【発明の詳細な説明】
（＋）−フォテムスチンを用いる新生物を治療するための 方法および組成物。
発明の分野
本発明は（＋）フォテムスチンを含む薬学的組成物に関する。別の側面では、
本発明はリンパ腫、黒色腫、神経膠腫および他の脳腫瘍、肺癌、肝臓転移および
血液や胃腸管の悪性疾患などの悪性疾患の治療に関する。
発明の背景
ケミカル・アブストラクトの標準的命名法では、フォテムスチンは〔１−〔〔
〔（２−クロロエチル）−ニトロソアミノ〕カルボニル〕アミノ〕エチルホスホ
ン酸ジエチルエステルである。フォテムスチンはまた１−〔Ｎ−（２−クロロエ
チル）−Ｎ−ニトロソウレイド〕エチルホスホン酸ジエチルエステルおよびジエ
チル−１−〔３−（２−クロロエチル）−３−ニトロソウレイド〕エチルホスホ
ネートとしても知られている。初期の文献はフォテムスチンをＳ１００３６と呼
んでいる。フォテムスチンのラセミ体の調製は米国特許第４，５６７，１６９号
に記述されている。この特許は「この発明はこの化合物の光学異性体にも関する
、、、、」と述べているが、そのような異性体は開示されていない。
フォテムスチンのラセミ体は悪性疾患の黒色腫、一次脳腫瘍や転移脳腫瘍、結
腸直腸癌、軟部組織や骨の肉腫および血液学的悪性疾患を治療するために臨床的
に使用されてきた。〔カヤットら，J．Nat'l Cancer Inst．80，1407-1408(1988
)、カヤットら，Cancer Res．47，6782-6785(1987)、ジャクイラットら，Proc．
Am．Assoc．Cancer Res. 30, A1088（1989）、ルージャーら，Eur．J．Cancer
29A(2)，288-9（1993）、カーブラットら，Eur．J．Cancer 29A(1)，143-144（1
993）を参照］。これらの臨床研究により、フォテムスチンラセミ体はこれらの
癌を治療するのに臨床的に有用であるが、その使用には骨髄における遅延性の、
蓄積性の毒性を伴うことが明らかにされている。投与量を制限するこの毒性は通
常好中球減少症、白血球減少症および血小板減少症に至る骨髄抑制である。腎臓
、肺臓および肝臓の毒性は観察される頻度はより少ない。フォテムスチンラセミ
体は突然変異原性であると信じられてもいる〔アシュビら，Mutation Res．286,
101-109（1993）を参照］。一部のケースでは吐き気が問題である。
フォテムスチンラセミ体の長所を持つが上に列挙した副作用を示さない化合物
を発見することが特に望まれている。
発明の概要
いまや、フォテムスチンの光学的に純粋な（＋）異性体が悪性疾患の治療に有
効な薬剤であることが発見された。フォテムスチンの光学的に純粋な（＋）異性
体はこの有効な治療を提供する一方、フォテムスチンラセミ体の投与に関連する
一つ以上の害作用を実質的
に減少させる。これらの害作用には好中球減少症、白血球減少症および血小板減
少症、腎毒性、肺毒性および肝毒性、突然変異原性、並びに吐き気などが含まれ
るがこれらに限定されない。
一つの側面では、本発明は悪性疾患を患う哺乳類にその（−）立体異性体を実
質的に含まない（＋）−フォテムスチンの治療上有効量を投与することを含む、
悪性疾患治療法に関する。
別の側面では、本発明はその（−）立体異性体を実質的に含まない（＋）−フ
ォテムスチン、および薬学的に許容され得る担体を含んで成る薬学的組成物に関
する。
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法に使用される活性な化合物はフォテムスチンの右旋
性または（＋）の光学的異性体である。この（＋）異性体の絶対立体化学は現在
知られていない。式Ｉは絶対立体化学が確定されていない１個の鏡像異性体を示
し、ここに提示するものを恣意的にＲ*とする。
鏡像異性体として純粋なフォテムスチンのグラフ的な表示はメール J．Chem．
Ed．62，114-120(1985)に記載されている。このよう
に、くさび形外観および破線を含む表示は、不確定な絶対立体配置を持つが鏡像
異性体的に純粋な化合物であることを示す。
本発明はその（−）立体異性体を実質的に含まない（＋）−フォテムスチンの
治療上有効な量の投与を含んで成る悪性疾患を治療する方法を包含する。
本明細書で使用されるとき、「（−）立体異性体を実質的に含まない」という
用語は、組成物が少なくとも９０重量％の（＋）−フォテムスチンを含みそして
１０重量％またはそれ以下の（−）フォテムスチンを含むことを意味する。より
好ましい態様では、「（−）立体異性体を実質的に含まない」という用語は、組
成物が少なくとも９９重量％の（＋）−フォテムスチンを含みそして１重量％ま
たはそれ以下の（−）フォテムスチンを含むことを意味する。最も好ましい態様
では、「（−）立体異性体を実質的に含まない」という用語は、本明細書で使用
されるとき、組成物が９９重量％より多くの（＋）−フォテムスチンを含むこと
を意味する。これらのパーセンテージは組成物中のフォテムスチンの総量に基づ
いている。「フォテムスチンの実質的に光学的に純粋な（＋）異性体」または「
実質的に光学的に純粋な（＋）−フォテムスチン」および「フォテムスチンの光
学的に純粋な（＋）異性体」および「光学的に純粋な（＋）−フォテムスチン」
という用語も上述の量により包含される。
本明細書で使用するとき、「悪性疾患を治療する」という用語はこのような状
態を治療し、緩和し、または一時的に和らげ、癌組織
の成長を抑制し、そしてこのようにして生存時間を増加させることを意味する。
「治療上有効な量」という用語は、悪性疾患を治療するのに十分な（＋）−フ
ォテムスチンの量を指す。（＋）−フォテムスチンが活性な悪性疾患には、リン
パ腫、黒色腫、神経膠腫および他の脳腫瘍、肺癌、肝転移および血液や胃腸管の
悪性疾患が含まれる。
本発明の方法はフォテムスチンラセミ体の投与と関連する害作用の同時負担を
減少させる。「害作用(adverse effects)」という用語には、好中球減少症、白
血球減少症および血小板減少症、腎毒性、肺毒性および肝毒性、突然変異原性、
および吐き気などが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法では、治療上有効な量を１回で投与することも、また治療上有効
な量の一部、すなわち、幾つかに分けた投与量の一つを投与することもできる。
同様に、本発明の薬学的組成物は（＋）−フォテムスチンの治療上有効量を含む
ことも、あるいは治療の有効性を確保するため個々の組成物の幾つかを投与する
ことが必要であることもある。
治療上有効な量を構成する（＋）−フォテムスチンの量は治療対象である状態
の重篤度およびその性質によりそして投与経路により変動する。投与サイズおよ
び投与頻度は患者個体の年齢、体重および反応によっても変動することがある。
一般に、本明細書に記載された状態に対する（＋）−フォテムスチンの１回投与
の投与量範囲
は、静脈内または動脈内注入により約２０ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇで
ある。１回投与量範囲は約２０ｍｇ／ｍ2から約８０ｍｇ／ｍ2であることが好ま
しい。一般に、投与は数週間の期間（例えば、約２から約８週間）周期的に（例
えば、毎週）行われる。
患者を管理する場合に、治療は低投与量で、おそらく約２０ｍｇ／ｍ2から約
４０ｍｇ／ｍ2までで開始し、そして患者の全体的反応に依存して約４０ｍｇ／
ｍ2までまたはそれよりも高くまで増加させる。６５歳を越えた患者および腎機
能や肝機能に障害を持つ患者は低投与量で投与を開始しそして個々の反応および
血液レベルに基づいて滴定される(be titrated)ことがさらに推奨される。当分
野で熟練した者には明らかであるように、ケースによっては、これらの範囲を越
えた投与量を用いることが必要になることもある。さらに、臨床医や治療医は個
々の患者の反応と関連させて治療を如何にして何時中断し、調節し、または終了
すべきかを知っている。「癌を抑制するのに十分であるが該害作用を惹起するに
は不十分な量」という用語は上述の投与量および投与頻度計画により包含される
。
（＋）−フォテムスチンの有効投与量を患者に与えるために適当な投与経路が
採用されるが、非経口（特に静脈内および動脈内）の投与法が好ましい。投与剤
形としては、分散剤、懸濁液、溶液、および同種のものが挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、活性成分として（＋）−フォテムスチ
ンを含み、そして薬学的に許容され得る担体、および必要に応じて他のアジュバ
ント、賦形剤、または治療用の成分を含む。非経口投与に適する組成物は必要に
応じ通常のアジュバントおよび賦形剤を含む水溶液として提供される。このよう
な組成物は薬学の分野で熟練した者に良く知られた方法で調製される。すべての
方法は一つ以上の必要な成分から成る活性成分と担体とを混ぜ合わせる工程を含
んでいる。
フォテムスチンのラセミ混合物の化学的合成は、上に引用した米国特許第４，
５６７，１６９号に記載されている。次いで、フォテムスチンの（＋）異性体を
キラル媒体上のクロマトグラフィーにより分割することができる。また、（＋）
−フォテムスチンはキラル酸のジアステレオマーエステルの分割結晶化またはク
ロマトグラフィーを用いるフォテムスチンのアミン前駆体の鏡像異性体の分割に
より得ることもできる。当分野で熟練した者に知られた分割の他の標準的方法も
使用することができる。（例えば、E．L．エリール，炭素化合物の立体化学，マ
ックグローヒル（１９６２）、およびウイルソンおよびロッホミュラー，「分割
剤の表」、Journal of Chromatography 113, 283-302（1975）を参照）。
光学的に純粋なフォテムスチンとフォテムスチンラセミ体の抗新生物剤として
の比活性、比効力および比特異性はイン・ビトロおよびイン・ビボで薬学的研究
により決定することができる。
これらの化合物は国立癌研究所（U.S.A.）により確立されそしてR.I.ゲランら
(Cancer Chemotherapy Reports，第III，3(2)巻，1-
87(1972))により出版されたプロトコールに従って腹膜腔内または筋肉内経路で
接種された腫瘍細胞を持つマウスの寿命を増加させるこれらの能力についてテス
トする。
造血毒性は、本発明の化合物の１回投与または数回投与で治療された動物につ
いて、末梢血細胞、骨髄、および骨髄中に含まれる幹細胞の計測により評価する
（ティルおよびマックロッホ，Radiation Res. 14, 213(1961))。最低の細胞濃
度は治療の開始後３日で記録される。この減少の程度を参照として使用するＮ−
Ｎ’−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソウレア（「ＢＣＮＵ」）の１回
投与で処置した後に測定し〔タングおよびアイゼンブラント，Arch．Pharm. 314
，910(1981)］、そしてフォテムスチンラセミ体と（＋）フォテムスチン投与後
の細胞計測と比較する。
肝毒性はロブリュースキーの方法に従って評価する。この方法はフォテムスチ
ンのラセミ体、（＋）フォテムスチンおよび（−）フォテムスチンの投与量の腹
膜腔内注射で治療したロング・エバンスラットから得た血清中のピルビン酸グル
タミン酸トランスアミナーゼ活性を測定することにより行う。
突然変異原性はタピエロら(Anticancer Research 9, 1617-1622(1989)]の方法
に従い下記のように評価する。
ヒト肺癌Ａ４２７およびＡ５４９と結腸癌ＢＥおよびＨＴ２９はコーンらによ
り記述されたように入手し維持する[（Cancer Chemother．Pharmacol．19，291-
295(1987)およびCancer Res．48，3622
-3625(1988)］。ネズミ白血病細胞株Ｐ３８８はＮＣＩから入手する。細胞は、
１０％ウシ胎児血清、１０-5Ｍの２−メルカプトエタノールおよび標準的抗生物
質で補強したＲＰＭＩ１６４０培地中で生育し維持する。すべての培養は５％Ｃ
Ｏ2の加湿雰囲気下で３８°で生育させる。細胞の成長阻害研究は薬物の継続的
存在下における指数培養について行う。得られる細胞数をクールター・カウンタ
ー・モデルＺＢＩ（クールター・エレクトロニクス、ハイアリーア、ＦＬ）で測
定する。
フォテムスチンのラセミ体、（＋）フォテムスチンおよび（−）フォテムスチ
ンは個々に使用直前にエタノールに溶解する。便利な標準的貯蔵溶液は３５ｍＭ
である。放射性同位元素標識化およびＸ線照射のために、２．５×１０5Ｐ３８
８細胞／ｍｌを０．０５μＣｉ／ｍｌの（14Ｃ）−チミジンか０．５μＣｉ／ｍ
ｌの（3Ｈ）−チミジンを含む培地中で生育させる。２０時間標識化した後、培
地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄する。１０μＭの非放射活性チミジンを用い
て４時間標準的チェイス処理を行う。トリチル化細胞を氷上で内部標準として３
００ラドのＸ線照射に曝す。アルカリ溶出手順はコーンら〔「アルカリ溶出によ
る鎖切断および架橋の測定」、フリーベルグおよびハナウオルト編、「ＤＮＡ補
修：研究手順の実験室マニュアル、ニューヨーク、デッカー、１：１９８１、３
７９−４０１頁〕により記述されている。完全生育培地中の薬物の前インキュベ
ーションと細胞毒活性の喪失との関係を決定するため、薬物を１０％ウシ胎児血
清を含む培地中に再懸濁しそして１〜５００分間３７°でインキュベートする。
Ｐ３８８細胞は適当な薬物濃度に達するまで希釈した培地中に再懸濁する。５％
ＣＯ2で３日
インキュベーションした後、細胞を計測する。
フォテムスチンのラセミ体、（＋）フォテムスチンおよび（−）フォテムスチ
ンに接触させられたＰ３８８細胞中での一本鎖切断の誘発を比較する。（14Ｃ）
−チミジンで２０時間標識化された細胞（５×１０5）を種々の濃度のフォテム
スチンで２時間処理し、そして同数の（3Ｈ）−チミジン標識化参照細胞と混合
する。これらの細胞を２．０μｍ穴サイズのポリカーボネートフィルター上で集
め、プロテイナーゼＫの存在下に２％ＳＤＳ／０．０２５ＭのＮａ4ＥＤＴＡ（
ｐＨ９．７）の５ｍｌで溶解する。溶出はコーンにより記述されたようにｐＨ１
２．１で暗所で行う。ＤＮＡ一本鎖切断の頻度は一次溶出動力学に基づいて計算
される。
ＤＮＡ−タンパク架橋の誘発は、フォテムスチンのラセミ体、（＋）フォテム
スチンまたは（−）フォテムスチンの存在下に種々の時間処理されたＰ３８８細
胞中で検討する。（14Ｃ）−チミジン−標識化薬物で処理された細胞を６００ラ
ドのＸ線で照射し、（3Ｈ）−チミジン標識化参照細胞を３００ラドのＸ線で照
射する。これらの細胞を２．０μｍ穴サイズのポリカーボネートフィルター上で
集め、プロテイナーゼＫの非存在下にｐＨ９．７で溶解する。溶出は上記と同様
である。
フォテムスチンラセミ体およびその鏡像異性体の等価のＤＮＡ損傷を惹起する
濃度にＰ３８８細胞を接触させた後の種々の時間にＰ３８８細胞中のＤＮＡ一本
鎖切断の除去をも検討することができる。最初に２時間の薬物処理に曝された（14
Ｃ）−チミジン−標識化
細胞を洗浄しそして薬物を含まない培地に再懸濁する。３７°で時間を換えてイ
ンキュベートした後、これらの細胞を同数の（3Ｈ）−チミジン標識化参照細胞
と混ぜ、ポリカーボネートフィルターの上で集めそしてアルカリ性溶出により分
析する。
前記のテストは比活性、比効力および比選択性の評価を与えてくれる。白イタチにおける嘔吐
。 実験は成熟雄白イタチで行う。この動物をまずステン
レス−スチール・ケーブル、このケーブルは今度はケージの上部の真鍮製の回り
継ぎ手に結合している、に連結したナイロンジャケットを着るのに適応させる。
馬具−つなぎ輪（tether-harness）に馴れさせた後、各動物のその右側の頸静脈
に外科的にカテーテルを埋め込む。このカテーテルは毎日ヘパリン化食塩水で洗
い流す。薬物研究はこの外科手順の１週間後に行う。くさりに繋がれた動物はそ
れぞれ別の部屋に入れる。
テスト化合物のそれぞれの投与量を評価するために８から１１頭の動物が用い
られる。個々の動物の重量を毎週測定しそし４８時間よりも大きな間隔で、フォ
テムスチンラセミ体、（＋）−フォテムスチンまたは（−）−フォテムスチンの
静注または経口の１回投与を無差別に行う。少なくとも３投与レベルで各テスト
化合物の評価を行う。
テスト物質の投与後３０分間、個々の動物を観察する。排除、吐き出しおよび
脱糞のすべてについてその頻度および潜伏を記録する
。用量−反応曲線から得られるデータをχ−二乗分析により統計的有意性をテス
トする。ＥＤ50値を各化合物に対して決定する。このテストは吐き気(nausea an
d vomiting)に対する相対的負担の評価を与える。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods and compositions for treating neoplasms using (+)-fotemustine . FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to pharmaceutical compositions comprising (+) fotemustine. In another aspect, the invention relates to the treatment of malignancies, such as lymphomas, melanomas, gliomas and other brain tumors, lung cancer, liver metastases, and malignancies of the blood and gastrointestinal tract. BACKGROUND OF THE INVENTION In the standard nomenclature of chemical abstracts, fotemustine is [1-[[[(2-chloroethyl) -nitrosoamino] carbonyl] amino] ethylphosphonic acid diethyl ester. Fotemustine is also known as 1- [N- (2-chloroethyl) -N-nitrosouride] ethylphosphonic acid diethyl ester and diethyl-1- [3- (2-chloroethyl) -3-nitrosouride] ethylphosphonate. I have. Early literature referred to fotemustine as S10036. The preparation of racemic fotemustine is described in US Patent No. 4,567,169. The patent states that "this invention also relates to optical isomers of this compound, ...", but such isomers are not disclosed. Racemic forms of fotemustine have been used clinically to treat the malignancies melanoma, primary and metastatic brain tumors, colorectal cancer, soft tissue and bone sarcomas and hematological malignancies. [Kayat et al. Nat'l Cancer Inst. 80 , 1407-1408 (1988); Kayat et al., Cancer Res. 47 , 6782-6785 (1987); Jaquilat et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 30, A1088 (1989) ; Rouge et al., Eur. J. Cancer 29A (2), 288-9 (1993), Curvrat et al., Eur. J. Cancer 29A (1), 143-144 (1993)]. These clinical studies have shown that racemic fotemustine is clinically useful for treating these cancers, but its use is associated with delayed, cumulative toxicity in the bone marrow. I have. This dose limiting toxicity is myelosuppression which usually leads to neutropenia, leukopenia and thrombocytopenia. Kidney, lung and liver toxicity is less frequently observed. Racemic fotemustine is also believed to be mutagenic [Ashvi et al., Mutation Res. 286, 101-109 (1993)]. Nausea is a problem in some cases. It is particularly desirable to find compounds that have the advantages of racemic fotemustine but do not exhibit the side effects listed above. SUMMARY OF THE INVENTION It has now been discovered that the optically pure (+) isomer of fotemustine is an effective agent for the treatment of malignancies. The optically pure (+) isomer of fotemustine provides this effective treatment while substantially reducing one or more of the adverse effects associated with the administration of racemic fotemustine. These adverse effects include, but are not limited to, neutropenia, leukopenia and thrombocytopenia, nephrotoxicity, pulmonary and hepatotoxicity, mutagenicity, and nausea. In one aspect, the present invention relates to a method for treating a malignant disease, comprising administering to a mammal suffering from the malignant disease a therapeutically effective amount of (+)-fotemustine substantially free of its (-) stereoisomer. In another aspect, the invention is directed to a pharmaceutical composition comprising (+)-fotemustine substantially free of its (-) stereoisomer, and a pharmaceutically acceptable carrier. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The active compound used in the compositions and methods of the present invention is the dextrorotatory or (+) optical isomer of fotemustine. The absolute stereochemistry of this (+) isomer is currently unknown. Formula I shows one enantiomer whose absolute stereochemistry is undefined, and what is presented here is arbitrarily designated as R * . A graphical representation of enantiomerically pure fotemustine is provided by E. J. Chem. Ed. 62 , 114-120 (1985). Thus, a representation containing a wedge-shaped appearance and a dashed line indicates that the compound has an undefined absolute configuration but is enantiomerically pure. The present invention includes a method of treating a malignant disease comprising administering a therapeutically effective amount of (+)-fotemustine substantially free of its (-) stereoisomer. As used herein, the term "substantially free of (-) stereoisomer" means that the composition comprises at least 90% by weight of (+)-fotemustine and 10% or less by weight. (-) Means containing fotemustine. In a more preferred embodiment, the term "substantially free of (-) stereoisomer" means that the composition comprises at least 99% by weight of (+)-fotemustine and 1% or less by weight of (-) fotemustine. Is included. In the most preferred embodiment, the term "substantially free of (-) stereoisomer", as used herein, means that the composition comprises more than 99% by weight of (+)-fotemustine. means. These percentages are based on the total amount of fotemustine in the composition. "Substantially optically pure (+) isomer of fotemustine" or "substantially optically pure (+)-fotemustine" and "optically pure (+) isomer of fotemustine" and " The term "optically pure (+)-fotemustine" is also encompassed by the above amounts. As used herein, the term "treating a malignant disease" treats, alleviates, or temporarily alleviates such a condition, inhibits the growth of cancerous tissue, and thus survives. Means to increase. The term "therapeutically effective amount" refers to an amount of (+)-fotemustine sufficient to treat a malignancy. (+)-Fotemustine active malignancies include lymphomas, melanomas, gliomas and other brain tumors, lung cancer, liver metastases, and malignancies of the blood and gastrointestinal tract. The method of the present invention reduces the co-morbidities associated with the administration of racemic fotemustine. The term `` adverse effects '' includes, but is not limited to, neutropenia, leukopenia and thrombocytopenia, nephrotoxicity, pulmonary and hepatotoxicity, mutagenicity, and nausea. It is not limited to. In the method of the present invention, a therapeutically effective amount can be administered at one time, or a part of the therapeutically effective amount, that is, one of several divided doses can be administered. Similarly, a pharmaceutical composition of the invention may contain a therapeutically effective amount of (+)-fotemustine, or it may be necessary to administer some of the individual compositions to ensure therapeutic effectiveness. Sometimes. The amount of (+)-fotemustine that constitutes a therapeutically effective amount will vary depending on the severity and nature of the condition being treated and on the route of administration. Dosage size and frequency may also vary with the age, weight and response of the individual patient. Generally, a dose range for a single dose of (+)-fotemustine for the conditions described herein is from about 20 mg / kg to about 150 mg / kg by intravenous or intraarterial infusion. It is preferred single dosage range is from about 20 mg / m 2 to about 80 mg / m 2. Generally, the administration is performed periodically (eg, weekly) for a period of several weeks (eg, about 2 to about 8 weeks). In managing patients, treatment is initiated at low doses, probably from about 20 mg / m 2 to about 40 mg / m 2 , and up to about 40 mg / m 2 or more depending on the patient's overall response. Also increase to higher. It is further recommended that patients over the age of 65 and those with impaired renal or hepatic function start on low doses and be titrated based on individual response and blood levels. As will be apparent to those skilled in the art, in some cases it may be necessary to use dosages outside these ranges. In addition, clinicians and physicians know how and when to interrupt, adjust, or terminate therapy in relation to individual patient response. The term "sufficient to suppress cancer but insufficient to elicit the harmful effect" is encompassed by the above-mentioned dosage and dosing frequency regimes. Any suitable route of administration may be employed for providing a patient with an effective dose of (+)-fotemustine, but parenteral (especially intravenous and intraarterial) administration is preferred. Dosage forms include dispersants, suspensions, solutions, and the like. Pharmaceutical compositions of the present invention comprise (+)-fotemustine as the active ingredient, and comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and optionally other adjuvants, excipients, or therapeutic ingredients. Compositions suitable for parenteral administration are provided as aqueous solutions, optionally containing conventional adjuvants and excipients. Such compositions are prepared in a manner well known to those skilled in the pharmaceutical arts. All methods include the step of bringing into association the active ingredient with the carrier with one or more necessary ingredients. Chemical synthesis of racemic mixtures of fotemustine is described in U.S. Patent No. 4,567,169, cited above. The (+) isomer of fotemustine can then be resolved by chromatography on chiral media. (+)-Fotemustine can also be obtained by resolution crystallization of diastereomeric esters of chiral acids or resolution of enantiomers of the amine precursor of fotemustine using chromatography. Other standard methods of resolution known to those skilled in the art can also be used. (See, for example, E. L. Eleel, Stereochemistry of Carbon Compounds, McGraw-Hill (1962), and Wilson and Lochmuller, "Table of Resolving Agents", Journal of Chromatography 113, 283-302 (1975)). The specific activity, specific potency and specificity of optically pure fotemustine and racemic fotemustine as antineoplastic agents can be determined by in vitro and in vivo pharmacological studies. These compounds were established intraperitoneally or intramuscularly according to the protocol established by the National Cancer Institute (USA) and published by RI Gellan et al. (Cancer Chemotherapy Reports, III, 3 (2), 1-87 (1972)). The ability to increase the longevity of mice bearing tumor cells inoculated by the internal route is tested. Hematopoietic toxicity is assessed by measuring peripheral blood cells, bone marrow, and stem cells contained in bone marrow in animals treated with one or several doses of a compound of the invention (Till and McLoch, Radiation Res. 14, 213 (1961)). The lowest cell concentration is recorded 3 days after the start of treatment. The extent of this reduction was measured after treatment with a single dose of N—N′-bis (2-chloroethyl) -N-nitrosourea (“BCNU”) used as a reference [Tang and Eisenbrand, Arch. Pharm. 314 , 910 (1981)], and the cell counts after administration of racemic fotemustine and (+) fotemustine. Hepatotoxicity is assessed according to Roblewski's method. The method is performed by measuring pyruvate glutamate transaminase activity in serum obtained from Long Evans rats treated with intraperitoneal injections of racemates of fotemustine, (+) fotemustine and (−) fotemustine. Mutagenicity is assessed as follows according to the method of Tapiello et al. (Anticancer Research 9, 1617-1622 (1989)): Human lung cancers A427 and A549 and colon cancers BE and HT29 are obtained as described by Kohn et al. [(Cancer Chemother. Pharmacol. 19 , 291-295 (1987) and Cancer Res. 48 , 3622-3625 (1988)]. The murine leukemia cell line P388 is obtained from NCI. Grow and maintain in RPMI 1640 medium supplemented with serum, 10 -5 M 2-mercaptoethanol and standard antibiotics.All cultures are grown at 38 ° in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . Growth inhibition studies are performed on exponential cultures in the continuous presence of the drug, and the resulting cell counts are determined using the Coulter Counter Model ZBI (Coulter Electronics, Hialeah, The racemates of fotemustine, (+) fotemustine and (−) fotemustine are individually dissolved in ethanol immediately before use, a convenient standard stock solution is 35 mM, radiolabeling and X-rays. For irradiation, 2.5 × 10 5 P388 cells / ml are grown in medium containing 0.05 μCi / ml ( 14 C) -thymidine or 0.5 μCi / ml ( 3 H) -thymidine. After labeling for 20 hours, the medium is removed, the cells are washed with cold PBS, standard chase treatment is performed for 4 hours with 10 μM non-radioactive thymidine, and tritylated cells are stored on ice as internal standard at 300 μM. Exposure to X-ray irradiation of Rad. The alkaline elution procedure is described by Kohn et al. Laboratory Manual of Research Procedures, New York, Decker, 1: 1981, pp. 379-401] To determine the relationship between preincubation of drug in complete growth medium and loss of cytotoxic activity, The drug is resuspended in medium containing 10% fetal bovine serum and incubated for 1-500 minutes at 37 ° P388 cells are resuspended in diluted medium until the appropriate drug concentration is reached 5% CO 2 The cells are counted after 3 days incubation at, and the induction of single strand breaks in P388 cells exposed to racemic fotemustine, (+) fotemustine and (-) fotemustine is compared. Cells (5 × 10 5 ) labeled with ( 14 C) -thymidine for 20 hours are treated with various concentrations of fotemustine for 2 hours and mixed with an equal number of ( 3 H) -thymidine labeled reference cells. The cells are collected on a 2.0 μm pore size polycarbonate filter and lysed with 5 ml of 2% SDS / 0.025 M Na 4 EDTA (pH 9.7) in the presence of proteinase K. Elution is performed in the dark at pH 12.1 as described by the cone. The frequency of DNA single strand breaks is calculated based on primary elution kinetics. Induction of DNA-protein cross-linking is studied in P388 cells treated for various times in the presence of racemic fotemustine, (+) fotemustine or (-) fotemustine. (14 C) - thymidine - was treated with labeled drug cells were irradiated with X-rays of 600 rads, (3 H) - irradiated with X-rays of the thymidine-labeled reference cell 300 rads. The cells are collected on a 2.0 μm pore size polycarbonate filter and lysed at pH 9.7 in the absence of proteinase K. Elution is the same as above. The removal of DNA single-strand breaks in P388 cells at various times after contacting P388 cells with concentrations that cause equivalent DNA damage of racemic fotemustine and its enantiomer can also be considered. . The ( 14C ) -thymidine-labeled cells that were first exposed to drug treatment for 2 hours are washed and resuspended in drug free media. After a variable incubation at 37 °, the cells are mixed with an equal number of ( 3 H) -thymidine-labeled reference cells, collected on polycarbonate filters and analyzed by alkaline elution. The above test gives an evaluation of specific activity, specific potency and specific selectivity. Vomiting in white weasel . Experiments are performed on mature male weasel. The animal is adapted to wear a nylon jacket connected to a stainless-steel cable, which in turn is connected to a brass swivel joint at the top of the cage. After acclimatization to the harness-tether-harness, each animal is surgically implanted with a catheter in its right jugular vein. The catheter is flushed daily with heparinized saline. Drug studies are performed one week after this surgical procedure. Put the animals connected to each other in separate rooms. Eight to eleven animals are used to evaluate each dose of the test compound. Individual animals are weighed weekly and at random intervals of greater than 48 hours, a single intravenous or oral dose of racemic fotemustine, (+)-fotemustine or (-)-fotemustine is given indiscriminately. Each test compound is evaluated at at least three dose levels. Individual animals are observed for 30 minutes after administration of the test substance. Record the frequency and latency of all eliminations, vomits and defecations. Data obtained from dose-response curves are tested for statistical significance by chi-square analysis. ED 50 values determined for each compound. This test gives an assessment of the relative burden on nausea and d vomiting.
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