JP2000500023A - 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、原核細胞中でタンパク質を発現させる段階と、細胞を採取する段階と、ｐＨ約８〜１１のバッファ中で細胞を直接可溶化する段階と、水及び希釈剤で希釈する段階と、から成る正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質またはポリペプチドの製造方法に関する。タンパク質またはポリペプチドは好ましくは、ＧＨ、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩである。

Description

【発明の詳細な説明】 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法 本発明は、正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質またはポリペ プチドの製造方法に関する。本発明方法は、タンパク質を原核細胞中で発現させ る段階と、細胞を採取する段階と、ｐＨ約８〜１１のバッファ中で細胞を直接可 溶化する段階と、次いで水と希釈剤とによって希釈する段階と、から成る。 タンパク質またはポリペプチドは好ましくは、ＧＨ、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ −ＩＩである。 序論 有効な細菌発現系中で組換えタンパク質を超発現させるときには一般に、タン パク質産物を天然型（ｎａｔｉｖｅ）コンホメーションに折畳むことが主として 問題となる。大腸菌中で高レベル産生する多くの系は顆粒画分（ｉｎｃｌｕｓｉ ｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）と呼ばれる変性タンパク質の凝集体を産生するが、いくつ かの場合にこれらの凝集体は所望の天然型タンパク質に再生され得る。再生を容 易にかつ効率的に行うための汎用 方法も知られている。１つの方法では、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のクラ スを使用し、いま１つの方法では、折畳み用酵素を使用する。ＨＳＰを使用した 場合には凝集が阻止され、折畳み用酵素を使用した場合には再生速度が加速され る。 しかしながら、すべてのタンパク質がこれらの処理方法に適応することはでき ないので、再生効率を向上させる別の解決方法も示唆されている。 Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １０，１９９２年１月号に収載のＪ．Ｄ．Ｃａｒｌ ｓｏｎらの論文は、天然型タンパク質、特にＳ−プロテインの収率を向上させる ためにタンパク質再生中のモノクローナル抗体の使用を開示している。 天然型タンパク質を回収するために示唆された別の方法では、顆粒画分の形態 のタンパク質をグアニジンまたは尿素のような変性剤によって可溶化し、必要な 場合にはジスルフィド結合を還元させる。希釈または透析と再酸化とによってタ ンパク質を天然型タンパク質に再生できる。 高濃度の組換えタンパク質の場合、新しい顆粒画分の形成を伴うことなく再生 に成功することは概して難しい。通常は、約２０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で最 高の収率が得られる。従っ て、再生は、高価な薬剤を必要とする極めて不経済な製造形態であると考えられ る。 しかしながら、タンパク質産物はしばしば凝集していたり修飾されていたりす るので再生処理の効率を予測することはできない。またＩＧＦ−Ｉ及び−ＩＩの 場合、再生された可溶性画分中には誤って折畳まれた種も含まれており、正しく 折畳まれた増殖因子の総収率はかなり低い値となる(Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｅ ．ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ９，３６３ページ) 。 正しく折畳まれたＩＧＦ−Ｉの収率を向上させるために種々の方法が提案され ている。 ヒトインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は最初に血清から単離された７０ 個のアミノ酸の単鎖ペプチドから成る増殖因子である。ＩＧＦ−Ｉは成長ホルモ ン（ＧＨ）によって正の調節作用を受け、多くの細胞類型に対してマイトジェン 様効果を示す。従って、ＩＧＦ−ＩはＧＨの成長促進作用のうちの多くの作用を 仲介すると考えられる。ホモロジー領域ではＩＧＦ−Ｉとインスリンとは４９％ 相同であり、６個のシステイン残基を含み、３個のジスルフィドブリッジを提供 する。ＩＧＦ−Ｉ の三次元構造はインスリンのＸ線構造に基づいてモデル化されており、このモデ ルは最近になって、ＩＧＦ−Ｉの二次元ＮＭＲ分光法で得られた距離制限によっ てジスルフィドブリッジ領域で確認された（ＩＧＦに関しては、インスリン様増 殖因子Ｉ及びＩＩ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ），Ｈｕｍｂｅｌ Ｒ．Ｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９０，４４５−４６２，１９９０参照）。 ヒト組換えＩＧＦ−Ｉは、大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)及びパ ン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の双方を用い、 分泌産物として製造されていた。双方の種から単離した物質中のＩＧＦ−Ｉは主 として分子間ジスルフィドをもつ誤った折畳み形態で検出された。更に、還元Ｉ ＧＦ−Ｉを酸素の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏ再生すると、希釈再生条件下であっ ても不正対合をもつ凝集した天然型ＩＧＦ−Ｉが蓄積することが判明した。 組換えＩＧＦ−Ｉの再生効率は、ブドウ球菌のプロテインＡに由来の２個のＩ ｇＧ−結合ドメイン（ＺＺ）から成る融合パートナーを用いることによってかな り改善された（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｅ．ら，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．９，３６３ページ）。ＺＺ融合パートナーは誤 って折畳まれた分子を可溶化するために、還元及び再酸化の途中及び前後に使用 される。正しく折畳まれたＩＧＦ−Ｉの収率はかなり増加することが判明したが 、誤って折畳まれたＩＧＦはまだかなりの量で存在する。 多くの特許及び特許出願が、誤って折畳まれたＩＧＦの問題を記載し、種々の 改良を示唆している。 国際特許ＷＯ９１／０２８０７（Ａｍｇｅｎ）（対応米国特許第５１５８８７ ５号）は、正電荷をもつ短い融合リーダー配列の存在下でリシン、アルギニン及 びヒスチジンのようなアミノ酸をＩＧＦ−ＩのＮ末端に融合させることによって ＩＧＦ−Ｉを再生させる方法を開示している。顆粒画分を単離し尿素で可溶化す る。 国際特許ＷＯ９３／１１２４０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、誤って折畳まれた 不溶性のＩＧＦ−Ｉを再生するために顆粒画分の可溶化と単一バッファ系中の再 生と行う方法を記載している。 米国特許第５１５１５０１号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）は、難 溶性のソマトトロピン（成長ホルモン）画分をスルホラン含有溶液に分散させ次 いで希釈することによって ソマトトロピンを可溶化し再生する方法を開示している。 国際特許ＷＯ９３１９０８４（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ）は、原核細胞中で発現させ 、第一還元剤を添加し、変性剤（例えば尿素）を添加し、酸化剤（例えば酸化グ ルタチオンまたはシステイン）を添加し、第二還元剤（例えばＤＴＴ、システイ ン、など）を添加する段階から成る活性ＩＧＦ−Ｉの製造方法を開示している。 Ｍｅｔ−ＩＧＦ−Ｉが発現される。 国際特許ＷＯ９５０６０６４は、正しく再生されたポリペプチドの収率を増加 させるために再生段階中に銅またはマンガン塩を存在させる方法を開示しており 、ＷＯ９５０６０５９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、相形成種を添加して多重水相 を形成することによって細胞を単離する方法を開示している。 本発明の発明者らはここに、正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパ ク質またはポリペプチドを製造するための新規で簡単な方法を開発した。特にＺ −ＩＧＦ−Ｉの発現後の組換えＩＧＦ−Ｉの製造について記載する。参考文献は 欧州特許ＥＰ２３０８６９、特にその実施例である。ハイブリッドタンパク質Ｚ −ＩＧＦ−Ｉを発現する大腸菌によって極めて高い発現レベル（発酵槽１リット ルあたり１５ｇ以下）が得られた。 本文に記載の方法では好ましいポリペプチドとしてＩＧＦ−Ｉを例示しているが 、誤って折畳まれた種を含み、正しく折畳まれたポリペプチドの総収率がかなり 低いような別のポリペプチド組換え体の製造にも本発明方法を使用できる。 請求の範囲に記載の方法によれば細胞の機械的破壊段階及び難溶性画分の単離 及び洗浄段階を削除し得る。 本発明方法は前述のような先行技術の方法よりも簡単でありまた高い効率が得 られる。 発明の詳細な説明 本発明は、正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質またはポリペ プチドを製造する方法であって、 （ａ）原核細胞中でタンパク質を発現させる段階と、 （ｂ）細胞を採取する段階と、 （ｃ）ｐＨ約８〜１１、好ましくはｐＨ約８のバッファ中でカオトロピック剤及 び還元剤によって細胞を直接可溶化する段階と、 （ｄ）水及び希釈剤で希釈する段階と、から成る。 タンパク質は例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはＧＨである。 タンパク質がＩＧＦ−Ｉのとき、方法は好ましくは、 （ａ）原核細胞系、好ましくは大腸菌中で、ＩＧＦ−Ｉ−融合タンパク質を発現 させる段階と、 （ｂ）細胞を採取する段階と、 （ｃ）ｐＨ約８〜１１、好ましくはｐＨ約８のバッファ中でカオトロピック剤及 び還元剤によって細胞を直接可溶化する段階と、 （ｄ）水及び希釈剤で希釈する段階と、 （ｅ）開裂剤を添加する段階と、 （ｆ）生物活性ＩＧＦ−Ｉを産生するために精製する段階と、から成る。 ＩＧＦ−Ｉ−融合タンパク質は好ましくはハイブリッドＺ−ＩＧＦ−Ｉである 。段階（ｃ）のバッファは例えばトリス（トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメ タン塩酸塩）またはグリシンである。 段階（ｃ）のカオトロピック剤は好ましくはグアニジンまたは尿素であり、グ アニジンは３〜７Ｍ、好ましくは５Ｍの濃度で使用する。段階（ｃ）の還元剤は 例えばＤＴＴ（ＤＬ−ジチオトレイトール）またはシステインであり、段階（ｄ ）の希釈 剤はエタノールでよい。 段階（ｄ）後のｐＨは、好ましくはｐＨ６未満、より好ましくはｐＨ３以下に 低下している。 ＩＧＦ−Ｉを製造する場合、段階（ｄ）と（ｅ）との間でｐＨを好ましくは３ 以下に下げる。 また、段階（ｄ）と（ｅ）との間に、クロマトグラフィー及び／またはイオン 交換を用いた濃縮段階及びバッファ交換段階が含まれてもよい。 ＩＧＦ−Ｉを製造する場合、段階（ｅ）の開裂剤はヒドロキシルアミン、酵素 または他の任意の開裂剤でよい。 純粋なタンパク質またはポリペプチドを得るための精製段階は例えばカチオン 交換、ＲＰ−ＨＰＬＣ及び／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ ）などを用いて行う。 ＩＧＦ−ＩがＺ−ＩＧＦ−Ｉとして産生される場合、ＩＧＦ−Ｉの溶解度が向 上している。即ち、より高い濃度の還元ＩＧＦ−Ｉの溶液が得られるので、正し く折畳まれたＩＧＦ−Ｉが大量に得られる。このことは、ＩＧＦ−Ｉの工業的製 造方法に極めて重要である。 実施例 実験で使用した組換えヒトＩＧＦ−Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）は、欧州特許ＥＰ２ ３０８６９の実施例ＶＩＩＩに記載の方法に従って（但し、発酵槽を用いて）大 腸菌中で３７℃で２０時間増殖させることによって得られた。実施例１ 可溶化 発酵後の細胞を遠心分離または交差流濾過によって採取した。 次いで、細胞を溶解し、以下の溶液を調製した。 １３リットルの細胞溶液、湿潤重量４９８ｇ／リットル、 ５モル／リットルのグアニジン−塩酸塩、 ９７ミリモル／リットルのトリス−塩基、 １５９ミリモル／リットルのトリス−ＨＣｌ、 ２ミリモル／リットルのエチレン−ジニトロ−四酢酸−二ナトリウム塩−二水 和物（ＥＤＴＡ）、 ４ミリモル／リットルのジチオトレイトール（ＤＤＴ）、 総量：１６．９リットル。 ｐＨを８．１に維持し、撹拌下、１５℃で３時間可溶化処理した。再生 可溶化溶液を３３．８リットルの２２．５％エタノール溶液で３倍に希釈した 。 撹拌下、１５℃でｐＨを８．１に維持した。 ２０時間後、溶液のｐＨが＜３．１になるまで濃塩酸を添加することによって 再生を停止させた。 再生溶液中のＺ−ＩＧＦ−Ｉの濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析によれば、３．２４ ９ｇ／リットルの正しく折畳まれたＺ−ＩＧＦ−Ｉが得られた。実施例２ 可溶化 発酵後の細胞を遠心分離または交差流濾過によって採取した。 次いで、細胞を溶解し、以下の溶液を調製した。 １５４ｍｌの細胞溶液、湿潤重量４５０ｇ／リットル、 ４．５モル／リットルのグアニジン−塩酸塩、 ４００ミリモル／リットルのグリシン、 ０．２％のトゥイーン２０、 ２ミリモル／リットルのエチレン−ジニトロ−四酢酸−二ナトリウム塩−二水 和物（ＥＤＴＡ）、 ３ミリモル／リットルのジチオトレイトール（ＤＤＴ）、 総量：２００ｍｌ。 ｐＨを１０．０に維持し、撹拌下、室温で３時間可溶化処理した。再生 可溶化溶液を１２５ｍｌのエタノール、４００ｍｌの水及び６６．８ｇのグア ニジン−塩酸塩で４倍に希釈した。 撹拌下、室温でｐＨを１０．０に維持した。 ２０時間後、溶液のｐＨが＜３．１になるまで濃塩酸を添加することによって 再生を停止させた。 再生溶液中のＺ−ＩＧＦ−Ｉの濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析によれば、１．３８ ｇ／リットルの正しく折畳まれたＺ−ＩＧＦ−Ｉが得られた。実施例３ 可溶化 発酵後の細胞を遠心分離または交差流濾過によって採取した。 次いで、細胞を溶解し、以下の溶液を調製した。 ９００ｍｌの細胞溶液、湿潤重量７２０ｇ／リットル、 ６モル／リットルのグアニジン−塩酸塩、 ９７ミリモル／リットルのトリス−塩基、 １５９ミリモル／リットルのトリス−ＨＣｌ、 ２ミリモル／リットルのエチレン−ジニトロ−四酢酸−二ナトリウム塩−二水 和物（ＥＤＴＡ）、 ３ミリモル／リットルのジチオトレイトール（ＤＤＴ）、 総量：１．１７リットル。 ｐＨを８．０に維持し、撹拌下、１５℃で３時間可溶化処理した。再生 可溶化溶液を５４７ｍｌのエタノール、１７８６ｍｌの水で３倍に希釈した。 総量３．６リットル。 撹拌下、１５℃でｐＨを８．１に維持した。 ２１時間後、溶液のｐＨが＜３．１になるまで濃塩酸を添加することによって 再生を停止させた。 濃度のＲＰ−ＨＰＬＣ分析によれば、１．３２ｇ／リットルの正しく折畳まれ たＺ−ＩＧＦ−Ｉが得られた。収率 可溶化：（発酵槽のＺ−ＩＧＦ−Ｉの）７４％ 可溶化及び再生の総効率：４１％ 最終精製したＩＧＦ−Ｉは例えばニワトリ胚大腿及びＲＲＡ（ラジオレセプタ ーアッセイ）において生物活性を有することが証明された。実施例４、第一精製段階 再生段階で得られた溶液をＷＦＩ（注射用水）で３倍に希釈し、交差流膜で清 澄化した後、カチオン交換器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＢＰＧ ２００／５００，ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ，９．５リットル、ベッド高 さ０．３３ｍ）に通した。 以下のバッファを使用した。 カラムを１カラムボリューム（ＣＶ）の注射用水で洗浄し、カラムを３カラム ボリュームの平衡バッファで処理し、サンプルをカラムで処理した。 カラムを先ず３カラムボリュームの洗浄段階１のバッファで洗浄し、次いで４ カラムボリュームの洗浄段階２のバッファで洗浄した。 産生物を５カラムボリュームの溶出バッファで溶出し、カラムを２カラムボリ ュームの再生バッファ及び２カラムボリュームの清浄化処理バッファで処理した 。 ＲＰ−ＨＰＬＣによれば、精製段階で正しく折畳まれたＩＧＦ−Ｉの総収率は ９８％であった。実施例５，開裂段階 カチオン性イオン交換カラムで第一精製段階を行った後、ＩＧＦ−ＩからＺを 開裂する処理を行った。 ４０．０リットルのカチオン性イオン交換プールと、１４２８ｇの二リン酸ナ トリウムと、４．０リットルのヒドロジルアミン（Ｈｙｄｒｏｚｙｌａｍｉｎｅ ）と、５０％のゾルとを容器に導入した。 （ＮａＯＨによって）ｐＨを９．５５に調整し、温度を４０℃に維持した。 ３時間後、温度を２５℃に下げ、４０．０リットルの濃酢酸（ＨＡｃ）と１６ ０リットルの注射用水とを添加することによって反応を停止させた。 ｐＨを３．３０に調整した。 ＲＰ−ＨＰＬＣによれば、この段階によって得られた正しく折畳まれた非酸化 ＩＧＦ−Ｉの収率は８４％であった。実施例６，開裂段階 カチオン性イオン交換カラムで第一精製段階を行った後、ＩＧＦ−ＩからＺを 開裂する処理を行った。 １８．６リットルのカチオン性イオン交換プールと、６６４ｇの二リン酸ナト リウムと、２．１７リットルのヒドロジルアミン(Ｈｙｄｒｏｚｙｌａｍｉｎｅ) と、５０％のゾルとを容器に導入した。 （ＨＡｃによって）ｐＨを９．５に調整し、温度を４０℃に維持した。 ３時間後、温度を２５℃に下げ、２２．３リットルの濃ＨＡｃと９３リットル の注射用水とを添加することによって反応を停止させた。 ｐＨを３．３５に調整した。 ＲＰ−ＨＰＬＣによれば、この段階で得られた正しく折畳まれた非酸化ＩＧＦ −Ｉの収率は６１％であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）原核細胞中でタンパク質またはポリペプチドを発現させる段階と、 （ｂ）細胞を採取する段階と、 （ｃ）ｐＨ約８〜１１のバッファ中でカオトロピック剤及び還元剤によって細胞 を直接可溶化する段階と、 （ｄ）水及び希釈剤で希釈する段階と、 から成る正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質またはポリペプチ ドの製造方法。 ２．タンパク質が、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはＧＨであることを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ３．タンパク質がＩＧＦ−Ｉであり、 （ａ）原核細胞系、好ましくは大腸菌中でＩＧＦ−Ｉ−融合タンパク質を発現さ せる段階と、 （ｂ）細胞を採取する段階と、 （ｃ）ｐＨ８〜１１のバッファ中でカオトロピック剤及び還元剤によって細胞を 直接可溶化する段階と、 （ｄ）水及び希釈剤で希釈する段階と、 （ｅ）開裂剤を添加する段階と、 （ｆ）生物活性ＩＧＦ−Ｉを産生するために精製する段階と、から成ることを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ４．ＩＧＦ−Ｉ−融合タンパク質がハイブリッドＺ−ＩＧＦ−Ｉであることを特 徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 ５．段階（ｃ）のバッファがトリスまたはグリシンであることを特徴とする請求 項１から４のいずれか一項に記載の方法。 ６．段階（ｃ）のｐＨが約８であることを特徴とする請求項１から５のいずれか 一項に記載の方法。 ７．段階（ｃ）のカオトロピック剤がグアニジンまたは尿素であることを特徴と する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 ８．グアニジンを濃度３〜７Ｍで使用することを特徴とする請求項７に記載の方 法。 ９．段階（ｃ）の還元剤がＤＴＴまたはシステインであることを特徴とする請求 項１から８のいずれか一項に記載の方法。 １０．段階（ｄ）の希釈剤がエタノールであることを特徴とする請求項１から９ のいずれか一項に記載の方法。 １１．段階（ｄ）後のｐＨが、好ましくはｐＨ６未満、より好ましくはｐＨ３以 下であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 １２．段階（ｄ）と（ｅ）との間でｐＨを３以下に下げることを特徴とする請求 項１１に記載の方法。 １３．段階（ｄ）と（ｅ）との間に濃縮段階とバッファ交換とを行うことを特徴 とする請求項３に記載の方法。 １４．クロマトグラフィー及び／またはイオン交換を使用することを特徴とする 請求項１３に記載の方法。