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JP2000501416A - Methods of treatment and drug screening to treat and prevent neuronal disease - Google Patents

Methods of treatment and drug screening to treat and prevent neuronal disease

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JP2000501416A
JP2000501416A JP9538713A JP53871397A JP2000501416A JP 2000501416 A JP2000501416 A JP 2000501416A JP 9538713 A JP9538713 A JP 9538713A JP 53871397 A JP53871397 A JP 53871397A JP 2000501416 A JP2000501416 A JP 2000501416A
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naip
neurons
iap
levels
cells
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Pending
Application number
JP9538713A
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Japanese (ja)
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ロバート ジー． コーネラック
アレクサンダー イー． マッケンジー
ジョージ エス． ロバートソン
ディー．ジー． エックスユー
エス．ジェイ． クロッカー
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University of Ottawa
Original Assignee
University of Ottawa
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 NAIDおよびIAPポリペプチドは、虚血、神経変性症状、および軸索切断によって起こるニューロン細胞死を防止する。本発明は、細胞死を防止することによって、神経を防御するための方法、ならびに神経を保護する治療的化合物を同定するためのキットおよび方法を提供する。   (57) [Summary] NAID and IAP polypeptides prevent neuronal cell death caused by ischemia, neurodegenerative symptoms, and axotomy. The present invention provides methods for protecting nerves by preventing cell death, as well as kits and methods for identifying therapeutic compounds that protect nerves.

Description

【発明の詳細な説明】ニューロン病を治療し予防するための、治療法および薬物のスクリーニング法 本発明の分野は、ニューロン細胞死である。 発明の背景 ニューロン細胞死は、外傷性傷害、虚血、変性病（例えば、パーキンソン病、 ALS、またはSMA）、または組織の成長および維持の正常な過程の一部としてなど 、さまざまな状態が原因となって起こりうる。 本発明者らは、以前、NAIPおよびIAP蛋白質を発見した（参照として組み入れ られるUSSN 08／511,485;08／576,956;および60／017,354を参照）。これらの蛋 白質は、アポトーシスの調節にも関与する。 発生過程における細胞死、すなわちアポトーシスは、自然におこる過程で、中 枢神経系（CNS）の発達において適正なニューロンの結合を確立する上で重要な 役割を果たすと考えられている。アポトーシスは、クロマチンが凝縮した後、細 胞本体が萎縮するという形態学的特徴を有する。生化学的には、アポトーシスの 顕著な特徴は、Ca2+／Mg2+依存的なエンドヌクレアーゼによって触媒されて、核 のDNAが、ヌクレオソーム断片（180塩基対の倍数）に分解されるということであ る。細胞死が起こる前にDNAが梯子状に分解されるが、これが、細胞死をもたら す上で主要な現象であるかもしれない。この考えに符合して、DNAの断片化を阻 害する薬剤は、アポトーシスを阻害する。但し、アポトーシスを示す形態は、核 DNAを分解する酵素によって生み出される。アポトーシスは、細胞死を起こして いる細胞内における、細胞死経路の活性化を示唆する、RNAおよび蛋白質の合成 にしばしば依存する。最も明確に定義された遺伝子的な細胞死の経路は、線虫、 カエノルハブディティス（Caenorhabditis）の経路であり、２つのエフェクター （ced-3とced-4）、およびリプレッサー（ced-9）遺伝子が単離されている。同 様の遺伝子が、哺乳動物でも同定されている。このような例の一つは、がん原遺 伝子bcl-2で、ced-9の哺乳動物における相同遺伝子であると考えられている。Bc l-2の過剰発現により、さまざまな広範な有害処理による損傷効果に対してニュ ーロンの抵抗性が付与されることが明らかになっている。しかし、成体の脳で検 出されるBcl-2のレベルが非常に低いことから、成熟したCNSでは、アポトーシス の防止において別 の蛋白質がより重要な役割を果たしていることが示唆される。 棘筋萎縮（SMA）は、脊髄および脳幹における運動ニューロンの重度の枯渇と いう特徴を有する、遺伝的な神経変性障害である。SMAの脊髄の剖検で観察され た多くの運動ニューロンは、アポトーシスと合致する染色質溶解などの特徴を示 す。脊髄の成熟過程で、50％もの運動ニューロンがアポトーシスを受ける。この ため、ニューロンのアポトーシス経路における遺伝的な欠損が、SMAの運動ニュ ーロンの枯渇に関係するかもしれないと考えられるようになった。最近になって 、２つの候補遺伝子、すなわち、生存運動ニューロン（smn）およびニューロン アポトーシス阻害蛋白質（naip）が同定された。naip遺伝子の産物は、ウイルス によって誘導されるアポトーシスを阻害する２つのバキュロウイルス蛋白質（Cp -IAPおよびOp-IAP）間との配列相同性から、ニューロンアポトーシス阻害蛋白質 （NAIP）と名付けられた。 パーキンソン病（PD）は、脳幹神経節におけるドーパミン（DA）の重度の枯渇 をもたらす黒質線状体ニューロンの消失によって特徴づけられる、進行性の神経 変性障害である。カテコールアミン特異的な神経毒6-ヒドロキシドーパミン（6- OHDA）によって作出された、黒質線状体経路の片側に傷害を有するラットは、PD の動物モデルとして役立つ。前脳側の内側、または黒質の緻密部［pars compact ］の中への6-OHDAの片側注入は、黒質線状体経路の急速な変性をもたらす。しか し、線条への6-OHDAの注入は、自然のPDの病理（Sauer and Oertel，1994）に、 より近似すると考えられている、黒質線状体経路の進行性の変性（＞１週間）を 生み出す。PD変性を防止するための良い治療法は、今のところ存在しない。 癲癇は、脳発作という特徴を有し、しばしば、ニューロン細胞死を引き起こす 。事前に刺激されたラット、すなわち、毎日低度の電気的刺激を与えることによ って「癲癇」となったラットは、未処理のラットと比較すると、カイニン酸によ って誘導される癲癇状態から起きる脳損傷はかなり少ないことが観察されている 。癲癇状態（SE）は、連続的な電位記録、および／または30秒以上の一定の間隔 で起きる行動による発作によって特徴づけられる。未処理の、刺激を与えていな いラットでは、この状態は、最終的に、いくつかの脳領域における重度のニュー ロンの損傷をもたらす。未処理のラットで観察されるのと同じくらい重度のSEの 状態を経験しているにもかかわらず、刺激された「癲癇」ラットは、最小限のニ ューロン消失のみを示す。経験によって誘導されるこの神経防御に関するメカニ ズムを決定することにより、SEだけでなく、発作などの神経学的外傷によって起 こる脳損傷の改善への新しい方法が提供されるかもしれない。 虚血は、CNSへの血流が阻止されたとき、結果的に起きる。これは、外傷性の 傷害、および発作の後にしばしば起こることである。細胞死がよく起こる。血流 の阻害がCNSの広範な領域にもたらされるか、または長い時間続くと、生き残る ために必要な神経学的な機能の消失により死が起こる。しかし、CNSへの血流が 一過性的に阻止され、数分内に再循環が確立したときには、脳の一定のニューロ ンだけが死ぬ。 虚血による部分的なニューロン死の最高の実験モデルは、４血管閉塞モデルで ある。この脳虚血の包括的なモデルにおいては、新皮質層３、５、および６'に おけるニューロン層、小型および中型の線条体ニューロン、および海馬CA1錐体 ニューロンが、中でも最も傷つきやすい（Pulsinelli et al.，Ann．Neurol．11 :491-498，1982）。これに対し、線条体のコリン作用性介在ニューロン、および 海馬のCA3錐体ニューロンは、一過性の全体的虚血の損傷効果に対して、より抵 抗性である（Francis and Pulsinelli，Brain Res．243:271-278，1982）。 発明の概要 本発明者らは、用いられるNAIPおよびIAPポリペプチドのレベルが上昇すると 、神経防御がもたらされ、ニューロン再生が可能になることを発見した。 本発明者らは、NAIPレベルの上昇は、正常な場合にはニューロン細胞死をもた らす、さまざまな条件下におけるニューロンの生存数に比例することに気づいた 。さらに、NAIPおよびIAPのレベルを上昇させると、軸索切断後の軸索の再成長 が可能になる。 これらをまとめると、NAIPおよびIAPが、虚血性損傷、およびニューロン変性 に対する抵抗性の付与と、ニューロン修復において重要な役割を果たしているこ とがこれらの発見から示される。したがって、本発明者らの発見は、ニューロン 損傷を防止し、およびニューロン修復するための方法、ならびに神経防御および 神経再生化合物をスクリーニングする方法を提供する。 本発明は、次のように要約される。 ２つの主要な局面において、本発明は、神経系の細胞死を阻害するための方法 、および／またはニューロン再生を促進するための方法を提供する。本方法には 、NAIPまたはIAPからなる群より選択されるポリペプチドの生物学的活性を上昇 させること（例えば、本明細書において説明されている神経防御効果）が含まれ る。虚血状態に置かれた細胞または置かれる可能性の高い細胞の中でのこの増加 は、正常な場合には少なくともある程度の神経細胞死の原因となる現象の後に、 細胞が生き残る可能性を20％以上上昇させるのに十分であれば、本発明の一部を なす。いくつかの態様において、このポリペプチドは、哺乳動物のNAIP、HIAP、 HIAP2、またはXIAPである。最も好ましくは、このポリペプチドはNAIPである。 好ましい態様の一つにおいて、このポリペプチドは、カルボキシ末端部位を欠失 したNAIPポリペプチドである。関連する態様において、神経細胞はCNSであり、 最も好ましくは、この細胞虚血性細胞死に感受性であることが知られているニュ ーロン細胞である。 別の態様において、この増加は、発現可能な遺伝子構築物におけるNAIPまたは IAPポリペプチドをコードするトランスジーンの投与による。このトランスジー ンは、さまざまなタイプのプロモーター、例えば、構成的なプロモーター、神経 系プロモーター、または制御可能なプロモーターを含む構造になっていてもよい 。 トランスジーンは、例えば、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベク ター、またはポリオウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。 好ましい態様において、トランスジーンは、本明細書において提供されている参 照において説明されているアミノ酸配列の少なくとも一つに実質的に同一なアミ ノ酸配列を含むNAIPまたはIAPをコードしており、このトランスジーンは、虚血 現象が起きる領域で（好ましくは、頭蓋内から）哺乳動物に投与され、トランス ジーンは、ウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ア デノ関連ウイルス、またはポリオウイルス）の中に含まれ、また、虚血は、外傷 性傷害、発作、心筋梗塞、または小発作が原因となる。 別の態様において、本発明には、虚血現象、神経変性、または軸索切断（例え ば、それぞれ、発作、パーキンソン病、または外科的損傷）を体験したことがあ る、または経験する危険性が高まっている哺乳動物を治療する方法で、哺乳動物 に、細胞死を阻害し、および／または再生させるのに十分な量のNAIPまたはIAP を投与することを含む方法が含まれる。さらに、本発明は、生理学的に許容され る担体に処方された、活性成分としてNAIPまたはIAPを含む治療的組成物を特徴 とする。 さらに別の態様において、この増加は、NAIPまたはIAP（例えば、HIAP1、HIAP 2、またはXIAP）を直接投与することにより、またはNAIPもしくはIAPの生物学的 活性を上昇させることが分かっている分子（例えば、K252以外のK252様アルカロ イド、ATP相同体、またはスタウロスポリン様化合物）を投与することによって もたらされるかもしれない。 本方法は、虚血現象を起こしたことがあると診断された患者、それが疑わしい 患者、または虚血、変性病、もしくは軸索損傷に対する素因を持っていると診断 された患者を治療するために用いてもよい。本発明の治療法において、最も好ま しいのは、虚血、変性、または損傷に対する素因が初めて検出されたらすぐに、 治療用分子を提供することである。なお、虚血効果をもたらす現象が起きてから 72時間以内に提供されてもよい。変性または損傷の場合、最初に病状が検出され たのちかなり時間がたっても有益な効果が得られるかもしれない。 本アッセイ法のいくつかの態様において、細胞は、ニューロン細胞またはグリ ア細胞のような関連のある細胞であり、この細胞は、哺乳動物（例えば、マウス ）の細胞または培養中の細胞である。 別の２つの関連する局面において、本発明は、NAIPまたはIAPを調節する化合 物または神経防御もしくは神経再生効果を模倣する化合物を同定する方法を特徴 とする。これらの方法は、神経防御および神経再生のための治療剤を同定するた めに用いられるかもしれない。第一の方法には、NAIPまたはIAP遺伝子mRNA、ま たはポリペプチドの発現もしくは安定性を上昇させることができる調節的な化合 物を同定することが含まれ、（a）NAIPまたはIAPを発現する細胞を提供すること 、および（b）細胞を候補化合物に接触させ、候補化合物に接触させた後に、NAI PもしくはIAP mRNA、または蛋白質の発現を上昇させたものにおいて、調節的な 化合物を同定することが含まれる。第二の方法には、NAIPまたはIAPの生物学的 活性を上 昇させることができる調節的な化合物を同定することが含まれ、（a）NAIPまた はIAPを発現する細胞を提供すること、および（b）細胞を候補化合物に接触させ 、その後、NAIPまたはIAPの発現が減少したものにおいて、調節的な化合物を同 定することが含まれる。また、好ましくは、本方法には、細胞死に感受性の細胞 （好ましくは、培養ニューロン細胞）に化合物を接触させて、化合物の存在下で 神経細胞死のレベルをモニターすることが含まれる。細胞死が減少すれば、神経 防御または神経再生用化合物として大いに有望な化合物であることを示している 。当業者が評価できるところは、当業者に既知で、この目的のために容易に応用 することができる無細胞系と固相状態でのアッセイ法とを用いても、NAIPまたは IAPの生物学的活性の上昇が達成されうることである。 ２つの方法の好ましい態様において、NAIPもしくはIAP遺伝子、またはNAIPも しくはIAPは、本明細書が提供する参照において説明されているアミノ酸配列の 一つ（カルボキシ末端が欠失したNAIP）と実質的に同一のアミノ酸配列をコード しているか、または含んでいる。また、候補化合物は、化合物のバンクから選択 されてもよく、またはより好ましくは、K252様化合物、スタウロスポリン様化合 物、ATP相同体、もしくは成長因子様化合物（例えば、神経栄養性化合物）であ る。 関連する局面において、本発明は、虚血現象を体験したことがあるか、または それを受ける危険性が高まっている哺乳動物を治療する方法を特徴とし、細胞死 を阻害するのに十分な量の調節化合物を患者に投与すること含む。好ましくは、 調節化合物は、NAIPまたはIAP遺伝子の発現を増加させることによって作用する 。 上記の方法を実施するためのキットも、本発明に含まれる。このようなキット は、好ましくは、特異的にNAIPまたはIAPを認識して結合する実質的に純粋な抗 体を含み、また、抗体結合を検出し定量するための方法を含んでいてもよい。ま たはこのキットは、ハイブリダイゼーションをするという目的に有用な、NAIPま たはIAPの塩基配列の全部または断片を含むかもしれず、また、NAIPまたはIAPRN Aのハイブリダイゼーションを検出し定量するための方法を含むかもしれない。 さらに別の態様において、このキットは、NAIPまたはIAP発現をモニターするた めの細胞系、または無細胞系を含んでいるかもしれない。また、キットは、神経 防御用化合物または神経再生用化合物の検出の判定を可能にするのに充分な使用 説明書 が含まれているかもしれない。 「NAIPまたはIAP」とは、バキュロウイルスのアポトーシス阻害因子に相同な アミノ酸配列を意味する。例えば、NAIP、欠失NAIP、HIAP1、HIAP2、およびXIAP が、特に含まれる（1995年８月４日に提出されたUSSNの08／511,485；1995年12 月22日に提出されたUSSNの08／576,956；1997年１月17日に提出されたPCT／IB97 ／00142）。好ましくは、このようなポリペプチドは、本明細書に提供される参 照において説明されているNAIP、欠失NAIP、HIAP1、HIAP2、またはXIAPのアミノ 酸配列の少なくとも一つに、少なくとも45％、好ましくは60％、最も好ましくは 85％、さらには95％同一なアミノ酸配列を有する。 「実質的に同一な」ポリペプチド配列とは、保存的なアミノ酸置換、例えば、 一つのアミノ酸を、同じクラスの別のアミノ酸に置き換えること（例えば、バリ ンをグリシンに、アルギニンをリシンになど）によってのみ異なるアミノ酸配列 、またはポリペプチドの機能を損なわないような（例えば、本明細書において説 明されているようにして測定された）アミノ酸配列の位置に起きた、一つ以上の 非保存的な置換、欠失、または挿入によって異なるアミノ酸配列を意味する。 好ましくは、このような配列は、本明細書に提供されている参照で説明されて いる配列に、アミノ酸レベルで、少なくとも85％、より好ましくは90％、最も好 ましくは95％同一である。ポリペプチドについては、比較する配列の長さは、一 般的に、少なくとも15アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好まし くは少なくとも25アミノ酸、最も好ましくは少なくとも35アミノ酸であろう。 同一性は、典型的には、配列解析用ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン州 53705、マディソン市、ユニバシティー・アベニュー1710、ウィスコンシン大学 バイオテクノロジーセンター、ジェネティクス・コンピュータ・グループの配列 解析用ソフトウェアパッケージ）を用いて測定される。このようなソフトウェア は、さまざまな置換、欠失、置換、およびその他の変更に対する同一性の程度を 指定することによって、類似した配列を比較する。保存的な置換は、典型的には 、以下のグループの中での置換を含む。すなわち、グリシン、アラニン；バリン 、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ ルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン 、 チロシン。 「蛋白質」または「ポリペプチド」とは、長さ、または翻訳後修飾（例えば、 グリコシル化、またはリン酸化）に関わらず、アミノ酸のいかなる鎖も意味する 。 「実質的に純粋な」とは、重量（乾燥重量）で、少なくとも60％が、目的の化 合物、例えば、NAIPもしくはIAP、またはNAIPもしくはIAP特異的な抗体である調 製物を意味する。好ましくは、この調製物は、重量で、少なくとも75％、より好 ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％が、目的の化合物であ る。適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動、またはHPLC解析などによって、純度を測定することができる。 「生物学的活性の増加」とは、関連する遺伝子の転写の増加、関連するmRNAの 翻訳、関連するRNAの安定性の増加、安定性を増加させるためのポリペプチドの 改変、例えば、本明細書で提供されているアッセイ法における、神経防御活性ま たは神経再生活性の促進、およびポリペプチドを安定させる化合物の投与を意味 する。 「精製されたDNA」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中で隣 接する２つのコーディング配列に（一つは5'末端に、および一つは3'末端に）隣 接していないDNAを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに 組み込まれた組換えDNA、自律複製するプラスミドもしくはウイルスに組み込ま れた組換えDNA、または真核生物または原核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換 えDNAが含まれ、または他の配列から独立した別個の分子として存在する（例え ば、cDNA、またはPCRもしくは制限酵素処理によって作出されたゲノムDNA断片） 組換えDNAが含まれる。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリ ッド遺伝子の一部である組換えDNAも含まれる。 「実質的に同一」な核酸とは、保存的なアミノ酸置換、例えば、一つのアミノ 酸を、同じクラスの別のアミノ酸に置き換えること（例えば、バリンをグリシン に、アルギニンをリシンになど）によってのみ異なるポリペプチドをコードする 塩基配列、またはポリペプチドの機能を損なわないような（例えば、本明細書に おいて説明されているように測定された）アミノ酸配列の位置に起きた、一つ以 上の非保存的な置換、欠失、または挿入によってのみ異なるポリペプチドをコー ドする塩基配列を意味する。好ましくは、コードされる配列は、本明細書によっ て提供されているNAIPまたはIAPの配列の少なくとも一つに、アミノ酸レベルで 、少なくとも45％、より好ましくは60％、最も好ましくは85％同一である。塩基 配列を比較するのであれば、「実質的に同一」な塩基配列は、本明細書で参照さ れているNAIPまたはIAPの配列に、少なくとも85％、より好ましくは90％、およ び最も好ましくは95％同一な配列である。比較する塩基配列の長さは、一般的に 、少なくとも50塩基、好ましくは少なくとも60塩基、より好ましくは少なくとも 75塩基、最も好ましくは110塩基であろう。ここでも、相同性は、典型的には、 配列解析用ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン州53705、マディソン市、ユ ニバシティー・アベニュー1710、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンタ ー、ジェネティクス・コンピュータ・グループの配列解析用ソフトウェアパッケ ージ）を用いて測定される。 「発現のために置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写および翻訳を指 令する（すなわち、NAIPまたはIAP蛋白質の産生を促進する）DNA配列に隣接して 置かれていることを意味する。 「精製された抗体」とは、重量で、少なくとも60％、抗体が自然には結合して いる蛋白質および天然の有機分子を含まない抗体を意味する。好ましくは、この 調製物は、重量で、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ま しくは少なくとも99％が抗体である。 「特異的に結合する」とは、NAIPまたはIAPを認識して結合するが、NAIPまた はIAPを自然に含む試料（例えば、生物学的試料）の中で、実質的に他の分子を 認識し結合することのない抗体を意味する。NAIPまたはIAPに「特異的に結合す る」抗体は、当業者にとって利用可能な標準的免疫学的技術（例えば、ウェスタ ンブロッティングまたは免疫沈降）を一つ以上用いて、そのような生物学的試料 におけるNAIPまたはIAP蛋白質産物を検出するのに十分である。 「虚血」とは、正常な場合よりもずっと速く細胞性無酸素症を引き起こし、細 胞死をもたらす、血流の破壊を意味する。ほとんどの虚血は、血流が一部、また は完全に失われた結果起こる。本発明による虚血は、好ましくは、CNSの細胞の 虚 血であり、最も好ましくはCNSのニューロン細胞の虚血である。 「野生型の試料に較べて」とは、（a）動物の非虚血領域から採った等価的な 組織試料に較べるか、または（b）培養細胞の非虚血細胞に較べることを意味す る。 「免疫学的方法」とは、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、および直接的 かつ競合的なELISAおよびRIA技術を含むが、これらに限定されない、抗体を基に した検出技術を含むアッセイ法を意味する。 「検出のための手段」とは、目的の現象が検出されたことを十分に示す、一つ または一組の構成要素を意味する。このような手段には、放射能、蛍光、および 化学発光標識などを含むが、これらに限定されない、測定し観察することができ る、少なくとも一つの標識が含まれる。 「NAIPまたはIAP RNA」とは、NAIPまたはIAPのDNA配列から転写されるメッセ ンジャーRNAを意味する。 「ハイブリダイゼーション技術」とは、DNA-DNA、RNA-RNA、およびDNA-RNA相 互作用など、核酸の鎖の間に起こる（相補性に基づいた）特異的な相互作用を含 む検出測定法を意味する。このようなハイブリダイゼーション技術には、必要に 応じて、PCR増幅段階が含まれる。 「トランスジーン」とは、技術的に細胞内に挿入され、その細胞およびその後 代細胞のゲノムの一部となる塩基配列を意味する。このようなトランスジーンは 、その細胞にとって、部分的または完全に異種性のものであってもよい。 「調節化合物」とは、本明細書において用いられるときは、NAIPまたはIAPの 発現（すなわち、転写、翻訳、翻訳後のレベル）を上昇させるか、またはNAIPも しくはIAP蛋白質の活性を上昇させること（すなわち、この蛋白質の活性型を安 定させるか、さもなけば、アポトーシスに感受性の細胞型においてアポトーシス の量を減少させることによって）を意味する。 「虚血性細胞死」とは、影響を受ける細胞への血流の減少または阻害に続いて 起きる細胞の生存力の消失を意味する。 「細胞死を阻害すること」とは、正常な場合には細胞死が起きるような事象の 後に細胞が生き残る可能性が、（未処理の対照細胞に較べて）少なくとも10％、 好ましくは20％上昇することを意味する。好ましくは、比較する細胞は、正常な 場合、虚血性細胞死、神経変性、または軸索切断に感受性の神経細胞である。好 ましくは、細胞が死ぬ可能性の減少は、80％、より好ましくは２倍、最も好まし くは５倍である。 本明細書において用いられる略語は、次の通りである：動眼神経核（３）；動 眼神経根（3nr）；顔面神経核（７）；内耳神経（8vn）；迷走神経核（10）；舌 下神経核（12）；頚部５（C5）；クラーク柱（CC）；楔状束核（Cu）；背部視床 下部領域（DA）；歯状回（DG）；背部内側脊髄三叉神経核（DMSP5）；脚内（end opeduncular）核（EP）；顆粒細胞層（G）；淡蒼球（GP）；薄束核（Gr）；エー ディンガー-ヴェストファル核（EW）；水平の斜行帯（diagonal band）（HDB） ；介入(interposed)小脳核（int）；ルクノサム(lucunosum)層（L）；外側小脳 核（lat）；コルレウス（coeruleus）部位（LC）；外側視床下部領域（LH）；外 側手綱核（Hhb）；分子層（M）；三叉神経中脳路核（Me5）；内側手綱核（Mhb） ；三叉神経運動核（Mo5）；オリエンス（oriens）層（O）；錐体細胞層（P）（ 図２）；プルキンエ細胞層（図11）；橋核（Pn）；三叉神経主知覚核（Pr5）； 放線状層（R）；赤核、大型細胞部（RMC）；赤核、小型細胞部（RPC）；ロスタ ル・ペリオリバリー（rostal periolivary）野（RPO）；仙骨脊髄（S）；黒質緻 密部（SNC）；黒質網状部（SNR）；黒質外側部（SNL）；三叉神経脊髄路核、口 部（SPO5）；蝸牛神経腹側核（VC）；垂直斜行帯（diagonal band）（VDB）；前 庭神経核（Ve）；胸郭２（T2）；および胸郭６（T6）。 本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求の範囲か ら明らかになると思われる。 図面の簡単な説明 図１は、一過性の全面虚血（Ａ-Ｅ）、または模擬外科手術（Ｆ）の後の海馬 におけるインサイチューハイブリダイゼーション組織化学によるNAIPのmRNAの検 出を示す写真である。NAIPのmRNAのレベルは、４血管閉塞（4-VO）の後、２時間 （Ａ）、および12時間（Ｂ）において、海馬CA1のニューロン（小さな矢印）に おいては検出限界以下であり、歯状回（大きな矢印）においては、かろうじて検 出できた。12時間目に、歯状回（大きな矢印）においてNAIPの僅かな発現上昇が 見られる（Ｂ）。24時間後（Ｃ）には、CA1ニューロン（小さな矢印）と歯状回 （大き な矢印）において、ハイブリダイゼーションシグナルが緩やかに上昇している。 4-VO後48時間（Ｄ）および72時間（Ｅ）目には、NAIPレベルは、歯状顆粒細胞（ 大きな矢印）においては一定のままであるが、CA1ニューロン（小さな矢印）で はさらに増加した。スケールバー＝500μm。 図２は、模擬虚血処理した動物（Ａ、ＢおよびＣ）、または10分間の一過的な 前脳虚血を起こした動物（Ｄ-Ｌ）の海馬CA1ニューロン（Ａ、Ｄ、ＧおよびＪ） 、線条体ニューロン（Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫ）、および視床ニューロン（Ｃ、Ｆ、 ＩおよびＬ）におけるNAIP様免疫反応性を示す写真である。模擬処理後24時間で 、海馬CA1ニューロン（CA1；Ａ）、および視床腹側部（THAL；Ｃ）に、中度レベ ルのNAIP様免疫反応性が現れた。線条（STR；Ｂ）では、大型のコリン作用性ニ ューロン（大きな矢印）が高いレベルのNAIP様免疫反応性を示すが、中型のニュ ーロン（小さな矢印）では、非常に低いレベルが検出されている。全体的な虚血 後３時間目のCA1ニューロンにおいては、緩やかなNAIP様免疫反応性の上昇が起 きた（Ｄ）が、NAIPのレベルは、24時間後（Ｇ）と72時間後（Ｊ）には低下して いるように見える。全体的な虚血後３時間で、中型（小さな矢印）および大型（ 大きな矢印）の線条体ニューロンの両方において、NAIP様免疫反応性が上昇した ように見える（Ｅ）。24時間後（Ｈ）と72時間後（Ｋ）、中型ニューロンでは、 NAIPのレベルは低下しているように見えるが、大型ニューロン（大きな矢印）で は低下しているようには見えない。４血管閉塞から３時間後（Ｆ）と24時間後（ Ｉ）に、NAIP様免疫反応性は劇的に上昇した。72時間後にも、視床ニューロンに おいて、NAIP様免疫反応性はさらに上昇しているように見える（Ｌ）。スケール バー＝150μm。 図３は、NAIP様免疫反応性（Ａ）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ （ChAT；Ｂ）の免疫反応性に関する、線条体ニューロンの免疫組織蛍光二重標識 を示す写真である。NAIP様免疫反応性とChAT免疫反応性（矢印）を示すニューロ ンが重複することは、線条においては、NAIPがコリン作用性ニューロンの中に排 他的に局在していることを示している。スケールバー＝40μm。 図４は、４血管閉塞（4-VO）を10分間行なってから５日後のCAIのニューロン 消失に及ぼす、K252aによる長期間の前処理の効果を示す写真である。海馬ニュ ーロ ンは、ニューロン特異的マーカーのNeuNに対するモノクローナル抗体（A60）に よって検出される。（Ａ）賦形剤を注入した模擬処理動物のCA1領域（矢印）に おけるNeuN様免疫反応性（VEH＋SHAM）。（Ｂ）再循環後５日目の賦形剤で処理 した動物のCA1領域（矢印）におけるNeuN様免疫反応性ニューロンの大量の消失 （VEH＋4-VO）。（Ｃ）K252aを長期的投与した後の、CA1領域（矢印）における 虚血に誘導されるニューロン死の減少（K252a＋4-VO）。スケールバー＝500μm 。 図５は、一過的な前脳虚血後のCA1のニューロンに対する、K252a長期的投与の 効果を示す写真である。NeuN様免疫反応性を発現しているCA1ニューロンの密度 は、コンピュータによる画像解析により評価される。ニューロン密度は、CA1錐 体層の長さ100μm当たりの、標識された細胞の数を表している。CA1領域の内側 面、中央面、および側面を長さ100μmについてカウントし、平均した。４血管閉 塞（4-VO）を10分間行なってから５日後のCA1領域において、CA1ニューロンの70 ％の消失が検出された（ISCHEMIA）。4-VOの７日前に、K252aを皮下注射（0.1 m g／kg／日）し、その後毎日（５日）注射すると、CA1領域における虚血性損傷を 、およそ50％低下させた（K252a＋ISCHEMIA）。アスタリスク、賦形剤処理の模 擬虚血の場合（VEHICLE＋SHAM）と有意に異なっている（p<0.01）。星印、4-VO を行なった動物で賦形剤処理したもの（VEHICLE＋ISCHEMIA）と有意に異なって いる（p<0.01）。 図６は、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）（Ａ）、またはK252a（0.1 ml／kg、 皮下注射）（Ｂ-Ｆ）の単回投与が、海馬におけるNAIP mRNAのレベルに与える効 果を、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学によって測定したことを 示す写真である。NAIP mRNAのレベルは、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）投与後 ３時間で、海馬CA1のニューロン（小さな矢印）においては検出限界以下であり 、歯状回（大きな矢印）においては、かろうじて検出できた（Ａ）。CA1（小さ な矢印）と歯状回（大きな矢印）の両方において、NAIP mRNAのレベルは、K252a 投与後1.5時間（Ｂ）と３時間（Ｃ）で上昇している。６時間後（Ｄ）には、CA1 領域と歯状回において、ハイブリダイゼーションシグナルは、正常のレベルに戻 っていた。K252aを投与してから12時間後（Ｅ）および24時間後（Ｆ）には、海 馬におけるNAIP mRNAのレベルは、基底レベルのままであった。スケールバー＝5 00μm。 図７は、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）、またはK252a（0.1 ml／kg、皮下注 射）の単回投与が、海馬（Ａ、ＤおよびＧ）、線条（Ｂ、ＥおよびＨ）、および 視床（Ｃ、ＦおよびＩ）におけるNAIP様免疫反応性に与える効果を示す写真であ る。賦形剤で処理した動物では、海馬CA1ニューロン（CA1；Ａ）、および視床ニ ューロン（THAL；Ｃ）において、中度レベルのNAIP様免疫反応性が現れている。 線条では、コリン作用性ニューロン（大きな矢印）が高レベルのNAIP様免疫反応 性を示すが、中型のニューロン（小さな矢印）では、低いレベルが検出されてい る（Ｂ）。K252a（0.1 ml／kg、皮下注射）を投与して３時間後、３つの領域す べてで、NAIP様免疫反応性が上昇した（Ｄ、ＥおよびＦ）。線条では、K252aは 、主に、中型ニューロン（小さな矢印）において、NAIP様免疫反応性を上昇させ るようである（Ｅ）。24時間後までに、海馬（Ｇ）、線条（Ｈ）および視床（Ｉ ）において、NAIP様免疫反応性は基底レベルに戻っていた。スケールバー＝150 μm。 図８は、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）（対照＝Ｃ）、またはK252a（0.1 ml ／kg、皮下注射）（処理＝Ｔ）を単回投与の３時間後の、視床（THAL）、海馬（ HIPP）、線条（STR）、および脊髄（SPIN.Ｃ）におけるNAIPレベルの解析を示す ウェスタンブロットである。K252aは、４つのすべての領域において、NAIPレベ ル（150 kDa）を上昇させたが、最も大きな上昇は、視床と線条において起きて いる。 図９は、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）（対照＝Ｃ）、またはK252a（0.1 ml ／kg、皮下注射）（処理＝Ｔ）を単回投与の３時間後の、視床（THAL）、海馬（ HIPP）、線条（STR）、および脊髄（SPIN.Ｃ）におけるNeuNレベルの解析を示す ウェスタンブロットである。高レベルのNeuN（60 kDa）が海馬と線条で見られ、 視床と脊髄ではそれよりも低かった。４つのすべての脳領域において、NeuNレベ ルは、対照条件でも、処理条件でも同じであったが、このことは、これらの各レ ーンに等量の蛋白質が流されたことを示している。NAIPおよびNeuNの免疫ブロッ ティングには、同じメンブレンを用いた。 図10は、一過的な虚血の後の、NAIPトランスジーンを発現する細胞におけるニ ューロンの密度を示すグラフである。 図11は、ニューロンアポトーシス阻害蛋白質（NAIP）に対する抗血清の解析を 示すウェスタンブロットである。ラットの脳からの全細胞抽出物を電気泳動によ って移動させたニトロセルロースの細片を、NAIP抗血清、またはグルタチオン-S -トランスフェラーゼ（GST）-NAIP融合蛋白質を予め吸着させたNAIP抗血清の何 れかでブロッティングした。アフィニティー精製したNAIP抗体は、NAIPについて 推定された分子量に相当する150 kDのバンドのみを認識した（レーンＡ）。抗体 に、予めGST-NAIP融合蛋白質を吸着させると、150 kDのバンドは現れなかった（ レーンＢ）。各レーンには20μgの蛋白質を泳動した。 図12は、新皮質におけるNAIP様免疫反応性（NAIP-LI）を示す写真である。ニ ューロン細胞質および突起を、すべての皮質層において適度に標識した（Ａ）。 第Ｖ層錐体ニューロンにおけるNAIP-LIが、先端突起において強い標識を示す（ 矢印）（Ｂ）。スケールバー＝300μm（Ａ）；30μm（Ｂ）。 図13は、海馬におけるNAIP-LIを示す写真である。NAIP-LIは、錐体ニューロン （CA1-CA3）、歯状顆粒細胞（DG）、および介在ニューロンで検出された（Ａ） 。CA1の下位分野の中では、NAIP-LIは、錐体ニューロンの細胞体および樹状突起 の中に存在した（Ｂ）。CA1-CA3の下位分野、および歯状回の中のニューロンに よって示されるNAIP-LIの強さは、同じように見えた（Ｂ、ＣおよびＤ）。これ らのニューロン集団に比べると、より強い染色が、オリエンス（oriens）層の海 馬全体に散在する介在ニューロン、CA1のルクノサム（lucunosum）（Ｂ）、CA2 およびCA3のルキダム（lucidum）（Ｃ）、ならびに歯状門（Ｄ）において見られ た。矢印は介在ニューロンを示している。スケールバー＝500μm（Ａ）；300μm （Ｂ、Ｃ、Ｄ）。 図14は、線条におけるNAIP-LIと、NAIPおよびコリンアセチルトランスフェラ ーゼ（ChAT）に対する線条体ニューロンの二重標識免疫組織蛍光検査を示す写真 である。強い標識を示す大型ニューロンが、尾状核−被殻全体に見られた（矢頭 ）（Ａ）。これに対して、中型ニューロンは、NAIP抗体によって弱く標識された （矢印）（Ａ）。免疫組織蛍光二重標識は、NAIP-LI（Ｂ）、およびChAT-免疫反 応性ニューロン（Ｃ）の間の完全な重複を示している（矢頭）。スケールバー＝ 300μm（Ａ）；30μm（Ｂ）。 図15は、脳幹神経節の出力構造体におけるNAIP-LIを示す写真である。淡蒼球 （ Ａ）、脚内［endopeduncular］核（Ｂ）、および黒質（Ｃ）において、標識され たニューロンが観察された。これらの構造体、特に、脚間核において、強く標識 された線維も見られた（Ｂ）。黒質において、NAIP陽性ニューロンは、主に、黒 質緻密部［pars compact］（SNC）に局在していた。また、散在した免疫反応性 ニューロンは、黒質網状部（SNR）と黒質外側部（SNL）に存在した。緻密部［pa rs compact］から発生する樹状突起が、SNRの中まで腹側に伸びているのが観察 された（Ｃ）。スケールバー＝300μm。 図16は、斜行帯（diagonal band）におけるNAIP-LIと、NAIPおよびChATに関す る斜行帯（diagonal band）ニューロンの二重免疫組織蛍光標識を示す写真であ る。NAIP免疫反応性ニューロンは、斜行帯（diagonal band）の水平脚と垂直脚 に存在していた（Ａ）。二重標識によって、斜行帯（diagonal band）において は、NAIP陽性ニューロン（Ｂ）とChAT陽性ニューロン（Ｃ）の間には僅かしか重 複がないことが明らかになった。矢印は、二重に標識された唯一のニューロンを 示している。スケールバー＝300μm（Ａ）；30μm（Ｂ、Ｃ）。 図17は、間脳におけるNAIP-LIを示す写真である。NAIP-LIは、腹内側核、およ び後腹側核に現れる、より強く標識されたニューロンにより、視床領域のほとん どすべてで検出された（Ａ）。（Ａ）に示された四角で囲んだ領域を拡大したも のは、後腹側核における標識されたニューロンを示している（Ｂ）。手綱におい て、NAIP-LIは、内側手綱核、および外側手綱核の両方で示された。外側手綱核 における双極ニューロンの小集団は、非常に強いNAIP-LIを示した（Ｃ）。視床 下部においては、NAIP-LIは殆ど検出されなかった（Ｄ）。スケールバー＝600μ m（Ａ）；300μm（Ｃ、Ｄ）。 図18は、黒質におけるNAIP-LIと、NAIPおよびTHに関する黒質ニューロンの二 重標識を示す写真である。NAIP-LIは、主に、SNC中のニューロンによって示され た（Ａ）。NAIP（Ｂ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（Ｃ）に関するSNCニュ ーロンの二重標識は、これら２つのマーカーに、細胞内で高い重複があることを 示している（矢頭）。スケールバー＝500μm（Ａ）；30μm（Ｃ）。 図19は、脳神経、および脳幹のリレー（relay）核におけるNAIP-LIを示す写真 である。動眼神経核、およびエーディンガー-ヴェストファル核（Ａ）、三叉神 経 核、蝸牛神経核（Ｂ）、顔面神経核（Ｃ）、迷走神経核、および舌下神経核（Ｄ ）など、いくつかの脳神経核において、強いNAIP-LIが検出された。動眼神経お よび蝸牛神経から腹側に伸びている神経根の強い標識が見られた（ＡおよびＢ） 。NAIP陽性ニューロンは、また、赤核（Ａ）、ならびに薄束核および楔状束核（ Ｄ）などの脳幹リレー（relay）核において見られた。スケールバー＝400μm。 図20は、脳幹のリレー核および網状核、ならびに小脳におけるNAIP-LIを示す 写真である。橋核、およびロスタル・ペリオリバリー（rostal periolivary）野 の中の多数のニューロンにおいて、NAIP-LIが観察された（Ａ）。コルレウス（c oeruleus）部位、ならびに三叉神経の主要な３つの核である、中脳路核、主知覚 核、および運動核も強いNAIP-LIを示した（Ｂ）。網様核の巨大細胞ニューロン は、強く標識され（矢頭は巨大な大きさのニューロンを示している）（Ｃ）、前 庭神経核のニューロンも強く標識された（Ｄ）。また、外側小脳核、および中位 小脳核などの小脳核にもNAIP-LIが存在した（Ｄ）。スケールバー＝400μm。 図21は、動眼神経核におけるNAIP-LIと、動眼神経ニューロンのNAIPおよびChA Tに対する二重免疫組織蛍光標識を示す写真である。細胞体と軸索の標識を示す 、動眼神経中のNAIP-LIの例（Ａ）。動眼神経中のNAIPを免疫組織蛍光標識した （Ｂ）。動眼神経核の領域で、（Ｂ）で示された領域と同じ領域をChATに対して 免疫組織蛍光標識した（Ｃ）。矢頭は、二重標識されたニューロンを示し、矢印 は、ChATを含まないNAIP免疫反応性ニューロンの例を示している。スケールバー ＝300μm；30μm（Ｂ、Ｃ）。 図22は、小脳皮質におけるNAIP-LIを示す写真である。小脳皮質において、規 則正しい単層の配列を有するNAIP陽性体が検出された（Ａ）。NAIP-LIは、その 他の層では見られなかった（Ａ）。小脳皮質における、NAIPの免疫組織蛍光標識 （Ｂ）。（Ｂ）と同じ小脳領域におけるプルキンエ細胞層（Ｃ）を示す、カルシ ウム結合蛋白質（28kD，CaBP）の免疫組織蛍光標識。NAIP（Ｂ）、およびCaBP（ Ｃ）に対して免疫反応するニューロンの間に完全な重複があることに注意のこと 。スケールバー＝300μm（Ａ）；30μm（Ｂ、Ｃ）。 図23は、脊髄におけるNAIP-LIを示す写真である。さまざまな大きさと形態を 有する、多数のNAIP陽性神経細胞質が、脊髄の頚部（Ａ）、胸郭（Ｂ、Ｃ）、お よ び仙骨（Ｄ）のレベルに見られた。強く標識されたニューロンは、主に、脊髄の 前部側に局在している。NAIP-LIが、灰白質と白質のニューロン突起の中に見ら れることに注意。スケールバー＝300μm。 図24は、胸郭レベル２の脊髄の後角、および前角におけるNAIP-LIの分布を示 す写真である。NAIP陽性ニューロンは、前角（板７、８および９）、およびクラ ーク柱（板７）の中に集中してあった。前角の中のNAIP陽性の神経細胞質の大多 数は、大型で三角形であった（矢頭）。数は少なく、小型であるが、板ＶとVIの 中にも、NAIP陽性神経細胞質が見られた。板Ｉ〜IVは、少数の免疫反応性ニュー ロンを含んでいた（Ａ）。脊髄前角における、NAIPに対する免疫組織蛍光標識（ Ｂ）。（Ｂ）で示された脊髄前角と同じ領域における、ChATに対する免疫組織蛍 光標識（Ｃ）。矢頭は、二重標識されたニューロンを示す。スケールバー＝300 μm（Ａ、Ｂ）；30μm（Ｃ、Ｄ）。 図25は、アデノウイルスが介在するNAIPの過剰発現が、線状体の6-OHDAの後に 、黒質THの免疫反応性に与える効果を示す写真である。上図：対照；中図：Lac7 -6-OHDA；下図：NAIP-6-OHDA。 図26は、軸索切開されたニューロン（上図）と対照ニューロンとを示す写真で ある。 図27は、軸索切開された細胞と対照細胞における、１日、３日および７日目の NAIPレベルを示す写真である。 図28は、顔面神経の軸索切開後のIAP発現を示す写真である。 図29は、軸索切開された新生細胞と対照新生細胞における、NAIP発現を示す写 真である。 図30は、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）、またはK252a（0.1 mg／kg、皮下注 射）の単回の投与が、海馬（Ａ、ＤおよびＧ）、線条（Ｂ、ＥおよびＨ）、およ び視床（Ｃ、ＦおよびＩ）におけるNAIP様免疫反応性に与える効果を示す写真で ある。賦形剤で処理した動物では、海馬CA1ニューロン（CA1；Ａ）、および視床 ニューロン（THAL；Ｃ）において、中度レベルのNAIP様免疫反応性が現れている 。線条では、コリン作用性ニューロン（矢頭）（Ｃ）。K252a（0.1 mg／kg、皮 下注射）を投与した３時間後、３つの領域すべてで、NAIP様免疫反応性が上昇し た（Ｄ、ＥおよびＦ）。線条では、K252aは、主に、中型ニューロン（矢印）に おいて、NAIP様免疫反応性を上昇させるようである（Ｆ）。24時間後までに、海 馬（Ｇ）、線条（Ｈ）および視床（Ｉ）において、NAIP様免疫反応性は基底レベ ルに戻っていた。スケールバー＝300μm（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）；50μm（ Ｃ、Ｆ、Ｉ）。 図31は、K252a処理がNAIPレベルに与える効果を示す写真である。Ａ．視床、 海馬、線条、および脊髄における、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射）の単回投与 の、NAIPおよびNeuNレベルに対する効果。（Ａ）賦形剤（1 ml／kg、皮下注射） （対照＝Ｃ）、またはK252a（0.1 mg／kg、皮下注射）（処理＝Ｔ）を単回投与 の３時間後の、視床（THAL）、海馬（HIPP）、線条（STR）、および脊髄（SPIN. Ｃ）におけるNAIPレベルのウェスタン解析。K252aは、４つのすべての領域にお いて、NAIPレベル（150 kDa）を上昇させたが、最も大きな上昇は、視床と線条 において起きている。（Ｂ）賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）（対照＝Ｃ）、また はK252a（0.1 mg／kg、皮下注射）（処理＝Ｔ）を単回投与の３時間後の、視床 （THAL）、海馬（HIPP）、線条（STR）、および脊髄（SPIN.Ｃ）におけるNeuNレ ベルのウェスタン解析。高レベルのNeuN（60 kDa）が海馬と線条で見られ、視床 と脊髄ではそれよりも低かった。４つのすべての脳領域において、NeuNレベルは 、対照条件でも、処理条件でも同じであったが、このことは、これらの各レーン に等量の蛋白質が泳動されたことを示している。NAIPおよびNeuNの免疫ブロッテ ィングには、同じメンブレンを用いた。Ｂ．K252aの短期的投与および長期的投 与が、海馬におけるNAIPレベルに与える効果の比較。賦形剤（1 ml／kg、皮下注 射）、もしくはK252a（0.1 mg／kg、皮下注射）の単回投与、またはK252a（0.1 mg／kg、皮下注射、１日１回を７日間）を長期的投与した後の、海馬におけるNA IPレベルのウェスタン解析。賦形剤を注射した動物に較べると、３匹の動物すべ てで、NAIPレベル（150 kDa）が上昇した。K252aの長期的投与は、実験した３匹 の動物すべてにおいて、さらに高いNAIPレベルの上昇をもたらした。Ｃ．海馬に おけるNAIPレベルに対する、K252aの単独、および反復投与効果のデンシトメー ター測定。K252a（0.1 mg／kg、皮下注射）の単回投与は、NAIPレベルを約50％ 上昇させたが、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射、１日１回を７日間）の長期的投 与は、NA IPレベルを約100％上昇させた。棒グラフとバーは、３匹の動物についての平均 値と平均値の標準誤差を表している。アスタリスク、賦形剤で処理した動物と有 意に異なる（p<0.01；ニューマン-ケウルス（Newman-Keuls検定））。星印、賦 形剤、またはK252aの一度の注射を受けた動物と有意に異なる（p<0.01；ニュー マン-ケウルス（Newman-Keuls検定））。 図32は、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学によって検出したと きの、海馬におけるNAIP mRNA発現に対する、K252aの短期的投与および長期的投 与の効果を示す写真である。低いレベルのNAIP mRNAが、賦形剤（1 ml／kg、皮 下注射）を注射された動物の海馬に存在していた（Ａ）。K252a（0.1 mg／kg、 皮下注射）の単回投与は、海馬におけるNAIP mRNAのレベルを上昇させた（Ｂ） 。K252a（0.1 mg／kg、皮下注射、１日１回を７日間）の長期的投与は、NAIP mR NAレベルをさらに上昇させた（Ｃ）。動物はすべて、最後に注射した３時間後に 殺処分した。 図33は、４血管閉塞（4-VO）を10分間行なってから５日後のCA1ニューロン消 失に及ぼす、K252aによる長期間の前処理の効果を示す写真である。Ａ．賦形剤 を注入した模擬処理動物（VEH＋SHAM、矢印は、CA1領域を示す）の海馬における 、ニューロン特異的マーカーNeuNに対するモノクローナル抗体（A60）によるニ ューロンの免疫組織化学的検出。Ｂ．再循環後５日目の賦形剤処理動物のCA1領 域（矢印）における、NeuN様免疫反応性ニューロンの大量の消失（VEH＋4-VO） 。Ｃ．K252aを長期的投与した後の、CA1領域（矢印）における、虚血に誘導され るニューロン死の減少（K252a＋4-VO）。スケールバー＝500μm。Ｄ．コンピュ ータによる画像解析により評価された、NeuN様免疫反応性を発現しているCA1ニ ューロンの密度。４-VOを10分間行なった５日後のCA1領域において、CA1ニュー ロンの70％の消失が検出された（ISCHEMIA）。K252aの長期的投与は、CA1領域に おける虚血性損傷を、およそ50％低下させた（K252a＋ISCHEMIA）。棒グラフと バーは、６匹の動物についての平均値と平均値の標準誤差を表している。アスタ リスク、賦形剤処理の模擬虚血の場合（VEHICLE＋SHAM）と有意に異なっている （p<0.01；ニューマン-ケウルス（Newman-Keuls検定））。星印、4-VOを行なっ た動物で賦形剤処理したもの（VEHICLE＋ISCHEMIA）と有意に異なっている（p<0 .01；ニューマン-ケウル ス（Newman-Keuls検定））。 図34は、ウイルスが介在するNAIPの過剰発現が、一過的な前脳虚血の後に、CA 1ニューロンの消失に与える効果を示す写真である。Ａ．４-VOを10分間行なった ５日後、LacZを含むアデノウイルス構築物を定位的に注射した海馬（左側）にお けるニューロン特異的マーカーNeuNに対するモノクローナル抗体（A60）による ニューロンの免疫組織化学的検出。Ｂ．４-VOを10分間行なった５日後、myc標識 したNAIPを含む組換えアデノウイルス構築物を定位的に注射した右海馬における NeuN様免疫反応性。NAIPアデノウイルスを注射された海馬におけるCA1ニューロ ンの数の多さに注意。Ｃ．４-VOを行なっていない動物において、lacZ構築物を 海馬の中に注射した後に、X-gal染色を示すCA1ニューロン（矢頭）。Ｄ．NAIPア デノウイルスを注射した側のCA1ニューロン（矢頭）を、myc標識したNAIPを認識 するmAb9E10抗体で標識したもの。スケールバー＝500μm（Ａ、Ｂ）；50μm（Ｃ 、Ｄ）。Ｅ．一過的な前脳虚血の後のCA1ニューロンの消失に与える、ウイルス が介在するNAIPおよびlacZの過剰発現効果の定量的な比較。NeuN様免疫反応性を 発現するCA1ニューロンの密度を、コンピュータによる画像解析により評価した 。ニューロン密度は、CA1錐体層の長さ100μm当たりの標識された細胞の数を表 している。CA1領域の中央の黒い部分は、注射処理によってできた損傷を表して いる。細胞数を数えたところ、lacZを含むアデノウイルス構築物を注射した側に 比較すると、myc標識したNAIPを含むアデノウイルス構築物を注射した海馬にお けるCA1の消失は、約60％抑制されたことが分かった。棒グラフとバーは、６匹 の動物についての平均値と平均値の標準誤差を表している。アスタリスク、lacZ ベクターを注射した側と有意に異なっている（p<0.01；ｔ検定）。 好ましい態様の説明 NAIP蛋白質（ニューロンアポトーシス阻害蛋白質）の突然変異は、脊髄運動ニ ューロンの枯渇によって特徴づけられる常染色体の劣性の疾患である棘筋萎縮と 関連している（Roy et al.，Cell 80:167-178，1995）。NAIP遺伝子は、バキュ ロウイルスの２つのアポトーシス蛋白質阻害因子（Cp-IAPとOp-IAP）に相同性を もち、Ｉ型棘筋萎縮を有する人では一部が欠失している。NAIPを過剰発現させる と、さまざまな原因で誘導されるアポトーシス死から、いくつかの細胞系が防御 さ れる。この発見は、NAIPがないと、運動ニューロンの過剰なアポトーシス死が起 こり、その結果、棘筋萎縮になるということを示しているようである。NAIPの抗 アポトーシス的役割に一致して、免疫組織化学的解析は、NAIPが、脊髄の知覚ニ ューロンではなく、運動ニューロンの中に局在していることを示している。 本発明者らは、成体の前脳における、一般的に、ならびに虚血、および神経変 性の条件の下でNAIPを発現するニューロンの分布を調べた。本発明者らの発見は 、NAIPが抗アポトーシス特性を有するという観察とともに、脳虚血および神経変 性から起こる損傷が、虚血の損傷作用に感受性のニューロンにおけるNAIPレベル の上昇によって制御されのかもしれないという結論に達した。本発明者らは、上 昇したNAIPレベルは、また、軸索の、軸索切開後の再生を生き延びる能力と密接 に関連もしていることを発見した。IAPによって得られたデータは、それらも、 同じような神経防御および神経再生の役割をもっていることを示している。この ように、本発明は、さまざまな状況の下での神経防御、および神経再生のための 治療を提供する。神経防御を強化する化合物を検出するための方法およびキット 、および神経変性病を検出するための診断キットも、本発明の一部である。 以下には、NAIPの神経防御的NAIP活性の特徴を調べ、これを示す、本発明者ら の結果の概観、神経防御方法の詳細、および本発明のさまざまな局面を例示する 実施例が述べられている。 NAIPの局在 本発明者らは、CNSにおけるNAIP-LIの分布を調べるために、ニューロンアポト ーシス阻害蛋白質またはNAIPに対して作製した、アフィニティー精製したポリク ローナル抗体を用いた。NAIPの免疫組織化学的検出によって、この抗アポトーシ ス蛋白質は、さまざまな構造物に局在するニューロンの中に存在していることが 明らかになった。NAIP-LIは、脳血管またはグリアに関連した細胞型などの非ニ ューロン細胞型の中では検出されなかったが、このことは、CNSでは、NAIPはｍ ニューロンによって選択的に発現されていることを示唆している。 前脳においては、皮質と海馬において、低レベルのNAIP-LIが見られた。皮質 の中では、表層および深層の両方で、NAIP-LIが観察された。細胞体の標識に加 えて、錐体ニューロンの先端突起において、NAIP-LIを明らかに見ることができ ること は、この抗アポトーシス蛋白質が活発に輸送されていることを示している。NAIP -LIは、また、CA1〜CA3下位分野の錐体ニューロン、介在ニューロン、および歯 状回の顆粒細胞の中でNAIP-LIが検出される海馬に広く分布していた。皮質にお いて見られるように、NAIP-LIは、細胞体、および錐体ニューロンの樹状突起の 両方に局在していた。NAIP染色の強度は、CA1ニューロンとCA3ニューロンで同程 度に見えたが、このことは、NAIPが、これらのニューロン集団の虚血損傷に対す る弱さに関する、特徴がよく分かった違いとは無関係であることを示している（ Francis and Pulshinelli，1982）。視床の中では、この構造体の腹側領域、お よび外側領域に位置する多数のニューロンにおいて、中度のNAIP-LIレベルが見 られた。NAIP-LIは、視床核の前部、層内、および内側にも存在するが、免疫反 応性ニューロンは、これらの領域では、少ししか検出されなかった。視床の腹外 側面において密なネットワークを形成する線維の中でNAIP-LIが濃縮されること は、NAIPが細胞体から樹状突起と軸索に輸送されることを示唆している。 皮質、海馬、および視床とは対照的に、線条、および手綱の中では、NAIP-LI は、ニューロンの小さな部分集団に限定されている。線条においては、二重標識 実験によって、NAIP-LIは、この構造体では全ニューロン集団の１％を占めるコ リン作用性介在ニューロンの中だけで発現されていた（Semba and Fibinger，19 89）。これらのニューロンの中で観察された高レベルのNAIP-LIは、これらのニ ューロンが、励起毒性（excitotoxic）／虚血傷害に抵抗性であることを一部説 明するかもしれないと推測しようとしている（Francis and Pulshinelli，1982 ）。NAIP-LIは、線条体のコリン作用性ニューロンの中に必ず存在していたが、 前脳基底部に存在するNAIP-LIは、コリン作用性ニューロンには、ほとんど見ら れなかった。この発見は、前脳基底部の中で、非コリン作用性細胞は、コリン作 用性ニューロンよりも、軸索切開によって作出される逆行性傷害に抵抗性である という観察と関連を有するのかもしれない（Peterson et al.，1987）。 皮質、線条、および視床に加えて、知覚および運動機能に関係するその他のい くつかの構造体が、NAIP陽性ニューロンを含んでいることが分かった。これらに は、淡蒼球、黒質緻密層、脚内核、橋核、外側網状核、小脳、および脊髄が含ま れる。これらの構造体のニューロンにおけるNAIP-LIの強度は、この抗アポトー シ ス蛋白質が、これらの構造体の生存を維持する役割を担っているのかもしれない ことを示唆している。この考えに適合して、重篤なSMAの症例の視床（腹側、お よび外側核）、淡蒼球、黒質、脚内核、橋核、小脳、および脊髄において、ニュ ーロン変性が報告されている（Staiman et al.，1980; Towfighi et al.，1985; Murayama et al.，1991）。NAIP-LIの分布と、SMAにおけるニューロン損傷との 一致は、NAIPの消失が、この神経変性障害で観察される病理過程に寄与すること を強く示唆している。 脳神経核において、高レベルのNAIP-LIが、運動ニューロン、および知覚ニュ ーロンの両方に存在していた。ChAT免疫組織化学を利用して、中脳、および脳幹 の中の運動ニューロン集団の同定を進めた。二重標識実験によって、NAIP-LIは 、動眼神経、滑車、運動三叉神経、顔面神経核、迷走神経の運動核、および舌下 神経核の運動（ChAT陽性）ニューロンの中にしばしば存在することが明らかにな った。これらの実験は、また、顔面神経核などのように、運動ニューロンと知覚 ニューロンを有する脳核の知覚（ChAT陰性）ニューロンの中には、NAIP-LIが存 在しないことも明らかにした。最近、知覚機能に関連した核、すなわち、クラー ク柱、薄束核、および楔状束核において、強度のNAIP-LIが見つけられた。さら に、SMAにおけるNAIP欠乏に対する中心的な役割を支えるのは、SMAでは、これら の構造体のすべてが損傷を示すことである（Staiman et al.，1980; Towfighi e t al.，1985）。 要約すると、NAIP局在実験は、CNSの中に広く分布することを示している。低 度から中度レベルのNAIP-LIが、皮質と海馬の中で見られたが、さまざまな皮質 下脳領域の中で、強度のNAIP-LIが検出された。これらには、視床（腹側核、お よび外側核）、神経節基底（線条、淡蒼球、脚内核、赤核、および黒質）、脳神 経核、脳幹リレー核（楔状束核、薄束核、橋核、外側網状核、脚間核、オリーブ 核、およびコルレウス（coeruleus）部位、小脳、および脊髄が含まれる。線条 を除いて、これらの領域はすべて、SMAの重篤な症例において神経病理を示す。 線条の中のNAIP-LIは、線条体ニューロン集団の僅か１％しかないコリン作用性 介在ニューロンの中だけに局在している事実は、この構造体における変性的な変 化を観察しようとした以前の実験が失敗した理由となるかもしれない（Towfighi et al.，198 5; Murayama et al.，1991）。 一過的虚血は、NAIPレベルを上昇させる インサイチューハイブリダイゼーション組織化学による、NAIPメッセージの測 定は、非常に低いレベルのmRNAが海馬に存在することを示している。実際、海馬 の歯状回細胞においてのみ、NAIP mRNAの基底的発現が検出できる。しかし、一 過的な脳虚血は、主に、CA1ニューロンにおいて、遅延するが、大きく、NAIPの 発現を上昇させた。これらの上昇は、一過的な前脳虚血を10分間行なった後、24 時間してから最初に現れ、72時間後に上昇はピークに達した。これらのNAIP mRN Aの大幅な上昇にもかかわらず、NAIP-Iは、CA1ニューロンでは増加しないようで ある。これに対して、再循環後72時間に、CA1ニューロンの中で、NAIP-Iは、基 底レベルよりも低くなる。これらの発見は、一過的な全体的虚血の後に、CA1ニ ューロンで、蛋白質合成が重度に抑制されることを示す以前の報告と一致する（ Thilman et al.，Acta．Neuropathol．71:88-93，1986; Maruno and Yanagihara ，Neurosci．Lett．115:155-160，1990;Widmann et al.，J．Neurochem．56:789 -796，1991）。さらに、これらは、一過的な虚血発作の後に、CA1ニューロンがN AIP蛋白質を製造することができないために、ニューロンが、この有害処理の傷 害効果に対して感受性になるのかもしれないことを示している。 海馬とは異なり、NAIP-I免疫反応性は、線条体のコリン作用性ニューロンにお いては、虚血発作の３時間後に劇的に上昇した。本発明者らは、一過的な脳虚血 の損傷効果に対する、これらのニューロンの抵抗性は、虚血発作の後のNAIP発現 を上昇させる能力によって付与されると考える。同様に、短時間の全体的な虚血 の後に視床ニューロンで検出されたNAIP-Iの大幅な上昇は、また、中型の線条体 およびCA1ニューロンに比べて、虚血損傷に対する、これらのニューロンの抵抗 性が大きくなることに寄与しているようである（Pulsinell et al.，1982，前記 ）。 虚血傷害の前にNAIPレベルが上昇して、ニューロンの生存率を高める。 本発明の主要な発見は、神経防御化合物のK252aで処理すると、10分間の一過 的脳虚血の後にレベルが上昇し、CA1消失を抑制することである。本発明者らの 結果は、４血管閉塞（4-VO）の前７日間、毎日１回、K252a（0.1 mg／kg、皮下 注射 ）を投与することによって、海馬における虚血損傷が減少することを示した。こ の結果の解釈の一つは、K252aの前処理によって、一過的な脳虚血の傷害効果に 対してCA1をより抵抗性にする防御蛋白質の発現が上昇するというものである。 この考えに合致して、本発明者らは、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射）を一度に 投与した後、海馬におけるNAIP mRNAとNAIP蛋白質のレベルが上昇するのを観察 した。したがって、本発明者らは、NAIPレベルを上昇させるK252aの能力が、そ の神経防御効果の原因であると考えている。 本発明者らは、また、K252aが、線条、視床、および脊髄において、NAIPレベ ルを上昇させることを発見している。このことは、また、この化合物が、NAIP発 現を上昇させることによって、これらの領域において、神経防御効果を発揮する ことを示している。 本発明者らは、K252aは、NAIPレベルを上昇させることによって作用すると考 えている。したがって、直接、または遺伝子治療によってIAPおよびNAIP蛋白質 のレベルを上昇させる方法を、虚血後のニューロン死を防止するために用いるこ とができよう。さらに、虚血から起こる中枢神経系細胞死を防止する化合物を同 定するための方法として、IAPおよびNAIPの遺伝子発現、および生物学的活性を モニターすることができよう。 虚血傷害に対する、NAIP発現と抵抗性との相関 一過的な脳虚血は、線条体コリン作用性ニューロンにおいて、NAIP様（NAIP-L I）免疫反応性を上昇させるが、一方、線条体［medium spiny］ニューロンにお けるNAIP-LIは、この発作によっては評価できるほど上昇しないとようであった 。視床の網状核におけるニューロンを著しい例外として、視床の腹側および外側 の側面におけるニューロンの標識は、また、短時間の全体的な虚血によって実質 的に上昇した。一過的な全体的虚血の後の、CA1ニューロンにおける蛋白質合成 が抑制されるという報告に一致するように（Thilman et al.，Acta．Neuropatho l．71:88-93，1986; Maruno et al.，Nurosci．Lett．115:155-160，1990; およ びWidman et al.，J．Neurochem．56:789-796，1991）、4-VOは、これらのニュ ーロンで、NAIP-LIを上昇させず、むしろ、再循環の72時間後には、免疫反応性 の低下が見られた。このように、線条体［medium spiny］、視床網状体、および 海馬CA1ニュ ーロンなど、一過的な全体的虚血の傷害効果に対して感受性であることが知られ ているニューロン集団（Pulsinelli et al.，Ann．Neurol．11:491-498，1982; およびSmith et al.，Acta Neuropathol．（Berl）64:319-332，1984）は、10分 間の4-VOの後に、NAIP-LIの上昇を示すことができなかった。これに対して、本 発明者らは、一過的な虚血発作の傷害効果に対して抵抗性である線条体コリン作 用性ニューロンおよび視床ニューロンにおいて、この抗アポトーシス蛋白質のレ ベルが非常に上昇するのを観察した（Pulsinelli et al.，Ann．Neurol．11:491 -498，1982; およびSmith et al.，Acta Neuropathol．（Berl）64:319-332，19 84）。したがって、本発明者らは、一過的な脳虚血の損傷効果に対する、これら のニューロン集団の感受性は、一過的な虚血発作の後にNAIPレベルを上昇させる ことができる能力によって、少なくとも部分的に判定することができると考えて いる。K252aは、虚血損傷を抑制し、NAIP発現を上昇させる。 本研究の主要な発見は、神経防御化合物のK252aで処理すると、10分間の一過 的脳虚血の後にレベルが上昇し、CA1消失を抑制できるということである。本発 明者らの結果は、4-VOの前７日間、毎日１回、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射） を投与することによって、海馬における虚血損傷が減少することを示した。4-VO の後、５日間、CA1ニューロンの消失が調べられたため、K252aの神経防御効果は 一過性のものでないことを確認するには、さらなる研究が必要であろう。K252a の投与によって、血圧、ガス（pCO2およびpO2）、またはpHが変わることはなか ったが、このことは、これらの生理学的な変数を変えることによって、CA1の消 失が抑制されなかったことを示している。虚血損傷を抑制するためには、K252a による長期的な処理が必要だという事実は、前処理が、一過的な脳虚血の傷害効 果に対してCA1をより抵抗性にする防御蛋白質の発現を上昇させることを示唆し ている。この考えに合致して、本発明者らは、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射） を一度に投与すると、海馬におけるNAIP mRNAとNAIP蛋白質のレベルが上昇する ことを観察した。さらに、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射、１日１回を７日間） を長期的投与すると、この化合物を単回投与（0.1 mg／kg、皮下注射）した後に 見られるよりも、NAIP mRNAおよび蛋白質のレベルが大幅に上昇させた。したが って、K252aを一度に投与したときに較べて、長期的投与後のNAIPレベルが大幅 に上昇することが観 察されたことは、K252aの反復投与が、この化合物を単回投与するよりも強い神 経防御をもたらすことを示した報告と関連性を有するかもしれない（Smith-Swin tosky et al.，Exp．Neurol．141:287-296，1996）。K252aを一度に投与しても 、線条、視床、および脊髄においてNAIPレベルが上昇するが、このことは、この 化合物が、NAIP発現を上昇させることによって、これらの領域において、神経防 御効果を発揮することを示している。この仮説に一致して、K252aは、線条体ニ ューロン、および脊髄の運動ニューロンの初期培養に対して、神経栄養性様の効 果を有することが示されている（Glickman et al.，J．Neurochem．61:210-221 ，1993; およびGlickman et al.，J．Neurochem．64:1502-1512，1995）。 K252aがNAIPの発現を上昇制御する経路は、まだ決定されていない。いくつか の証拠の流れは、K252様化合物が、成長因子レセプターに結合したチロシンキナ ーゼを活性化することによって有利な効果を発揮することを示唆している。まず 、K252aは、NGFの生物学的効果のいくつかを模倣することができ（Nakanishi et al.，J．Biol．Chem．23:6215-6219，1988）、また、チロシンのリン酸化を促 進することができる（Maroney et al.，J．Neurochem，64:540-549，1995）。次 に、抗ホスホチロシン抗体を用いて、海馬の培養物を、低濃度のK252a（100 pM ）と、K252aの9-カルボン酸誘導体であるK252b（100 pM）に曝すと、分子量が40 kDa から200 kDaの範囲にある多数の蛋白質のチロシンのリン酸化を促進するこ とが、ウェスタンブロッティングによって示されている（Cheng et al.，J．Neu rochem．62:1319-1329，1994）。第三に、K252様化合物の神経防御効果は、選択 的なチロシンキナーゼ・インヒビターであるゲニスチン（genistein）によって 阻害されたが、ゲニスチンの不活性類似化合物によっては阻害されなかった（Ch eng et al.，J．Neurochem．62:1319-1329，1994）。本発明者らは、NAIPレベル を上昇させるK252aの能力が、その神経防御効果の原因であると考えている。 ウイルス介在性NAIP過剰発現は、神経防御的である。 インビボでNAIPを過剰発現できるアデノウイルス構築物を用いて、この抗アポ トーシス蛋白質のレベルが上昇したら、一過性の前脳虚血の損傷効果を、海馬に おいて抑制するか否かを判定した。対照として、バクテリアの酵素であるlacZを 含むアデノウイルス構築物を、脳の反対側の海馬に注射した。細胞数を数えたと ころ、NAIPアデノウイルスは、一過的な前脳虚血を発症させた後にCA1ニューロ ンの生存数を増加させることが明らかになった。アデノウイルス構築物から生じ たNAIPはMyc標識されていたため、Myc抗原を選択的に認識する抗体を用いた免疫 組織化学によって、感染細胞を同定することができた。Mycの免疫組織化学的な 検出によって、CA1ニューロンがNAIPアデノウイルスによって感染されたことが 明らかになった。しかし、細胞数を数えたところ、実際に、虚血発作から防御さ れたCA1ニューロン（15±2）よりも多数のCA1ニューロンが（７±１）、NAIPア デノウイルスに感染した。この不一致は、少なくとも３つの方法で説明されよう 。まず、ほんの少数のCA1ニューロンでNAIPが過剰発現すれば、一過的な全体的 虚血後のCA1ニューロンの広範な消失を起こす一連の過程を防止するには十分で あるということがあり得る。第二に、アデノウイルスの弱い感染により生じた低 度のNAIPレベルが、神経防御的であるとも考えられる。このように低いレベルの 、アデノウイルス由来のNAIP（Myc標識されている）は、免疫組織化学的に評価 すると、検出限界以下であった。第三に、本発明者らは、アデノウイルス感染が CA1ニューロンに限定されないことを観察した。グリア、および介在ニューロン など、海馬のその他の細胞型も、NAIPアデノウイルスに感染したように見えた（ データは示さない）。その結果、これらの細胞性集団におけるNAIPの過剰発現は 、虚血損傷に対するCA1ニューロンの抵抗性を間接的に強化するという有益な効 果を有するのかもしれない。 神経防御化合物は、NAIPレベルを上昇させることによって機能する。 ニュートロフィン、インシュリン様成長因子、および線維芽細胞成長因子など の成長因子のいくつかが、培養ニューロンを、励起毒性（excitotoxic）／虚血 傷害から保護することが分かっている（Mattson et al.，Exp．Neurol．124:89- 95，1993）。しかし、発作を治療するために、成長因子を臨床への応用すること には、血液脳関門を僅かしか通過できないことによる制約がある。この問題のし 解決として考えられるのは、血液脳関門を容易に通過して、成長因子の神経防御 効果を模倣する低分子量化合物を使用することである。このような化合物の一つ は、インビトロで低濃度（fM〜nM）で神経防御効果を発揮することが分かってい る、バクテリアのアルカロイドK252aである（Kase et al.，J．Antiobiot．39:1 05 9-1065，1986; Knusel and Hefti，J．Neurochem．59(6):1987-1996，1992）。 海馬、皮質、中隔の初期培養において、K252aは、グルコース欠乏によって誘導 されるニューロン傷害に対して防御を行なう（Cheng et al.，J．Neurochem．62 :1319-1329，1994）。K252aは、ラット胚の脊髄培養におけるコリンアセチルト ランスフェラーゼ（ChAT）活性の上昇を測定したところ、神経栄養性様活性を有 することも報告されている（Glickman et al.，J．Neurochem．61:210-221，199 3; およびGlickman et al.，J．Neurochem．64(4):1502-1512，1995）。これら のインビトロでの発見と符合するように、K252aの類似化合物（CEP1347）が、発 生段階によってプログラムされた運動ニューロン死と、成体の運動ニューロンに おけるChATの消失を、インビボで阻害する（Glickman et al.，Soc．Neuro．Abs t．441，1994）。海馬に関しては、K252aを全身に単回投与すると、海馬内に注 入したカイニン酸による起こるCA3ニューロンの消失を減衰させる（Smith-Swint osky et al.，Soc．Neuro．Abst．2130，1995）。K252aの長期的投与を２ケ月行 なうと、１回の前処理後に見られる防御よりも、かなり強い防御が生み出される （Smith-Swintosky et al．1995、前記）。虚血性細胞死には、励起毒性（excit otoxic）メカニズムが関係していると考えられているため、本発明者らは、K252 aによる前処理が、一過的な全体虚血の後に、CA1海馬ニューロンの消失を抑制す るか否かを判定した。本発明者らは、NAIP発現を誘導することによって、K252a が神経防御になることを理論化した。よって、本発明者らは、視床、海馬、線条 、および脊髄におけるNAIP発現に対する、K252a投与の効果を調べた。 NAIPを免疫組織化学的に検出すると、脊髄に加えて、皮質（すなわち、錐体ニ ューロン）、海馬、視床、および線条などの、さまざまな前脳構造体にも、抗ア ポトーシス蛋白質が存在していることが明らかになる。海馬のNAIP-Iは、CA1、C A2、CA3、およびCA4錐体ニューロンと、歯状回の顆粒細胞に局在していた。視床 の中では、NAIP-Iは、主に、この構造体の腹側-内側、および腹側-外側の側面に あるニューロンによって提示される。NAIPがアポトーシス死の強力なインヒビタ ーだとすると、本発明者らは、NAIP枯渇が、棘筋萎縮で見られる視床異常の理由 であると考えている（Murayama et al.，Acta．Neuropathol．81:408-417，1991 ）。線条中のNAIP-Iは、ニューロン集団の約１％に限定されている。免疫組織蛍 光による二重標識により、線条体NAIP-Iは、コリン作用性ニューロンの中にのみ 局在することが示されている。これらの細胞は、介在ニューロンであり、線条体 ニューロン集団の約１％を占めていることが知られている（Semba and Fibiger ，Progress in Brain Res．79:37-63，1989）。 概要 本発明者らの発見は、K252aのような小さな分子量の化合物が、神経防御作用 を発揮するのに十分な量を周辺に投与されると、血液脳関門を通過できることを 示している。さらに、本実験の結果、これらの化合物は、抗アポトーシス蛋白質 NAIPのレベルを上昇させることによって、有利な作用をもたらすことが示されて いる。したがって、NAIPの免疫組織化学的検出は、神経防御化合物と推定される ものを同定するための、安価で迅速な、インビボの方法として役に立つかもしれ ない。さらに、NAIPレベルの上昇は、神経防御を得るための重要な治療法である 。ニューロンの生存に関する分子的な基礎をよく理解することによって、神経変 性病のよりよい治療法の開発のための新しい方法が明らかになる。 NAIPおよびIAPレベルは、軸索切断を生き延びた細胞において高くなる。 上記に加えて、本発明者らは、軸索切断を生き延びた細胞において、NAIPおよ びXIAPのレベルが高くなることに気づいた。このことは、これらの蛋白質（およ び生物学的活性を高める化合物）を、神経修復を促進するために用いるうること を示している。 中枢神経系の虚血作用の後で起こる細胞死を防止または緩和するための治療法。 本発明者らの発見を基にして、本発明者らは、NAIPまたはIAPポリペプチドが 十分にないことが、虚血発作の後に、または神経変性病の進行中に起こるニュー ロン死の一次的な発病メカニズムであるという結論に達した。NAIPのレベル、ま たはIAPのレベルを上昇させる治療措置によって、これらの症状の一部としてよ く起こる、破壊的な細胞死を防止または緩和する。これらの治療法は、虚血また は神経変性病になる可能性が高くなっている発症前の人を治療するためにも適当 である。例えば、虚血作用を経験している患者、例えば、外傷性傷害、発作、心 筋梗塞、一過性虚血発作、またはその他、CNS組織への血流を制限する症状をも っている患者には、高い蛋白質活性を提供することが有用であろう。遺伝的な条 件によ って、高い危険を抱えている患者も、これらの治療の候補である。NAIPまたはIA Pの生物学的活性レベルを上昇させる治療も、また、CNSへの血流を危うくするよ うな症状を起こす危険のある患者に対して提供されよう。例えば、発作に病歴を 有する患者、および頭蓋内手術を受けている患者は、予防的なNAIPまたはIAP治 療による恩恵を受けられよう。 ｉ）NAIPまたはIAP遺伝子治療 NAIPの発現は、虚血後の細胞の生存率が上昇することと比例しているため、NA IP、およびこれに関連するIAP遺伝子を、神経防御のための遺伝子治療に用いる ことも考えられる。 虚血による細胞死、または神経変性（例えば、線条体ニューロン、または新皮 質層３、５、および６ニューロンへの向性を有する）の影響を受ける細胞に対す る適当な向性を有するレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデ ノ関連ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、またはこの他のウイルスベ クターを、治療用のNAIPまたはIAP遺伝子構築物のための遺伝子導入輸送システ ムとして用いてもよい。この目的にとって有用なベクターは、一般的に知られて いる（ミラー（MIller），Humn Gene Therapy 15-14，1990; フリードマン（Fri edman），Science 244:1275-1281，1989; イグリティスとアンダーソン（Egliti s and Anderson），BioTechniques 6:608-614，1988; トルストシェフとアンダ ーソン（Tolstoshev and Anderson），Current Opinion in Biothechnology 1:5 5-61，1990; シャープ（Sharp），The Lancet 337:1277-1278，1991; コルネッ タら（Cornetta et al.），Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322，1987; アンダーソン（Anderson），Science 226:401-409，1984; モー エン（Moen），Blood Cells 17:407-416，1991; およびミラーとロスマン（Mill er and Rosman），Biotechneques 7:980-990，1989; ルガラサルら（Le Gal La Salle et al.），Science 259:988-990，1993; およびジョンソン（Johnson）， Chest 107:77S-83S，1995）。ウイルスベクターは、特によく開発されており、 臨床場面でも使用されている。 ウイルス以外の方法を用いて、治療用DNAを導入しないと、虚血、または神経 変性作用の後に死ぬ可能性の高い細胞の中に治療用DNAを導入する。例えば、NAI Pま たはIAPを、頭蓋内リポフェクチン法（フェルグナーら（Felgner et al.），Pro c．Natl.Acad．Sci．USA 84:7413，1987; オノら（Ono et al.）Neuroscience L ett．117:259，1990; ブリガムら（Brigham et al.），Am．J．Med．Sci．298:2 78，1989; スタウビンガーとパパハジョポウロス（Staubinger and Papahadjopo ulos），Meth．Enz．101:512，1983）、アシアロオロソムコイド-ポリリシン結 合法（ウおよびウ（Wu and Wu），J．Biol．Chem．263:14621，1988; ウら（Wu et al.），J．Biol．Chem．264:16985，1989）、またはより好ましくはないが、 外科手術状態の下でのマイクロインジェクション（ウォルフら（Wolff et al.） ，Science 247:1465，1990）によって、ニューロン細胞の中に導入してもよい。 上記の方法にとって、治療用NAIPまたはIAP DNA構築物は、好ましくは、虚血 または神経変性が起きた部位に（例えば、頭蓋内注射によって）施用されるが、 起きた部位の近くの組織、またはその部位の近くの領域に血液を供給している血 管に施用してもよい。 遺伝子治療構築物において、NAIPまたはIAP cDNAの発現は、適当なプロモータ ー（例えば、ヒトサイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、またはメタロチ オネインプロモーター）から起こるようになっており、また、その産生は、所望 の哺乳動物の制御因子によって調節される。例えば、必要に応じて、ニューロン 細胞または軸索細胞における遺伝子発現を選択的に指令することが知られている エンハンサーを用いて、NAIPまたはIAPの発現を行わせてもよい。 またはNAIPもしくはIAPゲノミッククローンが治療用構築物として利用される ときには、NAIPまたはIAPの発現は、好ましくは、異種生物に由来する制御配列 、例えば、上記のプロモーター、または制御配列のいずれかによって調節される 。 好ましくはないが、NAIPまたはIAP遺伝子治療は、NAIPまたはIAP mRNAを虚血 が起きた領域に直接投与して行なわれる。このmRNAは、標準的な技術によって産 生され、単離されるが、最も容易なのは、高効率プロモーター（例えば、T7プロ モーター）の調節下で、NAIPまたはIAP cDNAを用いたインビトロ転写によって産 生することである。NAIPまたはIAP mRNAの細胞への投与は、上記し、一般的に知 られている、核酸を直接投与するための方法の何れかによって実施される。 理想的には、上記のいずれかの遺伝子治療法による、NAIPまたはIAP蛋白質の 産 生によって、細胞内のNAIPまたはIAPのレベルが、少なくとも、通常は、虚血、 またはその他の作用で、ニューロン細胞死を起こすことが知られている作用を生 き延びる細胞におけるNAIPまたはIAPの細胞内レベルと同じになる。NAIPまたはI APが介在する遺伝子治療法による治療を、従来からある抗虚血治療法、または神 経防御治療法と組み合わせてもよい。 レトロウイルス遺伝子導入治療法、またはその他のウイルスベクター系によっ て、NAIP、HAIP1、HAIP2、またはXIAPポリペプチドの断片または誘導体を投与す ることもできる。NAIP、HAIP1、HAIP2、またはXIAPの有用な断片または誘導体の 投与は、上記のようにして、これらの断片または誘導体をコードする核酸を、NA IP、HAIP1、HAIP2、またはXIAPの完全な遺伝子の代わりに、遺伝子治療用ベクタ ーに挿入して行なってもよい。このような構築物を、本明細書の別の部分に提供 されている、虚血に対するNAIPの効果を検査するための方法を用いて検査しても よい。 ii）NAIPまたはIAPポリペプチドの投与 野生型NAIPまたはIAPを、虚血を起こした、または虚血を起こす可能性が高い 患者に投与してもよい。この方法にとって有用なポリペプチドは、患者に提供さ れてとき、NAIPまたはIAPの生物学的活性を２倍以上上昇させ、それによって、 神経防御効果を提供するポリペプチドである。 治療に用いるために、実験室で改変されたNAIPまたはIAPポリペプチド、また は核酸を投与してもよい。 有用な神経防御ポリペプチドを安定させ、および／または標的とするために、 NAIPまたはIAPポリペプチドをリガンドに融合した蛋白質を用いてもよい。例え ば、破傷風毒素、カルシウムチャンネル遮断因子、トランスフェリン、ポリオウ イルスのエピトープ、神経ペプチド断片、もしくはステロイドホルモンのアンド ロゲン、またはそれらの断片で、患者のニューロンを標的として防御ポリペプチ ドを輸送するのに十分なものに融合したNAIPまたはIAPポリペプチドを含む融合 蛋白質を用いてもよい。 iii）CNSの中で、NAIPまたはIAP活性を上昇させる化合物の投与 スタウロスポリン様、K252a様アルカロイド（K252aを除く）、ATP類似化合物 、 またはプロテインキナーゼ・インヒビターという化合物が、NAIPまたはIAPポリ ペプチドを増加させることができるかをスクリーニングし、もし効果的であれば 、それを、虚血、神経変性、または外傷性傷害を起こす危険があるか、それを患 っている患者に投与することができる。このような化合物を同定する方法を、下 記で提供する。 NAIPまたはIAPの調節因子を、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形 剤とともに、投薬単位毎の形態にして投与してもよい。従来からの薬学的な実践 法を用いて、虚血、神経変性、または外傷性傷害を起こす危険があるか、それの 発症前の患者に、NAIPまたはIAPを投与するのに適当な処方剤、または化合物を 提供してもよい。適当な投与経路として、例えば、頭蓋内投与、非経口投与、静 脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼窩内投与、眼からの投与、脳室内投与、包 内投与、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアロゾルによる投 与、または経口投与が用いられるかもしれない。治療処方薬は、水溶液または懸 濁液の形状かもしれない。経口投与するためには、処方薬は、錠剤またはカプセ ルの形状になっているかもしれない。また、鼻腔内用処方薬としては、粉末、鼻 腔ドロップ、またはエアロゾルの形状になっているかもしれない。 当業において周知の、処方薬を作製するために方法は、例えば、「レミントン の薬剤科学」の中に述べられている。非経口投与のための処方薬は、例えば、賦 形剤、滅菌水、もしくは食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキリン グリコール、植物油脂、または水素添加したナフタレンを含んでいるかもしれな い。生物適合的で、生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド・コ ポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン・コポリマーを用 いて、化合物の放出を調節してもよい。NAIPまたはIAP調節因子化合物を脳内輸 送するための、この他の有用なシステムには、ポンプ、移植可能な注入システム 、およびリポソーム法が含まれる。 必要に応じて、NAIPまたはIAP調節因子化合物による治療は、より伝統的な抗 虚血治療と組み合わせてもよい。 iv）予防的なNAIPまたはIAP療法 神経防御が必要な作用の発生に感受性だと診断された患者において、発症前に 、上記の治療の何れかを投与してもよい。特に、標準的な投薬量および投与経路 （上記参照）によって、NAIPもしくはIAPの発現、またはNAIPもしくはIAPの生物 学的活性を上昇させることが分かっている化合物を投与してもよい。 NAIPまたはIAP活性を上昇させる神経防御的化合物のスクリーニング。 試験化合物の曝したときの、NAIPもしくはIAPの発現、またはNAIPもしくはIAP 蛋白質をモニターすることによって、その化合物が抗虚血治療薬となる可能性が あるか否かを判定できよう。一つの方法では、NAIPまたはIAP mRNAを発現してい る細胞の培養液に、候補分子を、さまざまな濃度で添加する。そして、例えば、 ハイブリダイゼーション用プローブにNAIPまたはIAP cDNA（またはcDNA断片）を 用いた標準的なノザンブロット解析（アウスウベルら（Ausubel et al.）、前記 ）によって、NAIPまたはIAPの発現を測定する。候補分子の存在下でのNAIPまた はIAPの発現のレベルを、同じ培養培地中の同じ細胞について、候補分子が存在 しないところで測定したレベルと比較する。 必要に応じて、候補調節因子の発現に対する効果は、同じ一般的な方法、およ びNAIPまたはIAP特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング、または免疫 沈降などの標準的な免疫学的検出技術を用いて、別のものおいて、NAIPまたはIA P蛋白質の産生レベルを測定してもよい。 候補調節因子は、精製された（または実質に精製された）分子であるかもしれ ないし、または化合物の混合物（例えば、細胞から得られた抽出物、または上清 ；アウスウベルら（Ausubel et al.）、前記）の成分の一つであるかもしれない 。混合化合物アッセイ法で、候補化合物のプール（例えば、HPLCまたはFPLCなど の標準的な精製技術によって産生されたもの）の部分集合を次第に小さくしなが ら、NAIPまたはIAPの発現を調節することを示す単一の化合物、または最小の化 合物混合液が分かるまで、NAIPまたはIAPの発現をテストする。 NAIPまたはIAP調節因子の候補には、ペプチドも、非ペプチド（例えば、細胞 抽出物、哺乳動物の血清、または哺乳動物の細胞が培養されていた増殖培地など の中に見られるペプチド、または非ペプチド）も含まれる。NAIPまたはIAP発現 の特に有用な調節因子には、スタウロスポリン様化合物、K252a様化合物、ATP類 似化合物、またはプロテインキナーゼ・インヒビターが含まれる。 本発明において、NAIPもしくはIAPの発現、またはNAIPもしくはIAPの防御活性 を促進する分子が特に有用だと考えられる。そのような分子は、例えば、治療薬 として用いられるかもしれない。 NAIPまたはIAPの発現または活性のレベルに対して有効であることが分かった 調節因子は、動物モデルでも有効なことを確認し、もし有効であったら、抗虚血 治療薬として用いられよう。好ましくは、このような化合物は神経防御的である 。 NAIPまたはIAP蛋白質および核酸の配列。 NAIP遺伝子の配列は、図11、および1994年10月18日に提出された英国出願連続 番号9421010.2、および1997年1月17日に提出されたPCT／IB97／00142に記載して ある。IAPの配列は、1995年8月4日提出のUSSN08／511,485、および1995年12月22 日提出のUSSN08／576,956に記載されている。 NAIPおよびIAP蛋白質の発現。 一般的に、本発明に係るNAIPまたはIAP蛋白質は、NAIPもしくはIAPの全部もし くは一部、またはIAPをコードするcDNA断片（例えば、上記のcDNA）を適当なベ クターに入れたものを用いて、適当な宿主細胞を形質転換して産生されよう。 分子生物学の分野の当業者には、さまざまな発現系を用いて組換え蛋白質が提 供されることが分かるであろう。用いられる宿主細胞が正確に何であるかは、本 発明にとって重要ではない。NAIPまたはIAP蛋白質は、原核生物宿主（例えば、 大腸菌）、または真核生物宿主（例えば、サッカロマイセス・セレビシアエ（Sa ccharomyces cerevisiae）、例えば、Sf21などの昆虫細胞、または例えば、COS1 、NIH 3T3、またはHeLa細胞などの哺乳動物細胞）の中で産生される。これらの 細胞は、広範な供給源から入手することができる（例えば、米国基準培養株コレ クション、メリーランド州ロックランド；また、例えば、アウスウベルら（Ausu bel et al.）、分子生物学の最新プロトコール、ジョン・ウィリー・アンド・サ ンズ社（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、1994）。形質転換の方法、およ び発現ベクターの選択は、選択した宿主システムに依存する。形質転換法は、例 えば、アウスウベルら（Ausubel et al.）（前記）で説明されており、発現ベク ターは、例えば、クローニングベクター：実験マニュアル（P.H．Pouwels et al .，1985，Supp．1987）で提供されているものから選択される。 好ましい発現システムの一つは、クローンテック社（カリフォルニア州パルア ルト）から購入することができるバキュロウイルスシステム（例えば、pBacPAK9 ベクター）である。必要に応じて、このシステムは、例えば、エバンら（Evan e t al.）（Mol．Cell Biol．5:3610-3616，1985）によって説明されたmyc標識法 などの、別の蛋白質発現技術と組み合わせて用いてもよい。 または、NAIPもしくはIAPは、安定して形質転換された哺乳動物細胞系によっ て産生される。哺乳動物細胞を安定して形質転換するのに適した多くのベクター は、一般に入手可能である、例えば、ポーウェルズら（Pouwels et al.）（前記 ）参照。また、このような細胞系を構築する方法も一般に利用可能である、例え ば、アウスウベルら（Ausubel et al.）（前記）参照。実施例の一つにおいて、 NAIPまたはIAP蛋白質をコードしているcDNAが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHF R）遺伝子を含む発現ベクターの中にクローニングされている。プラスミドの組 み込み、すなわち、NAIPまたはIAP蛋白質をコードする遺伝子の宿主細胞の染色 体への組み込みは、（例えば、アウスウベルら（Ausubel et al.）に説明されて いるように）細胞培養培地に0.01〜300μMのメトトレキセートを含ませることに よって選抜される。この優性選抜は、ほとんどの細胞について行うことができる 。組換え蛋白質の発現は、DHFRの介在によって、形質転換された遺伝子が増幅す るために上昇する。遺伝子増幅を担う細胞系を選抜するための方法は、アウスウ ベルら（Ausubel et al.）（前記）で説明されているが、このような方法は、一 般的に、メトトレキセートのレベルを段階的に増加させたものを含む培地の中に 展開された培養細胞を含む。この目的のために広く用いられている、DHFRを含む 発現ベクターには、pCVSEII-DHFR、およびpAdD26SV(A)が含まれる（アウスウベ ルら（Ausubel et al.）（前記）で説明されている）。安定して形質転換した細 胞系の選抜、またはDHFRが介在する遺伝子増幅のDHFR選抜に好ましい宿主細胞に は、上記で説明されている宿主細胞のいずれか、または好ましくは、DHFR欠損CH O細胞系（例えば、CHO DHFR細胞、ATCC寄託番号CRL9096）がある。 組換えNAIPまたはIAP蛋白質が発現されたら、例えば、アフィニティークロマ トグラフィーを用いて、それを単離する。実施例の一つにおいて、抗NAIPまたは 抗IAP蛋白質抗体（例えば、本明細書において説明されているようにして産生さ れた もの）をカラムに付着させて、NAIPまたはIAP蛋白質を単離するために用いても よい。アフィニティークロマトグラフィーの前に、標準的な方法によって、NAIP またはIAP蛋白質を有する細胞の溶解および分画を行なう（アウスウベルら（Aus ubel et al.）前記参照）。 組換え蛋白質が単離されたら、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラ フィーを用いて、さらに精製することができる（例えば、フィッシャー（Fisher ）、生化学および分子生物学の実験技術、ワークとバーデン（Work and Burdon ）編、エルスビア社（Elsevier）、1980）。 本発明のポリペプチド、特に短いNAIPまたはIAP蛋白質の断片を、化学合成に よって（例えば、固相ペプチド合成、第二版、1984、イリノイ州ロックフォード のピアス化学社（The Pierce Chemical Co.）で説明されている方法によって） 作出することもできる。 ポリペプチドを発現させ、また精製する、これらの一般的な技術を用いて、有 用なNAIPまたはIAPの断片または類似体を産生して、単離することができる（本 明細書において説明されている）。 その他の態様 その他の態様において、本発明には、ショウジョウバエ、マウス、またはヒト のNAIPまたはIAPポリペプチドと実質的に同一の蛋白質が含まれる。また、この ような相同化合物には、その他の実質的に純粋な天然のNAIPまたはIAP蛋白質、 また、対立遺伝子の変異蛋白質、自然突然変異蛋白質、誘発突然変異蛋白質、緊 密度の高い条件の下で、または好ましくはないが、低い緊密条件（例えば、少な くとも40塩基長のプローブを用い、40℃で2XSSCで洗浄する）の下で、本明細書 において説明されているNAIPまたはIAP DNAの配列にハイブリダイズするDNAをコ ードする蛋白質、およびNAIPまたはIAPポリペプチドに対して作製された抗血清 が特異的に結合する蛋白質が含まれる。この語には、また、NAIPまたはIAP部位 を含むキメラポリペプチドが含まれる。 本発明は、さらに、天然のNAIPまたはIAPポリペプチドの類似化合物を使用す ることを含む。類似化合物は、アミノ酸配列の違い、翻訳後修飾、またはその両 方によって、天然のNAIPまたはIAP蛋白質と異なりうる。本発明の類似化合物は 、一 般的に、天然のNAIPまたはIAPのアミノ酸配列の全部または一部と、少なくとも8 5％、より好ましくは90％、そして、最も好ましくは95％、さらに99％の同一性 を示す。配列を比較する長さは、少なくとも15アミノ酸残基、好ましくは25アミ ノ酸残基、より好ましくは、35アミノ酸残基よりも長い。修飾には、インビボ、 およびインビトロでのポリペプチドの化学誘導、例えば、アセチル化、カルボキ シル化、リン酸化、またはグリコシル化が含まれ、このような修飾は、ポリペプ チドの合成もしくは加工、または単離された修飾酵素を用いた処理の後に起こる 。また、類似化合物は、天然のNAIPまたはIAPポリペプチドと、一次配列が変更 していることによって異なりうる。これらには、遺伝的変異体、自然のものと誘 発されたもの（例えば、放射線照射、もしくはエタンメチル硫酸によるランダム 突然変異誘発、またはサムブルック、フリッツ、およびマニアティス（Sambrook ，Fritsch and Maniatis）分子クローニング：実験マニュアル（第二版）CHSプ レス、1989、またはアウスウベルら（Ausubel et al.）前記において説明されて いる部位特異的突然変異誘発によってできたもの）が含まれる。また、環状化ペ プチド、分子、および類似化合物で、例えば、L-アミノ酸以外の残基を含むもの 、または例えば、βもしくはγアミノ酸など、天然にはない、もしくは合成した アミノ酸を含むものが含まれる。 完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、NAIPまたはIAPポリペプチドの断 片の使用も含む。本明細書で用いるときには、「断片」という用語は、少なくと も20個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも30個の連続したアミノ酸、よ り好ましくは少なくとも50個の連続したアミノ酸、また、最も好ましくは少なく とも60個から80個の連続したアミノ酸を意味する。NAIPまたはIAPポリペプチド の断片は、当業者にとり既知の方法によって生成することができ、または蛋白質 の通常のプロセシング（例えば、本来のポリペプチドから生物学的活性に必要の ないアミノ酸の除去、または選択的なmRNAのスプライシング、もしくは選択的な 蛋白質プロセシングによるアミノ酸の除去）によってできる。 本明細書において言及された出版物と特許出願はすべて、各独立した出版物、 および特許出願を、特異的かつ個別に参照として組み入れられると指示したのと 同じように、参照として本明細書に組み入れられる。 以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、制約することは意図 していない。実施例 実施例１：材料および方法 動物。成体のオスのウィスターラット（250〜275 g；モントリオール、チャー ルズリバーズ社（Charles Rivers））を２匹ずつケージに入れて、温度調節した 環境下に、12時間明期／12時間暗期という周期で置き、水とピュリナ社（Purina ）の実験室用飼料を自由に摂取させた。動物の処理はすべて、カナダ医学研究審 議会によって認められている実験動物の飼育と利用に関する手引きに適合してい た。 組織調製。動物は、ペントバルビタール（100 mg／kg、腹腔内）で麻酔をかけ 、200 mlの食塩水（0.9％）で経心臓的に（transcardially）潅流した後、４％ のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（0.1 M）で潅流した。脳は、一晩 、後固定（postfix）した後、10％スクロースを含むリン酸緩衝液（0.01 M）に 入れて、２日間凍結防止した。低温槽を用いて、適当な脳領域から12μmの厚さ の切片を切り出して、NAIP-LIのために処理した。 一過性前脳虚血モデル。4-VO法（プルシネリとブチャン（Pulsinelli and Buc han），Stroke 19:913-914，1988）の公開されている改変された方法（プルシネ リら（Pulsinelli et al.）、前記）を用いて、一過的な前脳虚血を行なった。 簡単にいうと、250 gの重さのある成体のオスのウィスターラット（250〜275 g ；モントリオール、チャールズリバーズ社（Charles Rivers））に、1.5％ハロ タンを用いて麻酔をかけた。そして、首の背中側の中線切開によって、第一頚椎 の翼状の孔に近づいた。電気メスにより、頚椎動脈を永久的に閉塞した。腹側か らの首の中線切開によって、頚動脈を分離し、絹の結紮糸でそれらの回りに緩く 巻いた。気管、食道、外頚静脈、および総頚動脈の後ろ側という首の領域に絹の 縫合糸を通らせた。結紮糸の端は、接着テープで首すじに緩やかに固定した。そ して、局所性のキシロカインゼリーで切開部を閉じた。 翌日、ラットを無作為に２つの群に分け、10分間の前脳虚血（実験区）、また は頚動脈の閉塞なしの操作（模擬区）を行なった。前脳虚血は、総頚動脈の回り に巻いた絹の結紮糸を用いて総頚動脈を持ち上げ、微小動脈瘤クリップ（#160-8 63、Gerge Tiemann & Co.，Plainview，NY）血管を閉塞して行なった。次に、副 行循環を遮断するために、首の筋肉の回りに巻いた結紮糸を締めた。側頭筋の中 に置かれた熱電対によって、間接的に脳の温度を測定した（Busto and Dietrich ，J．Cerebral Blood Flow Metab．7:729-738，1987）。外から暖めて、体温を3 6〜37℃に保った。微小動脈瘤クリップを外し、首の結紮糸を緩めて、虚血を終 結させた。4-VOの間に痙攣を起こした動物、または再潅流の後に十分な瞳孔拡張 を起こさなかった動物、または虚血の間に立ち直り反射がなくなった動物は、実 験から除外した。 K252aの一度の投与および長期的投与。本発明者らは、K252aの一度の投与（0. 1 mg／kg、皮下注射）が、海馬、視床、および線条におけるNAIP-LIに与える効 果を判定した。それぞれ３匹の動物からなる２つの群に、K252a（0.1 mg／kg、 皮下注射）を注射し、３時間、または24時間生かしておいた。第３群は、賦形剤 対照として用いた。これらの動物に賦形剤（1 ml／kg；10％シクロデキストリン と5％DMSOを含む水溶液）を注射した。NAIPとNeuNのレベルに対するK252aの効果 を判定するために、本発明者らは、ウェスタンブロッティングにより蛋白質レベ ルを測定した。それぞれ３匹の動物からなる２つの群に、賦形剤（1 ml／kg、皮 下注射）かK252a（0.1 mg／kg、皮下注射）を注射し、３時間に殺した。本発明 者らは、海馬において、それぞれインサイチューハイブリダイゼーション組織化 学とウェスタンブロッティングによって、NAIP mRNAレベル、およびNAIP蛋白質 のレベルに対する、K252aの一度投与および長期的投与の効果を比較した。それ ぞれ６匹の動物からなる３つの群に、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）、K252a（0 .1 mg／kg、皮下注射）、またはK252a（0.1mg／kg、皮下注射、１日１回を７日 間）を注射し、注射して３時間後に殺した。本発明者らは、４匹の動物において 、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射）が、血圧、ガス（O2およびCO2）、およびpHに 与える影響を調べた。血圧、ガス、およびpHをモニターするために、ポリエチレ ン製のカテーテルを大腿動脈にカニューレ挿入した。 一過的な全体的虚血後の、CA1ニューロンの消失に対する、K252a投与の効果。 それぞれ６匹の動物からなる２つの群に、賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）、また はK252a（0.1 mg／kg、皮下注射）を１日１回、７日間皮下注射（s.c.）した。 最後の注射をして３時間後に、すべての動物に4-VOを行ない、循環が回復したら すぐに、第２の注射を行なった。３つめの群には、前記の賦形剤を注射して、模 擬4-VOを行なった。4-VOまたは模擬処理の後、K252a（0.1 mg／kg、皮下注射） 、または賦形剤（1 ml／kg、皮下注射）を１日１回、５日間、動物に与え続けた 。動物はすべて、最後の注射の４時間後に殺し、また、CA1における細胞消失を 評価するために、NeuNを免疫染色するように脳試料を処理した。 ウイルス介在性NAIP過剰発現の、一過的な前脳虚血の発生によって起こるCA1 ニューロンの消失に対する効果の調査。６匹のオスのラットに、lacZ、またはmy c標識したNAIPを含む組換えアデノウイルス構築物（Ad5d1xDNA-TPC）を、それぞ れ、左の背中側の海馬と、右の背中側の海馬の中に、定位的に注射した。28ゲー ジの針を用いて、AP-3.6、ML±2.2、およびブレグマ20からDV-3.2の座標（mm） のところに、アデノウイルスベクター（10分間にわたって3μl注射した；１×106 粒子／μl）を注射した。ウイルス構築物は、以前、リストンら（Liston et al .）によって説明されている。７日後に、各動物に10分間の4-VOを行なった。す べての動物を５日後に殺した。CA1ニューロンの消失は、海馬のCA1領域における NeuN免疫反応性ニューロンの数を数えて、組織学的に評価した。６匹の動物から なる第２の群に、lacZを、背側海馬の中に片側注射した。lacZ、またはmyc標識 したNAIPを含むアデノウイルス構築物を注射したニューロンを、それぞれ、X-ga l染色、およびmyc蛋白質標識の免疫組織化学的検出によって同定した。 NAIPリボプローブ。マウスNAIPとヒトNAIPの間で保存されている塩基配列に対 して作られたプライマーを用いて、ラットの海馬mRNAから、RT-PCRにより、NAIP リボプローブの鋳型を作製した。プラスミドpcDNA3（Invitrogen，Inc.）のEcoR I部位の中に227 bpの配列をライゲーションした。MAXIスクリプト（MAXIscript ）インビトロ転写キット（アンビオン社（Ambion，Inc.））を用いて、鋳型化し た直鎖状プラスミドから、センス鎖、およびアンチセンス鎖の32S標識したリボ プローブを作製した。特異的な活性は、0.6〜1.2×108cpm／μlの範囲にあった 。 インサイチューハイブリダイゼーション組織化学。凍結切片（12μmの厚さ） を、センス鎖、またはアンチセンス鎖のNAIPリボプローブ（１×106cpm／100μl ／ スライド）を含むハイブリダイゼーション用緩衝液の中で、56℃で一晩インキュ ベートした。そして、切片をリボヌクレアーゼＡ（10μg／ml）で、35℃で30分 間処理し、2×SSCで30分間洗浄した。乾燥させた後、スライドを、42℃でコダッ クNTB-2乳化剤（蒸留水で1:1に希釈したもの）に漬けて、乾燥させ、4℃に２週 間感光させた。 ポリクローナル抗血清および免疫組織化学。アフィニティー精製されたポリク ローナル抗体を用いて、NAIP-Iを検出した。この抗体は、NAIPのエクソン７〜11 （150アミノ酸断片）に対して、ウサギの中で作製したものである。以前、ロバ ートソンとフィビガー（Robertson and Fibiger）（Neuroscience 46:315-328， 1992）によって説明された標準的な処理法を用いて、免疫組織化学的検査法を行 なった。簡単に云うと、内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断するため、0.3％ の過酸化水素を含む0.02 Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）で、切片（12μmか30μm の厚さ）を10分間洗浄した。そして、切片をPBSで３回洗浄して、0.3％TritonX- 100、0.02％アジド、およびNAIPに対する一次抗血清（例えば、1:750、もしくは 1:1000、またはA60（1:1000）に希釈する）を含むPBSの中で48時間インキュベー トした。次に、切片をPBSで３回洗浄し、ビオチン標識したロバ抗ウサギ第二抗 血清（1:500）とともに16時間インキュベートした。そして、切片をPBSで３回洗 浄し、0.3％TritonX-100とストレプトアビジン-ホースラディッシュ・ペルオキ シダーゼ（1:100；Amersham）を含むPBSとともに３時間インキュベートした。PB Sで３回洗浄した後、切片を、0.1 M酢酸緩衝液、pH 6.0で濯いだ。以前説明され た、グルコースオキシダーゼ-DAB-ニッケル法（Shu et al.，Neurosci．Lett．8 5:169-171，1988）を用いて、この反応を可視化した。酢酸緩衝液で洗浄して反 応を終結させ、切片を、クロム-アルミニウムでコートしたスライドに載せた。 乾燥させた後、段階的に連続希釈したアルコールで切片を脱水し、キシレンを２ 回変えて、顕微鏡で観察するために、カバーガラスをかけた。ChAT様免疫反応性 （ChAT-LI）の検出に用いられた抗体は、ヒト胎盤のChAT（Chemicon Internatio nal Inc.）に対して作製し、アフィニティー精製されたヤギ抗体である。中脳に おけるドーパミン作用性ニューロンを、TH（Incstar）に対するモノクローナル 抗体を用いて同定したが、小脳皮質の中で、プルキニエ細胞の位置を決めるため には、CaBP（Sigma） に対するモノクローナル抗体を用いた。 二重標識免疫組織蛍光検査法。0.3％TritonX-100を含むPBSの中で、48時間、 ４℃で、線条、前脳基底、脳幹、および脊髄からの切片を、ウサギ抗NAIP（1:30 0）および抗ChAT（1:500）とともにインキュベートし、腹側中脳切片を抗NAIP（ 1:300）および抗TH（1:500）とともにインキュベートし、また、小脳切片を抗NA IP（1:300）および抗CaBP（1:500）とともにインキュベートした。切片は、PBS で濯いでから、インドカルボシアニン（Cy3）標識したロバ抗ウサギ血清と、使 用する24時間前に調製した、適当にビオチニル化した第二抗血清（1:100Amersha m；1:50Amersham）とともにインキュベートした。室温に２時間、37℃に１時間 置いた後、切片をPBSで濯いだ。そして、切片を、ストレプトアビジン-フルオロ イソチオシアネート（FITC、1:50Amersham）と、TritonX-100を含ないPBSの中で 、室温で３時間インキュベートした。フェニルアミンジアミン（0.1 mM）と90％ グリセロールを含むPBSのマウンティング培地を用いて、スライドにカバーガラ スをかけ、FITCとCy3を可視化するための一重、および二重フィルターを付けた ツァイス・アクシオプラン（Zeiss Axioplan）顕微鏡を用いて調べた。 組織調製物。視床、海馬、線条、および脊髄を氷上で切り出した。まず、各脳 領域（約30〜50 mg）を、1 mlのスクロース緩衝液（0.25 Mスクロース，1 mM EG TA，15 mMトリス塩酸 pH 6.8）の中で、2mlの緩いドーンス（Dounce）型ホモジ ナイザー（A型、約15ストローク）でゆっくりと破砕した。また、緩衝液には、1 mM PMSF、2μg／mlのロイペプチン、および5μg／mlのアプロチニンを加えて、 氷上に置いた。8000 gで20分間遠心分離して（Costar microfuge）、細胞沈殿物 を得た。上記と同じスクロース緩衝液0.4から0.7 mlの中で細胞を懸濁してから 、電動のテフロン製乳棒（コール-パーマー社（Cole-Parmer）の器械，2500 rpm に設定）と、2 mlの組織磨砕液を用いて（約30ストローク）破砕した。13000 g で10分間（デンヴァー社（Denver）遠心分離機、４℃）遠心分離した後、低速の 上清を集めた。蛋白質を測定するために、等量液（10μl）をピペットで採った （Bio Rad）。そして、次の解析まで、精製された低速の上清を−80℃に保存し た。 SDS-PAGE、電気ブロティング、および免疫染色。組織抽出物（15〜25μg）を 、高分子量のポリペプチドが想定されている場合でも、ニトロセルロース膜への 迅 速で効率の良い蛋白質の移動が可能な、高度に多孔なSDS-PAGEシステム（ドーセ ットら（Doucet et al.））で電気泳動した。蛋白質を、10％ポリアクリルアミ ド、0.1％ビスアクリルアミドの泳動用ゲル（5.5 cmに固定した長さの）で解像 し、転移用緩衝液からメタノールを省いた点を除けば、トービンら（Towbin et al.）（1979）によって述べられた方法にしたがって、電気泳動によりニトロセ ルロース膜に蛋白質を転移させた。まず、ニトロセルロース膜を、５%のブロッ ト（blotto）を含むトリス塩酸食塩水緩衝液pH 7.2（TBS）の中で、室温で１時 間インキュベートし、さらに42℃で１時間インキュベートした。次に、１%のブ ロットの中で、室温で１時間、次の抗体の何れかとインキュベートした。すなわ ち、NAIP（1:1000）、およびA60（1:1000；R.J.ミュラン（R.J．Mullen）博士の 厚意により提供された）。次に、ブロットをTBS-トゥイーン（tween）で洗浄し て（３分間ずつ５回洗浄）、高度に精製されたビオチン結合抗ウサギ抗体（1:20 00；Bio／Can Scientific）、または抗マウス抗体（1:2000；Bio／Can Scientif ic）を含む１%ブロットの中で、１時間インキュベートした。ブロットを、再び 、前と同じように洗浄して、ストレプトアビジン-ホースラディッシュ・ペルオ キシダーゼ（1:2000；Amersham）とともに１時間インキュベートした。最後に、 増強された化学発光剤で現像した（ECL、Amersham）。 6-OHDA傷害ネズミの調製。オスのウィスターラット（250〜300ｇ；n=各群につ き６匹）に、myc標識したNAIP（3 gl；１×106粒子）、またはバクテリア遺伝子 のlacZ（3 gl；１×10粒子）を含むアデノウイルス構築物を、側背側線条に定位 注射した。アデノウイルス構築物は、線条のドーパミン作用性末端から取り込ま れて、SNCにある細胞体に輸送される（リドーら（Ridoux et al.）、1994）。１ 週間後、すべての動物に、右側線条の、アデノウイルス注射の前に決められたも のと同じ座標に、6-OHDA（3 gl；20 gg／ml）を一回定位注射した。３週間回復 させた後、頭蓋内に食塩水を潅流させた後、固定液を潅流させ、チロシンヒドロ キシラーゼを、ニューロン特異的なマーカーNeuN、およびNAIPアデノウイルス構 築物の蛋白質マーカーであるMycによって、免疫組織化学的に検出するために、 脳の切片を作製した。 顔面神経軸索切開：左側顔面神経を離断して、１、３、７、14日後に動物を殺し た。新鮮な脳幹を取り出し、以前に説明されている（テツゥラフら（Tetslaff e t al.）J．Nuerosci．1988）ようにして、右側と左側の顔面核をミクロ切除した 。全RNAを抽出して、逆転写させ、アポトジェン社（Apoptogen）によって提供さ れたラットの配列情報に基づいた、NAIPおよびXIAPに特異的なプライマーを用い て増幅した。RT産物の連続希釈（cDNA；３、６、12、24 ng）を用いて増幅率の 直線性を確実にするために、異なった回数の増幅を行なった。ホスホイメージン グ（phosphoimaging）を用いて、増幅産物を定量した。50塩基重合体プローブを 用いたサザンブロッティングによって、PCR産物の特異性を確認した。シクロフ ィリン（cyclophilin）を増幅して、投入したRNAの量と質が同じであることを確 認するために用いた。成体ラットにおける、NAIP、XIAP、およびHIAP-2の発現に 対する、軸索切開の効果も、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学検 査法によって調べられた。 NAIP抗血清の特異性の試験。免疫組織化学的検査とウェスタンブロッティング によって、NAIP抗血清の特異性を評価した。この実験において、本発明者らは、 この抗血清を、予め、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）-NAIP融合蛋 白質に吸着させておけば、NAIP-LIが除去されるかを判定した。第二の実験では 、前脳、中脳、後脳、および脊髄におけるさまざまなレベルから切り出した冠状 の切片における、NAIP-LIの免疫組織化学的局在を調べた。第三の実験では、NAI P、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、チロシンヒドロキシラ ーゼ（TH）、およびカルビンジン（calbindin）D-28K（CaBP）を含む、いくつか のマーカー蛋白質を用いて、それぞれ、コリン作用性ニューロン、ドーパミン作 用性ニューロン、およびプルキニエニューロンにおけるNAIP-LIの局在を調べる ために、二重免疫蛍光標識を行なった。 統計的解析。細胞数と濃度計によるデータについては、一元分散分析を行なっ た。血液ガスとpHについては、何度も反復した測定値を用いて一元分散分析を行 なった。解析結果が有意なときには、ニューマンとケウルス（Newman and Keulu s）検定を用いて、多元的な比較を行なった。アデノウイルスの実験に関する、 細胞数データについては、対にならないスチューデントのｔ検定を行なった。 実施例２：中枢神経系におけるNAIP様免疫応答性の分布 アフィニティ精製されたNAIP抗体は、150kDの単一のバンドを認識した。150kD とは、NAIPの予想分子量に相当する。反対に、NAIP融合蛋白質を予め吸着させた 抗血清は、このバンドを検出することができなかった。神経の標識が、アフィニ ティ精製された抗体を用いた免疫組織化学により検出された。この標識は、GST- NAIP融合蛋白質を抗血清に予め吸着させることにより消失した（データは示して いない）。これらの結果は、この抗体がNAIPを選択的に認識することを示す。 １．終脳 皮質 NAIP-LIを示す神経が新皮質（II-VI）の全ての層で観察された（図12A ）。低程度から中程度のNAIP-LIが調べた全ての皮質領域で検出された。細胞体 中の免疫応答性標識は、中程度であり、細胞質に限定されていた。比較すると、 樹状突起の染色がより強く、最も顕著な標識は第V層錘体ニューロンの樹状突起 の先端に観察された（図12B）。 海馬 海馬では、CA1〜CA3亜領域における錘体ニューロンの全て、および歯状 回における顆粒細胞が、中程度の免疫応答性を示し、それは神経細胞形質および 突起の両方において見られた（図2、13A、13B、13C）。オリエンス層（oriens l ayer）内の海馬全体に散在する介在ニューロン、放線状膜、およびCA1のルキュ ノサム分子（lucunosum moleculare）、ならびにCA2およびCA3の淡明層が、強い 標識を示した（図13B、13C、13D）。 線条 強く標識されたニューロンが、尾状被殻および中隔側坐核において観察 された。これらの免疫応答性のニューロンは大きく（25〜30μm）、線状体ニュ ーロン総数に占める割合は非常に低く、およそ1％であった（図14A）。これらの 観察と一致して、ChAT抗体での二重標識で、NAIP-LIがコリン作動性の介在ニュ ーロンにのみ局在していることが明らかになった（図14B、14C）。この構造内の 他のニューロンは全て、非常に低レベルのNAIP-LIを示した。 淡蒼球 大きい、強く染色された双極性ニューロンが、この線状体突出部位で 観察された（図15A）。 基底前脳 中程度に免疫応答性のニューロンが、ブロカ（Broca）の斜方向バ ンドの水平樹状突出部分および垂直樹状突出部分の両方、ならびに内側中隔核お よび腹側淡蒼球で検出された（図16A）。これらのNAIP免疫応答性細胞体の分布 は、 基底前核内のコリン作動性ニューロンの分布と一致すると考えられた。しかしな がら、NAIPおよびChATに対する二重標識では、内側中隔および斜方向バンド内で NAIP-LIおよびChAT-LIが同時に存在していることはほとんどないことが明らかに なった。 ２．間脳 視床 中強度から高強度の標識が、視床の腹側および外側の部分に位置する多 数の中型のニューロンで観察された（図17A、17B）。数は少なかったが、視床の 前方、層内、内側でも免疫応答性のニューロンが観察された。 手綱 多数の、小型で丸い中程度に免疫応答性の神経細胞形質が、内側の手綱 核で観察された。外側の手綱核では、強く染色された中型のニューロンが少数検 出された（図17C）。 視床下部 視床と比較すると、視床下部にはNAIP-LIがほとんど観察されなか った。少数の弱く染色されたニューロンが、弓状核、ならびに背側および外側の 視床下部領域で検出された（図17D）。 内茎核（Entopeduncular Nucleus）この脳幹神経節の出口で強い標識が観察さ れた。神経細胞形質に加え、繊維状の網状構造を形成している神経突起において も、NAIP-LIは極めて高濃度に存在した（図15B）。 ３．中脳 黒質では、NAIP-LIニューロンの大部分が黒質細胞層部に位置していた。NAIP- LIはまた、腹側に黒質手綱部へと伸びるこれらのニューロンの樹状突起内にも存 在した（図15C）。少数のNAIP-LIニューロンが、黒質の手綱部および外側部にも 観察された（図15C、18A）。二重標識で、これらの領域内でNAIP-LIを示すニュ ーロンの大部分がドーパミン作動性であることが明らかとなった（図18B、18C） 。中脳で最も強く標識されたニューロンは、動眼神経核に位置していた。強く標 識された繊維は、動眼神経根にも明確に見られた（図19A、21A）。高レベルのNA IP-LIは、エーディンガー・ヴェストファル核および滑車神経核のニューロンで 検出された（図19A）。赤核の小細胞部分および大型細胞部分の両方が、強いNAI P-LIを示した（図19A）。橋核では、多数の小型で丸い神経細胞形質が観察され た（図20A）。 ４．メットセファロンおよびマイレンセファロン（Met-and mylencephalon） 、脳幹 脳幹内の脳神経核の大部分が、強いNAIP-LIを示した。強いNAIP陽性の ニューロンは、三叉神経の主要な核全てに存在した。これらには、三叉神経の脊 髄核、中脳路核、主知覚核、および運動核が含まれていた（図19B、19C、20B） 。最も強い標識は、中脳三叉神経内の中型ニューロンにより示された（図20B） 。強いNAIP-LIは、前庭神経核、蝸牛神経核、前庭蝸牛神経の神経繊維にも検出 された（図19B、19D）。顕著な標識を含む他の脳神経核には、顔面神経核、孤束 核、迷走神経運動核、および舌下神経核が含まれていた（図19C、19D）。NAIPお よびChATに対する脳神経核の二重標識により、動眼神経核などの運動核では、NA IP陽性ニューロンの大部分が、ChATに対しても免疫応答性であることが明らかと なった（図21B、21C）。薄束核のような脳幹中継核、楔状束核、巨大細胞核、お よびコルレウス部位（locus coeruleus）内に位置するニューロンも、NAIP抗体 で強く染色された（図19D、20B、20C）。さらに、NAIP-LIは、滑車神経核、疑核 、脚間核、オリーブ核、および側索核で検出された。 小脳 小脳においては、丸い形状のNAIP-LI神経細胞形質が、小脳皮質の単層 に観察された（図22A）。プルキンエ細胞のマーカー蛋白質であるカルビンディ ン（calbindin）D-28Kに対する抗体を用いた、これらのニューロンの二重免疫蛍 光標識で、NAIP-LIはプルキンエ細胞内に位置することが示された（図22B、22C ）。NAIP-LIは、小脳皮質の他の層では全く検出されなかった。NAIP-LIを含む細 胞体は、中位核および外側核のような深小脳核にも観察された（図20D）。 ５．脊髄 大きさおよび形態が様々に異なる強く標識された神経細胞形質が、 前核（第VIII層および第IX層）および中間領域（第VII層）に主に位置する、脊 髄の様々なレベルで観察された（図23、24A、24B）。前核内の最も顕著に標識さ れた細胞は、非常に大きなニューロン、おそらくα運動ニューロンであった（合 う24B）。この推定と一致して、これらのニューロンは、ChAT抗体で二重標識さ れた（図24C、24D）。特に中心管に近位の第VII層においても、大きい神経細胞 形質が観察された。第VII層に位置するクラーク柱は、NAIP抗体で強く標識され た。背側核の第V層および第VI層には、少数のニューロンが検出された。小型の 丸い神経細胞形質を有する少数の陽性ニューロンも、背側核（第I〜IV層）に観 察された（図 24A）。最後に、脊髄の白質内に繊維染色が存在した（図23）。 実施例３：海馬内のNAIP mRNAレベルに対する一過的前脳虚血の効果 それぞれ4匹からなる5つの群に対して、10分間の4血管閉塞（four-vessel occ lusion）（4-VO）を行い、再循環の2、12、24、48、および72時間後にペントバ ルビタール（100mg／kg、腹腔内注射）で麻酔した。4匹からなる第6の群は、対 照として用いた。これらの動物は、にせの4-VO操作を行った後、48時間後にペン トバルビタール（100mg／kg、腹腔内注射）で麻酔した。深く麻酔をかけた後、 全ての動物を頸部を断頭することにより屠殺した。脳を迅速に取り除き、イソペ ンタン（-65℃）中で凍結させ、低温保持装置を用いて背側海馬を通過する12μm の厚さの切片を調製した。インサイチュー・ハイブリダイゼーション組織化学に より、海馬切片内のNAIP mRNAを検出した。 NAIP mRNAの基礎的発現は、歯状回にのみ検出された（図1）。一過的脳虚血の 後には、NAIP mRNAレベルの増加が、24時間後にCA1領域において最初に観察され た。NAIPに対するハイブリダイゼーション・シグナルは、48時間後にも増加を続 け、72時間後に最大に達した。CA1錘体ニューロンとは異なり、歯状顆粒細胞お よびCA3ニューロンは、4血管閉塞(4-VO)の24、48、72時間後に、NAIPレベルの中 程度の増加のみを示した。 実施例４：ウイルス介在性のNAIP過剰発現は、線条体内6-OHDA損傷後の黒質線条 体経路の変性を抑制する 6-ヒドロキシドーパミンを齧歯類の線条体に注入することにより、黒色線条体 経路の遅延型変性が生じる。本発明者らは、新規な抗アポトーシス蛋白質NAIPの 過剰発現により、短時間の脳虚血操作により生じる海馬ニューロンの欠損が減少 することを既に示した。本実施例において、本発明者らは、NAIPのウイルス介在 性の過剰発現が、パーキンソン病の6-OBDAモデルにおける黒色線条体損傷をも緩 解させることを示す。 線条体注入6-OHDAにより、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体で標識され たドーパミンニューロンが有意に減少した（図25、上および中央）。予備的実験 による結果より、NAIPアデノウイルス構築体は、6-ヒドロキシドーパミンの線条 体内投与により生じたドーパミンニューロンの欠損を有意に減少させることが示 される（図25、中央および下）。 NAIPアデノウイルスベクターが、6-ヒドロキシドーパミンにより生じるドーパ ミンニューロン欠失を減少させることができるということより、NAIP発現を増加 させることができる治療がパーキンソン病の治療に利用可能であるということが 示唆される。 実施例５：海馬、線条体、および視床内のNAIP様免疫応答性に対する一過的前脳 虚血の効果 それぞれ5匹からなる3つの群に対して、10分間の4血管閉塞（4-VO）を行い、 再灌流の3、24、および72時間後にペントバルビタール（100mg／kg、腹腔内注射 ）で麻酔した。4匹からなる第4の群は、対照として用いた。これらの動物は、に せの4-VO操作を行った後、24時間後にペントバルビタール（100mg／kg、腹腔内 注射）で麻酔した。深く麻酔をかけた後、全ての動物を、200mlの生理食塩水（0 .9％）、次に150mlの4％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（0.1M）で経 心臓的（transcardially）に灌流した。脳を一晩後固定（postfix）し、10％シ ョ糖を含むリン酸緩衝液（0.01M）中で2日間凍結保護した。低温保持装置を用い て適当な前脳領域から12μmの厚さの切片を切り出し、NAIP-I用に処理した。線 条体NAIP-Iが、コリン作動性マーカー酵素であるコリンアセチルトランスフェラ ーゼ（ChAT）を発現するニューロンに共存するか否かを決定するため、二重標識 免疫組織蛍光を用いて第3の実験を行った。 インサイチュー・ハイブリダイゼーション組織化学の結果と一致して、低レベ ルから中レベルのNAIP-Iが、末処理動物の海馬CA1に検出された（図2）。同様に 、CA1ニューロンにおけるNAIP-Iの強度は、10分間の一過的前脳虚血の3時間後変 化していないようであった。しかし、NAIP mRNAレベルとは反対に、NAIP-Iは、 再灌流の24時間後および72時間後に基底レベル以下に減少した。線条体における NAIP-Iは、ニューロン総数の約1％に位置していた。これらのニューロンは、サ イズが大きく（直径25〜30μm）、海馬CA1ニューロンよりも高レベルのNAIP-Iを 示した。二重標識免疫組織蛍光により、線条体NAIP-IがChAT免疫応答性を含むニ ューロン内に位置することが明らかとなった（図3）。一過的前脳虚血により、 再灌流の3時間後これらの線条体ニューロン内のNAIP-Iが大きく増加した（図2） 。NAIP -Iは、4-VOの24時間後には依然増加していたが、72時間後には基底レベルにまで 戻った。視床の腹側−後側および腹側−内側の部分のニューロンの大部分には、 NAIP-Iが含まれていた（図2）。これらのニューロンは、血流の回復から3時間後 にNAIP-Iの大きな増加を示した。NAIP-Iは、再灌流の24時間後には依然増加して いたが、72時間後には基底レベルにまで戻った。 実施例６：短期的K252a投与のNAIPレベルに対する効果 NAIP-LIは、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の単回投与の3時間後、CA1ニュー ロン内で増強された（図30Aおよび30D）。24時間後までに、NAIP-LIはこれらの ニューロンにおける注射前のレベルに戻った（図30G）。同様に、視床の腹側− 内側および腹側−後側の領域におけるNAIP-LIは、K252a（0.1mg／kg、皮下注射 ）の単回投与の3時間後上昇していた（図30Bおよび30E）。24時間後までに、NAI P-LIはこれらの視床領域における正常なレベルに戻った（図30H）。NAIP-LIは、 K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の3時間後、線条体ニューロンにおいても上昇し 、24時間後までに基底レベルにまで戻った（図30C、30F、30I）。線条体におい て、K252a投与は、主に中型のニューロンにおいてNAIP-LIを増加させるようであ った（図30F）。イムノブロッティングにより、NAIP抗体が、NAIPの推定分離量 に相当する150kDaの相対分子量を有する単一のバンドを選択的に認識することが 示された（図31A）。多数の視床ニューロン内にNAIPが存在することを示す免疫 組織化学の結果と一致して、抗アポトーシス蛋白質が視床に高濃度に存在するこ とがウェスタン解析で示された（図31）。NAIP発現が線条体ニューロン（コリン 作動性ニューロン）のわずか1％に限定されているにもかかわらず、視床におい て観察されたのと同様のレベルが線条体で見られた。比較的小さいが明確に区別 可能なレベルのNAIP蛋白質が、海馬および脊髄で検出された。本発明者らの免疫 組織化学による知見と一致して、NAIPレベルがK252a（0.1mg／kg、皮下注射）の 単回投与の3時間後、線条体、海馬、および視床において上昇していることが、 イムノブロッティングにより明らかとなった（図31A）。蛋白質適用の対照とし て、NeuNレベルのウェスタン解析をNAIPを検出するために使用したのと同一の膜 上で行った。イムノブロッティングにより、高レベルのNeuN（60kDa）が海馬お よび線条体に存在し、一方視床および脊髄には低レベルしか見られないことが示 された（図31A）。脳の4 つの領域全てにおいて、溶媒（1ml／kg、皮下注射）およびK252a（0.1mg／kg、 皮下注射）で処理した動物におけるNeuNレベルは類似していた。このことから、 各レーンに等量の蛋白質が適用されたことが確認された。 実施例７：海馬、線条体、および視床におけるNAIP-Iに対するK252a投与の効果 それぞれ3匹からなる2つの群に、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）を注射し、3 時間後または24時間後のいずれかに過剰量のペントバルビタール（100mg／kg、 腹腔内注射）を与えた。3匹からなる第3の群は、対照として用いた。これらの動 物には、溶媒（1mg／kg、皮下注射）を注射した後、3時間後に過剰量のペントバ ルビタール（100mg／kg、腹腔内注射）を与えた。24時間後にペントバルビター ル（100mg／kg、腹腔内注射）で麻酔した。麻酔をかけた後、全ての動物を、生 理食塩水（200ml）および4％パラホルムアルデヒド（150ml）で灌流した。脳を 取り除き、後固定（postfix）し、凍結保護し、低温保持装置を用いて海馬、線 条体、および視床を通過する12μmの厚さの切片を切り出した。切片は、NAIP-I 用に処理した。 NAIP-Iは、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の単回投与の3時間後上昇していた （図7）。24時間後までに、NAIP-Iはこれらの視床領域における注射前のレベル に戻った。同様に、NAIP-Iは、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の3時間後、線条 体ニューロンにおいても上昇し、24時間後までに基底レベルにまで戻った。線条 体において、K252aは、主に中型のニューロンにおいてNAIP-Iを増加させるよう であった（図7）。K252a（0.1mg／kg、皮下注射）は、視床の腹側−内側および 腹側−後側の領域においてもNAIP-Iを上昇させた（図7）。24時間後までに、NAI P-Iはこれらの視床領域における正常レベルにまで戻った。 実施例８：海馬、線条体、視床、および脊髄におけるNAIP-IおよびNeuNに対する 短期的K252a投与の効果 それぞれ3匹からなる2つの群に、溶媒（1mg／kg、皮下注射）またはK252a（0. 1mg／kg、皮下注射）を注射し、3時間後にペントバルビタール麻酔下断頭により 屠殺した。脳を取り除き、氷上で背側海馬、線条体、視床、および脊髄を切片化 した。イムノブロッティングにより、これらの領域の細胞質蛋白質抽出物にNAIP およびNeuNが検出された。 イムノブロッティングにより、NAIP抗体が、150kDaの相対分子量を有する単一 のバンドを選択的に認識することが示された。このバンドは、NAIPの推定分離量 に相当する（図8）。様々な前脳の領域におけるNAIPレベルの比較より、NAIPが 視床および線条体に最も豊富に存在することが示される。比較的小さいが明確に 区別可能なレベルのNAIP蛋白質が、海馬および脊髄で検出される。免疫組織化学 による結果と一致して、NAIPレベルがK252a（0.1mg／kg、皮下注射）の単回投与 の3時間後、線条体、海馬、および視床において上昇していることが、イムノブ ロッティングにより明らかとなった（蛋白質適用の対照として、NeuNレベルのウ ェスタン解析をNAIPを検出するために使用したのと同一の膜上で行った）。イム ノブロッティングにより、高レベルのNeuN（60kDa）が海馬および線条体に存在 し、一方視床および脊髄には低レベルしか見られないことが示された（図9）。 脳の4つの領域全てにおいて、溶媒（1ml／kg、皮下注射）およびK252a（0.1mg／ kg、皮下注射）で処理した動物におけるNeuNレベルは類似していた。このことか ら、各レーンに等量の蛋白質が適用されたことが確認された。 実施例９：海馬のCA1領域における虚血により誘導される神経欠損に対する長期 的K252a投与の効果 それぞれ6匹からなる2つの群に、溶媒（1mg／kg、10％シクロデキストリンお よび0.5％DMSOを含む水溶液）またはK252a（0.1mg／kg）を、7日間1日1回皮下注 射した。全ての動物に、最後の注射から3時間後に4-VO（10分間）を与え、循環 が回復した直後に2度目の注射をした。6匹からなる第3の群には、前記と同様に 溶媒を注射し、にせの4-VOを与えた。4-VO操作またはにせの4-VO操作の後、5日 間1日に1回、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）または溶媒（1mg／kg、皮下注射） を動物に投与し続けた。注射から4時間後に、全ての動物に過剰量のペントバル ビタール（100mg／kg、皮下注射）を与え、生理食塩水（200ml）、次に4％パラ ホルムアルデヒド（150ml）で再灌流した。脳を取り出し、後固定（postfix）し 、凍結保護し、低温保持装置を用いて背側海馬を通過する12μmの厚さの切片を 切り出した。海馬のCA1領域で生存中のニューロンを、ニューロン特異的マーカ ーNeuNを認識するモノクローナル抗体（Mullenら、Development 116:201-211,19 92）を用いて検出した。 4-VOの前に7日間、そしてその後毎日、K252a（0.1mg／kg、皮下注射、1日1回 ）を全身投与することにより、10分間の一次前脳虚血により生じた海馬CA1ニュ ーロンの欠損が有意に減少した（図4）。海馬の内側、中央、および後側の3分の 1における細胞数を計数することにより、K252aによりCA1ニューロンの枯渇が約5 0％減少することが示された（図5）。 実施例10：NAIP蛋白質レベルに対する長期的K252a投与の効果 K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の短期的投与により、調べた3匹の動物のそれ ぞれにおいて海馬のNAIPレベルが上昇するのが観察された（図31B）。150kDaのN AIP免疫応答性バンドの光学濃度の測定によると、K252a（0.1mg／kg、皮下注射 ）の短期的投与により、海馬のNAIPレベルは約50％上昇した（図31C）。K252a（ 0.1mg／kg、皮下注射、1日1回7日間）の長期的投与によりNAIPレベルはさらに上 昇した（図32Bおよび32C）。溶媒を注射した対照と比較すると、K252a（0.1mg／ kg、皮下注射、1日1回7日間）の長期的投与により、NAIP濃度は約100％増加した 。蛋白質適用の対照として、NeuNレベルのウェスタン解析をNAIPを検出するため に使用したのと同一の膜上で行った。イムノブロッティングにより、NeuNレベル はK252aの短期的投与によっても長期的投与によっても上昇しないことが示され た。このことから、各レーンに等量の蛋白質が適用されたことが確認された（図 31B）。 実施例11：海馬のNAIP mRNAレベルに対する短期的K252a投与の効果 それぞれ3匹からなる5つの群に、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）を注射し、1. 5、3、6、12、または24時間後にペントバルビタール麻酔下断頭した。3匹からな る第6の群には、溶媒（1mg／kg、皮下注射）を注射し、3時間後に同様にして屠 殺した。迅速に脳を取り除き、イソペンタン（-65℃）中で凍結させ、低温保持 装置を用いて海馬を通過する12μmの厚さの切片を切り出した。海馬切片に対し て、インサイチュー・ハイブリダイゼーション組織化学によるNAIP mRNAの検出 を行った。 K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の単回投与により、1.5から3時間後、歯状回に おけるNAIP発現は上昇していた（図6）。6時間後までに、NAIP mRNAレベルは、 これらの領域における基底レベルに戻るのが観察された。NAIPレベルは、K252a （0.1mg／kg、皮下注射）注射の12時間後または24時間後、基底レベルのままで あっ た。 実施例12：K252a投与のNAIP発現に対する効果 インサイチュー・ハイブリダイゼーション組織化学により、溶媒を注射した動 物の海馬に低レベルのNAIP mRNAが存在することが明らかとなった（図32A）。K2 52a（0.1mg／kg、皮下注射）の投与により、CA1〜CA4亜領域および歯状回におけ るNAIP mRNAレベルが急速に上昇した（図32B）。K252a（0.1mg／kg／日、7日間 ）の長期的投与により、海馬におけるNAIP mRNAレベルが上昇するのが観察され た（図32C）。 実施例13：長期的K252a投与によりニューロンが虚血損傷から保護される 10分間の4-VOにより生じた一過的脳虚血により、海馬内のCA1ニューロンの数 が約70％減少した（図33A、33B）。K252a（0.1mg／kg、皮下注射；1日1回）を、 4-VOの前に7日間、その後毎日（5日間）全身投与することにより、10分間の一過 的脳虚血により生じる海馬CA1ニューロンの欠損が減少した（図33C）。細胞数の 計数によると、長期的K252a投与によりCA1ニューロンの枯渇は約50％減少した（ 図33D）。 実施例14：血圧、pH、pO2、およびpCO2に対するK252aの効果。 血圧、PH、pO2、およびpCO2の基底値（平均値±平均の標準偏差）は、それぞ れ、114.5±13.8mmHg、7.44±0.01mmHg、92.2±3.1mmHg、および35.6±4.9mmHg であった。これらの値は、K252a（0.1mg／kg、皮下注射）の投与後に調べた各時 点において測定された値と有意に異なっていた。 実施例15：ウイルス介在性のNAIP過剰発現の後虚血神経保護効果 細菌酵素lacZを含む組換えアデノウイルス構築体（Ad5d1xDNA-TPC）を、対測 性海馬へと定位注射しても、一過的前脳虚血の事象から5日後CA1ニューロンの欠 失は減少していなかった（図34A）。反対に、myc-タグを結合したNAIPを含むア デノウイルス構築体を背側海馬へと注射すると、CA1ニューロンの欠失が有意に 減少した（図34B）。細胞数の計数から、lacZ注射側と比較して、NAIPアデノウ イルスを注射した海馬におけるCA1欠損は、約60％減少した（図34E）。myc免疫 応答性およびX-gal染色により、海馬ニューロンは、それぞれ、Myc-タグを結合 したNAIPまたはlacZを含むアデノウイルス構築体により影響を受けることが確認 された（図34 C、34D）。Myc（7±1）およびX-gal（10±2）により染色されたニューロンの細 胞数の計数より、ほぼ同数のニューロンがこれら2つのアデノウイルス構築体に より標識されることが明らかとなった（P＞0.05）。しかし、NAIPアデノウイル スを注射した海馬においては、Myc免疫応答性を示すニューロン（7±1）よりも 有意に多くのCA1ニューロンが、虚血損傷から保護された（15±1）（P＜0.01） 。 実施例16：妊娠ラットにおけるNAIPおよびIAPのアップレギュレーション 本発明者らは、インサイチューおよび免疫組織化学の手法を用いて、naipおよ びiap遺伝子の発現および蛋白質レベルに対する出産の効果を検討した。本発明 者らの結果より、naip遺伝子、および少なくとも一つのIAP遺伝子、xiapが、妊 娠ラットの脳においてアップレギュレーションを受けていることが示された。さ らに重要なこととして、このアップレギュレーションは、SEの間に起こる過剰な 刺激に抵抗性であることが示された脳領域において見られた。 この観察より、本発明者らは2つの重要な結論に達した。まず、この生理学的 機構を用いて、NAIPおよびIAP遺伝子発現を誘導しうる可能性がある。第二に、 出産後にレベルが上昇することが知られている因子、例えばBDNFおよびNGFを、 ニューロン環境、およびNAIPまたはIAP発現の増加が望まれるその他の環境にお いて、IAPおよびNAIPレベルを増加させるために用いうる可能性がある。 実施例17：NAIPウイルスベクターを用いたトランスジェニック治療 本発明者らは、NAIP遺伝子配列を含むヒト複製欠損アデノウイルス構築体（Ad 5d1xDNA-TPC；Listonら、Nature 3:349,1996）を、雄ウィスター（Wistar）ラッ トの背側海馬へと定位投与した。その後、アデノウイルス注射により海馬の虚血 細胞死に対する抵抗性が増強されるか否かを決定するため、動物に一過的脳虚血 を与える。 ペントバルビタール（50mg／kg、腹腔内注射）麻酔下、滅菌ハミルトン（Hami lton）シリンジ（5μl）を用いて、0.5μl／分の流速で、約1×10°粒子／mlを 含む3μlのアデノウイルス懸濁液を、右側海馬のCA1領域へと注射する。その後 、針を2分間かけて徐々に取り除き、傷口を縫合により閉じる。左側海馬のCA1領 域には、対照の注射（20％ショ糖の0.01Mリン酸緩衝生理食塩水溶液中に懸濁し た3μlのLacZアデノウイルス構築体）を行う。定位手術から1週間後、動物に一 過的な 全身虚血を与える。一過的全身虚血（10分間）は、PM-117に既に記載されている 4血管閉塞法を用いて行われる。4血管閉塞の5日後、全ての動物を過剰量のペン トバルビタール（100mg／kg、腹腔内注射）で屠殺する。半分の動物を4％パラホ ルムアルデヒドで灌流する。その後、脳を取り除き、10％ショ糖中で凍結保護し 、低温保持装置上で切片化する。残りの半分は、断頭し、ドライアイスで-65℃ に冷却したイソペンタン中で迅速に脳を凍結させる。低温保持装置を用いて、新 鮮な凍結切片をこの組織から切り出す。それぞれ、新鮮な凍結切片にはインサイ チュー・ハイブリダイゼーション組織化学、パラホルムアルデヒドにより固定し た組織には免疫組織化学を行うことにより、NAIPのmRNAおよび蛋白質を測定する 。 図10は、NAIP発現トランスジーンで処理された動物において、虚血後の細胞死 の抑制が増強されることを示す。NeuN抗体で標識されたCA1ニューロンは、イメ ージ解析システムを用いて計数された。細胞数の計数により、LacZA注射側と比 較して、NAIP構築体はCA1ニューロン細胞死を約40％減少させることが明らかと なった。アスタリスクは、lacZ注射側と有意（p＜0.05）に異なることを示す。 実施例18：軸索切断により顔面運動ニューロンにおけるNAIPおよびXIAP発現が上 昇する。 成体哺乳動物の運動ニューロンは軸索損傷を受けても生存し続けるが、新生児 の場合には2〜7日以内に死亡することが、よく立証されている（図26）。死の機 構は、自然に起こるアポトーシスであると考えられる。従って、本発明者らは、 IAPファミリーに属する分子が成体運動ニューロンの生存を媒介し、この保護機 構は新生児には見られないという仮説を試験した。従って、本発明者らは、成体 ラットおよび新生ラットの顔面運動ニューロンにおけるNAIP、XIAP、およびHIAP -2の発現に対する軸索切断の効果を比較した。 1日目に、成体ラットの軸索切断した顔面神経核において、NAIP mRNAが1.5〜2 倍に増加した（図27）。3日目に、段階希釈系列を定量すると、軸索切断した側 は、8〜10倍の増加を示した。この増加は、7〜14日の実験期間中継続的に維持さ れた。軸索切断後に、XIAPに対するプライマーを用いて増幅を行うと、ほんのわ ずかにしか増加していないことが明らかとなった（データは示していない）。イ ンサイチュー・ハイブリダイゼーション組織化学により、成体ラットにおいて軸 索 切断から3日後、NAIP、およびわずかではあるがXIAPの発現が上昇していること が明らかとなった（図28）。成体とは反対に、新生児の顔面神経核は、軸索切断 後に比較できるほどのNAIPの増加を示さなかった（図29）。 これらのデータより、NAIPおよびXIAPが、軸索切断後の成体の運動ニューロン の生存において役割を果たしていることが示された。また、新生児に見られる死 が、NAIP発現が増加しないことと関連している可能性が示された。現在、NAIP発 現ベクターを用いて、この仮説の機能解析が行われている。 NAIP、そしておそらくIAPファミリーに属する他の分子は、損傷を受けた運動 ニューロンに生存反応に関与している。このことから、NAIP発現の刺激が、運動 ニューロンの生存を促進するための実施可能な治療法となりうるという提案がさ らに確証される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods of treatment and drug screening to treat and prevent neuronal disease The field of the invention is neuronal cell death. Background of the Invention Neuronal cell death can be caused by a variety of conditions, including traumatic injury, ischemia, degenerative diseases (eg, Parkinson's disease, ALS, or SMA), or as part of the normal process of tissue growth and maintenance. It can happen. We have previously discovered NAIP and IAP proteins (see USSN 08 / 511,485; 08 / 576,956; and 60 / 017,354, which are incorporated by reference). These proteins are also involved in the regulation of apoptosis. Developmental cell death, or apoptosis, is a natural process that is thought to play an important role in establishing proper neuronal connections in the development of the central nervous system (CNS). Apoptosis has the morphological characteristic of the cell body shrinking after chromatin has condensed. Biochemically, the salient feature of apoptosis is Ca 2+ / Mg 2+ Catalyzed by a dependent endonuclease, nuclear DNA is broken down into nucleosome fragments (multiples of 180 base pairs). DNA is broken down in a ladder before cell death occurs, which may be a major phenomenon in causing cell death. Consistent with this belief, agents that inhibit DNA fragmentation inhibit apoptosis. However, the form showing apoptosis is produced by an enzyme that degrades nuclear DNA. Apoptosis is often dependent on the synthesis of RNA and proteins in cells undergoing cell death, suggesting activation of the cell death pathway. The most clearly defined pathway of genetic cell death is that of the nematode, Caenorhabditis, with two effectors (ced-3 and ced-4) and a repressor (ced-c 9) The gene has been isolated. Similar genes have been identified in mammals. One such example is the proto-oncogene bcl-2, which is thought to be a homologous gene in mammals for ced-9. It has been shown that overexpression of Bcl-2 confers neuronal resistance to the damaging effects of a wide variety of deleterious treatments. However, the very low levels of Bcl-2 detected in the adult brain suggest that another protein may play a more important role in preventing apoptosis in the mature CNS. Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic neurodegenerative disorder characterized by severe motor neuron depletion in the spinal cord and brain stem. Many motoneurons observed at autopsy of the spinal cord for SMA display features such as chromatin lysis consistent with apoptosis. During spinal cord maturation, as many as 50% of motor neurons undergo apoptosis. This has led to the suggestion that genetic deficiencies in neuronal apoptotic pathways may be related to motor neuron depletion of SMA. Recently, two candidate genes have been identified, viable motor neurons (smn) and neuronal apoptosis inhibitory proteins (naip). The product of the naip gene was named Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) due to sequence homology between two baculovirus proteins (Cp-IAP and Op-IAP) that inhibit apoptosis induced by the virus. Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by loss of nigrostriatal neurons that results in severe depletion of dopamine (DA) in the basal ganglia. Rats created by the catecholamine-specific neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and having lesions on one side of the nigrostriatal pathway serve as an animal model for PD. Unilateral injection of 6-OHDA inside the forebrain or into the substantia nigra pars compact results in rapid degeneration of the substantia nigra striatum pathway. However, infusion of 6-OHDA into the striatum is thought to more closely resemble the pathology of natural PD (Sauer and Oertel, 1994), with progressive degeneration of the nigrostriatal pathway (> 1 week) ). There is currently no good treatment to prevent PD degeneration. Epilepsy is characterized by a brain attack and often causes neuronal cell death. Pre-stimulated rats, i.e., rats that have become "epileptic" by applying a low level of electrical stimulation daily, have less brain damage from epileptic states induced by kainate compared to untreated rats. Significantly less has been observed. Epileptic states (SE) are characterized by continuous electrical recordings and / or seizures by behavior occurring at regular intervals of 30 seconds or more. In untreated, unstimulated rats, this condition ultimately results in severe neuronal damage in some brain regions. Stimulated "epileptic" rats show only minimal neuronal loss, despite experiencing SE conditions as severe as those observed in untreated rats. Determining the mechanisms involved in this neuroprotection induced by experience may provide a new way to improve brain damage caused by not only SE but also neurological trauma such as seizures. Ischemia results when blood flow to the CNS is blocked. This is often the case after traumatic injury and seizures. Cell death often occurs. When blockage of blood flow is effected over a large area of the CNS or lasts for a long time, death occurs due to the loss of neurological function necessary to survive. However, when blood flow to the CNS is temporarily blocked and recirculation is established within minutes, only certain neurons in the brain die. The best experimental model of partial neuronal death due to ischemia is the four vessel occlusion model. In this comprehensive model of cerebral ischemia, neuronal layers in neocortical layers 3, 5, and 6 ', small and medium striatal neurons, and hippocampal CA1 pyramidal neurons are among the most vulnerable (Pulsinelli et al. al., Ann. Neurol. 11: 491-498, 1982). In contrast, striatal cholinergic interneurons and hippocampal CA3 pyramidal neurons are more resistant to the damaging effects of transient global ischemia (Francis and Pulsinelli, Brain Res. 243: 271-278, 1982). Summary of the Invention The present inventors have discovered that elevated levels of NAIP and IAP polypeptides used provide neuroprotection and allow neuronal regeneration. The inventors have noticed that elevated NAIP levels are proportional to the number of surviving neurons under various conditions, which normally leads to neuronal cell death. In addition, increasing levels of NAIP and IAP allow axonal regrowth following axotomy. Taken together, these findings indicate that NAIP and IAP play a key role in conferring resistance to ischemic injury and neuronal degeneration and in neuronal repair. Thus, our findings provide methods for preventing and repairing neuronal damage, as well as methods for screening for neuroprotective and regenerative compounds. The present invention is summarized as follows. In two main aspects, the invention provides methods for inhibiting cell death of the nervous system and / or for promoting neuron regeneration. The method includes increasing a biological activity of a polypeptide selected from the group consisting of NAIP or IAP (eg, a neuroprotective effect described herein). This increase in cells that are or are likely to be placed in an ischemic state increases the likelihood that cells will survive after a phenomenon that normally causes at least some neuronal death. % If it is sufficient to increase it by more than one percent. In some embodiments, the polypeptide is a mammalian NAIP, HIAP, HIAP2, or XIAP. Most preferably, the polypeptide is NAIP. In one preferred embodiment, the polypeptide is a NAIP polypeptide lacking a carboxy terminal site. In a related embodiment, the neural cell is the CNS, most preferably a neuronal cell known to be susceptible to this cellular ischemic cell death. In another embodiment, the increase is due to administration of a transgene encoding a NAIP or IAP polypeptide in the expressible gene construct. The transgene may be structured to include various types of promoters, for example, constitutive, nervous, or regulatable promoters. The transgene may be, for example, a viral vector such as an adenovirus vector, a herpes virus vector, or a poliovirus vector. In a preferred embodiment, the transgene encodes a NAIP or IAP comprising an amino acid sequence substantially identical to at least one of the amino acid sequences described in the references provided herein, wherein the transgene Is administered to a mammal in an area where ischemic events occur (preferably, intracranial), and the transgene is contained in a viral vector (eg, herpes virus, adenovirus, adeno-associated virus, or poliovirus). Also, ischemia is caused by traumatic injury, stroke, myocardial infarction, or small stroke. In another aspect, the invention has experienced, or increases the risk of having, ischemia, neurodegeneration, or axotomy (eg, seizure, Parkinson's disease, or surgical injury, respectively). A method of treating a mammal comprising administering to the mammal an amount of NAIP or IAP sufficient to inhibit cell death and / or regenerate. Further, the invention features a therapeutic composition comprising NAIP or IAP as the active ingredient, formulated in a physiologically acceptable carrier. In yet another embodiment, the increase is by direct administration of NAIP or IAP (eg, HIAP1, HIAP2, or XIAP), or a molecule known to increase the biological activity of NAIP or IAP (eg, For example, a K252-like alkaloid other than K252, an ATP homolog, or a staurosporine-like compound) may result. This method is used to treat patients who have been diagnosed with, suspected of, or predisposed to ischemia, degenerative disease, or axonal damage, having undergone ischemic events May be used. In the therapeutic methods of the invention, most preferred is to provide a therapeutic molecule as soon as a predisposition to ischemia, degeneration, or damage is detected. It may be provided within 72 hours after the phenomenon causing the ischemic effect occurs. In the case of degeneration or damage, a beneficial effect may be obtained long after the pathology is first detected. In some embodiments of the assay, the cells are related cells, such as neuronal cells or glial cells, which are mammalian (eg, mouse) cells or cells in culture. In another two related aspects, the invention features a method of identifying a compound that modulates NAIP or IAP or that mimics a neuroprotective or neuroregenerative effect. These methods may be used to identify therapeutics for neuroprotection and regeneration. The first method involves identifying a regulatory compound that can increase the expression or stability of NAIP or IAP gene mRNA or polypeptide, and (a) identifying cells that express NAIP or IAP. And (b) contacting the cell with the candidate compound and identifying a regulatory compound in the NAPI or IAP mRNA or protein that has increased expression after contacting the candidate compound. included. The second method involves identifying a modulatory compound that can increase the biological activity of NAIP or IAP, (a) providing a cell that expresses NAIP or IAP, and ( b) contacting the cells with a candidate compound and subsequently identifying a modulatory compound in those with reduced expression of NAIP or IAP. Also preferably, the method includes contacting the compound with cells susceptible to cell death, preferably cultured neuron cells, and monitoring the level of neuronal cell death in the presence of the compound. A decrease in cell death indicates a highly promising compound for neuroprotection or regeneration. Those skilled in the art will appreciate that using cell-free systems and solid-phase assays known to those of skill in the art and which can be readily applied for this purpose, the biological properties of NAIP or IAP An increase in activity can be achieved. In a preferred embodiment of the two methods, the NAIP or IAP gene, or NAIP or IAP, is substantially identical to one of the amino acid sequences described in the reference provided herein (NAIP with the carboxy terminus deleted). Encodes or includes the amino acid sequence of Also, the candidate compound may be selected from a bank of compounds, or more preferably, is a K252-like compound, a staurosporine-like compound, an ATP homolog, or a growth factor-like compound (eg, a neurotrophic compound). . In a related aspect, the invention features a method of treating a mammal that has experienced, or is at increased risk of receiving, the ischemic event, wherein the amount is sufficient to inhibit cell death. Administering to the patient. Preferably, the modulatory compound acts by increasing the expression of the NAIP or IAP gene. A kit for performing the above method is also included in the present invention. Such a kit preferably includes a substantially pure antibody that specifically recognizes and binds NAIP or IAP, and may include a method for detecting and quantifying antibody binding. Alternatively, the kit may comprise all or a fragment of the base sequence of NAIP or IAP useful for the purpose of hybridization, and may include a method for detecting and quantifying hybridization of NAIP or IAPRNA. unknown. In yet another embodiment, the kit may include a cell line for monitoring NAIP or IAP expression, or a cell-free system. Also, the kit may include instructions for use sufficient to allow a determination of the detection of a neuroprotective or neural regeneration compound. "NAIP or IAP" refers to an amino acid sequence homologous to a baculovirus apoptosis inhibitor. For example, NAIP, deletion NAIP, HIAP1, HIAP2, and XIAP are specifically included (08 / 511,485 of USSN filed August 4, 1995; 08 / 511,485 of USSN filed December 22, 1995). 576,956; PCT / IB97 / 00142, filed January 17, 1997). Preferably, such a polypeptide is at least 45%, preferably at least 45%, in at least one of the amino acid sequences of NAIP, deleted NAIP, HIAP1, HIAP2, or XIAP described in the references provided herein. It has an amino acid sequence that is 60%, most preferably 85%, and even 95% identical. A “substantially identical” polypeptide sequence is defined as a conservative amino acid substitution, for example, replacing one amino acid with another amino acid of the same class (eg, replacing valine with glycine, arginine with lysine, etc.). One or more non-conservative substitutions that occur only at amino acid sequences that differ only, or at positions in the amino acid sequence that do not impair the function of the polypeptide (e.g., measured as described herein). , Deletion, or insertion. Preferably, such a sequence is at least 85%, more preferably 90%, and most preferably 95% identical at the amino acid level to the sequence described in the references provided herein. For polypeptides, the length of the sequences to be compared will generally be at least 15 amino acids, preferably at least 20 amino acids, more preferably at least 25 amino acids, and most preferably at least 35 amino acids. Identity is typically determined using sequence analysis software (e.g., sequence analysis software package from Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, 53705, Wisconsin). Measured. Such software compares similar sequences by specifying the degree of identity for various substitutions, deletions, substitutions, and other changes. Conservative substitutions typically include substitutions in the following groups. Glycine, alanine; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine; and phenylalanine, tyrosine. By “protein” or “polypeptide” is meant any chain of amino acids, regardless of length or post-translational modification (eg, glycosylation, or phosphorylation). By "substantially pure" is meant a preparation that is at least 60% by weight (dry weight) a compound of interest, eg, NAIP or IAP, or an antibody specific for NAIP or IAP. Preferably, the preparation is at least 75%, more preferably at least 90%, most preferably at least 99%, by weight, the compound of interest. Purity can be measured by any appropriate method, for example, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis. `` Increased biological activity '' refers to increased transcription of an associated gene, translation of an associated mRNA, increased stability of an associated RNA, modification of a polypeptide to increase stability, e.g., as described herein. As used herein, refers to the promotion of neuroprotective or regenerative activity and the administration of a compound that stabilizes a polypeptide in the assays provided herein. “Purified DNA” refers to two coding sequences that are adjacent (one at the 5 ′ end and one at the 3 ′ end) in the naturally occurring genome of the organism from which it is derived. No DNA means. Thus, the term includes, for example, recombinant DNA integrated into a vector, recombinant DNA integrated into an autonomously replicating plasmid or virus, or recombinant DNA integrated into eukaryotic or prokaryotic genomic DNA. Includes recombinant DNA that is included or present as a separate molecule independent of other sequences (eg, cDNA, or genomic DNA fragments generated by PCR or restriction enzyme treatment). Also included are recombinant DNAs that are part of a hybrid gene encoding additional polypeptide sequence. "Substantially identical" nucleic acids differ only by conservative amino acid substitutions, for example, replacing one amino acid with another amino acid of the same class (eg, replacing valine with glycine, arginine with lysine, etc.). One or more non-conservative non-conservative occurrences at positions in the nucleotide sequence encoding the polypeptide or in the amino acid sequence that do not impair the function of the polypeptide (eg, as measured herein). Nucleotide sequence that encodes a polypeptide that differs only by various substitutions, deletions, or insertions. Preferably, the encoded sequence is at least 45%, more preferably 60%, and most preferably 85% identical at the amino acid level to at least one of the sequences of the NAIP or IAP provided herein. . When comparing nucleotide sequences, a "substantially identical" nucleotide sequence is at least 85%, more preferably 90%, and most preferably 95%, of the sequence of the NAIP or IAP referred to herein. % Identical sequences. The length of the base sequences to be compared will generally be at least 50 bases, preferably at least 60 bases, more preferably at least 75 bases, most preferably 110 bases. Again, homology is typically determined by sequence analysis software (eg, 17705 University Avenue, Madison, 53705, Wisconsin, University of Wisconsin Biotechnology Center, Genetics Computer Group, Sequence Analysis software package). ). "Placed for expression" means that a DNA molecule is placed adjacent to a DNA sequence that directs the transcription and translation of that sequence (ie, promotes production of a NAIP or IAP protein). means. By “purified antibody” is meant an antibody that is at least 60% by weight free of proteins and natural organic molecules to which the antibody is naturally associated. Preferably, the preparation is at least 75%, more preferably at least 90%, most preferably at least 99%, by weight, antibody. "Specifically binds" means that recognizes and binds NAIP or IAP, but substantially recognizes other molecules in a sample (eg, biological sample) that naturally contains NAIP or IAP. An antibody that does not bind is meant. Antibodies that “specifically bind” to NAIP or IAP can be identified in such biological samples using one or more of the standard immunological techniques available to those of skill in the art (eg, western blotting or immunoprecipitation). Sufficient to detect NAIP or IAP protein products. "Ischemia" refers to disruption of blood flow that causes cellular anoxia much faster than normal, resulting in cell death. Most ischemia results from a partial or complete loss of blood flow. The ischemia according to the invention is preferably an ischemia of cells of the CNS, most preferably an ischemia of neuronal cells of the CNS. By "compared to a wild-type sample" is meant (a) compared to an equivalent tissue sample taken from a non-ischemic area of an animal, or (b) compared to non-ischemic cells in cultured cells. By "immunological method" is meant an assay method that includes, but is not limited to, Western blotting, immunoprecipitation, and antibody-based detection techniques, including direct and competitive ELISA and RIA techniques. By "means for detection" is meant one or a set of components that is sufficient to indicate that the phenomenon of interest has been detected. Such means include at least one label that can be measured and observed, including but not limited to radioactive, fluorescent, and chemiluminescent labels. "NAIP or IAP RNA" refers to messenger RNA transcribed from the DNA sequence of NAIP or IAP. "Hybridization technology" refers to detection assays that involve specific (complementarity-based) interactions between nucleic acid strands, such as DNA-DNA, RNA-RNA, and DNA-RNA interactions. I do. Such hybridization techniques optionally include a PCR amplification step. "Transgene" means a nucleotide sequence that is technically inserted into a cell and becomes part of the genome of that cell and its progeny. Such a transgene may be partially or completely heterologous to the cell. A "modulatory compound," as used herein, increases the expression of NAIP or IAP (ie, transcription, translation, post-translational levels) or increases the activity of a NAIP or IAP protein ( That is, by stabilizing the active form of this protein or otherwise reducing the amount of apoptosis in cell types that are susceptible to apoptosis). By "ischemic cell death" is meant a loss of cell viability following a decrease or inhibition of blood flow to the affected cells. "Inhibiting cell death" means that the probability of survival of a cell after an event that would normally result in cell death is at least 10% (compared to untreated control cells), preferably 20% Means rising. Preferably, the cells to be compared are normally neurons that are susceptible to ischemic cell death, neurodegeneration, or axotomy. Preferably, the reduction in the likelihood of cell death is 80%, more preferably 2 fold, and most preferably 5 fold. The abbreviations used herein are: oculomotor nucleus (3); oculomotor nerve root (3nr); facial nucleus (7); inner ear nerve (8vn); vagus nucleus (10); Inferior nucleus (12); Cervical 5 (C5); Clark column (CC); Cuneiform nucleus (Cu); Dorsal hypothalamus (DA); Dentate gyrus (DG); Dorsal medial spinal trigeminal nucleus (DMSP5) End opeduncular nucleus (EP); granular cell layer (G); pallidum (GP); thin bundle nucleus (Gr); Edinger-Westfar nucleus (EW); horizontal oblique zone (diagonal) band) (HDB); Interposed cerebellar nucleus (int); lucunosum layer (L); outer cerebellar nucleus (lat); colleus (coeruleus) site (LC); lateral hypothalamus region (LH); Rein nucleus (Hhb); molecular layer (M); trigeminal mesencephalic nucleus (Me5); medial rein nucleus (Mhb); trigeminal motor nucleus (Mo5); oriens layer (O); pyramidal cells (P) (Figure 2); Purkinje cell layer (Figure 11); Bridge nucleus (Pn); Trigeminal major sensory nucleus (Pr5); Radial layer (R); Red nucleus, large cell part (RMC); Red nucleus , Small cell part (RPC); rostal periolivary field (RPO); sacral spinal cord (S); substantia nigra compact (SNC); substantia nigra (SNR); substantia nigra (SNL); Trigeminal spinal tract nucleus, mouth (SPO5); ventral cochlear nucleus (VC); vertical diagonal band (VDB); vestibular nucleus (Ve); thorax 2 (T2); T6). Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a photograph showing the detection of NAIP mRNA by in situ hybridization histochemistry in the hippocampus after transient global ischemia (AE) or sham surgery (F). NAIP mRNA levels were below the limit of detection in hippocampal CA1 neurons (small arrows) at 2 hours (A) and 12 hours (B) after 4 vascular occlusions (4-VO), with dentate At the time (large arrow), it was barely detectable. At 12 hours, a slight increase in NAIP expression is seen in the dentate gyrus (large arrow) (B). Twenty-four hours later (C), the hybridization signal in CA1 neuron (small arrow) and dentate gyrus (large arrow) gradually increases. At 48 hours (D) and 72 hours (E) after 4-VO, NAIP levels remained constant in dentate granule cells (large arrows) but increased further in CA1 neurons (small arrows). . Scale bar = 500 μm. FIG. 2 shows hippocampal CA1 neurons (A, D, G, and A) in animals treated with simulated ischemia (A, B, and C), or animals with transient forebrain ischemia for 10 minutes (DL). J), Photographs showing NAIP-like immunoreactivity in striatal neurons (B, E, H and K) and thalamic neurons (C, F, I and L). Twenty-four hours after sham treatment, moderate levels of NAIP-like immunoreactivity appeared in hippocampal CA1 neurons (CA1; A) and ventral thalamus (THAL; C). In the striatum (STR; B), large cholinergic neurons (large arrows) show high levels of NAIP-like immunoreactivity, whereas very small levels are detected in medium-sized neurons (small arrows). . In CA3 neurons 3 hours after global ischemia, a modest increase in NAIP-like immunoreactivity occurred (D), but NAIP levels were 24 hours (G) and 72 hours (J). Appears to be declining. At 3 hours after global ischemia, NAIP-like immunoreactivity appears to be elevated in both medium (small arrows) and large (large arrows) striatal neurons (E). At 24 hours (H) and 72 hours (K), the levels of NAIP appear to be reduced in medium-sized neurons, but not in large neurons (large arrows). At 3 hours (F) and 24 hours (I) after 4 vessel occlusions, NAIP-like immunoreactivity increased dramatically. After 72 hours, NAIP-like immunoreactivity appears to be further elevated in thalamic neurons (L). Scale bar = 150 μm. FIG. 3 is a photograph showing immunohistofluorescent double labeling of striatal neurons with respect to NAIP-like immunoreactivity (A) and choline acetyltransferase (ChAT; B) immunoreactivity. The overlapping neurons showing NAIP-like and ChAT immunoreactivity (arrows) indicate that in the striatum NAIP is exclusively localized in cholinergic neurons. Scale bar = 40 μm. FIG. 4 is a photograph showing the effect of long-term pretreatment with K252a on CAI neuron loss 5 days after 4-vessel occlusion (4-VO) for 10 minutes. Hippocampal neurons are detected by a monoclonal antibody (A60) against the neuron-specific marker NeuN. (A) NeuN-like immunoreactivity (VEH + SHAM) in CA1 region (arrow) of mock-treated animals injected with vehicle. (B) Massive loss of NeuN-like immunoreactive neurons (VEH + 4-VO) in the CA1 area (arrow) of vehicle treated animals 5 days after recirculation. (C) Reduction of ischemia-induced neuronal death in the CA1 region (arrow) after chronic administration of K252a (K252a + 4-VO). Scale bar = 500 μm. FIG. 5 is a photograph showing the effect of long-term administration of K252a on neurons of CA1 after transient forebrain ischemia. The density of CA1 neurons expressing NeuN-like immunoreactivity is assessed by computer image analysis. Neuron density represents the number of labeled cells per 100 μm length of the CA1 pyramidal layer. The inner, middle, and side surfaces of the CA1 region were counted and averaged for a length of 100 μm. Five days after 10 minutes of 4-vessel occlusion (4-VO), 70% loss of CA1 neurons was detected in the CA1 region (ISCHEMIA). Subcutaneous injection of K252a (0.1 mg / kg / day) 7 days before 4-VO followed by daily (5 days) reduced ischemic damage in the CA1 area by approximately 50% (K252a + ISCHEMIA). Asterisk, significantly different from vehicle-treated simulated ischemia (VEHICLE + SHAM) (p <0.01). Asterisk, significantly different from vehicle-treated animals (VEHICLE + ISCHEMIA) treated with 4-VO (p <0.01). FIG. 6 shows that a single administration of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (A) or K252a (0.1 ml / kg, subcutaneous injection) (BF) effects NAIP mRNA levels in the hippocampus. FIG. 2 is a photograph showing that the effect was measured by in situ hybridization histochemistry. NAIP mRNA levels were below the detection limit in hippocampal CA1 neurons (small arrows) and 3 hours after vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) administration, and in the dentate gyrus (large arrows). It was barely detectable (A). In both CA1 (small arrow) and dentate gyrus (large arrow), NAIP mRNA levels are increased 1.5 hours (B) and 3 hours (C) after K252a administration. Six hours later (D), the hybridization signal had returned to normal levels in the CA1 region and the dentate gyrus. At 12 hours (E) and 24 hours (F) after administration of K252a, levels of NAIP mRNA in the hippocampus remained at basal levels. Scale bar = 500 μm. FIG. 7 shows that a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) or K252a (0.1 ml / kg, subcutaneous injection) was administered to hippocampus (A, D and G), striatum (B, E and H) and photographs showing the effect on NAIP-like immunoreactivity in the thalamus (C, F and I). Animals treated with vehicle show moderate levels of NAIP-like immunoreactivity in hippocampal CA1 neurons (CA1; A) and thalamic neurons (THAL; C). In the striatum, cholinergic neurons (large arrows) show high levels of NAIP-like immunoreactivity, whereas low levels are detected in medium-sized neurons (small arrows) (B). Three hours after administration of K252a (0.1 ml / kg, subcutaneous injection), all three areas had increased NAIP-like immunoreactivity (D, E and F). In the striatum, K252a appears to increase NAIP-like immunoreactivity, mainly in medium-sized neurons (small arrows) (E). By 24 hours, NAIP-like immunoreactivity had returned to basal levels in the hippocampus (G), striatum (H), and thalamus (I). Scale bar = 150 μm. FIG. 8 shows the thalamus (3 ml) after a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (control = C) or K252a (0.1 ml / kg, subcutaneous injection) (treatment = T). 7 is a Western blot showing analysis of NAIP levels in the THAL), hippocampus (HIPP), striatum (STR), and spinal cord (SPIN.C). K252a increased NAIP levels (150 kDa) in all four areas, with the largest increases occurring in the thalamus and striatum. FIG. 9 shows the thalamus (3 ml) after a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (control = C) or K252a (0.1 ml / kg, subcutaneous injection) (treatment = T). 7 is a western blot showing analysis of NeuN levels in THAL), hippocampus (HIPP), striatum (STR), and spinal cord (SPIN.C). High levels of NeuN (60 kDa) were found in the hippocampus and striatum, and lower in the thalamus and spinal cord. In all four brain regions, NeuN levels were the same under control and treatment conditions, indicating that each of these lanes was flushed with equal amounts of protein. The same membrane was used for NAIP and NeuN immunoblotting. FIG. 10 is a graph showing the density of neurons in cells expressing the NAIP transgene after transient ischemia. FIG. 11 is a western blot showing analysis of antisera against neuronal apoptosis inhibitory protein (NAIP). Electrophoretically transferred whole cell extracts from rat brain were used to transfer nitrocellulose strips to either NAIP antiserum or glutathione-S-transferase (GST) -NAIP fusion protein pre-adsorbed NAIP antiserum. And blotted. The affinity-purified NAIP antibody recognized only a 150 kD band corresponding to the estimated molecular weight for NAIP (lane A). When the GST-NAIP fusion protein was previously adsorbed to the antibody, no 150 kD band appeared (lane B). In each lane, 20 μg of the protein was electrophoresed. FIG. 12 is a photograph showing NAIP-like immunoreactivity (NAIP-LI) in the neocortex. Neuronal cytoplasm and processes were moderately labeled in all cortical layers (A). NAIP-LI in layer V pyramidal neurons shows strong labeling in apical processes (arrows) (B). Scale bar = 300 μm (A); 30 μm (B). FIG. 13 is a photograph showing NAIP-LI in the hippocampus. NAIP-LI was detected in pyramidal neurons (CA1-CA3), dentate granule cells (DG), and interneurons (A). Within the subfield of CA1, NAIP-LI was present in the cell bodies and dendrites of pyramidal neurons (B). The strength of NAIP-LI exhibited by the subfields of CA1-CA3 and by neurons in the dentate gyrus appeared similar (B, C and D). Compared to these neuronal populations, stronger staining was found in interneurons scattered throughout the hippocampus in the oriens layer, lucunosum of CA1 (B), lucidum of CA2 and CA3 (C), and Seen at the dentate (D). Arrows indicate interneurons. Scale bar = 500 μm (A); 300 μm (B, C, D). FIG. 14 is a photograph showing double-label immunohistofluorescence of striatal neurons for NAIP-LI and NAIP and choline acetyltransferase (ChAT) in the striatum. Large neurons showing strong labeling were found throughout the caudate nucleus-putamen (arrowheads) (A). In contrast, medium-sized neurons were weakly labeled by the NAIP antibody (arrow) (A). Immunohistofluorescent double labeling shows complete overlap between NAIP-LI (B) and ChAT-immunoreactive neurons (C) (arrowheads). Scale bar = 300 μm (A); 30 μm (B). FIG. 15 is a photograph showing NAIP-LI in the output structure of the basal ganglia. Labeled neurons were observed in the pallidum (A), endopeduncular nucleus (B), and substantia nigra (C). Strongly labeled fibers were also found in these structures, especially in the interleg nuclei (B). In the substantia nigra, NAIP-positive neurons were mainly localized in the substantia nigra pars compact (SNC). Also, scattered immunoreactive neurons were present in the substantia nigra reticulum (SNR) and outer substantia nigra (SNL). Dendrites emanating from the dense part [pars compact] were observed extending abdominally into the SNR (C). Scale bar = 300 μm. FIG. 16 is a photograph showing NAIP-LI in the diagonal band and dual immunohistofluorescence labeling of diagonal band neurons for NAIP and ChAT. NAIP immunoreactive neurons were present in the horizontal and vertical legs of the diagonal band (A). Double labeling revealed that in the diagonal band, there was little overlap between NAIP-positive neurons (B) and ChAT-positive neurons (C). The arrow indicates the only doubly labeled neuron. Scale bar = 300 μm (A); 30 μm (B, C). FIG. 17 is a photograph showing NAIP-LI in the diencephalon. NAIP-LI was detected in almost all of the thalamic area by more strongly labeled neurons appearing in the ventromedial and retroventral nuclei (A). An enlargement of the boxed area shown in (A) shows labeled neurons in the ventral nucleus (B). In the reins, NAIP-LI was shown on both the medial and outer rein nuclei. A small population of bipolar neurons in the lateral bridle showed very strong NAIP-LI (C). NAIP-LI was hardly detected in the hypothalamus (D). Scale bar = 600 μm (A); 300 μm (C, D). FIG. 18 is a photograph showing NAIP-LI in the substantia nigra and dual labeling of substantia nigra neurons for NAIP and TH. NAIP-LI was mainly shown by neurons in SNC (A). Double labeling of SNC neurons for NAIP (B) and tyrosine hydroxylase (C) indicates that these two markers have high intracellular duplication (arrowheads). Scale bar = 500 μm (A); 30 μm (C). FIG. 19 is a photograph showing NAIP-LI in the cranial nerve and the relay nucleus of the brain stem. The oculomotor nucleus and several nuclei such as the Eddinger-Westfal nucleus (A), the trigeminal nucleus, the cochlear nucleus (B), the facial nucleus (C), the vagus nucleus and the hypoglossal nucleus (D) Strong NAIP-LI was detected in the cerebral nucleus. Strong labeling of nerve roots extending ventrally from the oculomotor and cochlear nerves was seen (A and B). NAIP-positive neurons were also found in the red nucleus (A) and brainstem relay nuclei such as the fasciculate and cuneiform nuclei (D). Scale bar = 400 μm. FIG. 20 is a photograph showing NAIP-LI in the brain and relay nuclei and the cerebellum. NAIP-LI was observed in a large number of neurons in the pontine nucleus and rostal periolivary area (A). The colleus site, as well as the three major nuclei of the trigeminal nerve, the midbrain tract nucleus, the major sensory nucleus, and the motor nucleus also showed strong NAIP-LI (B). Giant cell neurons in the reticular nucleus were strongly labeled (arrowheads indicate giant-sized neurons) (C), and neurons in the vestibular nucleus were also strongly labeled (D). NAIP-LI was also present in the cerebellar nuclei such as the outer cerebellar nucleus and the middle cerebellar nucleus (D). Scale bar = 400 μm. FIG. 21 is a photograph showing NAIP-LI in the oculomotor nucleus and dual immunohistofluorescence labeling of oculomotor neurons for NAIP and ChAT. Example of NAIP-LI in oculomotor nerve showing labeling of cell bodies and axons (A). NAIP in the oculomotor nerve was immunohistofluoresced (B). In the area of the oculomotor nucleus, the same area as the area shown in (B) was immunohistofluoresced for ChAT (C). Arrowheads indicate double labeled neurons, arrows indicate examples of NAIP immunoreactive neurons without ChAT. Scale bar = 300 μm; 30 μm (B, C). FIG. 22 is a photograph showing NAIP-LI in the cerebellar cortex. In the cerebellar cortex, NAIP positives having a regular monolayer sequence were detected (A). NAIP-LI was not found in the other layers (A). Immunohistofluorescent labeling of NAIP in cerebellar cortex (B). Immunohistofluorescent labeling of calcium-binding protein (28 kD, CaBP) showing Purkinje cell layer (C) in the same cerebellar region as in (B). Note that there is a complete overlap between neurons immunoreactive for NAIP (B) and CaBP (C). Scale bar = 300 μm (A); 30 μm (B, C). FIG. 23 is a photograph showing NAIP-LI in the spinal cord. Numerous NAIP-positive neurocytoplasms of various sizes and morphologies were found at the level of the cervical (A), thorax (B, C), and sacrum (D) of the spinal cord. Strongly labeled neurons are mainly located on the anterior side of the spinal cord. Note that NAIP-LI is found in gray and white matter neuronal processes. Scale bar = 300 μm. FIG. 24 is a photograph showing the distribution of NAIP-LI in the dorsal horn and the anterior horn of the spinal cord at thoracic level 2. NAIP-positive neurons were concentrated in the anterior horn (plates 7, 8 and 9) and in the Clark column (plate 7). The majority of NAIP-positive neurons in the anterior horn were large and triangular (arrowheads). Although small in number and compact, NAIP-positive neuronal cytoplasm was also found in plates V and VI. Plates I-IV contained a small number of immunoreactive neurons (A). Immunohistofluorescent labeling for NAIP in the spinal cord horn (B). Immunohistofluorescent labeling for ChAT in the same region as the spinal cord horn shown in (B) (C). Arrowheads indicate double labeled neurons. Scale bar = 300 μm (A, B); 30 μm (C, D). FIG. 25 is a photograph showing the effect of adenovirus-mediated overexpression of NAIP on the immunoreactivity of substantia nigra TH after 6-OHDA in the striatum. Upper panel: control; middle panel: Lac7-6-OHDA; lower panel: NAIP-6-OHDA. FIG. 26 is a photograph showing neurons that have undergone axotomy (top) and control neurons. FIG. 27 is a photograph showing NAIP levels on day 1, 3 and 7 in axotomized cells and control cells. FIG. 28 is a photograph showing the expression of IAP after axotomy of the facial nerve. FIG. 29 is a photograph showing NAIP expression in axotomized neoplastic cells and control neoplastic cells. FIG. 30 shows that a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) or K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) was administered to the hippocampus (A, D and G), striatum (B, E). And H) and photographs showing the effect on NAIP-like immunoreactivity in the thalamus (C, F and I). Animals treated with vehicle show moderate levels of NAIP-like immunoreactivity in hippocampal CA1 neurons (CA1; A) and thalamic neurons (THAL; C). In the striatum, cholinergic neurons (arrowheads) (C). Three hours after administration of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection), NAIP-like immunoreactivity increased in all three areas (D, E and F). In the striatum, K252a appears to increase NAIP-like immunoreactivity, mainly in medium-sized neurons (arrows) (F). By 24 hours, NAIP-like immunoreactivity had returned to basal levels in the hippocampus (G), striatum (H), and thalamus (I). Scale bar = 300 μm (A, B, D, E, G, H); 50 μm (C, F, I). FIG. 31 is a photograph showing the effect of K252a treatment on NAIP levels. A. Effect of a single dose of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) on NAIP and NeuN levels in the thalamus, hippocampus, striatum, and spinal cord. (A) Thalamic (THAL) 3 hours after a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (control = C) or K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) (treatment = T) ), Western analysis of NAIP levels in hippocampus (HIPP), striatum (STR), and spinal cord (SPIN. C). K252a increased NAIP levels (150 kDa) in all four areas, with the largest increases occurring in the thalamus and striatum. (B) Thalamic (THAL) 3 hours after a single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (control = C) or K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) (treatment = T). ), Western analysis of NeuN levels in hippocampus (HIPP), striatum (STR), and spinal cord (SPIN.C). High levels of NeuN (60 kDa) were found in the hippocampus and striatum, and lower in the thalamus and spinal cord. In all four brain regions, NeuN levels were the same under control and treatment conditions, indicating that equal amounts of protein were run in each of these lanes. The same membrane was used for NAIP and NeuN immunoblotting. B. Comparison of the effects of short-term and long-term administration of K252a on NAIP levels in the hippocampus. Single dose of vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) or K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) or long-term administration of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection, once a day for 7 days) Analysis of NA IP levels in hippocampus after targeted administration. NAIP levels (150 kDa) were elevated in all three animals when compared to the vehicle injected animals. Chronic administration of K252a resulted in even higher NAIP levels in all three animals studied. C. Densitometer measurements of K252a alone and repeated dose effects on NAIP levels in hippocampus. A single dose of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) increased NAIP levels by about 50%, whereas long-term administration of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection, once daily for 7 days) Increased the NA IP level by about 100%. Bar graphs and bars represent the mean and the standard error of the mean for three animals. Asterisk, significantly different from vehicle-treated animals (p <0.01; Newman-Keuls test). Significantly different from animals that received a single injection of the asterisk, vehicle, or K252a (p <0.01; Newman-Keuls test). FIG. 32 is a photograph showing the effect of short-term and long-term administration of K252a on NAIP mRNA expression in the hippocampus as detected by in situ hybridization histochemistry. Low levels of NAIP mRNA were present in the hippocampus of animals injected with vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) (A). A single dose of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) increased NAIP mRNA levels in the hippocampus (B). Long-term administration of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection, once daily for 7 days) further increased NAIP mRNA levels (C). All animals were sacrificed 3 hours after the last injection. FIG. 33 is a photograph showing the effect of long-term pretreatment with K252a on CA1 neuron loss 5 days after performing 4-vessel occlusion (4-VO) for 10 minutes. A. Immunohistochemical detection of neurons in the hippocampus of mock-treated animals injected with vehicle (VEH + SHAM, arrow indicates CA1 region) by monoclonal antibody (A60) against neuron specific marker NeuN. B. Massive loss of NeuN-like immunoreactive neurons (VEH + 4-VO) in the CA1 area (arrow) of vehicle-treated animals 5 days after recirculation. C. Reduction of ischemia-induced neuronal death in the CA1 area (arrow) after chronic administration of K252a (K252a + 4-VO). Scale bar = 500 μm. D. Density of CA1 neurons expressing NeuN-like immunoreactivity as assessed by computer image analysis. In the CA1 region 5 days after 4-VO for 10 minutes, 70% loss of CA1 neurons was detected (ISCHEMIA). Long-term administration of K252a reduced ischemic damage in the CA1 area by approximately 50% (K252a + ISCHEMIA). Bar graphs and bars represent the mean and the standard error of the mean for six animals. Asterisk, significantly different from vehicle-treated simulated ischemia (VEHICLE + SHAM) (p <0.01; Newman-Keuls test). Star, significantly different from vehicle-treated animals (VEHICLE + ISCHEMIA) with 4-VO (p <0.01; Newman-Keuls test). FIG. 34 is a photograph showing the effect of virus-mediated overexpression of NAIP on the loss of CA1 neurons after transient forebrain ischemia. A. Immunohistochemical detection of neurons by a monoclonal antibody (A60) against the neuron-specific marker NeuN in the hippocampus (left) stereotactically injected with LacZ-containing adenovirus constructs 5 days after 4-VO 10 min. B. NeuN-like immunoreactivity in the right hippocampus stereotactically injected with a recombinant adenovirus construct containing myc-tagged NAIP 5 days after 4-minute VO. Note the high number of CA1 neurons in the hippocampus injected with NAIP adenovirus. C. CA1 neurons showing X-gal staining after injection of the lacZ construct into the hippocampus in animals without 4-VO (arrowheads). D. CA1 neuron (arrowhead) on the side injected with NAIP adenovirus is labeled with mAb9E10 antibody that recognizes myc-labeled NAIP. Scale bar = 500 μm (A, B); 50 μm (C, D). E. FIG. Quantitative comparison of the effects of virus-mediated overexpression of NAIP and lacZ on the loss of CA1 neurons after transient forebrain ischemia. The density of CA1 neurons expressing NeuN-like immunoreactivity was evaluated by computer image analysis. Neuron density represents the number of labeled cells per 100 μm length of CA1 pyramidal layer. The black area in the center of the CA1 area represents the damage caused by the injection process. Cell counting revealed that CA1 loss was reduced by about 60% in hippocampus injected with adenovirus constructs containing myc-labeled NAIP, compared to those injected with adenovirus constructs containing lacZ. . Bar graphs and bars represent the mean and the standard error of the mean for six animals. Asterisk, significantly different from lacZ vector injected side (p <0.01; t-test). Description of the preferred embodiment Mutations in the NAIP protein (neuron apoptosis inhibitory protein) are associated with spinal muscular atrophy, an autosomal recessive disease characterized by depletion of spinal motor neurons (Roy et al., Cell 80: 167-178). , 1995). The NAIP gene has homology to two baculovirus apoptosis protein inhibitors (Cp-IAP and Op-IAP) and is partially deleted in people with type I spinal muscular atrophy. Overexpression of NAIP protects several cell lines from apoptotic death induced by various causes. This finding appears to indicate that in the absence of NAIP, excessive apoptotic death of motor neurons results in spinal muscular atrophy. Consistent with the anti-apoptotic role of NAIP, immunohistochemical analysis indicates that NAIP is localized in motor neurons but not sensory neurons in the spinal cord. We examined the distribution of neurons expressing NAIP in the adult forebrain, generally and under conditions of ischemia and neurodegeneration. Our findings, along with the observation that NAIP has anti-apoptotic properties, may indicate that damage resulting from cerebral ischemia and neurodegeneration is controlled by elevated NAIP levels in neurons susceptible to the damaging effects of ischemia. We have come to the conclusion We have found that elevated NAIP levels are also closely linked to the ability of axons to survive regeneration following axotomy. Data obtained by IAPs indicate that they also have similar neuroprotective and regenerative roles. Thus, the present invention provides treatments for nerve defense and nerve regeneration under various circumstances. Methods and kits for detecting compounds that enhance neuroprotection and diagnostic kits for detecting neurodegenerative diseases are also part of the invention. The following describes an overview of our results, characterizes and demonstrates the neuroprotective NAIP activity of NAIP, and details examples of neuroprotection methods, and examples illustrating various aspects of the invention. ing. Localization of NAIP The present inventors used an affinity-purified polyclonal antibody raised against a neuronal apoptosis-inhibiting protein or NAIP to examine the distribution of NAIP-LI in the CNS. Immunohistochemical detection of NAIP revealed that this anti-apoptotic protein is present in neurons that are located in various structures. NAIP-LI was not detected in non-neuronal cell types, such as cerebral vascular or glial-associated cell types, indicating that in the CNS, NAIP is selectively expressed by m neurons. Suggests. In the forebrain, low levels of NAIP-LI were found in the cortex and hippocampus. In the cortex, NAIP-LI was observed in both superficial and deep layers. The apparent visibility of NAIP-LI in the apical processes of pyramidal neurons, in addition to cell body labeling, indicates that this anti-apoptotic protein is actively transported. NAIP-LI was also widely distributed in the hippocampus where NAIP-LI was detected in pyramidal neurons, interneurons, and granule cells of the dentate gyrus in the CA1-CA3 subfield. As seen in the cortex, NAIP-LI was localized to both the cell body and the dendrites of pyramidal neurons. NAIP staining intensity appeared similar in CA1 and CA3 neurons, independent of well-characterized differences in NAIP's vulnerability to ischemic damage in these neuronal populations (Francis and Pulshinelli, 1982). In the thalamus, moderate NAIP-LI levels were found in a large number of neurons located in the ventral and lateral regions of the structure. NAIP-LI is also present in the anterior, intralamellar, and inner nuclei of the thalamus, but immunoreactive neurons were only slightly detected in these areas. Enrichment of NAIP-LI in fibers forming a dense network on the ventrolateral surface of the thalamus suggests that NAIP is transported from the cell body to dendrites and axons. In the striatum and reins, in contrast to the cortex, hippocampus, and thalamus, NAIP-LI is restricted to a small subpopulation of neurons. In the striatum, double labeling experiments showed that NAIP-LI in this construct was expressed only in cholinergic interneurons, which make up 1% of the total neuronal population (Semba and Fibinger, 1989). The high levels of NAIP-LI observed in these neurons try to speculate that they may partially explain that these neurons are resistant to excitotoxic / ischemic injury (Francis and Pulshinelli, 1982). NAIP-LI was always present in striatal cholinergic neurons, whereas NAIP-LI, present in the basal forebrain, was rarely found in cholinergic neurons. This finding may be related to the observation that non-cholinergic cells in the basal forebrain are more resistant to retrograde injury created by axotomy than cholinergic neurons. No (Peterson et al., 1987). In addition to cortex, striatum, and thalamus, several other structures involved in sensory and motor function were found to contain NAIP-positive neurons. These include the pallidum, the dense substantia nigra, the inner limb nucleus, the pons nucleus, the outer reticular nucleus, the cerebellum, and the spinal cord. The strength of NAIP-LI in neurons of these structures suggests that this anti-apoptotic protein may be responsible for maintaining the survival of these structures. Consistent with this notion, neuronal degeneration has been reported in the thalamus (ventral and lateral nuclei), pallidum, substantia nigra, intraleg, pons, cerebellum, and spinal cord in cases of severe SMA (Staiman et al., 1980; Towfighi et al., 1985; Murayama et al., 1991). The agreement between the distribution of NAIP-LI and neuronal damage in SMA strongly suggests that loss of NAIP contributes to the pathological processes observed in this neurodegenerative disorder. In the cranial nucleus, high levels of NAIP-LI were present in both motor and sensory neurons. ChAT immunohistochemistry was used to identify motor neuron populations in the midbrain and brainstem. According to double labeling experiments, NAIP-LI is often present in motor (ChAT-positive) neurons of the oculomotor, trochlear, motor trigeminal, facial, vagal, and hypoglossal nuclei. It was revealed. These experiments also revealed that NAIP-LI is absent in sensory (ChAT-negative) neurons of the brain nucleus, including motor and sensory neurons, such as the facial nucleus. Recently, strong NAIP-LI was found in nuclei associated with sensory function: Clark's column, thin bundle nucleus, and wedge-shaped nucleus. In addition, supporting a central role for NAIP deficiency in the SMA is that in the SMA all of these structures exhibit damage (Staiman et al., 1980; Towfighie et al., 1985). In summary, NAIP localization experiments indicate that it is widely distributed in the CNS. Low to moderate levels of NAIP-LI were found in the cortex and hippocampus, but strong NAIP-LI was detected in various subcortical brain regions. These include the thalamus (ventral and lateral nuclei), basal ganglion (striatal, pallidal, intraleg, nucleus, and substantia nigra), cerebral nuclei, brainstem relay nuclei (wedge-shaped nuclei, thin bundles) Includes the nucleus, pontine nucleus, lateral reticular nucleus, interlimb nucleus, olive nucleus, and the site of coeruleus, cerebellum, and spinal cord.With the exception of the striatum, all of these areas are Demonstrates neuropathology The fact that NAIP-LI in the striatum is localized only in cholinergic interneurons, which makes up only 1% of the striatal neuron population, is due to the degenerative nature of this structure. Previous experiments attempting to observe changes may be the reason for failure (Towfighi et al., 1985; Murayama et al., 1991) Transient ischemia increases NAIP levels In situ hybridization Measurement of NAIP messages by histochemistry is extremely This indicates that low levels of mRNA are present in the hippocampus, in fact, basal expression of NAIP mRNA can only be detected in dentate gyrus cells of the hippocampus, but transient cerebral ischemia is mainly due to In CA1 neurons, the expression of NAIP was delayed but increased significantly, with these increases first appearing after 24 hours of transient forebrain ischemia for 10 minutes and then 72 hours later Elevation peaked: Despite these large elevations of NAIP mRNA, NAIP-I does not appear to increase in CA1 neurons, whereas 72 hours after recirculation, CAIP neurons do not. In these studies, NAIP-I is lower than basal levels.These findings are consistent with earlier reports showing that protein synthesis is severely inhibited in CA1 neurons after transient global ischemia. (Thilman et al., Acta. Neuropathol. 71: 88-93, 1986; Maruno and Yanagihara 115: 155-160, 1990; Widmann et al., J. Neurochem. 56: 789-796, 1991. Furthermore, after transient ischemic attacks, CA1 This indicates that neurons may be susceptible to the damaging effects of this harmful treatment because of the inability to produce AIP protein. In striatal cholinergic neurons, there was a dramatic rise three hours after the ischemic attack. We believe that the resistance of these neurons to the damaging effects of transient cerebral ischemia is conferred by the ability to increase NAIP expression following an ischemic attack. Similarly, the significant elevation of NAIP-I detected in thalamic neurons after a brief period of global ischemia also indicates that these neurons respond to ischemic damage compared to medium striatum and CA1 neurons. Seem to contribute to the increased resistance (Pulsinell et al., 1982, supra). NAIP levels are increased prior to ischemic injury, increasing neuronal survival. A major finding of the present invention is that treatment with the neuroprotective compound K252a increases levels after 10 minutes of transient cerebral ischemia and suppresses CA1 loss. Our results show that administering K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) once daily for 7 days prior to 4 vessel occlusion (4-VO) reduces ischemic damage in the hippocampus. showed that. One interpretation of this result is that pretreatment with K252a increases the expression of protective proteins that render CA1 more resistant to the damaging effects of transient cerebral ischemia. Consistent with this belief, we observed elevated levels of NAIP mRNA and protein in the hippocampus after a single dose of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection). Thus, we believe that K252a's ability to increase NAIP levels is responsible for its neuroprotective effects. We have also discovered that K252a increases NAIP levels in the striatum, thalamus, and spinal cord. This also indicates that the compound exerts neuroprotective effects in these areas by increasing NAIP expression. We believe that K252a acts by increasing NAIP levels. Thus, methods to increase IAP and NAIP protein levels, either directly or by gene therapy, could be used to prevent neuronal death after ischemia. In addition, IAP and NAIP gene expression and biological activity could be monitored as a way to identify compounds that prevent central nervous system cell death resulting from ischemia. Correlation between NAIP expression and resistance to ischemic injury Transient cerebral ischemia increases NAIP-like (NAIP-LI) immunoreactivity in striatal cholinergic neurons, while NAIP-LI in medium spiny neurons did not appear to rise appreciably with this attack. With significant exceptions to the neurons in the reticulated nucleus of the thalamus, labeling of neurons on the ventral and lateral aspects of the thalamus was also substantially elevated by brief global ischemia. Consistent with reports that protein synthesis in CA1 neurons is suppressed after transient global ischemia (Thilman et al., Acta. Neuropathol. 71: 88-93, 1986; Maruno et al. , Nurosci. Lett. 115: 155-160, 1990; and Widman et al., J. Neurochem. 56: 789-796, 1991), 4-VO does not increase NAIP-LI in these neurons. Rather, a decrease in immunoreactivity was seen 72 hours after recirculation. Thus, a population of neurons known to be susceptible to the damaging effects of transient global ischemia, such as the medium spiny, thalamic reticulum, and hippocampal CA1 neurons (Pulsinelli et al. Ann. Neurol. 11: 491-498, 1982; and Smith et al., Acta Neuropathol. (Berl) 64: 319-332, 1984) show that after 10 minutes of 4-VO, NAIP-LI Could not show rise. In contrast, we found that levels of this anti-apoptotic protein were significantly elevated in striatal cholinergic and thalamic neurons that are resistant to the damaging effects of transient ischemic attacks (Pulsinelli et al., Ann. Neurol. 11: 491-498, 1982; and Smith et al., Acta Neuropathol. (Berl) 64: 319-332, 1984). Thus, we believe that the susceptibility of these neuronal populations to the damaging effects of transient cerebral ischemia is at least in part due to the ability to increase NAIP levels following a transient ischemic attack. We think that we can make judgment. K252a suppresses ischemic damage and increases NAIP expression. The main finding of this study is that treatment with the neuroprotective compound K252a can increase levels and suppress CA1 loss after 10 minutes of transient cerebral ischemia. Our results showed that administering K252a (0.1 mg / kg, sc) once daily for 7 days prior to 4-VO reduced ischemic damage in the hippocampus. Five days after 4-VO, the loss of CA1 neurons was examined, so further studies may be needed to confirm that the neuroprotective effects of K252a are not transient. Blood pressure, gas (pCO Two And pO Two ), Or the pH did not change, indicating that altering these physiological variables did not suppress the loss of CA1. The fact that long-term treatment with K252a is required to suppress ischemic damage is due to the fact that pretreatment may result in a protective protein that makes CA1 more resistant to the damaging effects of transient cerebral ischemia. Suggests increasing expression. Consistent with this idea, we have proposed K252a (0. (1 mg / kg, subcutaneous injection) was observed to increase the levels of NAIP mRNA and protein in the hippocampus. In addition, K252a (0. After long-term administration of 1 mg / kg, subcutaneous injection, once a day for 7 days, the compound was administered as a single dose (0. (1 mg / kg, sc) significantly increased NAIP mRNA and protein levels than seen after. Thus, a significant increase in NAIP levels after long-term administration was observed when compared to a single dose of K252a, indicating that repeated doses of K252a had stronger neuronal effects than a single dose of the compound. May be relevant to reports showing protection. (Smith-Swin tosky et al. , Exp. Neurol. 141: 287-296, 1996). A single dose of K252a increases NAIP levels in the striatum, thalamus, and spinal cord, indicating that the compound exerts neuroprotective effects in these areas by increasing NAIP expression It indicates that you want to. Consistent with this hypothesis, K252a has been shown to have neurotrophic-like effects on early cultures of striatal and spinal cord motor neurons (Glickman et al. , J. et al. Neurochem. 61: 210-221, 1993; and Glickman et al. , J. et al. Neurochem. 64: 1502-1512, 1995). The pathway by which K252a up-regulates NAIP expression has not been determined. Some lines of evidence suggest that K252-like compounds exert a beneficial effect by activating tyrosine kinases bound to growth factor receptors. First, K252a can mimic some of the biological effects of NGF (Nakanishi et al. , J. et al. Biol. Chem. 23: 6215-6219, 1988) and can promote tyrosine phosphorylation (Maroney et al. , J. et al. Neurochem, 64: 540-549, 1995). Exposure of hippocampal cultures to low concentrations of K252a (100 pM) and K252b, a 9-carboxylic acid derivative of K252a (100 pM), using anti-phosphotyrosine antibodies, resulted in molecular weights between 40 kDa and 200 kDa. Western blotting has been shown to promote tyrosine phosphorylation of many proteins in the kDa range (Cheng et al. , J. et al. Neu rochem. 62: 1319-1329, 1994). Third, the neuroprotective effects of K252-like compounds were inhibited by the selective tyrosine kinase inhibitor genistein, but not by inactive analogs of genistin (Cheng et al. , J. et al. Neurochem. 62: 1319-1329, 1994). We believe that K252a's ability to increase NAIP levels is responsible for its neuroprotective effects. Virus-mediated NAIP overexpression is neuroprotective. Using an adenovirus construct capable of overexpressing NAIP in vivo, it was determined whether elevated levels of this anti-apoptotic protein would suppress the damaging effects of transient forebrain ischemia in the hippocampus. As a control, an adenovirus construct containing the bacterial enzyme lacZ was injected into the hippocampus opposite the brain. Cell counting revealed that NAIP adenovirus increased the survival of CA1 neurons after developing transient forebrain ischemia. Since the NAIP generated from the adenovirus construct was Myc-labeled, the infected cells could be identified by immunohistochemistry using an antibody that selectively recognizes the Myc antigen. Immunohistochemical detection of Myc revealed that CA1 neurons were infected by NAIP adenovirus. However, counting the cells, in fact, more CA1 neurons (7 ± 1) were infected with NAIP adenovirus than CA1 neurons (15 ± 2) protected from ischemic attacks. This mismatch will be accounted for in at least three ways. First, it may be that overexpression of NAIP in only a few CA1 neurons is sufficient to prevent a series of processes leading to widespread loss of CA1 neurons after transient global ischemia. Second, the low NAIP levels resulting from weak adenovirus infection are also considered neuroprotective. These low levels of adenovirus-derived NAIP (Myc-labeled) were below the limit of detection as assessed by immunohistochemistry. Third, we observed that adenovirus infection was not restricted to CA1 neurons. Other cell types of the hippocampus, such as glia and interneurons, also appeared to be infected with NAIP adenovirus (data not shown). As a result, overexpression of NAIP in these cellular populations may have the beneficial effect of indirectly enhancing the resistance of CA1 neurons to ischemic injury. Neuroprotective compounds function by increasing NAIP levels. Some growth factors, such as neutrophin, insulin-like growth factor, and fibroblast growth factor, have been shown to protect cultured neurons from excitotoxic / ischemic injury (Mattson et al. , Exp. Neurol. 124: 89-95, 1993). However, the clinical application of growth factors to treat seizures is limited by their small ability to cross the blood-brain barrier. A possible solution to this problem is to use low molecular weight compounds that easily cross the blood-brain barrier and mimic the neuroprotective effects of growth factors. One such compound is the bacterial alkaloid K252a, which has been shown to exert neuroprotective effects at low concentrations (fM to nM) in vitro (Kase et al. , J. et al. Antiobiot. 39: 1 05 9-1065, 1986; Knusel and Hefti, J. et al. Neurochem. 59 (6): 1987-1996, 1992). In early cultures of hippocampus, cortex, and septum, K252a protects against neuronal injury induced by glucose deficiency (Cheng et al. , J. et al. Neurochem. 62: 1319-1329, 1994). K252a has also been reported to have neurotrophic-like activity, as measured by increased choline acetyltransferase (ChAT) activity in spinal cord cultures of rat embryos (Glickman et al. , J. et al. Neurochem. 61: 210-221, 1993; and Glickman et al. , J. et al. Neurochem. 64 (4): 1502-1512, 1995). Consistent with these in vitro findings, an analog of K252a (CEP1347) inhibits developmental stage programmed motor neuron death and loss of ChAT in adult motor neurons in vivo (Glickman et al. . , Soc. Neuro. Abs t. 441, 1994). In the hippocampus, a single systemic dose of K252a attenuates the loss of CA3 neurons caused by kainate injected into the hippocampus (Smith-Swintosky et al. , Soc. Neuro. Abst. 2130, 1995). Prolonged administration of K252a for two months produces significantly stronger protection than that seen after a single pretreatment (Smith-Swintosky et al. 1995, supra). Because ischemic cell death is thought to involve an excit otoxic mechanism, we pre-assess that K252a pretreatment with CA1 hippocampus after transient global ischemia. It was determined whether the loss of neurons was suppressed. We have theorized that by inducing NAIP expression, K252a becomes a neuroprotective. Thus, the present inventors examined the effects of K252a administration on NAIP expression in the thalamus, hippocampus, striatum, and spinal cord. When NAIP is detected immunohistochemically, anti-apoptotic proteins are present in various forebrain structures, such as the cortex (ie, pyramidal neurons), hippocampus, thalamus, and striatum, in addition to the spinal cord. It becomes clear that there is. Hippocampal NAIP-I was localized to CA1, CA2, CA3, and CA4 pyramidal neurons and granule cells of the dentate gyrus. In the thalamus, NAIP-I is mainly presented by neurons on the ventral-inner and ventral-lateral sides of this structure. Given that NAIP is a potent inhibitor of apoptotic death, we believe that NAIP depletion is the reason for the thalamic abnormalities seen in spinal atrophy (Murayama et al. Acta. Neuropathol. 81: 408-417, 1991). NAIP-I in the striatum is restricted to about 1% of the neuronal population. Double labeling by immunohistofluorescence indicates that striatal NAIP-I is localized only in cholinergic neurons. These cells are interneurons and are known to make up about 1% of the striatal neuron population (Semba and Fibiger, Progress in Brain Res. 79: 37-63, 1989). Summary Our findings show that small molecular weight compounds, such as K252a, can cross the blood-brain barrier when administered in the surroundings in amounts sufficient to exert a neuroprotective effect. In addition, the results of this experiment indicate that these compounds have a beneficial effect by increasing the level of the anti-apoptotic protein NAIP. Thus, immunohistochemical detection of NAIP may serve as a cheap, rapid, in vivo method for identifying putative neuroprotective compounds. In addition, elevated NAIP levels are important treatments for obtaining neuroprotection. A better understanding of the molecular basis of neuronal survival will reveal new ways to develop better treatments for neurodegenerative diseases. NAIP and IAP levels are elevated in cells that survived axotomy. In addition to the above, we noticed that NAIP and XIAP levels were higher in cells that survived axotomy. This indicates that these proteins (and compounds that increase biological activity) can be used to promote nerve repair. Treatment to prevent or reduce cell death following ischemic effects of the central nervous system. Based on our findings, we believe that the insufficiency of NAIP or IAP polypeptides is a primary cause of neuronal death following an ischemic attack or during the development of a neurodegenerative disease. We conclude that it is a pathogenic mechanism. Therapeutic measures that increase the levels of NAIP, or IAP, prevent or reduce the catastrophic cell death that often occurs as part of these symptoms. These therapies are also suitable for treating pre-symptomatic individuals who are more likely to develop ischemia or a neurodegenerative disease. For example, patients experiencing ischemic effects, such as those with traumatic injury, stroke, myocardial infarction, transient ischemic stroke, or other conditions that limit blood flow to the CNS tissue, It may be useful to provide protein activity. Patients at high risk due to genetic conditions are also candidates for these treatments. Treatment that increases the level of biological activity of NAIP or IAP will also be offered to patients at risk of developing conditions that compromise blood flow to the CNS. For example, patients with a history of stroke and undergoing intracranial surgery may benefit from prophylactic NAIP or IAP treatment. i) NAIP or IAP gene therapy Since NAIP expression is proportional to the increase in cell viability after ischemia, NAIP and its associated IAP genes can be treated with gene therapy for neuroprotection. It can also be used. Retroviral vectors with appropriate tropism for cells that are affected by ischemia-induced cell death or neurodegeneration (eg, having tropism for striatal neurons or neocortical layers 3, 5, and 6 neurons) , Adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, poliovirus vectors, or other viral vectors may be used as a gene transfer system for therapeutic NAIP or IAP gene constructs. Useful vectors for this purpose are generally known (Miller, Humn Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989; Iglitis and Anderson (Egliti) and Anderson), BioTechniques 6: 608-614, 1988; Tolstoshev and Anderson, Current Opinion in Biothechnology 1: 55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277-1278, 1991 ; Cornetta et al. ), Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322, 1987; Anderson, Science 226: 401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17: 407-416, 1991; Miller and Rosman), Biotechneques 7: 980-990, 1989; Le Gal La Salle et al. ), Science 259: 988-990, 1993; and Johnson, Chest 107: 77S-83S, 1995). Viral vectors are particularly well developed and are used in clinical settings. If the therapeutic DNA is not introduced using a method other than a virus, the therapeutic DNA is introduced into cells that are more likely to die after ischemia or neurodegenerative effects. For example, NAIP or IAP can be used for intracranial lipofectin (Felgner et al. ), Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987; Ono et al. ) Neuroscience Lett. 117: 259, 1990; Brigham et al. ), Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger and Papahadjopo ulos, Meth. Enz. 101: 512, 1983), asialoorosomucoid-polylysine conjugation method (Wu and Wu, J. Am. Biol. Chem. 263: 14621, 1988; Wu et al. ), J. et al. Biol. Chem. 264: 16985, 1989), or less preferably, microinjection under surgical conditions (Wolff et al. ), Science 247: 1465, 1990). For the above methods, the therapeutic NAIP or IAP DNA construct is preferably applied to the site where ischemia or neurodegeneration has occurred (e.g., by intracranial injection), but at the tissue near the site where it occurred, or at the site thereof. It may be applied to blood vessels supplying blood to an area near the site. In a gene therapy construct, expression of the NAIP or IAP cDNA is adapted to originate from a suitable promoter (eg, the human cytomegalovirus, simian virus 40, or metallothionein promoter), and its production is controlled by the desired mammal. Is regulated by a control factor. For example, if desired, expression of NAIP or IAP may be achieved using an enhancer known to selectively direct gene expression in neuronal or axonal cells. Alternatively, when a NAIP or IAP genomic clone is utilized as a therapeutic construct, expression of the NAIP or IAP is preferably regulated by a control sequence from a heterologous organism, such as a promoter, or any of the control sequences described above. . Although not preferred, NAIP or IAP gene therapy is performed by administering NAIP or IAP mRNA directly to the ischemic area. This mRNA is produced and isolated by standard techniques, but most easily is produced by in vitro transcription using NAIP or IAP cDNA under the control of a high efficiency promoter (eg, the T7 promoter). . The administration of NAIP or IAP mRNA to cells is performed by any of the methods described above and generally known for directly administering nucleic acids. Ideally, the production of NAIP or IAP protein by any of the above-described gene therapy modifies the level of NAIP or IAP in the cell, at least, usually by ischemia or other effects, resulting in neuronal cell death. To the intracellular levels of NAIP or IAP in cells that survive the actions known to cause NAIP or IAP mediated gene therapy may be combined with conventional anti-ischemic or neuroprotective therapies. Fragments or derivatives of NAIP, HAIP1, HAIP2, or XIAP polypeptides can also be administered by retroviral gene transfer therapy or other viral vector systems. Administration of a useful fragment or derivative of NAIP, HAIP1, HAIP2, or XIAP can be accomplished by replacing the nucleic acid encoding these fragments or derivatives with the complete gene of NAIP, HAIP1, HAIP2, or XIAP, as described above. Alternatively, it may be inserted into a vector for gene therapy. Such constructs may be tested using the methods provided elsewhere herein for testing the effect of NAIP on ischemia. ii) Administration of NAIP or IAP polypeptide Wild-type NAIP or IAP may be administered to a patient who has, or is likely to have, ischemia. Polypeptides useful for this method are those that, when provided to a patient, increase the biological activity of NAIP or IAP by a factor of two or more, thereby providing a neuroprotective effect. Laboratory modified NAIP or IAP polypeptides or nucleic acids may be administered for use in therapy. To stabilize and / or target useful neuroprotective polypeptides, proteins in which a NAIP or IAP polypeptide is fused to a ligand may be used. For example, tetanus toxin, calcium channel blocker, transferrin, poliovirus epitope, neuropeptide fragment, or steroid hormone androgen, or a fragment thereof that is sufficient to target a patient's neurons to deliver a protective polypeptide A fusion protein containing a NAIP or IAP polypeptide fused to a protein may be used. iii) Administration of a compound that increases NAIP or IAP activity in the CNS Staurosporine-like, K252a-like alkaloid (excluding K252a), an ATP analog, or a protein kinase inhibitor, It can be screened for an increase, and if effective, it can be administered to patients at risk for or suffering from ischemia, neurodegeneration, or traumatic injury. Methods for identifying such compounds are provided below. The modulator of NAIP or IAP may be administered in unit dosage form together with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient. Using conventional pharmaceutical practice, a prescription agent suitable for administering NAIP or IAP to a patient at risk of, or before the onset of, ischemia, neurodegeneration, or traumatic injury, Alternatively, a compound may be provided. Suitable administration routes include, for example, intracranial administration, parenteral administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraorbital administration, administration from the eye, intraventricular administration, intracapsular administration, intraspinal administration, intracisternal administration Administration, intraperitoneal, intranasal, aerosol, or oral administration may be used. The therapeutic prescription may be in the form of an aqueous solution or suspension. For oral administration, the prescription may be in tablet or capsule form. Intranasal prescriptions may also be in the form of powder, nasal drops, or aerosols. Methods for making prescription drugs, well known in the art, are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences. Formulations for parenteral administration may include, for example, excipients, sterile water or saline, polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, vegetable oils, or hydrogenated naphthalene. Biocompatible, biodegradable lactide polymers, lactide / glycolide copolymers, or polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers may be used to control the release of the compound. Other useful systems for delivering NAIP or IAP modulator compounds into the brain include pumps, implantable infusion systems, and liposome methods. If desired, treatment with a NAIP or IAP modulator compound may be combined with more traditional anti-ischemic treatments. iv) Prophylactic NAIP or IAP Therapy In patients diagnosed as susceptible to the occurrence of an effect requiring neuroprotection, any of the above treatments may be administered prior to onset. In particular, compounds known to increase NAIP or IAP expression or the biological activity of NAIP or IAP may be administered by standard dosages and routes of administration (see above). Screening for neuroprotective compounds that increase NAIP or IAP activity. By monitoring the expression of NAIP or IAP, or the NAIP or IAP protein upon exposure of a test compound, one could determine whether the compound is likely to be an anti-ischemic therapeutic. In one method, candidate molecules are added at various concentrations to a culture of cells expressing NAIP or IAP mRNA. Then, for example, standard Northern blot analysis using NAIP or IAP cDNA (or cDNA fragment) as a hybridization probe (Ausubel et al. ), The expression of NAIP or IAP is measured by the above-mentioned method. The level of expression of NAIP or IAP in the presence of the candidate molecule is compared to the level measured for the same cell in the same culture medium in the absence of the candidate molecule. If necessary, the effect on the expression of the candidate modulator can be determined using the same general methods and standard immunological detection techniques such as Western blotting using antibodies specific for NAIP or IAP, or immunoprecipitation. Alternatively, the production level of the NAIP or IAP protein may be measured. Candidate modulators may be purified (or substantially purified) molecules, or may be a mixture of compounds (eg, extracts or supernatants obtained from cells; Ausubel et al. ), May be one of the components of the above). A single compound that modulates NAIP or IAP expression in a mixed compound assay, while gradually reducing the subset of the pool of candidate compounds (eg, those produced by standard purification techniques such as HPLC or FPLC). Test the expression of NAIP or IAP until one compound or a minimum compound mixture is known. Candidate NAIP or IAP modulators include peptides, non-peptides (eg, peptides found in cell extracts, mammalian serum, or growth media in which mammalian cells have been cultured, or non-peptides). ) Is also included. Particularly useful modulators of NAIP or IAP expression include staurosporine-like compounds, K252a-like compounds, ATP analogs, or protein kinase inhibitors. In the present invention, molecules that promote the expression of NAIP or IAP, or the protective activity of NAIP or IAP, are considered particularly useful. Such a molecule may be used, for example, as a therapeutic. Modulators found to be effective on the level of NAIP or IAP expression or activity will also prove effective in animal models, and if effective, would be used as anti-ischemic therapeutics. Preferably, such compounds are neuroprotective. NAIP or IAP protein and nucleic acid sequences. The sequence of the NAIP gene is shown in FIG. 11 and UK application serial number 9421010, filed Oct. 18, 1994. 2, and PCT / IB97 / 00142, filed January 17, 1997. The sequence of IAP is described in USSN 08 / 511,485, filed August 4, 1995, and in USSN 08 / 576,956, filed December 22, 1995. Expression of NAIP and IAP proteins. In general, the NAIP or IAP protein according to the present invention can be prepared by using all or part of NAIP or IAP, or a cDNA fragment encoding IAP (for example, the above-mentioned cDNA) in an appropriate vector. Will be produced by transforming a suitable host cell. Those skilled in the field of molecular biology will recognize that a variety of expression systems may be used to provide the recombinant protein. The exact host cell used is not critical to the invention. The NAIP or IAP protein can be a prokaryotic host (eg, E. coli) or a eukaryotic host (eg, Saccharomyces cerevisiae, eg, an insect cell such as Sf21, or eg, COS1, NIH 3T3, or HeLa). (Mammalian cells such as cells). These cells are available from a wide variety of sources (eg, the American Type Culture Collection, Rockland, MD; see also, for example, Ausubel et al. ), The latest protocol in molecular biology, John Wiley & Sons, New York, 1994). The method of transformation and the choice of expression vector will depend on the host system chosen. Transformation methods are described, for example, in Ausubel et al. ) (Supra), and the expression vector is, for example, a cloning vector: an experimental manual (P. H. Pouwels et al. , 1985, Supp. 1987). One preferred expression system is the baculovirus system (eg, pBacPAK9 vector), which can be purchased from Clonetech, Inc. (Palto, CA). Optionally, this system can be used, for example, with Evan et al. ) (Mol. Cell Biol. 5: 3610-3616, 1985), and may be used in combination with other protein expression techniques, such as the myc labeling method. Alternatively, NAIP or IAP is produced by a stably transformed mammalian cell line. Many vectors suitable for stably transforming mammalian cells are commonly available, for example, see Pouwels et al. ) (Supra). Methods for constructing such cell lines are also generally available, for example, Ausubel et al. ) (Supra). In one embodiment, a cDNA encoding a NAIP or IAP protein has been cloned into an expression vector containing a dihydrofolate reductase (DHF R) gene. Plasmid integration, ie, integration of the gene encoding the NAIP or IAP protein into the chromosome of the host cell, is described, for example, in Ausubel et al. 0.) As described in a). Selected by including 01-300 μM methotrexate. This dominant selection can be performed on most cells. Expression of the recombinant protein is increased due to DHFR mediated amplification of the transformed gene. Methods for selecting cell lines responsible for gene amplification are described in Ausubel et al. ) (Supra), such methods generally involve culturing cells expanded in a medium containing a stepwise increase in methotrexate levels. Expression vectors containing DHFR that are widely used for this purpose include pCVSEII-DHFR, and pAdD26SV (A) (Ausubel et al. ) (Described above)). Preferred host cells for selection of stably transformed cell lines, or for DHFR selection for DHFR-mediated gene amplification, include any of the host cells described above, or preferably, a DHFR-deficient CHO cell line. (Eg, CHO DHFR cells, ATCC deposit number CRL9096). Once the recombinant NAIP or IAP protein has been expressed, it is isolated using, for example, affinity chromatography. In one example, an anti-NAIP or anti-IAP protein antibody (eg, produced as described herein) is applied to a column to isolate the NAIP or IAP protein. May be used. Prior to affinity chromatography, lysis and fractionation of cells bearing NAIP or IAP proteins is performed by standard methods (Ausubel et al. ) See above). Once the recombinant protein has been isolated, it can be further purified, if desired, using, for example, high performance liquid chromatography (eg, Fisher, experimental techniques in biochemistry and molecular biology, work-in-progress). Edited by Work and Burdon, Elsevier, 1980. Polypeptides of the invention, especially fragments of short NAIP or IAP proteins, can be synthesized by chemical synthesis (eg, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). ) Can be produced. Using these general techniques for expressing and purifying polypeptides, useful NAIP or IAP fragments or analogs can be produced and isolated (as described herein). ). Other aspects In other embodiments, the invention includes a protein that is substantially identical to a Drosophila, mouse, or human NAIP or IAP polypeptide. Such homologous compounds also include other substantially pure natural NAIP or IAP proteins, allelic variants, spontaneous muteins, induced muteins, and Or, preferably, under low stringency conditions (eg, using a probe of at least 40 bases in length and washing with 2 × SSC at 40 ° C.) to a sequence of NAIP or IAP DNA as described herein. Includes proteins encoding soybean DNA and proteins specifically bound by antisera raised against NAIP or IAP polypeptides. The term also includes chimeric polypeptides that include a NAIP or IAP site. The invention further involves using analogous compounds of the native NAIP or IAP polypeptide. Analogous compounds can differ from native NAIP or IAP proteins by differences in amino acid sequence, post-translational modifications, or both. Analogous compounds of the invention will generally have at least 85%, more preferably 90%, and most preferably 95%, and even 99%, identity to all or part of the amino acid sequence of a native NAIP or IAP. Shows sex. The length comparing the sequences is at least 15 amino acid residues, preferably 25 amino acid residues, more preferably longer than 35 amino acid residues. Modifications include in vivo and in vitro chemical derivation of the polypeptide, for example, acetylation, carboxylation, phosphorylation, or glycosylation, and such modifications may involve synthesis or processing of the polypeptide, or isolation. Occurs after treatment with the modified enzyme. Also, analogous compounds can differ from native NAIP or IAP polypeptides by alteration in primary sequence. These include genetic variants, natural and induced (eg, radiation or random mutagenesis with ethanemethyl sulfate, or Sambrook, Fritsch and Maniatis) molecular cloning. Experimental Manual (2nd edition) CHS Press, 1989, or those produced by site-directed mutagenesis described in Ausubel et al., Supra. Also included are cyclized peptides, molecules, and similar compounds that contain, for example, residues other than L-amino acids, or that contain non-naturally occurring or synthesized amino acids, such as, for example, β or γ amino acids. . In addition to full-length polypeptides, the invention also includes the use of NAIP or IAP polypeptide fragments. As used herein, the term `` fragment '' refers to at least 20 contiguous amino acids, preferably at least 30 contiguous amino acids, more preferably at least 50 contiguous amino acids, and most preferably at least 60 contiguous amino acids. Means from 1 to 80 contiguous amino acids. Fragments of a NAIP or IAP polypeptide can be produced by methods known to those of skill in the art, or can be obtained by normal processing of the protein (eg, by removing amino acids that are not required for biological activity from the native polypeptide, or by selection). Splicing of mRNA or removal of amino acids by selective protein processing). All publications and patent applications mentioned herein are hereby incorporated by reference in the same manner as if each independent publication and patent application were specifically and individually indicated to be incorporated by reference. Incorporated. The following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention. Example Example 1 Materials and Methods Animals. Two adult male Wistar rats (250-275 g; Montreal, Charles Rivers) were caged two at a time in a temperature-controlled environment with a 12 hour light / 12 hour dark cycle. And allowed free access to water and Purina laboratory feed. All animal treatments were in accordance with the guidelines for the care and use of laboratory animals approved by the Canadian Medical Research Council. Tissue preparation. Animals are anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal), transcardially perfused with 200 ml of saline (0.9%) and then phosphate buffered with 4% paraformaldehyde. Perfused with liquid (0.1 M). The brains were postfixed overnight and then placed in 10% sucrose in phosphate buffer (0.01 M) to prevent freezing for 2 days. Using a cryostat, 12 μm thick sections were cut from the appropriate brain region and processed for NAIP-LI. Transient forebrain ischemia model. Using the published modified method of the 4-VO method (Pulsinelli and Buchan, Stroke 19: 913-914, 1988) (Pulsinelli et al., Supra), Excessive forebrain ischemia was performed. Briefly, adult male Wistar rats weighing 250 g (250-275 g; Montreal, Charles Rivers) were anesthetized with 1.5% halothane. Then, the midline incision on the back side of the neck approached the wing hole of the first cervical vertebra. The cervical artery was permanently occluded with an electric scalpel. The carotid arteries were separated by midline incision of the neck from the ventral side and wrapped loosely around them with silk ligatures. Silk sutures were passed through the area of the neck, behind the trachea, esophagus, external jugular vein, and common carotid artery. The end of the ligature was loosely fixed to the neck line with adhesive tape. The incision was then closed with local xylocaine jelly. On the next day, the rats were randomly divided into two groups and subjected to a 10-minute forebrain ischemia (experimental section) or an operation without occlusion of the carotid artery (mock section). Forebrain ischemia involves lifting the common carotid artery using a silk ligature wrapped around the common carotid artery and obstructing the microaneurysm clip (# 160-63, Gerge Tiemann & Co., Plainview, NY). I did it. Next, the ligature wrapped around the neck muscles was tightened to block collateral circulation. Brain temperature was measured indirectly by a thermocouple placed in the temporal muscle (Busto and Dietrich, J. Cerebral Blood Flow Metab. 7: 729-738, 1987). Body temperature was maintained at 36-37 ° C., warmed from the outside. The microaneurysm clip was removed and the neck ligature was loosened to terminate ischemia. Animals that had convulsions during 4-VO, or did not undergo sufficient pupil dilation after reperfusion, or lacked righting reflexes during ischemia were excluded from the study. Single and long-term administration of K252a. We determined the effect of a single dose of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) on NAIP-LI in the hippocampus, thalamus and striatum. Two groups of three animals each were injected with K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) and kept alive for 3 or 24 hours. The third group was used as a vehicle control. These animals were injected with vehicle (1 ml / kg; aqueous solution containing 10% cyclodextrin and 5% DMSO). To determine the effect of K252a on NAIP and NeuN levels, we measured protein levels by Western blotting. Two groups of three animals each were injected with vehicle (1 ml / kg, sc) or K252a (0.1 mg / kg, sc) and killed for 3 hours. We compared the effects of one-time and long-term administration of K252a on NAIP mRNA levels and NAIP protein levels in the hippocampus by in situ hybridization histochemistry and Western blotting, respectively. Three groups of 6 animals each were given vehicle (1 ml / kg, sc), K252a (0.1 mg / kg, sc) or K252a (0.1 mg / kg, sc), Once daily for 7 days) and sacrificed 3 hours after injection. We found that in four animals, K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection) did not respond to blood pressure, gas (O Two And CO Two ), And the effect on pH. A polyethylene catheter was cannulated into the femoral artery to monitor blood pressure, gas, and pH. Effect of K252a administration on loss of CA1 neurons after transient global ischemia. Two groups of 6 animals each were injected subcutaneously (sc) once daily with vehicle (1 ml / kg, sc) or K252a (0.1 mg / kg, sc) for 7 days. . Three hours after the last injection, all animals received 4-VO and a second injection was given as soon as circulation was restored. A third group received a simulated 4-VO injection of the vehicle described above. Following 4-VO or mock treatment, animals were continued to receive K252a (0.1 mg / kg, sc) or vehicle (1 ml / kg, sc) once daily for 5 days. All animals were sacrificed 4 hours after the last injection and brain samples were processed to immunostain for NeuN to assess cell loss in CA1. Investigation of the effect of virus-mediated NAIP overexpression on loss of CA1 neurons caused by the development of transient forebrain ischemia. Six male rats were given a recombinant adenovirus construct (Ad5d1xDNA-TPC) containing lacZ or myc-tagged NAIP in the left and right back hippocampus, respectively. Stereotactically injected. Using a 28 gauge needle, AP-3.6, ML ± 2.2, and Bregma 20 The adenovirus vector (3 μl injected over 10 minutes; 1 × 10 6 Particles / μl). The viral construct has been previously described by Liston et al. Seven days later, each animal received 4-minute 4-VO. All animals were killed after 5 days. Loss of CA1 neurons was assessed histologically by counting the number of NeuN immunoreactive neurons in the CA1 region of the hippocampus. A second group of six animals was unilaterally injected with lacZ into the dorsal hippocampus. Neurons injected with adenovirus constructs containing lacZ or myc-labeled NAIP were identified by X-gal staining and immunohistochemical detection of myc protein label, respectively. NAIP riboprobe. Using a primer generated for a nucleotide sequence conserved between mouse NAIP and human NAIP, a template of NAIP riboprobe was prepared from rat hippocampus mRNA by RT-PCR. The 227 bp sequence was ligated into the EcoRI site of plasmid pcDNA3 (Invitrogen, Inc.). Using the MAXI script (MAXIscript) in vitro transcription kit (Ambion, Inc.), the sense and antisense strands were 32 An S-labeled riboprobe was prepared. Specific activity is 0.6-1.2 × 10 8 It was in the cpm / μl range. In situ hybridization histochemistry. Frozen sections (12 μm thick) were prepared using sense or antisense NAIP riboprobes (1 × 10 6 (cpm / 100 μl / slide) in a hybridization buffer at 56 ° C. overnight. Then, the sections were treated with ribonuclease A (10 μg / ml) at 35 ° C. for 30 minutes, and washed with 2 × SSC for 30 minutes. After drying, slides were soaked in Kodak NTB-2 emulsifier (diluted 1: 1 with distilled water) at 42 ° C., dried and exposed to 4 ° C. for 2 weeks. Polyclonal antiserum and immunohistochemistry. NAIP-I was detected using an affinity-purified polyclonal antibody. This antibody was raised in rabbits against exons 7-11 of NAIP (150 amino acid fragment). Immunohistochemistry was performed using standard procedures previously described by Robertson and Fibiger (Neuroscience 46: 315-328, 1992). Briefly, to block endogenous peroxidase activity, Contains 3% hydrogen peroxide Sections (12 μm or 30 μm thick) were washed with 02 M phosphate buffered saline (PBS) for 10 minutes. The sections were then washed three times with PBS and 3% TritonX-100, 0. Incubation was performed for 48 hours in PBS containing 02% azide and a primary antiserum to NAIP (eg, diluted 1: 750, or 1: 1000, or A60 (1: 1000)). The sections were then washed three times with PBS and incubated with biotin-labeled donkey anti-rabbit second antiserum (1: 500) for 16 hours. The sections were washed three times with PBS and Incubation was carried out for 3 hours with PBS containing 3% Triton X-100 and streptavidin-horseradish peroxidase (1: 100; Amersham). After washing three times with PBS, the sections were 1 M acetate buffer, pH 6. Rinse at 0. The glucose oxidase-DAB-nickel method previously described (Shu et al. Neurosci. Lett. 85: 169-171, 1988). The reaction was terminated by washing with acetate buffer and sections were mounted on chromium-aluminum coated slides. After drying, the sections were dehydrated in stepwise serially diluted alcohol, xylene was changed twice, and coverslipped for microscopic observation. The antibody used for detection of ChAT-like immunoreactivity (ChAT-LI) was obtained from human placenta ChAT (Chemicon International Inc.). 2) and affinity purified goat antibody. Dopaminergic neurons in the midbrain were identified using a monoclonal antibody to TH (Incstar), but to locate Purkinje cells in the cerebellar cortex, a monoclonal antibody to CaBP (Sigma) was used. Double-label immunohistofluorescence. 0. Sections from striatum, basal forebrain, brainstem, and spinal cord in PBS containing 3% Triton X-100 for 48 hours at 4 ° C. were prepared using rabbit anti-NAIP (1300) and anti-ChAT (1: 500), ventral midbrain sections were incubated with anti-NAIP (1: 300) and anti-TH (1: 500), and cerebellar sections were incubated with anti-NA IP (1: 300) and anti-CaBP (1: 300). 500). Sections were rinsed with PBS, and then with an indocarbocyanine (Cy3) labeled donkey anti-rabbit serum, and a suitably biotinylated second antiserum (1: 100 Amersham; 1:50 Amersham) prepared 24 hours prior to use. ). After 2 hours at room temperature and 1 hour at 37 ° C., the sections were rinsed with PBS. Sections were then incubated with streptavidin-fluoroisothiocyanate (FITC, 1:50 Amersham) in PBS without TritonX-100 for 3 hours at room temperature. Phenylamine diamine (0. Zeiss Axioplan microscope with coverslips on slides and single and double filters for visualization of FITC and Cy3 using PBS mounting media containing 1 mM) and 90% glycerol It investigated using. Tissue preparation. The thalamus, hippocampus, striatum, and spinal cord were cut on ice. First, each brain area (about 30-50 mg) was added to 1 ml of sucrose buffer (0. 25 M sucrose, 1 mM EGTA, 15 mM Tris-HCl pH 6. In 8), crushed slowly with a 2 ml loose Dounce homogenizer (type A, about 15 strokes). In addition, 1 mM PMSF, 2 μg / ml leupeptin, and 5 μg / ml aprotinin were added to the buffer, and placed on ice. Centrifugation at 8000 g for 20 minutes (Costar microfuge) gave a cell pellet. Sucrose buffer as above 0. 4 to 0. After suspending the cells in 7 ml, use an electric Teflon pestle (Cole-Parmer instrument, set to 2500 rpm) and 2 ml of tissue trituration solution (about 30 strokes). ) Crushed. After centrifugation at 13000 g for 10 minutes (Denver centrifuge, 4 ° C.), the low-speed supernatant was collected. An equal volume (10 μl) was pipetted for protein determination (Bio Rad). Then, the purified low-speed supernatant was stored at -80 ° C until the next analysis. SDS-PAGE, electroblotting, and immunostaining. A highly porous SDS-PAGE system (Dorsett) that allows rapid and efficient transfer of proteins to nitrocellulose membranes, even when high molecular weight polypeptides are envisioned, from tissue extracts (15-25 μg) (Doucet et al. )). Protein, 10% polyacrylamide, 0. 1% bisacrylamide gel for electrophoresis (5. (With a fixed length of 5 cm) and Tobin et al. (Towbin et al., Except that methanol was omitted from the transfer buffer). ) (1979), proteins were transferred to nitrocellulose membranes by electrophoresis. First, the nitrocellulose membrane was washed with Tris-HCl saline buffer pH 7. 2 (TBS), incubated at room temperature for 1 hour, and further incubated at 42 ° C. for 1 hour. They were then incubated with any of the following antibodies for 1 hour at room temperature in a 1% blot. That is, NAIP (1: 1000), and A60 (1: 1000; R. J. Mulan (R. J. Mullen) courtesy of Dr.). Next, the blot was washed with TBS-tween (5 washes of 3 minutes each) and highly purified biotin-conjugated anti-rabbit antibody (1: 2000; Bio / Can Scientific) or anti-mouse antibody (1: 2000; Bio / Can Scientific) in a 1% blot containing 1 hour. Blots were again washed as before and incubated with streptavidin-horseradish peroxidase (1: 2000; Amersham) for 1 hour. Finally, it was developed with an enhanced chemiluminescent agent (ECL, Amersham). Preparation of 6-OHDA injured rats. Male Wistar rats (250-300 g; n = 6 per group) were injected with adeno containing myc-labeled NAIP (3 gl; 1 × 10 6 particles) or the bacterial gene lacZ (3 gl; 1 × 10 particles). The virus construct was stereotactically injected into the dorsal dorsal striatum. Adenovirus constructs are incorporated from the dopaminergic end of the striatum and transported to the cell body at the SNC (Ridoux et al. ), 1994). One week later, all animals received a single stereotactic injection of 6-OHDA (3 gl; 20 gg / ml) in the right striatum, at the same coordinates as determined prior to adenovirus injection. After 3 weeks of recovery, intracranial perfusion of saline followed by perfusion of fixative and immunostimulation of tyrosine hydroxylase by the neuron-specific marker NeuN and Myc, a protein marker of the NAIP adenovirus construct. Brain sections were prepared for histochemical detection. Facial nerve axotomy: The left facial nerve was transected and the animals were killed 1, 3, 7, 14 days later. Remove the fresh brainstem and describe as previously described (Tetslaff e t al. J.). Nuerosci. 1988), the right and left facial nuclei were microexcised. Total RNA was extracted, reverse transcribed, and amplified using primers specific for NAIP and XIAP based on rat sequence information provided by Apoptogen. Different numbers of amplifications were performed using serial dilutions of the RT product (cDNA; 3, 6, 12, 24 ng) to ensure linearity of the amplification. Amplification products were quantified using phosphoimaging. The specificity of the PCR product was confirmed by Southern blotting using a 50 base polymer probe. Cyclophilin was amplified and used to confirm that the quantity and quality of the input RNA was the same. The effect of axotomy on expression of NAIP, XIAP, and HIAP-2 in adult rats was also examined by in situ hybridization histochemistry. Testing for specificity of NAIP antisera. The specificity of the NAIP antiserum was assessed by immunohistochemistry and Western blotting. In this experiment, the present inventors determined whether NAIP-LI would be removed if this antiserum had previously been adsorbed to glutathione-S-transferase (GST) -NAIP fusion protein. In a second experiment, the immunohistochemical localization of NAIP-LI was examined in coronal sections cut from various levels in the forebrain, midbrain, hindbrain, and spinal cord. In a third experiment, NAIP and several marker proteins, including choline acetyltransferase (ChAT), tyrosine hydroxylase (TH), and calbindin (D-28K (CaBP)), were used, To determine the localization of NAIP-LI in active, dopaminergic, and Purkinje neurons, double immunofluorescence labeling was performed. Statistical analysis. One-way analysis of variance was performed on cell counts and densitometer data. One-way analysis of variance was performed on blood gases and pH using repeated measurements. When the analysis results were significant, multiple comparisons were made using the Newman and Keulus test. Unpaired Student's t-test was performed on cell number data for adenovirus experiments. Example 2: Distribution of NAIP-like immunoreactivity in the central nervous system The affinity-purified NAIP antibody recognized a single band at 150 kD. 150 kD corresponds to the expected molecular weight of NAIP. Conversely, the antiserum to which the NAIP fusion protein had been adsorbed beforehand could not detect this band. Nerve labeling was detected by immunohistochemistry using affinity purified antibodies. This label was eliminated by pre-adsorption of the GST-NAIP fusion protein to the antiserum (data not shown). These results indicate that this antibody selectively recognizes NAIP. 1. Telencephalic cortex Nerves showing NAIP-LI were observed in all layers of the neocortex (II-VI) (FIG. 12A). Low to moderate NAIP-LI was detected in all cortical areas examined. Immunoreactive labels in the cell body were moderate and restricted to the cytoplasm. By comparison, dendritic staining was stronger and the most prominent labeling was observed at the tip of dendrites of layer V pyramidal neurons (FIG. 12B). Hippocampus In the hippocampus, all pyramidal neurons in the CA1-CA3 subregion and granule cells in the dentate gyrus exhibited moderate immunoreactivity, which was found in both neuronal traits and processes (FIG. 2, 13A, 13B, 13C). Interneurons scattered throughout the hippocampus in the oriens layer, the stratum corneum, and the lucunosum moleculare of CA1, as well as the clear layer of CA2 and CA3, showed strong labeling (FIG. 13B, 13C, 13D). Striatal strongly labeled neurons were observed in the caudate putamen and nucleus accumbens. These immunoreactive neurons were large (25-30 μm) and very low in the total number of striatum neurons, approximately 1% (FIG. 14A). Consistent with these observations, dual labeling with the ChAT antibody revealed that NAIP-LI was localized only to cholinergic interneurons (FIGS. 14B, 14C). All other neurons in this structure exhibited very low levels of NAIP-LI. Pallidus Large, strongly stained bipolar neurons were observed at this striatum protrusion (FIG. 15A). Basal forebrain Moderately immunoreactive neurons are detected in both the horizontal and vertical dendrites of the oblique band of Broca, as well as in the medial septal nucleus and ventral pallidum (FIG. 16A). The distribution of these NAIP immunoreactive cell bodies was thought to be consistent with the distribution of cholinergic neurons in the basal pronucleus. However, dual labeling for NAIP and ChAT revealed that NAIP-LI and ChAT-LI were rarely present simultaneously in the medial septum and oblique bands. 2. Mesencephalic Thalamus Medium to high intensity markers were observed in a large number of medium-sized neurons located in the ventral and outer parts of the thalamus (FIGS. 17A, 17B). Although small in number, immunoreactive neurons were also observed in front of, within, and inside the thalamus. Reins A number of small, round, moderately immunoreactive neuronal traits were observed in the medial retina nucleus. In the outer bridle nuclei, a small number of strongly stained, medium-sized neurons were detected (FIG. 17C). Compared with the hypothalamus, almost no NAIP-LI was observed in the hypothalamus. A small number of weakly stained neurons were detected in the arcuate nucleus and the dorsal and lateral hypothalamic areas (FIG. 17D). Entopeduncular Nucleus Strong labeling was observed at the exit of the basal ganglia. In addition to the neuronal traits, NAIP-LI was also present at extremely high concentrations in neurites forming a fibrous network (FIG. 15B). 3. In the midbrain substantia nigra, most of the NAIP-LI neurons were located in the substantia nigra cell layer. NAIP-LI was also present in the dendrites of these neurons, extending ventrally into the substantia nigra (FIG. 15C). A small number of NAIP-LI neurons were also observed in the retina and lateral parts of the substantia nigra (FIGS. 15C, 18A). Double labeling revealed that most of the neurons displaying NAIP-LI in these regions were dopaminergic (FIGS. 18B, 18C). The most strongly labeled neurons in the midbrain were located in the oculomotor nuclei. Strongly labeled fibers were also clearly seen in the oculomotor roots (FIGS. 19A, 21A). High levels of NA IP-LI were detected in neurons in the Edinger Westfal nucleus and the trochlear nucleus (FIG. 19A). Both the small and large cell parts of the red nucleus showed strong NAI P-LI (FIG. 19A). Numerous small and round neuronal traits were observed in the pontine nucleus (FIG. 20A). 4. Met- and mylencephalon, brain stem Most of the brain nuclei in the brain stem showed strong NAIP-LI. Strong NAIP-positive neurons were present in all major nuclei of the trigeminal nerve. These included the trigeminal spinal nucleus, midbrain tract nucleus, major sensory nucleus, and motor nucleus (Figures 19B, 19C, 20B). The strongest label was shown by medium-sized neurons within the midbrain trigeminal nerve (FIG. 20B). Strong NAIP-LI was also detected in vestibular, cochlear, and vestibular cochlear nerve fibers (FIGS. 19B, 19D). Other cranial nuclei with prominent markers included the facial nucleus, the solitary nucleus, the vagus motor nucleus, and the sublingual nucleus (FIGS. 19C, 19D). Double labeling of the brain nucleus for NAIP and ChAT revealed that in motor nuclei such as the oculomotor nucleus, the majority of NA IP-positive neurons were also immunoreactive for ChAT (FIG. 21B, 21C). Brain stem relay nuclei, such as the fascicle nucleus, the cuneiform nucleus, the giant cell nucleus, and neurons located within the locus coeruleus also stained strongly with the NAIP antibody (FIGS. 19D, 20B, 20C). In addition, NAIP-LI was detected in trochlear nuclei, pseudonuclei, interlegs, olive nuclei, and lateral cord nuclei. Cerebellum In the cerebellum, round NAIP-LI neuronal traits were observed in the monolayer of the cerebellum cortex (FIG. 22A). Double immunofluorescence labeling of these neurons with an antibody to Calbindin D-28K, a Purkinje cell marker protein, showed that NAIP-LI was located in Purkinje cells (FIG. 22B). , 22C). NAIP-LI was not detected at all in other layers of the cerebellar cortex. Cell bodies containing NAIP-LI were also observed in the cerebellar nuclei, such as the medial and lateral nuclei (FIG. 20D). 5. Spinal cord Strongly labeled neuronal traits of varying size and morphology are observed at various levels of the spinal cord, located mainly in the pronucleus (Layers VIII and IX) and in the middle region (Layer VII) (Figures 23, 24A, 24B). The most prominently labeled cells in the pronucleus were very large neurons, probably alpha motor neurons (fit 24B). Consistent with this assumption, these neurons were double-labeled with the ChAT antibody (FIGS. 24C, 24D). Large neuronal traits were also observed, especially in layer VII proximal to the central canal. Clark columns located in layer VII were strongly labeled with NAIP antibody. A small number of neurons were detected in layers V and VI of the dorsal nucleus. A small number of positive neurons with small round neuronal traits were also observed in the dorsal nucleus (layers I-IV) (FIG. 24A). Finally, there was fiber staining in the white matter of the spinal cord (FIG. 23). Example 3: Effect of transient forebrain ischemia on NAIP mRNA levels in hippocampus Four-vessel occlusion (4-VO) for 10 minutes for 5 groups of 4 animals each And anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injection) at 2, 12, 24, 48, and 72 hours after recirculation. A sixth group of four animals was used as a control. The animals were anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, ip) 48 hours after the fake 4-VO procedure. After deep anesthesia, all animals were sacrificed by decapitation of the neck. Brains were quickly removed, frozen in isopentane (-65 ° C.) and cryostated to prepare 12 μm thick sections through the dorsal hippocampus. NAIP mRNA in hippocampal slices was detected by in situ hybridization histochemistry. Basal expression of NAIP mRNA was detected only in the dentate gyrus (FIG. 1). Following transient cerebral ischemia, an increase in NAIP mRNA levels was first observed in the CA1 region after 24 hours. The hybridization signal for NAIP continued to increase after 48 hours and reached a maximum after 72 hours. Unlike CA1 pyramidal neurons, dentate granule cells and CA3 neurons showed only a modest increase in NAIP levels at 24, 48, and 72 hours after 4-vessel occlusion (4-VO). Example 4: Virus-mediated NAIP overexpression suppresses alteration of the substantia nigra striatal pathway following 6-OHDA injury in the striatum By injecting 6-hydroxydopamine into the striatum of rodents And delayed degeneration of the black striatal pathway occurs. The present inventors have already shown that overexpression of the novel anti-apoptotic protein NAIP reduces hippocampal neuron loss caused by brief cerebral ischemia operations. In this example, we show that virus-mediated overexpression of NAIP also ameliorates black striatal injury in the 6-OBDA model of Parkinson's disease. Striatal injection 6-OHDA significantly reduced dopamine neurons labeled with antibodies to tyrosine hydroxylase (FIG. 25, top and middle). Preliminary results indicate that the NAIP adenovirus construct significantly reduces dopamine neuron loss caused by intrastriated administration of 6-hydroxydopamine (FIG. 25, middle and bottom). The ability of NAIP adenovirus vectors to reduce dopamine neuron loss caused by 6-hydroxydopamine suggests that treatments that can increase NAIP expression may be used to treat Parkinson's disease You. Example 5: Effect of transient forebrain ischemia on NAIP-like immune responsiveness in the hippocampus, striatum, and thalamus For three groups of five each, four vessel occlusions (4- VO) and anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, ip) 3, 24 and 72 hours after reperfusion. A fourth group of four animals was used as a control. These animals were anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, ip) 24 hours after the fake 4-VO operation. After deep anesthesia, all animals were flushed with 200 ml of saline (0. 9%) followed by 150 ml of a phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde (0. 1M) transcardially. The brain was postfixed overnight and phosphate buffered with 10% sucrose (0. 01M) for 2 days. Using a cryostat, a 12 μm thick section was cut from the appropriate forebrain region and processed for NAIP-I. To determine whether striatal NAIP-I coexists in neurons expressing the cholinergic marker enzyme choline acetyltransferase (ChAT), a third experiment was performed using double-labeled immunohistofluorescence. went. Consistent with the results of in situ hybridization histochemistry, low to moderate levels of NAIP-I were detected in hippocampus CA1 of untreated animals (FIG. 2). Similarly, the intensity of NAIP-I in CA1 neurons did not appear to change 3 hours after 10 minutes of transient forebrain ischemia. However, contrary to NAIP mRNA levels, NAIP-I decreased below basal levels at 24 and 72 hours after reperfusion. NAIP-I in the striatum was located at about 1% of the total number of neurons. These neurons were large in size (25-30 μm in diameter) and exhibited higher levels of NAIP-I than hippocampal CA1 neurons. Double-labeled immunohistofluorescence revealed that striatal NAIP-I is located in neurons containing ChAT immunoreactivity (FIG. 3). Transient forebrain ischemia significantly increased NAIP-I in these striatal neurons 3 hours after reperfusion (FIG. 2). NAIP-I was still increasing 24 hours after 4-VO, but returned to basal levels after 72 hours. Most of the neurons in the ventral-posterior and ventral-medial portions of the thalamus contained NAIP-I (FIG. 2). These neurons showed a large increase in NAIP-I 3 hours after restoration of blood flow. NAIP-I was still increasing 24 hours after reperfusion, but returned to basal levels after 72 hours. Example 6: Effect of short-term K252a administration on NAIP levels NAIP-LI is associated with K252a (0. Three hours after a single dose of 1 mg / kg, subcutaneous injection), it was enhanced in CA1 neurons (FIGS. 30A and 30D). By 24 hours, NAIP-LI had returned to pre-injection levels in these neurons (FIG. 30G). Similarly, NAIP-LI in the ventral-medial and ventral-posterior regions of the thalamus was K252a (0. (1 mg / kg, subcutaneous injection) 3 hours after a single dose (FIGS. 30B and 30E). By 24 hours, NAI P-LI had returned to normal levels in these thalamic areas (FIG. 30H). NAIP-LI is K252a (0. Three hours after injection (1 mg / kg, subcutaneous injection), it also increased in striatal neurons and returned to basal levels by 24 hours (FIGS. 30C, 30F, 30I). In the striatum, K252a administration appeared to increase NAIP-LI mainly in medium-sized neurons (FIG. 30F). Immunoblotting showed that the NAIP antibody selectively recognized a single band with a relative molecular weight of 150 kDa, corresponding to the estimated separation of NAIP (FIG. 31A). Consistent with immunohistochemistry, which indicates the presence of NAIP in a large number of thalamic neurons, Western analysis showed that anti-apoptotic proteins were present at high concentrations in the thalamus (FIG. 31). Despite NAIP expression being restricted to only 1% of striatal neurons (cholinergic neurons), levels similar to those observed in the thalamus were found in the striatum. Relatively small but clearly distinguishable levels of NAIP protein were detected in the hippocampus and spinal cord. Consistent with our immunohistochemistry findings, NAIP levels were K252a (0. Three hours after a single dose of 1 mg / kg (subcutaneous injection), immunoblotting revealed elevation in the striatum, hippocampus, and thalamus (FIG. 31A). As a control for protein application, Western analysis of NeuN levels was performed on the same membrane that was used to detect NAIP. Immunoblotting showed that high levels of NeuN (60 kDa) were present in the hippocampus and striatum, while only low levels were found in the thalamus and spinal cord (FIG. 31A). In all four regions of the brain, vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) and K252a (0. NeuN levels in animals treated with 1 mg / kg, subcutaneous injection) were similar. This confirmed that the same amount of protein was applied to each lane. Example 7: Effect of K252a administration on NAIP-I in hippocampus, striatum, and thalamus K252a (0. 1 mg / kg, subcutaneous injection) and given an excess of pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injection) either 3 or 24 hours later. A third group of three animals was used as a control. The animals received an excess of pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injection) 3 hours after injection of vehicle (1 mg / kg, subcutaneous injection). Twenty-four hours later, they were anesthetized with pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injection). After anesthesia, all animals were perfused with saline (200 ml) and 4% paraformaldehyde (150 ml). The brain was removed, postfixed, cryoprotected, and cryopreserved to cut 12 μm thick sections through the hippocampus, striatum, and thalamus. Sections were processed for NAIP-I. NAIP-I is K252a (0. (1 mg / kg, subcutaneous injection) 3 hours after a single administration (FIG. 7). By 24 hours, NAIP-I had returned to pre-injection levels in these thalamic areas. Similarly, NAIP-I is available for K252a (0. Three hours after injection (1 mg / kg, subcutaneous injection), it also increased in striatal neurons and returned to basal levels by 24 hours. In the striatum, K252a appeared to increase NAIP-I mainly in medium-sized neurons (FIG. 7). K252a (0. 1 mg / kg, subcutaneous injection) also increased NAIP-I in the ventral-medial and ventral-posterior regions of the thalamus (FIG. 7). By 24 hours, NAI PI had returned to normal levels in these thalamic areas. Example 8: Effect of short-term K252a administration on NAIP-I and NeuN in hippocampus, striatum, thalamus, and spinal cord Two groups of 3 animals each received vehicle (1 mg / kg, subcutaneous injection) or K252a (0 . (1 mg / kg, subcutaneous injection), and 3 hours later, they were sacrificed by decapitation under pentobarbital anesthesia. The brain was removed and the dorsal hippocampus, striatum, thalamus, and spinal cord were sectioned on ice. By immunoblotting, NAIP and NeuN were detected in cytoplasmic protein extracts in these regions. Immunoblotting showed that the NAIP antibody selectively recognized a single band with a relative molecular weight of 150 kDa. This band corresponds to the estimated separation of NAIP (FIG. 8). Comparison of NAIP levels in various forebrain regions indicates that NAIP is most abundant in the thalamus and striatum. Relatively small but clearly distinguishable levels of NAIP protein are detected in the hippocampus and spinal cord. Consistent with the results by immunohistochemistry, NAIP levels were K252a (0. Three hours after a single dose of 1 mg / kg, subcutaneous injection), immunoblotting revealed elevations in the striatum, hippocampus, and thalamus (as a control for protein application, Western blotting of NeuN levels The analysis was performed on the same membrane used to detect NAIP). Immunoblotting showed that high levels of NeuN (60 kDa) were present in the hippocampus and striatum, while only low levels were found in the thalamus and spinal cord (FIG. 9). In all four areas of the brain, vehicle (1 ml / kg, subcutaneous injection) and K252a (0. NeuN levels in animals treated with 1 mg / kg, subcutaneous injection) were similar. This confirmed that the same amount of protein was applied to each lane. Example 9: Effect of chronic K252a administration on neuronal deficits induced by ischemia in the CA1 region of the hippocampus. Two groups of 6 animals each received vehicle (1 mg / kg, 10% cyclodextrin and 0.1 mg / kg). Aqueous solution containing 5% DMSO) or K252a (0. 1 mg / kg) was injected subcutaneously once a day for 7 days. All animals received 4-VO (10 minutes) 3 hours after the last injection and received a second injection immediately after circulation was restored. A third group of six animals received vehicle injections and received bogus 4-VO as before. After the 4-VO operation or fake 4-VO operation, once a day for 5 days, K252a (0. Animals continued to receive 1 mg / kg, sc injection or vehicle (1 mg / kg, sc injection). Four hours after injection, all animals received an excess of pentobarbital (100 mg / kg, subcutaneous injection) and were reperfused with saline (200 ml) followed by 4% paraformaldehyde (150 ml). Brains were removed, postfixed, cryoprotected, and 12 μm thick sections cut through the dorsal hippocampus using a cryostat. Surviving neurons in the CA1 region of the hippocampus were detected using a monoclonal antibody that recognizes the neuron-specific marker NeuN (Mullen et al., Development 116: 201-211,1992). 7 days before 4-VO, and daily thereafter, K252a (0. Systemic administration of 1 mg / kg, subcutaneous injection, once a day) significantly reduced the loss of hippocampal CA1 neurons caused by primary forebrain ischemia for 10 minutes (FIG. 4). Counting the number of cells in the inner, middle, and posterior third of the hippocampus showed that K252a reduced CA1 neuron depletion by approximately 50% (FIG. 5). Example 10: Effect of chronic K252a administration on NAIP protein levels K252a (0. Short-term administration of 1 mg / kg (subcutaneous injection) was observed to increase hippocampal NAIP levels in each of the three animals examined (FIG. 31B). Measurement of the optical density of the 150 kDa NAIP immunoreactive band indicated that K252a (0. Short-term administration (1 mg / kg, subcutaneous injection) increased hippocampal NAIP levels by about 50% (FIG. 31C). K252a (0. Long-term administration of 1 mg / kg, subcutaneous injection, once daily for 7 days) further increased NAIP levels (FIGS. 32B and 32C). When compared to vehicle injected controls, K252a (0. Long-term administration of 1 mg / kg, subcutaneous injection, once a day for 7 days) increased NAIP concentration by about 100%. As a control for protein application, Western analysis of NeuN levels was performed on the same membrane that was used to detect NAIP. Immunoblotting showed that NeuN levels were not increased by short-term or long-term administration of K252a. This confirmed that the same amount of protein was applied to each lane (FIG. 31B). Example 11: Effect of short-term K252a administration on hippocampal NAIP mRNA levels Five groups of three each had K252a (0. 1 mg / kg, subcutaneous injection) and 1. Decapitation was performed under pentobarbital anesthesia after 5, 3, 6, 12, or 24 hours. A sixth group of three animals was injected with the vehicle (1 mg / kg, subcutaneous injection) and sacrificed 3 hours later. Brains were quickly removed, frozen in isopentane (-65 ° C.), and 12 μm thick sections cut through the hippocampus using a cryostat. Hippocampal slices were detected for NAIP mRNA by in situ hybridization histochemistry. K252a (0. 1 mg / kg, subcutaneous injection). After 5 to 3 hours, NAIP expression in the dentate gyrus was elevated (FIG. 6). By 6 hours, NAIP mRNA levels were observed to return to basal levels in these regions. NAIP level is K252a (0. (1 mg / kg, subcutaneous injection) 12 or 24 hours after injection remained at basal levels. Example 12: Effect of K252a administration on NAIP expression In situ hybridization histochemistry revealed that low levels of NAIP mRNA were present in the hippocampus of animals injected with the vehicle (Figure 32A). K2 52a (0. Administration of 1 mg / kg, subcutaneous injection) rapidly increased NAIP mRNA levels in the CA1-CA4 subregion and dentate gyrus (FIG. 32B). K252a (0. Long term administration of 1 mg / kg / day for 7 days) was observed to increase NAIP mRNA levels in the hippocampus (FIG. 32C). Example 13: Long-term K252a administration protects neurons from ischemic damage Transient cerebral ischemia caused by 10 min of 4-VO reduced the number of CA1 neurons in the hippocampus by about 70% (FIG. 33A, 33B). K252a (0. 1 mg / kg, subcutaneous injection; once daily) was administered systemically for 7 days before 4-VO, and then daily (5 days) to produce hippocampal CA1 neurons produced by transient cerebral ischemia for 10 minutes. The defect was reduced (FIG. 33C). Cell counts showed that chronic K252a administration reduced CA1 neuron depletion by approximately 50% (FIG. 33D). Example 14: Blood pressure, pH, pO Two , And pCO Two Effect of K252a on Blood pressure, PH, pO Two , And pCO Two The base values (mean ± standard deviation of the mean) were 114.5 ± 13.8 mmHg, 7.44 ± 0.01 mmHg, 92.2 ± 3.1 mmHg, and 35.6 ± 4.9 mmHg, respectively. These values were significantly different from the values measured at each time point examined after administration of K252a (0.1 mg / kg, subcutaneous injection). Example 15: Ischemic neuroprotective effect after virus-mediated NAIP overexpression. Five days after the event of targeted forebrain ischemia, the loss of CA1 neurons was not reduced (FIG. 34A). In contrast, injection of an adenoviral construct containing myc-tagged NAIP into the dorsal hippocampus significantly reduced the loss of CA1 neurons (FIG. 34B). Cell counts showed that CA1 deficiency was reduced by about 60% in hippocampus injected with NAIP adenovirus compared to lacZ injection (FIG. 34E). Myc immunoreactivity and X-gal staining confirmed that hippocampal neurons were affected by Myc-tagged NAIP or lacZ containing adenovirus constructs, respectively (FIGS. 34C, 34D). Cell counts of neurons stained with Myc (7 ± 1) and X-gal (10 ± 2) revealed that approximately the same number of neurons were labeled by these two adenovirus constructs ( P> 0.05). However, in hippocampus injected with NAIP adenovirus, significantly more CA1 neurons were protected from ischemic injury (15 ± 1) than Myc immunoreactive neurons (7 ± 1) (P <0.01). ). Example 16: Up-Regulation of NAIP and IAP in Pregnant Rats We examined the effects of birth on naip and iap gene expression and protein levels using in situ and immunohistochemical techniques. Our results indicate that the naip gene and at least one IAP gene, xiap, are up-regulated in the brain of pregnant rats. More importantly, this up-regulation was seen in brain regions that were shown to be resistant to excessive stimulation that occurred during SE. From this observation we came to two important conclusions. First, it is possible that this physiological mechanism could be used to induce NAIP and IAP gene expression. Second, factors known to increase levels after childbirth, such as BDNF and NGF, are used to increase IAP and NAIP levels in the neuronal environment and other environments where increased expression of NAIP or IAP is desired. Could be used for Example 17: Transgenic therapy using NAIP viral vector The present inventors constructed a human replication-defective adenovirus construct containing the NAIP gene sequence (Ad 5d1xDNA-TPC; Wistar rats were stereotactically administered to the dorsal hippocampus. The animals are then given transient cerebral ischemia to determine if the adenovirus injection enhances the hippocampus's resistance to ischemic cell death. Under pentobarbital (50 mg / kg, intraperitoneal injection) anesthesia, 3 μl of adenovirus containing about 1 × 10 ° particles / ml using a sterile Hamilton syringe (5 μl) at a flow rate of 0.5 μl / min. The suspension is injected into the CA1 area of the right hippocampus. Thereafter, the needle is gradually removed over 2 minutes and the wound is closed by suture. The CA1 region of the left hippocampus receives a control injection (3 μl LacZ adenovirus construct suspended in 20% sucrose in 0.01 M phosphate buffered saline). One week after stereotactic surgery, the animals are given transient whole body ischemia. Transient systemic ischemia (10 minutes) is performed using the four-vessel occlusion procedure already described in PM-117. 4 Five days after vascular occlusion, all animals are sacrificed with an overdose of pentobarbital (100 mg / kg, intraperitoneal injection). Half the animals are perfused with 4% paraformaldehyde. The brain is then removed, cryoprotected in 10% sucrose, and sectioned on a cryostat. The other half is decapitated and rapidly freezes the brain in isopentane cooled to -65 ° C on dry ice. Fresh cryosections are cut from the tissue using a cryostat. NAIP mRNA and protein are measured by performing in situ hybridization histochemistry on fresh frozen sections and immunohistochemistry on tissues fixed with paraformaldehyde, respectively. FIG. 10 shows that suppression of cell death after ischemia is enhanced in animals treated with the NAIP-expressing transgene. CA1 neurons labeled with NeuN antibody were counted using an image analysis system. Cell counts revealed that the NAIP construct reduced CA1 neuronal cell death by approximately 40% compared to the LacZA injected side. The asterisk indicates significantly (p <0.05) different from the lacZ injection. Example 18: Axotomy Increases NAIP and XIAP Expression in Facial Motor Neurons It is well documented that adult mammalian motoneurons survive axonal injury, but die within 2-7 days in newborns (FIG. 26). The mechanism of death is thought to be naturally occurring apoptosis. Thus, we tested the hypothesis that molecules belonging to the IAP family mediate the survival of adult motoneurons and that this protective mechanism is not found in neonates. Therefore, we compared the effect of axotomy on expression of NAIP, XIAP, and HIAP-2 in facial motor neurons of adult and neonatal rats. On day 1, NAIP mRNA increased 1.5- to 2-fold in axotomized facial nuclei of adult rats (FIG. 27). On the third day, the serial dilution series was quantified and the axotomized side showed an 8-10 fold increase. This increase was maintained continuously throughout the experimental period of 7-14 days. Amplification with primers for XIAP after axotomy revealed only a slight increase (data not shown). In situ hybridization histochemistry revealed elevated expression of NAIP and, to a lesser extent, XIAP three days after axotomy in adult rats (FIG. 28). In contrast to adults, neonatal facial nuclei did not show a comparable increase in NAIP after axotomy (FIG. 29). These data indicate that NAIP and XIAP play a role in the survival of adult motor neurons after axotomy. It was also suggested that deaths in newborns could be associated with no increase in NAIP expression. Currently, functional analysis of this hypothesis is being performed using NAIP expression vectors. NAIP, and possibly other members of the IAP family, are involved in the survival response in damaged motor neurons. This further confirms the proposal that stimulation of NAIP expression could be a viable therapy to promote motor neuron survival.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 35/76 48/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ロバートソン ジョージ エス. カナダ国 オンタリオ州 オタワ キャン バーランド 650 ユニバーシティー オ ブ オタワ (72)発明者 エックスユー ディー．ジー. カナダ国 オンタリオ州 オタワ キャン バーランド 650 ユニバーシティー オ ブ オタワ (72)発明者 クロッカー エス．ジェイ. カナダ国 オンタリオ州 オタワ キャン バーランド 650 ユニバーシティー オ ブ オタワ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 45/00 A61K 35/76 48/00 45/00 C07K 14/475 48/00 C12N 15/09 C07K 14 / 475 G01N 33/15 G01N 33/15 Z 33/566 33/566 C12N 15/00 A (72) Inventor Robertson George S. Ottawa, Ontario, Canada 650 University of Ottawa, Ottawa (72) Invention XD. G. Ottawa Camberland, Ontario, Canada 650 University of Ottawa (72) Inventor Crocker S.S. Jay Canada Ottawa, Ontario Camberland 650 University of Ottawa

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．非処理の対照と比べてニューロン生存性の可能性を上昇させるのに十分な ほど、NAIPおよびIAPからなる群より選択されるポリペプチドの生物学的活性を 上昇させることを含む、ニューロンの生存性を高める方法。 ２．蛋白質がNAIPである、請求項１記載の方法。 ３．IAPが、HIAP1、HIAP2、またはXIAPからなる群より選択される、請求項１ 記載の方法。 ４．上昇が虚血症状の後に起こるものである、請求項１記載の方法。 ５．上昇が、神経変性病を有する個体において起こるものである、請求項１記 載の方法。 ６．神経変性病が、パーキンソン病である、請求項５記載の方法。 ７．ニューロンがヒトのものである、請求項１記載の方法。 ８．ニューロン生存性の可能性の上昇が、少なくとも20％である、請求項１記 載の方法。 ９．ニューロンがCNSの中にある、請求項１記載の方法。 １０．ニューロンが、海馬ニューロン、中脳のドーパミン作用性ニューロン、網 膜神経節ニューロン、外傷性傷害を受けたニューロン、および脳基底部のコリン 作用性ニューロンからなる群より選択される、請求項９記載の方法。 １１．上昇が、発現可能な遺伝子構築物中のNAIPまたはIAPポリペプチドをコー ドするトランスジーンを投与することによって起こる、請求項１記載の方法。 １２．発現可能な遺伝子構築物が構成的なプロモーターを含む、請求項１１記載 の方法。 １３．プロモーターが、エノラーゼプロモーターまたはニューロフィラメントプ ロモーターである、請求項１２記載の方法。 １４．発現可能な遺伝子構築物が制御可能なプロモーターを含む、請求項１１記 載の方法。 １５．トランスジーンがウイルスベクターの中にある、請求項１１記載の方法。 １６．ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターであるか、ヘルペスウイル スベクターであるか、またはポリオウイルスベクターである、請求項１５記載の 方法。 １７．上昇が、NAIPおよびIAPからなる群より選択されるポリペプチドを治療的 な用量投与することによって起こる、請求項１記載の方法。 １８．上昇が、NAIPまたはIAPの生物学的活性を上昇させる化合物を投与するこ とによって起こる、請求項１記載の方法。 １９．投与が、外傷性傷害の後に行われる、請求項１記載の方法。 ２０．投与が、虚血を起こす素因があると診断された患者に対して行われる、請 求項１記載の方法。 ２１．NAIPポリペプチドおよびIAPポリペプチドからなる群より選択されるポリ ペプチドの生物学的活性を上昇させることを含む、軸索の伸長を促進する方法。 ２２．ポリペプチドがNAIPである、請求項２０記載の方法。 ２３．以下の段階を含む、神経防御化合物を同定するための方法： （a）NAIPまたはIAPからなる群より選択されるポリペプチドを発現または含むこ とができる細胞、溶液、または固体システムを提供する段階、（b）該細胞、該 溶液、または該固体システムを、候補化合物と接触させる段階、および（c）該 ポリペプチドの生物学的活性の上昇を測定する段階（該ポリペプチドの生物学的 活性またはレベルの上昇により候補化合物が神経防御化合物として利用できるこ とが示される）。 ２４．IAPが、HIAP1、HIAP2、およびXIAPからなる群より選択される、請求項１ ９記載の方法。 ２５．細胞または溶液が、虚血の後にアポトーシスを起こす細胞に由来するもの である、請求項２３記載の方法。 ２６．測定が、免疫組織化学的解析によるものである、請求項２３記載の方法。 ２７．免疫組織化学的解析が、ウェスタンブロッティングによるものである、請 求項２５記載の方法。 ２８．解析が、NAIPまたはIAP mRNAのレベルを測定するものである、請求項２３ 記載の方法。 ２９．細胞が、ニューロン細胞である、請求項２３記載の方法。 ３０．細胞が、非ニューロン細胞である、請求項２３記載の方法。 ３１．細胞が、哺乳動物の細胞である、請求項２３記載の方法。 ３２．細胞が、培養細胞である、請求項２３記載の方法。 ３３．哺乳動物が、マウスである、請求項３０記載の方法。[Claims]   1. Sufficient to increase the likelihood of neuronal viability compared to untreated controls The biological activity of a polypeptide selected from the group consisting of NAIP and IAP. A method of increasing the survival of neurons, including raising.   2. 2. The method according to claim 1, wherein the protein is NAIP.   3. The IAP is selected from the group consisting of HIAP1, HIAP2, or XIAP. The described method.   4. 2. The method of claim 1, wherein the elevation occurs after ischemic symptoms.   5. 2. The elevation according to claim 1, wherein the elevation occurs in an individual having a neurodegenerative disease. The method described.   6. The method according to claim 5, wherein the neurodegenerative disease is Parkinson's disease.   7. 2. The method of claim 1, wherein the neurons are human.   8. 2. The increase in neuronal viability potential is at least 20%. The method described.   9. 2. The method of claim 1, wherein the neurons are in the CNS. 10. Neurons are hippocampal neurons, midbrain dopaminergic neurons, Membrane ganglion neurons, traumatically injured neurons, and choline in the basal brain 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of active neurons. 11. An increase encodes a NAIP or IAP polypeptide in the expressible gene construct. 2. The method of claim 1, wherein the method occurs by administering a transgene that transduces. 12. 12. The expressible gene construct comprises a constitutive promoter. the method of. 13. The promoter is an enolase promoter or a neurofilament promoter. 13. The method of claim 12, which is a motor. 14． 12. The expression construct of claim 11, wherein the expressible gene construct comprises a controllable promoter. The method described. 15. 12. The method of claim 11, wherein the transgene is in a viral vector. 16. The virus vector is an adenovirus vector or a herpes virus 16. The method according to claim 15, which is a virus vector or a poliovirus vector. Method. 17． Elevation is therapeutic for a polypeptide selected from the group consisting of NAIP and IAP 2. The method of claim 1, wherein the method occurs by administering a different dose. 18. Administer a compound whose elevation increases the biological activity of NAIP or IAP. 2. The method of claim 1, wherein the method occurs by: 19. 2. The method of claim 1, wherein the administering occurs after the traumatic injury. 20. Dosing should be administered to patients diagnosed as predisposed to ischemia. The method of claim 1. 21. A polypeptide selected from the group consisting of a NAIP polypeptide and an IAP polypeptide A method of promoting axonal outgrowth, comprising increasing the biological activity of a peptide. 22. 21. The method according to claim 20, wherein the polypeptide is NAIP. 23. A method for identifying a neuroprotective compound, comprising the following steps: (A) expressing or containing a polypeptide selected from the group consisting of NAIP or IAP; Providing a cell, solution, or solid system that is capable of Contacting a solution, or said solid system, with a candidate compound; and (c) Measuring an increase in the biological activity of the polypeptide (the biological activity of the polypeptide Can a candidate compound be used as a neuroprotective compound by increasing its activity or level? Is shown). 24. 2. The IAP is selected from the group consisting of HIAP1, HIAP2, and XIAP. 9. The method according to 9. 25. The cell or solution is derived from cells that undergo apoptosis after ischemia 24. The method of claim 23, wherein 26. 24. The method according to claim 23, wherein the measurement is by immunohistochemical analysis. 27. Immunohistochemical analysis is by Western blotting. 26. The method of claim 25. 28. 24. The analysis measures NAIP or IAP mRNA levels. The described method. 29. 24. The method of claim 23, wherein the cells are neuronal cells. 30. 24. The method of claim 23, wherein the cells are non-neuronal cells. 31. 24. The method of claim 23, wherein the cells are mammalian cells. 32. 24. The method according to claim 23, wherein the cells are cultured cells. 33. 31. The method according to claim 30, wherein the mammal is a mouse.
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