JP2000504202A

JP2000504202A - 本来のアミロイド前駆体タンパク質欠失トランスジェニック動物

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Publication number: JP2000504202A
Application number: JP8517675A
Authority: JP
Inventors: ゼン，ヒユイ; チエン，ハワード・ワイ; トラムバウアー，マーナ・イー; フアン・デル・プルーフ，レオナルドウス・ハー・テー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-12-05
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 2000-04-11
Also published as: EP0799305A1; WO1996017926A1; CA2206789A1; EP0799305A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、本来のアミロイド前駆体タンパク質を欠失するトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病及び中枢神経系を含む疾患の研究に使用されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】本来のアミロイド前駆体タンパク質欠失トランスジェニック動物発明の分野本発明は、本来のアミロイド前駆体タンパク質欠失非ヒトトランスジェニック動物に関する。発明の背景アルツハイマー病（ＡＤ）は、６５歳以上の人々に非比例的に影響を与える神経性疾患である。この病気の発生は、６０−６５歳で１％未満から、７５歳で５％、８５歳で４７％まで増加する。結果として、６５才以上の人々の痴呆の症例全ての６０〜８０％はＡＤが原因である。罹患患者は認知機能及び記憶が悪化する。ＡＤのための適切な診断方法も有効な治療法もない。ＡＤの原因は不明であるけれども、遺伝的、免疫的、及び環境的因子がＡＤの悪化に関与している。ＡＤの顕著な特徴は、新皮質、海馬及び関連構造において老人斑及び神経原繊維変化並びに広範なニューロン損失があることである。老人斑は、ジストロフィー性神経炎、グリア、及びアストロサイトの輪に囲まれたβ−アミロイドコアを含む細胞外沈着物からなる。β−アミロイド沈着物は新皮質血管璧に存在する。老人斑の主要成分は、Ａβといわれる４ｋＤａペプチドであり、これは、より大きい１２０ｋＤａアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解的に切断される。斑の他の成分にはユビキチン、アミロイドＰ、アポＥ、インターロイキン−１、及びα−１−アンチキモトリプシンがある。ＡＤでのＡβ関与を支持する生化学的証拠に加えて、ＡＰＰとＡＤの間の関連を示唆する強力な遺伝的データがある。ＡＤに関与する遺伝子の位置に関する手がかりは、ダウン症候群の患者の分析から得られる。これらの患者では、染色体２１のトリソミーが原因でＡＤの早期発症が起る。ダウン症候群の患者の核型分析により、染色体２１の長腕の上部に含まれる遺伝子がマップできた。含まれる領域は、ＡＰＰ遺伝子を含む数個の遺伝子をコードする。ダウン症候群の患者のＡＤの早期発症（約３５歳）は、染色体２１の長腕上のしかるべき一つ又は複数のマーカーの遺伝子量の増加が大部分のＡＤ患者において観察される神経病状の原因であることを示唆している。ＡＤ症例の大部分は特発性であるようであるが、早期発症の家族性ＡＤ（ＦＡＤ）の幾つかの症例が報告された。ＦＡＤ家族の遺伝分析から、この病気は優性常染色体遺伝子欠陥として遺伝することが明確になり、この欠陥は、染色体２１の長腕にマップされ、ＡＰＰ遺伝子に密接に連関している。これらの知見はダウン症候群の患者の分析から得られた遺伝的データとも一致している。ＡＤの早期発症がＡＰＰ遺伝子のエキソン１７のアミノ酸７１７の変異（Ｖａｌ−Ｉｌｅ）の存在と厳密に連関しているＦＡＤの数家族も同定された。ＡＰＰの膜貫通ドメイン内の変異とＦＡＤとは分離の法則に従って遺伝する。ＡＰＰ７１７ＦＡＤの家族は異なる民族起源であるので（英国人、日本人、及びカナダ人）、ＡＤのこれらの症例でのＦＡＤ遺伝子の関与の証拠は強力である。この変異は、特発性ＡＤ患者、ダウン症候群患者、家族性ＡＤの晩期発症、及び更に早期発症のＦＡＤの他の大部分の症例における対照個人にはみられない。他のＦＡＤ家族でのＡＤ発症を説明できる、ＡＰＰ遺伝子の幾つかの更なる変異が同定された。異なる早期発症ＡＰＰ７１７ＦＡＤの５家族での遺伝的証拠により、これらのＦＡＤ家族のＡＰＰ７１７遺伝子がＡＤ進行の経路に直接関与するという仮説が強く支持される。ＡＰＰ遺伝子は約４００ｋｂの長さであり、細胞−細胞相互作用に関与する可能性のあるグリコシル化膜貫通タンパク質をコードしている。ＡＰＰ遺伝子は少なくとも１８エキソンを有し、択一的スプライシングによって少なくとも５種の異なるＡＰＰ転写物を作りだす。優勢な転写物は６９５、７５１、７７０アミノ酸のタンパク質をコードする（ＡＰＰのこれらの主要型はそれぞれ、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７b０と命名されている）。ＡＰＰ６９５の転写物は脳に多い。ＡＰＰ７５１ｍＲＮＡ種とＡＰＰ７７０ｍＲＮＡ種をコードする転写物は抹梢組織で優勢である。３種全てのアイソフォームは４２アミノ酸Ａβドメインを含む。ＡＰＰアイソフォーム７５１と７７０は、クニッツ型セリンプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）をコードする更なる５６アミノ酸インサートを含む。ＡＰＰは少なくとも２種の経路でタンパク質分解により代謝される。一つの経路は、ＡβドメインのＬｙｓ１６とＬｅｕ１７の間に位置するα−セクレターゼ開裂部位に拘わっている。この部位のタンパク質分解による開裂は、アミロイド性Ａβ本体の生成を防いでいる。第２の経路は、完全長のＡＰＰ分子のβ− とγ−セクレターゼ開裂部位でのタンパク質分解的開裂によって、完全な、アミロイド性Ａβ（３９−４２アミノ酸）を産生する。ＡＤ患者に見られるＡβ含有老人沈着物はまた、老人、及び非ヒト霊長類、北極熊、犬を含む他の老齢哺乳動物に見出される。しかし、実験ラットと実験マウスなどの他の老齢哺乳動物には通常Ａβ沈着物が見られない。これは、ヒトとマウスＡＰＰの間のβ−アミロイド配列に存在する３個のアミノ酸の差異が、マウスＡβが斑を形成するのを防止していることによるものであろう。ヒト病原に似た、安価な実験動物モデルがないので、ＡＤ神経病理の理解とＡＤに対する治療薬を開発することを難しくしている。トランスジェニック技術により、この問題の適切な代替策が得られる可能性がある。マウス中枢神経系でのキー領域に、高レベルのヒトＡＰＰ又はその成分を発現させる遺伝子構築物を加えると、ＡＤ表現型に似た神経病理的変化が起る可能性がある。トランスジェニック動物でヒトアミロイド前駆体タンパク質のセグメント又は完全長の野生型タンパク質を発現させようという試みが成功している。マウスにおいて、異なる野生型の、完全長及び端をとったＡＰＰｃＤＮＡアイソフォームの発現を記載した多数の報告がある（Kammesheidt ら、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci., 89，10857-10861；Sandhu ら、（1991）J.Biol.Chem.,266,21331-21334；Quon ら、（1991）Nature,352,239-241；Wirakら、（1991）Science，253，323-325； Kawabataら、（1991）Nature354,476-478；特許、国際公開ＷＯ93/02189、発明者 Neve,R.）。しかし、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルを造ろうとするこれらの今までの試みは本質的に失敗であった。マウス脳でヒトβＡ４を沈着させないようにする、トランスジェニックマウスでの内因性マウスＡＰＰ遺伝子の存在によって、上記の失敗が起った可能性がある。それ故、マウスアミロイド前駆体タンパク質を発現しないトランスジェニックマウスを提供することが本発明の目的である。本発明のトランスジェニックマウスは、中枢神経系及び他の組織でのＡＰＰ及びβ−アミロイドペプチドの in vi vo機能の測定に有用である。これらのマウスは、産生されたＡＰＰがヒト起源のものだけであるマウスの一系統を造るために、ヒトＡＰＰＦＡＤを発現しているトランスジェニックマウスと交配される。ＡＤにおけるＡＰＰの正確な役割は現在十分に理解されていない。ＡＤ及び他の神経疾患でのＡＰＰの生物学的重要性のために、ＡＰＰ遺伝子は、胚性幹（ＥＳ）細胞操作の重要な標的である。ＡＰＰ欠失トランスジェニックマウスの作製はＡＰＰの正常な役割を決定するのに助けとなり、ＡＰＰ欠失動物モデルを、ＡＰＰ活性を調節する種々のアプローチの設計と評価に使用させるであろう。このようなＡＰＰ改変トランスジェニックマウスはまた、細胞培養のための細胞源として使用されることができる。発明の概要本発明は、本来のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を欠失するトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病及び中枢神経系を含む疾患の研究において使用されることができる。図面の簡単な説明図１は、マウスＡＰＰ遺伝子のゲノム地図、一次ゲノムライブラリーから単離されたコスミドクローンの位置、異なるプローブ、コスミドクローンから作製されたサブクローンである。ｅｘ１：ＡＰＰ遺伝子のエキソン１。図２は、置換ベクターｐＨＺ０３８を使用する標的組換えによる、マウス染色体ＡＰＰ遺伝子の予測された改変である。ターゲティングベクター（ｐＨＺ０３８）は左から右に以下のものを含む：ＡＰＰ遺伝子座と５′相同性を有する１．４ｋｂ；ＡＰＰ遺伝子と反対方向に挿入されたＰＧＫｎｅｏ発現カセット；ＡＰＰプロモーター領域の３′部分に相同な７．１ｋｂフラグメント；及びＭＣ１−ＴＫ遺伝子。１．０ｋｂのＡＰＰプロモーターを含む３．８ｋｂ配列、第１のエキソン及び第１のイントロンの部分、が欠失された。内因性ＡＰＰ遺伝子とターゲティングベクターの相同性を、影をつけた長方形で表す。ベクターと野生型ＡＰＰ遺伝子座の間の標的組換えにより、ＡＰＰ遺伝子のプロモーターとエキソン１の欠失、続いて１．５ｋｂのｎｅｏコード配列による置換が起る。サザンブロット解析で使用したプローブは、１．０ｋｂのＸｂａＩ−ＢｇｌIIフラグメント（５′−プローブ）、０．８ｋｂのＢｇｌII−ＮｃｏＩフラグメント（３′−プローブ）であったが、両方ともターゲティングベクターとｎｅｏ配列の外部にある。野生型と標的ＡＰＰアレレを区別するためにＥｃｏＲＩを使用したが、それは、５′−プローブにより９．０ｋｂと６．５ｋｂのフラグメント、３′−プローブにより９．５ｋｂと９．０ｋｂをそれぞれ産生する。Ｒ：ＥｃｏＲＩ、Ｘ：ＸｂａＩ、Ｂ：ＢｇｌII、Ｎ：ＮｃｏＩ。Ｐｒ：マウスＡＰＰプロモーター、Ｅ１：マウスＡＰＰ遺伝子のエキソン１。ＰＧＫ：ホスホグリセレートキナーゼプロモーター。図３は、ＡＰＰノックアウトを有する４種の標的胚性幹（ＥＳ）クローンのサザンハイブリダイゼーション解析である。野生型ＡＢ２．１細胞と４種の陽性クローン（７６、１２３、１７４、１９６）からのＥＳ細胞ＤＮＡ（８μｇ）を、ＥｃｏＲＩで制限酵素消化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、Gene Screen Plus nylon membrane（NEN-Dupont ）に移し、５′ープローブ（標識ａ）、３′−プローブ（データは示さず）、ｎｅｏプローブ（標識ｂ）とハイブリダイズさせた。野生型の９．０ｋｂのフラグメントに加え、標的クローン全てで、６．５ｋｂの診断フラグメントを５′−プローブで検出する。ｎｅｏコード配列（ｂ）による同じフィルターのプロービングは、ｎｅｏ遺伝子は６．５ｋｂバンドに存在し、全てのクローンで唯一の挿入であることを示す。高分子量の他の２種のバンドは、親のＡＢ２．１細胞においてレトロウイルスによって導入された非機能性ｎｅｏ配列に対応する。図４は、ＡＰＰノックアウトのトランスジェニックマウスの尾のＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析である。ヘテロ×ヘテロ交配からのゲノムＤＮＡのサザン解析により、破壊されたＡＰＰアレレに関しホモ接合マウスを予定数得たことが分かる。ヘテロ接合マウスの交配から得た２週齢の仔の尾から単離されたゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、フィルター上にブロットし、５′−プローブとハイブリダイズさせた。＋／＋：野生型；＋／−：ヘテロ接合；−／−：ホモ接合ＡＰＰ欠失マウス。図５は、ノックアウトと野生型対照マウスにおけるＡＰＰ転写物の測定のためのノーザンハイブリダイゼーション解析である。予想されるように、ノックアウトマウスからの脳ＲＮＡではＡＰＰ発現が検出できなかったが、野生型対照動物とヘテロ接合動物はかなりの量のＡＰＰ活性を示した。野生型(＋／＋)、ヘテロ接合（＋／−）、ホモ接合（−／−）ＡＰＰマウスからの全ＲＮＡ（２０μｇ）を、ＲＮＡｚｏｌＢ方法（Biotecx Laboratories，Inc.）を用いて脳から単離し(各々のために２匹のマウス)、ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡプローブでプローブした。各ケースで示す下のパネルは、同量のＲＮＡが各レーンでロードされたことを示すために、マウスβ−アクチンｃＤＮＡとの対照ハイブリダイゼーションである。発明の詳細な説明本発明は、本来のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を欠失するトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明のトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病及び中枢神経系を含む疾患の研究において使用されることができる。３９ないし４３アミノ酸のβ−アミロイドペプチドは、アルツハイマー病の特徴の神経炎斑の主要成分である。β−アミロイドは、より大きなアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から誘導される。ＡＰＰｍＲＮＡは択一的スプライシングを受け、幾つかのアイソフォームを産生する。それらのアイソフォームは６９５〜７７０個のアミノ酸残基の範囲のタンパク質をコードする。これらのうち、ＡＰＰ６９５はニューロンで優勢に発現し、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０は試験した全ての組織で検出されることができる。５種の異なるタイプの点突然変異がヒトＡＰＰ遺伝子で現在同定されており、それらは、関係のない数家族で家族性早期発症アルツハイマー病の原因となる。これらの病気の家族は、ＡＰＰプロセシングとβ−アミロイドペプチドはアルツハイマー病進行に主要な役割を果たすという考えの最大の証拠である。ＡＰＰは脳で最も豊富なタンパク質の一つであり、β−アミロイドペプチドは健康人及びＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に分泌される。in vivoでのＡＰＰと β−アミロイドの機能ははっきりしない。ＡＰＰはin vitroで腺維芽細胞培養で生育因子として関わっている。β−アミロイドペプチドは、試験した細胞系列及びタンパク質製剤に依存して、ニューロン防御作用とニューロン毒性作用を有することが知見された。ＡＰＰのＮ末端部分のクニッツプロテアーゼインヒビタードメインは、タンパク質半減期の制御で役割を果たす可能性がある。本発明者らは、マウス発生と中枢神経系でＡＰＰの役割を評価するために、ＡＰＰ遺伝子を不活化することを望んだ。更に、ＦＡＤのマウスモデルを作製するために、ＡＰＰ欠失マウスはヒトＦＡＤタンパク質のアクセプターとして有用である可能性がある。マウスＡＰＰは、ヒトＡＰＰと比較すると全体として保存されているが、β−アミロイドドメインの３個の必須である可能性のあるアミノ酸残基において異なる。マウスＡＰＰ遺伝子はサイズが約４００ｋｂであり、少なくとも１８エキソンによってコードされている。マウスＡＰＰ遺伝子は、プロモーターとＡＴＧ翻訳開始コドンをコードする第１のエキソンを欠失させると、不活化された。マウスＥＳ細胞のＡＰＰ遺伝子を標的とするために、正と負の選別戦略を使用した。ターゲティングベクタ−ｐＨＺ０３８（図２）は、ＡＰＰ遺伝子の５′末端から得られる８．５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡをコードした。ＡＰＰプロモーターと第１のイントロンをコードする３．８ｋｂ配列をこのベクターから欠失させ、正の選択可能マーカーであるＰＧＫｎｅｏ（ネオマイシン−ホスホ−トランスフェラーゼ）で置換させた。ＭＣ１− ＴＫ（チミジンキナーゼ）カセット（図２でＨＳＶ−ＴＫと表示）を、負の選別のために、ベクターの末端に挿入した。ＥＳ細胞でターゲティングベクターとＡＰＰアレレの一つの間の正しい相同組換えにより、ＡＰＰ遺伝子とシグナルペプチドをコードするエキソン１が欠失するであろう。ターゲティングベクターをＡＢ２．１ＥＳ細胞にエレクトロポレーションで入れた。Ｇ４１８及びＦＩＡＵ耐性クローンをミニサザンプロトコルによってスクリーンした。５倍の濃縮が、ＦＩＡＵで細胞を選別することにより達成された。６個の標的クローンを同定し、ＡＰＰ遺伝子座での標的組換え対ランダム挿入の頻度は１／１６０であった（図３）。胚盤胞に注入した４種のクローンのうち２種（ｎｏ．７６及び１７４）が仔に標的ＡＰＰアレレを伝達した。破壊されたＡＰＰ遺伝子のホモ接合マウスを作製するために、ヘテロ接合交配を行った。これらの交配から得られたホモ接合ＡＰＰノックアウトマウスが期待頻度で得られた（図４）。これらのマウスは１４週齢まで正常で健康であるようである。プローブとしてＡＰＰ６９５ｃＤＮＡを使用して、脳から単離されたＲＮＡのノーザンブロット解析により、ＡＰＰｍＲＮＡは、標的アレレのホモ接合マウスで産生されないことが知見された。ＡＰＰｍＲＮＡレベルは、野生型対照と比較するとヘテロ接合マウスで約５０％減少した（図５）。本発明は、ＡＰＰ遺伝子の５′部分をコードするクローン化ＤＮＡを利用する。改変ＡＰＰ遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製する。天然の遺伝子の改変は修飾、欠失及び置換である。修飾、欠失及び置換は天然の遺伝子を非機能性にして、ノックアウト動物を作製できる。又は修飾、欠失及び置換により機能が改変されたＡＰＰを得ることができる。ヒトの病気の動物モデルの作製、及びＡＰＰ連関病気又は疾患の可能性ある治療のために、これらのトランスジェニック動物は薬剤アンタゴニスト又はアゴニスト研究用に重要である。本来のＡＰＰを欠失するトランスジェニック動物はＡＰＰの in vivo機能を特徴付けるのに有用である。ＡＰＰのノックアウトを有するトランスジェニック動物は、ＡＰＰを含む病気の非ヒトモデルの確立のために、そして in vivoとinvitro系でのＡＰＰ活性を区別するために、有用である。「動物」という用語は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含むものとして本明細書で使用し、また胚段階及び胎仔段階を含む全ての発生段階の個々の動物を含むものとする。「トランスジェニック動物」は、微量注入又は組換えウイルスの感染による方法などの、細胞下レベルでの意図した遺伝子操作により、直接的に、又は間接的に受取った遺伝情報を有する一つ以上の細胞を含有する動物である。この導入されたＤＮＡ分子は染色体内に挿入されたものでも、又は染色体外複製ＤＮＡであってもよい。「生殖細胞系列トランスジェニック動物」という用語は、遺伝情報が生殖細胞系列に導入され、子孫にその情報を移す能力を付与されたトランスジェニック動物を指す。このような子孫が事実、上記情報の一部又は全部を所有するならば、そのときその子孫もまたトランスジェニック動物である。遺伝子改変又は遺伝情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来であってもよく、特定のレシピエント個体のみにとって外来であってもよい。この場合、改変又は導入遺伝子は本来の遺伝子とは異なるように発現されよう。改変ＡＰＰ遺伝子は、宿主動物にとって本来のものと同一のＡＰＰを全部コードすべきではないし、その発現産物はわずかに又は大きく改変されるべきであり、又は全く欠失すべきである。しかし、よりわずかに改変されたＡＰＰ遺伝子も本発明の範囲内である。遺伝子導入のための標的細胞のタイプは胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、in vitroで培養された移植前胚から得られ、胚と融合できる(M.J.Evansら、 Nature292:154-156(1981)；Bradleyら、Nature309:255-258(1984);Gosslerら、P roc.Natl.Acad.Sci.USA83:9065-9069(1986);Robertsonら、Nature322,445-448(1 986))。移入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション、微量注入などの種々の標準的技術、又はレトロウイルス媒介トランスダクションによって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後非ヒト動物からの胚盤胞と一緒にすることができる。その後、導入されたＥＳ細胞は胚に移植され、得られたキメラ動物の生殖細胞系列になる可能性がある(R.Jaenisch,Science240:1468-1474(1988))。提案されたＡＰＰ機能は複雑なので、その機能は種々の方法で試験される必要がある。個々の遺伝子及びそれらの発現産物の寄与を測定するという問題への一つのアプローチは、単離した遺伝子を使用し、全能性ＥＳ細胞（本明細書で記載したものなど）で天然の野生型遺伝子を選択的に不活化し、トランスジェニックマウスを作製することである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作製での遺伝子標的ＥＳ細胞の使用は 1987年（Thomasら、Cell 51:503-512，(1987)）に記載され、ほかにレビューされている（Frohmanら、Cell56:145-147(1989)；Cap ecchi，Trends in Genet．5:70-76(1989)；Baribaultら、Mol.Biol.Med．6:481- 492(1989)；Wagner，EMBO J．9: 3025-3032(1990);Bradleyら、Bio/Technology 10:534-539(1992)）。染色体アレレの中に特定の変化を挿入するような標的相同組換えを使用して、所望の任意の変異になるように遺伝子領域を不活化させ、又は改変する技術が利用できる。しかし、１００％近い頻度で起る相同染色体外組換えと比較して、相同プラスミド−染色体組換えは１０^-6〜１０^-3の頻度でのみ検出されることが元々報告された（Linら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA82:1391-1395 (1985)；Smithies ら、Nature 317:230-234(1985)；Thomasら、Cell44:419-428( 1986);Song ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 6820-6824(1987))。非相同プラスミド−染色体相互作用はより頻度が高く、比較できる相同挿入より１０⁵倍（Lin ら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 82: 1391-1395(1985)）から１０²倍（Thomasら、Cell44:419-428(1986);Songら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 84:6820-6824(1987 )）大きいレベルで起る。マウスＥＳ細胞での標的組換えのこの低い割合を克服するために、まれな相同組換えを検出又は選別するために種々の戦略が開発された。相同改変を検出する一つのアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、相同挿入のための形質転換細胞のプールをスクリーニングし、次に個々のクローンをスクリーニングすることである（Kim ら、Nucleic Acid Res.16: 8887-8903(1988)；Ki m ら、Gene 103: 227-233(1991)）。あるいは、相同挿入が起るときのみ活性であるマーカー遺伝子を構築し、これらの組換え体が直接選択される、正の遺伝子選別アプローチが開発された(Sedivy ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:227-231(1989))。相同組換え体を選別するために開発された最も一般的なアプローチの一つは、改変の直接的選別が存在しない遺伝子（例えばＡＰＰ）のために開発された正−負選別（ＰＮＳ）法である（Ma nsourら、Nature336:348-352(1988)；Capecchi，Science 244: 1288-1292(1989) ；Capecchi，Trends in Genet.5: 70-76(1989))。ＰＮＳ法は、高レベルで発現されない標的遺伝子のためにより効率的である。何故ならば、マーカー遺伝子はそれ自身のプロモーターを有するからである。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用し、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）又はＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５ −ヨードウラシル）などのヘルペス薬剤で非相同挿入を選別することによって、非相同組換え体が選別される。この逆選別によって、生残っている形質転換体の中の相同組換え体の数を濃縮することができる。本明細書で使用する「標的遺伝子」又は「ノックアウト」（ＫＯ）は、上記の方法を含むがそれらに限定されないヒトの手によって、非ヒト動物の生殖細胞系列の中に導入されるＤＮＡ配列である。本発明の標的遺伝子は、同種の内因性アレレを特異的に改変するように設計されたＤＮＡ配列を含む。標的組換え法及び得られたノックアウトマウスを評価する方法は容易に入手でき、当業界公知である。このような方法には、標的アレレを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するための、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットがあるが、それらに限定されない。以下の実施例を例として記載するが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。実施例１マウス胚性幹細胞ゲノムライブラリーの調製胚性幹（ＥＳ）細胞における相同ゲノムターゲティングは、ゲノムＤＮＡの僅かの塩基対の差によって強く阻害される（＞１００×）ことを示唆する証拠があった（Riele ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5128-5132(1992)；Deng ら、 Mol.Cell.Biol.12:3365-3371(1992)）。この可能性のある問題を回避するために、次のＥＳ細胞ターゲティングに使用する遺伝子の単離のため、支持細胞層の無いところで生育したＥＳ細胞からゲノムライブラリーを構築した。 (Mudgettら、Genomics8:623-633(1990))に記載されたinsitu方法で、ＡＢ２．１細胞からゲノムライブラリーを構築した。コスミドベクターｓＣｏｓ−１を選択した。ベクターとインサートを脱リン酸化させるからである。このことにより、コンカンタマー生成が防止され、一般的に他のベクターで達成されるよりもより良好な量と質（パッケージ当たり最大５×１０⁶クローン）のゲノムライブラリーができる（Evans ら、Gene79:9-20(1989))。ゲノムライブラリーを、細菌宿主ＳＵＲＥを用いて構築した。ＳＵＲＥ宿主系列（Stratagene）を使用して、インダイレクトリピートを安定に維持し、メチル化ＤＮＡを単離できた。実施例２マウスＡＰＰコスミドクローンの単離とキャラクタリゼーションプローブとしてＡＰＰ遺伝子のプロモーターに位置する１．０ｋｂのＨｉｎｄ III−Ｐｖｕ IIフラグメントを用いて、実施例１の一次マウスコスミドライブラリーをスクリーンした(Izumi ら、Gene 112:189-195(1992)) 。ライブラリープレーティングとスクリーニングの条件は Sambrookら、“Molec ular Cloning: A laboratory Manual”Cold Spring harbor Press,(1989)に記載されている。約６×１０⁴クローンを、１５０ｍｍＮＺＹＤＴ／ａｍｐ（１００ μｇ／ｍｌ）プレート上にプレートした。合計１．２×１０⁶独立クローンをスクリーンした。偽陽性の機会を減少させるために、二重リフティングを使用した。異なるが相同の遺伝子と関連偽遺伝子を単離する機会を減少させるために、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を用いた。唯一の陽性クローンを同定し、更に二次、三次スクリーニングによって精製した。コスミドＤＮＡを、標準的条件を用いて調製した（Sambrookら、上記）。コスミドＤＮＡを異なる制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＨＨ５．０から単離された異なるプローブとハイブリダイズさせ(Izumi ら、Gene112:189-195(1992))、マウスＡＰＰ遺伝子のプロモーターとエキソン１と同様に境界部分をマップした（図１）。実施例３ＡＰＰ遺伝子ターゲティングベクターの構築制限部位、プロモーター及び第１エキソンに関するマウスＡＰＰ遺伝子のゲノム構成の知識（実施例２）から、ＡＰＰ遺伝子を不活化する遺伝子ターゲティングベクターを、標準的クローニング技術を用いて調製した（Sambrookら、上記）。ａ）エキソン１（ｅｘ１）の上流のＡＰＰコスミドクローンの５′部分の１．４ｋｂのＢｇｌ II−ＨｈｏＩフラグメント、コスミドクローンの３′部分の７ｋｂのＸｈｏＩ−Ｂｇｌ IIフラグメント、及びＢａｍＨＩ消化ｐＫＳベクターを使用する３ウエイ連結を行った。得られたプラスミドをｐＨＺ０３６と命名した。ｂ）プラスミドｐＨＺ０３６をＸｈｏＩで部分消化し、ＰＧＫｎｅｏの１．５ｋｂのＸｈｏＩ−Ｓａｌ IIフラグメントと連結させた。２種のＡＰＰフラグメント間に挿入されたネオを有する連結産物を選択し、ｐＨＺ０３７と命名した。ｃ）ｐＫＳ−ＴＫからの２ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを、ＳａｌＩ消化ｐＨＺ０３７ベクターに挿入した。得られたプラスミドｐＨＺ０３８は、マウスＡＰＰ遺伝子のターゲティングのための完全な構築物である。実施例４マウスＥＳ細胞のＡＰＰ遺伝子の標的破壊ＡＰＰ遺伝子破壊実験に使用したターゲティングベクターは実施例３のｐＨＺ０３８ベクターであった。ＡＰＰ遺伝子ノックアウト（ＡＰＰＫＯ）を作製するために、このベクターを野生型ＡＰＰアレレと再結合させると、プロモーター、ＡＴＧ翻訳開始コドンをコードするエキソン１及びシグナルペプチドが欠失した（図２）。ＴＫカセットの末端に結合したｐｋｓ配列を残して、プラスミドを線状化させるためにＮｏｔＩで消化したｐＨＺ０３８を用いて、マウス胚性幹細胞系列ＡＢ２．１にエレクトロボレーションを行った。ＡＢ２．１ＥＳ細胞全部を、上記のようにＳＮＬ支持細胞上で培養した（Robertson,Teratocarcinomas and embryonic stem cells, IRL Press,pp.71-112(1987)）。Bio-Rad Gene Pul serを用いてＰＢＳ緩衝液０．８ｍｌ中の１×１０⁷ＥＳ細胞と線状化ベクター２５μｇを使用して２３０ｖ、５００μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの２４時間後、ＥＳ細胞形質転換体を、抗生物質ゲネチシン（Gibco G418:活性 G418200 μg/ml）で選別し、幾つかの形質転換体を、相同組換え体の増強のため４８時間後にＦＩＡＵ(Bristol Myers Squibb; 0.4μＭ)で逆選別をした。マウス白血病阻害因子(LIF;ESGRO,Gibco BRL,Inc.)を２００Ｕ／ｍｌで使用した。ＦＩＡＵでの選別により、Ｇ４１８選別だけに比較して約５倍少ないコロニーを得て、標的形質転換体の単離を増強した。Ｇ４１８とＦＩＡＵ耐性ＥＳクローンを単離し、生育させ、ミニーサザンプロトコル（Ramirez-Solis,R.ら、Anal.Biochem.201:3 31-335,1992）で解析した。合計６個の標的クローンを、解析した２００個の二重耐性コロニーから同定した。それ故、ＡＰＰ遺伝子座の標的組換え対ランダム挿入の頻度は１／１６０である。５′−、３′−、及びｎｅｏプローブを使用する標的クローンの詳細なサザンブロット解析により、ＡＰＰ遺伝子内とＡＰＰ隣接領域の両方で期待された挿入パターンであることが知見された。標的組換え以外の挿入は検出できなかった。実施例５ドナー胚盤胞へのＡＰＰＫＯクローンの注入ＡＰＰが破壊されたことを確認するために、ＡＰＰ標的ＡＢ２．１細胞系列の全てをサザンハイブリダイゼーション解析でキャラクタリゼーションした。それから正常に生育し、異常な分化細胞（Robert son，上記）を含まない標的細胞系列を、トリプシンで細胞培養物を処理し、支持細胞を約３０分結合させ、末結合のＥＳ細胞を得ることによって、支持細胞から分離した。ＥＳ細胞を、レシピエントの胚盤胞に注入した。４種のＡＰＰ標的ＥＳクローン（７６、１２３、１７４、１９６）を、上記技術（Bradley,A．“P roduction and analysis of chimericmice.In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach”，E.J.Robertson編、Oxford:IRL Press(1 987),pp.113-151）を用いて別々の実験でＣ５７ＢＬ／６Ｊレシピエント胚盤胞に注入した。注入されたＣ５７ＢＬ／６Ｊレシピエント胚盤胞を３日偽妊娠Ｔａｃ：ＳＷ（ｆＢＲ）マウスの子宮に再移植し、期間が来るまで発育させた。仔を初めはコートの色のキメラでスクリーニングした。アグーチ色（ＥＳ細胞バックグラウンド系である）はＥＳ細胞キメラの指標である。ＡＰＰターゲティングを、これらのマウスから得た尾のサンプルから単離したゲノムＤＮＡで行ったサザンハイブルダイゼーション解析で確認した。ＡＰＰ標的系列の注入により、１２匹のオスのキメラと１匹のメスのキメラを得た。キメラの頻度は２０％〜１００％であった。ＥＳ細胞系列ＡＢ２．１はアグーチ（Ａ）コート色遺伝子に関しホモ接合であるので、注入されたＣ５７ＢＬ／６胚盤胞（黒コート色）中へのＥＳ細胞の浸透は、キメラのコート色のマウスを生じる。実施例６キメラマウスの育種キメラコート色マウスを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（黒コート）と１２９／Ｊ（アグーチコート）メスマウスと交配させた。もしキメラのオスが、その生殖細胞系列に導入されたＥＳ細胞遺伝物質を有するならば（アグーチは黒コート色に対し優性である）、キメラ×Ｃ５７ＢＬ／６交配の仔の何匹かはアグーチであることが期待された。キメラ×１２９／Ｊ交配ではアグーチマウスのみを得るであろう。破壊されたＡＰＰアレレを含むＥＳ細胞遺伝情報をその仔に転移させるために、これらの交配を行った。クローン７６と１７４の両方からの３匹のオスキメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスと交配させたとき、アグーチの仔を得た。ＡＰＰ遺伝子型を決定するために、約２週齢の各マウスから採った約１ｃｍの尾から、ゲノムＤＮＡを精製した。ゲノムＤＮＡを上記の通り精製し（Laird ら、上記）、フェノール：クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿させた。サザンハイブリダイゼーション解析（実施例５に記載）を使用し、破壊されたＡＰＰアレレを含む仔を同定した。これらのトランスジェニック仔はＡＰＰ破壊に関しヘテロ接合であった。トランスジェニックヘテロ接合マウスと非トランスジェニックマウスの両方のゲノムＤＮＡ（尾）をＥｃｏＲＩで消化し、トランスジェニックＡＰＰ構造を確認するために５′隣接ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。サザンハイブリダイゼーション解析により、改変ＡＰＰアレレの構造は、ＡＰＰ標的ＥＳクローンで予測し、以前にキャラクタリゼーションを行ったものと同一であることを確認した。実施例７ヘテロ接合マウスの育種及びホモ接合ＡＰＰ欠失マウスの作製各々が改変ＡＰＰアレレの１コピーを含むオスとメスのトランスジェニックマウス（ヘテロ接合マウス）を互いに交配させて、ＡＰＰの両方のコピーが標的、改変ＡＰＰアレレをコードするマウスを作製した。マウス胚の１／４が、改変ＡＰＰ遺伝子に関しホモ接合であることが予測された。生存仔の遺伝子型分類を、上記のようにサザンハイブリダイゼーションで行った（図４）。８７匹の仔マウスのうち２１匹（２４％）がホモ接合ＡＰＰ−／−であり、３０匹（３４％）が野生型ＡＰＰ＋／＋であり、３６匹（４１％）がヘテロ接合ＡＰＰ＋／−であることを決定した。これらの数は、２週齢で生存するＡＰＰ欠失トランスジェニックマウスの数において顕著な減少はないことを示している。実施例８ホモ接合ＡＰＰ欠失マウスのキャラクタリゼーション実施例７の生存するホモ接合ＡＰＰ欠失マウスが生殖能力を有するかどうかを決定するために、それらを野生型又はヘテロ接合体と交配させた。試験した全てのホモ接合ＡＰＰ−／−オスとメスは生殖能力を有した。ＡＰＰ欠失マウスと野生型又はヘテロ接合マウスの間の全体的形態又は組織の顕著な差は観察されなかった。実施例９ノーザン解析によるＡＰＰ不活化の確認脳全ＲＮＡを、野生型、ヘテロ接合及びホモ接合ＡＰＰＫＯマウスから調製した。プローブとしてＡＰＰ６９５ｃＤＮＡを使用する標準的方法により、ノーザンハイブリダイゼーションを行った（図５）。２匹のホモ接合ＡＰＰノックアウトマウスでＲＮＡは検出されなかった。実施例１０細胞培養本発明のトランスジェニック動物を、細胞培養の細胞源として使用できる。ＡＰＰ遺伝子欠失脳組織の細胞を、標準的技術を用いて培養できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チエン，ハワード・ワイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者トラムバウアー，マーナ・イーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フアン・デル・プルーフ，レオナルドウス・ハー・テーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．体細胞及び生殖細胞が、マウスアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子を欠失するトランスジェニック動物。２．動物がマウスであることを特徴とする請求項１に記載のトランスジェニック動物。３．マウスが生殖能力を有し、改変アミロイド前駆体タンパク質遺伝子をその仔に伝達できることを特徴とする請求項２に記載のマウス。４．改変胚性幹細胞のマウス胚盤胞への微量注入によって、改変アミロイド前駆体タンパク質遺伝子が、胚段階で親マウスから除去されていることを特徴とする請求項２に記載のマウス。５．改変胚性幹細胞のマウス胚盤胞への微量注入、又は改変胚性幹細胞の受精卵もしくは桑実胚との共インキュベーションによって、改変アミロイド前駆体タンパク質遺伝子が、胚段階でマウスに導入されていることを特徴とする請求項２に記載のマウス。６．体細胞及び生殖細胞が、マウスアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子を欠失するマウスの作製方法であって、（ａ）マウス胚性幹細胞のアレレを標的とするように設計されたＡＰＰの改変型をコードする遺伝子を提供すること；（ｂ）マウス胚性幹細胞に改変遺伝子を導入すること；（ｃ）改変遺伝子を含む胚性幹細胞を選別すること；（ｄ）改変ＡＰＰ遺伝子を含む胚性幹細胞をマウス胚盤胞に注入すること；（ｅ）注入された胚盤胞を偽妊娠マウスに移植すること；及び（ｆ）胚を期間まで発育させ、親のトランスジェニックマウスを作製すること；を含むことを特徴とする方法。７．ステップ（ｄ）の導入が微量注入によるものであることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．（ｇ）キメラのトランスジェニックマウスを野生型マウスと交配させ、ヘテロ接合（Ｆ１）マウスを得ること；及び（ｈ）ホモ接合（Ｆ２）ＡＰＰトランスジェニックマウスを作製するために、ヘテロ接合（Ｆ１）マウスを交配させること；のステップを更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。９．請求項１に記載のトランスジェニック動物由来の細胞系列。１０．ＡＰＰプロモーター領域にわたるゲノムマウスコスミドクローン。