JP2000500017A

JP2000500017A - Gene therapy nucleic acid constructs, their manufacture and their use in treating heart disease

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Publication number: JP2000500017A
Application number: JP9518509A
Authority: JP
Inventors: ウォルフガンク−エムフランツ; ロートマン，トーマス; アーカトウス，ハー
Original assignee: ウォルフガンク−エムフランツ
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 2000-01-11
Also published as: US20030035794A1; WO1997017937A2; WO1997017937A3; EP0862644A2; DE19681032D2; AU1867297A

Abstract

(57)【要約】本発明は、治療上有効な遺伝子産物またはアンチセンス核酸またはリボザイムの情報をコードしている核酸と機能的に結合している、心臓のミオシンＬ２鎖遺伝子（ＭＬＣ−２）の５′末端の調節核酸配列を含んだ遺伝子治療核酸構造体ならびにその製造方法と心臓疾患の遺伝子治療へのその利用に関する。 The present invention relates to a cardiac myosin L2 chain gene (MLC-2) operably linked to a therapeutically effective gene product or an antisense nucleic acid or a nucleic acid encoding ribozyme information. The present invention relates to a gene therapy nucleic acid construct containing a regulatory nucleic acid sequence at the 5 'end, a method for producing the same, and its use in gene therapy for heart disease.

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子治療核酸構造体、その製造と心臓疾患治療へのその利用本発明は、治療上有効な遺伝子産物、アンチセンス核酸またはリボザイムの情報をコードしている核酸と機能的に結合している、心臓のミオシンＬ２鎖遺伝子（ＭＬＣ−２）の５′末端の調節核酸配列を含んだ遺伝子治療核酸構造体ならびにその製造方法と心臓疾患遺伝子治療へのその利用に関する。心筋病の病像は、収縮障害ならびに電気生理学的障害のいずれの形をも取り、最終的に重篤な心不全および／または突然の電気生理学的心臓死に至る一群の心臓筋肉疾患を包括している。よく知られている形の拡張性および肥大性の心筋病に関する一元的発生原因の究明は目下数多くの科学的研究の対象となっている。これに関連してまさにごく最近、心臓筋肉疾患の発生原因が分子レベルで解明された。たとえばいわゆるデュシェン筋ジストロフィー（ＤＭＤ）も心筋病の原因となる。ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の突然変異および欠失によって惹起される遺伝病である。ジストロフィン遺伝子はｘ染色体上に局在しており、健常者の場合には特に心筋細胞においてエクスプライムされる。さらに、慢性の鬱血性心麻痺（ＣＨＦ）の場合には心筋層は健全な心筋層に比較して５０％以下のβアドレナリン作動性レセプターしか含んでいないことが見いだされた。したがって遺伝子欠陥の確認または疾患心筋組織における遺伝子発現の変異の検出に応じて、分子生物学的方法により疾病を治療する可能性が生ずる。その意味でたとえば体細胞への遺伝子導入は遺伝に起因する心臓筋肉疾患の治療にとって有望な方法である。体細胞への遺伝子導入にはさまざまな方法、たとえばＤＮＡインジェクションによる遺伝子導入、リポソーム援用遺伝子導入またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはアデノ関連ウイルスベクターによる遺伝子導入が適している。遺伝子治療を成功に導く重要な前提条件は高い感染率、安定した遺伝子発現および組織特異性である。ＷＯ９４／１１５０６には遺伝子導入の成功例と冠状血管平滑筋細胞ならびに心筋細胞の双方におけるＣＭＶプロモーターのコントロール下でのβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の発現の成功例が示されている。ただし心筋特異的発現の実現には至っていなかった。同明細書中では一般的に心筋特異トロポニンＣ（ｃＴＮＣ）プロモーターが指摘されているが、心臓特異的なｉｎｖｉｖｏ発現は示されていない。Ｆｒａｎｚ，Ｗ．−Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｃａｒｄｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５，２３５−２４３，Ｎｏ．４から、受精したマウス卵母細胞の雄性前核にミオシンＬ２鎖（ＭＬＣ−２）プロモーター・ルシフェラーゼ融合遺伝子のｎａｋｅｄＤＮＡをマイクロインジェクションするとルシフェラーゼ遺伝子の心筋特異的発現を示す遺伝形質転換マウスが生み出されることが知られている。心筋および紋理構造を有するその他の筋の主成分であるミオシンは２本のＨ鎖（ＭＨＣ）と２対のミオシンＬ鎖（ＭＬＣ）とから成っている。ＭＬＣは再びリン酸化不能な鎖（ＭＬＣ−１）とリン酸化可能な鎖（ＭＬＣ−２）とに分けられる。これまでに、ラットの骨格筋と心筋とのＭＬＣ２遺伝子の５′末端での調節核酸配列（プロモーター）は相異しているが、ラットとニワトリとの心筋のＭＬＣ２遺伝子のそれは両者が発生的に非常に離れているにもかかわらず保存されていることが見いだされた（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１８１４２−１８１４８）。ところでＬｅｅｅｔａｌ．（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，１２２０−１２２９，Ｎｏ．２）は、遺伝形質転換マウスをベースとして、転写開始点の上流２５０塩基対の範囲内にある正の（ＨＦ−１ａおよびＨＦ−１ｂ）制御ユニットと負の（Ｅ−配列およびＨＦ−３）現制御ユニットとのコンビネーションが現在までのところ遺伝子治療ｉｎｖｉｖｏ適用に際する特異性の保持は示され得ていないとはいえ心室特異的発現を惹起することを見いだした。だが、Ｆｒａｎｚｅｔａｌ．（１９９４）（上記）は、同じく遺伝形質転換マウスをベースとして、心筋特異的発現にはもう一つの調節配列、いわゆる心筋特異的配列（ＣＳＳ）、すなわち転写開始点の上流約１７００塩基対にあるリプレッサーユニットが必要であることを見いだしていた。これらの結果から、遺伝子の心臓特異的発現メカニズムはまだ未解明であり、遺伝子のｉｎｖｉｖｏ適用後の心臓特異的発現はまだ見いだされていなかったことが認められる。したがって本発明の目的は、心臓疾患の遺伝子治療のために、高い感染率、安定した遺伝子発現および特に心筋細胞に対する特異性を有する核酸構造体を見いだすことであった。したがって本発明の目的は、治療上有効な遺伝子産物、アンチセンス核酸またはリボザイムの情報をコードしている核酸と機能的に結合している、心臓好ましくは哺乳動物の心臓、特にヒトまたは齧歯類動物なかんずくラットの心臓のミオシンＬ２鎖遺伝子（ＭＬＣ−２）の５′末端の調節核酸配列を含んだ遺伝子治療核酸構造体である。本発明の趣旨の調節核酸配列として理解されるものは、一般に、ＭＬＣ−２遺伝子の転写開始点（＋１）の上流にある核酸配列であって、この配列と３′末端で結合した下流にある核酸配列の転写を正しい転写開始、転写速度および／または心筋組織特異性の点でコントロールする核酸配列であり、換言すればこの調節核酸配列は下流にある核酸配列と機能的に結合している。心臓のＭＬＣ−２遺伝子の転写開始点を基準として約＋１８ないし−１９番目から約−８００番目までの配列が特に好ましいが（図１０、参照）、それは転写開始点の上流の約８００塩基対がいわゆる心臓特異配列ＣＳＳを含んでいないにもかかわらずｉｎｖｉｖｏ適用に際して心臓特異的発現と特に心室特異的発現を結果するのに十分であることが特に顕著だったからである。心臓のＭＬＣ−２遺伝子の転写開始点を基準として約＋１８ないし−１９番目から約−１６００番目までと特に約＋１８ないし−１９番目から約−１８００番目までの配列、とりわけ約＋１８ないし−１９番目から約−２１００番目または約＋１８ないし−１９番目から約−２７００番目までの配列もさらに別の好ましい実施形態である（図１０）参照）。同調節核酸配列は特に、ＴＡＴＡ配列、ＨＦ−１ａ、ＨＦ−１ｂ、ＨＦ−２、ＨＦ−３、Ｅ配列、ＭＬＥ１および／またはＣＳＳ配列、特にＴＡＴＡ配列、ＨＦ−１ａ、ＨＦ−１ｂ、ＨＦ−２、ＨＦ−３、Ｅ配列および／またはＭＬＥ１からセレクトされた１つまたは複数の調節ユニットを含んでいる。たとえばラットの調節核酸配列の場合には、ＴＡＴＡ配列はＭＬＣ−２遺伝子の転写開始点を基準として約−１９８番目と−１９番目との間にあり、保存された２８塩基長の配列であるＨＦ−１ユニットは約−７２番目と−４５番目との間、特にＨＦ−１ａユニットは約−５７番目と−６５番目との間、ＨＦ−１ｂユニットは約−４５番目と−５６番目との間、ＨＦ−２ユニットは約−１２３番目と−１３４番目との間、ＨＦ− ３ユニットは約−１８６番目と−１９８番目との間、Ｅ配列は約−７２番目と− ７７番目との間、ＭＬＥ１ユニットは約−１６５番目と−１７６番目との間、ＣＳＳ類似ユニットは約−１７２３番目と−１６８６番目との間にある（図１０、参照）。ラットのＭＬＣ−２遺伝子の場合には、調節配列のＴＡＴＡ配列、ＨＦ −１ｂユニット、ＨＦ−１ａユニット、Ｅ配列ユニット、ＨＦ−２ユニット、ＭＬＥ１ユニットおよびＨＦ−３ユニットはこの順序で遺伝子の転写開始点の上流の最初の２００塩基の範囲内にある（図１０、参照）。心臓特異的発現には、本発明に基づく核酸構造体がＨＦ−１ａユニット、ＨＦ −１ｂユニット、ＭＬＥ１ユニットおよびＨＦ−３ユニットを、好ましくはＥ配列ユニット、特にＥ配列ユニットおよび／またはＨＦ−２ユニットと共に含んでいるのが好適である。同じくいずれの場合にも本発明に基づく核酸構造体が付加的に心臓特異配列ＣＳＳを含んでいるのが好ましい。本発明の趣旨の遺伝子治療核酸構造体として理解されるものは、特にＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、好ましくは一本鎖または二本鎖、特に二本鎖のＤＮＡ配列である核酸配列を有した核酸構造体であり、同核酸構造体は心臓疾患の遺伝子治療医薬として、特に心不全、拡張性または肥大性の心筋病、ジストロフィー、脈管疾患、高血圧、動脈硬化、血管の狭窄または再狭窄の治療に好適に利用することができる。本発明に基づく核酸構造体は好ましくはウイルスベクターおよび／またはリポソームと組み合わされ、好ましくはアデノウイルスベクター、特に複製不全アデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター、特にもっぱら逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から成るアデノ関連ウイルスベクターと結びつけられる。本発明の特に好ましい実施形態は本発明に基づく核酸構造体とアデノウイルスベクター、特に複製不全アデノウイルスベクターとの遺伝子工学的結合である。アデノウイルスベクターおよび特に複製不全アデノウイルスベクターは以下の理由から特に好ましい：ヒトのアデノウイルスは約３６キロベースペア（Ｋｂ）のゲノムを有した二本鎖ＤＮＡウイルスのクラスに属している。同ウイルスＤＮＡは約２７００種の遺伝子産物をコードしており、それらはアデノウイルス複製サイクルを基準として初期（“初期遺伝子”）産物と後期（“後期遺伝子”）産物に区分される。“初期遺伝子”は４つの転写単位、Ｅ１〜Ｅ４に細分される。後期遺伝子産物はキャプシッド蛋白質をコードしている。免疫学的には少なくとも４２種のアデノウイルスと下位グループＡ〜Ｆが区別されるが、これらはすべて本発明にとって適切である。ウイルス遺伝子の転写はアデノウイルス遺伝子発現のトランスアクチベーターをコードしているＥ１領域の発現を前提としている。後続のすべてのウイルス遺伝子の発現とＥ１トランスアクチベーターとのこの相関性は複製能のないアデノウイルスベクターの作製に利用することができる（たとえば以下参照、ＭｃＧｒｏｒｙ，Ｗ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌ．１６３，６１４ −６１７およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔａｌ．（１９８２）、“ＥｕｋａｒｙｏｔｌｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｄ）１８７ −１９２、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。アデノウイルスベクター、特にタイプ５のアデノウイルスベクター（配列については以下参照、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌ．１８６，２８０−２８５）およびなかんずく下位グループＣのウイルスベクターにおいて、一般に、Ｅ１遺伝子領域は固有のプロモーターを有した外来遺伝子または本発明に基づく核酸構造体によって代替される。後続のアデノウイルス遺伝子の発現の前提であるＥ１遺伝子領域のこの交換によって複製能のないアデノウイルスが生ずる。これらのウイルスは、したがって、欠落しているＥ１遺伝子に代替する単一の細胞系でのみ増殖することができる。したがって複製不全アデノウイルスは、一般に、Ｅ１領域のコピーをゲノム中に安定的に統合したいわゆる２９３細胞系（ヒトの胚的腎細胞）における相同組換えによって形成される。このため固有のプロモーター（たとえば本発明に基づくｍｌｃ−２プロモーター）のコントロール下で核酸配列（たとえば本発明に基づく治療上有効な遺伝子産物またはマーカー、たとえばβ−ガラクトシダーゼ／ β−Ｇａｌのための核酸配列）が組換えアデノウイルスプラスミド中でクローニングされる。続いてプラスミドｐＡｄ．ｍｌｃ−２／β−ＧａｌとＥ１欠失アデノウイルスゲノム、たとえばｄ１３２７またはｄｅ１３２４（アデノウイルス５）との間の相同組換えがヘルパー細胞系２９３中で行なわれる。組換えが首尾よく行なわれるとウイルスプラークが得られる。こうして作製された複製不全ウイルスはその後高い力価（たとえば１０⁹〜１０¹¹“プラーク形成単位（plaquefor ming unit)”）で細胞培養の感染または体細胞遺伝子治療に使用される。一般に、アデノウイルスゲノムへの外来ＤＮＡの正確な挿入箇所は重要な問題ではない。たとえば、Ｅ３遺伝子の欠失箇所に外来ＤＮＡをクローニングすることも可能である（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１９８６，５，２３７７−２３８５）。ただしＥ１領域またはその一部、たとえばＥ１ＡまたはＥ１Ｂ（たとえばＷＯ９５／００６５５、参照）がなかんずくＥ３領域が欠失している場合にあっても外来ＤＮＡによって代替されるのが好ましい。ただし本発明はアデノウイルスベクター系に限定されているわけではなく、アデノ関連ウイルスベクターも以下の理由から本発明に基づく核酸構造体との組合せに特に適している：ＡＡＶウイルスはパルヴォウイルス科に属している。これは直径１８〜３０ｎｍの正二十面体の無包囲キャプシッドを特徴とし、同キャプシッドは約５ｋｂの直鎖状の一本鎖ＤＮＡを含んでいる。ＡＡＶの効率的な増殖には宿主細胞がヘルパーウイルスに同時感染することが必要である。ヘルパーとして適しているのはたとえばアデノウイルス（Ａｄ５またはＡｄ２）、ヘルペスウイルスおよびワクチニアウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，９７−１２９）である。ヘルパーウイルスが介在しない場合にはＡＡＶは潜伏状態に移行し、その際、同ウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる。宿主ゲノムに組み込まれるこうしたＡＡＶの特性は哺乳動物細胞の形質導入ベクターとして特に興味深いものである。同ベクター機能にとっては、一般に、約１４５ｂｐの長さの２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ：inverted terminal repeats；たとえばＷＯ９５／２３８６７、参照）で十分である。これは、複製、パッケージングおよび宿主細胞ゲノムへの組み込みに必要な“シス[cis]”信号を保有している。組換えベクター粒子へのパーケージングのため、非構造蛋白（rep-protein）の遺伝子と構造蛋白（cap-protein）の遺伝子とを保有したベクタープラスミドがアデノウイルス感染した細胞にトランスフェクションされる。数日後、組換えＡＡＶ粒子の他にアデノウイルスも含んだ無細胞の溶解質が作られる。アデノウイルスは５６℃に熱するかまたは塩化セシウム密度勾配遠心法でのバンド状集積化により好適に分離することができる。この同時トランスフェクション法により１０⁵〜１０⁶ＩＥ／ｍｌの力価のｒＡＡＶを得ることができる。ワイルドタイプウイルスによるコンタミは、パッケージングプラスミドとベクタープラスミドとの配列に重複がなければ、検出限界以下である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，３８２２−３８２８）。体細胞への外来遺伝子の導入はＡＡＶにより、分化した静止細胞内に行なうことができ、これは心臓の遺伝子治療にとって特に好適である。前記の組み込み能によりｉｎｖｉｖｏの長期持続的な遺伝子発現も保証されるが、これもまた特に好適である。ＡＡＶのさらなる長所は、このウイルスが人間にとって病原となることなく、ｉｎｖｉｖｏで相対的に安定していることである。本発明に基づく核酸構造体のＡＡＶベクターまたはその一部へのクローニングは、たとえばＷＯ９５／２３８６７、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＨｕｍａｎｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ６，１５３１−１５４１またはＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５，７９３−８０１に述べられている類の、専門家に知悉されている方法に基づいて行なわれる。本発明の趣旨のもう一つの好ましい組合せは本発明に基づく核酸構造体とリポソームとの複合であるが、それはこれによって特に心筋細胞に関する非常に高いトランスフェクション効率を実現することができるからである（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，７４１３−７４１７）。リポフェクションに際し、リポソーム懸濁液の超音波処理により陽イオン電荷脂質から成る単層の小胞が作られる。ＤＮＡはリポソームの表面にイオン結合され、しかも正の純電荷が残留してプラスミドＤＮＡが１００％リポソームによって複合されるようにして結合される。この間に、Ｆｅｌｇｎｅｒｅｔａｌ．（１９８７、上記）によって使用された脂質混合物ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の他に、数多くの新しい脂質製剤が合成され、さまざまな細胞系のトランスフェクションに関するその効率がテストされた（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６９８２−６９８６；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１；Ｇａｏ，Ｘ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．１７９，２８０−２８５；Ｚｈｏ，Ｘ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１８９，１９５−２０３）。新しい脂質製剤の例はＤＯＴＡＰＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］− Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェートまたはＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）である。ＤＮＡ− リポソーム複合体の製造と心臓特異トランスフェクションにおけるその適用の成功に関する例はＤＥ４４１１４０２に記載されている。治療的遺伝子産物として適しているのは、たとえばジストロフィン、β−アドリナリン作動性レセプター、一酸化窒素シンターゼまたは、たとえば一元的欠陥を補完し、電気生理学的障害を防止ないし低下するかまたはその他の心臓特異的疾病を緩和ないし治癒することのできるその他のすべての遺伝子産物である。特に、治療的遺伝子産物をコードしている遺伝子（トランス遺伝子）が好ましくはプロモーターとトランス遺伝子のスタートコドンとの間にイントロンを含む１つもしくは複数の非コード配列を含みおよび／または特にトランス遺伝子の３′末端にポリＡ配列、たとえばそれぞれの遺伝子の内在性ポリＡ配列、好ましくはＳＶ４０ウイルスのポリＡ配列を含んでいるのが好適であるが、それはこれによって心筋細胞内でのｍＲＮＡの安定化を実現することができるからである（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ７４，９−１４およびＰａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，４７８−４８２）。ただし、ＭＬＣ−２遺伝子の調節核酸と機能的に結合している核酸は治療上有効な遺伝子産物をコードしている核酸がそうであるだけでなく、“アンチセンス ”核酸、好ましくは“アンチセンス”オリゴヌクレオチド、特に“アンチセンス ”ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはリボザイムをコードしている核酸もそうである。“アンチセンス”オリゴヌクレオチドによっても、またリボザイムによっても同様に心臓における遺伝子の発現を特異的に低下もしくは防止することができ、これにより多数の心臓特異疾患、たとえば動脈硬化症または再狭窄症さらにまた自己免疫疾患または癌疾患も治療することができる（たとえば以下参照、Ｂａｒｒ，Ｅ．＆Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）ＴｒｅｎｄｓＣａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．４，５７−６３，Ｎｏ．２およびＢｅｒｔｒａｎｄ，Ｅ．ｅｔａｌ．（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，２９３ −３００）。本発明に基づく核酸構造体の製造方法も本発明のもう一つの目的であり、同方法において上記に詳述した調節核酸配列は治療上有効な遺伝子産物またはアンチセンス核酸またはリボザイムをコードしている核酸と機能的に結合される。好ましい実施形態において前記の調節核酸と、治療上有効な遺伝子産物またはアンチセンス核酸またはリボザイムをコードしている核酸とは同時にかまたは順次に上記に詳述したウイルスベクターのいずれかにクローニングされる。本発明に基づく方法は一般に専門家に知悉されている遺伝子工学的方法で行なわれる（たとえば以下参照、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。治療上有効な遺伝子産物の蛋白配列ないし核酸配列はたとえばＥＭＢＬ遺伝子バンクまたはその他の公的に利用可能な各遺伝子バンクを経て得ることができる。ラットの心臓のＭＬＣ−２遺伝子の配列はＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９）（上記）から既に知られており、ＭＬＣ−２遺伝子の調節核酸配列は図１０から看取することができる。これらの配列とＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９）（上記）に記述されたゲノム遺伝子バンクからの調節配列を含めたＭＬＣ−２遺伝子の分離法とを基礎として、ラット遺伝子と相同な配列をその他の動物または人間からも容易に見いだすことができる。特にその他の動物または人間のゲノム遺伝子バンクにおいて心臓のＭＬＣ −２遺伝子のその他の調節配列を過大な費用を要さずに分離することが可能であるが、それは、すでに述べたように、心臓のＭＬＣ−２遺伝子の５′末端にある調節核酸配列がたとえばラットとニワトリのような発生的に非常にかけ離れた動物種の間でさえも基本的に保存されているからである（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９）、上記）。本発明のもう一つの目的は、本発明に基づく核酸構造体がリポソーム、たとえばＤＥ４４１１４０２に詳細に記載されているたぐいのリポソームと複合される方法に関する。本発明に基づく核酸構造体を心臓疾患の遺伝子治療または心臓疾患遺伝子治療用の医薬の製造に利用することも本発明の別途目的であり、その際の心臓疾患とは好ましくは心不全、拡張性または肥大性の心筋病、ジストロフィー、脈管疾患、高血圧、動脈硬化、血管の狭窄および／または再狭窄である。特に、本発明に基づく核酸構造体が基本的に心室（Ventrikel）において作用するのが好ましい。したがって、本発明に基づく核酸構造体と、場合により、たとえば好ましくは約６．０から約８．０までのｐＨ、とりわけ約６．８から約７．８、特に約７．４までのｐＨおよび／または約２００から約４００ミリオスモル／リットル（ｍｏｓｍ／Ｌ）まで、好ましくは約２９０から約３１０ｍｏｓｍ／Ｌまでのオスモル濃度を備えた生理学的緩衝液を含んだ薬剤キャリアとを含む医薬も本発明のもう一つの目的である。同薬剤キャリアはその他になお適切な安定剤、たとえばヌクレアーゼ抑制剤、好ましくは錯体形成剤、たとえばＥＤＴＡおよび／または専門家に知悉されているその他の助剤も含むことができる。場合により上述したウイルスベクターまたはリポソームと組み合わされた本発明に基づく核酸構造体はたとえばカテーテルを利用して一般に静脈内（ｉ．ｖ．）適用される。好適なのは、たとえば、特に組換えアデノウイルスの形の本発明に基づく核酸構造体を患者の冠動脈に直接に注入することである（“経皮冠動脈遺伝子導入法”ＰＣＧＴ）。とりわけ組換えアデノウイルスの形の本発明に基づく核酸をたとえばＦｅｌｄｍａｎｅｔａｌ．（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９４）ＪＡＣＣ２３５Ａ，９０６−３４）に記述されているようにバルーンカテーテルを用いて適用するのが特に好ましいが、それはこれによってトランスフェクションを心臓に限定できるだけでなく、心臓内のインジェクション箇所にそれを限定することもできるからである。本発明の思いがけない長所は、本発明に基づく核酸構造体が心臓疾患の遺伝子治療に際して高い感染率を示し、トランスフェクションされた細胞中で安定的且つエクスプライム可能であり、特に心筋細胞に対するその特異性を失わない点にある。このことはたとえばｓｍｍｈｃ−プロモーターが新生平滑筋細胞／成体平滑筋細胞に対するその特異性を喪失し（以下の例６、参照）、心臓特異配列ＣＳＳを含まない本発明に基づく核酸構造体の好ましいｍｌｃ−２プロモーターが特にアデノウイルスベクターと結びついてその特異性を保持するという点で驚異的である。したがって本発明の趣旨の特異性として理解されるのは、心筋細胞特に心室におけるｍｌｃ−２プロモーターコントロールされた発現がたとえば血管筋細胞におけるｍｌｃ−２プロモーターコントロールされた発現よりも著しく高いこと、とりわけ発現の差が約１〜３×１０乗、特に３〜６×１０乗、なかんずく約３〜４×１０乗に達することである。また、ｍｌｃ−２プロモーターがルシフェラーゼの発現をαｍｈｃ−プロモーターよりも遥かに強力に心臓に限定することも驚異的であった（以下の例１０、参照）。さらに、本発明に基づく核酸構造体の利用によりｉｎｖｉｖｏ適用後の心臓特異的発現が心室（Ventrikel）に限定されている（以下の例１１、参照）ということも、それによりたとえば心室の収縮力を高めることができることからして特に好適である。以下に図および例に基づいて本発明を詳細に説明する。ただし本発明はこれらの図および例に限定されるものではない。図面の簡単な説明図１は、作製されたプラスミド、ｐＡｄ−Ｌｕｃ、ｐＡｄ−ｒｓｖＬｕｃ、ｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃおよびｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃを図解したものである。ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩは当該酵素の制限酵素切断箇所をあらわしている。ＩＴＲは“逆位末端反復配列［Inverted Terminal Repeat］”を意味し、Ψはパッケージ配列を、ｍｌｃ−２は“ミオシンＬ鎖［myosin lightchai n］”−２ｖ−プロモーターを、ルシフェラーゼはルシフェラーゼコード配列を、Ａｄ９．４−１８ｍ．ｕ．はアデノウイルス・タイプ５の９．４〜１８“マップユニット［map units］”（１ｍ．ｕ．＝３６０ｂｐ）のアデノウイルス配列を、ｏｒｉ／ａｍｐＲは“複製開始点［origin of replication］”とアムピシリン抵抗遺伝子とをそれぞれ意味している。図２は、相同組換えによって得られた、アデノウイルスｄｅ１３２４に由来する組換えアデノウイルスを示したものであり、ルシフェラーゼ遺伝子は元のＥ１領域にクローニングされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は血管平滑筋に特異的なｓｍｍｈｃ−プロモーター（Ａｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃ）、心筋特異的な発現のためのｍｌｃ−２ｖ−プロモーター（Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃ）、正の制御としてのＲＳＶプロモーター（Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃ）によってコントロールされるかまたは負の制御として一つのプロモーター（Ａｄ−Ｌｕｃ）によってコントロールされる。略称は図１と同じである。図３Ａ〜Ｃは、種々の細胞系におけるＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃおよびＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性を示している。それぞれの棒上の細線は平均標準偏差をあらわしている。図４Ａ〜Ｃは、種々の主要細胞組織におけるＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性を示している。それぞれの棒上の細線は実験の平均標準偏差をあらわしている。図５Ａ〜Ｃは、新生ラットの心室に組換えアデノウイルスをインジェクションした後の各種組織におけるＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性を示している。それぞれの棒上の細線は実験の平均標準偏差を表している。図６ＡおよびＢは、組換えアデノウイルスＡＤ．ＲＳＶβｇａｌを洞内インジェクションした後の心筋におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の組織学的検出を示している。図６Ａは心尖（インジェクション箇所）を通る組織断面の写真であり、図６Ｂは左心室を通る組織断面の写真である。棒の長さは１００μｍをあらわしている。図７Ａ〜Ｃは、組換えアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃを洞内インジェクションした後の１２種の組織におけるアデノウイルスＤＮＡの検出を示している。図７Ａは、被検量のＡｄｄｅ１３２４ＤＮＡの増幅によって得られた固有の８６０ｂｐのＰＣＲ産物を含んだ２．４％アガロースゲルの写真を示している。試料としてはラットの１００ｎｇのゲノムＤＮＡがＡｄｄｅ１３２４と混合されて使用された：痕跡１：１０ｐｇ；痕跡２：１ｐｇ；痕跡３：１００ｆｇ；痕跡４：１０ｆｇ；痕跡５：１ｆｇ；痕跡６；０．１ｆｇ；痕跡７：ウイルスＤＮＡなし。Ｍは１ＤＮＡマーカー（１００ｂｐ導体）に対応。図７Ｂは、Ａｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃを洞内インジェクションした後に記載の各組織から分離されていた１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅されて得られた固有な８６０ｂｐのＰＣＲ産物を含んだ２．４％アガロースゲルの写真を示している。ラットの１００ｎｇのゲノムＤＮＡと１ｐｇのＡｄｄｅ１３２４ＤＮＡとの混合によるＰＣＲ法が正の制御として利用され、Ａｄｄｅ１３２４ＤＮＡなしの方法が負の制御として利用された。図７Ｃは、図７Ｂに示したＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ感染された動物のサザンブロットを示している。プローブとしては³²Ｐ標識された８６０ｂｐのＰＣＲ産物が使用された。図８ＡおよびＢは、新生ラットの左心室に洞内インジェクションした後の種々の組織における組換えアデノウイルスＡｄ−αｍｈｃＬｕｃ（図８Ａ）とＡｄ− ｍｌｃＬｕｃ（図８Ｂ）とのルシフェラーゼ活性を示している。図９Ａ〜Ｃは、心房（図９Ａ）および心室（図９Ｂ）における組換えアデノウイルスＡｄ−ｒｓｖＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃ、Ａｄ−αｍｈｃＬｕｃおよびＡｄ−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性を示している。図９Ｃは心房と心室とにおける活性の比を示している。棒は４つの実験の中央値を示しており、図中の点はそれぞれの実験動物の結果および心室と心棒とのルシフェラーゼ活性の比をあらわしている。図１０Ａ〜Ｃは、ラットのＭＬＣ−２ｖ遺伝子の転写開始点（＋１）の上流にある２２１６塩基対長のプロモーターの核酸配列を示している。位置１−１５６の核酸はアデノウイルスＡｄ５のパッケージ配列Ψをコードしている（位置３００−４５６）。制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩのクローニング配列は位置１５８−１６３にあり、ＫｐｎＩのそれは位置１８９−１９４にある。位置１８９ −２４０５にはＭＬＣ−２ｖ遺伝子の２２１６ベースペア長のプロモーターが存在している。ＣＳＳ類似配列は位置６８２−７２４にあり、ＨＦ−３ユニットは位置２２０７−２２１９に、ＭＬＥ１ユニットは位置２２２９−２２４１に、ＨＦ−２ユニットは位置２２７１−２２８９に、Ｅ配列ユニットは位置２３２８− ２３３３に、ＨＦ−１ａユニットは位置２３４０−２３４８に、ＨＦ−１ｂユニットは位置２３４９−２３６１に、転写開始点（＋１）は位置２４０６にある。ルシフェラーゼ・コード配列は位置２４６１で開始する。位置１６６０−２４０６にはプラスミドｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃの７４６ベースペア長の調節配列が位置している（例１、参照）。実施例１．組換えプラスミドｐＡＤ−Ｌｕｃ、ｐＡｄ−ｒｓｖＬｕｃ、ｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ、ｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃおよびｐＡｄαｍｈｃＬｕｃの作製プラスミドｐＡＤ−Ｌｕｃ、ｐＡＤ−ｒｓｖＬｕｃ、ｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ、ｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃ（図１）およびｐＡｄαｍｈｃＬｕｃは、ＢａｍＨＩ −ＫｐｎＩＲＳＶ−βｇａｌ−カセット（“ラウス肉腫ウイルス”プロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ−レポーター遺伝子）がその内在ポリアデニル化信号によりプロモーターなしでか（ｐＡＤ−Ｌｕｃ）またはＲＳＶ−プロモーター（ｐＡＤ−ＲＳＶ−Ｌｕｃ）、ｍｌｃ−２ｖ−プロモーター（ｐＡＤ−ｍｌｃＬｕｃ）、“平滑筋ミオシンＨ鎖”−プロモーター（ｐＡＤ−ｓｍｍｈｃＬｕｃ）または“α−ミオシンＨ鎖”−プロモーター（ｐＡＤ−αｍｈｃＬｕｃ）でルシフェラーゼｃＤＮＡと交換されているプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶβｇａｌ（Ｓｔｒａｄｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．Ｄ．，Ｊ．（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，６２６−６３０）の誘導体である。このためルシフェラーゼ遺伝子をコードしているプラスミドｐＳＶＯＡＬのＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ断片が５′でベクターｐブルースクリプトＳＫ（Ｓｔｒａｔａ遺伝子）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩクローニング切断箇所にサブクローニングされ、これによってプラスミドｐブルースクリプト−Ｌｕｃが産生された（Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．ｅｔａｌ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，７２５ −７３５）。サブクローンｐブルースクリプト−ＬｕｃのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩルシフェラーゼ断片は続いてプラスミドｐＡＤ．ＲＳＶ−βｇａｌのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断箇所にクローニングされ、これによってプラスミドｐＡＤ−Ｌｕｃが産生された。プラスミドｐＡＤ−ｒｓｖＬｕｃのクローニングのため、プラスミドｐＡＤ．ＲＳＶ−βｇａｌのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＲＳＶ−断片（５８７ｂｐ）がサブクローンｐブルースクリプト−ＬｕｃのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断箇所にクローニングされ、これによりプラスミドｐブルースクリプト−ＲＳＶ− Ｌｕｃが産生された。続いてプラスミドｐブルースクリプト−ＲＳＶ−ＬｕｃのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩＲＳＶ−ルシフェラーゼ−断片がｐＡＤ．ＲＳＶ−βｇａｌのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断箇所にクローニングされ、これによってプラスミドｐＡｄ−ｒｓｖＬｕｃが産生された。プラスミドｐＡＤ−ｍｌｃＬｕｃの作製のため、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩｍｌｃ −ルシフェラーゼ断片（７４６ベースペア長の“ミオシンＬ鎖”−２ｖ−プロモーター、図１０、および１．８ｋｂルシフェラーゼ遺伝子）がプラスミドｐＭＬＣＬΔ５′から直接にプラスミドｐＡｄ−ＲＳＶβｇａｌのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断箇所にクローニングされた（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１８１４２−１８１４８）。このためｍｌｃ−２／ルシフェラーゼ−融合体が制限酵素切断箇所ＫｐｎＩで切除され、突出端がいわゆる“Ｋｌｅｎｏｗ−反応”で補充され、両端にＰｖｕＩＩ −リンカーが結合された。続いて４．０ｋｂ長のｍｌｃ−２／ルシフェラーゼ− ＤＮＡ断片が組換えプラスミドｐＡＤ．ＲＳＶβｇａｌと同様にアデノウイルス・タイプ５（Ａｄ５）ゲノムの１．３ｍ．ｕ．領域の３′末端でＰｖｕＩＩ−切断箇所に連結された。プラスミドｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃの作製のため、１．２ｋｂ大のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩｓｍｍｈｃ−断片（ウサギ“平滑筋ミオシンＨ鎖”プロモーター／−１２２５／−４）がプラスミドｐＲＢＳＭＨＣ−１２２５βｇａｌ（Ｋａｌｌｍｅｉｅｒ，Ｒ．Ｃ．ｅｔａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０９４９−３０９５７）から分離され、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切開されたサブクローンｐブルースクリプト−Ｌｕｃにルシフェラーゼ遺伝子の前方へクローニングされ、これによってサブクローンｐ１．２ｓｍｍｈｃブルースクリプト−Ｌｕｃが作製された。このサブクローンのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩｓｍｍｈｃ−ルシフェラーゼ−断片は続いてプラスミドｐＡｄ−ＲＳＶβｇａｌのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断箇所にクローニングされ、プラスミドｐＡＤ− ｓｍｍｈｃＬｕｃが産生された。 “α−ミオシンＨ鎖”−プロモーターを含んだプラスミドｐＡｄ−αｍｈｃＬｕｃ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２４６１３−２４６２０）の作製のため、１０６４ｂｐ大のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片がプラスミドｐブルースクリプト−ＬｕｃのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断箇所にクローニングされた。続いてこれからＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩｍｈｃ−ルシフェラーゼ−断片がプラスミドｐＡｄ．ＲＳＶ−βｇａｌのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ切断箇所にクローニングされ、これによってプラスミドｐＡＤ−αｍｈｃＬｕｃが得られた。２．組換えアデノウイルスの作製組換えアデノウイルスは標準法に基づき、プラスミドｐＡｄ−Ｌｕｃ、ｐＡｄ −ｒｓｖＬｕｃ、ｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ、ｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃおよびｐＡｄ−αｍｈｃＬｕｃとアデノウイルスｄｅ１３２４（Ａｄ５）のゲノムＤＮＡとの間の相同組換えにより２９３−細胞中でｉｎｖｉｖｏ産生された（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９８２）Ｃｅｌｌ３１，５４３−５５１およびＳｔｒａｄｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．Ｄ．ｅｔａｌ．（１９９２），上記、およびＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９−７４）。組換えアデノウイルスはＥ３領域に欠失があり、トランス遺伝子Ｌｕｃ、ＲＳＶ−Ｌｕｃ、ｍｌｃＬｕｃ、ｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃおよびｐＡｄ−αｍｈｃＬｕｃがＥ１領域を代替している。トランスフェクションが行なわれる前日に２×１０⁶個の２９３細胞が小型の細胞培養シャーレに塗着された。Ａｄｄｅ１３２４のゲノムＤＮＡの大型ＣｌａＩ −断片５μｇが５μｇのＡａｔＩＩ直鎖状プラスミドｐＡｄ−Ｌｕｃ、ｐＡｄ− ＲＳＶ−Ｌｕｃ、ｐＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ、ｐＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃおよびｐＡｄ−αｍｈｃＬｕｃと共にリン酸カルシウム法により２９３細胞中で同時トランスフェクションされた。軟寒天（１％シープラークアガロース、１ｘＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン）に入れ、３７℃、５％ＣＯ₂で８〜１０日間培養した後ウイルスプラークが取り出され、２９３細胞でクローン増殖させられた。２×１０⁶個の完全に感染された２９３細胞から組換えウイルスのウイルスＤＮＡが分離され、制限エンドヌクレアーゼでの加水分解によりトランス遺伝子が正しく組み込まれているか否かが検査された。正のウイルスクローンにつき、それらが２９３細胞中で大規模処理用に増殖されて２度の塩化セシウム密度勾配遠心法によって精製される前に、再度個別プラーク精製が実施された（Ｓｔｒａｄｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｌ．Ｄ．，１９９２，上記）。最後に同ウイルスはＴＤバッファ（１３７ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、０．７ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．５ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）透析されて−７２℃で凍結された。組換えアデノウイルスの力価を測定するため、２９３細胞を使用して “プラークアッセイ”が実施された。すべての組換えアデノウイルスは約１０¹¹ “プラーク形成単位”（ｐ．ｆ．ｕ．）／ｍｌの力価を有していた。ウイルス原液のＤＮＡが分離され、制限エンドヌクレアーゼとＰＣＲによる分析によってインサートが正しく組み込まれているか否かが検査された。さらにウイルス原液がＰＣＲによってワイルドタイプＡｄ−５の有無につき検査されたが、５０ｎｇのアデノウイルスＤＮＡになんらのコンタミも検出されなかった（Ｚａｎｇ，Ｗ．Ｗ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１８，４４４−４４７）。３．ルシフェラーゼ測定ｉｎｖｉｔｒｏ−スタディーのため、細胞が感染４８時間後に回収された。続いて蛋白エキストラクト中でのルシフェラーゼ活性が確立されたプロトコールに基づきトランスイルミノメーターＬｕｍａｔＬＢ９５０１（Ｂｅｒｔｏｌｄ、Ｗｉｌｄｂａｄ）を用いて測定された（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＧｒｅｅｎａｎｄＷｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。ルシフェラーゼ活性はｐｇルシフェラーゼ／μｇ蛋白に換算された（Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ，Ｖ．＆Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６，１５７５−１５８６およびＦｒａｎｚ，Ｗ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３，６２９−６３８）。ｉｎｖｉｖｏ−スタディーのため、ラットがインジェクションより５日後に除脳された。１２種の異なった組織（肋間筋、心臓、胸腺、肺臓、横隔膜、腹筋、肝臓、胃、脾臓、腎臓、大腿四頭筋、脳）が採取され、ただちに液体窒素中で凍結された。続いて組織試料が秤量され、２００μｌの溶解バッファ（１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１ｍＭＤＴＴ、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８）に入れられ、ガラス均等器で砕解され、１５分間にわたり４℃にて冷却遠心器で遠心分離された。上清がルシフェラーゼ測定に使用された（Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．３，５７９−５８４およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）、上記）。これに基質ルシフェリンとＡＴＰとが添加され、ルシフェラーゼ活性と比例関係にある発光が５６０ｎｍにてトランスイルミノメーターで測光測定された。ルシフェラーゼ活性は非感染動物の種々の組織に関して調査されたバックグラウンド活性を差し引いた後、“相対光単位”（ＲＬＵ）／ｍｇ組織湿重量で表わされた。４．βガラクトシダーゼ測定新生ラットの心臓が窒素冷却されたイソペンタン中で凍結され、−７０℃で保存された。同心臓組織はＯ．Ｃ．Ｔ．（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ．Ｍｉｌｅｓ，ＵＳＡ）凍結包埋剤に包埋され、１０μｍの組織切片がクリオスタット（Ｆｒｉｇｏｃｕｔ２８００Ｅ，Ｌｅｉｃａ）で作製された。続いて同切片は１０分間にわたり溶液Ａ（ＰＢＳ、０．２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ₂）で固定され、３×１０分間にわたり溶液Ｂで洗浄され（ＰＢＳ、０，０１％（ｖ／ｖ）ナトリウム−デオキシコール酸、０．０２％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ４０、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ₂）、一晩にわたり３７℃にて溶液Ｃで染色された（溶液Ｂ＋１ｍｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌ、５ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆、５ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆）。続いて溶液Ｂで一回、蒸留水で一回、１０分間にわたり洗浄が行なわれた。ヘマトキシリンとエオシンによる弱い対比染色ならびに試料の脱水と包埋が標準プロトコールにしたがって行なわれた（Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ａ．＆Ｚａｃｈｇｏ，Ｊ．（１９９３）“ＧｅｎｅａｎｄｅｎｈａｎｃｅｒｔｒａｐｓｃｒｅｅｎｉｎＥＳｃｅｌｌｃｈｉｍｅｒａｓ”、以下収載：Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（ｅｄ．）ＧｅｎｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｎｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１８１−２２５）。５．ＰＣＲ法によるアデノウイルスＤＮＡの検出実施例３のルシフェラーゼ測定と並行して、アデノウイルス感染された新生ラットの組織ホモジネートの沈殿物からＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｕｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ）を使用しメーカーの指定にしたがってゲノムＤＮＡが抽出された。それぞれ、Ａｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ＲＳＶ−ＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃで感染された２匹の動物がインジェクションされたウイルスの組織内分布に関して、アデノウイルスＤＮＡ検出のためのＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって検査された（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｗ．（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１８，４４４−４４７）。このため１００ｎｇのゲノムＤＮＡが試料として、４０ｎｇのオリゴヌクレオチドＥ２Ｂ−１とＥ２Ｂ−２および反応量２５ μｌのプロメガの１．２５ＵＴａｑポリメラーゼと共に使用された。固有なＰＣＲ産物のゲル電気泳動は８６０ｂｐバンドを結果した。ＰＣＲの感度はプレテストによって測定された。このため非感染ラットのゲノムＤＮＡ１００ｎｇが被検量のＡｄｄｅ１３２４ＤＮＡと混合され、ＰＣＲ反応の試料として使用された。ＰＣＲの検出感度を向上させるため、ＰＣＲ産物が毛管ブロットによってジーンスクリーンプラス・ナイロン膜（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）上に移され、続いてサザンブロット・ハイブリダイゼーション法によって検出が行なわれた（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９８９），上記）。プローブとしてはＰＣＲによって増幅された、正の制御のアデノウイルス８６０ｂｐＤＮＡ断片が使用された。同ＰＣＲ産物はゲルから精製され、“ランダム・ヘキサヌクレオチドプライム”により³²ｐ放射線マーキングされ、ハイブリダイゼーションの試料として使用された。こうした方法でＰＣＲ検出感度は１０倍から１００倍まで向上させることができた。６．細胞系の感染（ｉｎｖｉｔｒｏ）Ａ１０細胞（ラットの平滑筋細胞株）、Ｈ９ｃ２細胞（ラットの心臓筋芽細胞 −細胞株）およびＨｅＬａ細胞（ヒトの頚癌−細胞株）が“ダルベッコの改良されたイーグル培地“（ＤＭＥＭ）で、２９３細胞をＭＥＭに補足して、１０％ウシ新生児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭＬ−グルタミンで培養された。感染１日前に、確立された細胞株Ｈ９ｃ２、Ａ１０およびＨｅＬａの１×１０⁵個の細胞がトリプルで“１２ｗｅｌｌ”培養シャーレに塗着された。細胞は“感染の多重度”（ｍ．ｏ．ｉ．）１０の組換えアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ＲＳＶＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃおよびＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃを含んだ０．２ｍｌのそれぞれの無血清培地で培養された（１０ウイルス／細胞）。軽く揺すりながら３７℃ にて１時間培養した後、１５分毎にそれぞれの完全培地２ｍｌが加えられた。すべての感染実験は４回繰り返された。感染３日後に上述したようなルシフェラーゼ活性が測定された。実験結果は図３にあらわされている。検査されたすべての細胞系の場合に、アデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性はプロモーターなしのアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃでの負の制御よりも低いことが認められる。Ａｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃはＨｅＬａ細胞系で高い活性を示し、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃは正の制御としてすべての被検細胞系で最高のルシフェラーゼ活性を示している。７．組織培養における一次細胞の感染（ｉｎｖｉｔｒｏ）生後２〜３日の新生ラットの一次心筋細胞がＳｅｎ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９１３２−１９１３６に述べられているようにして調整され、培養された。感染１日前に２×１０⁵個の調整したての新生心筋細胞がトリプルで“１２ｗｅｌｌ”培養シャーレに塗着された。同細胞は“感染の多重度”（ｍ．ｏ．ｉ．）１０の組換えアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ＲＳＶＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃおよびＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃを含んだ０．２ｍｌのそれぞれの無血清培地で培養された（１０ウイルス／細胞）。軽く揺すりながら３７℃にて１時間培養した後、１５分毎にそれぞれの完全培地２ｍｌが加えられた。すべての感染実験は４回繰り返された。ラットの一次新生／成体平滑筋細胞が同様にして感染された。実験結果は図４にあらわされている。新生心筋細胞の場合にのみ組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性はアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃでの負の制御よりも高いが、アデノウイルスＡｄ−ｒｓｖＬｕｃでの正の制御よりも低く、ただし平滑筋細胞におけるよりも３００〜９００倍高いことが認められる。さらに、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性はＡｄ−ｓｍｍｈｃＬｕｃのそれよりも１２９倍高いことも認められる。これから、ｍｌｃ−２プロモーターは新生心筋細胞中では活性を有するが、他方、ｓｍｍｈｃプロモーターに予測された活性は新生／成体平滑筋細胞では生じなかったと結論することができる。８．新生ラットの左心臓腔への組換えアデノウイルスの洞内インジェクションすべてのインジェクションは特に病原汚染のない生後２〜３日のＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（ＣＲＷｉｇａ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）で実施された。インジェクションの実施前にこれらの新生ラットは３〜５分間のメトキシフルラン（Ｍｅｔｏｆａｎｅ，ＪａｎｎｓｓｅｎＧｍｂＨ社）の吸入によって麻酔された。組換えアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃの２×１０⁹“プラーク形成単位”（ｐ．ｆ．ｕ．）が２０μｌ、ツベルクリン注射針（２７．５ｇａｕｇｅ）を用いてインジェクションされた。インジェクションは第４肋間腔の横から胸廓を貫き心室への直接の穿刺によって行なわれた。心臓血液の吸引により針の先端が確実に洞内ポジショニングされた。ツベルクリン注射器によりウイルスの緩慢なインジェクション（２０μｌ／ｍｉｎ）が実現された。大腿四頭筋への組換えアデノウイルスのインジェクションも同様にして実施された。インジェクションから５日後に１２種類の組織（肋間筋、心臓、胸腺、肺臓、横隔膜、腹筋、肝臓、胃、脾臓、腎臓、脳および大腿四頭筋）におけるルシフェラーゼ活性が測定された。測定されたＲＬＵ／ｍｇ組織中でのルシフェラーゼ活性は図５にまとめられている。心筋特異的なｍｌｃ−２ｖプロモーターを備えたアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃは心筋に限定されたルシフェラーゼ活性を示した（図５ｃ）。正の制御Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃのインジェクションは肋間筋、心臓においてもっとも高いルシフェラーゼ活性を示すと共に肺臓、胸腺および横隔膜において強いルシフェラーゼ活性を示した（図５ｂ）。Ａｄ−Ｌｕｃインジェクションされた動物の場合には肋間筋、心臓および横隔膜にわずかなルシフェラーゼ活性が測定された（図５ａ）。心臓ではＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ誘発されたルシフェラーゼ活性はＡｄ−Ｌｕｃ誘発されたそれよりも１７倍も高く、他方、その他のすべての組織ではＡｄ−ＬｕｃとＡｄ−ｍｌｃＬｕｃとのルシフェラーゼ活性は同程度であった。これにより、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃは特異的に心臓において活性を示すことが明らかとなった。新生ラットの心室にアデノウイルスがインジェクションされた後の感染心筋細胞の分布は予備実験において組換えアデノウイルスＡｄ−ｒｓｖβｇａｌのインジェクションによって付加的にチェックされた。組換えアデノウイルスＡｄ−ｒｓｖβｇａｌは“ラウス肉腫ウイルス”（ｒｓｖ）プロモーターのコントロール下でレポーター遺伝子としてのβ−ガラクトシダーゼをエクスプライムする。インジェクションから５日後に動物の剖検が行なわれ、β−ガラクトシダーゼの発現がトランス遺伝子の染色によって測定された。組織切片中では核が青く染まっていることにより感染細胞を識別することができる。心筋のβ−ガラクトシダーゼ活性の約半分が心室への穿刺箇所の部域に認められた。注射針の経路に沿ってほぼすべての心筋細胞にβ−ガラクトシダーゼ活性が見いだされたが（図６ａ）、他方、それ以外の心筋では感染心筋細胞の数はわずかであった（図６ｂ）。９．新生ラット大腿筋組織への組換えアデノウイルスのインジェクション骨格筋中でのｍｌｃ−２ｖプロモーターの活性を検査するため、３種の組換えアデノウイルスＡｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃの２×１０⁹“プラーク形成単位”（ｐ．ｆ．ｕ．）が２０μｌ、新生ラットの右大腿筋−大腿４頭筋−にインジェクションされた。インジェクションより５日後にルシフェラーゼ活性が測定された。Ａｄ−ＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃはインジェクションされた筋肉中において同程度の低いルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇ組織）を示していたが、他方、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃは非常に強い活性を示していた（表１）。Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃによって達成されたルシフェラーゼ活性はＡｄ−ｒｓｖＬｕｃのルシフェラーゼ活性の０．０５％であった。これらのデータはＡｄ−ｍｌｃＬｕｃが骨格筋中においては不活性であることを示すと共に組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃによる心筋特異的な遺伝子発現を裏付けている。１０．心室への組換えアデノウイルスのインジェクション後の組織内アデノウイルスＤＮＡの検出心室に組換えアデノウイルスをインジェクションした後の非心臓組織の感染の程度を測定するため、１２種類の組織（肋間筋、心臓、胸腺、肺臓、横隔膜、腹筋、肝臓、胃、脾臓、腎臓、脳、大腿四頭筋）からゲノムＤＮＡが分離され、これらの組織中におけるアデノウイルスＤＮＡの存在がＰＣＲ法によって測定された。Ａｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｒｓｖＬｕｃおよびＡｄ−ｍｌｃＬｕｃで感染されたそれぞれ２匹の動物の組織が検査に付された。予備実験において、非感染ラットのゲノムＤＮＡ１００ｎｇを被検量のアデノウイルスＤＮＡＡｄｄｅ１３２４（１０ｐｇから０．１ｆｇまで）と混合し、続いてＰＣＲ法での検査に付すことにより、アデノウイルスＤＮＡの検出感度が測定された。その際、非感染ラットのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ中になお１０ｆｇのアデノウイルスＤＮＡＡｄｄｅ１３２４が検出され得ることが判明した。これは細胞あたり０．０１７のアデノウイルスゲノムに相当している（図７Ａ）。アデノウイルス感染された動物の場合には、肋間筋、心臓、胸腺、肺臓、横隔膜および肝臓においてウイルスＤＮＡが正式に検出された（図７Ｂ）。アデノウイルスＤＮＡの検出感度を高めるため、ＰＣＲ産物がナイロン膜上に移され、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法による検出に付された。その結果、アデノウイルスＤＮＡは個々の動物間でわずかな相違はあるにせよその他の組織においても微量で検出されることが明らかとなった。図７ＣにはＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ感染された動物の代表的なサザンブロットが示されている。上述した実験は、組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃの遺伝子発現は心筋特異的なｍｌｃ−２ｖプロモーターに帰着され、局部的に高いウイルス濃度に帰せられるものではないとのことを示している。１１．ｍｌｃプロモーターとαｍｈｃプロモーターとの比活性の比較約２×１０⁹“プラーク形成単位”の組換えアデノウイルスＡｄ−αｍｈｃＬｕｃ（図８Ａ）とＡｄ−ｍｌｃＬｕｃ（図８Ｂ）とを新生ラットの左心室に洞内インジェクションした後、双方のアデノウイルスにつき心臓において最も高いルシフェラーゼ活性が検出された。ただし組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃの活性は心臓においてＡｄ−ｍｈｃＬｕｃよりも３〜４倍高い。他方、組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｈｃＬｕｃの活性は腎臓、脾臓、肝臓、横隔膜、肺臓および肋間筋においてＡｄ−ｍｌｃＬｕｃよりも高い。したがって、ｍｌｃ−２プロモーターはアデノウイルスベクター系においてルシフェラーゼの発現をαｍｈｃプロモーターよりも遥かに強力に心臓に限定し、さらに心臓におけるｍｌｃ− ２プロモーターの活性はαｍｈｃプロモーターのそれよりも３〜４倍高いと結論することができる。１２．心室特異的発現の検出２×１０⁹“プラーク形成単位”の組換えアデノウイルスＡｄ−ｒｓｖＬｕｃ、Ａｄ−ｍｌｃＬｕｃ、Ａｄ−ｍｈｃＬｕｃおよびＡｄ−Ｌｕｃが２０〜４０μ ｌで新生ラットの左心室にインジェクションされた。インジェクションより５日後に組織が分析された。４回の独立した実験において、組換えアデノウイルスＡｄ−ｍｌｃＬｕｃについてのみ心室に限定された遺伝子発現を認め得ることが明らかとなった（図９）。心室におけるＡｄ−ｍｌｃＬｕｃのルシフェラーゼ活性と心房におけるそれとの比は約３０であり、他方、他のすべてのウイルスについてはそれは１〜２倍であった（図９Ｃ）。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Gene therapy nucleic acid constructs, their manufacture and their use in treating heart disease The invention relates to the information of therapeutically effective gene products, antisense nucleic acids or ribozymes. Heart myosin L2 chain gene operably linked to a nucleic acid encoding a reporter Gene therapy nucleic acid constructs and regulatory nucleic acid sequences at the 5 'end of (MLC-2) The present invention relates to a method for producing the same and its use for gene therapy for heart disease. Myocardial disease takes the form of both systolic and electrophysiological disorders, A group of hearts that eventually lead to severe heart failure and / or sudden electrophysiological cardiac death Includes visceral muscle disorders. Well-known forms of dilated and hypertrophic cardiomyopathy The investigation of the central causes of the disease is currently the subject of numerous scientific studies. In this connection, very recently, the causes of heart muscle disease have been elucidated at the molecular level. Was. For example, the so-called Duchenne muscular dystrophy (DMD) is also a cause of cardiomyopathy. Becomes DMD is caused by mutation and deletion of the dystrophin gene. Genetic disease. The dystrophin gene is located on the x chromosome, In particular, it is particularly primed in cardiomyocytes. In addition, chronic congestive heart In the case of paralysis (CHF), the myocardium is less than 50% β-added compared to a healthy myocardium. It was found that it contained only renergic receptors. Therefore, confirmation of gene defects or mutation of gene expression in diseased myocardial tissue Depending on the detection, the possibility arises of treating the disease by molecular biological methods. Its meaning In taste, for example, gene transfer into somatic cells is useful for the treatment of hereditary heart muscle disease. And a promising way. There are various methods for gene transfer into somatic cells, such as DNA injection. Gene transfer, liposome-assisted gene transfer or retroviral vector, Gene transfer by adenovirus vector or adeno-associated virus vector Is suitable. Key prerequisites for successful gene therapy are high infection rates and stable Gene expression and tissue specificity. WO94 / 11506 contains examples of successful gene transfer and coronary vascular smooth muscle cells and Β-galacto under control of the CMV promoter in both cardiomyocytes Successful expression of the gene encoding the sidase is shown. However, myocardium specific Expression had not been achieved. In this specification, generally, cardiac-specific troponin Although the C (cTNC) promoter has been pointed out, it has been shown that cardiac-specific in vivo Expression is not shown. Franz, W.C. -M. et al. (1994) C ardioscience, 5, 235-243, no. From 4, fertilized mau Myosin L2 chain (MLC-2) promoter lucifer Microinjection of naked DNA of the lase fusion gene Generation of transgenic mice that show myocardium-specific expression of the ERase gene It has been known. Myosin, the main component of myocardium and other muscles with printed structures, has two heavy chains (MHC) and two pairs of myosin light chains (MLC). MLC again It is divided into non-oxidizable chains (MLC-1) and phosphorylatable chains (MLC-2). You. To date, regulation of the skeletal and cardiac muscle of the rat at the 5 'end of the MLC2 gene Nucleic acid sequence (promoter) is different, but ML of rat and chicken myocardium That of the C2 gene is conserved despite their developmental separation (Henderson, SA et al. (198) 9) J.I. Biol. Chem. 264, 18142-18148). by the way Lee et al. (Lee, KJ et al. (1994) Mol. C. ell. Biol. , 14, 1220-1229, no. 2) is genetic transformation Based on the mouse, a positive (H) within 250 base pairs upstream of the transcription start site F-1a and HF-1b) control units and negative (E-sequence and HF-3) expression Combination with the control unit has so far been gene therapy in vivo o Causes ventricular-specific expression, although retention of specificity upon application has not been demonstrated I found something to do. However, Franz et al. (1994) (above) Is another alternative for myocardial-specific expression, also based on transgenic mice. A regulatory sequence, the so-called myocardial specific sequence (CSS), ie about 1 upstream of the transcription start site. They found that a repressor unit at 700 base pairs was required. From these results, the mechanism of cardiac-specific expression of genes has not yet been elucidated. Heart-specific expression of the gene after in vivo application had not yet been found. Is recognized. Therefore, an object of the present invention is to provide a high infection rate and low cost for gene therapy of heart disease. Find nucleic acid constructs with defined gene expression and especially specificity for cardiomyocytes It was out. Accordingly, it is an object of the present invention to provide therapeutically effective gene products, antisense nucleic acids or Is heart-friendly, operatively linked to the nucleic acid encoding ribozyme information Or myocardium in the heart of mammals, especially human or rodent, especially rat hearts. Gene therapy including regulatory nucleic acid sequence at the 5 'end of the thin L2 chain gene (MLC-2) It is a nucleic acid structure. What is understood as a regulatory nucleic acid sequence for the purposes of the present invention is generally referred to as the MLC-2 family. A nucleic acid sequence upstream of the transcription start site (+1) of the gene, comprising The transcription of the downstream nucleic acid sequence linked by the Is a nucleic acid sequence that controls in terms of myocardial tissue specificity, in other words, The nucleic acid sequence is operably linked to a downstream nucleic acid sequence. MLC-2 inheritance in the heart From about +18 to -19th to about -800th from the transcription start point of the child Is particularly preferred (see FIG. 10), which is about 800 upstream of the transcription start site. Although base pairs do not contain the so-called heart-specific sequence CSS, sufficient to result in cardiac-specific expression and especially ventricular-specific expression during vo application It was especially noticeable. Based on cardiac MLC-2 gene transcription start site Approximately +18 or -19th to approximately -1600th, especially about +18 The sequence from the -19th to about the -1800th, especially about +18 to -1 9th to about -2100th or about +18 to -19th to about -2700 The first up to the second sequence are still another preferred embodiment (see FIG. 10). Same adjustment The nucleic acid sequence may be, in particular, a TATA sequence, HF-1a, HF-1b, HF-2, HF-3. , E sequence, MLE1 and / or CSS sequence, especially TATA sequence, HF-1a , HF-1b, HF-2, HF-3, E sequence and / or MLE1 It includes one or more adjustment units. For example, the regulatory nucleus of the rat In the case of the acid sequence, the TATA sequence is based on the transcription start point of the MLC-2 gene. It is a conserved 28-base sequence between about -198 and -19. HF-1 unit is between about -72 and -45, especially HF-1a unit Is Between about -57 and -65, the HF-1b unit is about -45 and -56. The HF-2 unit is between about -123 and -134, HF- 3 units are between about -186 and -198, and the E sequence is about -72 and -198. Between the 77th position, the MLE1 unit is approximately between the -165th and -176th positions, C The SS-like unit is between the -1723th and the -1686th (FIG. 10, reference). In the case of the rat MLC-2 gene, the TATA sequence of the regulatory sequence, HF -1b unit, HF-1a unit, E sequence unit, HF-2 unit, M The LE1 and HF-3 units are in this order upstream of the transcription start site of the gene. In the first 200 bases (see FIG. 10). For cardiac-specific expression, the nucleic acid construct according to the present invention comprises an HF-1a unit, HF -1b unit, MLE1 unit and HF-3 unit, preferably in E configuration Including with a row unit, especially an E-array unit and / or an HF-2 unit Is preferred. In each case, the nucleic acid structure according to the present invention is added. Preferably, it includes a cardiac specific sequence CSS. What is understood as a gene therapy nucleic acid construct for the purpose of the present invention is, in particular, a DNA sequence. Sequence or RNA sequence, preferably single-stranded or double-stranded, especially double-stranded DNA sequence A nucleic acid structure having a nucleic acid sequence of Medications, especially heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophy, pulse Suitable for the treatment of vascular disease, hypertension, arteriosclerosis, stenosis or restenosis of blood vessels Can be. The nucleic acid construct according to the invention is preferably a viral vector and / or a liposome. Adenovirus vectors, preferably replication defective Virus vector or adeno-associated virus vector, especially exclusively the inverted end It is ligated with an adeno-associated virus vector consisting of a repeat sequence (ITR). Book A particularly preferred embodiment of the invention relates to a nucleic acid construct according to the invention and an adenovirus vector. Genetically engineered with a replication-defective adenovirus vector. Adenovirus vectors and especially replication-defective adenovirus vectors are: Particularly preferred for reasons: Human adenovirus has two genomes of about 36 kilobase pairs (Kb). Belongs to the class of strand DNA viruses. The virus DNA is about 2700 species Encoding gene products that are based on the adenovirus replication cycle It is divided into early ("early gene") products and late ("late genes") products. “First The late gene is subdivided into four transcription units, E1 to E4. It encodes a pseudoprotein. Immunologically at least 42 adenowis Russ and subgroups AF are distinguished, all of which are appropriate for the present invention. It is. Viral gene transcription is a transactivator of adenovirus gene expression. The expression of the E1 region encoding the promoter is assumed. All subsequent widgets This correlation between the expression of the Lus gene and the E1 transactivator indicates that it is replication incompetent It can be used for the production of adenovirus vectors (for example, see below, M cGrory, W.C. J. et al. (1988) Virol. 163,614 -617 and Gluzman, Y .; et al. (1982), "Eukar yotlc Viral Vectors (Gluzman, Y. ed) 187 -192, Cold Spring Harbor Press, Cold S (Pring Harbor, New York). Adenovirus vector, special A type 5 adenovirus vector (see below for sequence, Chromobo czek, J .; et al. (1992) Virol. 186,280-285 ) And above all subgroup C viral vectors The gene region is a foreign gene having a unique promoter or a nucleic acid according to the present invention. Replaced by structure. E, which is a prerequisite for the subsequent expression of adenovirus genes This exchange of one gene region results in a replication incompetent adenovirus. these Of the virus is therefore a single cell line that replaces the missing E1 gene. Can only proliferate. Thus, replication deficient adenoviruses generally make copies of the E1 region in the genome. In a so-called 293 cell line (human embryonic kidney cells) stably integrated into It is formed by replacement. For this reason, a unique promoter (for example, based on the present invention) Under control of the nucleic acid sequence (for example, based on the present invention). Therapeutically effective gene products or markers, such as β-galactosidase / nucleic acid sequence for β-Gal) is cloned into a recombinant adenovirus plasmid. Is performed. Subsequently, the plasmid pAd. mlc-2 / β-Gal and E1 deleted ade Virus genome such as d1327 or de1324 (adenovirus 5 ) Is performed in the helper cell line 293. Recombination is successful If performed well, a viral plaque is obtained. The replication deficiency window thus produced Lus then has a high titer (eg, 10⁹-10¹¹“Plaque-forming units ming unit) ”) used for infection of cell culture or somatic cell gene therapy. In general, the exact location of foreign DNA in the adenovirus genome is a critical issue is not. For example, foreign DNA can be cloned into the E3 gene deletion site. (Karlsson, S. et al. EMBO J. 1986) , 5,2377-2385). However, the E1 region or a part thereof, for example, E1A Or E1B (see, for example, WO 95/00655), notably the E3 region Even in the case of deletion, it is preferable that the DNA be replaced by foreign DNA. However, the present invention is not limited to the adenovirus vector system. Deno-associated virus vectors can also be combined with nucleic acid constructs according to the present invention for the following reasons: Particularly suitable for: AAV virus belongs to the Parvoviridae family. This is 18-30n in diameter m is characterized by an icosahedral unenclosed capsid, which is approximately 5 kb Contains linear single-stranded DNA. Host cells are helical for efficient AAV growth Co-infection with the par virus is necessary. Suitable as a helper For example, adenovirus (Ad5 or Ad2), herpes virus and vaccine Tinia virus (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Mi. crobiol. Immunol. 158, 97-129). HELPAU If the virus does not intervene, the AAV goes into a latent state, The nom is stably integrated into the host cell genome. Integrated into the host genome The properties of AAV are particularly interesting as transduction vectors for mammalian cells. is there. For the vector function, generally two inversion terminals of about 145 bp in length are used. Inverted terminal repeats (ITR: for example, WO 95/238) 67, suffices. This includes replication, packaging and host cell genomics. It holds the "cis" signal required for integration into the system. Recombinant vector particles Non-structural protein (rep-protein) gene and structural protein for packaging to offspring (Cap-protein) gene and vector plasmid containing adenovirus Transfected into stained cells. A few days later, in addition to the recombinant AAV particles, A cell-free lysate is created that also contains the denovirus. Adenovirus heats to 56 ° C Or separation by band integration in cesium chloride density gradient centrifugation can do. By this co-transfection method, 10^Five-10⁶IE / rAAV with a titer of ml can be obtained. Wild type virus Tami should have no overlap between the sequences of the packaging plasmid and the vector plasmid. Is below the detection limit (Samulski, RJ (1989) J. Vi). rol. 63, 3822-3828). Introduction of foreign genes into somatic cells can be performed by AAV into differentiated quiescent cells. This is particularly suitable for cardiac gene therapy. As mentioned above Guarantees long-lasting gene expression in vivo, but this is also a feature It is suitable for. A further advantage of AAV is that the virus is pathogenic for humans. Without the need to be relatively stable in vivo. Based on the present invention Cloning of the nucleic acid construct into an AAV vector or a portion thereof can be performed, for example, using W O95 / 23867, Chiorini, J .; A. et al. (1995) H umane Gene Therapy 6,1531-1541 or Kot in, R .; M. (1994) Human Gene Therapy 5,79 It should be performed according to methods known to the expert, such as those described in 3-801. Will be Another preferred combination of the spirit of the invention is a nucleic acid construct according to the invention and a liposome. Complex with the chromosome, which is very high, especially for cardiomyocytes This is because transfection efficiency can be achieved (Felgner , P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417). For lipofection, liposome suspension Sonication of the suspension produces monolayer vesicles composed of cationically charged lipids. DN A is ion-bonded to the surface of the liposome, and a positive net charge remains on the liposome. The DNA is bound in such a manner that the DNA is complexed by 100% liposomes. this while In Felgner et al. (1987, supra) The mixture DOTMA (1,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammonium) Bromide) and DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamido) In addition, many new lipid preparations have been synthesized, Its efficiency with respect to transfection was tested (Behr, JP et al. . (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,698 2-6986; Felgner, J .; H. et al. (1994) J. Am. Bio l. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X .; & Huang, L . (1991) Biochem. Biophys. Res. Commu. 179 280-285; Zho, X .; & Huang, L.A. (1994) Bioch em. Biophys. Acta 1189, 195-203). Made of new lipid An example of the agent is DOTAP N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl]- N, N, N-trimethylammonium methyl sulfate or DOGS (tiger (Dioctadecylamidoglycylspermine). DNA- Preparation of liposome complex and its application in cardiac-specific transfection An example of this is described in DE 4411402. Suitable as therapeutic gene products are, for example, dystrophin, β-ad Linergic receptors, nitric oxide synthase or, for example, a central defect Supplements and prevents or reduces electrophysiological disorders or other cardiac-specific All other gene products that can alleviate or cure the disease. Special Preferably, the gene (transgene) encoding the therapeutic gene product is preferably One containing an intron between the promoter and the start codon of the transgene Or comprising multiple non-coding sequences and / or especially the 3 'end of a transgene At the end a poly A sequence, such as the endogenous poly A sequence of each gene, preferably S It preferably contains the polyA sequence of the V40 virus, which This makes it possible to stabilize mRNA in cardiomyocytes (Jac kson, R .; J. (1993) Cell 74, 9-14 and Palmit. er, R .; D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 88, 478-482). However, nucleic acids functionally linked to regulatory nucleic acids of the MLC-2 gene are therapeutically valuable. Not only are nucleic acids encoding potent gene products, but also "antisense "Nucleic acids, preferably" antisense "oligonucleotides, especially" antisense " "Nor is a nucleic acid encoding a DNA oligonucleotide or ribozyme. You. By "antisense" oligonucleotides and by ribozymes Can also specifically reduce or prevent gene expression in the heart This leads to a number of heart-specific diseases, such as arteriosclerosis or restenosis, Autoimmune or cancer diseases can also be treated (see, eg, Ba, below). rr, E.C. & Leiden, J. et al. M. (1994) Trends Cardi ovasc. Med. No. 4, 57-63, No. 2 and Bertrand, E .; et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22,293 -300). A method for producing a nucleic acid structure according to the present invention is another object of the present invention. The regulatory nucleic acid sequence detailed above in the method may be a therapeutically effective gene product or an anti- It is operably linked to a sense nucleic acid or a nucleic acid encoding a ribozyme. Like In a preferred embodiment, the regulatory nucleic acid is combined with a therapeutically effective gene product or anti- The nucleic acid encoding the sense nucleic acid or ribozyme may be simultaneously or sequentially Cloned into any of the viral vectors detailed above. The method according to the present invention is generally performed by genetic engineering methods known to experts. (See, eg, Maniatis et al. (1982) Mo. See, for example, the circular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New Yo rk). The protein or nucleic acid sequence of a therapeutically effective gene product is, for example, EMBL Can be obtained via the gene bank or other publicly available gene banks it can. The sequence of the rat heart MLC-2 gene is described in Henderson, S .; A . et al. (1989) (supra), the MLC-2 gene The regulatory nucleic acid sequence of can be seen in FIG. These sequences and Hende rson, S.M. A. et al. (1989) Genomic inheritance described in (above) Based on the method of isolating the MLC-2 gene including the regulatory sequence from the child bank, Tsu Can be easily found in other animals or humans. Wear. Cardiac MLC, especially in other animal or human genomic gene banks It is possible to separate other regulatory sequences of -2 gene without incurring excessive costs. However, it is at the 5 'end of the cardiac MLC-2 gene, as already mentioned. If the regulatory nucleic acid sequence is very distant in development, for example in rats and chickens Even between species are essentially preserved (Henderson, S . A. et al. (1989), supra). Another object of the present invention is that the nucleic acid construct according to the present invention is a liposome, e.g. For example, complexed with liposomes as described in detail in DE 4411402 About the method. Gene therapy for heart disease or gene therapy for heart disease using nucleic acid constructs according to the present invention It is also another object of the present invention to utilize it for the manufacture of a medicament for the treatment of heart disease. Preferably heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophy, vascular disease Hypertension, arteriosclerosis, stenosis and / or restenosis of blood vessels. In particular, the present invention Preferably, the nucleic acid construct based on acts essentially in the ventricle (Ventrikel) . Thus, a nucleic acid construct according to the invention and optionally, for example preferably PH from about 6.0 to about 8.0, especially about 6.8 to about 7.8, especially about 7. PH and / or from about 200 to about 400 milliosmol / liter (m osm / L), preferably from about 290 to about 310 mosm / L. The present invention also provides a medicament comprising a drug carrier containing a physiological buffer having a Another purpose. The drug carrier may also contain other suitable stabilizers, such as Creatase inhibitors, preferably complexing agents such as EDTA and / or Other auxiliaries known to the gatekeeper may also be included. The present invention, optionally in combination with a viral vector or liposome as described above The nucleic acid constructs based on light are generally intravenous (iv. ) Applied. Preference is given, for example, to the invention, in particular in the form of a recombinant adenovirus. Is to inject a nucleic acid construct based on a direct injection into a patient's coronary artery (“percutaneous coronary artery The gene transfer method "PCGT", especially according to the invention in the form of a recombinant adenovirus For example, nucleic acids are described in Feldman et al. (Feldman, L.J.e. t al. (1994) JACC 235A, 906-34). It is particularly preferable to use a balloon catheter as described above. Thus, transfection can be limited to the heart, This is because it can be limited to the action location. An unexpected advantage of the present invention is that the nucleic acid construct according to the present invention can It shows a high infection rate upon treatment and is stable and stable in transfected cells. Is exempt and does not lose its specificity, especially for cardiomyocytes is there. This means, for example, that the smmhc-promoter is Loss of its specificity for smooth muscle cells (see Example 6, below) and the cardiac-specific sequence CS A preferred mlc-2 promoter of the nucleic acid construct according to the invention without S is particularly Amazing in that it retains its specificity by binding to an adenovirus vector It is. Therefore, it is understood that the specificity of the gist of the present invention is that cardiomyocytes, particularly Mlc-2 promoter-controlled expression in the ventricle Mlc-2 promoter significantly higher than cell-controlled expression in cells In particular, the difference in expression is about 1 to 3 × 10 power, especially 3 to 6 × 10 power, especially About 3 to 4 × 10 power. Also, the mlc-2 promoter is Lucif. Restricting the expression of cellulase to the heart much more strongly than the αmhc-promoter Were both surprising (see Example 10, below). Furthermore, the nucleic acid structure according to the invention Use of the body causes cardiac-specific expression after in vivo application to ventricle (Ventrikel) Limited (see Example 11, below) also means that, for example, the ventricles This is particularly preferable because it can increase the shrinkage force. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings and examples. However, the present invention However, the present invention is not limited to the figures and examples of FIG.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the plasmids prepared, pAd-Luc, pAd-rsvLuc, p 1 illustrates Ad-mlcLuc and pAd-smmhcLuc. B amHI, KpnI and HindIII indicate the restriction enzyme cleavage sites of the enzyme. I do. The ITR stands for “Inverted Terminal Repeat”. Taste, Ψ indicates a package sequence, mlc-2 indicates “myosin light chain [myosin lightchai n] "-2v-promoter and luciferase the luciferase coding sequence. , Ad9.4-18m. u. Is the adenovirus type 5 9.4-18 " Adenovirus sequence of "map units" "(1 mu = 360 bp) And ori / ampR is "origin of replication" And the phosphorus resistance gene. FIG. 2 is derived from adenovirus de1324, obtained by homologous recombination. Luciferase gene is the original E1 Region cloned. Luciferase gene expression is specific to vascular smooth muscle Smmhc-promoter (Ad-smmhcLuc), for myocardium-specific expression Mlc-2v-promoter (Ad-mlcLuc) for positive control Controlled by the RSV promoter (Ad-rsvLuc) or Is controlled by one promoter (Ad-Luc) as a negative control. It is. Abbreviations are the same as in FIG. Figures 3A-C show Ad-Luc, Ad-rsvLuc, A in various cell lines. Show luciferase activity of d-mlcLuc and Ad-smmhcLuc I have. The thin line on each bar represents the mean standard deviation. 4A-C show Ad-Luc, Ad-rsvLu in various major cell tissues. The luciferase activity of c and Ad-mlcLuc is shown. Each stick The upper thin line represents the average standard deviation of the experiment. 5A-C show injection of recombinant adenovirus into ventricle of newborn rat. Ad-Luc, Ad-rsvLuc, Ad-mlcL in various tissues after uc shows luciferase activity. The thin line on each bar is the average mark for the experiment. Represents the quasi-deviation. 6A and 6B show recombinant adenovirus AD. RSV βgal was injected into sinus 2 shows histological detection of β-galactosidase activity in myocardium after injection. are doing. FIG. 6A is a photograph of a tissue section passing through the apex of the heart (the injection point). FIG. 6B is a photograph of a tissue section through the left ventricle. The length of the rod represents 100 μm are doing. 7A-C show recombinant adenoviruses Ad-Luc, Ad-rsvLuc and And Ad-mlcLuc in 12 tissues after intrasinus injection 4 shows detection of denovirus DNA. FIG. 7A shows the unique 8 obtained by amplification of a test amount of Addel3224 DNA. A photograph of a 2.4% agarose gel containing a 60 bp PCR product is shown. Trial As a material, 100 ng of rat genomic DNA was mixed with Adde 1324. Used: Trace 1:10 pg; Trace 2: 1 pg; Trace 3: 100 fg; Trace 4 Trace 10: 1 fg; Trace 6; 0.1 fg; Trace 7: Viral DNA And M corresponds to one DNA marker (100 bp conductor). FIG. 7B shows Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc 100 ng of geno that had been separated from each of the listed tissues after intra-injection 2.4 containing a unique 860 bp PCR product obtained by amplification from DNA A photograph of a% agarose gel is shown. 100 ng of rat genomic DNA and 1 PCR by mixing pg with Addel 1324 DNA was used as a positive control. Thus, the method without Adde1324 DNA was used as a negative control. FIG. 7C shows the Southern block of the Ad-mlcLuc-infected animal shown in FIG. 7B. Is shown. As a probe³²The 860 bp PCR product labeled with P Was used. FIGS. 8A and 8B show various views after intrasinus injection into the left ventricle of a newborn rat. Ad-αmhcLuc (FIG. 8A) and Ad-αmhcLuc The luciferase activity with mlcLuc (FIG. 8B) is shown. 9A-C show recombinant adenosine in the atria (FIG. 9A) and ventricles (FIG. 9B). Irs Ad-rsvLuc, Ad-mlcLuc, Ad-αmhcLuc and The luciferase activity of Ad-Luc is shown. FIG. 9C shows atria and ventricles The activity ratios are shown. The bar shows the median of the four experiments, and the points in the figure are The results of each experimental animal and the ratio of luciferase activity between ventricle and mandrel are shown. are doing. FIGS. 10A-C show upstream of the transcription start site (+1) of the rat MLC-2v gene. The nucleic acid sequence of a 2216 base pair long promoter is shown. Position 1-156 Encodes the adenovirus Ad5 package sequence （(position 30). 0-456). The cloning sequence for the restriction endonuclease BamHI is position 1 58-163, and that of KpnI at positions 189-194. Position 189 -2405 contains a 2216 base pair length promoter for the MLC-2v gene. Are there. The CSS-like sequence is at positions 682-724 and the HF-3 unit is At positions 2207-2219, the MLE1 unit at positions 2229-2241, The F-2 unit is at position 2271-2289, the E sequence unit is at position 2328- At 2333, the HF-1a unit is at positions 2340-2348, at the HF-1b unit. The position is at position 2349-2361, and the transfer start point (+1) is at position 2406. The luciferase coding sequence starts at position 2461. Positions 1660-240 In position 6, a regulatory sequence of 746 base pair length of plasmid pAd-mlcLuc is located. (See Example 1).Example 1. Recombinant plasmids pAD-Luc, pAd-rsvLuc, pAd-mlc Production of Luc, pAd-smmhcLuc and pAdαmhcLuc Plasmids pAD-Luc, pAD-rsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc (FIG. 1) and pAdαmhcLuc were obtained from BamHI -KpnI RSV-βgal-cassette ("Rous sarcoma virus" promoter -And β-galactosidase-reporter gene) have their endogenous polyadenylation Depending on signal, without promoter (pAD-Luc) or RSV-promoter -(PAD-RSV-Luc), mlc-2v-promoter (pAD-mlc Luc), “smooth muscle myosin heavy chain” -promoter (pAD-smmhcLuc) ) Or “α-myosin heavy chain” -promoter (pAD-αmhcLuc). Plasmid pAd. Exchanged for luciferase cDNA. RSVβgal (S tradeford-Perricaudet, L .; D. , J. et al. (1992) C lin. Invest. 90, 626-630). For this reason The plasmid pSVOAL encoding the ferase gene, HindIII / The KpnI fragment is 5 'and the vector p Bluescript SK (Strata Subcloned into the HindIII / KpnI cloning site of the gene This produced the plasmid pBluescript-Luc (Wet , J. et al. R. et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7,725 -735). Subclone pBluescript-Luc's BamHI / KpnI The luciferase fragment was subsequently transferred to plasmid pAD. BamHI of RSV-βgal / KpnI site, which results in the plasmid pAD-Lu c was produced. For the cloning of the plasmid pAD-rsvLuc, the plasmid pAD. BamHI / HindIII RSV fragment of RSV-βgal (587 bp) Is BamHI / HindIII digestion of subclone pBluescript-Luc And the plasmid pBluescript-RSV- Luc was produced. Subsequently, plasmid pBluescript-RSV-Luc The BamHI / KpnI RSV-luciferase-fragment was pAD. RSV-βg al is cloned into the BamHI / KpnI cleavage site, thereby adding Mid pAd-rsvLuc was produced. For the construction of plasmid pAD-mlcLuc, BamHI / KpnImlc -Luciferase fragment ("myosin light chain" of 746 base pair length-2v-promo 10, the 1.8 kb luciferase gene) and the plasmid pML. BamHI / Kpn of plasmid pAd-RSVβgal directly from CLΔ5 ′ I. The site was cloned at the cleavage site (Henderson, SA et al. (1989) J. Am. Biol. Chem. 264, 18142-18148). This Of the mlc-2 / luciferase-fusion at the restriction site KpnI And the protruding ends are replenished with a so-called "Klenow-reaction", and PvuII The linker is attached. Subsequently, 4.0 kb long mlc-2 / luciferase- The DNA fragment is the recombinant plasmid pAD. Adenovirus as well as RSVβgal -1.3 m. Of the type 5 (Ad5) genome. u. PvuII-cut at the 3 'end of the region Connected to the break. For the construction of plasmid pAd-smmhcLuc, a 1.2 kb BamH I / HindIII smmhc-fragment (rabbit "smooth muscle myosin heavy chain" promoter -1225 / -4) is the plasmid pRBSMHC-1225βgal ( Kallmeier, R .; C. et al. (1995) J. Mol. Biol. Che m. 270, 30949-30957) and BamHI / HindI II Incised subclone pBluescript-Luc luciferase inheritance Of the subclone p1.2smmhc Roux-Luc was produced. BamHI / Kpn of this subclone The Ismmhc-luciferase-fragment was subsequently treated with the plasmid pAd-RSVβg al was cloned into the BamHI / KpnI site and the plasmid pAD- smmhcLuc was produced. Plasmid pAd-αmhcL containing “α-myosin heavy chain” -promoter uc (Subramaniam, A. et al. (1991) J. Biol. Chem. , 266, 24613-24620). BamHI / HindIII fragment of plasmid pBluescript-Luc It was cloned into the BamHI / HindIII site. Then from now on B amHI / KpnI mhc-luciferase-fragment was obtained from plasmid pAd. RS It was cloned into the BamHI / KpnI site of V-βgal, As a result, a plasmid pAD-αmhcLuc was obtained. 2. Production of recombinant adenovirus Recombinant adenovirus was prepared based on standard methods using plasmids pAd-Luc, pAd -RsvLuc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc and pA d-αmhcLuc and the genomic DNA of adenovirus de1324 (Ad5) Produced in vivo in 293-cells by homologous recombination between (Thim mappaya, B .; et al. (1982) Cell 31, 543-55. 1 and Stratford-Perricaudet, L .; D. et al . (1992), supra, and Graham, F .; L. et al. (1977 J.). Gen. Virol. 36, 59-74). The recombinant adenovirus is E3 There is a deletion in the region and the transgenes Luc, RSV-Luc, mlcLuc, p Ad-smmhcLuc and pAd-αmhcLuc replace the E1 region. You. 2 × 10 the day before transfection is performed⁶293 cells are small cells The cells were applied to a cell culture dish. Large ClaI of genomic DNA of Adde 1324 -5 µg of the fragment was 5 µg of the AatII linear plasmid pAd-Luc, pAd- RSV-Luc, pAd-mlcLuc, pAd-smmhcLuc and pA Simultaneous transfection in 293 cells by calcium phosphate method with d-αmhcLuc Sfected. Soft agar (1% sea plaque agarose, 1xMEM, 2% FCS, 100 U / ml penicillin, 0.1 μg / ml streptomy Syn, 2 mM L-glutamine) at 37 ° C, 5% CO_TwoCulture for 8-10 days After cultivation, viral plaques were removed and cloned in 293 cells . 2 × 10⁶Virus D of the recombinant virus from 293 fully infected 293 cells NA is isolated and the transgene is converted by hydrolysis with restriction endonucleases. It was checked for correct incorporation. For each positive virus clone, These were grown for large-scale processing in 293 cells and subjected to two cesium chloride density gradient runs. Individual plaque purification was again performed before purification by the heart method (Strad tford-Perricaudet, L .; D. , 1992, supra). Finally the same The virus was TD buffer (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na_TwoHPO_Four0.5 mM CaCl_Two, 1 mM MgCl_Two, 10% (v / v) Glycerin, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4) dialyzed and frozen at -72 ° C Was tied. To determine the titer of the recombinant adenovirus, using 293 cells A "plaque assay" was performed. All recombinant adenoviruses have about 10¹¹ It had a titer of "plaque forming units" (pfu) / ml. Virus source The DNA of the solution is separated and analyzed by restriction endonuclease and PCR. The insert was checked for correct incorporation. In addition, the virus stock solution Tested for the presence of wild type Ad-5 by PCR, No contamination was detected in the adenovirus DNA (Zang, W. et al. W. et al. (1995) BioTechniques 18,444-4. 47). 3. Luciferase measurement Cells were harvested 48 hours post infection for in vitro studies. Protocol for establishing luciferase activity in protein extract Based on transilluminometer Lumat LB 9501 (Bertol d, Wildbad) (Ausubel, FM et a). l. (1989) Current Protocols in Molecul ar Biology. Green and Wiley, New York) . Luciferase activity was converted to pg luciferase / μg protein (Krouu gliac, V .; & Graham, F .; L. (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 and Franz, W.C. M. et al. ( 1993) Circ. Res. 73, 629-638). Rats 5 days after injection for in vivo study The brain was decerebrated. 12 different tissues (intercostal muscles, heart, thymus, lungs, diaphragm, abdominal muscles) , Liver, stomach, spleen, kidney, quadriceps, brain) Was frozen. Subsequently, the tissue sample was weighed and 200 μl of lysis buffer (1% (v / V) Triton X-100, 1 mM DTT, 100 mM potassium phosphate p H7.8), crushed in a glass equalizer and cooled at 4 ° C. for 15 minutes Centrifuged in a centrifuge. The supernatant was used for luciferase measurement (Acsa di, G .; et al. (1994) Hum. Mol. Gen. 3,579-5 84 and Ausubel, F.R. M. (1989), supra). This is the substrate Lucif Erin and ATP were added, and luminescence proportional to luciferase activity was increased by 56%. Photometric measurements were taken at 0 nm with a transilluminometer. Luciferase activity Background activity investigated for various tissues of uninfected animals was subtracted It was later expressed as "relative light units" (RLU) / mg tissue wet weight. 4. β-galactosidase measurement Newborn rat hearts are frozen in nitrogen-cooled isopentane and stored at -70 ° C. Survived. The heart tissue is O.D. C. T. (Tissue Tek. Miles, U SA) A 10 μm tissue section embedded in a frozen embedding medium was cryostat (Frig). oct2800E, Leica). Next, the section was baked for 10 minutes. Solution A (PBS, 0.2% (v / v) glutaraldehyde, 5 mM EDT A, 2 mM MgCl_Two) And washed with solution B for 3 × 10 minutes (PBS, 0.01% (v / v) sodium-deoxycholic acid, 0.02% ( v / v) Nonidet P40, 5 mM EDTA, 2 mM MgCl_Two), Overnight Staining at 37 ° C. with solution C (solution B + 1 mg / ml X-Gal, 5 mM K_ThreeFe (CN)₆, 5 mM K_FourFe (CN)₆). Then once with solution B, Washing was performed once with distilled water for 10 minutes. Hematoxylin and eosin Counterstain, and dehydration and embedding of samples according to standard protocols (Gossler, A. & Zachgo, J. (1993) "Ge ne and enhancer trap screen in ES ce ll chimeras ", listed below: Joyner, AL (ed.) Ge. ne Targeting, Oxford University Pres s, 181-225). 5. Detection of adenovirus DNA by PCR In parallel with the luciferase measurement of Example 3, the adenovirus-infected From the tissue homogenate precipitate in a QIAamp tissue kit (Quiagen). Genomic DNA was extracted using Hilden) according to the manufacturer's instructions. Was. Ad-Luc, Ad-RSV-Luc and Ad-mlcLu, respectively. c. Two animals infected with c. were involved in the tissue distribution of the injected virus. PCR for detecting adenovirus DNA (polymerase chain reaction) (Zhang, WW (1995) BioTechniq). es 18, 444-447). For this reason, 100 ng of genomic DNA Then, 40 ng of oligonucleotides E2B-1 and E2B-2 and a reaction amount of 25 Used with μl of Promega's 1.25 U Taq polymerase. Unique P Gel electrophoresis of the CR product resulted in an 860 bp band. PCR sensitivity was measured by pretest. Therefore, the genotype of uninfected rats 100 ng of DNA is mixed with a test amount of Adde 1324 DNA, and the PCR reaction is performed. Was used as a sample. To improve the detection sensitivity of PCR, Gene screen plus nylon membrane (NEN, Boston) by tube blot. n, Massachusetts) followed by Southern blot hives. Detection was performed by the redidation method (Ausubel, FM et. al. (1989), supra). Amplified by PCR as a probe, A positive control adenovirus 860 bp DNA fragment was used. The PCR product Purified from gel and "random hexanucleotide prime"³²p radiation Line markings were used as hybridization samples. These By the method, the PCR detection sensitivity could be improved from 10 times to 100 times. 6. Cell line infection (in vitro) A10 cells (rat smooth muscle cell line), H9c2 cells (rat cardiac myoblasts) -Cell line) and HeLa cells (human cervical cancer-cell line) 293 cells were supplemented with MEM in the prepared Eagle's medium “(DMEM), and 10% Neonatal serum (FCS), 100 U / ml penicillin, 0.1 μg / ml strain The cells were cultured with putomycin and 2 mM L-glutamine. One day before infection 1 × 10 of isolated cell lines H9c2, A10 and HeLa^FiveCells are triple To a "12 well" culture dish. The cells have a "multiplicity of infection" (m . o. i. ) 10 recombinant adenoviruses Ad-Luc, Ad-RSVLuc, 0.2 ml each containing Ad-mlcLuc and Ad-smmhcLuc (10 viruses / cell). 37 ° C with gentle shaking After 1 hour of culture, 2 ml of each complete medium was added every 15 minutes. You All infection experiments were repeated four times. Lucifera as described above 3 days after infection Zetas activity was measured. The experimental results are shown in FIG. For all cell lines tested, The luciferase activity of the denovirus Ad-mlcLuc was determined to be promoterless. It is observed that it is lower than the negative control with the denovirus Ad-Luc. Ad-s mmhcLuc shows high activity in HeLa cell line, Ad-rsvLuc shows positive activity As a control, all test cell lines show the highest luciferase activity. 7. Infection of primary cells in tissue culture (in vitro) Primary cardiomyocytes of neonatal rats 2-3 days after birth were analyzed by Sen, A. et al. et al. (19 88) J.-J. Biol. Chem. 263, 19132-19136 Was adjusted and cultured. 2 x 10 days before infection^FiveFreshly adjusted Of neonatal cardiomyocytes were spread in triple “12 well” culture dishes. same Cells were treated with "multiplicity of infection" (moi) 10 recombinant adenovirus Ad-L. uc, Ad-RSVLuc, Ad-mlcLuc and Ad-smmhcLuc (10 virus / cell) ). After culturing at 37 ° C. for 1 hour with gentle rocking, complete 2 ml of medium was added. All infection experiments were repeated four times. Rat primary Neonatal / adult smooth muscle cells were similarly infected. The experimental results are shown in FIG. Recombinant adeno only in neonatal cardiomyocytes Luciferase activity of the virus Ad-mlcLuc was determined by the adenovirus Ad-Lu. positive control with adenovirus Ad-rsvLuc, but higher than negative control with c Lower, but 300-900 times higher than in smooth muscle cells Can be Furthermore, the luciferase activity of Ad-mlcLuc is determined by Ad-smmhc It is also observed that it is 129 times higher than that of Luc. From now on, mlc-2 pro The motor is active in neonatal cardiomyocytes, while the smmhc promoter It can be concluded that the expected activity did not occur in neonatal / adult smooth muscle cells. Wear. 8. Intrasinus injection of recombinant adenovirus into the left heart cavity of newborn rats All injections were spragu 2-3 days old, especially without pathogenic contamination. e Performed on Dawley rats (CRWiga, Sulzfeld). I Prior to injection, these newborn rats were treated with methoxyflurane for 3-5 minutes. (Methofane, Jannssen GmbH) was anesthetized by inhalation . Recombinant adenoviruses Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlc Luc's 2 × 10⁹20 μl of “plaque-forming unit” (pfu), tuber Injection was performed using a Clin syringe needle (27.5 gauge). Inge E The puncture is performed by direct puncture of the ventricle through the thorax from the side of the fourth intercostal space. Was. The aspiration of the heart blood ensured that the tip of the needle was positioned in the sinus. Tuber Slow injection of virus (20 μl / min) with Clin syringe It was realized. Similarly, injection of recombinant adenovirus into quadriceps muscle It was carried out. Five days after injection, 12 kinds of tissues (intercostal muscle, heart, thymus, lung, Lucifer in the diaphragm, abs, liver, stomach, spleen, kidney, brain and quadriceps) Lase activity was measured. Luciferase activity in measured RLU / mg tissue The gender is summarized in FIG. Equipped with myocardium-specific mlc-2v promoter Adenovirus Ad-mlcLuc shows luciferase activity restricted to myocardium (FIG. 5c). Positive control Ad-rsvLuc injection is intercostal muscle, heart Shows highest luciferase activity in lungs, lungs, thymus and phrenic Strong luciferase activity was shown in the membrane (FIG. 5b). Ad-Luc Injection Slight lucifera in intercostal muscles, heart and diaphragm in case of shocked animals Ase activity was measured (FIG. 5a). Ad-mlcLuc induced rusi in heart Ferase activity is 17 times higher than that induced by Ad-Luc, while its In all other tissues, luciferase activity between Ad-Luc and Ad-mlcLuc Sex was similar. This allows Ad-mlcLuc to specifically in the heart It was found to show activity. Infected myocardial cells after adenovirus injection into the ventricle of neonatal rats The distribution of the vesicles was determined in a preliminary experiment by the introduction of the recombinant adenovirus Ad-rsvβgal. Checked additionally by injection. Recombinant adenovirus Ad-r svβgal controls the “Rous sarcoma virus” (rsv) promoter Below, β-galactosidase as the reporter gene is primed. I Five days after injection, animals are necropsied and β-galactosidase is released. Current was measured by transgene staining. Nuclei stain blue in tissue sections By doing so, infected cells can be identified. Myocardial β-galactosidase About half of the activity was found in the area of the ventricular puncture site. Along the path of the injection needle Β-galactosidase activity was found in almost all cardiomyocytes (FIG. 6a). , On the other hand, the number of infected cardiomyocytes was small in other myocardium (FIG. 6b). 9. Injection of recombinant adenovirus into neonatal rat thigh muscle tissue To test the activity of the mlc-2v promoter in skeletal muscle, three recombinants were used. Adenoviruses Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc 2 × 10⁹20 μl of “plaque forming unit” (pfu), right of newborn rat Injections were made into the thigh muscles-quadriceps muscles. 5 days after injection The luciferase activity was measured. Ad-Luc and Ad-mlcLuc are Comparably low luciferase activity (RL) in injected muscle U / mg tissue), whereas Ad-rsvLuc showed very strong activity. (Table 1). Luciferase activity achieved by Ad-mlcLuc The sex was 0.05% of the luciferase activity of Ad-rsvLuc. these Data show that Ad-mlcLuc is inactive in skeletal muscle. Shows that myocardium-specific gene expression by recombinant adenovirus Ad-mlcLuc I have. 10. Adenovirus in tissues after recombinant adenovirus injection into the ventricle Detection of Ruth DNA Infection of non-cardiac tissue after recombinant adenovirus injection into the ventricle To measure the degree, 12 kinds of tissues (intercostal muscle, heart, thymus, lung, diaphragm, abdomen) Genomic DNA from muscle, liver, stomach, spleen, kidney, brain, quadriceps) The presence of adenovirus DNA in these tissues was determined by PCR. Was. Infected with Ad-Luc, Ad-rsvLuc and Ad-mlcLuc Tissues from two animals each were examined. In preliminary experiments, uninfected rats 100 ng of genomic DNA from a test amount of adenovirus DNA Adde 1324 (From 10 pg to 0.1 fg), followed by PCR As a result, the detection sensitivity of adenovirus DNA was measured. At that time, uninfected rats 10 fg of adenovirus DNA Adde in 100 ng of genomic DNA It turned out that 1324 could be detected. This is 0.017 adeno per cell It corresponds to the viral genome (FIG. 7A). Place for animals infected with adenovirus In the intercostal muscle, heart, thymus, lungs, diaphragm and liver Was formally detected (FIG. 7B). To increase the detection sensitivity of adenovirus DNA The PCR product was transferred to a nylon membrane and subjected to Southern blot hybridization. The method was used for detection. As a result, adenoviral DNA can be transmitted between individual animals. It is clear that even small differences can be detected in trace amounts in other tissues. It was ok. FIG. 7C shows a representative Southernb of an animal infected with Ad-mlcLuc. Lots are shown. The experiments described above show that the gene expression of recombinant adenovirus Ad-mlcLuc Attributable to the muscle-specific mlc-2v promoter, resulting in locally high virus concentrations It is not attributable. 11. Comparison of specific activity between mlc promoter and αmhc promoter About 2 × 10⁹"Plaque forming units" of recombinant adenovirus Ad-αmhcL uc (FIG. 8A) and Ad-mlcLuc (FIG. 8B) in the sinus of the newborn rat in the left ventricle After injection, the highest leukemia in the heart for both adenoviruses Cypherase activity was detected. However, the recombinant adenovirus Ad-mlcLu The activity of c is 3-4 times higher in the heart than Ad-mhcLuc. On the other hand, recombinant The activity of adenovirus Ad-mhcLuc is observed in kidney, spleen, liver, diaphragm, lung and lung. And higher than Ad-mlcLuc in intercostal muscles. Therefore, mlc-2 Motif modulates luciferase expression in the adenovirus vector system by αmh is much more strongly restricted to the heart than the c promoter, Conclusion that the activity of 2 promoter is 3 to 4 times higher than that of αmhc promoter can do. 12. Detection of ventricular-specific expression 2 × 10⁹"Plaque forming units" of recombinant adenovirus Ad-rsvLuc , Ad-mlcLuc, Ad-mhcLuc and Ad-Luc are 20 to 40 μm 1 was injected into the left ventricle of a newborn rat. 5 days from injection Later, the tissue was analyzed. In four independent experiments, recombinant adenovirus A It is clear that only d-mlcLuc can show gene expression restricted to the ventricle. It became clear (Fig. 9). Luciferase activity of Ad-mlcLuc in ventricle And its ratio in the atrium is about 30, while for all other viruses It was 1-2 times (Fig. 9C).

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月６日（１９９８．２．６）【補正内容】請求の範囲１．治療上有効な遺伝子産物またはアンチセンス核酸またはリボザイムをコードする核酸と機能的に結合している、心臓のミオシンＬ２鎖遺伝子（ＭＬＣ−２）の５’−末端の調節核酸配列を含んだ遺伝子治療核酸構造体、ならびに薬学的に許容し得る担体を含んでいる医薬。２．前記調節核酸配列が哺乳動物の心臓、特にヒトまたは齧歯類動物、なかんずくラットの心臓に由来する請求項１に記載の医薬。３．前記調節核酸配列が心臓のミオシンＬ２鎖遺伝子（ＭＬＣ−２）の転写開始点を基準として約＋１８番目ないし−１９番目から約−８００番目までの位置、なかんずく約＋１８番目ないし−１９番目から約−１６００番目までの位置の核酸と特に約＋１８番目ないし−１９番目から約−１８００番目までの位置、なかんずく約＋１８番目ないし−１９番目から約−２１００番目までもしくは約＋１８番目ないし−１９番目から約−２７００番目までの位置の核酸を含んでいる請求項１または２に記載の医薬。４．前記調節核酸配列がＨＦ−１ａユニット、ＨＦ−１ｂユニット、ＭＬＥ１ユニットおよびＨＦ−３ユニットを含んでいる請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。５．前記調節核酸配列が付加的にＥ配列ユニットおよび／またはＨＦ−２ユニットを含んでいる請求項４に記載の医薬。６．前記調節核酸配列が付加的にＣＳＳ配列を含んでいる請求項４または５に記載の医薬。７．前記核酸配列がＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、好ましくはＤＮＡ配列である請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。８．前記ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列がウイルスベクターに含まれている請求項７に記載の医薬。９．前記ＤＮＡ配列がアデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターに含まれている請求項８に記載の医薬。１０．前記アデノウイルスベクターが複製不全アデノウイルスベクターである請求項９に記載の医薬。１１．前記アデノ関連ウイルスベクターがもっぱら２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から成る請求項９に記載の医薬。１２．治療的遺伝子産物がジストロフィン、βアドレナリン作動性レセプターまたは一酸化窒素シンターゼからセレクトされている請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬。１３．治療上有効な遺伝子産物をコードしている核酸が１つまたは複数の非コード配列および／または１つのポリＡ配列を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬。１４．前記心臓のＭＬＣ−２の５’末端の調節核酸配列がウイルスベクターに含まれているかまたはリポソームと複合している請求項１〜７のいずれに定義した遺伝子治療核酸構造体。１５．前記調節核酸配列がアデノウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターに含まれている請求項１４に記載の遺伝子治療核酸構造体。１６．前記アデノウイルスベクターが複製不全アデノウイルスベクターである請求項１５に記載の遺伝子治療核酸構造体。１７．前記アデノ関連ウイルスがもっぱら２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）からなる請求項１５に記載の遺伝子治療核酸配列。１８．治療的遺伝子産物がジストロフィン、βアドレナリン作動性レセプターまたは一酸化窒素シンターゼから選ばれる請求項１４〜１７のいずれかに記載の遺伝子治療核酸構造体。１９．治療上有効な遺伝子をコードする核酸が一つまたは複数の非コード配列および／または一つのポリＡ配列を含む請求項１４〜１８のいずれかに記載の遺伝子治療核酸構造体。２０．前記調節核酸配列が治療上有効な遺伝子産物またはアンチセンス核酸またはリボザイムをコードする核酸と機能的に結合されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに定義した核酸構造体の製造方法。２１．前記核酸配列が請求項８〜１１のいずれかに定義したウイルスベクターで付加的にクローニングされおよび／またはリポソームと複合されることを特徴とする請求項２０の方法。２２．心臓疾患の遺伝子治療医薬の製造のため請求項１〜１９のいずれかに定義した核酸構造体の使用。２３．心臓疾患が心不全、拡張性または肥大性の心筋病、ジストロフィー、脈管疾患、高血圧、動脈硬化、血管の狭窄および／または再狭窄であることを特徴とする請求項２２の使用。２４．前記医薬が基本的に心室で作用することを特徴とする請求項２２または２３の使用。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] February 6, 1998 (1998.2.6) [Correction contents] The scope of the claims 1. Encodes a therapeutically effective gene product or antisense nucleic acid or ribozyme Heart myosin L2 chain gene (MLC-2) operatively linked to a nucleic acid A gene therapy nucleic acid construct comprising a 5'-terminal regulatory nucleic acid sequence of A medicament comprising an acceptable carrier. 2. The regulatory nucleic acid sequence is a mammalian heart, especially a human or rodent, especially The medicament according to claim 1, which is derived from rat heart. 3. The regulatory nucleic acid sequence initiates transcription of cardiac myosin L2 chain gene (MLC-2) Positions from about + 18th to -19th to about -800th with respect to the point, Above all, the nucleus at positions from about + 18th to -19th to about -1600th Acids, especially from about + 18th to -19th to about -1800th, among them About + 18th or -19th to about -2100th or about +1 A contract containing nucleic acids from positions 8 to -19 to about -2700 3. The medicament according to claim 1 or 2. 4. The regulatory nucleic acid sequence may be HF-1a unit, HF-1b unit, MLE1 4. A unit according to any one of the preceding claims, comprising a knit and an HF-3 unit. Medicine. 5. The regulatory nucleic acid sequence may additionally comprise an E sequence unit and / or an HF-2 unit. 5. The medicament according to claim 4, which comprises a drug. 6. 5. The method of claim 4, wherein said regulatory nucleic acid sequence additionally comprises a CSS sequence. Or the medicament according to 5; 7. The nucleic acid sequence is a DNA or RNA sequence, preferably a DNA sequence The medicament according to any one of claims 1 to 6. 8. The DNA or RNA sequence is contained in a viral vector. 8. The medicament according to 7. 9. The DNA sequence is an adenovirus vector or an adeno-associated virus vector; 9. The medicament according to claim 8, which is contained in an adenovirus vector. 10. The adenovirus vector may be a replication-defective adenovirus vector. The medicament according to claim 9. 11. The adeno-associated virus vector is exclusively composed of two inverted terminal repeats (I The medicament according to claim 9, which comprises TR). 12. Therapeutic gene products are dystrophin, beta-adrenergic receptor or 12. The method according to claim 1, which is selected from nitric oxide synthase. The medicament according to item. 13. The nucleic acid encoding a therapeutically effective gene product may contain one or more non-coding nucleic acids. 13. The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the sequence comprises at least one polyA sequence. The medicament according to claim. 14． The regulatory nucleic acid sequence at the 5 'end of the cardiac MLC-2 is contained in a viral vector. 8. A method as defined in any of claims 1 to 7, wherein the composition is present or complexed with a liposome. Gene therapy nucleic acid constructs. 15. The regulatory nucleic acid sequence is an adenovirus vector or an adeno-associated virus vector. 15. The method according to claim 14, which is contained in a vector, preferably an adenovirus vector. Gene therapy nucleic acid constructs. 16. The adenovirus vector is replication-defective adenovirus vector The gene therapy nucleic acid construct according to claim 15, which is a promoter. 17． If the adeno-associated virus is exclusively two inverted terminal repeats (ITR) 16. The gene therapy nucleic acid sequence according to claim 15, comprising: 18. Therapeutic gene products are dystrophin, beta-adrenergic receptor or Or a residue selected from nitric oxide synthase. Gene therapy nucleic acid constructs. 19. A nucleic acid encoding a therapeutically effective gene may comprise one or more non-coding sequences or And / or a gene comprising one polyA sequence. Child therapy nucleic acid constructs. 20. The regulatory nucleic acid sequence may be a therapeutically effective gene product or an antisense nucleic acid or Is operably linked to a nucleic acid encoding a ribozyme. A method for producing a nucleic acid structure as defined in any one of the above-mentioned items. 21. The virus vector according to any one of claims 8 to 11, wherein the nucleic acid sequence is Characterized in that they are additionally cloned and / or complexed with liposomes. 21. The method of claim 20, wherein 22. A method as claimed in any of claims 1 to 19 for the manufacture of a gene therapy drug for heart disease. Use of a modified nucleic acid construct. 23. Heart disease is heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophy, vascular Characterized by disease, hypertension, arteriosclerosis, stenosis and / or restenosis of blood vessels 23. Use according to claim 22. 24. 23. The method according to claim 22, wherein the medicament acts essentially in the ventricle. Use of 3.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/7088 Ａ６１Ｋ 31/70 ６２３ 48/00 48/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 31/7088 A61K 31/70 623 48/00 48/00 // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MG, MK, MN, MW , MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. Information on therapeutically effective gene products, antisense nucleic acids or ribozymes Cardiac myosin L2 chain gene (MLC -2) A gene therapy nucleic acid construct comprising the 5'-terminal regulatory nucleic acid sequence. 2. The regulatory nucleic acid sequence is a mammalian heart, especially a human or rodent, especially The nucleic acid construct according to claim 1, which is derived from a rat heart. 3. The regulatory nucleic acid sequence initiates transcription of cardiac myosin L2 chain gene (MLC-2) Positions from about + 18th to -19th to about -800th with respect to the point, Above all, the nucleus at positions from about + 18th to -19th to about -1600th Acids, especially from about + 18th to -19th to about -1800th, among them About + 18th or -19th to about -2100th or about +1 A nucleic acid at positions 8 to -19 to about -2700. 3. The nucleic acid structure according to claim 1 or 2. 4. The regulatory nucleic acid sequence may be HF-1a unit, HF-1b unit, MLE1 A knit and an HF-3 unit, as claimed in any one of claims 1 to 3. Nucleic acid structure. 5. The regulatory nucleic acid sequence may additionally comprise an E sequence unit and / or an HF-2 unit. 5. The nucleic acid structure according to claim 4, wherein the nucleic acid structure comprises: 6. 6. The method according to claim 4, wherein the regulatory nucleic acid sequence additionally includes a CSS sequence. The nucleic acid structure according to any one of the preceding claims. 7. The nucleic acid sequence is a DNA or RNA sequence, preferably a DNA sequence The nucleic acid structure according to any one of claims 1 to 6. 8. The DNA or RNA sequence is contained in a viral vector. 8. The nucleic acid structure according to 7. 9. The DNA sequence is an adenovirus vector or an adeno-associated virus vector; 9. The nucleic acid construct according to claim 8, which is preferably contained in an adenovirus vector. Structure. 10. The adenovirus vector may be a replication-defective adenovirus vector. 10. The nucleic acid structure according to claim 9. 11. The adeno-associated virus vector is exclusively composed of two inverted terminal repeats (I The nucleic acid structure according to claim 9, which comprises TR). 12. Therapeutic gene products are dystrophin, beta-adrenergic receptor or 12. The method according to claim 1, which is selected from nitric oxide synthase. Item 14. The nucleic acid structure according to Item. 13. The nucleic acid encoding a therapeutically effective gene product may contain one or more non-coding nucleic acids. 13. The method according to any one of claims 1 to 12, wherein the sequence comprises at least one polyA sequence. The nucleic acid structure according to any one of the preceding claims. 14． The regulatory nucleic acid sequence may be a therapeutically effective gene product, antisense nucleic acid or recombinant nucleic acid. It is characterized in that it can be functionally linked to a nucleic acid encoding bozyme information. A method for producing a nucleic acid structure according to any one of claims 1 to 13. 15. The virus vector according to any one of claims 8 to 11, wherein the nucleic acid sequence is Is additionally cloned and / or complexed with liposomes. 15. The method according to 14. 16. 14. A method for producing a gene therapy drug for heart disease according to any one of claims 1 to 13. Use of nucleic acid constructs. 17． Heart disease is heart failure, dilated or hypertrophic cardiomyopathy, dystrophy, vascular 17. The method according to claim 16, wherein the disease is hypertension, arteriosclerosis, stenosis and / or restenosis of blood vessels. Use of the description. 18. 18. The method according to claim 16, wherein the medicament basically acts in the ventricle. Use described in section. 19. A nucleic acid construct according to any one of claims 1 to 13 and optionally pharmaceutically. A medicament comprising a suitable carrier.