は、フュージンと結合でき、感染を阻害できる作用剤を提供する。一つの態様で は、該作用剤はオリゴペプチドである。別の態様では、該作用剤はポリペプチド である。 さらなる態様では、該ポリペプチドは、該配列のＮ末端アミノ酸の欠失を持つ SDF-1からなる。該欠失は、SDF-1配列のＮ末端アミノ酸の最初の6、7、8、9であ っても良い。 本発明はまた、上記の非ケモカイン作用剤であって、SDF-1に対して抗拮抗剤 効果を生じるようにN末端配列を修飾されたSDF-1配列を具備する作用剤ヲ提供す る。修飾の一つには、SDF-1のN末端のグリシンをセリンで置換しビオチンで誘導 化する事があげられる。別の修飾では、SDF-1のＮ末端グリシンをセリンで置換 し、メチオニンで誘導化する事があげられる。さらに別の修飾には、SDF-1のN末 端に対して、終端グリシンの手前にメチオニンを付加する事があげられる。 また別の態様では、該作用剤は抗体又は抗体の一部である。別の態様では、該 作用剤は非ペプチジル作用剤である。 フュージンに結合できる該作用剤は、インビトロでフュージンに結合するその 能力について、様々な化合物をスクリーニングすることによって特定し得る。 フォルクスら(Fowlkes et al.1994)らは、適切な方法を国際出願:PCT/US94/03 143、国際公開WO94/23025に記載している。この内容は、ここでの引用により本 明細書の一部をなす参照文献として本願に組み込まれる。簡略に説明すれば、フ ェロモン系を持つ酵母菌細胞を、酵母フェロモン系蛋白の異種代用物を発現する ように加工する。該代用物は、フュージンを取り込み、ある条件下では、該酵母 細胞のフェロモン系において対応する酵母フェロモン系蛋白が自然に行う機能を 実行する。このような酵母細胞はまた、ペプチドのライブラリーを発現するよう に加工される。これによって、フュージンを結合するペプチドを含む酵母細胞は 、代理酵母フェロモン系蛋白と酵母フェロモン系との相互作用を調節するが、こ の調節は選択又はスクリーニングが可能な現象である。同様のアプローチを使用 して、フュージンおよびケモカイン・レセプターC-C CKR5の両方に結合できる作 用剤を特定し得る。 本発明はまた、HIV-1のCD4+細胞への融合を阻害するのに有効な量のこのよう な非ケモカイン作用剤又はフュージンと結合できる作用剤と、薬学的に許容でき る担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 薬学的に許容可能な担体は、当該技術者には周知である。このような薬学的に 許容可能な担体には、水性溶液又は非水性溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられ る。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植 物性油（例えばオリーブ油）、および注入可能な有機エステル（例えばオレイン 酸エチル）が挙げられる。水性担体には、水、アルコール/水性溶液、乳剤、又 は懸濁液、生理食塩水および緩衝培地が挙げられる。非経口ベヒクルとしては、 塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース，デキストローすおよび塩化ナ トリウム、乳酸リンゲル又は固定化油が挙げられる。静脈ベヒクルとしては、液 体、栄養補給剤、電解物補給剤例えばリンゲルデキストロースを基礎とするもの 等が挙げられる。保存剤およびその他の添加物、例えば抗細菌剤、抗酸化剤、キ レート 剤、不活性ガス等が存在していてもよい。 本発明は、ケモカイン・レセプターと結合する事ができ、かつHIV-1のCD4+細 胞への融合を阻害する物質であって、ケモカイン・レセプター以外のCD4+細胞細 胞表面レセプターと結合できるリガンドに連結された非ケモカイン作用剤を含み 、該非ケモカイン作用剤がケモカイン・レセプターに結合しても、前記他のレセ プターへの前記リガンドの結合は阻害されないような物質を提供する。一つの態 様において、該細胞表面レセプターはCD4である。別の態様において、該リガン ドは抗体又は抗体の一部である。 本発明はまた、HIV-1のCD4+細胞への融合を阻害するのに有効な量の上記物質 と、薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、ケモカイン・レセプターに結合し、且つつHIV-1のCD4+細胞への融 合を阻害する事ができる物質であって、非ケモカイン作用剤のインビボでの半減 期を増大させる事ができる化合物に連結される非ケモカイン作用剤を含む物質を 提供する。一つの態様において、該化合物はポリエチレングリコールである。 本発明はまた、HIV-1のCD4+細胞への融合を阻害するに有効な量の、非ケモカ イン作用剤のインビボでの半減期を増大させる事ができる化合物に連結された非 ケモカイン作用剤を含む物質と、薬学的に許容可能な担体とを含有する薬学的組 成物を提供する。 本発明はまた、対象におけるHIV-1感染の可能性を減らす方法であって、上記 記載の薬学的組成物を対象に投与する事を具備した方法を提供する。本発明はま た、HIV-1感染を治療する方法であって、上記記載の薬学的組成物を投与するこ と事を具備した方法を提供する。 本発明はまた、非ケモカイン作用剤がHIV-1のCD4+細胞に対する融合を阻害す る事ができるかどうかを決定する方法であって、（ａ）第一の色素で標識された CD4+細胞（i）と、細胞表面にHIV-1エンベロープ糖蛋白を発現する第二の色素で 標識された細胞(ii)とを、前記作用剤の過剰存在下において、表面にHIV-1エン ベロープ糖蛋白を発現する細胞とCD4+細胞との融合を前記作用剤の不存在下で可 能にする条件のもとで接触させる工程（ここで、前記第一及び第二の色素は、こ れら色素間での共鳴エネルギーの転移を可能にするように選択される）と；（ｂ ）工程（ａ）の産物を、融合が起ったときに共鳴エ ネルギー転移を生じる条件に曝す工程と；（ｃ）前記作用剤の不存在下での共鳴 エネルギー転移と比較して共鳴エネルギー転移の減少があるかどうかを決定し、 該エネルギー転移の減少によって、該作用剤がHIV-1のCD4+細胞に対する融合を 阻害できる事が示される工程とを具備する方法を提供する。 HIV-1は適切なCD4+細胞とだけ融合するある。例えば、実験室適応性のＴリン パ球親和性HIV-1株は、ほとんどのCD4+ヒト細胞と融合する。臨床学的HIV-1単離 物は、ほとんどの形質転換されたCD4+ヒト細胞系とは融合しないが、ヒト初代CD 4+細胞、例えば、CD4+Tリンパ球およびマクロファージとは融合する。手順の決 まった実験を行うことにより、そのCD4+細胞が上記の融合分析に適切であるかど うかを容易に決定することができる。 本発明に記載するように、HIV-1膜融合は、共鳴エネルギー転移（RET）分析に よってモニターされる。該分析は、国際公開WO 95/16789、並びに1994年12月16 日に出願された国際出願PCT/US94/14561に記載されている。本分析は、1995年６ 月７日に提出された合衆国の同時係属出願番号08/476、515に更に詳述されてい る。これら出願の内容は、ここでの引用により本明細書の一部をなす。 上記方法の一つの態様において、非ケモカイン作用剤はオリゴペプチドである 。別の態様において、該ケモカイン作用剤はポリペプチドである。また別の態様 において、該作用剤は抗体又は抗体の一部である。別の態様において、該ケモカ イン作用剤は非ペプチジル作用剤である。 別の態様では、CD4+細胞はPM1細胞である。他の態様では、HIV-1エンベロープ 糖蛋白を発現する細胞は、HIV-1JR-FL gp120/gp41を発現するHeLa細胞である。 本発明は、次に続く実験の詳細を参照する事によってより良く理解されるであ ろ。しかし、当業者は、詳述された特異的な実験が後述の請求の範囲に完全に記 載されている本発明を単に例証するにすぎない事を容易に理解するであろう。実験の詳細 第一実験シリーズ １） ケモカイン類は、HIV-1の実験室順応Ｔリンパ球親和性株ではなくHIV-1の マクロファージ向性初代単離物から得られるエンベローブ糖蛋白によって 媒介される融合を阻害する。 ケモカイン類のRANTES、MIP-1α及びMIP-1βは、Ｒ＆Ｄシステム(Minneapolls ,MN）から入手した。これらは、Hela-envJR-FI細胞（マクロファージ性単離物HI V-1JR-F1から得られるgp120/gp41を発現する）とPM1細胞間の融合を阻害する能 力について、あるいは、Hela−envLAI細胞（実験室適用株HIV−1LAIから得られ るgp120/gp41を発現する）と様々なCD4+Ｔリンパ細胞系間の融合を阻害する能力 について、RET分析でテストされた。図１に示すように、３つのケモカインは全 て、マクロファージ性ウイルスエンベローブ糖蛋白によって媒介される融合を阻 害したがしかし実験室適用株エンベロープ糖蛋白によって媒介される融合は阻害 しなかった。 次に、ウイルスの付着時に起こるケモカインのCD4とHIV-1 gp120間の相互作用 を阻害する能力について試験した。該ケモカイン類はこの相互作用を阻害しない 事がわかった（図2）。これにより、HIV-1エンベロープ糖蛋白に媒介される膜融 合の阻止は、融合に先がけて起こる初期のCD4−gp120の相互作用というよりもむ しろ、膜融合そのもの自身が起こった時点で起こるという事が、実証された。 ２）HIV-1 融合を阻害する非ケモカインペプチド及びその誘導体 非ケモカインには、ケモカイン断片及びケモカイン誘導体が含まれ、これらは RET分析でテストされ、どれがHIV-1膜融合を阻害するのに活性があるかを決定し た。特に、HIV-1融合を阻害するが白血球反応を活性化しない断片又は誘導体に 注目が集まっている。これら非ケモカインには下記のものが含まれる： a）該ケモカインの類のＮ末端誘導体。ケモカインのＮ末端に残基を付加 すると、ケモカイン・レセプターと結合するケモカインの能力を重篤に削 減することなく、これらの蛋白の機能を阻害する。例えば、Met-RANTES（ Ｎ末端メチオニンを持 つRANTES)は、天然のRANTESの力強な抗拮抗剤である事及びある系では化 学走性又はカルシウム代謝を誘導する事ができない事が知られている。拮 抗作用のメカニズムはレセプターと結合するための競合であるようだ（９ ）。RANTESのN末端の別の誘導体（９）を使用してもまた他のケモカイン 、例えばIL8（C-X-Cケモカインのメンバー）のN末端を修飾する事によっ ても、同様の結果がみられた（10）。本発明には、メチオニン又は他の残 基をN末端に添加する事で誘導されるMet-PANTES及び他のケモカインを含 み、その結果、HIV-1JR-FLのエンベロープ糖蛋白によって媒介される融合 が阻害され、かつHIV-1の多数の単離物によって感染が阻害され、炎症性 反応も活性化されない。 b）N末端アミノ酸欠失を持つケモカイン： ケモカイン抗拮抗剤は、N末端領域においてアミノ酸を欠失させる事によ って生成されてきた。例えば、ケモカインMCP-1（C-Cケモカイン群のメン バー）のＮ末端において、最高８アミノ酸まで欠失させることによって、 ケモカイン・レセプターの結合及び自然のMCP−１の活性を阻害する能力 を維持させたまま、蛋白の生物学的活性を除去した（11、12）。 本発明は、HIV-1融合及びHIV-1感染を阻害する、天然蛋白の生物学的活性 を欠くRANTES、MIP-1α及びＭ工Ｐ-1βのN末端欠失物を包含する。 c）他のペプチド：RANTES、MIP-1α及びMIP-1βの全領域から得られる重 複した一連のペプチド類（例えば、20−67残基）は、同じアプローチによ ってスクリーンされ、白血球を活性化せずして、HIV-1融合を阻害するに 最も力のあるペプチド類を特定した。白血球反応を活性化は、次の手順の 決まった方法によって測定される（9、10、11、12）。 3） ケモカイン・レセプターのクローニング HIV-1融合に必要とされるケモカイン・レセプターは、次の方法によってクロ ーン化される。まず、哺乳類発現ベクター（例えば、Invitrogen Corp．Sna Die go，CA から入手されるpcDNA3.1）中で、PM1細胞系又はCD4+Tリンパ球あるいはマクロフ ァージから調製されたmRNAを使用してcDNAライブラリーを作成する。縮重オリゴ ヌクレオチド・プローブを使用して、ケモカイン・レセプターファミリーのメン バーをコードしているcDANライブラリーのメンバーを、例えば次の先般公開され た方法（2）を使用して特定する。次いで、ケモカイン・レセプターcDNAsを含む ベクターは、ヒトCD4を発現するがHeLa-envJR-FL細胞（例えば、HeLa-CD4、CHO- CD4あるいはCOS-CD4）又はHeLa-envLAI細胞（例えば、CHO-CD4，COS-CD4）とは 融合しない幾つかの哺乳類細胞系において、個々に発現される。RET分析での分 析に続いて、HeLa-envJR-FL細胞又はHeLa-envLAI細胞と融合する能力を得たクロ ーンが特定され、そのコード配列が、当該者に既知の手法に従ってPCR増幅で再 生された。次いでDNAの配列決定が行われ、再生されたcDNAが既知のケモカイン ・レセプターをコードしているかどうかが決定された。レセプターの発現に続い て、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が調製され、HIV-1単離物のパ ネルによって感染を阻害するその能力についてテストされた。第一実験シリーズの引用文献 第二実験シリーズ CD4+Ｔ細胞において、一次非シンシチウム誘導性（NSI）HIV-1単離物の複製物 は、c-cβケモカインMIP-1α、MIP-1β及びRANTES（1、２）によって阻害される が、Ｔ細胞系適用性（TCLA）又はシンチウム誘導性（SI）の初代株は感受性を示 さない（2、3）。該βケモカインは、リンパ球及び単核球細胞形（4−8）の細胞 上で活性な、小さい（8kDa）関連蛋白である。それらのレセプターは、７つの膜 にかかるＧ蛋白連結スーパーファミリーのメンバーであり、そのうちの一つ（LE STRオーファンレセプター）はTCLA HIV-1株の第二レセプターとして特定されて きていたが、現在はフュージンと命名されている（９）。フュージンがβケモカ イン・レセプターである事は知られていない（7−9）。 βケモカインがどのようにしてHIV-1複製を阻害するかを研究するために、ト ランスに発現するエンベロープ糖蛋白を補充したenv欠失ウイルスNL4/3Δenv（ ルシフェラーゼレセプター遺伝子も担持する）による単一サイクル感染に基づく ウイルス侵入分析が採用された（10、11）。様々なenv補充ウイルスを、PM1細胞 （初代及びTCLA HIV-1株の複製を助ける特異的な能力を有するHUT-78変種）の中 でテストし、共通の細胞のバックグラウンドに対するエンベロープ糖蛋白機能の 比較を可能にした（2、12）。MIP-1α、MIP―β及びRANTESは、これらを組み合 わせると、HIV-1に対して一番活性があり（2、3）、ＮＳＩ初代株ADA及びBaL（ 表1a）から誘導されたエンベロープをもった補充ウイルスによるPM1細胞の感染 を強力に阻害する。 表１： PM1細胞及びCD4+T細胞におけるHIT-1の侵入 のβケモカインによる阻害 表１の説明 PM1細胞をルソーら（Lusso et al．）(12）よって記載のように培養した。実 験室労働者（LW）から得られたフィコール／ハイパーク単離PBMCは、CD8+リンパ 球を抗CD8免疫磁性ビーズ（DYNAL，Great Neck NY）で除去する前に、PHAで72時 間刺激された。CD4+リンパ球は、先般記載のように（3）、インターロイキン２ （100 U/ml.Hoffmann laRoche,Nutley,NJ）を含む培養基中に保持された。目的 細胞（１─2X105）に、NL4/3Δenvルシフェラーゼ・ベクターとHIV-1 env発現ベ クターとが供トランスフェクトした293細胞より得られる上澄み液（10-50 ngのH IV-1 p24）を感染せた。βケモカイン（R & D Systems，Minneapolis）は、ウイ ルスと同時に、第一カラムに括弧書きで示される最終濃度（ng/ml）で目的細胞 に添加された。βケモカイン濃度範囲は、先般の研究（2、3）に基づいて選択さ れた。二時間後、細胞はPBSで二回 洗浄され、βケモカイン配合培地中に再懸濁され、48−96時間維持された。細胞 溶融物中のルシフェラーゼ活性は、先に記載されたように測定された（10、11） 。示された値は、ルシフェラーゼ活性(cpm)/ng p24/mg蛋白を表し、βケモカイ ン（100g）を欠くウイルスのコントロール培地中のルシフェラーゼ活性にと相対 させて表され、二重又は6重に行われた測定の平均である。ndは、測定されなか ったもの。R/Mα/Mβ，RANTES+MIP-1α+MIP-1β． RANTES及びMIP-1βは、個々に添加するときわめて活性であったのに対し、MIP -1α、MCP-1、MCP−２、Mcp−3(参照番号13−15)は、弱い阻害剤であった（表1a ）。しかしながら、MIP-1α、MIP-1β及びRANTESは、組み合わせるとPMI細胞のT CLA株NL4/3及びHxB2のよる感染あるいは非脂肪親和性ネズミの白血球ウイルス（ MuLV-Ampho）の偽タイプによる感染を阻害しなかった（表ｌａ）。このように、 ウイルスの侵入分析においては、HIV-1のエンベロープ糖蛋白の表現形の特徴が 、βケモカインの感受性に影響を与える。 Env補充分析を使用して、二つのコントロール固体（LW4、LW5）から得られたC D4+Ｔ細胞へのHIV-1の侵入を評価した。MIP-1α+MIP-1β及びRANTESは、LW4'及 びLW5'のCD4+Ｔ細胞にNSI初代株JR-FLが感染することによって、感染を強力に阻 害し、LW細胞のHxB2感染を若干減少させた（表１ｂ）。これによって、異なるウ イルス株によって活性化されたCD4"T細胞上のレセプターは、幾分か重複して使 用され得る事が示唆される。正常PBLにおけるBaL envに媒介される複製もまた 、MIP-1α、MIP-1β及びRANTESによって阻害されたが、感受性の点では、ドナー 間に著しい変異（データは不表示）が見られた。 いつβケモカインが、HIV-1の複製を阻害するかは、PM1細胞への感染を完全に 阻害するには、ADA又はBaL env補体ウイルス（図3a）添加後最高５時間までβケ モカインが続けて存在する事が必要であることを立証する事によって、決定され た。感染に先立って細胞をβケモカインで2時間又は24時間前処理し、その細胞 をウイルスの添加前に、 続けて洗浄すると何の阻害効果示さなかった。更に、ウイルス添加後２時間して βケモカインを添加すると、ごく僅だがウイルスの侵入に影響を与えた（図3a） 。次に、PCRをもとにした分析を使用し、感染の10時間後、PM1細胞中での初期の DNA逆転写物を検出した。ＮＬ4/3ではなくADAの逆転写物は、MIP-1β及びRANTES （図3b）の存在下では検出する事ができなかった。このように、βケモカインに よる阻害には、HIV-1複製の初期段階の少なくとも一つの段階；つまりウイルス の付着、融合及び初期の逆転写の少なくとも一段階の間、でβケモカインが存在 している必要がある。 第一実験シリーズの中で一部記載したように、βケモカイン類が、JR-Fl又はB RU（LAI）gp120の可溶性CD4に対する結合を阻害するか、又は四量体CD4-IgG2の オリゴ量体のエンベロープ糖蛋白（17）を発現するHeLa-JR-Fl細胞に対する結合 を阻害するかをまずテストする事によって、βケモカイン類の作用部位が区別さ れた。いずれの分析においても、どのβケモカインによっても阻害は見られなか ったが、OKT4a CD4-MAbは、両分析において阻害性を強く示した（図２、データ 不表示）。このように、βケモカインは、CD４結合後の工程、つまりエンベロー プ糖蛋白における形態的変化してウイルスと細胞膜の融合を導く時、を阻害する （18）。細胞と細胞の融合もまた、gp120−CD4の相互作用によって誘導され、細 胞膜に取り入れられた蛍光染料間の共鳴エネルギー転換（RET）によって直接監 視できる（17）。該RET分析では、OKT4aは、PMl細胞とJR-FL（HeLa-JR-Fl、HeLa envJR-FLとして上記に言及された同じ細胞系）又はBRU（HeLa-BRU，HeLa−envJ R-FL として上記に言及された同じ細胞系）のいづれかのエンベロープ糖蛋白を発 現するHeLa細胞との膜融合を完全に阻害する。これによってプロセスに特異的で あることが確認された（17）。RANTES、MIP-1β（及び程度は低いが、MIP-1α） は、HeLa-JR-FL細胞とPM1細胞との膜融合を強力に阻害するが、PM1細胞とHeLa-B RU細胞の間の融合は、これらのβケモカインに対する感受性は示さなかった（図 1及び表2a）. 表２： RET分析を使用して測定されたHIV-1エンベロープ糖蛋白によって媒介 される膜融合におけるβケモカインの影響 表2の説明： CD4+目的細胞（分裂促進剤によって活性化されたCD4+リンパ球又はPM1細胞） は、オクラデシル・ローダミン（Molecular Probes Eugne，OR）で標識し、HeLa -JR-F1細胞HeLa-BRU細胞（又はコントロールHeLa細胞、不表示）は、オクタデシ ル・フルオロセイン（Molecular Probes）で一晩37℃で標識された。同じ数の標 識された目的細胞とenv発現細胞とを96ウエルプレート中で混合し、βケモカイ ンを第一カラムの括弧内に示した最終濃度（ng/ml）で添加した。蛍光の発光値 を細胞混合後4時間目に測定した（17）。 もし細胞融合が起こったなら、染料は結合した膜にしっかりと会合する。そう すると、450nmで蛍光が励起し、結果として、共鳴エネルギー転移（RET）となり 、590nmでロダミンによる発光が起こる。融合パーセントは、100Ｘ[（実験RET− 最小RET）]/（最大RET−最小RET）と等しいと規定されている。ここで、最大RET は、Hela−Env 細胞及びCD発現細胞を、混合したとき得られる%RET値である。実験RETは、Hela- Env細胞とCD4+細胞を、融合阻害化合物の存在下で混合したときに得られる%RET 値である。最小RETは、Hela細胞（HIV-1エンベロープ糖蛋白を欠く）及びCD4+細 胞を混合したときに得られる%RET値である。該%RET値は、どこか別の場所で述べ た計算で規定され（17）手織り、夫々は三重に行った測定の平均である。Hela-J R-F1及びHeLa-BRU細胞のこれらの値は、夫々、PM1細胞11.5%,10.5%;LW5CD4+細胞 6.0%,10.5%;R/M α/Mβ，RANTES+MIP-1α+MIP-1β． 同様な結果が、LW5から得られる初代CD4+T細胞によって得られた（表2b）が、 PM1細胞においてよりも、初代細胞においてのほうがより高濃度のβケモカイン が膜融合を阻害するために必要であった。このように、βケモカインの活性は、 ＰＭ１細胞系に限られる訳ではない。RET分析によって、βケモカインがenvに媒 介される膜融合を阻害する事が実証される。 これらの結果をもっと単純に説明すると、ある種のβケモカインのそのレセプ ターに対する結合は、直接又はその他の方法で、HIV-1とCD4+T細胞との融合を妨 げる。HIV-1がCD4+細胞へ侵入するためには、第二のレセプターが必要である事 がこの10年来既知となっている（19−21）。この機能は、TCLA株については、フ ュージン（９）によって提供される。MIP-1α、MIP-1β及びRANTESについて幾つ かのレセプターが特定されており（6、7）、βケモカインは、レセプターを利用 する際に相当な交差反応性を示す（4−8）。しかしながら、組織発現パターン及 びMIP-1α、MIP-1β及びRANTES（4、7、8、15、22）に結合するその能力を基に して、C-C CKR-1特にC-C CKR-5が、最も可能性のある候補だと特定された。C-C CKR-1、C-C CKR-5及びLESTRは、PM1細胞及び初代マクロファージ（データ不表示 ）中でmRNAレベルで各々発現される。これら及び他のβケモカイン・レセプター は、よってPCR増幅され、クローンされ、発現された。 HeLa-CD4（ヒト）、COS-CD4(サル）、3T3-CD4(ネズミ)細胞においてC-C CKR-5 が発現すると、それら各々の細胞は、HIV-1侵入のenv相補性分析においては、初 代NSI株ADA及びBaLによって容易に感染させられる様になった（表3）。表３の説明 ケモカイン・レセプター遺伝子C-C CKR─1，C-C CKR-2a，C-C CKR-3，C-C CKR -4，C-C-CKR-5はイントロンを持たない（4-8，15，22）ず、7人の健常ドナーのR BMC派生のヒトゲノムDNAプールにおいて直接行われるPCRによって単離される。A TG及び停止コドンと重複し、pcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen Inc．）に指向 性をもってクローンするためのBamHI及びXhol制限部位を含むオリゴヌクレオチ ドが使用された。LESTR（フュージン又はHUMSTRとしても知られる。）（4，9，2 4）は直接PM1細胞派生するcDNA上で行われたPCRによって、ＮＩＨデータベース から派生する配列を使用してクローンされた。下記のリストは、第一回目（5-1 、及び3-1）、二回目（5-2、3-2）の直接ヒトゲノムDNAから得られたCKR遺伝子 及びPM1cDNAから得られたLESTRのPCR増幅に使用された5'─3'のプラーマー対で ある。CKR-5を増幅させるに、僅1組みのプライマーが使用された。 ヒトCD4発現細胞系HeLa-CD4(P42)，3T3-CD4(sc6)及びCOS-CD4(Z28T1)(23)には 、異なるpcDNA3.1−CKR構築物をりん酸カルシウム法によってトランスフェクト させ、48時間後に、異なるレポーターウイルス（200ngのHIV-1p24/106細胞）を βケモカインの存在下又は不存在下で感染させた。細胞溶融物中のルシフェラー ゼ活性を48時間後に測定した（10、11）。βケモカインの阻害データは、他のC- C CKR遺伝子によって媒介された感染の阻害の程度が数値化するには低すぎると して、C-C CKR-5についてのみ示された。HIV−1の侵入のPCRにもとずく分析では 、NL4/3及びADAのC-C-CKR-1発現細胞中への侵入レベルが一貫して低い（データ 不表示）事が観察された。 LESTRもC-C-CKR-1，-2a，-3又は-4も本分析中では、C-C CKR-5の代替となる 事はできなかった。COS-CD4及び3T3-CD4細胞中でのLESTRの発現はHxB2の侵入を 可能とし、HxB2は、未トランスフェクト（コントロールプラスミドトランスフェ クト）HeLa-CD4細胞中に容易に侵入した（表３）。BAL及びADAの３つのC-C CKR- 5発現細胞系全てへの侵入は、MIP-1α、MIP-1β及びRANTESの組み合せによって 殆ど完全に阻害された。しかるに、HxB2のLESTR発現細胞中への侵入は、βケモ カインに対して非感受性であった（表３）。これらの結果によって、C-C CKR-5 は、初代NSI HIV-1株についてのβケモカイン感受性第二レセプターとして機能 する事が示唆された。 C-C CKR-5の第二レセプター機能は、envによって媒介される膜融合分析におい て確認された。C-C CKR-5が、永久的にヒトCD4を発現するCOS及びHeLa細胞系で 一時的に発現された時、両細胞系は、JR-FLエンベロープ糖蛋白を発現するHeLa 細胞と強力に融合されたが、しかるに、コントロールプラスミドを使用したとき には融合は起こらなかった（データ不表示）。C-C CKR-5に代わってLESTRが発現 しても、COS-CD4及びHeLa-CD4細胞のどちらもHeLa-JR-FL細胞と融合できなかっ た。しかしCOS-CD4細胞及びHeLa-BRU細胞間の融合はできた（データ不表示）。 βケモカイン・レセプターの融合能もまた、RET分析でテストされた。C-C CKR -1、-2a，-3，又は-4ではなくC-C CKR-5の発現はHeLa-CD4細胞及びHeLa-JR-FL細 胞間の強力な融合を可能とした。HeLa-JR-FL細胞とC-C CKR-5発現HeLa-CD4細胞 間の融合の程度は、構成的なレベルのHeLa-BRU及びHeLa-CD4細胞間の融合より大 きかった（図４）。よって、初代NSI HIV-1株についてのC-C CKR-5の融合賦与機 能が二つの独立した融合分析において確認された。 実験の考察 上記の結果によって、MIP-1α、MIP-1β及びRANTESが、CD4結合に続くウイル スと細胞の融合反応を阻止する事によって、HIV-1感染を侵入段階で阻害する事 が立証された。C-C CKR-5が、HIV-1の初代NSI株がCD4+T細胞中に侵入するための 第二レセプターとして働くことが可能である事、及びβケモカインとC-C CKR-5 との相互作用によって、HIV-1融合反応が阻害される事が証明された。第二実験シリーズの引用文献 第三実験シリーズ ケモカインSDF-1（間質細胞派生因子１）はフュージン/CXCR4に対する天然リ ガンドで、HTV-1の実験室適用株による感染を阻止する（参照１及び２）。SDF-1 は、SDF-１遺伝子（参照１及び３）の可変スプライシングで少なくとも二つの型 :SDF-1α及びSDF-2β、で存在する。RET分析においては、このケモカインは、図 ５に示したようにマクロファージ性単離物HIV-1JR-FLから得られるgp120/gp41に よってではなく、実験室適用株HIVLANから得られるgp120/gp41によって媒介され る膜融合を特異的に阻害する。第三実験シリーズの引用文献 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION CD4+How to prevent HIV-1 infection of cells This application is related to the parent application filed on June 25, 1996, United States Application No. 08 / 673,682. This parent application is also a continuation-in-part of its grandfather, filed on June 14, 1996. This is a continuation-in-part application of U.S. Application No. 08 / 663,616, A continuation-in-part of U.S. Application No. 08 / 627,684, filed April 2, 1996. You. The contents of these earlier applications are hereby incorporated by reference as part of this specification. It is taken in. Throughout this application, various references are cited in parentheses. These publications The disclosure of the publications is in its entirety, in order to more fully describe the state of the art to which this invention pertains. The body is incorporated herein as part of the specification. Full of these quotes Bibliographic citations are listed at the end of each experimental series. [Background of the Invention] Chemokines are components secreted by lymphocytes and other cells. A family of related soluble proteins of 8-10 KDa It binds to putters, for example, to activate and fluidize leukocytes in the inflammatory process. Nearby In 2010, Cocchi et al. Described the chemokines RANTES, MIP-1α and MIP. -1β is CD8+Factors produced by T lymphocytes that are Inhibits infection by primary clophage tropic isolates, but prevents HIV-1 virus It was demonstrated that infection by the applied strain was not inhibited (1). These chemokines are It is a member of the c-c group of chemokines. This is because they are adjacent The cysteine residue carries one amino acid. It is different from the c-x-c group separated by acid (2). Koch et al. Reported that HIV-1 RNA expression was It has been found that treatment with chemokines inhibits these molecules, Not specified. Resonance energy transfer (RET) component of membrane fusion mediated by HIV-1 envelope glycoprotein Analysis of HIV-1JR-FLObtained from primary macrophage tropic isolates of yeast Rope sugar Whether fusion mediated by white is specifically inhibited by chemokines , A laboratory-adapted T lymphocyte affinity strain HIV-1LAIMediated by envelope glycoprotein Was determined in comparison with the fusion. This is exactly the case, as explained below. Has been demonstrated. Because of this, some chemokine receptors are HI It was demonstrated to be a fusion auxiliary molecule required for V-1 infection. In previous studies In addition to the HIV-1 receptor CD4, unconfirmed It has been pointed out that a cell surface molecule is required. CD4 is required for HIV-1 attachment In contrast, this auxiliary molecule is required for the invasive fusogenic step. These supplements Auxiliary molecules are generally only expressed on human cells. Therefore, HIV-1 is a non-human CD 4+It does not infect cells (3-6). In addition, these are (polyethylene glyco Human CD4)+By fusing with cells, non-human CD4+Cells Complementary and responsive target for HIV-1 envelope-mediated membrane fusion It is possible to generate heterokaryons (heterokaryotes) (7, 8). these Have been performed using laboratory-adapted T-lymphotropic strains of the virus. Was. In some cases, the fusion accessory molecule is human CD4+Found on a subset of cells It appears necessary for infection by HIV-1 isolates with particularly tropism. For example, HIV-1JR -FL Primary macrophage tropic strains of HIV-1 such as HIV-1LAILaboratory adaptation like Do you have different requirements for accessory molecules when compared to T lymphocyte-affinity strains? Maybe. This phenomenon could explain the difference in tropism between HIV-1 strains. U. The present invention encompasses a series of new treatments for HIV-1 infection. Chemokines invade HIV-1 Work in the fusion process of the virus, depending on the laboratory-adapted T-lymphotropic strain of the virus. Not mediated by envelope glycoproteins of macrophage tropic primary virus isolates It has been demonstrated for the first time that specific inhibition of membrane fusion is performed. First generation of the virus Clophage tropic isolates are strains normally involved in viral transmission and are It is of particular importance because it can be of particular importance in the pathogenesis of E. coli. These results indicate the resonance energy transfer of HIV-1 envelope-mediated membrane fusion. Obtained using transfer (RET) analysis. In addition, using this analysis, HIV-1 Inhibits rope glycoprotein-mediated membrane fusion, thereby neutralizing the virus and inflaming Do not induce a sexual response Non-chemokines, including chemokine fragments and modified chemokines, were identified. [Summary of the Invention] The present invention relates to HIV-1 and CD4+And a method for inhibiting the fusion with. The method uses CD4+ Cells and non-chemokine agents capable of binding to chemokine receptors CD4+Consists of contacting the cells in an amount and under conditions that can inhibit fusion to the cells. . The present invention also relates to CD4+Methods for inhibiting HIV-1 infection of cells are provided. The method comprises the steps of C D4+Cells and non-chemokine agents that can bind to chemokine receptors -1 CD4+Contact under conditions and in an amount that will inhibit fusion to the cells, It inhibits HIV-1 infection. The present invention further relates to the ability to bind to the chemokine receptor and the HIV-1 CD4+ A non-chemokine agent capable of inhibiting fusion to a cell is provided. The present invention is capable of binding to fusin and inhibiting infection. The present invention provides an agent capable of: In one embodiment, the agent is an oligopeptide is there. In another embodiment, the agent is a polypeptide. In another aspect Thus, the agent is an antibody or a portion of an antibody. In another embodiment, the agent is non-pe It is a putidyl agent. In addition, the present invention relates to HIV-1 CD4+An amount effective to inhibit fusion to the cell. A non-chemokine agent or an agent capable of binding to fusin; And a pharmaceutical composition comprising: The present invention relates to the binding of the CD4 of HIV-1 to the chemokine receptor.+Melting on cells A substance capable of inhibiting the binding. The composition comprises a chemokine receptor Non-CD4+Non-chemokka linked to a ligand capable of binding to cell surface receptors The non-chemokine agent binds to the chemokine receptor, Binding of the ligand to the receptor is not inhibited. The present invention also relates to the CD4 of HIV-1.+An amount of the above set effective to inhibit fusion to cells A pharmaceutical composition comprising the composition and a pharmaceutically acceptable carrier is provided. The present invention is capable of binding to the chemokine receptor, and the HIV-1 CD4+cell To Substances that inhibit the in vivo half-life of non-chemokine agonists Provide a substance comprising a non-chemokine agent linked to a compound capable of being increased . The present invention also relates to the CD4 of HIV-1.+An effective amount of non-cellular Linked to compounds that can increase the in vivo half-life of mokine agonists Composition comprising a non-chemokine agent and a pharmaceutically acceptable carrier I do. The present invention is a method of reducing the likelihood of HIV-1 infection in a subject, the method comprising: And a method comprising administering the above pharmaceutical composition. The present invention Also comprises administering an above-described pharmaceutical composition, comprising the step of: A method for treating dyeing is provided. The present invention also provides that the non-chemokine agent is HIV-1 CD4+Can inhibit fusion to cells Provide a way to determine if The method comprises: (a) C labeled with a first dye D4+Cell (i) and a second dye that expresses the HIV-1 envelope glycoprotein on the cell surface The labeled cell (ii) is treated with HIV-1 enzyme on the surface in the presence of the agent in excess. Cells expressing CD4 and envelope glycoprotein+Can be fused with cells in the absence of the agent A step of contacting under conditions that enable the reaction (where the first and second dyes are (B) are selected to allow transfer of resonance energy between the dyes); ) The product of step (a) under conditions that result in resonance energy transfer when fusion occurs (C) comparing with resonance energy transfer in the absence of said agent. Determine if there is a reduction in the energy transfer, Thus, the agent is HIV-1 CD4+Steps shown to inhibit fusion to cells And [Detailed description of drawings] Figure 1 HIV-1JR-FLMembrane fusions mediated by envelope glycoproteins include RANTES, Inhibited by MIP-1α and MIP-1β. PM1 cells and HeLa-envJR-FL(■) or HeLa-envLAIObtained from the fusion with (◆) % RET was measured in the presence and absence of recombinant human chemokines at concentrations Range: RANTS (80-2.5 ng / ml), MIP-1α (400-12.5 nq / ml), MIP-1β (200-6.25 ng / ml) as indicated. Chemokines and cells are the same at the beginning of the 4-hour incubation. Sometimes added. Data were collected from three or more independent experiments performed in duplicate. Show. The% inhibition of RET is defined as described below. % Inhibition = 100 · [(maximum RET−minimum RET) − (experimental RET−minimum RET)] / (Maximum RET-minimum RET) In this case, the maximum RET is in the absence of the inhibitory compound in the HeLa-env cell. % RET values obtained at 4 hours using cells and CD-expressing cells. Experiment RE T is the% RE obtained for the same cell combination in the presence of the inhibitory compound. T value. Minimal RET results in Hela cells instead of HeLa envelope expressing cells. Background% RET values obtained using cells. Figure 2 CD4: HIV-1 gp120 binding in the presence of human chemokines HIV-1 of soluble human CD4LAIAnd HIV-1JR-FLbinding to gp120 In the presence of noclonal antibody OKT4A or recombinant human chemokine and In the absence, the same concentration range as used in the RET inhibition study of FIG. KT4A (62-0.3nM), RANTS (10.3-0.3), MIP-1α (53.3-2.9nM), MIP- 1β (25.6-0.8 nM), determined by ELISA. The inhibitor is bio Microtiter dishes (Dynatech Laborato) with tinylated HIV-1 gp120 ries, Inc., Chantilly, vA). Was. After 2 hours incubation at room temperature, extensive washing, 1 hour with putavidin, horseradish and peroxidase At room temperature. Washed several more times Afterwards, the substrate is added and the optical density (OD) at 492 nm is read on an ELISA plate. It was measured with a reader. The data consist of two independent experiments performed in quadruplicate. Test. Figure 3 Specificity: time course and stage of β-chemokine inhibition of HIV-1 replication (A) pM1 cells (1 × 106) To RANTES + MIP-1α + MIP-1β (R / Mα / Mβ, 100ng / ml each) for 24 hours (-24h) Incubate for 2 hours (-2 h) and wash twice with phosphate buffered saline (PBS) Was. HIV-1 (BaL env-complementation) virus (50 ng p24, see description in Table 1) for 2 hours Add, wash cells and luciferase activity in cell lysate as described above. Incubation was performed for 48 hours before measurement (10, 11). Or virus and At the same time, add R / Mα / Mβ to the cells at the indicated time point (1 hour, 3 hours, etc.). Wash twice in BS, resuspend in medium and incubate at 48 hours prior to luciferase analysis. Has been recorded. Time 0 indicates a positive control, to which β-chemokines were added. Not. +2 hours for 2 hours virus and cell mixture before washing twice with PBS Is shown. Continue culturing for an additional 48 hours before adding R / Mα / Mβ and luciferase analysis I do. (B) PM1 cells (1x106) Grown in CEM cells (NL4 / 3, lanes 1-4) HIV-1 (500 pg p24) or macrophages (ADA; lanes 5-8) were added at 500 nq / ml. RANTES (lanes 1 and 5), MIP-1β (lanes 2 and 6) or β-free chemokine (re Infections in the presence of hairpins 4 and 8). Lanes 3 and 7 are negative controls (no virus) It is. All stocks of virus used for PCR analysis were treated with DNAse for 30 minutes at 37 ° C. And tested for DNA contamination before use. After 2 hours, the cells are washed and the same β Resuspended in medium containing chemokine for an additional 8 hours. Next, DNA / RNA isolation kit (US b DNA was extracted from infected cells using iochemical). The first nested PCR Primer: No. 2) and the second round uses primers: The following amplification cycle in a Perkin-Elmer 2400 cycler: 94 ° C for 5 minutes, 94 C. 30 seconds, 55.degree. C. 30 seconds, 72.degree. C. 30 seconds, 72.degree. C. 7 minutes were performed in 35 cycles. M is 1Kb Indicates a DNA ladder, where 1, 10, 100, and 1000 are reference plasmids Shows the copy number of (pAD8). This analysis yielded 100 copies of the reverse transcript Was detected. Figure 4 HIV-1 env-mediated membrane fusion transiently expressing C-C CKR-5 Mediated by β-chemokine receptor expressed in HeLa cells Membrane fusion was demonstrated as follows. Control plasmid pcDNA3.1 or plasmid The rasmid pcDNA3.1-CKR construct was transformed using lipofectin (Gibco BRL). Cells were transfected. pcDNA3.1 plasmid is T7 It has a remelase promoter and is a beta chemokine receptor Transient expression of 1 × 10 encoding T7 polymerase (vFT7.3)7p After lipofectin administration by infecting cells with fu vaccine ( 9) Increased at 4 hours. The cells are then cultured overnight in a medium containing R18, HeLa-JR-FL cells (solid columns) or HeLa-BRU cells (hatched cells) Was tested for its ability to fuse with About control HeLa cells The% RET of 3% and 4% regardless of the transfected brassmid %Met. Figure 5 HIVLAIMembrane fusion mediated by envelope glycoproteins is inhibited by SDF-1. Hindered PM1 cells and Hela-envJR-FLOr Hela-envLAIObtained from cell fusion % RET (as shown on the graph) was replaced with recombinant SDF-1α (Gryphon Scie nce, San Francisco) at the indicated concentrations. Experiment The method is as described in the description for FIG. [Detailed description of the invention] The present invention relates to HIV-1 and CD4+A method for inhibiting fusion with cells, comprising the steps of:+On cells On the other hand, a non-chemokine agonist capable of binding to a chemokine receptor is called C-1 of HIV-1. D4+Contacting under conditions and under conditions that inhibit fusion to cells I will provide a. The invention also relates to CD4+A method for inhibiting HIV-1 infection of cells, comprising the steps of:+On cells On the other hand, a non-chemokine agonist capable of binding to a chemokine receptor is called C-1 of HIV-1. D4+cell HIV-1 infection by contacting in amounts and under conditions that inhibit fusion to A method comprising inhibiting In the present invention, a chemokine is defined as RANTES, MIP-1α, MIP-1β, or HIV-1 Means other chemokines that block dyeing. Chemokine receptor is RANTES Binds MIP-1α, MIP-1β, or other chemokines that block HIV-1 infection Means a possible receptor. Throughout this application, the receptor "fusin" has also been named CXCR4. The chemokine receptor C-C CKR5 is also named CCR5. HIV-1 used in this application retains its clinical characteristics unless otherwise specified. Clinical or primary or field isolates of the HIV-1 virus To taste. HIV-1 clinical isolates are passaged in primary peripheral blood mononuclear cells Is also good. The HIV-1 clinical isolate is macrophage tropic. The non-chemokine agent of the present invention can bind to a chemokine receptor and 1 CD4+Can inhibit fusion to cells. The non-chemokine agents include chemokai. But not limited to fragments, derivatives and analogs of amino acids. But It does not contain natural chemokines. The non-chemokine agent includes a chemokine. Fragments, derivatives and analogs or chemokines linked to other molecules Various forms of fusion molecules, including fragments, derivatives and analogs are included. In one embodiment of the invention, the non-chemokine agent is an oligopeptide. You. In another aspect, the non-chemokine agent is a polypeptide. Another aspect Wherein the non-chemokine agent is an antibody or a portion of an antibody. Chemokine Recept Antibodies to the protein can be easily generated by routine experimentation. Chemokai The synthesis of antibody fragments that can bind to receptor receptors is also described in the art. Within the range of the bell. In yet another embodiment, the non-chemokine agent is a non-peptidyl Activator. Non-chemokine agents with a pure peptidyl composition have been applied to the solid phase method (Merrifield, 1966). Thus, they can be chemically synthesized or assembled in either prokaryotic or eukaryotic systems. Produced using replacement techniques. The synthesis and recombination methods are already known in the prior art. Is knowledge. Non-chemokine agents containing biotin or other peptidyl groups may be synthetic or recombinant. Prepared by chemically modifying chemokines or non-chemokines it can. One method of chemical modification involves serine or sulfur as the N-terminal amino acid. 2-aminoa present in a chemokine having leonine or a non-chemokine agonist Periodate oxidation of rucol (Geophegan and Stroh, 1992). That The resulting aldehyde group is used to convert peptidyl or non-peptidyl groups. By primary amination, hydrazination or other chemical techniques known to those skilled in the art, It can be linked to an oxidized chemokine or a non-chemokine agent. The N-terminus of the protein used here is the terminus of the protein after processing. means. In the case of a secretory protein containing a cleavable signal sequence, the N-terminal of the secretory protein The end should be the end after cleavage of the signal peptide. The present invention provides a method for identifying these non-chemokine agents. Chemokai Binding to HIV-1 receptor and HIV-1 CD4+Non-peptidic inhibitors of fusion to cells One method for identifying such agents, including drug agents, is to use the following analytical methods 1) soluble CD4, HIV-1JR-FLOr HIV-1LAIObtained from Incubate with biotinylated gp120; 2) This complex is Not expressing CCR5 or CXCR4 (HIV-1JR-FLOr HIV-1LAI gp120s) With or without a candidate inhibitor; 3) wash, Incubated with streptavidin phycoerythrin and washed 4) And then bind the amount bound to gp120 using flow cytometry or a fluorometer. The degree of binding inhibition by the inhibitor is calculated. The above biotinylated gp120-streptavidin phycoerythrin method Alternatively, some alternative methods of detecting bound gp120 can be used. For example, Instead of otylated gp120, a peroxidase-conjugated gp120 can be used, Binding is performed by spectrometry using an appropriate chromogenic substrate for peroxidase. Data can be detected. The present invention further provides non-chemokine agents identified by some of the above methods. Offer. The present invention relates to the ability to bind to chemokine receptors,+Fusion to cells To provide a non-chemokine agent capable of inhibiting chemokines. In one embodiment, the non-chemo Cain agonists are polypeptides. In yet another aspect, the polypeptide Is a fragment of the chemokine RANTES (Gong et al., 1996). In yet another aspect The polypeptide consists of a RANTES sequence lacking the N-terminal amino acid of the sequence. You may. The deletion consists of the first eight N-terminal amino acids of the RANTES sequence (SEQ ID NO: 5). Acid may be used. In another embodiment, the polypeptide is a MIP-1β sequence lacking the N-terminal amino acid of the sequence. It may consist of rows. The deletion consists of the first 7, 8, 9, 10 N-terminals of the MIP-1β sequence. Terminal amino acids may be used. In another embodiment of the non-chemokine agent, the polypeptide is an amino acid or MIP-1β sequence with N-terminal sequence modified by adding oligopeptide Consists of In another embodiment, the N-terminal alanine is removed and replaced with serine or starch. Leonin, and another amino acid, or oligopeptide or non-peptidyl moiety Consisting of a MIP-1β sequence having an N-terminal sequence modified by substitution with Yet another In embodiments, the other amino acid is methionine. As described in the Experimental Details section below, co-phasing of HIV-1 fusion and invasion Was identified and named "Fujin" (Feng et al., 1996). The invention Provides an agent that can bind to fusin and inhibit infection. In one aspect In the formula, the agent is an oligopeptide. In another aspect, the agent is a polypeptide It is. In a further aspect, the polypeptide has a deletion of the N-terminal amino acid of the sequence Consists of SDF-1. The deletion is in the first 6, 7, 8, 9 of the N-terminal amino acid of the SDF-1 sequence. May be. The present invention also relates to the above non-chemokine agent, which is an antagonist against SDF-1. An agent having an SDF-1 sequence having an N-terminal sequence modified to produce an effect is provided. You. One modification is to replace the N-terminal glycine of SDF-1 with serine and induce with biotin Can be raised. In another modification, the N-terminal glycine of SDF-1 is replaced with serine And derivatization with methionine. Yet another modification is the N-terminal of SDF-1 Methionine may be added to the end before the terminal glycine. In another aspect, the agent is an antibody or a portion of an antibody. In another embodiment, the The agent is a non-peptidyl agent. The agent capable of binding to fusin is the agent that binds to fusin in vitro. Ability can be identified by screening various compounds. (Fowlkes et al. 1994) et al., Filed an appropriate method in international application: PCT / US94 / 03. 143, International Publication WO94 / 23025. The contents of this book are quoted here. It is hereby incorporated by reference as an integral part of the specification. Simply put, Yeast cells with pheromone system express heterologous substitutes for yeast pheromone proteins Process as follows. The surrogate incorporates fusin and, under certain conditions, the yeast The function that the corresponding yeast pheromone protein naturally performs in the cell pheromone system Execute. Such yeast cells may also express a library of peptides. Processed into This allows yeast cells containing the peptide that binds fusin to Regulates the interaction between the surrogate yeast pheromone protein and the yeast pheromone system. Regulation is a phenomenon that can be selected or screened. Use a similar approach To bind to both the fusion and chemokine receptor C-C CKR5 The agent can be specified. The present invention also relates to the CD4 of HIV-1.+An amount of such an effective amount to inhibit fusion to cells A non-chemokine agent or an agent capable of binding to fusin; A pharmaceutical composition comprising: Pharmaceutically acceptable carriers are well-known to those skilled in the art. Such pharmaceutically Acceptable carriers include aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. You. Examples of non-aqueous solvents include propylene glycol, polyethylene glycol, Physical oils such as olive oil, and injectable organic esters such as olein Acid ethyl). Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solutions, emulsions and Include suspensions, saline and buffered media. Parenteral vehicles include: Sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride Thorium, lactated Ringer or immobilized oils. Intravenous vehicles include liquid Body, nutritional and electrolyte supplements, eg based on Ringer's dextrose And the like. Preservatives and other additives such as antibacterials, antioxidants, rate Agents, inert gases and the like may be present. The present invention relates to the ability to bind to the chemokine receptor and+Fine A substance that inhibits fusion to vesicles, other than the chemokine receptor CD4+Cell details Including a non-chemokine agent linked to a ligand capable of binding to cell surface receptors The other chemokine-binding agent binds to a chemokine receptor; A substance is provided which does not inhibit the binding of said ligand to the puter. One form In one embodiment, the cell surface receptor is CD4. In another embodiment, the ligand The antibody is an antibody or a portion of an antibody. The present invention also relates to the CD4 of HIV-1.+An effective amount of the above substance to inhibit fusion to cells And a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention relates to a CD4 of HIV-1 that binds to a chemokine receptor.+Melting into cells Substance that can inhibit the binding of non-chemokine agents in vivo Substances containing non-chemokine agents linked to compounds that can increase provide. In one embodiment, the compound is polyethylene glycol. The present invention also relates to the CD4 of HIV-1.+An effective amount of non-chemokka to inhibit fusion to cells Non-linked to a compound capable of increasing the in vivo half-life of an in-acting agent Pharmaceutical combination comprising a substance containing a chemokine agonist and a pharmaceutically acceptable carrier Provide a product. The present invention also provides a method of reducing the likelihood of HIV-1 infection in a subject, comprising: A method comprising administering the described pharmaceutical composition to a subject. The present invention Also, a method of treating HIV-1 infection, comprising administering the pharmaceutical composition described above. And a method provided with the above. The invention also provides that the non-chemokine agent is HIV-1 CD4+Inhibits fusion to cells And (a) labeling with a first dye. CD4+Cell (i) and a second dye that expresses the HIV-1 envelope glycoprotein on the cell surface The labeled cell (ii) is treated with HIV-1 enzyme on the surface in the presence of the agent in excess. Cells expressing CD4 and envelope glycoprotein+Can be fused with cells in the absence of the agent A step of contacting under conditions that enable the reaction (where the first and second dyes are (B) are selected to allow transfer of resonance energy between the dyes); ) The product of step (a) is resonated when fusion occurs. Exposing to conditions that cause energy transfer; and (c) resonance in the absence of said agent. Determining whether there is a decrease in resonance energy transfer compared to the energy transfer, Due to the decrease in the energy transfer, the agent becomes HIV-1 CD4+Fusion to cells And a step that can be inhibited. HIV-1 is the right CD4+Some fuse only with cells. For example, laboratory compatible T phosphorus Papillinophil HIV-1 strains contain most CD4+Fuse with human cells. Clinical HIV-1 isolation The product is most transformed CD4+Does not fuse with human cell lines, but human primary CD Four+Cells, for example, CD4+It fuses with T lymphocytes and macrophages. Procedure decision By conducting an experiment, the CD4+Whether the cells are suitable for the above fusion assay Can be easily determined. As described in the present invention, HIV-1 membrane fusion is useful for resonance energy transfer (RET) analysis. Monitored accordingly. The analysis was carried out in WO 95/16789, as well as on December 16, 1994. It is described in International Application No. PCT / US94 / 14561 filed on the day of the present application. This analysis was conducted in June 1995. Further details are provided in United States co-pending application Ser. No. 08 / 476,515, filed on Nov. You. The contents of these applications are hereby incorporated by reference. In one embodiment of the above method, the non-chemokine agent is an oligopeptide . In another embodiment, the chemokine agonist is a polypeptide. Another aspect Wherein the agent is an antibody or a portion of an antibody. In another embodiment, the chemocha In-acting agents are non-peptidyl acting agents. In another embodiment, the CD4+The cells are PM1 cells. In another aspect, the HIV-1 envelope Cells expressing glycoproteins are HIV-1JR-FL HeLa cells expressing gp120 / gp41. The invention will be better understood by reference to the experimental details that follow. No. However, those skilled in the art will appreciate that the specific experiments detailed are fully described in the claims below. It will be readily understood that the invention as described is merely illustrative.Experimental details First experiment series 1)Chemokines are not laboratory-adapted T-lymphotropic strains of HIV-1 but HIV-1 By envelope glycoproteins from macrophage tropic primary isolates Inhibits mediated fusion. The chemokines RANTES, MIP-1α and MIP-1β are available from the R & D system (Minneapolls , MN). These are Hela-envJR-FICells (macrophage isolate HI V-1JR-F1Expressing gp120 / gp41 obtained from) and the ability to inhibit fusion between PM1 cells About force or Hela-envLAICells (laboratory strain HIV-1LAIObtained from Gp120 / gp41) and various CD4+Ability to inhibit fusion between T lymphocyte cell lines Were tested by RET analysis. As shown in FIG. 1, all three chemokines were Inhibit fusion mediated by the macrophage viral envelope glycoprotein Affected, but Inhibited, Fusions Mediated by Laboratory-Applied Envelope Glycoproteins Did not. Next, the interaction between the chemokines CD4 and HIV-1 gp120 occurs during virus attachment Was tested for the ability to inhibit The chemokines do not inhibit this interaction I understood that (Figure 2). This results in membrane fusion mediated by the HIV-1 envelope glycoprotein. Blockade is more than an early CD4-gp120 interaction that precedes fusion However, it was demonstrated that membrane fusion itself occurs when it occurs. 2)HIV-1 Non-chemokine peptides inhibiting fusion and their derivatives Non-chemokines include chemokine fragments and chemokine derivatives, which are Tested by RET assay to determine which are active in inhibiting HIV-1 membrane fusion Was. In particular, fragments or derivatives that inhibit HIV-1 fusion but do not activate the leukocyte reaction Attention is gathering. These non-chemokines include: a) N-terminal derivatives of said chemokines. Add residue to N-terminus of chemokine This severely reduces the ability of chemokines to bind to chemokine receptors. Inhibit the function of these proteins without loss. For example, Met-RANTES ( Has N-terminal methionine (RANTES) is a potent antagonist of natural RANTES, and in some systems It is known that it is not possible to induce academia or calcium metabolism. Antagonist The mechanism of anti-action appears to be competition for binding to the receptor (9 ). Use of another N-terminal derivative of RANTES (9) may also result in other chemokines For example, by modifying the N-terminus of IL8 (a member of the C-X-C chemokine) Similar results were obtained (10). The present invention includes methionine or other residues. Including Met-PANTES and other chemokines derived by adding a group to the N-terminus And, consequently, fusion mediated by the envelope glycoprotein of HIV-1 JR-FL And infection is inhibited by multiple isolates of HIV-1 and inflammatory The reaction is not activated either. b) Chemokines with N-terminal amino acid deletion: Chemokine antagonists delete amino acids in the N-terminal region. Has been generated. For example, chemokine MCP-1 (C-C chemokine group member) By deleting up to 8 amino acids at the N-terminus of bar) Ability to inhibit chemokine receptor binding and natural MCP-1 activity The biological activity of the protein was removed while maintaining (11, 12). The present invention relates to the biological activity of the native protein, which inhibits HIV-1 fusion and HIV-1 infection. And N-terminal deletions of RANTES, MIP-1α, and M-P-1β lacking. c) Other peptides: weights obtained from the entire region of RANTES, MIP-1α and MIP-1β Multiple sets of peptides (eg, residues 20-67) can be combined using the same approach. To inhibit HIV-1 fusion without activating leukocytes The most potent peptides were identified. Activating the leukocyte reaction involves the following steps It is measured by a fixed method (9, 10, 11, 12). 3)Cloning of mokine receptor Chemokine receptors required for HIV-1 fusion are cloned by: It is First, a mammalian expression vector (for example, Invitrogen Corp. Sna Die go, CA PM1 cell line or CD4 in pcDNA3.1) obtained from+T lymphocytes or macrophages A cDNA library is prepared using mRNA prepared from the library. Degenerate oligos Using nucleotide probes, members of the chemokine receptor family The members of the bar-coding cDAN library, for example, Using method (2). Then contains chemokine receptor cDNAs The vector expresses human CD4 but contains HeLa-envJR-FLCells (eg, HeLa-CD4, CHO- CD4 or COS-CD4) or HeLa-envLAIAbout cells (eg, CHO-CD4, COS-CD4) It is expressed individually in some non-fused mammalian cell lines. Minutes from RET analysis Following the analysis, the HeLa-envJR-FLCells or HeLa-envLAIBlack that has the ability to fuse with cells The coding sequence is identified and its coding sequence is reproduced by PCR amplification according to techniques known to the individual. Was born. The DNA is then sequenced and the regenerated cDNA is converted to a known chemokine. -It was determined whether it codes for a receptor. Following expression of the receptor Thus, monoclonal and polyclonal antibodies are prepared and purified from HIV-1 isolates. Tested for its ability to inhibit infection by flannel.References from the first experimental series Second experiment series CD4+Replicates of primary non-syncytia-inducible (NSI) HIV-1 isolates in T cells Is inhibited by the c-cβ chemokines MIP-1α, MIP-1β and RANTES (1, 2) However, T cell line compatible (TCLA) or scintillation inducible (SI) primary strains are sensitive No (2, 3). The beta chemokines are lymphocyte and mononuclear cell type (4-8) cells It is a small (8 kDa) related protein that is active above. These receptors consist of seven membranes Is a member of the G protein-linked superfamily, and one of them (LE STR orphan receptor) has been identified as the second receptor of the TCLA HIV-1 strain It has now been named Fujin (9). Fugin is beta chemocha It is not known to be an in-receptor (7-9). To study how beta chemokines inhibit HIV-1 replication, Env-deleted virus NL4 / 3Δenv supplemented with envelope glycoprotein expressed in lance ( Based on single-cycle infection with luciferase receptor gene Virus invasion analysis was employed (10,11). Various env-supplemented viruses, PM1 cells (HUT-78 variant with specific ability to assist replication of primary and TCLA HIV-1 strains) Of envelope glycoprotein function against a common cell background Allowed comparison (2,12). MIP-1α, MIP-β and RANTES combine In total, it is most active against HIV-1 (2, 3), and the first NSI strains ADA and BaL ( Infection of PM1 cells with enveloped replacement virus derived from Table 1a) Strongly inhibits. Table 1: PM1 cells and CD4+HIT-1 invasion in T cells Inhibition by β-chemokines Explanation of Table 1 PM1 cells were cultured as described by Lusso et al. (12). Real Ficoll / Hypaque isolated PBMC obtained from laboratory workers (LW)+lymph 72 hours with PHA before removing spheres with anti-CD8 immunomagnetic beads (DYNAL, Great Neck NY) I was stimulated for a while. CD4+Lymphocytes were obtained from interleukin 2 as previously described (3). (100 U / ml. Hoffmann la Roche, Nutley, NJ). Purpose Cells (1─2X10Five) Shows the NL4 / 3Δenv luciferase vector and HIV-1 env expression vector. Supernatant obtained from the transfected 293 cells (10-50 ng of H IV-1 p24). Beta chemokines (R & D Systems, Minneapolis) At the same time as the final concentration of the target cells (ng / ml) in the first column in parentheses. Was added. The beta chemokine concentration range was selected based on previous studies (2, 3). Was. After 2 hours, cells are washed twice with PBS Washed and resuspended in β-chemokine-containing medium and maintained for 48-96 hours. cell Luciferase activity in the melt was measured as previously described (10,11) . The values shown represent luciferase activity (cpm) / ng p24 / mg protein, β Relative to luciferase activity in control medium of virus lacking And is the average of the measurements made in duplicate or in triplicate. nd is not measured Thing. R / Mα / Mβ, RANTES + MIP-1α + MIP-1β. RANTES and MIP-1β were extremely active when added individually, whereas MIP-1β -1α, MCP-1, MCP-2, Mcp-3 (ref. 13-15) were weak inhibitors (Table 1a ). However, MIP-1α, MIP-1β and RANTES, when combined, reduce the TMI of PMI cells. Infection with CLA strains NL4 / 3 and HxB2 or non-lipophilic murine leukocyte virus ( MuLV-Ampho) did not inhibit pseudotyped infection (Table la). in this way, In viral invasion analysis, the phenotypic characteristics of the envelope glycoprotein of HIV-1 were characterized. Affects the sensitivity of beta chemokines. C obtained from two control solids (LW4, LW5) using Env supplementation analysis D4+HIV-1 entry into T cells was evaluated. MIP-1α + MIP-1β and RANTES are LW4 'and And LW5 'CD4+Infection of T cells with the NSI primary strain JR-FL strongly inhibits infection. And slightly reduced HxB2 infection of LW cells (Table 1b). This allows different Receptors on CD4 "T cells activated by the strain of Ils use some overlap. It is suggested that it can be used. BaL env-mediated replication in normal PBLs is also , MIP-1α, MIP-1β and RANTES, but in terms of sensitivity Significant mutations were found between them (data not shown). When β-chemokines inhibit HIV-1 replication, complete infection of PM1 cells For inhibition, β-cells were added for up to 5 hours after the addition of ADA or BaL env complement virus (FIG. Determined by demonstrating that it is necessary for mokine to be present Was. Prior to infection, cells were pre-treated with β-chemokines for 2 or 24 hours, Before adding the virus, Subsequent washing showed no inhibitory effect. 2 hours after virus addition Addition of beta chemokines affected virus entry very slightly (Figure 3a) . Then, using PCR-based analysis, 10 hours after infection, the initial DNA reverse transcript was detected. The reverse transcript of ADA, but not NL4 / 3, was MIP-1β and RANTES No detectable in the presence of (FIG. 3b). In this way, beta chemokines Inhibition by at least one of the early stages of HIV-1 replication; Β chemokines are present during at least one stage of attachment, fusion and early reverse transcription Need to be. As described in part in the first series of experiments, β-chemokines were converted to JR-Fl or B Inhibits the binding of RU (LAI) gpl20 to soluble CD4 or inhibits the tetramer CD4-IgG2 Binding of oligomers to HeLa-JR-Fl cells expressing envelope glycoprotein (17) By first testing whether they block the action of β-chemokines. Was. No inhibition by any of the beta chemokines in any of the assays However, OKT4a CD4-MAb showed strong inhibition in both assays (Figure 2, data Not shown). Thus, the β-chemokine is a process after CD4 binding, that is, envelope. Inhibits when morphological changes in the glycoprotein lead to fusion of the virus and cell membrane (18). Cell-to-cell fusion is also induced by the gp120-CD4 interaction, Direct monitoring by resonance energy conversion (RET) between fluorescent dyes incorporated into the cell membrane Can be seen (17). In the RET analysis, OKT4a was expressed in PMl cells and JR-FL (HeLa-JR-Fl, HeLa envJR-FLOr BRU (HeLa-BRU, HeLa-env)J R-FL Release envelope glycoproteins from any of the same cell lines mentioned above as Completely inhibits membrane fusion with the emerging HeLa cells. This makes it process specific and (17). RANTES, MIP-1β (and, to a lesser extent, MIP-1α) Strongly inhibits membrane fusion between HeLa-JR-FL cells and PM1 cells, but inhibits PM1 cells and HeLa-B Fusion between RU cells showed no sensitivity to these β chemokines (Fig. 1 and Table 2a). Table 2: Mediated by HIV-1 envelope glycoprotein measured using RET assay Of β-chemokine on membrane fusion Description of Table 2: CD4+Target cells (CD4 activated by mitogen+Lymphocytes or PM1 cells) Is labeled with Okradecyl Rhodamine (Molecular Probes Eugne, OR) and HeLa -JR-F1 cells HeLa-BRU cells (or control HeLa cells, not shown) Labeled with Le Fluorescein (Molecular Probes) at 37 ° C overnight. Same number of markers The target cells and the env-expressing cells were mixed in a 96-well plate, and Was added at the final concentration (ng / ml) indicated in parentheses of the first column. Fluorescence emission value Was measured 4 hours after cell mixing (17). If cell fusion occurs, the dye will associate tightly with the associated membrane. so Then, fluorescence is excited at 450 nm, resulting in resonance energy transfer (RET). At 590 nm, emission by Lodamine occurs. The fusion percentage was 100 X [(experimental RET- Minimum RET)] / (maximum RET-minimum RET). Where max RET Is Hela-Env The% RET value obtained when cells and CD-expressing cells are mixed. Experimental RET, Hela- Env cells and CD4+% RET obtained when cells are mixed in the presence of the fusion inhibitor Value. Minimal RET was performed using Hela cells (lacking the HIV-1 envelope glycoprotein) and CD4+Fine % RET value obtained when cells are mixed. The% RET value must be stated elsewhere. (17) Hand-woven, each is the average of triplicate measurements. Hela-J These values for R-F1 and HeLa-BRU cells are 11.5% and 10.5% for PM1 cells, respectively; LW5CD4+cell 6.0%, 10.5%; R / M α / Mβ, RANTES + MIP-1α + MIP-1β. Similar results are obtained from the original CD4 from LW5+Obtained by T cells (Table 2b) Higher concentrations of β-chemokines in primary cells than in PM1 cells Was required to inhibit membrane fusion. Thus, the activity of β-chemokines is It is not limited to the PM1 cell line. By RET analysis, β chemokines are transferred to env Inhibition of mediated membrane fusion is demonstrated. To more simply explain these results, the receptor for certain beta chemokines Binding to HIV-1 directly or by other means+Prevents fusion with T cells I can. HIV-1 is CD4+Requires a second receptor to enter cells Has been known for the last 10 years (19-21). This feature is available for TCLA strains. Provided by Luzin (9). About MIP-1α, MIP-1β and RANTES Receptor has been identified (6,7), β-chemokines utilize the receptor It shows considerable cross-reactivity when running (4-8). However, tissue expression patterns and And its ability to bind to MIP-1α, MIP-1β and RANTES (4, 7, 8, 15, 22) As a result, C-C CKR-1, especially C-C CKR-5, was identified as the most likely candidate. C-C CKR-1, C-C CKR-5 and LESTR were used for PM1 cells and primary macrophages (data not shown). ) Are each expressed at the mRNA level. These and other beta chemokine receptors Was thus PCR amplified, cloned and expressed. C-C CKR-5 in HeLa-CD4 (human), COS-CD4 (monkey), and 3T3-CD4 (murine) cells When expressed, each of these cells is initially in env complementation analysis of HIV-1 entry. It became easily infected by progeny NSI strains ADA and BaL (Table 3).Explanation of Table 3 Chemokine receptor gene C-C CKR─1, C-C CKR-2a, C-C CKR-3, C-C CKR -4, C-C-CKR-5 has no intron (4-8, 15, 22) and R from 7 healthy donors It is isolated by PCR performed directly on a BMC-derived human genomic DNA pool. A Overlaps TG and stop codon and points to pcDNA3.1 expression vector (Invitrogen Inc.) Oligonucleotides Containing BamHI and Xhol Restriction Sites for Sexual Cloning Was used. LESTR (also known as fusion or HUMSTR) (4,9,2) 4) NIH database by PCR performed directly on cDNA derived from PM1 cells Cloned using an array derived from The list below is the first one (5-1 And 3-1), the second (5-2, 3-2) CKR genes obtained directly from human genomic DNA And 5'─3 'primer pair used for PCR amplification of LESTR obtained from PM1 cDNA and is there. Only one set of primers was used to amplify CKR-5. The human CD4-expressing cell lines HeLa-CD4 (P42), 3T3-CD4 (sc6) and COS-CD4 (Z28T1) (23) Transfected different pcDNA3.1-CKR constructs by calcium phosphate method 48 hours later, a different reporter virus (200 ng of HIV-1p24 / 106Cells) Infections were performed in the presence or absence of beta chemokines. Lucifera in cell melt Zetas activity was measured after 48 hours (10, 11). Beta chemokine inhibition data shows that other C- C CKR gene-mediated inhibition of infection is too low to quantify And only for C-C CKR-5. In an analysis based on PCR of HIV-1 invasion, , NL4 / 3 and ADA have consistently low levels of entry into cells expressing C-C-CKR-1 (data (Not shown) was observed. Both LESTR and C-C-CKR-1, -2a, -3 or -4 are alternatives to C-C CKR-5 during this analysis. Things could not be done. Expression of LESTR in COS-CD4 and 3T3-CD4 cells leads to HxB2 invasion HxB2 was not transfected (control plasmid transfer H) easily invaded into HeLa-CD4 cells (Table 3). Three C-C CKR- of BAL and ADA Invasion of all 5 expressing cell lines is due to the combination of MIP-1α, MIP-1β and RANTES. Almost completely inhibited. However, the entry of HxB2 into LESTR-expressing cells Insensitive to Cain (Table 3). Based on these results, C-C CKR-5 Functions as a beta-chemokine-sensitive second receptor for the primary NSI HIV-1 strain It was suggested to do. The second receptor function of C-C CKR-5 is involved in env-mediated membrane fusion assays Was confirmed. C-C CKR-5 is permanently expressed in COS and HeLa cell lines expressing human CD4 When transiently expressed, both cell lines contain HeLa expressing the JR-FL envelope glycoprotein. Strongly fused with cells, but with control plasmid Did not fuse (data not shown). LESTR expressed in place of C-C CKR-5 However, neither COS-CD4 nor HeLa-CD4 cells could fuse with HeLa-JR-FL cells Was. However, fusion between COS-CD4 cells and HeLa-BRU cells was possible (data not shown). The ability of the β-chemokine receptor to fuse was also tested in a RET assay. C-C CKR Expression of C-C CKR-5, but not of -1, -2a, -3, or -4, was observed in HeLa-CD4 cells and HeLa-JR-FL cells. Strong fusion between cells was enabled. HeLa-JR-FL cells and HeLa-CD4 cells expressing C-C CKR-5 The degree of fusion between cells is greater than that between constitutive levels of HeLa-BRU and HeLa-CD4 cells. It was ok (Figure 4). Therefore, C-C CKR-5 fusion awarding machine for the first NSI HIV-1 strain Performance was confirmed in two independent fusion analyses. Experimental considerations According to the above results, MIP-1α, MIP-1β and RANTES were found to be the virus following CD4 binding. Inhibit HIV-1 infection at the entry stage by blocking the fusion reaction between cells and cells Was proved. C-C CKR-5 is required for the primary NSI strain of HIV-1 to enter CD4 + T cells Capable of acting as a second receptor, and β-chemokines and C-C CKR-5 It has been demonstrated that the interaction with H1 inhibits the HIV-1 fusion reaction.References from the second series of experiments Third experiment series Chemokine SDF-1 (stromal cell-derived factor 1) is a natural receptor for fusin / CXCR4 In Gand, block infection by laboratory-applied strains of HTV-1 (Refs. 1 and 2). SDF-1 Indicates at least two types of variable splicing of the SDF-1 gene (references 1 and 3) : SDF-1α and SDF-2β. In RET analysis, this chemokine was As shown in FIG. 5, the macrophage isolate HIV-1JR-FLGp120 / gp41 obtained from Therefore, not the laboratory strain HIVLANMediated by gp120 / gp41 obtained from Specifically inhibits membrane fusion.References from the third experiment series
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