JP2000500121A

JP2000500121A - 免疫系による生きた被移植細胞の破壊を阻止する方法

Info

Publication number: JP2000500121A
Application number: JP9513711A
Authority: JP
Inventors: ウェーバー、コリン・ジェイ; ハグラー、メリー・ケー; リンズレイ、ピーター・エス; カップ、ジュディス・エー
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2000-01-11
Also published as: CA2232815A1; AU721737B2; AU7378296A; WO1997011607A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、患者に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を封入することと、b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置することを具備してなる方法を提供する。ある実施態様では、免疫系協同刺激減少を阻害する物質はＣＴＬＡ4である。本発明によって、患者の糖尿病を治療する方法であって、a）半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、またはこのような細胞を具備する組織を封入することと、b）このような生きた被封入インシュリン産生細胞を有効量患者に移植することと、c）有効量の免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】免疫系による生きた被移植細胞の破壊を阻止する方法本出願は、1995年９月27日に出願された米国暫定出願第60／004,375号の利益を主張するものであり、その内容は参照文献として本明細書に取り込まれる。本明細書において開示される発明は、政府の援助によるＮＩＨグラント第Ｒ01 −ＤＫ39088の下でなされた。したがって、米国政府は本発明に対して、ある種の権利を有する。本出願では、種々の参照文献は、括弧内に参照されている。本明細書では、参照文献として、これらの文献の開示内容全体を本出願に取り込み、本発明が属する分野の現状をより完全に記載する。これらの参照文献の完全な文献リストは、本出願の最後部、請求の範囲の前に示されている。発明の背景インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の合併症を回避するために、さらに優れたインシュリン補充療法が必要不可欠である。我々の最終目標は、ミクロカプセル化した異種膵島（xenogeneic islet）を移植する技術を開発し、糖尿病患者に、耐久性のある、インシュリンの生理的供給源を提供することである。ミクロカプセルが生体に適合すること、およびストレプトゾトシン（ＳＺＮ）で引き起こした糖尿病を発症したマウスの腹腔内で、ミクロカプセルに含有された異種膵島の移植片が永続的に機能することは以前から示されてきた。このように、ミクロカプセルは、インビボにおいて損傷を受けず、安定なようであり、長期的な生着および異種膵島の機能に必要とされるであろう因子がアクセスすることができる。ミクロカプセルは機械的な障壁として作用し、レシピエントのリンパ球とドナーの膵島との間の細胞−細胞間接触を防ぐ。機械的な障壁は、免疫的な破壊から移植片を保護するというより、主として宿主の感作を妨げる。何故なら、カプセル化した膵島は、膵島のドナー細胞抗原に対して予め感作されたレシピエントによって極めて急速に破壊されるからである。同様に、カプセル化した異種膵島は、(２週間で)ＮＯＤマウスによって拒絶されたが、これはおそらく、ＮＯＤが膵島抗原に対して予め感作されていることによるものであろう。ＮＯＤマウス中の拒絶された異種移植片は、ＩＬ−1α、ＴＮＦα（これらは免疫組織化学によって裏付けられた）を有する多数の活性化されたマクロファージおよび免疫グロブリンに取り囲まれており、ＩＬ-4のmＲＮＡがＲＴ− ＰＣＲによって検出された。我々は、カプセル化膵島から分泌されたドナー抗原、または流出したドナー抗原がＮＯＤの拒絶を開始させ、宿主ＡＰＣ(antigen p resenting cell;抗原提示細胞)によるＭＨＣ（major histocompatibility compl ex;主要組織適合性複合体）クラスII経路を介して、該抗原がプロセッシングされると仮定している。これらのＡＰＣは、Ｔh2応答を生じせしめるＮＯＤＣＤ4 ＋Ｔ細胞を活性化し、ドナー膵島の破壊はサイトカインを介して現象を通じて起こる。我々はミクロカプセル化法を改良し、ＮＯＤマウスの中でさえ、近縁種である（concordant）ラットの異種膵島移植片が長期間生着し得るようにすることも可能にした。さらに、我々は、ＮＯＤの協同刺激細胞（co−stimulatory cell）をＣＴＬＡ4Ｉgで阻害すれば、近縁種でない（discordant）ウサギ膵島異種移植片の生着が200日まで、顕著に延びることを見出した。このようにして、我々は、自己免疫性糖尿病レシピエントの中にカプセル化膵島異種移植片を移植する際に伴う問題を克服することもできた。インシュリン依存性糖尿病この数年間で、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に対する治療法の効果またはその知識が著しく増大したことは明らかである。糖尿病の制御および合併症に関する試験（ＤＣＣＴ;Ｄiabetes Ｃontrol and Ｃomplications Ｔrial）によって、集中的インシュリン療法が発病を遅らせ、ＩＤＤＭ患者の網膜障害、腎障害、および神経障害の進行を緩やかにすることが見出された（1）。不幸にも、集中的インシュリン療法は多くのＩＤＤＭ患者にとって適切とはいえず、注意深くモニタリングしても、ＤＣＣＴの患者では重篤な低血糖の徴候が増加した（1）。皮肉にも、ＤＣＣＴの結果は、膵臓移植および膵島移植の理論が正しいことを支持するものである。膵島移植実験の開始以来、このような移植片は、外来性のインシュリンと比べて恒常的にインシュリンを供給するかもしれないという期待、および糖質代謝が「正常に近く」修復されれば、ＩＤＤＭの二次的な合併症は防止できるかもしれないという期待があった（2）。臨床的な膵臓同種移植（allograft）は、免疫抑制との組み合わせが実現するとともに、結果が向上し、膵臓同種移植および自己移植によって、多くの場合グルコースのホメオスタシスは正常に近くなる（3）。しかし、ヒト膵臓同種移植片の１年目の死亡率は未だに高く（10％）、免疫抑制を要し、臨床的に行われた膵臓の臓器全体移植の数は、世界でも極く限られている（2,4,5）。ミクロカプセル化膵島異種移植の理論的裏付け膵臓の外分泌作用に関する問題を避け得るため、ＩＤＤＭ患者にとって、膵島移植は魅力的な治療法である。しかし、ヒト膵島をドナーとする同種移植は、長い間成功せず（3）、且つヒト膵島の入手および供給は限られている。多数の患者に対する治療的な膵島移植には、殆ど確実に、動物から採取されたドナー膵島（異種移植）が必要となるであろう（2,4）。臨床に用いるのに、最も適切な異種膵島の採取源には議論の余地が残されている。類人霊長類（subhuman primate）から膵島が単離され、免疫抑制を施した、糖尿病の齧歯類に異種移植することにより、短期間糖尿病が回復した（6）。しかし、霊長類の使用にはそれを取り巻く重大な倫理的問題が存在する。他の有望な採取源はブタ、ウシ、イヌおよびウサギの膵島であり、これらは移植の拒絶が起こるまで、糖尿病の齧歯類内で、きわめてよく機能する(すなわち、正常血糖値を維持する)（7−11）。ヒト、ウシおよびブタ膵島の異種移植が、ヌードマウスおよびラットの中で長期間生着することが文献に記載されており、異種のレシピエント中にも、膵島特異的成長因子が十分に存在していることを示唆する（2, 12−17）。社会的／倫理的理由で、イヌの膵島は臨床的には不適当である。ブタの膵島は、(完全な状態で)単離しづらく、且つインビトロで維持することも困難であるが、将来的な臨床応用には非常に有望である（18−21）。ウシの膵島の単離は、技術的には(ブタ膵島に比べて)容易であり、子ウシの膵島はグルコース応答性である(22)。最近、ウサギ膵島の大規模な単離が開発された（予備的研究を参照）（23）。ウサギの膵臓は、魅力的な膵島の採取源である。ブタインシュリンのように、ウサギは、ヒトインシュリンと１アミノ酸だけが異なっており、且つウサギ膵島はグルコース応答性である（22,24）。さらに、ヒトの多くは天然の抗ウサギ抗体を保有しておらず、そのため異種移植の拒絶が起こらない可能性が増大するかもしれない（25）。現在では、多数のドナーを使用して、子ウシ、ブタまたはウサギの何れかから、糖尿病のヒトレシピエント当たり100万個のドナー膵島を単離することも考えられる。ヒトＩＤＤＭへの膵島異種移植に対する最も重大な障害は、種間移植拒絶を防ぐための、有効な免疫抑制療法が存在しないことである（2,26−28）。最近、精製された高親和性抗ＨＬＡ（ab）₂にドナー膵島を晒すことによって（29）、または抗ＣＤ4抗体（16）もしくはＣＴＬＡ4Ｉg（ＣＤ28−Ｂ7相互作用を阻止する高親和性融合タンパク質）（12）の何れかで処置したＳＺＮ−糖尿病マウスの中で、ヒト膵島が長期間生着するであろうという報告がなされた。しかし、これらの研究を除いては、多孔性の機械的障壁の助けを借りずに、膵島異種移植片を永続的に生着させることは希であった。血管内装置および血管外装置の両者が開発中である。しかし、出血、凝固、および生体不適合性のような臨床的に起こり得る合併症のため、現在それらを糖尿病患者に用いることは困難となっている（30 ,31）。例えば、皮下に配置されたアクリル性共重合体の中空繊維によって、ヒト膵島同種移植片は２週間生存し続けた。（1.5cmの繊維当たり50膵島）（65,00 0Ｍ.Ｗ.透過性）（32）。しかし、50万個の膵島を移植するためには、これらの中空繊維が150メートル以上必要となり、臨床的には実施不可能である。膵島の封入法の中で最も有望なものの１つは、ポリアミノ酸−アルギネートミクロカプセルである。最近、多くの研究によって、ストレプトゾトシン糖尿病マウスまたはラット中へ、カプセル化ラット、イヌ、ブタまたはヒト膵島を腹腔内異種移植すると、即座に血中グルコースは正常になり、10〜100日間正常であることが示された（7、19、33−39）。ミクロカプセル化イヌ膵島の同種移植、ブタ膵島の異種移植によって、高グルコース血症は長期間正常化し、ヒト膵島の同種移植が１例報告された（21、40−42）。ミクロカプセルが、宿主の破壊から膵島異種移植片を保護する機序は、完全には理解されていない。しかし、宿主免疫細胞との細胞−細胞間接触を阻止することが重要であることは推測されてきた（30、 35）。糖尿病を発症させた齧歯類中の、近縁関係にない（widely unrelated）カプセル化膵島異種移植片が、極めて長持ちしたことにより、糖尿病を自然発症する動物での研究が進んだ。ヒトＩＤＤＭのモデルとしての糖尿病自然発症ＮＯＤマウス肥満でない糖尿病（ＮＯＤ;Ｎonobese diabetic）マウスでは、糖尿病が自然に進行し、約12週齢で発症する。幾つかの点で、ＮＯＤマウスの疾病はヒトＩＤＤＭに類似しているので、ＮＯＤマウスは膵島異種移植の実施可能性を研究するための最適なモデルである。膵島へのマクロファージ、樹状細胞、およびリンパ細胞の侵入は、早くも４週齢で検出することができ、明白な高血糖に先立って起こる（43−46）。ＮＯＤの糖尿病は、Ｔリンパ球依存性であり（43−45）、（ＭＨＣ）クラスII遺伝子と関連している（47−50）。ＮＯＤマウスから、細胞障害性Ｔ細胞、およびβ細胞またはインシュリン特異的な抗体が同定、特性決定され、クローニングされてきた（44、45、51−55）。ＮＯＤが膵島抗原に対する免疫寛容を喪失することは、グルタミン酸脱炭酸酵素（ヒトＩＤＤＭにおける主要な自己抗原であると報告されてきた因子である（5、657））に対するＴh1免疫応答の発生と相関している。糖尿病のＮＯＤから、ＣＤ8＋Ｔ細胞およびＣＤ4＋Ｔ細胞、すなわち両Ｔ細胞クローンを移植することによって、糖尿病でない同系マウスに、該疾病を引き起こすことができる（44、52、55、58）。そして、ＮＯＤのマクロファージもしくはＣＤ4＋Ｔリンパ球を阻害すれば、または抗クラスIIモノクローナル抗体で処置すればＮＯＤマウスの糖尿病の開始が停止または遅延する（ 59、50）。ＮＯＤマクロファージ、Ｃ5補体、およびＮＫ細胞機能の欠陥が報告されてきた（61）。ヘルパーＴ細胞はＣＤ8＋細胞を活性化するように機能し、ＣＤ8＋細胞が直接的な細胞毒性的攻撃によって、β細胞に損傷を与えると推測されてきた。しかし、最近のいくつかの研究によれば、β細胞の損傷には、初期にはＣＤ4＋細胞が関与するが、サイトカインおよび既知のβ細胞性毒素である酸素フリーラジカル（特に一酸化窒素）（62−65）を放出する浸潤マクロファージ（infiltrating macrophage）をも含む非特異的な炎症応答から生じる間接的なものであると推測されている。ＩＤＤＭと類似しているので、ＮＯＤマウスは、膵島の異種移植を研究するための最良のモデルである。最近、Ｓcid変異をＮＯＤバックグラウンドに対して戻し交雑したところ、免疫不全ＮＯＤ−Ｓcidマウスが生じた（66−69）。Ｓcid変異に対して同種（homo logous）であるこれらのマウスは、Ｔ細胞受容体および免疫グロブリン遺伝子を配列し直すことができない（66、67）。その結果、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が欠落する。これらのマウスは糖尿病を自然発症しないが、低量ストレプトゾトシン処方を繰り返すことによって（ＭＬＤ−ＳＺＮ;multiple low dose−streptozotocin）糖尿病を発症させることができ、養子移入実験の最適なモデルとなる（67−69）。ＮＯＤ−Ｓcidは、疾病の進行に関連したＮＯＤＭＨＣ遺伝子およびその他の遺伝子を発現する。それらは、強いマクロファージ応答および限定的なＮＫ−細胞応答を備えているが、機能し得るＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球は欠損している（69）。糖尿病ＮＯＤマウスへの膵島異種移植ＳＺＮによって引き起こした糖尿病に罹ったマウスとは異なり、糖尿病のＮＯＤマウスは非カプセル化膵島異種移植片、同種移植片および同系移植片を即座に拒絶する（7、8、10、19、33、56、70、71）。従来の免疫抑制処方は、該反応には殆ど効果がない（10、71−73）。ＣＤ4＋ヘルパーＴリンパ球またはＦＫ506に対して誘導したモノクローナル抗体で、ＮＯＤレシピエントを処置すれば、膵島移植が機能する期間が延びるが（5〜25日）（7、8、10、73）、ＮＯＤ中で膵島移植片が長期間生着するという報告はなされていない。腹腔内のミクロカプセル化（同種および異種性の）膵島は、非カプセル化対照に比べて、有意に長く機能することが幾つかの研究室により報告されてきたが、これらも最終的には、自然発症性（自己免疫性）糖尿病を伴いながら、レシピエントによって破壊される（ＮＯＤマウスまたはＢＢラット）（7、9、19、33、35、70、 74−78）。拒絶は、主としてマクロファージおよびリンパ球から構成される強烈な細胞性反応を伴い、これによって、膵島を含有するミクロカプセルが捕捉され（entrap）、ＮＯＤおよびＢＢレシピエントとともに、21日以内に高血糖が再発する7、19、74、76、77）。糖尿病を自然発症する動物によって、カプセル化した膵島が拒絶される機序は完全には理解されていないが、誘導性（ＳＺＮ）糖尿病のマウスでは、希にしか起こらないという事実は、膵島移植片の破壊に抗膵島自己免疫が関わっているかもしれないということを示唆する。ＮＯＤによる、カプセル化した膵島異種移植片の破壊機序：マクロファージ、Ｔ −細胞、およびサイトカイン他の生体用人工膜装置（bioartificial membrane device）のように、ミクロカプセルは、（Ａ）ドナー抗原の放出を抑えて、または最少にして宿主の感作を減少させることにより、および／または（Ｂ）宿主のエフェクター機構(すなわち、Ｔ細胞の接触、抗移植片抗体の結合、サイトカインの放出)を抑えることにより、または減少させることにより、異種膵島および同種膵島の生着を促進することが、何人かの研究者によって示唆されてきた。ミクロカプセルおよび他の膜装置中の膵島の拒絶に関する研究の多くは、エフェクター機構に焦点を当ててきた。例えば、Ｈalle（35）、ＤarguyおよびＲeac h（79）は、ミクロカプセルが、宿主の免疫グロブリン、特にヒト抗膵島抗体および補体効果から、ドナーの膵島をインビトロで保護することを報告した（79）。補体成分は、極めて大きいので（＞＞150,000kＤ）従来のポリ−Ｌ−リジンミクロカプセルに入ることができないが、流出したドナー抗原と抗体が結合して、インビボ（腹腔内）でマクロファージのＦcＲに結合する複合体を形成し、カプセル化した膵島の破壊を引き起こすサイトカインの放出が開始することはあり得る（80）。補体は、Ｃ3b受容体を介して、またはマクロファージの数を増加させ得る化学走性ペプチドの放出によって、マクロファージへの複合体の結合を促進しているのかもしれない。デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin;ＤＳＧ）（Ｔ細胞阻害性免疫抑制剤）（81）でＮＯＤのレシピエントを処置すれば、カプセル化したハムスターからＮＯＤマウスへのカプセル化膵島異種移植が有意に延長される見出したＩwata ら（81）によって、カプセル化した膵島の拒絶にＮＯＤＴ−リンパ球が関与していることが、提唱されてきた。このデータは、ＣＤ4＋ヘルパーＴ細胞に対するモノクローナル抗体またはＦＫ−506でＮＯＤを処置すれば、ラットからＮＯＤへの、カプセル化および非カプセル化膵島移植の機能が、ともに延長するという、幾つかの研究室による以前の発見と一致しており（7、8、10、73）、これらの発見は、ＣＤ4＋Ｔ細胞が異種反応性において主要な役割を果たしているというA uchincloss(27)、Pierson（82）およびＧill（83）の観察と同様なものである。ＮＯＤマウスおよびＢＢラット中のカプセル化膵島同種移植片および異種移植片からミクロカプセル周辺部に滲出した液中に、マクロファージ／単球が目立つことが報告されてきた(7、33、36、74、76−78、84)。ＩＬ−1およびＴＮＦを含む(62、 77、85、86)、マクロファージの産物であることが明らかとなっているサイトカインが、カプセル化した膵島の破壊に関与しているのかもしれない。ＩＬ−1およびＴＮＦは、インビトロにおいて、ともにインシュリンの分泌を減少させ、膵島細胞に進行性の損傷を引き起こすことが報告されてきた（58、62−64、85−87）。サイトカインを介した傷害は、腹腔内の炎症応答を活性化させることによって、直接的または間接的に起こるのかもしれない（30、77）。最近、Ｊ.Ｃorbett博士によって、各膵島内部に10個ものマクロファージが存在することが報告された(ＩＰＩＴＡconf.6／95)。ＩＬ−1は一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を誘導し（63− 65）、その結果β細胞中のミトコンドリアおよびＤＮＡに損傷を引き起こす一酸化窒素（ＮＯ）を生成させる（63−65）。その上、該膵島損傷経路はＴＮＦによって、さらに増強される（88、89）。理論的には、ドナー膵島および宿主腹腔、または下部膵島（downislet）のマクロファージが、サイトカインを介した、カプセル化膵島の損傷に関与し得るかもしれない。ハムスターからラット肝臓への膵島異種移植およびブタからマウスへの膵島異種移植のサイトカインメッセンジャーＲＮＡプロフィールの研究により、Ｔh2サイトカイン（ＩＬ-4、ＩＬ−5、IＬ-10）が選択的に増加し、ＩＬ-2は正常のものと不変であることが明らかとなった（11、90）。これらは、拒絶された非カプセル化膵島同種移植片の生検組織中にＩＬ-2メッセンジャーＲＮＡを報告したＯ' Ｃonnellらのもの（91、92）とは明らかに異なっている。Ｔh1活性（93−95）に比べてＴh2活性が増加していることは、既知のＮＯＤ「Ｔh1」抗膵島免疫応答（56、 57、96）と相違する。Ｔh2応答は、外来抗原に対して誘起された抗体応答に特徴的なものであり、カプセル化した異種移植片に対する液性反応が、極めて重要であるかもしれないということを示唆する。さらに、「Ｔh2」応答を喪失させるようにデザインされた戦略により、カプセル化した膵島異種移植片の生着が有意に延びるかもしれない。「Ｔh2」ヘルパーＴ細胞のサイトカインmＲＮＡプロフィールは、外来抗原に対する抗体応答に特徴的なものである。協同刺激（co−stimulatory）分子、ＡＰＣおよびＮＯＤマウスによる膵島異種移植片の破壊膵島異種移植片に対する免疫応答にＡＰＣが関与することが、Ｌenschowら（1 2）の最近の研究によって示唆されている。彼らは協同刺激分子であるＢ7を可溶性融合タンパク質であるＣＴＬＡ4Ｉgで阻害することによって、ヒトからマウスへの膵島異種移植片が、ＳＺＮ−糖尿病マウス中で長く機能することを見出した。幾つかのインビトロおよびインビボでの研究によって、Ｔ細胞受容体と相互作用する外来分子（ペプチド、特異的抗体、分裂促進因子）自体は、ナイーブＴ細胞を刺激して増殖させることができず（95、97）、抗原特異的なアネルギーを引き起こすかもしれないということが示されてきた。少なくともさらに１つ（協同刺激）シグナルが必要であり、それはＡＰＣによって与えられるものである。マウスの場合、このような協同刺激経路の１つに、ＡＰＣ上の２つのリガンド（Ｂ 7−1およびＢ7−2）のうちの何れか１つと、Ｔ細胞表面抗原（ＣＤ28）との相互作用が含まれる（95、97−102）。しかし、このようなＴ細胞とＡＰＣとの完全な相互作用が一度起これば、その後ペプチド、分裂促進因子等とＴ細胞が再び接触することにより、協同刺激非存在下で増殖するようになるであろう（95）。ＣＴＬＡ4は、ＣＤ28と密接に関連した細胞表面タンパク質であるが、ＣＤ28とは異なり、活性化されたＴ細胞上だけで発現される。Ｂ7−1は、ＣＤ28よりもＣＴＬＡ4に対して高い親和性を有する。そして、ＣＴＬＡ4はＣＤ28の機能を調節するかもしれないと推測されてきた（97、103、104）。ＣＴＬＡ4Ｉgは、ＣＴＬＡ4分子の細胞外結合ドメインにＩgＧ₁遺伝子の定常領域を組み合わせた、組換え可溶性融合タンパク質である。ヒトおよびマウスＣＴＬＡ4Ｉgはともに、マウスのＴリンパ球応答（141、142）を阻害することが示されてきた（141、142）。マウスにＣＴＬＡ4Ｉgを投与すれば、抗原特異的な非応答性（マウスループスモデル）（ 97、99、105）が得られ、マウス心臓同種移植片が長期間受容されることが示された（106、107）。さらに、ＬenschowらはＳＺＮ糖尿病マウス中のヒト膵島に免疫寛容を引き起こすことを見出した（12）。ＣＴＬＡ4ＩgはＮＯＤで糖尿病の発生を減少させることも報告されてきた（108）。ＮＯＤマウスのような自然発症性糖尿病のレシピエント中の膵島移植片の生着に対して、ＣＴＬＡ4Ｉgが有効であるという報告はこれまでにはなかった。しかし、我々の研究は、ＣＴＬＡ4Ｉgによって、ＮＯＤレシピエント中のカプセル化ウサギ膵島の生着期間が有意に延長することを示している。さらに、ヘルパーＴ細胞上のリガンド（ＧＰ39）とＡＰＣ−ＣＤ40抗原との結合の重要性を認識して、最近の研究ではヘルパーＴ細胞−ＡＰＣ相互作用が脚光を浴びている（109、110）。ハムスター抗マウスＧＰ39モノクローナル抗体（ＭＲ1）はヘルパーＴ細胞とＡＰＣ、マクロファージ、エフェクターＴ細胞およびＢリンパ球との相互作用を阻害する（109、110）。最近、Ａ.Ｒossini博士は、７日目のＢ7陰性のドナー脾臓細胞とＭＲ1によって、ＳＺＮ糖尿病マウス中で同種膵島と異種膵島の両者が長期間生着し得ることを報告した（ＩＰＩＴＡ conf.6／95）。カプセル化膵島の免疫原性および破壊の移植の機序空のミクロカプセルは、全く細胞性応答を引き起こさないことが報告されてきた（33、35、36）。これに反して、空のカプセルに対する反応を見出してきた者もいる（30、76、77、111、112）。エンドトキシンによる汚染のような試薬中の不純物または高濃度のマンヌロネート（mannuronate）が生体不適合性に関与している可能性が最も高い（113）。ポリ−Ｌ−リジンミクロカプセル処方には生体適合性を有するものも、そうでないものもあることは明白である。標準化された試薬が利用可能になるまでは、研究者は、生体適合性が明白な空のミクロカプセル対照も含めることにより、初めて（ミクロカプセル化されている）免疫学的な研究を解釈することができる。最近、de Ｖosら（114）は、いくつかのミクロカプセルで、膵島のカプセル化が不完全であること、またはミクロカプセル膜から膵島が実際に突き出ていることを報告し、このような生体機械的（biomechanical）な不完全さが、ミクロカプセル崩壊の１つの要因であることを示唆した。ポリ−Ｌ−リジンアルギネートミクロカプセル壁の中に膵島および肝細胞が取り込まれることを考案したＣhang （115）は、同様の観察を行った。他に、数人の研究者が、明らかにカプセル、壁の中に膵島が没入（entrapment）していることを示すカプセル化した膵島の写真を公開したが、この問題には言及していなかった（35、116、117）。不完全なカプセル化によって、未完成カプセルの亀裂、および宿主細胞に対するドナー膵島の露出が生じると予想されるが、ドナー抗原の露出、感作および宿主の原因として、このことを分析した報告はない。宿主免疫応答の開始における、ミクロカプセルから放出されたドナー膵島抗原の役割に注目してきた研究は比較的少ない。Ｒickerら（33）は、ＮＯＤマウスによる、ミクロカプセル中のラットインシュリノーマ、肝臓癌および褐色細胞腫細胞系に対する同様の激しい細胞性反応を報告し、ＮＯＤ免疫反応は膵島特異的ではないと結論した。Ｈorcherら（36）は、ウィスター（Ｗistar）からルイス（Ｌewis ）への、カプセル化した同種移植のうち8／10が56日以内に不成功に終わったのと比べて、ルイスラット膵島のカプセル化した同系移植のうち6／7が15週間生着したことを報告した（36）。同系移植片の生検により、膵島が生きていること（ viable）、カプセルが元通りであること、およびカプセル周辺の免疫反応がないことが示されたが（36）、一方、不成功に終わった同種移植の生検からは、カプセル周辺の細胞性応答、および膵島が生きていないことが明らかとなった。これは、カプセル化した膵島同系移植対照を用いた、唯一の文献中の報告である。ルイスラットモデルは、自己免疫性糖尿病を有するモデルではないが、この結果は重要であり、ドナー抗原が、その後の宿主応答に対する刺激であることを示唆している。発明の概要本発明は、患者（subject）に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を封入することと、 b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象（costimulation event）を阻害する物質で、患者を処置することを具備してなる方法を提供する。１つの実施態様において、免疫系の協同刺激現象を阻害する該物質はＣＴＬＡ 4である。従って、本発明はさらに、患者に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を封入することと、 b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量のＣＴＬＡ4で患者を処置することを具備してなる方法を提供する。本発明はまた、患者の糖尿病を治療する方法であって、 a）半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を封入することにより、生きた被封入インシュリン産生細胞を得ることと、 b）患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ（a）で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c）ステップ（b）で得られた、多数の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法を提供する。図の簡単な記述図１:未処置の（unmodified）糖尿病ＮＯＤＨ＆Ｅに異種移植してから150日後の、カプセル化したルイスラットの膵島（×250）。該ミクロカプセルは「二重壁」ミクロカプセルである。図２:膵島異種移植の生着、「二重壁」ミクロカプセル。図３:100,000Ｋdの透過性を有するミクロカプセルの中にカプセル化したウサギ膵島の生着と、70,000Ｋdまでの透過性を有するミクロカプセルの中にカプセル化したウサギ膵島の生着との比較。図４:ルイスラット脾臓細胞に対する感作が、ルイスラットからＮＯＤへのミクロカプセル化膵島移植に対して及ぼす影響。図５:ルイスラット膵島に対する感作が、ルイスラットからＮＯＤへのカプセル化膵島移植に対して及ぼす影響。図６:80日目にＧk1.5.で処置したＮＯＤマウスの腹腔から得た、ミクロカプセル化イヌ膵島。Ｈ＆Ｅ（×250）図７:86日目に生検した、ＣＴＬＡ4Ｉgで処置したＮＯＤマウスの腹腔から得た、機能しているカプセル化ウサギ膵島。ＮＯＤ細胞応答がなく、カプセル内に生きた膵島が存在していることに注目されたい。Ｈ＆Ｅ（×400）図８:膵島異種移植に対する、ＣＴＬＡ4Ｉg処置と組み合わせた膵島のミクロカプセル化の影響。図９:ＮＯＤに移植した、ミクロカプセル化マウスＩＮＳ−ＣＴＬＡ4膵島の生着。これらの膵島はＣＴＬＡ4を発現する。図10:ストレプトゾトシンＳＺＮ−糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスへの、ラット膵島の移植の影響。図11:ストレプトゾトシン（ＳＺＮ）−糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスへの、ウサギ膵島の移植の影響。図12:ストレプトゾトシン（ＳＺＮ）−糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスへの、ミクロカプセル化ウサギ膵島の移植の影響。図13:86日目にＣＴＬＡ4Ｉgで処置したＮＯＤマウスの腹腔から生検した、機能しているカプセル化ウサギ膵島。ＮＯＤ細胞応答がなく、カプセル内に生きた膵島がないことに注目されたい。Ｈ＆Ｅ（×400）。矢印はカプセル壁の外側を示す。図14:ブタ新生児の膵臓からの膵島の収量（全膵島の数）。図15:非カプセル化（Ｎ）およびカプセル化（Ｅ）ブタ新生児膵島（μＵ／1000 膵島／24hr）からの、インビトロでのインシュリンの放出。図16:組織培養における、分散したブタ新生児の「膵島」、５日目。抗インシュリン免疫組織化学は5−10％のβ細胞を示している。約400×。図17:ＳＺＮ−糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスから、103日目に生検したミクロカプセル中の新生児の膵島。抗インシュリン免疫組織化学は、膵島の約80％を占める、強インシュリン陽性β細胞を示している。約400×。矢印はミクロカプセル膜の外部表面を示す。図18:ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスの脾臓／門脈中の、非カプセル化新生児ブタ膵島異種移植。生検（示されていない）によって、肝臓および脾臓実質中ともに生きたブタ膵島が確認された。Ｎ＝１Ｔ＝移植Ｓ＝脾臓および肝臓生検のために屠殺図19:ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスの腹腔内への、ミクロカプセル化ブタ新生児膵島の異種移植。 103日目に生検（図20参照）Ｎ＝１Ｔ＝移植Ｓ＝屠殺図20:ＳＺＮ−糖尿病ＮＯＤ−Ｓcidマウスへの異種移植後103日目に生検した、ミクロカプセル中のブタ新生児の膵島。Ｈ＆Ｅ、×400。矢印は、ミクロカプセル膜の内部表面を示す。図21:200μgのＣＴＬＡ4Ｉg（i.p.Ｑ.Ｏ.Ｄ.）で処置した、ＮＯＤ中のカプセル化ブタ新生児膵島の異種移植（Ｎ＝5）、×20日。101日目に、ＮＯＤ880を生検した（図22参照）。Ｓ＝生検のために屠殺（−−−）＝移植不成功図22:自然発症性糖尿病のＮＯＤマウスの腹腔内に異種移植してから101日目に生検した、ミクロカプセル化新生児ブタ膵島。ＣＴＬＡ4Ｉg、200μg i.p.Ｑ.Ｏ. Ｄ.、0−21日。矢印は、全く変化していないミクロカプセル内壁を指している。カプセル周辺のＮＯＤ細胞応答はない。Ｈ＆Ｅ×200。図23:隣接した同一生検組織切片の抗インシュリン免疫細胞化学によって、多くの細胞がインシュリン陽性β細胞であることが示されている。×400。図24:ＣＴＬＡ4Ｉg^*で処置したＮＯＤマウス腹腔中のミクロカプセル化ブタ新生児膵島異種移植片は、補体を結合しない。図25:抗原非存在下において、96穴プレート中で、脾臓細胞を２×10⁶細胞／mlで培養した。10個は空のカプセル、10個はブタ新生児の膵島（放射線照射しないまたは2000Ｒで放射線照射した、4×10³のブタ新生児の膵島）を含むカプセル。脾臓細胞は、正常ＮＯＤマウス（パネルＡ）、糖尿病ＮＯＤマウス（パネルＢ）から得た。糖尿病ＮＯＤマウスは、図24に記載されているように、ブタ新生児のカプセル化膵島を移植され、ＣＴＬＡ4Ｉg^*（パネルＤ）を投与された。48時間インキュベーションした後、³Ｈ−ＴdＲを添加し、18時間後に細胞を採取した。結果は３つの培養の平均±ＳＤで表されている。図26:図24に記載されているマウスから得た脾臓細胞の培養液中のリンホカイン産生をＥＬＩＳＡで測定した。図24で記載したような放射線未放射のブタ新生児膵島とともに、正常または糖尿病ＮＯＤマウスからの脾臓細胞を培養した。24時間インキュベーションした後に、上清の液体を採取し、サンドウィッチＥＬＩＳＡ、および適切な組換えサイトカインを標準として用いて、ＩＬ-4、ＩＬ-10およびＩＦＮ−γのアッセイを行った。図27:自己免疫性ＮＯＤマウスによる、ミクロカプセル化した異種膵島に対する免疫応答のモデル。分泌されたインシュリンは、明らかに二重壁のミクロカプセル膜を透過して、移植を受けたマウスのグルコースレベルを制御した。１）:膵島から流出または分泌された100,000mw（ＡgＸ）未満の、他のドナータンパク質またはタンパク質断片が、ミクロカプセルから拡散し、樹状細胞の細胞内に取り込まれた（endo-cytosed）可能性がある。２）:樹状細胞はＭＨＣクラスII経路を介してタンパク質のプロセシングを行い、クラスIIおよび協同刺激分子と複合体を形成したペプチドＸをＣＤ4＋Ｔ細胞に提示する。適切なサイトカインの存在下、ＣＤ4＋Ｔ細胞は活性化され、ＣＤ40Ｌ（ＧＰ39）を発現するＴh2細胞になる。ＡgＸを結合するＩgＭを表面上に有するＢ細胞は、ＡgＸを細胞内に取り込んで、Ｂ細胞表面上に発現されているＭＨＣクラスIIと結合するペプチドにプロセシングする。クラスIIと複合体化したＴh2特異的ペプチドＸはＢ細胞と結合し、ＣＤ40 Ｌ（ＧＰ39）とＣＤ40の相互作用がＢ細胞の活性化を引き起こす。３）Ｔh2リンホカインに誘導されて、活性化されたＢ細胞は形質細胞へと成熟する。４）形質細胞は、ＡgＸと複合体を形成する特異的抗体を分泌する。５）複合体がＦcＲに結合するとマクロファージが活性化され、ＩＬ-1、ＴＮＦαおよび一酸化窒素（ＮＯ）を含む様々な伝達物質が分泌される。これらは全て、膵島に対する毒性効果を有し、且つ非常に小さいので二重壁ミクロカプセルを透過し得る。発明の詳細な記述本発明は、患者に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を封入することと、 b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置することを具備してなる方法を提供する。本明細書で用いられる、「免疫系協同刺激現象」とは、ＡＰＣ表面上のＭＨＣに結合した抗原が、Ｔ細胞受容体に結合するときに必要とされる、ＡＰＣとＴ細胞間の相互作用である。免疫系協同刺激現象には、Ｔ細胞上の特異的リガンドと（ＭＨＣに結合した抗原以外の）ＡＰＣ細胞表面分子との特異的な結合が全て含まれる。このような特異的結合には、Ｔ細胞表面上のＣＴＬＡ4受容体すなわちＣＤ28受容体への（ＡＰＣの表面上に存在する）Ｂ7分子の結合、および（Ｔ細胞表面上の）ＧＰ39への（ＡＰＣの表面上に存在する）ＣＤ40分子の結合が含まれるが、これらに限定されない。免疫系協同刺激現象を阻害する物質は当業者に公知であり、ＭＲ1（Ｔ細胞表面上に発現されたＧＰ39への、ＡＰＣ表面上に発現されたＣＤ40の結合を遮断する）のようなＴ細胞またはＡＰＣ細胞表面分子の類縁体、またはＣＴＬＡ4（ＣＤ28受容体すなわちＣＴＬＡ4受容体へのＢ7分子の結合を遮断する）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載した、生きた移植細胞の破壊を阻害するための方法の実施態様の１つにおいて、免疫系協同刺激現象を阻害する物質はＣＴＬＡ4である。本発明において用いるＣＴＬＡ4なる語は、ＣＴＬＡ4受容体のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、またはＣＴＬＡ4受容体のアミノ酸配列と十分な同一性を有するアミノ酸配列を具備するタンパク質性構築物（proteinasceous construct）であって、該タンパク質性構築物がＢ7分子を結合することができ、それによってＢ7 分子とＴ細胞上のＣＴＬＡ4受容体との結合を遮断するような全ての構築物を指すものとする。タンパク質性構築物は当業者に周知であり、ペプチド、ポリペプチド、およびペプチドおよび／またはペプチドサブユニットを具備する分子を含む、互いにペプチド結合によって連結されたアミノ酸部分を具備する全ての分子を指す。このように、ＣＴＬＡ4なる語には、遺伝子工学的に作出した細胞の中で、ＣＴＬＡ4受容体のＢ7−結合部位をコードする遺伝子によって発現された分子、ＣＴＬＡ4受容体のＢ7−結合部位をコードする遺伝子の変異体によって発現された分子であって、Ｂ7分子を結合することができる分子、およびＣＴＬＡ4受容体のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、またはＣＴＬＡ4受容体のアミノ酸配列と十分に同一であり、Ｂ7を結合し得るようなアミノ酸配列を有する合成アミノ酸鎖が含まれるが、これらに限定されない。ＣＴＬＡ4には、ＣＴＬＡ4Ｉgのような、ＣＴＬＡ4受容体の細胞外結合ドメインを具備する可溶性ＣＴＬＡ4も含まれる。それ故、本発明において用いるＣＴＬＡ4なる語には、ＣＴＬＡ4Ｉg、すなわちＩgＧ1の定常領域とＣＴＬＡ4受容体の細胞外結合ドメインとを組み合わせた、組換え可溶性融合タンパク質も含まれる。本発明の実施態様において、免疫系協同刺激現象を阻害する物質は患者のサイトカインプロフィールも変化させて、被封入細胞または組織を患者の免疫系から保護する。「サイトカインプロフィール」なる語は、ある時刻に、患者の中で産生されたサイトカインの種類および各種サイトカインの量を意味する。サイトカインは白血球によって放出される、免疫効果を有するタンパク質である。サイトカインの例には、（γ−インターフェロンのような）インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン（ＩＬ）1、ＩＬ-2、ＩＬ-4、ＩＬ-6、およびＩＬ-10が含まれるが、これらには限定されない。例えば、該物質は患者のγ−インターフェロンの産生を増加させる物質であり得る。患者のサイトカインプロフィールを変化させて、患者に移植した、被封入細胞または組織を保護する物質の例はＣＴＬＡ4Ｉgである。別の実施態様では、免疫系協同刺激現象を阻害する物質は補体を結合する。補体を結合する物質は、患者に移植した、被封入細胞または組織の生着を長引かせる。補体を結合する物質の例は、ＣＴＬＡ4Ｉgである。本発明はさらに、患者に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞または生きた細胞を具備する組織を封入することと、 b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量のＣＴＬＡ4で患者を処置することを具備してなる方法を提供する。生きた細胞または組織の移植に有用な半透膜を具備する装置は当業者に周知であり、このような装置は全て、本発明に用いることができる。本発明に有用な装置は、様々な素材から構成され、様々な形状にすることができ、このような素材および形状は当業者に周知である。本発明に適用する該装置は全て、患者と素材との生体適合性、移植部位、移植が血管内または血管外の何れであるのか、移植法、入手可能性、および経済性を含む要素に基づいて選択し得るが、要素はこれらに限定されない。装置に適切な形状の例には、中空の繊維、円盤および球体が含まれるが、これらに限定されない。適切な素材には、アガロースハイドロゲル、プラスチック、重合体、およびポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。装置は、一以上の素材から構成されていてもよい。本発明の好適な実施態様において、該装置はミクロカプセルである。本明細書において用いられる、「ミクロカプセル」なる語は、全てのポリアミノ酸球体カプセルを意味する。本発明書に明示されるミクロカプセルおよびそれらの製造方法は当業者に周知であり、単層、二重層、または多層ポリアミノ酸の他に、一層以上のアルギネートを具備するポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。前述した本発明の方法中の生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織は、任意の生きた細胞源から得ることができる。ある実施態様では、生きた細胞または組織は異種のドナー、すなわち生きた細胞または組織を移植する患者とは種が異なる対象から得られる。別の実施態様では、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織は、同種のドナー、すなわち生きた細胞または組織を移植する患者と種が同じ対象から得られる。さらなる実施態様において、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織は、それらを移植した患者から得られる。すなわち、とりわけそれらは患者から採取された後、装置の中に封入され、移植によって患者に戻される。例えば、採取した後、患者に移植して戻す前に、患者から採取された生きた細胞に遺伝子工学を施してもよい。生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織は、どのようなドナーから採取してもよい。ある実施態様では、ドナーは哺乳類である。例えば、このような哺乳類ドナーは子ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウスまたはヒトであってもよい。生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織は、ブタの新生児のような哺乳類の新生児から採取してもよい。本明細書に記載した、本発明の方法の患者は、生きた細胞を移植することが望まれる患者であれば、どのような患者であってもよい。ある実施態様では、患者はヒトである。もし患者がヒトであれば、ある実施態様においては、生きた細胞またはそれらを含有する組織は、哺乳類、例えばヒトから得られる。他の実施態様では、患者は家畜である。本明細書において用いられる、家畜とはヒトの支配が及ぶ全ての動物である。例えば、家畜には、ヒトによって飼育され、ヒトが消費するための産物を得るための手段として用いられる農業用動物が含まれる。このような産物には、肉、ミルク、および皮が含まれるが、これらに限定されない。家畜の例には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマおよびニワトリが含まれるが、これらに限定されない。本発明を適用する上で有用な家畜は、成熟した動物、未成熟な動物、またはその他の任意の発達段階にある家畜であり得る。患者が家畜である場合における、ある実施態様では、生きた細胞は家畜の成長を促すホルモンを分泌する細胞を具備する。このようなホルモンは、当業者には周知であり、成長ホルモンおよびインシュリンのようなホルモンが含まれる。ある実施態様においては、遺伝子工学によってホルモンを分泌させることにより、このようなホルモンを分泌する生きた細胞にする、。すなわち、それらはホルモンをコードする遺伝子を含むように遺伝子工学を施され、該遺伝子を発現することができる。前述した、本発明の方法では、ある実施態様における生きた細胞は、生物学的に活性な物質を分泌する細胞を具備する。本明細書で用いられる「生物学的に活性な物質」とは、患者に生理的な応答を生じせしめ得る任意の物質を意味する。生物学的に活性な物質は、該物質を産生する細胞が移植される患者に応答を生じせしめ得る。生物学的に活性な物質を分泌する細胞は当業者に周知であり、そのような細胞は全て本発明において用い得る。ある実施態様では、生物学的に活性な物質を分泌する細胞は内分泌細胞である。内分泌細胞は当業者に周知であり、インシュリン産生細胞、肝細胞、上皮小体細胞、および下垂体細胞が含まれるが、これらに限定されない。別の実施態様においては、生物学的に活性な物質を分泌する細胞は、神経外胚葉細胞（neuroect odermal cells）である。神経外胚葉細胞は当業者に周知であり、副腎細胞およびリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様においては、細胞は、生物学的に活性な物質を分泌するように遺伝子工学を施される。例えば、細胞を移植された患者を治療するのに有用な生物学的に活性な物質を分泌するように、細胞に遺伝子工学的処理を行ってもよい。このように、本方法は癌およびＨＩＶ感染を含む症状（ただし、これらには限定されない）を患う患者を治療するための、有用且つ有利な新規薬物供給システムを提供する。患者が癌を患っている場合には、移植される生きた細胞は、例えば、インターロイキン−2、サイトカイン、またはリンホカインを分泌するように、遺伝子工学的処理がなされる。患者がＨＩＶに感染している場合には、移植される生きた細胞は、例えば、Ｔ細胞成長因子またはＨＩＶＴ細胞受容体のような、患者内でリンパ球産生を刺激する物質を分泌するように遺伝子工学的処理がなされる。本発明の方法においては、装置の半透膜の透過性は当業者に周知の因子、例えば封入される細胞または組織のサイズ、膜を透過して細胞または組織を維持するために必要な任意の物質のサイズ、および装置を透過することが望まれる、細胞によって分泌される生物学的に活性な任意の物質のサイズに基づいて決定される。ある実施態様では、半透膜はリンパ球を透過させない。別の実施態様では、半透膜はリンパ球および免疫グロブリンを透過させない。免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない半透膜を用いれば、患者の免疫グロブリンおよび／またはリンパ球と生きた被封入細胞との接触を阻止し、それによって、そのような接触によって生じるかもしれない、被封入細胞の破壊を阻止する。本発明においては、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置するためには、任意の適切な処置法を用いてもよく、そのような方法は当業者に周知である。例えば、薬学的に受容できる組成物の形態で、注射によって該物質を患者に投与してもよい。もし該物質が、ＣＴＬＡ4であれば、ＣＴＬＡ4Ｉgを直接患者に投与してもよく、または別の実施態様では、ＣＴＬＡ4を分泌するように、遺伝子工学的処理を行った細胞、すなわちＢ7分子に結合することができる分子をコードする遺伝子を含有し、該分子を発現するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植してもよい。本発明の別の実施態様では、物質による患者の処置は、物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植することを含む。物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植する場合には、移植の前に、半透膜を具備する装置の中にこのような細胞自体を封入してもよい。別の実施態様では、物質を分泌する細胞を含有する装置の半透膜は、免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させず、こうしなければ、このような接触によって生じたであろうこれらの細胞の破壊を阻止する。前述の実施態様において、物質による処置は、生きた細胞または組織の移植の前、後、または同時に行ってもよい。本発明の別の実施態様において、物質による患者の処置は、移植の前に、生きた細胞または組織を含有する装置の中に、物質を分泌するように遺伝子工学的な処理を行った細胞を封入することを具備する。本発明のさらなる実施態様において、物質による患者の処置は、患者に移植される生きた細胞に、移植の前に、物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行うことを具備する。患者の免疫系が前記被封入細胞または組織に応答するのを阻害するのに有効な量の物質は、患者に移植する生きた細胞または組織の量、および患者の大きさおよび体重を含む、当業者に周知の因子によって決定されるが、これらに限定されない。本発明の方法によって、生きた被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を阻害することには、患者の免疫グロブリン産生を阻害すること、および患者のマクロファージの活性化を阻害することが含まれる。そうでなければ、このような免疫グロブリンおよび活性化されたマクロファージは、生きた被封入細胞または組織と反応することができ、該生きた被封入細胞または破壊してしまうかもしれない。本発明はまた、患者の糖尿病を治療する方法であって、 a）生きた被封入インシュリン産生細胞を得るために、半透膜を具備する装置内に生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を封入することと、 b）患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ（a）で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c）ステップ（b）で得られた、多数の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法を提供する。免疫系協同刺激現象を阻害する物質は当業者に公知であり、このような物質は全て、本明細書に記載した糖尿病治療法において使用し得る。本糖尿病治療法に用い得る免疫系協同刺激現象を阻害する物質は、上述されている。ある実施態様では、該物質はＣＴＬＡ4である。生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織は、任意の既知のインシュリン産生細胞源から、またはインシュリン産生細胞を具備する組織源から得ることができる。本発明のある実施態様では、生きたインシュリン産生細胞は、膵臓の膵島組織から得られる。別の実施態様では、生きたインシュリン産生細胞は、移植の前に、インシュリンを分泌するように、遺伝子工学的処理を行った細胞を具備する。該生きた細胞または組織は、異種のドナー、同種のドナー、または移植前の患者から得ることができる。細胞を患者から得る場合、ある実施態様においては、患者から取り出した後、移植によって患者に戻す前までに、該細胞に遺伝子工学的処理を行って、インシュリンを産生させる。膵臓の膵島組織のような生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織は、任意のドナーから採取してもよい。ある実施態様では、ドナーは哺乳類である。このような哺乳類のドナーは、例えば、子ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、またはヒトであってもよい。膵臓の膵島組織のような生きたインシュリン産生細胞、またはインシュリン産生細胞を具備する組織は、ブタの新生児のような哺乳類の新生児から採取してもよい。ある実施態様では、本発明に用いられる生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織はブタ新生児の膵臓細胞を具備する。本明細書に記載した、本発明の方法の患者は、生きた細胞を移植することが望まれる患者であれば、どのような患者であってもよい。ある実施態様では、患者はヒトである。もし患者がヒトであれば、ある実施態様においては、生きた細胞またはそれらを含有する組織は、哺乳類、例えばヒトから得られる。上述したように、半透膜を具備する装置は当業者に周知であり、このような装置は全て、本糖尿病治療法に用い得る。該方法の別の実施態様では、装置は中空の繊維、円盤および球体である。本方法の別の実施態様において、上述したように装置はミクロカプセルである。本発明書に記載された糖尿病治療法は、糖尿病治療が望まれている任意の患者に適用し得る。本発明による患者の糖尿病治療法の実施態様の１つにおいて、該患者はインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を患っている。該方法の別の実施態様では、患者は哺乳類、例えばヒトである。患者の糖尿病を治療するのに有効な、患者に移植した、生きた被封入インシュリン産生細胞の量は、患者の体重、および糖尿病の程度のような、当業者に既知の要素に依存するが、要素はこれらに限定されない。本糖尿病治療法における装置の半透膜の透過性は、上述した透過性を決定するための諸因子を含めた、当業者に公知の因子によって決定される。該方法の別の実施態様では、半透膜は免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない。本糖尿病治療法における、免疫系協同刺激現象を阻害する物質による患者の処置には、上述の処置法が含まれる。もし該物質が、ＣＴＬＡ4であれば、該処置は、例えば注射によって、患者にＣＴＬＡ4Ｉgを投与することを含む。上述したように、物質を用いた処置には、該物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植することが含まれる。移植の前に、このような遺伝子工学的処理を行った細胞自体を、半透膜を具備する装置内に封入してもよい。物質を用いた処置が、半透膜を具備する装置内に被封入患者の細胞であって、該物質を分泌するように遺伝子工学的処理を行った細胞を患者に移植することを含むのであれば、別の実施態様において、該装置は免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない。ＣＴＬＡ4のような、免疫系協同刺激現象を阻害し得る物質で患者を処置する前述の方法においては、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植する前、後、または同時に処置を行ってもよい。本糖尿病治療法の別の実施態様においては、免疫系協同刺激現象を阻害し得る物質で患者を処置することには、移植の前に、生きたインシュリン産生細胞または組織を含有する装置の中に、該物質を分泌するように遺伝子工学的な処理を行った細胞を封入することが含まれる。本糖尿病治療法の別の実施態様においては、物質で患者を処置することには、移植の前に、該物質を分泌するように、生きたインシュリン産生細胞に遺伝子工学的な処理を行うことが含まれる。本糖尿病治療法によって、患者の免疫系が、生きた被封入インシュリン産生細胞に対して応答するのを阻害することには、患者内での免疫グロブリン産生の阻害、およびマクロファージの活性化の阻害が含まれ、さもなければ生きたインシュリン産生細胞または組織と反応して、これらは破壊されるかもしれない。本発明は、以下のセクションの「実験の詳細」からさらに良く理解されるであろう。しかし、当業者であれば、そこに議論された具体的な方法および結果は、さらにその後に続く請求の範囲においてさらに完全に記載されている本発明を限定する意図ではなく、むしろ単に説明を加えるものであることが容易に理解されよう。実験の詳細ミクロカプセルデザインの改良自然発症性糖尿病ＮＯＤマウス中のラット膵島を殆ど永久的に生存させることができる、改良したポリ−Ｌ−リジン−アルギネートミクロカプセル化処方は、「二重壁」ミクロカプセルである（図１および２）。該二重壁ミクロカプセルは、従来のミクロカプセルに比べて、耐久性があり、カプセル壁の損傷が少なく、測定した膜の透過性はおよそ100,000Ｋdであり、(ＩgＧおよび148,000Ｋdの蛍光性デキストランを透過させる従来デザインのカプセルとは異なり)(9,19,20,118)Ｉ gＧを排除する。これらのデータは、ＩＤＤＭのヒトの中で永久的に使用するのに、カプセル化膵島異種移植が適切であることを支持する。ポリ−L−リジン（ＰＬＬ）濃度は、ＰＬＬ−アルギネートミクロカプセルの透過性を変化させるミクロカプセル化した膵島異種移植片の生着が、ミクロカプセルの透過性によって影響を受けるであろうと推測された。我々は、ミクロカプセル処方中のＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リジン）濃度を増加または減少させることによって、ミクロカプセルの透過性が変化するかもしれないということを見出した。エアジェットシステムを介して、赤血球細胞をアルギネート中にカプセル化し、続いてＰＬＬを含む様々なポリアミノ酸とともにイインキュベートした。次に、該赤血球細胞を溶解させて、同時に処置した対照とともに、480nmで、ヘモグロビン（ＭＷ64,500）の流出を分光光度的に経時測定した。透過性係数は、以下の式:（2.303^*Ｃf^*Ｖt^* Ｓ）／（Ｃi^*Ａt）（ここで、ＣlおよびＣfは、開始時および終了時のヘモグロビン濃度、ＶtおよびＡtは、各々カプセルの総容積および総面積、Ｓ＝ln（Ｃt-Ｃf）／（Ｃi−Ｃt ）の傾きである）（119）に従って計算した。ＰＬＬの置換（ポリ−Ｌ−オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、およびヒスチジン）では生きたカプセルは得られなかった。ＰＬＬの分子量の変化は、透過性に影響を与えなかった。ＰＬＬの濃度は、カプセルの拡散を変化させる、最も重要な因子であった。これらの結果は、他の研究者による最近の発見によって支持される（119）。ＰＬＬ濃度を４倍増加させたカプセルから生じるヘモグロビンの流出は13分の１に減少した( 表１参照)。実験では、100,000Ｋdの透過性のミクロカプセルに対して、70,000 Ｋd未満の透過性のミクロカプセルを用いると、ＮＯＤ中のカプセル化したウサギ膵島の生着が延長する（図３参照）。ミクロカプセルは、宿主の感作を阻止または遅延させるミクロカプセルが、ラット異種膵島を長期間保護する機序を明らかにするために、１組の糖尿病ＮＯＤを生理的食塩水またはルイスラット膵島(腹腔内に200個 )または10⁶個のルイスラット脾臓細胞（腹腔内）で前処理した実験を行った。14 日後、予め感作させたＮＯＤおよび対照ＮＯＤに、カプセル化ルイス膵島を異種移植した。図４および５に示されているように、膵島の前処理および脾臓細胞の前処理によって、移植片はすぐに拒絶されたが、予め感作させなかったＮＯＤはカプセル化膵島異種移植片を長期間受容した。これらのデータは、ミクロカプセルの主要な機能は、応答のエフェクターアーム(arm)から移植片を保護するというより、むしろ宿主の感作を阻止することであることを示唆している。このように、膵島の免疫原性を減少させる方策は、膵島のカプセル化と協働効果を示すかもしれない。ＮＯＤ中での、カプセル化膵島同系、同種および異種移植片の生着の比較ミクロカプセル化によって、拒絶時と同様にＮＯＤ細胞がミクロカプセル周囲へ集まりながら、ＮＯＤ中の膵島異種移植片が、ルイスラット膵島の場合79±15 日（Ｎ＝8）（Ｘ±ＳＥ）、ウサギ膵島の場合20±2日（Ｎ＝7）、イヌ膵島の場合14±4（Ｎ＝3）生着することを我々は明らかにした（表２）。またＮＯＤは、カプセル化したＢalb／c同種膵島を73±31日（Ｎ＝4）で拒絶し、カプセル化したＮＯＤ同系膵島を44±7日（Ｎ＝4）で拒絶した（表２）。しかし、これらの同種および同系移植片の生検により、拒絶時において、宿主のマクロファージがミクロカプセルに殆ど付着しておらず、遊離の腹腔細胞（今のところ特定されていない）が存在することが示された。このように、カプセル化膵島異種移植の拒絶は、このモデルにおいては、同系および同種移植の拒絶とは区別される。我々は、脾臓内に投与した、非カプセル化膵島の生着と比較して、ミクロカプセルが、ＮＯＤ中の膵島異種移植片を機能的に、より長期間生着させることも見出した。同じことが、ＮＯＤへの膵島の同種および同系移植片に当てはまる（表３）。p<.01vs．脾臓:＠＝平均±ＳＥＭ．ＣＡＰ／Ｉ.Ｐ＝腹腔内へのミクロカプセル化膵島の移植; 脾臓＝脾臓被膜下への非カプセル化膵島の移植移植後4−50日目に、糖尿病を自然発症したＮＯＤマウス腹腔の移植部位から、機能しているカプセル化異種移植片および拒絶されたカプセル化異種移植片を生検した。対照には、正常なマウス腹腔液、および空のカプセルまたは機能しているラット膵島を入れたカプセルを有するＮＯＤマウス（正常血糖値のレシピエントからの腹腔液を含めた（20,74）。しかし、14日および50日目の拒絶時に、細胞数は劇的に増加した。生検したカプセルをピペッティングすることによって、接着した細胞を遊離させた。フローサイトメトリー分析によって、非接着性腹腔細胞のうち20−50％がＢ220+（Ｂ細胞）であり、遊離の腹腔細胞およびミクロカプセルに接着した細胞の大部分が、Ｍac1+であることが明らかとなった（20,7 4）。ＣＤ4＋およびＣＤ8＋の腹腔細胞のパーセントは低かった（4−9％）。ＦＡＣＳ分析によって、ミクロカプセル中の異種膵島が拒絶される間に、腹腔Ｍac 1細胞の表現型が、大多数を占めていたＧran1^-からＧran1⁺に移行した（vs.空のカプセル）。（20,74,120）。これらの発見は、免疫細胞化学によって確認した（20,74）。さらに、免疫組織化学は、ＩgＧおよびＩgＭがミクロカプセル周囲に存在し、並びにＩＬ −1およびＴＮＦαがミクロカプセル周囲と内部の療法に存在することを明らかにした（20,74）。ＮＯＤから得たカプセル化膵島異種移植片の生検試料中のサイトカインメッセンジャーＲＮＡ（mＲＮＡ）の分析ＮＯＤによってカプセル化膵島が破壊される病因を明らかにするために、レシピエントＮＯＤの腹腔細胞からmＲＮＡを抽出して、以前記述したように(121)、ＩＬ-2、ＩＬ-4、およびＩＬ-10のmＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ノーザントランスファー、およびβアクチンの3'未翻訳領域に対するプローブとのハイブリダイゼーションを検査することによって、ＲＮＡサンプルの統一性を評価した(121)。拒絶されている異種移植片の大多数で、ＩＬ-4が検出された。ＩＬ-10の発現は、一定していなかった（表４）。自己免疫によってＮＯＤ同系移植片（および１つの同種移植片）が崩壊する間、ＩＬー2が検出されたが、拒絶されている異種移植片では極めて希にしか検出されなかった。これらのデータは、拒絶されたカプセル化膵島異種移植中の一次的Ｔ細胞応答が「Ｔh2様(Ｔh2- Ｌike)」であることを示している。この解釈は、活性化された、多数のマクロファージおよび免疫グロブリンが、ＮＯＤ中の拒絶されたカプセル化膵島異種移植片と会合しているという観察と一致するものである。このように、宿主のＡＰＣによって、クラスII経路を介して加工された、可溶性の（すなわち流出した）異種抗原によって、カプセル化膵島異種移植片の拒絶が始まることはあり得る。次に、これらのＡＰＣはＢ7／ＣＤ28依存性の機構を介して、Ｔh2細胞を活性化する。腹腔中の抗原−抗体複合体の形成によって、マクロファージを活性化し、カプセル化膵島に対して直接的に有害なサイトカインが放出されると我々は仮定する。Ｃap＝カプセルに付着している細胞^* ＦＣ＝遊離腹腔細胞 φ＝ＲＴ−ＰＣＲ（−）は検出不能、（＋）検出可能ＮＯＤ−ＭＨＣが、カプセル化膵島移植片の拒絶に必要であるＮＯＤおよび（ＳＺＮ−糖尿病性）Ｂ10.Ｈ−2^g7（ＮＯＤ−ＭＨＣに連関した疾病の対立遺伝子を発現している）は、ともにカプセル化ラット膵島を拒絶したが、ＮＯＤ.Ｈ−2^bマウス（ＭＨＣに連関していない糖尿病感受性遺伝子を全て発現している）は（Ｂ10対照と同様に）＞100日間以上カプセル化ラット膵島を受容した（75）。Ｂ10.Ｈ−2^g7マウスおよびＮＯＤ4−2^bマウスが、ともに糖尿病を自然発症しないので、このことから糖尿病感受性とは異なる、カプセル化膵島に対する破壊的な応答に、ＮＯＤ−ＭＨＣが寄与しているかもしれないと推測される（ 20,75）。ＳＺＮによるＢＩＯ.Ｈ−2^g7マウスの処置が、自己免疫応答を開始させたかもしれないという可能性を考えたが、2／2の非糖尿病（ＳＺＮ無処置）ＢＩＯ.Ｈ−2^g7マウスが、カプセル化ラット膵島を拒絶した（生検の組織検査による、第60日）（75）。ＣＤ8＋の除去は、ＮＯＤ中のカプセル化膵島異種移植を防御しないカプセル化ウサギ膵島のＮＯＤレシピエントをモノクローナル抗体53.6.7，（５日目に100μg、その後週に２回、腹腔内）（抗−ＣＤ8）またはサイクロスポリンＡ（ＣyＡ）（毎日30mg／kg、皮下）の何れかで処置したが、移植片の生着には全く影響がないことが分かった（表２）。ＣＤ8＋細胞の除去は、ＮＯＤの脾臓および腹腔細胞のフローサイトメトリーによって確認された。失敗した移植片の生検によって、強烈な宿主の細胞応答、および元通りのミクロカプセル中で死滅した細胞が見出された。これらのデータは、非カプセル化膵島異種移植の拒絶において、（ＣＤ8＋ではなく）ＣＤ4＋Ｔ細胞が主要な役割を果たしているという以前の観察と一致している（83）。これらは、Ｔh2 ＮＯＤによるカプセル化膵島異種移植片の拒絶機構ともほぼ一致している。協同刺激の阻害により、糖尿病ＮＯＤ中のカプセル化膵島異種移植片の寿命が延びる糖尿病ＮＯＤレシピエントにモノクローナル抗体ＧＫ1.5を投与することによって、ＣＤ4＋ヘルパーＴ細胞を阻害すると、カプセル化ラット膵島およびイヌ膵島の生着が、ともに顕著に増大する（＞100日）ことが以前示された（7,84）（図６）。本明細書の実験は、ＣＴＬＡ4Ｉg（０日目に腹腔内へ200μgおよび90 日目までＱＯＤ）でＮＯＤマウスを処置すれば、カプセル化ウサギ膵島の生着が、20±２日から98日±25日まで（p＜.05）有意に延びることを示している（表２および図７、８参照）。このことは、カプセル化膵島異種移植片に対するＮＯＤの応答においては、抗原提示の「間接的」経路が優勢であることを示唆している。ＳＺＮ糖尿病マウスにヒト膵島を移植したときの発見とは異なり（12）、ＣＴＬＡ4Ｉgだけでは、ＮＯＤ中（脾臓または腎臓被膜下）の非カプセル化ウサギまたはラット膵島の生着は増大せず（表２）、移植片の生着を延ばすためには、カプセル化とＣＴＬＡ4Ｉg が、ともに必要であったことを示唆している。さらに、本明細書の実験は、β細胞のインシュリンプロモーター上でＣＴＬＡ 4を発現しているＩＮＳＣＴＬＡ4マウス（雌）からのカプセル化膵島は、ＮＯＤ中で長期間機能することを示している（図９参照）。非カプセル化ＩＮＳＣＴＬＡ4膵島は、6−7日でＮＯＤによって拒絶された。これらのデータは、ドナー膵島のカプセル化と限定的な宿主免疫の修飾を組み合わせることによって、近縁関係にない膵島異種移植片が永続的に生着するかもしれないということを示唆している。これらのデータは、ドナー抗原がミクロカプセルから流出して、Ｂ7／ＣＤ28依存性の機構を介して、ＣＤ4＋Ｔ細胞を活性化するＡＰＣによってプロセッシングされるという作業仮説をも支持している。このモデルでは、ＣＴＬＡ4 −トランスジェニックマウスは、インシュリンとともにＣＴＬＡ4を分泌し、ＣＴＬＡ4が抗原提示を阻害する。興味深いことに、このトランスジェニックモデルでは、雄マウスに比べて雌マウスの方がＣＴＬＡ4を多く分泌する（pers.comm .）。ＮＯＤ−Ｓcidマウスは、ラットおよびウサギ膵島異種移植片を長期間受容するこれらの実験は、ＮＯＤ-ＳcidマウスはＭＬＤ−ＳＺＮ糖尿病（30mg／kg毎日５回）に対して感受性があることを実証し、ラットおよびウサギの非カプセル化およびカプセル化膵島の異種移植によって、ＮＯＤ−scid糖尿病が50日間以上回復することを明らかにしている（図10,11,および12、および表２参照）。このように、ＮＯＤ−Ｓcidマウスは、カプセル化膵島が拒絶される機構を研究するために、抗体および／またはＴ細胞を導入するための適切なレシピエントモデルとなるであろう。我々は、51,68,および70日目に、ミクロカプセル化ウサギ膵島を与えられた４匹のＮＯＤ−Ｓcidのうち３匹で、高血糖が再発することに気付いた。同時に行った、空のミクロカプセル対照にでは、50日目に３つのミクロカプセルのうちの１つが破損し、２つが元のままであることが示されたので、技術的な理由により崩壊したカプセルおよび細胞の最小限の破壊が明らかとなる。ＣＴＬＡ4Ｉgを用いた協同刺激の阻害方法：管を注入し、コラーゲナーゼで消化することによって、成熟ニュージーランドウサギの膵島を単離した。ウサギ膵島（約2000個）を２重壁、ポリ−Ｌ−リジンアルギネートミクロカプセル中にカプセル化し、以前に報告したように（7,20）ＮＯＤの腹腔内に異種移植した。対照には、以前に記載したように（7,20）、脾臓または腎臓の被膜下に異種移植した約2000個の非カプセル化ウサギ膵島を与えた。ブリストル−マイヤーズ−スクイブ、シアトル、ワシントン州（Ｂristol-Ｍy ers-Ｓquibb、Ｓeattle、ＷＡ）から購入したマウスＣＴＬＡ4Ｉgを１日目に200 μg腹腔内投与し、続いて14もしくは92日間または移植が拒絶されるまでＱ.Ｏ. Ｄ.で投与した。同様にカプセル化したウサギの膵島を与えられ（腹腔内）、他には処置を受けなかったＮＯＤ、１日目およびそれ以後毎日30mg／kgのサイクロスポリン（皮下）を与えられたＮＯＤ、または５日前、２日目およびそれ以後毎週100μg（腹腔内）の抗ＣＤ8モノクローナル抗体＃53.6.7.7（Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.）を与えられたＮＯＤが、対照に含まれる。メタファン（metafane）麻酔および無菌技術を用いて、長期間機能している腹腔ミクロカプセルの生検を定期的に行った。100−200のミクロカプセルを採取すれば、移植による正常な血糖を変化させずに、組織学的な光学顕微鏡による研究が可能であった。カプセル化ウサギ膵島の異種移植が成功してから180日後に、長期間機能しており、生検で確認を行った、１匹のＣＴＬＡ4Ｉg処置ＮＯＤに脾臓除去手術を施した。これらの脾臓細胞を（10⁷）を２匹のナイーブ糖尿病ＮＯＤの腹腔に、受動的に（passively）導入し、その後脾臓細胞導入後10−14日後に、同様にカプセル化した、新鮮なウサギ膵島（ドナータイプ、ニュージーランド、非近親交配）を腹腔内に与えた。グループ間の統計的な差は、スチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを用いて評価した。結果：ＣＴＬＡ4ＩgでＮＯＤを処置することにより、膵島をミクロカプセル化しただけのもの、または宿主をＣＴＬＡ4Ｉgで処置しただけのものと比べて、ポリ−Ｌ −アルギネートでミクロカプセル化した、自然発症性糖尿病ＮＯＤ腹腔中のドナーウサギ膵島異種移植片の生着期間が延びた（ＣＡＰ／Ｉ.Ｐ.）。最も長期間機能した移植片は、92日間ＣＴＬＡ4ＩgＫを処置したＮＯＤ中のものであったが、平均移植生着期間は、ＣＴＬＡ4Ｉgを14日間だけ与えたＮＯＤの生着期間と有意な差はなかった(表５参照)。対照的に、サイクロスポリンＡ（ＣyＡ）、ＣＤ8特異的なモノクローナル抗体（53.6.7.7）、またはＣＴＬ4ＩgだけでレシピエントＮＯＤを処置しても効果がなかった（表５参照）。長期間生着しているカプセル化ウサギ膵島をＮＯＤから生検することにより、ミクロカプセルが元通りであること、ドナー膵島が生きていること、およびカプセル周囲（per-capsular）にＮＯＤ細胞応答が存在しないことが裏付けられた（図13参照）。ＣＴＬＡ4Ｉg処置した、不成功のカプセル化ウサギ膵島異種移植片を生検すると、殆どが崩壊した（破壊した）ミクロカプセルがであり、生きているドナー膵島は殆どなく、カプセル周囲の細胞反応が最少であることが示された。拒絶時に脾臓内のウサギ膵島を生検すると、核および細胞質の損傷、並びに死亡した膵島が示された。腹腔内カプセル化ウサギ膵島を与えられた対照、さらにＣyＡまたは53.6.7.7処置されたレシピエント、または全く処置されなかったものから、移植後12-52日目の拒絶時に生検することによって、以前記載したように(143,3,14 4)、全て一様に、カプセル周囲にマクロファージ、好中球、およびリンパ球が顕著に集まっていることが示された。受動的な導入から10-14日後のカプセル化ウサギ膵島、または長期間血糖値が正常なＮＯＤの脾臓細胞（10⁷個）を与えられたＮＯＤはともに、10-12日目に移植片を拒絶し（90日間ＣＴＬＡ4Ｉg処置を中止した、機能しているカプセル化ウサギ膵島を有する）、移植片の生検組織は未処置の対照ＮＯＤと区別できなかった。ＮＯＤの全実験群の膵臓を生検することによって、すべて一様に膵島が消失し、血管周囲領域にリンパ球が時折集積していることが示された。s＝屠殺、機能している移植 d＝死亡、機能している移植^* p＜.005vs．第１群（"t"−テスト）^** p＜.001vs．第１群（"t"−テスト）ＣＴＬＡ4Ｉg、１日前に200μg、その後Ｑ.Ｏ.Ｄ.、i.p．１日前にＣyＡ30mg／kg、その後Ｑ.Ｄ.、s.c． 63.6.7.7−５日前、２日目、その後毎週i.p.、100μg、 (r)＝腎臓被膜下、非カプセル化 (s)＝脾臓皮膜下＠＝p＝.31vs．第４群、ＡＮＯＶＡ新生児ブタ膵島の大規模な単離我々は、ブタの新生児が、最も有望な異種のドナー膵島の採取源であると考えている。ブタの新生児ドナーから、生きた機能的膵島を多数、再現的に単離する方法が開発されてきた（146,147）。この手法を用いることにより、各ブタのドナーから30,000−100,000個の膵島が得られるであろう（図14）。ブタ新生児の膵島細胞は、ミクロカプセル化後、インビトロでインシュリンを分泌し続ける（図15）。これらのブタ新生児の膵島は、ブタ新生児の膵臓細胞を実際に分散させたものであるが、該細胞は再び集まって、約5−10％のβ細胞を有する「膵島」様の楕円体を形成する（図16）。これは、成熟ブタの膵島中のβ細胞濃度である 1−2％に比べて有意に高い。さらに、異種移植から100日経過した後、これらの「膵島」を生検すると、インシュリン強陽性膵島細胞の数が増大していることが分かる（図17）。これらのブタ新生児の膵島は、移植後ミクロカプセル中で分化、増殖するように思われるという点で、成熟膵島に比べて、さらに利点がある。カプセル化および非カプセル化ブタ新生児膵島はともに、ＮＯＤ−ＳcidマウスのＳＺＮ−糖尿病を回復させる最近、Ｓcid変異がＮＯＤバックグラウンドに対して、戻し交雑され、免疫不全ＮＯＤ−Ｓcidマウスが得られた（66,67,68,69）。これらのマウスは、Ｓcid 変異に関してはホモ接合体であり、Ｔ細胞受容体および免疫グロブリン遺伝子を配列し直すことができない（48,79）。その結果、これらのマウスはＴリンパ球およびＢリンパ球を欠く。ＮＯＤ−Ｓcidマウスは、糖尿病を自然発症しないが、低量のストレプトゾトシンを繰り返すことにより（ＭＬＤ−ＳＺＮ）、糖尿病にすることができるよう（67,68,69）。ＮＯＤ−Ｓcidは、糖尿病ＮＯＤからのリンパ球導入時に、糖尿病の発症に必要とされるＮＯＤＭＨＣ遺伝子およびその他の遺伝子を発現する。ブタ新生児膵島が機能的に生存していることを証明するために、我々はＳＺＮ糖尿病にそれらを異種移植したところ、ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＤ−Ｓci dマウスの高血糖が100日以上正常化した（図18,19,20）。このデータは、免疫的な攻撃の非存在下、種が異なるレシピエント中で、ブタ新生児の膵島が生き続け、生理的に機能する期間が延びることを示している。我々は、ＮＯＤレシピエント中のカプセル化ウサギおよびブタ膵島の生着期間がＣＴＬＡ4Ｉgによって有意に延びるが、ＣＴＬＡ4Ｉg単独では、ＮＯＤマウス中の非カプセル化膵島異種移植片が保護されないことを見出した（表６および図 21）。ＩＰ＝腹腔内ＣＴＬＡ4Ｉg、200mgＩ.Ｐ.,ＱＯＤ^* ＝p＞.001vs.ＭＣ単独 a）×92日 b）×14日 c）×21日 (s)＝生検のため屠殺長期間機能しているカプセル化ブタ新生児膵島異種移植片の生検により、元通りのミクロカプセルの中で、ブタ膵島が生きていることが示され、長期間血糖値が正常であるＮＯＤの生検組織には、宿主ＮＯＤのカプセル周囲の反応がないことが観察された（図22および23）。このモデルにおいて考えられる、ＣＴＬＡ4Ｉgの作用機構を分析するために、我々は、補体を結合しないＣＴＬＡ4Ｉgの変異体（ＣtＬa4Ｉg^*）を最近考案して、代わりに用いた（145）。図24に示されているように、我々の研究により、ＣＴＬＡ4Ｉ g^*は、カプセル単独のもの以上には、移植片の生着期間を延ばさないことが明らかとなった。該データは、従来のＣＴＬＡ4Ｉgまたは変異ＣＴＬＡ4Ｉg^*の何れかによって、顕著に延びるという、マウス異種移植片を用いた観察とは異なっている。これらの結果は、ＣＴＬＡ4Ｉg^*によって移植片の生着期間が延びた機序は、同種膵島移植と異種膵島移植の場合とでは異なるかもしれないということを示唆している。該結果は、患者中のサイトカインプロフィールが、移植片を防御する方向に変化し得ることを示唆する。該実験で調べたシステムでは、従来のＣＴＬＡ4Ｉgは、宿主中のγ−インターフェロン産生を増加させることによって、移植片を保護するようにサイトカインの産生を変化させた。逆に、調べた該システムでは、ＣＴＬＡ4Ｉg^*処置によって引き起こされたＩＬ-10産生の増加は、移植を拒絶する方向に作用した。我々は、同一バッチのカプセル化ブタ新生児膵島を移植したが、ＣＴＬＡ4Ｉg または非補体結合性ＣＴＬＡ4Ｉg^*の何れかで処置した糖尿病ＮＯＤマウスのマッチングペアからの脾臓細胞による増殖応答も測定した（図25）。この実験では、ブタ新生児の膵島によって刺激されたとき（パネルＡおよびＢ）、正常ＮＯＤマウスまたは糖尿病ＮＯＤマウスは増殖しなかった。移植されなかったＮＯＤマウスの応答が一貫していない理由は、まだ分からないが、現在調査中である。空のカプセルは、どの脾臓細胞の増殖をも引き起こさなかったが、Ｔ細胞によって認識された膵島およびカプセル化膵島は、非常に小さいのでミクロカプセルから流出する。しかし、さらに多くの実験によって、このような解釈が確認されるであろう。通常のように、移植片を拒絶しているマウスからの脾臓細胞のバックグラウンド応答は（パネルＤ）、移植片を拒絶していないマウスからのもの（パネルＣ）より高かった。これらの結果は、カプセル化膵島を移植された両マウスからの脾臓細胞がインビボで感作されていることを示唆するが、ＣＴＬＡ4Ｉgを与えたマウスが拒絶の徴候を全く示さなかったという事実が得られて幾分驚かされた。これらの結果は、ＥＬＩＳＡによるリンホカインのためのブタ新生児膵島で刺激した培養液から、別の液体が存在したという可能性を示していなかった（図26）。これらの結果は、ブタ新生児の膵島を移植されたマウスによってのみ、リンホカインが産生されることを示している。さらに重要なことには、その移植を長期間受容したマウス（ＣＴＬＡ4Ｉgで処置した）からの脾臓細胞は、主としてＩＮＦγを産生し、低レベルのＩＬ-10を産生した。これらの結果は、ＣＴＬＡ4Ｉgが、ＩＮＦγを産生するＴ細胞を伴う、新生児のブタ膵島に対して長期間免疫寛容を引き起こしたことを示唆する。リンホカインがＩＬ-10に移行したとき、膵島異種移植片の拒絶が起こった。このように、移植片の生着にはＴh1様の応答が関与するが、移植片の拒絶にはＴh2様の応答が関与する。これらの発見は、我々の作業モデルと一致する（図27）。これらの結果は、ＩＬ-4が顕著であった、カプセル化した異種膵島を拒絶したマウス中の拒絶部位のmＲＮＡレベルを分析することによって得られた様子とは幾分異なっている。考察我々のデータに基づいて、ＮＯＤマウスによる、すなわち自己免疫によるミクロカプセル化異種膵島の拒絶に関与していると、我々が考える機構を記述するモデルを我々は提出する（図27）。明らかに、分泌されたインシュリンは２重壁ミクロカプセルの膜を透過し、移植されたマウスのグルコースレベルを調節する。膵島から流出または分泌された100,000mw（ＡgＸ）未満の他のドナータンパク質またはタンパク質断片がミクロカプセルから拡散し、樹上細胞内に取り込まれる可能性がある。樹上細胞は、ＭＨＣクラスII経路を介して、タンパク質をプロセシングし、クラスIIとペプチドＸの複合体および協同刺激分子をＣＤ4＋Ｔ細胞に提示する。適当なサイトカインの存在下で、ＣＤ4＋Ｔ細胞は活性化され、ＣＤ40Ｌを発現するＴh2細胞になる。ＡgＸを結合するＩgＭを表面上に有するＢ細胞は、ＡgＸを細胞内に取り込んで、Ｂ細胞表面上に発現されているＭＨＣクラスIIと結合するペプチドにプロセシングする。クラスIIと複合体化したＴh2特異的ペプチドＸはＢ細胞と結合し、ＣＤ40ＬとＣＤ40の相互作用がＢ細胞の活性化を引き起こす。Ｔh2リンホカインに誘導されて、活性化されたＢ細胞は形質細胞へと成熟する。形質細胞は、ＡgＸと複合体を形成する特異的抗体を分泌する。抗体は、極めて大きいのでカプセル内に入ることはできず、カプセル化した膵島を直接損傷を与えることはできない。しかし、カプセル化した膵島異種移植片を拒絶しているＮＯＤの腹腔内における主要な群であるマクロファージを補強および活性することに、抗体が関与していることはあり得る。腹腔内の特異的抗体は、カプセルから流出または分泌された抗原と複合体を形成することができるであろう。このような抗原−抗体複合体は、腹腔マクロファージの表面上に発現されているＦcＲに、効率的に結合する。複合体のＦcＲへの結合によって、マクロファージは活性化されて、ＩＬ−1、ＴＮＦαおよび一酸化窒素（ＮＯ）を含む種々の情報伝達物質を分泌し（122,123）、これらは全て膵島に有害な影響を与え、且つ非常に小さいので二重壁ミクロカプセルを透過する。抗原複合体による補体（c）の活性化によって、エフェクターアームはさらに増強され得るであろう。複合体に結合したＣ3bは、Ｃ3b受容体を介した複合体の結合を増加させることによってマクロファージの活性化を増強せしめ（124）、補体活性化の間に放出された、Ｃ3bのような小ペプチドは、局所的炎症応答を引き起こし、それによって、さらに多くのマクロファージを腹腔に引き寄せる（125）。我々はドナー膵島のミクロカプセル化とＮＯＤのＣＴＬＡ4Ｉgによる処置が、膵島異種移植片の生着を延長させるという相乗効果を実証した。我々のデーダは、生検によって確認された、ＮＯＤへの、近縁関係にない膵島異種移植片の生着期間としては、これまでの報告のなかで最長であることを示している。ＣＴＬＡ 4Ｉg単独またはカプセル化単独では、何れも有効でなかった。さらに、移植が長期間上手く機能したレシピエントからの脾臓細胞は、ドナー特異的な非応答性をもたらさなかった。抗ＣＤ−8抗体およびＣyＡ療法の効果がないことは、このモデルにおける応答が主としてＴh2タイプであるという我々の仮説と一致する。異種認識は（同種認識と異なり）、主としていわゆる「間接的」抗原提示経路を介して起こり、それによって宿主のＡＰＣは、（ドナーの）細胞外タンパク質から捕捉したペプチドを宿主のヘルパーＴ細胞に提示するということにはかなりの証拠がある（27,137,29,138）。ＮＯＤのカプセル化膵島異種移植片の拒絶には、宿主のＭＨＣが必須であるという我々の最近のレポート（75）、およびヘルパーＴ細胞がこの応答に不可欠であるという我々の以前の観察(7)はどちらも「間接的」経路と一致する。「直接的」経路は、「近縁関係にある」ドナー組織に対する反応の方を加速すると思われるので、「近縁関係にない」カプセル化膵島（イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ）は、「近縁関係の」膵島（ラット）に比べて早く崩壊するという我々の以前の発見も（20）、この仮説を支持する。さらに、我々の最新データからは、カプセル化膵島異種移植の該モデルにおいて、「間接的」抗原提示はＣＴＬＡ4Ｉgによって阻止され得ると推測される。結論として、我々は、ミクロカプセル単独またはＣＴＬＡ4Ｉg単独では、ともにＮＯＤによるウサギ膵島の破壊を防げないということを見出した。しかし、我々は、ＮＯＤレシピエントのＣＴＬＡ4Ｉg処置とカプセル化との相乗効果により、近縁関係にない膵島異種移植片の生着が顕著に延びることを観察した。参照文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/30 Ａ６１Ｋ 35/30 35/39 35/39 35/407 35/407 48/00 48/00 (72)発明者ハグラー、メリー・ケーアメリカ合衆国、ジョージア州 30249、ローガンビル、バニー・コート・エス・ダブリュ 1193 (72)発明者リンズレイ、ピーター・エスアメリカ合衆国、ワシントン州 98119、シアトル、ナインス・アベニュー・ウエスト 2430 (72)発明者カップ、ジュディス・エーアメリカ合衆国、ジョージア州 30322、アトランタ、ピアース・ドライブ 1639、エモリー・ユニバーシティー・スクール・オブ・メディソン、デパートメント・オブ・サージェリー内

Claims

【特許請求の範囲】１．患者に移植した生きた細胞が、患者の免疫系によって破壊されるのを阻止する方法であって、 a）移植の前に、半透膜を具備する装置内に、生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を封入することと、 b）前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で、患者を処置することを具備してなる方法。２．該物質がＣＴＬＡ4である請求項１の方法３．該装置が中空の繊維、円盤、または球体である請求項１の方法。４．該装置がミクロカプセルである請求項１の方法。５．該生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を異種のドナーから得る請求項１の方法。６．該生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を同種のドナーから得る請求項１の方法。７．該生きた細胞、または生きた細胞を具備する組織を患者から得る請求項１の方法。８．患者への移植の前に、該生きた細胞に遺伝子工学的処理を施す請求項７の方法。９．該患者がヒトである請求項１の方法。１０．哺乳類から該生きた細胞を得る、請求項９の方法。１１．該哺乳類がヒトである請求項１０の方法。１２．該患者が家畜である請求項１の方法。１３．該家畜がウシ、子ウシ、ブタ、ヒツジ、子ヒツジ、ウマまたはニワトリである請求項１２の方法。１４．該細胞が家畜の成長を促すホルモンを分泌する細胞を具備する請求項１２の方法。１５．該生きた細胞が生物学的に活性な物質を分泌する細胞を具備する請求項１の方法。１６．生物学的に活性な物質を分泌する細胞が内分泌細胞である請求項１５の方法。１７．該内分泌細胞がインシュリン産生細胞、肝細胞、上皮小体細胞、または下垂体細胞である請求項１６の方法。１８．生物学的に活性な物質を分泌する該細胞が神経外胚葉細胞である請求項１５の方法。１９．該神経外胚葉細胞が副腎細胞またはリンパ球である請求項１８の方法。２０．該半透膜が免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない請求項１の方法。２１．請求項２の方法であって、ＣＴＬＡ4で患者を処置することが、患者に可溶性ＣＴＬＡ4を投与することを具備する方法。２２．該可溶性ＣＴＬＡ4がＣＴＬＡ4Ｉgである請求項２１の方法。２３．請求項１の方法であって、前記被封入細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を阻止することが、該生きた細胞または組織と反応し得る免疫グロブリンおよび活性化されたマクロファージを阻止することを具備する方法。２４．患者の糖尿病を治療する方法であって、 a）半透膜を具備する装置内に、生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を封入することにより、生きた被封入インシュリン産生細胞を得ることと、 b）患者の糖尿病を治療するのに有効な量の、ステップ（a）で得た、生きた被封入インシュリン産生細胞を患者に移植することと、 c）ステップ（b）で得られた、多数の生きた被封入インシュリン産生細胞に対する患者の免疫系の応答を有効に阻止する量の、免疫系協同刺激現象を阻害する物質で患者を処置することを具備する方法。２５．免疫系協同刺激現象を阻害する該物質がＣＴＬＡ4である、請求項２４の方法。２６．請求項２４の方法であって、生きたインシュリン産生細胞を具備する該組織が、膵臓膵島組織を具備している方法２７．請求項２４の方法であって、該生きたインシュリン産生細胞が、移植の前に、インシュリンを分泌するように遺伝子工学的処理を施した細胞を具備する方法。２８．該装置が中空の繊維、円盤、または球体である請求項２４の方法。２９．該装置がミクロカプセルである請求項２４の方法。３０．請求項２４の方法であって、該生きたインシュリン産生細胞細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を異種のドナーから得る方法。３１．請求項２４の方法であって、該生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を同種のドナーから得る請求項２４の方法。３２．請求項２４の方法であって、該生きたインシュリン産生細胞、または生きたインシュリン産生細胞を具備する組織を患者から得る方法。３３．請求項３２の方法であって、患者に移植する前に遺伝子工学的処理を施して、該生きたインシュリン産生細胞にインシュリンを分泌せしめる方法。３４．該患者がインシュリン依存性糖尿病患者である請求項２４の方法。３５．該患者が哺乳類である請求項３４の方法。３６．該患者がヒトである請求項３５の方法。３７．該患者が哺乳類である請求項２４の方法。３８．該患者がヒトである請求項３７の方法。３９．該半透膜が免疫グロブリンおよび／またはリンパ球を透過させない請求項２４の方法。４０．請求項２５の方法であって、ＣＴＬＡ4で患者を処置することが、患者に可溶性ＣＴＬＡ4を投与することを具備する方法。４１．該可溶性ＣＴＬＡ4がＣＴＬＡ4Ｉgである請求項４０の方法。４２．請求項２４の方法であって、前記生きた被封入インシュリン産生細胞または組織に対する患者の免疫系の応答を阻止することが、該生きたインシュリン産生細胞または組織と反応し得る免疫グロブリンおよび活性化されたマクロファージを阻止することを具備する方法。４３．請求項１の方法であって、免疫系協同刺激現象を阻害する該物質が、患者のサイトカインプロフィールも変化せしめて、患者の免疫系から被封入細胞または組織を保護する方法。４４．該物質が患者のγ−インターフェロンを増加させる請求項４３の方法。４５．該物質がＣＴＬＡ4Ｉgである請求項４３の方法。４６．免疫系協同刺激現象を阻害する該物質が補体を結合する請求項１の方法。４７．該物質がＣＴＬＡ4Ｉgである請求項４６の方法。