JP2000300257A - 抗菌または除草活性化合物の探索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 非メバロン酸経路に係わる抗菌または除草活
性物質の探索方法を提供する。 【解決手段】 ピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン
酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生
合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−
リン酸の生合成を経由しイソペンテニルピロリン酸を生
合成するための非メバロン酸経路上に存在する酵素から
選ばれる酵素の有する活性を有している蛋白質の反応を
阻害する物質を探索することを特徴とする抗菌活性また
は除草活性を有する物質の探索方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、原核生物由来の形
質転換体を用いたイソプレノイド化合物の製造方法、な
らびに非メバロン酸経路に係わる抗菌または除草活性物
質の探索方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イソプレノイドとは、炭素数５のイソプ
レン単位を基本骨格に持つ化合物の総称で、イソペンテ
ニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成され
る。自然界には多種多様なイソプレノイド化合物が存在
しており、人類にとって有用なものも多い。

【０００３】例えば、ユビキノンは電子伝達系の必須成
分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患
に効果のある医薬品として使用されているほか、欧米で
は健康食品としての需要が増大している。

【０００４】ビタミンKは血液凝固系に関与する重要な
ビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最
近骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が
期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品と
して許可されている。また、ユビキノンやビタミンＫ類
には貝類の付着阻害作用があり、貝類付着防止塗料への
応用が期待される。

【０００５】さらに、カロテノイドと呼ばれる炭素数４
０のイソプレン骨格を基本とする化合物は抗酸化作用が
あり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサ
ンチンなど、がん予防や免疫賦活活性を有するものとし
て期待されているものもある。このように、イソプレノ
イド化合物には多くの有用物質が含まれており、これら
の安価な製造方法が確立されれば、社会的にも医学的に
も多大な恩恵があると思われる。

【０００６】発酵法によるイソプレノイド化合物の生産
は以前から検討されており、培養条件の検討や変異処理
による菌株育種、さらに遺伝子工学的手法による生産量
の向上への試みもなされている。しかし、その効果は個
々の化合物種に限定されており、イソプレノイド化合物
全般に効果のある方法は知られていない。イソプレノイ
ド化合物の基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン
酸（ＩＰＰ）は、動物や酵母などの真核生物ではアセチ
ルCoAからメバロン酸を経由して生合成される（メバロ
ン酸経路）ことが証明されている。

【０００７】メバロン酸経路では３−ヒドロキシ−３−
メチルグルタリルＣｏＡ（HMG-CoA）リダクターゼが律
速と考えられており〔Mol．Biol．Cell，5，655(199
4)〕、酵母において、HMG-CoAリダクターゼを高発現化
させカロテノイドの生産性を上げる試みがなされている
〔三沢ら カロテノイド研究談話会講演要旨集(199
7)〕。

【０００８】原核生物ではメバロン酸経路の存在を証明
した知見はなく、別の経路、即ち、ピルビン酸とグリセ
ルアルデヒド３−リン酸が縮合して生じる１−デオキシ
−Ｄ−キシルロース５−リン酸を経由してＩＰＰが生合
成されるという非メバロン酸経路が多くの原核生物にお
いて発見されており〔Biochem. J.,295,517 (1993)〕、
¹³Ｃラベル化基質を使った実験から１−デオキシ−Ｄ−
キシルロース５−リン酸は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリス
リトール４−リン酸を経由してＩＰＰへと転換されるこ
とが示唆されている[Tetrahedron Lett.38, 4769(199
7)]。

【０００９】大腸菌において、ピルビン酸とグリセルア
ルデヒド３−リン酸を縮合させ１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−リン酸を生合成させる酵素１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）をコー
ドする遺伝子が同定されている〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA.,94, 12857 (1997)〕。該遺伝子は、ファルネシ
ルピロリン酸合成酵素をコードするispＡを含む４つのO
RFからなるオペロンに含まれている。

【００１０】更に、大腸菌においては、１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リスリトール４−リン酸に変換する活性が存在すること
が知られている[Tetrahedron Lett.39, 4509(1998)]。
該オペロンに含まれるこれら遺伝子を操作して、イソプ
レノイド化合物の生産性を向上させることに関する記載
も示唆も現時点ではない。原核生物における非メバロン
酸経路に関する知見は徐々に蓄積されつつあるが、関与
する酵素やそれをコードする遺伝子の多くは未だ不明で
ある。

【００１１】光合成細菌において、コリスメートを４−
ヒドロキシベンゾエートへ転換する酵素ｕｂｉＣの遺伝
子（ｕｂｉＣ遺伝子）およびｐ−ヒドロキシベンゾエー
トトランスフェラーゼの遺伝子（ｕｂｉＡ）を導入する
ことにより、ユビキノン−１０を効率的に生産する方法
が知られている（特開平８−１０７７８９）が、非メバ
ロン酸経路の酵素遺伝子を操作することによってイソプ
レノイド化合物の生産性を向上させた例は皆無である。
更に、非メバロン酸経路上の反応を、変異または薬剤処
理等により阻害することにより、原核生物がいかなる影
響を受けるかに関する知見はない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、心疾
患、骨粗鬆症、止血、がん予防、免疫賦活等を目的とし
た医薬品、健康食品および貝類付着防止塗料等に有用な
イソプレノイド化合物の生合成に関与するＤＮＡを１つ
以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え
体ＤＮＡを原核生物由来の宿主細胞に導入し、得られた
形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド
化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化
合物を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合
物の製造方法、イソプレノイド化合物の生合成効率を向
上させることのできる活性を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得
られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形
質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄
積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴と
する、該蛋白質の製造方法、該蛋白質および該蛋白質を
コードするＤＮＡを提供することにある。さらに、本発
明の課題は、非メバロン酸経路上の酵素反応を阻害する
物質を探索することを特徴とする、抗菌および除草活性
物質の探索方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、原核生物
によるイソプレノイド生産性を向上させることのできる
ＤＮＡを検索し、得られたＤＮＡを原核生物に導入する
ことにより、イソプレノイド生産性を向上させることの
できることを見出し本発明を完成するに至った。

【００１４】即ち、本願の第１の発明は、以下の
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）
から選ばれるＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに
組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを原核生物由来の宿
主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、
培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培
養物からイソプレノイド化合物を採取することを特徴と
する、イソプレノイド化合物の製造方法である。

【００１５】（ａ）はピルビン酸とグリセルアルデヒド
３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リ
ン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ、（ｂ）はファルネシルピロリン酸合成
酵素をコードするＤＮＡ、（ｃ）は配列番号３記載のア
ミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつイソプレノイド化合物の生合成効率を
向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、（ｄ）は配列番号４記載のアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質の有す
るアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させること
のできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）は１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸から2-C
-メチル-D-エリスリトール4-リン酸を生じる反応を触媒
する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｆ）は
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）から選ば
れるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ選ばれたＤＮＡにコードされた蛋白質が有す
る活性と実質的に同一の活性を有している蛋白質をコー
ドするＤＮＡである。

【００１６】本明細書中の、アミノ酸の欠失、置換若し
くは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発
法により実施することができ、また、１若しくは数個の
アミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換
若しくは付加できる程度の数、例えば１〜５個のアミノ
酸を意味する。

【００１７】かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質
は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manua
l)、第二版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Frits
ch)、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press）、１９８９年刊（以下、モレ
キュラー・クローニング第二版と略す）〕、Current Pr
otocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1
987-1997)、NucleicAcids Research, 10, 6487 (198
2)、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 79, 6409(1982)、Ge
ne, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 44
31 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (198
5)等に記載の方法に準じて調製することができる。

【００１８】上記において、ピルビン酸とグリセルアル
デヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−リン酸を生成する反応を触媒する蛋白質をコードす
るＤＮＡとして、例えば、配列番号１、２６または２８
に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、あるいはこれら蛋白質の有するアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセ
ルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有す
る蛋白質をコードするＤＮＡ等をあげることができる。

【００１９】具体的な例として、配列番号６記載の塩基
配列を有するＤＮＡ、配列番号２７または２９に記載の
塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。ファ
ルネシルピロリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとし
て、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を有する蛋
白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質の有するアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファ
ルネシルピロリン酸合成酵素活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡをあげることができる。具体的な例とし
て、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげ
ることができる。

【００２０】配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋
白質をコードするＤＮＡの具体的な例として、配列番号
８記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができ
る。配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡの具体的な例として、配列番号９記載の
塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。

【００２１】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン
酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸
を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡとして、例えば、配列番号５または３０に記載
のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、該
蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リ
ン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン
酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡ等をあげることができる。該ＤＮＡの具体的
な例として、配列番号１０または３１に記載の塩基配列
を有するＤＮＡ等をあげることができる。

【００２２】上記の「ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡ」とは、上記のＤＮＡまたは該Ｄ
ＮＡの断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイ
ゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あ
るいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用
いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、
コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡ
の断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．
０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーショ
ンを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃
度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃
条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤ
ＮＡをあげることができる。

【００２３】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて
行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとし
て、具体的には配列番号１、２、３、４および５から選
ばれる塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有す
るＤＮＡ、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮ
Ａをあげることができる。

【００２４】イソプレノイド化合物として、例えば、ユ
ビキノン、ビタミンＫ₂、カロテノイド等をあげること
ができる。本願の第２の発明は、以下の（ａ）、（ｂ）
および（ｃ）から選ばれるイソプレノイド化合物の生合
成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質で
ある。

【００２５】（ａ）は配列番号３記載のアミノ酸配列を
有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）は配列
番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋
白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなる蛋白質、（ｃ）は配列番号５記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列
において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質である。

【００２６】本願の第３の発明は、上記の第２の発明に
記載の蛋白質をコードするＤＮＡをベクターに組み込
み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し、得ら
れた形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を
生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを
特徴とする、イソプレノイド化合物の生合成効率を向上
させることのできる活性を有する蛋白質の製造方法であ
る。

【００２７】上記において、形質転換体として、Escher
ichia属に属する微生物、Rhodobacter属に属する微生物
またはErwinia属に属する微生物をあげることができ
る。

【００２８】本願の第４の発明は、以下の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）から選ばれるイソプレノイ
ド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡである。（ａ）は配列
番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする
ＤＮＡ、（ｂ）は配列番号４記載のアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｃ）は配列番号５記載
のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）は配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｅ）は配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｆ）は配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｇ）は（ａ）〜（ｆ）いずれかに記載のＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであ
る。

【００２９】本願の第５の発明は、ピルビン酸とグリセ
ルアルデヒド３リン酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロ
ース５−リン酸を生合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−
エリスリトール４−リン酸の生合成を経由しイソペンテ
ニルピロリン酸を生合成するための非メバロン酸経路上
に存在する酵素から選ばれる酵素の有する活性を有して
いる蛋白質の反応を阻害する物質を探索することを特徴
とする抗菌活性を有する物質の探索方法である。

【００３０】本願の第６の発明は、ピルビン酸とグリセ
ルアルデヒド３リン酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロ
ース５−リン酸を生合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−
エリスリトール４−リン酸の生合成を経由しイソペンテ
ニルピロリン酸を生合成するための非メバロン酸経路上
に存在する酵素から選ばれる酵素の有する活性を有して
いる蛋白質の反応を阻害する物質を探索することを特徴
とする除草活性を有する物質の探索方法である。

【００３１】上記発明５および６において、蛋白質とし
て、以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をあげることが
できる。（ａ）はピルビン酸とグリセルアルデヒド３−
リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸
を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質、（ｂ）
は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−
Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反
応を触媒する活性を有する蛋白質である。

【００３２】上記において、ピルビン酸とグリセルアル
デヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−リン酸を生成する反応を触媒する蛋白質として、例
えば、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、
または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセルアルデヒ
ド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−
リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質を
あげることができる。

【００３３】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン
酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸
を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質として、例
えば、配列番号５記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、
または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
ス５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール
４−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白
質をあげることができる。本発明の第７の発明は、上記
第５の発明の探索方法により取得される抗菌活性を有す
る物質である。ただし、該探索方法により取得される公
知の物質は本発明に入らない。

【００３４】本発明者らは、１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ反応の産物であ
る２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸やこ
の酵素反応で想定される反応中間体とフォスミドマイシ
ン〔3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphosphonic ac
id〕との構造的類似性に着目し、フォスミドマイシンが
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼ阻害活性を有し、かつ抗菌活性をも有すると
の推測の基に、後述の実施例１０に示した上記第５の発
明の探索方法の実験を行い、フォスミドマイシンが、該
阻害活性を有し、かつ抗菌活性を有する物質であること
を見いだすと共に、上記第５の発明の探索方法の妥当性
を証明したが、公知であるフォスミドマイシンは本発明
から除かれる。

【００３５】本発明の第８の発明は、上記第６の発明の
探索方法により取得される除草活性を有する物質であ
る。上記同様、該探索方法により取得される公知の物質
は本発明に入らない。以下、本発明を詳細に説明する。

【００３６】

【発明の実施の形態】Ｉ． イソプレノイド化合物の生
合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得 （１） ＤＸＳをコードするＤＮＡ（ＤＸＳ遺伝子）の
塩基配列を利用した、イソプレノイド化合物の生合成に
関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得既に決定され
ている、大腸菌の染色体およびＤＸＳ遺伝子の塩基配列
情報〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,94, 12857 (199
7)〕を利用し、大腸菌よりＤＸＳ遺伝子を含む、あるい
はＤＸＳ遺伝子近隣の遺伝子のＤＮＡ領域をＰＣＲ法
〔Science，230，1350(1985)〕によりクローニングし、
取得することができる。

【００３７】ＤＸＳ遺伝子を含む塩基配列情報として、
例えば、配列番号１１に記載の塩基配列をあげることが
できる。ＤＸＳ遺伝子を含むＤＮＡ領域の取得法として
は、具体的には以下の方法をあげることができる。

【００３８】大腸菌、例えばE. coli XL1-Blue株（東洋
紡より購入可能）を大腸菌に適した培地、例えばＬＢ液
体培地〔バクトトリプトン(ディフコ社製）１０ｇ、酵
母エキス（ディフコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを水１リ
ットルに含みｐＨ７．２に調整した培地〕を用い常法に
従って培養する。培養後、培養物より遠心分離により菌
体を取得する。

【００３９】取得した菌体より公知の方法（例えば、モ
レキュラー・クローニング第二版）に従い染色体ＤＮＡ
を単離する。配列番号１１に記載された塩基配列情報を
利用し、ＤＸＳ遺伝子を含む、あるいはＤＸＳ遺伝子近
隣の遺伝子のＤＮＡ領域に対応する塩基配列を含有する
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮ
Ａ合成機を用いて合成する。

【００４０】ＰＣＲ法により増幅後、該増幅ＤＮＡ断片
をプラスミドに導入可能なようにセンスプライマーおよ
びアンチセンスプライマーの５’末端には適切制限酵素
サイト、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素サ
イトを付加させることが好ましい。該センスプライマ
ー、アンチセンスプライマーの組合せとしては、例え
ば、配列番号１２および１３、配列番号１４および１
５、配列番号１２および１６、配列番号１７および１
８、配列番号１９および１３、配列番号２２および２３
の組合せの塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることがで
きる。

【００４１】染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライ
マー、TaKaRa LA-PCR^TM Kit Ver.2(宝酒造社製)またはE
xpand^TM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マ
ンハイム社製)等を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキ
ンエルマージャパン社製)でＰＣＲを行う。

【００４２】ＰＣＲの条件として、上記プライマーが２
ｋｂ以下のＤＮＡ断片の場合には９４℃で３０秒間、５
５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工
程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片の場
合にはは９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反
応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７
２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。

【００４３】該増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅
可能な適切なベクターを上記プライマーで付与した制限
酵素サイトと同じサイトで切断後、アガロース電気泳
動、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法により
ＤＮＡ断片を分画・回収する。

【００４４】該回収ＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、
モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocol
s in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wil
ey& Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniqu
es, A PracticalApproach, Second Edition, Oxford Un
iversity Press (1995)等に記載された方法、あるいは
市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for
cDNASynthesis andPlasmid Cloning（ライフ・テクノ
ロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit〔ストラタジ
ーン（Staratagene)社製〕を用いクローニングベクター
を作製し、作製した該クローニングベクターを用い、大
腸菌、例えばE. coli DH5α株（東洋紡より購入可能）
を形質転換する。

【００４５】該大腸菌を形質転換するためのクローニン
グベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できる
ものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター
等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをク
ローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、
ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5,58
(1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Rese
arch,17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジ
ーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, APractica
l Approach,1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテッ
ク社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U
（ファルマシア社製）、pcD2〔H.Okayamaand P.Berg；M
ol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬
社製）、pUC118（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bac.,172,
2392 (1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげること
ができる。

【００４６】得られた形質転換株より、目的とするＤＮ
Ａを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラー
・クローニング第二版、Current Protocols in Molecul
ar Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1
987-1997)、DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practi
cal Approach, Second Edition, Oxford University Pr
ess (1995)等に記載された方法により取得することがで
きる。

【００４７】該方法により、ピルビン酸とグリセルアル
デヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白
質をコードするＤＮＡ、ファルネシルピロリン酸合成酵
素をコードするＤＮＡ、配列番号３記載のアミノ酸配列
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４記載の
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等を有
するプラスミドおよびこれらＤＮＡを１つ以上含むプラ
スミドを取得することができる。

【００４８】該プラスミドとして、例えば、上記ＤＮＡ
を全て含むプラスミドｐＡＤＯ−１、配列番号６記載の
塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドpＤＸＳ-1あ
るいはｐＱＥＤＸＳ−１、配列番号７記載の塩基配列を
有するＤＮＡを含むプラスミドｐＩＳＰ−１、配列番号
８記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＸ
ＳＥ−１、配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡを
含むプラスミドｐＴＦＥ−１等をあげることができる。

【００４９】これらプラスミドに挿入された大腸菌由来
のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の原核生物、例え
ば、Rhodobacter属に属する微生物等より、該ＤＮＡの
ホモログを上記と同様の方法により取得することができ
る。

【００５０】（２） 大腸菌のメチルエリスリトール要
求性変異株を相補することのできる活性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡ（メチルエリスリトール要求性相補
遺伝子）の取得 大腸菌メチルエリスリトール要求性変異株の取得 大腸菌、例えばE. coli W3110株（ATCC14948）を、常法
に従って培養する。培養後、得られた培養液より遠心分
離により菌体を取得する。

【００５１】該菌体を、適切な緩衝剤、例えば、０．０
５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等で洗浄
後、菌体濃度が１０⁴〜１０¹⁰細胞／ｍｌになるように
同緩衝液に懸濁する。該懸濁液を用いて常法により変異
処理を行う。常法として、例えば、該懸濁液にＮＴＧを
終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０
分間保持して変異処理する方法をあげることができる。

【００５２】該変異処理懸濁液を最少寒天培地に０．０
５〜０．５％メチルエリスリトールを添加した培地で培
養する。最少寒天培地として、例えば、Ｍ９培地（モレ
キュラー・クローニング第二版）に寒天を添加した培地
等をあげることができる。メチルエリスリトールは、Te
trahedron Letters,38, 35, 6184 (1997)に記載の方法
に準じて化学合成したものを用いることができる。

【００５３】培養後、生育し形成されたコロニーを、最
少寒天培地とメチルエリスリトールを０．０５〜０．５
％含む最少寒天培地にレプリカし、メチルエリスリトー
ル要求性を示すもの、すなわち、メチルエリスリトール
を含む最少寒天培地では生育できるが、最少寒天培地で
は生育できない株を目的の変異株として選択する。該操
作により取得されたメチルエリスリトール要求性変異株
としてＭＥ７株をあげることができる。

【００５４】 メチルエリスリトール要求性相補遺伝
子の取得 大腸菌、例えば、E. coli W3110株（ATCC14948）を培養
培地、例えば、ＬＢ液体培地に植菌し、常法に従って対
数増殖期まで培養する。培養後、得られた培養液を遠心
分離して菌体を回収する。

【００５５】得られた菌体より、常法（例えば、モレキ
ュラー・クローニング第二版に記載の方法）に従い染色
体ＤＮＡを単離・精製する。上記（１）に記載の方法で
取得される染色体ＤＮＡを単離・精製された染色体ＤＮ
Ａとして用いることもできる。該染色体ＤＮＡの適当量
を適切な制限酵素、例えば、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化
し、得られた消化ＤＮＡ断片を、常法、例えば、シュー
クロース密度勾配超遠心分離（２６，０００ｒｐｍ、２
０℃、２０ｈｒ）により、サイズ分画する。

【００５６】該分画により取得される大きさが４〜６ｋ
ｂのＤＮＡ断片を、適切な制限酵素で消化したベクタ
ー、例えば、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）にラ
イゲーションすることにより染色体ゲノムライブラリー
を作製する。作製した染色体ライブラリーを用い、上記
で分離されたメチルエリスリトール要求性変異株、例
えば、ＭＥ７株を常法（例えば、モレキュラー・クロー
ニング第二版に記載の方法）に従い形質転換する。

【００５７】該形質転換体を、ベクターの有する薬剤耐
性遺伝子に対応する薬剤を添加した最少寒天培地、例え
ば、アンピシリン１００μｇ／ｌ入れたＭ９寒天培地に
塗布し、３７℃で一晩培養する。該方法により、メチル
エリスリトール要求性の回復された形質転換体を選択す
ることができる。

【００５８】得られた該形質転換体より、常法によりプ
ラスミドを抽出する。該メチルエリスリトール要求性を
回復させることのできるプラスミドとして、例えばpMEW
73、pQEDXRをあげることができる。該プラスミド中に導
入されたＤＮＡの塩基配列を決定する。

【００５９】該方法により決定された塩基配列として、
配列番号１０に示されるyaeM遺伝子の塩基配列を含む配
列等をあげることができる。得られた該yaeM遺伝子の塩
基配列情報を利用して他の原核生物あるいは植物から該
yaeM遺伝子のホモログを上記と同様の方法により取得す
ることができる。

【００６０】II． イソプレノイド化合物の生合成効率
を向上させることのできる活性を有する蛋白質の製造 上記のようにして得られたＤＮＡを宿主細胞中で発現さ
せるためには、まず、目的とする該ＤＮＡ断片を、制限
酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、該遺伝子を含む適
当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロ
モーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した
発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に
導入する。

【００６１】宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発
現できるものは全て用いることができる。例えば、エッ
シェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、
ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセ
ス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、
トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や
動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。

【００６２】発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能
で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモー
ターを含有しているものが用いられる。細菌等を宿主細
胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための
発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時
に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡお
よび転写終結配列より構成された組換えベクターである
ことが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含ま
れていてもよい。

【００６３】発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、
pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社よ
り市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invit
rogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGE
N社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-11
0600）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistr
y,48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53,
277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptI
I SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERMBP-5407)、pT
rS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3
（Novagen社製）、pTerm2(US4686191、US4939094、US51
60735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔gene,
33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、p
STV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118
（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pEG400
〔J. Bacteriol.,172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN
社製）等を例示することができる。

【００６４】プロモーターとしては、宿主細胞中で発現
できるものであればいかなるものでもよい。例えば、tr
pプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、
P_Lプロモーター、P_Rプロモーター、P_SEプロモーター等
の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1
プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等
をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプ
ロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロ
モーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改
変されたプロモーター等も用いることができる。

【００６５】リボソーム結合配列としては、宿主細胞中
で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドン
との間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した
プラスミッドを用いることが好ましい。目的とするＤＮ
Ａの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、
好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置すること
が望ましい。

【００６６】宿主細胞としては、Escherichia属、Coryn
ebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microb
acterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacteri
um属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis
属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erw
inia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobac
ter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scene
desmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas
属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、
Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium
属、Bacillus属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Al
icyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrob
acter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Met
hylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhod
opseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun属、S
treptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属に属する
微生物等をあげることができる。

【００６７】該微生物の具体例として、例えば、Escher
ichia coli XL1-Blue、Escherichiacoli XL2-Blue、Esc
herichia coli DH1、Escherichia coli DH5α、Escheri
chiacoli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escheric
hia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichi
a coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia
coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia col
i MP347、Escherichia coli NM522、Bacillussubtili
s、Bacillusamyloliquefacines、Brevibacteriumammmon
iagenes、Brevibacteriumimmariophilum ATCC14068、Br
evibacteriumsaccharolyticum ATCC14066、Brevibacter
iumflavum ATCC14067、Brevibacteriumlactofermentum
ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、C
orynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacteri
um acetoacidophilum ATCC13870、Microbacteriumammon
iaphilum ATCC15354、Serratiaficaria、Serratiafonti
cola、Serratialiquefaciens、Serratiamarcescens、Ps
eudomonas sp. D-0110、Agrobacterium radiobacter、A
grobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Anaba
enacylindrica、Anabaenadoliolum、Anabaenaflos-aqua
e、Arthrobacteraurescens、Arthrobactercitreus、Art
hrobacterglobformis、Arthrobacterhydrocarboglutami
cus、Arthrobactermysorens、Arthrobacternicotiana
e、Arthrobacterparaffineus、Arthrobacterprotophorm
iae、Arthrobacterroseoparaffinus、Arthrobactersulf
ureus、Arthrobacterureafaciens、Chromatiumbuderi、
Chromatiumtepidum、Chromatiumvinosum、Chromatiumwa
rmingii、Chromatiumfluviatile、Erwinia uredovora、
Erwinia carotovora、Erwinia ananas、Erwinia herbic
ola、Erwinia punctata、Erwinia terreus、Methylobac
teriumrhodesianum、Methylobacteriumextorquens、Pho
rmidium sp. ATCC29409、Rhodobacter capsulatus、Rho
dobactersphaeroides、Rhodopseudomonasblastica、Rho
dopseudomonasmarina、Rhodopseudomonaspalustris、Rh
odospirillumrubrum、Rhodospirillumsalexigens、Rhod
ospirillumsalinarum、Streptomycesambofaciens、Stre
ptomycesaureofaciens、Streptomycesaureus、Streptom
ycesfungicidicus、Streptomycesgriseochromogenes、S
treptomycesgriseus、Streptomyceslividans、Streptom
ycesolivogriseus、Streptomycesrameus、Streptomyces
tanashiensis、Streptomycesvinaceus、Zymomonas mobi
lis等をあげることができる。

【００６８】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene,
17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168,
111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。酵
母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとし
て、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（A
TCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、
ｐＨＳ１５等を例示することができる。

【００６９】プロモーターとしては、酵母中で発現でき
るものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇ
ａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモー
ター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等
のプロモーターをあげることができる。

【００７０】宿主細胞としては、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporonpullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomycesa
lluvius）等をあげることができる。

【００７１】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol.,194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔J. Bacteriol.,153, 163(1983)〕、Proc.Nat
l. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978)記載の方法等をあ
げることができる。

【００７２】動物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤ
Ｍ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平
3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ
３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329,
840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社
製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３
〔J. Biochem.,101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等
を例示することができる。

【００７３】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、
ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒ
トＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと
共に用いてもよい。宿主細胞としては、ナマルバ細胞、
ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ１細
胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができ
る。

【００７４】動物細胞への組換えベクターの導入法とし
ては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用
いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法
〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム
法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84, 7413(1987)〕、virolo
gy, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができ
る。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７
０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に
記載されている方法に準じて行なうことができる。

【００７５】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expr
ession Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサ
プルメント1-３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6,47
(1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現する
ことができる。

【００７６】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができ
る。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとし
ては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢ
ｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等を
あげることができる。

【００７７】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodop
terafrugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バ
キュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア
・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フ
リーマン・アンド・カンパニー（W. H. Freeman and Co
mpany）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trich
oplusianiの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジ
ェン社製）等を用いることができる。

【００７８】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第二版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行う
ことができる。

【００７９】酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現
させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を
得ることができる。上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に
イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることの
できる活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物よ
り該蛋白質を採取することにより、イソプレノイド化合
物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する
蛋白質を製造することができる。

【００８０】本発明のイソプレノイド化合物の生合成効
率を向上させることのできる活性を有する蛋白質製造用
の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用
いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明
の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生
物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生
物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、
形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培
地、合成培地のいずれでもよい。

【００８１】炭素源としては、それぞれの微生物が資化
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類が用いられる。

【００８２】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物等が用いられる。

【００８３】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６
時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。

【００８４】また培養中必要に応じて、アンピシリンや
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、tr
pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微
生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。

【００８５】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲ
ＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Me
dical Association,199, 519 (1967)〕、Ｅａｇｌｅの
ＭＥＭ培地〔Science,122, 501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培
地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceed
ing of the Society for the Biological Medicine,73,
1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した
培地等が用いられる。

【００８６】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。

【００８７】昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴ
ＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社製〕、Sf-900 II SFM培
地（ギブコＢＲＬ社製）、ExCell400、ExCell405〔いず
れもJRH Biosciences社製〕、Grace's Insect Medium
〔Grace, T.C.C.,Nature, 195, 788 (1962)〕等を用い
ることができる。

【００８８】培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等
の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。本発明の形質転換体の培養物から、本発明のイソプ
レノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる
活性を有する蛋白質を単離精製するには、通常の酵素の
単離、精製法を用いればよい。

【００８９】例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION
HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交
換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシ
ア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース
等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子
篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等
の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用
い、精製標品を得ることができる。

【００９０】また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成し
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。

【００９１】本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。このようにして
取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜５に示
されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する
蛋白質をあげることができる。

【００９２】また、上記方法により発現させた蛋白質
を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル
法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化
学合成法によっても製造することができる。また、桑和
貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマー
ジャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオ
テク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米
国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米
国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテ
ッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合
成機を利用し合成することもできる。

【００９３】III．イソプレノイド化合物の製造 上記II．で取得された形質転換体を、上記II．の方法に
準じて培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成
蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取す
ることによりイソプレノイド化合物を製造することがで
きる。

【００９４】該培養により、ユビキノン、ビタミン
Ｋ₂、カロテノイド等のイソプレノイド化合物を製造す
ることができる。具体的な例として、例えば、Escheric
hia属に属する微生物を形質転換体としたユビキノンー
８やメナキノンー８の製造、Rhodobacter属に属する微
生物を形質転換体としたユビキノンー１０の製造、Arth
robacter属に属する微生物を形質転換体としたビタミン
Ｋ₂の製造、Agrobacterium属に属する微生物を形質転換
体としたアスタキサンチンの製造、Erwinia属に属する
微生物を形質転換体としたリコペン、β-カロテン、ゼ
アキサンチンの製造等をあげることができる。

【００９５】培養終了後、培養液に適当な溶媒を加えて
イソプレノイド化合物を抽出し、遠心分離などで沈殿物
を除去した後、各種クロマトグラフィーを行うことによ
りイソプレノイド化合物を単離・精製することができ
る。

【００９６】ＩＶ．非メバロン酸経路上の酵素活性を阻
害する物質の探索 （１） 非メバロン酸経路上の酵素活性の測定 非メバロン酸経路上の酵素活性の測定は、通常の酵素の
活性測定法に準じて行うことができる。

【００９７】即ち、活性測定の反応液に用いる緩衝液の
ＰＨは、目的とする酵素の活性を阻害しないＰＨ範囲で
あればよく、最適ＰＨを含む範囲のＰＨが好ましい。例
えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダ
クトイソメラーゼにおいては、ｐＨ５〜１０、好ましく
は６〜９である。

【００９８】緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上
記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用い
ることができる。該緩衝液として、トリス塩酸緩衝液や
リン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰ
Ｓ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができる。
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼにおいては、例えば、トリス塩酸緩衝液が好
適に用いられる。

【００９９】緩衝液の濃度は酵素活性に阻害を及ぼさな
い限りどのような濃度でも用いることができるが、好適
には１ｍＭから１Ｍである。目的とする酵素に補酵素が
必要な場合には、反応液に補酵素を添加する。例えば、
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼにおいては、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨあるいは
その他の電子供与体を用いることができ、好ましくはＮ
ＡＤＰＨをあげることができる。

【０１００】添加する補酵素の濃度は、反応を阻害しな
い限りいずれの濃度でも用いることができるが、好適に
は０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍ
Ｍ〜１０ｍＭの濃度である。反応液には必要に応じて金
属イオンを添加してもよい。金属イオンは、反応を阻害
しない限りどのようなものでも添加することができる
が、好適にはＣｏ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺などがあげられ
る。

【０１０１】金属塩として金属イオンを添加することが
でき、例えば、塩化物や硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩など
として添加することができる。添加する金属イオンの濃
度は、反応を阻害しない限りどのような濃度でも添加で
きるが、好適には０ｍＭから１００ｍＭ、より好適には
０．１ｍＭから１０ｍＭである。

【０１０２】反応液には、目的とする酵素の基質を添加
する。例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リ
ン酸レダクトイソメラーゼにおいては、１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース５−リン酸を添加する。基質の濃度は
反応に支障のない限りどのような濃度でも用いることが
できるが、好適には反応液中の濃度は０．０１ｍＭ〜
０．２Ｍである。

【０１０３】反応に用いる酵素濃度に特に制限はない
が、通常０．０１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃
度範囲で反応を行う。用いる酵素は必ずしも単一にまで
精製されている必要はなく、反応を妨害しない限り、他
の侠雑蛋白質が混入した標品であってもよい。また、下
記（２）の探索においては、該酵素活性を含む細胞抽出
液あるいは該酵素活性を有する細胞も用いることができ
る。

【０１０４】反応温度は、目的とする酵素の活性を阻害
しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温
度が好ましい。即ち、反応温度は、１０℃から６０℃、
より好ましくは３０℃から４０℃である。活性の検出
は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加
を、基質あるいは反応生成物を測定できる方法を用いて
行うことができる。

【０１０５】該方法として、例えば、必要に応じて高速
液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物
質を分離定量する方法をあげることができる。また反応
の進行に伴ってＮＡＤＨやＮＡＤＰＨが増減する場合に
は、反応液の３４０ｎｍの吸光度を測定することで活性
を直接測定することができる。例えば、１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにお
いては、３４０ｎｍの吸光の減少を分光光度計で測定す
ることにより反応の進行に伴い減少するＮＡＤＰＨを定
量し、活性を検出することができる。

【０１０６】（２）非メバロン酸経路上の酵素活性を阻
害する物質の探索 非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質の探索
は、上記（１）の酵素活性測定系に被探索物質を加えて
同様に反応させ、無添加時より基質の減少量を抑えるよ
うな物質あるいは反応産物の生成量を抑えるような物質
を探索することで行うことができる。

【０１０７】探索の方法としては、基質の減少量あるい
は反応生産物の増加量等を経時的に追跡する方法、一定
時間反応させた後の基質の減少量あるいは反応生産物の
増加量等を測定する方法等をあげることができる。基質
の減少量あるいは反応生産物の増加量等を経時的に追跡
する方法においては、反応中１５秒〜２０分程度の間隔
で基質の減少量あるいは反応生産物の増加量を測定する
ことが好ましく、１〜３分間隔で測定することがより好
ましい。

【０１０８】一定時間反応させた後の基質の減少量ある
いは反応生産物の増加量等を測定する方法においては、
反応時間は、１０分〜１日が好ましく、より好ましくは
３０分〜２時間である。非メバロン酸経路上の酵素活性
を阻害する物質は、該非メバロン酸経路を有する微生物
および植物の生育を阻害する。該物質が該微生物および
植物の生育を阻害することは、本発明者らが始めて見出
した。

【０１０９】非メバロン酸経路は微生物や植物に存在
し、動物や人には存在しないことより、上記探索方法に
より、人や動物に影響を及ぼさない、非メバロン酸経路
上の酵素活性を阻害する物質を取得することができる。
該物質は、有効な抗菌剤あるいは除草剤となり得る。以
下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。 実施例で示した遺伝子組
換え実験は、特に言及しない限りモレキュラー・クロー
ニング第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用い
て行った。

【０１１０】

【実施例】実施例１ イソプレノイド化合物の生合成に
関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得 （１） 大腸菌ＤＸＳ遺伝子の塩基配列を利用した、イ
ソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコード
するＤＮＡの取得E . coli XL1-Blue株（東洋紡より購入）を1白金耳、１
０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養し
た。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を
取得した。

【０１１１】該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単
離・精製した。配列番号１２および１３、配列番号１４
および１５、配列番号１２および１６、配列番号１７お
よび１８、配列番号１９および１３の塩基配列の組合せ
を有する５‘末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵
素切断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびア
ンチセンスプライマー、配列番号２２および２３の塩基
配列の組合せを有する５‘末端にＢａｍＨＩ制限酵素切
断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチ
センスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。

【０１１２】染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライ
マーと、TaKaRa LA-PCR^TM Kit Ver.2(宝酒造社製)、Exp
and^TM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マン
ハイム社製)またはTaq DNA polymerase（Boelinnger社
製）を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマー
ジャパン社製)でＰＣＲを行った。

【０１１３】ＰＣＲは、２ｋｂ以下のＤＮＡ断片は９４
℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分
間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超え
るＤＮＡ断片は９８℃で２０秒間、６８℃で３分間から
なる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った
後、７２℃で７分間反応させる条件で行った。

【０１１４】ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片のう
ち、５‘末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素切
断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチ
センスプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片は制限
酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、５‘末端に
ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位をそれぞれ有するセンスプ
ライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅さ
れたＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。

【０１１５】消化後、これら制限酵素処理ＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処
理ＤＮＡ断片およびＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片を取得し
た。ｌａｃプロモーターを有する広宿主域ベクターｐＥ
Ｇ４００〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕を、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電
気泳動を行い、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＥＧ４０
０断片を取得した。

【０１１６】ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａ
ｍＨＩ処理ｐＵＣ１１８断片を取得した。上記で取得さ
れたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片各々につい
てＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＥＧ４００断片と混合
した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物
を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行う
ことにより組換え体ＤＮＡを各々取得した。

【０１１７】該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋
紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形
質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含む
ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生育し
てきたスペクチノマイシン耐性の形質転換体のコロニー
数個について、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを
含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養し
た。

【０１１８】得られた培養液を遠心分離することにより
菌体を取得した。該菌体より常法に従ってプラスミドを
単離した。該方法により単離したプラスミドを各種制限
酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することに
より、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドで
あることを確認した。

【０１１９】配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａ、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番
号８記載の塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号９記
載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＡＤ
Ｏ−１、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡを含
むプラスミドをpＤＸＳ-1、配列番号７記載の塩基配列
を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＩＳＰ−１、配列
番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミド
をｐＸＳＥ−１、配列番号９記載の塩基配列を有するＤ
ＮＡを含むプラスミドをｐＴＦＥ−１と命名した。

【０１２０】また、上記で取得されたＢａｍＨＩ処理Ｄ
ＮＡ断片およびＢａｍＨＩ処理ｐＵＣ１１８断片を混合
した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物
を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行う
ことにより組換え体ＤＮＡを取得した。以後上記と同様
の方法で、大腸菌を形質転換し、該大腸菌よりプラスミ
ドを単離した。

【０１２１】上記同様、該方法により単離したプラスミ
ドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決
定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されている
プラスミドであることを確認した。該プラスミドをＢａ
ｍＨＩ処理し、目的のＤＮＡ断片を上記と同様の方法で
回収し、発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen社製)に常法に
よりサブクローニングした。該サブクローニングにより
得られた、配列番号６記載の塩基配列を有するプラスミ
ドをｐＱＥＤＸＳ−１と命名した。

【０１２２】（２） メチルエリスリトール要求性相補
遺伝子の取得 大腸菌メチルエリスリトール要求性変異株の取得E . coli W3110株（ATCC14948）を、LB液体培地に植菌
し、対数増殖期まで培養した。培養後、得られた培養液
より遠心分離により菌体を取得した。

【０１２３】該菌体を、０．０５Ｍトリスーマレイン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０⁹細胞
／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。該懸濁液にＮ
ＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温
で２０分間保持して変異処理を行った。

【０１２４】得られた変異処理菌体をメチルエリスリト
ール０．１％を含むＭ９最少寒天培地〔モレキュラー・
クローニング第二版〕プレートに塗布し、培養した。メ
チルエリスリトールは、Tetrahedron Letters,38, 35,
6184 (1997)に記載の方法に準じて化学合成した。

【０１２５】メチルエリスリトール０．１％を含むＭ９
最少寒天培地上で生育してきたコロニーを、Ｍ９最少寒
天培地とメチルエリスリトールを０．１％含むＭ９最少
寒天培地にレプリカし、メチルエリスリトール要求性を
示すもの、すなわち、メチルエリスリトールを０．１％
含むＭ９最少寒天培地では生育できるが、Ｍ９最少寒天
培地では生育できない株を目的の変異株として選択し
た。該選択により得られたメチルエリスリトール要求性
変異株ＭＥ７株を以下の実験に用いた。

【０１２６】 メチルエリスリトール要求性相補遺伝
子の取得E . coli W3110株（ATCC14948）をLB液体培地に植菌して
対数増殖期まで培養した後、遠心分離して菌体を回収し
た。得られた菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離
・精製した。該染色体DＮＡ２００μｇを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩで部分消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を、シ
ュークロース密度勾配超遠心分離（２６，０００ｒｐ
ｍ、２０℃、２０ｈｒ）により、サイズ分画した。

【０１２７】該分画により取得された大きさが４〜６ｋ
ｂのＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化したベク
ターｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）にライゲーシ
ョンすることにより染色体ゲノムライブラリーを作製し
た。作製した染色体ライブラリーを用い、上記で分離
されたＭＥ７株を常法に従い形質転換した。

【０１２８】得られた形質転換体を、アンピシリン１０
０μｇ／ｌ入れたＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩
培養した。該培養において生育してきた複数のコロニー
からプラスミドを抽出して塩基配列を決定した。塩基配
列を決定したクローンは配列番号１０に示される塩基配
列を含む配列を有していた。これらのプラスミドをpMEW
41およびpMEW73と名づけた。

【０１２９】該配列を有するクローンの１株より抽出し
たプラスミドをpMEW73と命名した。pMEW73をＨｉｎｄII
IおよびＳａｃＩで二重消化し、得られた配列番号１０
に示される塩基配列を有するＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ処
理DNA断片を広宿主域ベクターpEG400〔J. Bac.,172, 23
92 (1990)〕のマルチクローニングサイトに連結してpEG
YM1を作製した。

【０１３０】上記ＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ処理ＤＮＡ断
片をベクターpUC19〔Gene, 33,103 (1985)〕のＨｉｎｄ
III−ＳａｃＩ部位に連結してpUCYM-1を作製した。Genb
ankのデータベースに基づく大腸菌の染色体塩基配列情
報より、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片はｙａｅＭ遺
伝子を含有することが分かった。

【０１３１】ｙａｅＭ遺伝子を十分発現させるような組
換え体ベクターをPCR法〔Science，230，1350 (1985)〕
を用いて下記方法により構築した。配列番号２０に示し
た配列を有するセンスプライマーおよび配列番号２１に
示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合
成機を用いて合成した。

【０１３２】該センスプライマーおよびアンチセンスプ
ライマーの５’末端にはそれぞれＢａｍＨＩの制限酵素
サイトを付加させた。染色体DNAを鋳型として、これら
プライマーおよびTaq DNA polymerase（Boelinnger社
製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージ
ャパン社製）でＰＣＲを行うことによりyaeM遺伝子を増
幅した。

【０１３３】ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で３
０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクル
と３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条
件で行った。増幅されたＤＮＡ断片およびpUC118（宝酒
造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、各々のＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。

【０１３４】これら精製された両断片を混合した後エタ
ノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸
留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組
換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡがｙａｅＭ
遺伝子であることをＤＮＡ配列を決定することによって
確認した後、発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen社製)にサ
ブクローニングした。得られた組換え体ＤＮＡをｐＱＥ
ＹＭ１と命名した。

【０１３５】ｐＱＥＹＭ１を用いて、ＭＥ７株を常法に
従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００
μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩
培養した。該形質転換株は、野生型株と同程度の生育速
度でコロニーを形成することが確認されたことより、ｙ
ａｅＭ遺伝子によりＭＥ７株の変異が相補されることが
分かった。

【０１３６】実施例２ 組換え大腸菌によるユビキノン
−８（ＣｏＱ８）の生産 （１）実施例１で取得したプラスミドｐＡＤＯ−１、p
ＤＸＳ−１、ｐＸＳＥ−１またはコントロールとしてｐ
ＥＧ４００をE. coli DH5α株にそれぞれ導入し、１０
０μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンに抵抗性を示す
形質転換体E. coli DH5α／pADO-1、E. coli DH5α／pD
XS-1、E. coli DH5α／pXSE-1およびE. coli DH5α／pE
G400を各々取得した。

【０１３７】チアミン（thiamine）とビタミンB₆をそれ
ぞれ１００ｍｇ／ｌ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸５０ｍｇ
／ｌ、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌ添加したＬ
Ｂ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転換体を植
菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。

【０１３８】培養終了後、各々の培養液を１０倍濃縮し
た。各々の濃縮液３００μｌに２−ブタノール３００μ
ｌおよびガラスビーズ３００μｌを加え、マルチビーズ
ショッカーＭＢ−２００（安井器械社製）で５分間菌体
破砕しつつ、イソプレノイド化合物の溶媒抽出を行った
後、遠心分離により2−ブタノール層を採取した。

【０１３９】該ブタノール層中のＣｏＱ８を、高速液体
クロマトグラフィー（LC-10A 島津製作所製）で定量分
析することにより、形質転換体によるＣｏＱ８の生産量
を算定した。カラムはDevelosil ODS-HG-5（野村化学）
を用い、メタノール：ｎ−ヘキサン＝８：２の溶液を移
動相とし、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長２７５ｎｍの
条件で分析した。結果を第１表に示す。

【０１４０】

【表１】

【０１４１】ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5
α／pEG400と比較し、DH5α／pADO-1、DH5α／pDXS-1お
よびDH5α／pXSE-1では有意に高かった。特に、実施例
１で取得したＤＮＡを全て導入したDH5α／pADO-1にお
いて最も高い生産性が得られた。

【０１４２】（２）Ｍ９培地を１０ｍｌ入れた試験管
に、上記（１）で取得したE. coli DH5α／pDXS-1また
はE. coli DH5α／pEG400をそれぞれ植菌し、３０℃で
７２時間振盪培養した。培養終了後、上記（１）と同様
の方法により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定
した。結果を第２表に示す。

【０１４３】

【表２】

【０１４４】ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5
α／pEG400と比較し、DH5α／pDXS-1では有意に高かっ
た。 （３） 組換え大腸菌によるＣｏＱ８の生産 実施例１で取得したプラスミドｐＥＧＹＭ１またはコン
トロールとしてｐＥＧ４００をE. coli DH5α株に導入
し、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンに抵抗
性を示す形質転換体E. coli DH5α／pEGYM1およびE. co
li DH5α／pEG400を各々取得した。

【０１４５】グルコース１％、ビタミンＢ₁ １００ｍｇ
／ｌ、ビタミンＢ₆ １００ｍｇ／ｌ、ｐ−ハイドロキシ
安息香酸５０ｍｇ／ｌ添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れ
た試験管にこれら形質転換体を植菌し、３０℃で７２時
間振盪培養した。培養終了後、上記（１）と同様の方法
により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
結果を第３表に示す。

【０１４６】

【表３】

【０１４７】ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5a
／pEG400と比較し、DH5a／pEGYM1では有意に高かった。

【０１４８】実施例３ 組換え大腸菌によるメナキノン
ー８(ＭＫ−８)の生産 （１）スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ添加した
ＴＢ培地〔バクトトリプトン(ディフコ社製）１２ｇ、
酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ、グリセロール５ｇ
を水９００ｍｌに溶解し、ＫＨ₂ＰＯ₄を０．１７Ｍ、Ｋ
₂ＨＰＯ₄を０．７２Ｍ含有する水溶液を１００ｍｌ加え
て調製した培地〕を１０ｍｌ入れた試験管に、実施例２
（１）で取得した、E. coli DH5α／pADO-1またはE. co
li DH5α／pEG400をそれぞれ植菌し、３０℃で７２時間
振盪培養した。培養終了後、実施例２（１）のＣｏＱ８
の定量法と同様の方法によりＭＫ−８を定量し、形質転
換体によるＭＫ−８の生産量を算定した。結果を第４表
に示す。

【０１４９】

【表４】

【０１５０】ＭＫ−８の生産量は、コントロール株DH5
α／pEG400と比較して、DH5α／pADO-1では有意に高か
った。 （２）実施例２（１）で取得したE. coli DH5α／pDXS-
1またはE. coli DH5α／pEG400を、上記（１）と同様の
方法で培養し、形質転換体によるＭＫ−８の生産量を算
定した。結果を第５表に示す。

【０１５１】

【表５】

【０１５２】ＭＫ−８の生産量は、コントロール株DH5
α／pEG400と比較して、DH5α／pDXS-1では有意に高か
った。

【０１５３】実施例4 Erwinia carotovoraによるＣｏＱ
８の生産 実施例１で取得したプラスミドｐＤＸＳ−１またはコン
トロールとしてｐＥＧ４００をErwinia carotovora IFO
-3380株に導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノ
マイシンに抵抗性を示す形質転換体IFO-3380／pDXS-1お
よびIFO-3380／pEG400を取得した。

【０１５４】スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ添
加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転
換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養終
了後、実施例２（１）と同様の方法により形質転換体に
よるＣｏＱ８の生産量を算定した。結果を第６表に示
す。

【０１５５】

【表６】

【０１５６】ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株IFO-
3380／pEG400と比較し、IFO-3380／pDXS-1では有意に高
かった。

【０１５７】実施例５：Erwinia uredovoraによるユビ
キノンおよびカロテノイドの生産 実施例１で取得したプラスミドpUCYM-1、pQEDXS-1、pQE
YM-1またはコントロールとしてpUC19およびpQE30をエレ
クトロポレーション法によりErwinia uredovora DSM-30
080株に導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリン
に抵抗性を示す形質転換体E. uredovora DSM-30080／pU
CYM-1、E. uredovora DSM-30080／pQEDXS-1、E. uredov
ora DSM-30080／pQEYM-1、E. uredovora DSM-30080／pU
C19およびE. uredovora DSM-30080／pQE30を取得した。

【０１５８】アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、グルコー
ス１％、ビタミンＢ₁ １００ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ₆ １
００ｍｇ／ｌ、ｐ−ハイドロキシ安息香酸５０ｍｇ／ｌ
添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質
転換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。

【０１５９】培養終了後、実施例２（１）と同様の方法
により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
カロテノイド色素の生産量は、実施例２（１）と同様の
方法により得られた２−ブタノール層を分光光度計を用
い、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより算出し
た。結果を第７表に示す。

【０１６０】

【表７】

【０１６１】ＣｏＱ８の生産量およびカロテノイド色素
の生産量ともに、コントロール株DSM-30080/pUC19と比
較し、DSM-30080/pUCYM-1では有意に高かった。同様
に、ＣｏＱ８の生産量およびカロテノイド色素の生産量
ともに、コントロール株DSM-30080/pQE30と比較し、DSM
-30080/pQEYM-1およびDSM-30080/pQEDXS-1では有意に高
かった。

【０１６２】実施例６ 光合成細菌Rhodobacter sphaer
oidesからのイソプレノイド化合物の生合成に関与する
蛋白質をコードするＤＮＡの取得 （１）R．sphaeroidesからのＤＸＳ遺伝子の取得 大腸菌で見出されたDXS遺伝子配列を用いて、他生物種
で保存されているDXSホモログをgenbankより検索した。
その結果、Haemophilus influenzae(P45205)、Rhodobac
ter capsulatus(P26242)、Bacillussubtilis(P54523)、
Synechocystis sp. PCC6803(P73067)およびMycobacteri
un tuberculosis(O07184)等でホモログが見出された。
これら配列を比較して、高度に保存されているアミノ酸
配列を選択した。保存アミノ酸配列に対応する塩基配列
をR. sphaeroidesのコドン使用頻度を考慮にいれて設計
し、センスプライマーとして配列番号３２および配列番
号３３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、アンチ
センスプライマーとして配列番号３４を有するＤＮＡ断
片をＤＮＡ合成機を用いて合成した。

【０１６３】R．sphaeroides KY4113株（FERM-P4675）
の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、Expa
nd^TM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハ
イム社製)を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエル
マージャパン社製)でＰＣＲを行った。

【０１６４】ＰＣＲは、９４℃で４０秒間、６０℃で４
０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクル
として、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応さ
せる条件で行い、目的とするＤＮＡ断片を取得した。こ
のＤＮＡ断片をDIG DNA Labeling Kit（ベーリンガー・
マンハイム社製）を用いてＤＩＧ標識した。

【０１６５】R. sphaeroidesのＤＸＳ遺伝子全長を取得
するため、ＫＹ４１１３株のゲノムライブラリーを作成
した。ＫＹ４１１３株をＬＢ培地で一晩培養し、染色体
ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し
てショ糖密度勾配超遠心法により４〜６ｋｂのＤＮＡ断
片を精製した。該ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ消化したベク
ターｐＵＣ１９をLigation Pack(ニッポンジーン社製)
を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質
転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレ
ートに塗布し、約１００００個のコロニーを得た。

【０１６６】上記方法で取得したＤＩＧ標識ＤＮＡ断片
をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法
によるスクリーニングをしたところ、２種類のＤＮＡ断
片が検出された。各々をシークエンスしたところ、それ
ぞれのＤＮＡ断片から他生物種の既知ＤＸＳ遺伝子と相
同性の高いＯＲＦが見出された。配列番号２６に示すア
ミノ酸配列をＤＸＳ１、配列番号２７に示すアミノ酸配
列をＤＸＳ２と命名した。

【０１６７】（２）大腸菌ＤＸＳ遺伝子欠損株を用いた
相補性確認 大腸菌ＤＸＳ遺伝子欠損株の取得E . coli W3110株（ATCC14948）を、ＬＢ液体培地に植菌
し、対数増殖期まで培養した。培養後、得られた培養液
より遠心分離により菌体を取得した。該菌体を、０．０
５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄
後、菌体濃度が１０⁹細胞／ｍｌになるように同緩衝液
に懸濁した。

【０１６８】該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／
ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理
を行った。得られた変異処理菌体を１−デオキシキシル
ロース０．１％を含むＭ９最少寒天培地〔モレキュラー
・クローニング第二版〕プレートに塗布して培養した。
１−デオキシキシルロースは、J. C. S. Perkin Trans
I, 2131-2137 (1982)に記載の方法に準じて化学合成し
た。

【０１６９】１−デオキシキシルロース０．１％を含む
Ｍ９最少寒天培地上で生育してきたコロニーを、Ｍ９最
少寒天培地と１−デオキシキシルロースを０．１％含む
Ｍ９最少寒天培地にレプリカし、１−デオキシキシルロ
ースを０．１％含むＭ９最少寒天培地では生育できる
が、Ｍ９最少寒天培地では生育できない、１−デオキシ
キシルロース要求性を示す株を目的の変異株として選択
した。該方法で選択され、取得された変異株をＭＥ１株
と命名した。該ＭＥ１株にｐＤＸＳ−１を導入したとこ
ろ、１−デオキシキシルロース要求性を相補したことか
ら、ＭＥ１株はＤＸＳ遺伝子が欠損した株であると判断
した。

【０１７０】（３）ＤＸＳ１およびＤＸＳ２の相補性試
験 ＫＹ４１１３株由来の、配列番号２７からなるＤＸＳ１
をコードするＤＮＡ断片、および配列番号２９からなる
ＤＸＳ２をコードするＤＮＡ断片を各々ベクターｐＵＣ
１９のｌａｃプロモーター下流に連結したプラスミドを
構築した。

【０１７１】これら構築したプラスミドをそれぞれＭＥ
１株に導入したところ、ＤＸＳ１およびＤＸＳ２いずれ
もＭＥ１株の１−デオキシキシルロース要求性を相補し
た。以上のことから、R. sphaeroidesはピルビン酸とグ
リセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キ
シルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を
有するＤＸＳ１およびＤＸＳ２のＤＸＳ遺伝子を2つ持
つことが判明した。

【０１７２】（４）R.sphaeroides由来メチルエリスリ
トール要求性相補遺伝子の取得 実施例１（２）で得られた大腸菌メチルエリスリトー
ル要求性変異株ＭＥ７株を、メチルエリスリトール０．
１％含むＬＢ液体培地に植菌して対数増殖期まで培養し
た後、遠心分離して菌体を回収した。該菌体を１０％グ
リセロールを含む１ｍＭＨＥＰＥＳ水溶液で２回洗浄し
て培地成分を可能な限り除去した。

【０１７３】該洗浄菌体に、実施例６（１）で作成した
R.sphaeroides KY4113株のゲノムライブラリーから抽出
したプラスミドを、常法に従い、エレクトロポレーショ
ンにより導入した。導入後、アンピシリン１００μｇ／
ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し
た。生育してきたコロニーを釣菌し、ＬＢ液体培地に植
菌して培養し、該培養菌体よりプラスミドを抽出した。

【０１７４】抽出したプラスミドをＭＥ７株に再導入し
たところ、メチルエリスリトールを含まない培地でも生
育したことから、抽出したプラスミドにR.sphaeroides
由来のメチルエリスリトール要求性を相補するＤＮＡ断
片が含まれていることを確認した。本ＤＮＡ断片の塩基
配列を決定した結果、配列番号３１からなる、大腸菌ya
eMと相同性の高いアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
が見出された。

【０１７５】実施例７ 組換え光合成細菌によるユビキ
ノンー１０（ＣｏＱ１０）の生産 実施例６で取得した配列番号２７からなるＤＮＡ断片Ｄ
ＸＳ１および配列番号２９からなるＤＮＡ断片ＤＸＳ２
の上流に、KY4113株由来のglnBプロモーターを連結し、
広宿主域ベクターpEG400に挿入して作成したプラスミド
をpRSDX-1およびpRSDX-2と命名した。また、yaeMとＤＸ
Ｓ１をタンデムに連結し、glnBプロモーター下流に連結
したプラスミドを構築し、pRSYMDX1と命名した。これら
プラスミドを、エレクトロポレーション（Bio-Rad社
製）によりR．sphaeroides KY4113株に導入した。

【０１７６】導入後、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチ
ノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日
間培養した。生育してきたコロニーを１００μｇ／ｍｌ
濃度のスペクチノマイシンを含むＬＢ培地に植菌して一
晩培養後、培養菌体を遠心分離により回収した。

【０１７７】得られた菌体よりプラスミド抽出（Qiagen
社製）し、各々導入したプラスミドを保持していること
を確認した。このようにして得られた形質転換体をKY41
13/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2、KY4113/pRSYMDX1およびK
Y4113/pEG400と命名した。種培地〔グルコース２％、ペ
プトン１％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ
７．２、ＮａＯＨで調整）〕を５ｍｌ入れた試験管に各
形質転換体を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養し
た。

【０１７８】得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノン
ー１０生産培地（廃糖蜜４％、グルコース２．７％、コ
ーンスチープリカー４％、硫酸アンモニウム０．８％、
リン酸１カリウム０．０５％、リン酸２カリウム０．０
５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％、硫酸
第一鉄・７水和物３ｍｇ／ｌ、チアミン８ｍｇ／ｌ、ニ
コチン酸８ｍｇ／ｌ、トレースエレメント１ｍｌ／ｌを
含む培地をｐＨ９に調整後、炭酸カルシウム１％を添加
してオートクレーブ滅菌したもの）を５ｍｌ入れた試験
管に添加し、３０℃で５日間振盪培養した。培養終了後
実施例２（１）のＣｏＱ８の定量法と同様の方法によ
り、形質転換体によるＣｏＱ１０の生産量を算定した。
結果を表８に示す。

【０１７９】

【表８】

【０１８０】ＣｏＱ１０生成量は、コントロール株KY41
13/pEG400と比較しKY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2お
よびKY4113/pRSYMDX1では有意に高かった。

【０１８１】実施例８ yaeM遺伝子がコードする酵素の
活性測定 （１）yaeM遺伝子の高発現化 ｙａｅＭ遺伝子を十分発現させるような組換え体プラス
ミドをＰＣＲ法〔Science，230，1350 (1985)〕を用い
て下記方法により構築した。配列番号２４に示した配列
を有するセンスプライマーおよび配列番号２５に示した
配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を
用いて合成した。

【０１８２】該センスプライマーおよびアンチセンスプ
ライマーの５’末端にはそれぞれＢａｍＨＩの制限酵素
サイトを付加させた。染色体ＤＮＡを鋳型として、これ
らプライマーおよびTaq DNA polymerase（ベーリンガー
社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマー
ジャパン社製）でＰＣＲを行うことによりｙａｅＭ遺伝
子を増幅した。

【０１８３】ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で３
０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクル
と３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条
件で行った。増幅されたＤＮＡ断片およびpUC118（宝酒
造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、各々のＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。

【０１８４】これら精製された両断片を混合した後エタ
ノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸
留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組
換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡがｙａｅＭ
遺伝子であることをＤＮＡ配列を決定することによって
確認した。

【０１８５】該組換え体からプラスミドを抽出し、制限
酵素制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気
泳動を行いＢａｍＨＩ処理ｙａｅＭ遺伝子含有ＤＮＡ断
片を取得した。ｐQE30（QIAGEN社製）を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨ
Ｉ処理pQE30断片を取得した。

【０１８６】上記で取得されたＢａｍＨＩ処理ｙａｅＭ
遺伝子含有ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ消化pQE30断片と混
合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿
物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行
うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体Ｄ
ＮＡを用い、E. Coli JM109株を常法に従って形質転換
後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。

【０１８７】上記と同様の方法で、該大腸菌よりプラス
ミドを単離した。上記同様、該方法により単離したプラ
スミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列
を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されて
いるプラスミドであることを確認した。このプラスミド
をpQEDXRと命名した。

【０１８８】（２） ｙａｅＭ遺伝子産物の活性測定 ｙａｅＭ遺伝子産物の精製 （１）で作成したpQEDXRを常法によりpREP4を有するE.
coli M15株(QIAGEN社製)に導入し、アンピシリン200μg
/ml、カナマイシン25μg/mlに耐性を示すM15/pREP4+pQE
DXR株を得た。

【０１８９】M15/pREP4+pQEDXR株をアンピシリン２００
μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液
体培地１００ｍｌ中、３７℃で培養し、６６０ｎｍの濁
度が０．８に達した時点でイソプロピルチオガラクトシ
ドを終濃度０．２ｍＭになるように添加した。さらに３
７℃で５時間培養した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、
１０分間）によって培養上清を除いた。この菌体を１０
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６ｍｌに懸濁
し、超音波破砕機(SONIFIER,BRANSON社製)を用いて氷冷
しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１
０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回
収した。この細胞抽出液遠心上清をNi-NTAレジンカラム
(QIAGEN社製)に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液〔１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭイミダゾール、
０．５％ Tween２０〕で洗浄した。ついで溶出緩衝液
〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭイ
ミダゾール〕１０ｍｌを通塔し、溶出液を１ｍｌづつ分
画した。各分画について蛋白量を測定（ＢｉｏＲａｄ社
の蛋白量定量キット使用)し、蛋白質を含む画分を精製
蛋白画分とした。

【０１９０】 基質１−デオキシ-D-キシルロース5-
リン酸の調製 反応基質である１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸
は以下のようにして調製した。１−デオキシ-D-キシル
ロース5-リン酸の検出は、ＨＰＬＣ〔カラム：Senshu p
ak NH2-1251-N(4.6 x 250mm、Senshu社製)、移動層：１
００ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ３．５）〕によって１９５ｎ
ｍの吸光度を測定する方法で行った。大腸菌のｄｘｓ遺
伝子を高発現するプラスミドpQDXS-1を上記と同様にE.c
oliM15/pREP4株に導入し、M15/pREP4+pQDXS-1株を得
た。

【０１９１】該株を実施例８（２）と同様に培養し、
Ni-NTAレジンカラムを用いてｄｘｓ酵素蛋白質を精製し
た。該精製ｄｘｓ蛋白質を２０ｍｌの反応液〔１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭピルビン酸ナト
リウム、３０ｍＭＤＬ−グリセルアルデヒド−３−リン
酸、１．５ｍＭチアミンピロリン酸、１０ｍＭＭｇＣｌ
₂、１ｍＭＤＬ−ジチオスレイトール〕に加え３７℃で
保温した。

【０１９２】１２時間反応した後、反応液を水で３００
ｍｌに希釈し、活性炭カラム（２．２ｘ８ｃｍ）を通し
た後、Dowex 1-X8（Ｃｌ−型、３．５ｘ２５ｃｍ）に通
塔し、１％食塩水で溶出した。溶出画分を濃縮後、Seph
adex G-10（１．８ｘ１００ｃｍ）に通塔し、水で溶出
した。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸含有
画分を凍結乾燥し、約５０ｍｇの白色粉末を得た。該粉
末が１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸であること
をＮＭＲ分析(A-500、日本電子社製)で確認した。

【０１９３】 yaeM遺伝子産物の酵素活性測定 １００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＭｍＣｌ
２、０．３ｍＭＮＡＤＰＨと実施例８（２）で得たｙ
ａｅＭ遺伝子産物を含む反応液１ｍｌに、上記のように
合成した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸
０．３ｍＭ（終濃度）を加え、３７℃でインキュベート
した。インキュベート中のＮＡＤＰＨの増減を３４０ｎ
Ｍの吸光を分光光度計(UV-160、島津社製)で測定する方
法で追跡したところ、経時的にＮＡＤＰＨが減少するこ
とが分かった。

【０１９４】上記反応産物の構造を確認するため、以下
のようにスケールを大きくして反応を行い、産物を単離
した。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の濃
度を０．１５ｍＭとした以外は上記と同じ組成の反応液
２００ｍｌを、同様に３７℃で３０分間インキュベート
した後、その全量を活性炭カラムに通し、通過液を水で
１Ｌに希釈した後、Dowex 1-X8（Cl-型、３．５ｘ２０
ｃｍ）カラムに通塔した。

【０１９５】１％食塩水４００ｍｌで溶出し、Sephadex
G-10（１．８ｘ１００ｃｍ）に通塔し、水で溶出し
た。溶出画分を凍結乾燥することで、反応産物を単離し
た。ＨＲ−ＦＡＢＭＳ解析から単離された反応産物の分
子式はＣ₅Ｈ₁₂Ｏ₇Ｐ［ｍ／ｚ２１５．０２７６（Ｍ−
Ｈ）^-、△−４．５ｍｍｕ］と推定された。¹Ｈおよび ¹³
ＣＮＭＲ解析から、以下のケミカルシフトが得られた。

【０１９６】¹H NMR(D₂O, 500 MHz):δ4.03(ddd, J=11.
5, 6.5, 2.5 Hz, 1H), 3.84(ddd, J=11.5, 8.0, 6.5 H
z, 1H), 3.78(dd, J=80, 2.5 Hz, 1H), 3.60(d, J=12.0
Hz,1H), 3.50(d, J=12.0 Hz, 1H), 1.15(s, ³H); ¹³C
NMR(D₂O, 125 MHz):δ75.1(C-2), 74.8(C-3), 67.4(C-
1), 65.9(C-4), 19.4(2-Me) この反応産物をアルカリ性ホスファターゼ(宝酒造社製)
で処理して得られる化合物を¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲ解
析して得られるケミカルシフトは、TetrahedronLetter,
38, 6184 (1997)に記載の方法で合成した２−Ｃ−メチ
ル−Ｄ−エリスリトールのＮＭＲ解析で得られるケミカ
ルシフトと完全に一致した。

【０１９７】さらに前者の旋光度は［α］_D ²¹=＋６．０
（ｃ=０．０５０，Ｈ₂Ｏ）で、報告されている〔Tetrah
edron Letter, 38, 6184 (1997)〕２−Ｃ−メチル−Ｄ
−エリスリトールの旋光度［α］_D ²⁵=＋７．０（ｃ=
０．１３，Ｈ₂Ｏ）と一致した。

【０１９８】これらの結果から、ｙａｅＭ遺伝子産物の
反応産物は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リ
ン酸であることが明らかになった。即ち、ｙａｅＭ遺伝
子産物はＮＡＤＰＨの消費を伴いながら１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−
エリスリトール４−リン酸を生じる活性を有することが
判明した。この触媒活性に基づき、本酵素を１−デオキ
シ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ
と命名した。

【０１９９】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−
リン酸レダクトイソメラーゼの性質実施例８（２）に
記した１ｍｌ反応系を用いて、１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの酵素学的性
質を調べた。なお１ｕとは１分間に１ｍｍｏｌのＮＡＤ
ＰＨを酸化する活性と定義する。

【０２００】ＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに置換した場合、活
性は１／１００以下に低下した。１−デオキシ−Ｄ−キ
シルロース５−リン酸の代りに１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロースを用いると全く反応は起らなかった。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ解析から、本酵素は４２ｋＤａポリペプチドか
ら構成されていることが分かった。反応系への金属添加
効果を第9表に示した。

【０２０１】

【表９】

【０２０２】ＭｎＣｌ₂存在下での１−デオキシ−Ｄ−
キシルロース５−リン酸、ＮＡＤＰＨへのＫｍは、それ
ぞれ２４９μＭ、７．４μＭだった。反応温度の影響を
図１に、反応ｐＨの影響を図２に示した。

【０２０３】実施例９ ｙａｅＭ欠損変異株の作成と性
質 （１）ｙａｅＭ欠損変異株の作成 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼが細胞の生育に必須か否かを調べるため、以
下のようにしてその欠損変異株を作成した。ｙａｅＭ遺
伝子中に挿入するためのカナマイシン耐性遺伝子カセッ
トを以下のようにして作成した。

【０２０４】実施例１（２）で得たプラスミドｐＭＥ
Ｗ４１を制限酵素ＢａｌＩで消化後アガロースゲル電気
泳動し、ＢａｉＩＩ処理ＤＮＡ断片を取得した。Ｔｎ５
を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｍＩで消化した後、DN
A blunting kit（宝酒造社製）を用いて断片の末端を平
滑化した。

【０２０５】得られた平滑化ＤＮＡ断片を先に作成した
ＢａｉＩＩ処理ｐＭＥＷ４１ＤＮＡ断片と混合した後、
エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌ
の蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことによ
り組換え体ＤＮＡを取得した。該組換え体ＤＮＡを用
い、E. coli JM109株（宝酒造より購入）を常法に従っ
て形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌとカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布し、３７℃で一晩培養した。

【０２０６】生育してきたアンピシリン耐性の形質転換
体のコロニー数個について、アンピシリン１００μｇ／
ｍｌとカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地
１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。得られた培養
液を遠心分離することにより菌体を取得した。

【０２０７】該菌体より常法に従ってプラスミドを単離
した。該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素
で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されて
いるプラスミドであることを確認した。このプラスミド
をpMEW41Kmと名づけた。

【０２０８】pMEW41Kmを用いて、相同組換えによる染色
体上のyaeM遺伝子の破壊を行った。組換えの模式図を図
３に示した。pMEW41Kmを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａ
ｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い直鎖状の
断片を精製した。この断片を用いて常法に従って、大腸
菌FS1576株を形質転換した。FS1576株は国立遺伝学研究
所よりME9019株の名で入手可能である。該形質転換体を
カナマイシン１５μｇ／ｍｌと２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３
７℃で一晩培養した。

【０２０９】生育してきたカナマイシン耐性コロニー数
個について、カナマイシン１５μｇ／ｍｌと２−Ｃ−メ
チル−Ｄ−エリスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ液体培地
１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。得られた培養
液を遠心分離することにより菌体を取得した。該菌体よ
り常法に従って染色体ＤＮＡを単離した。

【０２１０】染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩまたはＰ
ｓｔＩで消化した。またFS1576株の染色体についても同
様に処理した。常法に従って、これら制限酵素処理ＤＮ
Ａをアガロースゲル電気泳動後、カナマイシン耐性遺伝
子およびｙａｅＭ遺伝子をプローブとしたサザンハイブ
リダイゼーション解析に供した。その結果、カナマイシ
ン耐性コロニーの染色体は図３に示した構造をとってお
り、目的どおりｙａｅＭ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝
子で分断破壊されていることが確かめられた。

【０２１１】（２） ｙａｅＭ欠損変異株の性質 上記の手順で作成されたｙａｅＭ欠損株およびその親株
であるＦＳ１５７６株を、ＬＢ寒天培地および２−Ｃ−
メチル−Ｄ−エリスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培
地に塗布し、３７℃で培養した。２日後の生育度合いを
第１０表に示した。

【０２１２】

【表１０】

【０２１３】ｙａｅＭ欠損変異株は２−Ｃ−メチル−Ｄ
−エリスリトールを添加しない培地では生育できないた
め、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール非存在下では
本遺伝子が細胞の生育に必須であることが明白となっ
た。

【０２１４】実施例１０ １−デオキシ−Ｄ−キシルロ
ース５−リン酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が菌の生育
に及ぼす効果 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼ反応の産物である２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリ
スリトール４−リン酸やこの酵素反応で想定される反応
中間体とフォスミドマイシンは構造的に似ているため、
フォスミドマイシンが該酵素を阻害する可能性があると
の推定の基に以下の実験をおこなった。

【０２１５】実施例８に示した１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ活性測定系に
フォスミドマイシンを添加し、酵素活性への影響を調べ
た。フォスミドマイシンは〔Chem. Pharm. Bull., 30,
111-118 (1982)〕に記載の方法に従って合成した。

【０２１６】実施例８（２）に示した反応系を０．２
ｍｌにスケールダウンした系（各濃度は同じ）に各種濃
度のフォスミドマイシンを添加し、３７℃でインキュベ
ートし、ＮＡＤＰＨの増減をベンチマークマイクロプレ
ートリーダー（バイオラド社製）を用いて測定した。

【０２１７】図４に示したように、フォスミドマイシン
は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクト
イソメラーゼを阻害することが判った。大腸菌W3110株
をＬＢ寒天培地、フォスミドマイシンを３．１３ｍｇ／
ｌ含むＬＢ寒天培地およびフォスミドマイシン３．１３
ｍｇ／ｌと２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール０．２
５ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地にそれぞれ塗布し、３７℃
で培養した。

【０２１８】培養２日後において、ＬＢ寒天培地、フォ
スミドマイシンおよび２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリト
ール０．２５ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地上の２種類の培
地では菌は生育することができたが、フォスミドマイシ
ンだけを添加したＬＢ寒天培地では菌は生育することが
できなかった。

【０２１９】これらの結果から、フォスミドマイシンが
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼを阻害することによって菌の生育を阻害する
ことが明白となった。 以上のことから、ｙａｅＭ（１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソ
メラーゼ）の活性を阻害する物質は有効な抗菌剤あるい
は除草剤となり得る。

【０２２０】

【発明の効果】本発明によれば、心疾患、骨粗鬆症、止
血、がん予防、免疫賦活等を目的とした医薬品、健康食
品および貝類付着防止塗料等に有用なイソプレノイド化
合物の生合成に関与するＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡを
ベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを原核生
物由来の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地
に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積
させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取するこ
とを特徴とする、イソプレノイド化合物の製造方法、イ
ソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることので
きる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを１つ以上
含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体Ｄ
ＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に
培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物
から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の
製造方法、および該蛋白質、ならびに１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を
有する新規な酵素蛋白質および該酵素を阻害する物質を
探索することによる、抗菌およびまたは除草活性を有す
る化合物の探索方法を提供することができる。

【０２２１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> A METHOD OF SCREENING A COMPOUND HAVING ANTIBIOTIC OR WEED KILLER ACTIVITY <130> H11-0431N2 <140> <141> <150> H10-103101 <151> 1998-04-14 <150> H10-221910 <151> 1998-08-05 <150> H11-035739 <151> 1999-02-15 <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 620 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Phe Asp Ile Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser 1 5 10 15 Thr Gln Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly 35 40 45 His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His 50 55 60 Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His 65 70 75 80 Gln Ala Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly 85 90 95 Thr Ile Arg Gln Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu 100 105 110 Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser 115 120 125 Ala Gly Ile Gly Ile Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg 130 135 140 Arg Thr Val Cys Val Ile Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala 145 150 155 160 Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val 165 170 175 Ile Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu 180 185 190 Asn Asn His Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Glu Gly Gly Lys Lys Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu 210 215 220 Leu Leu Lys Arg Thr Glu Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly 225 230 235 240 Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly 245 250 255 His Asp Val Leu Gly Leu Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu 260 265 270 Lys Gly Pro Gln Phe Leu His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr 275 280 285 Glu Pro Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe 290 295 300 Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser 305 310 315 320 Tyr Ser Lys Ile Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp 325 330 335 Asn Lys Leu Met Ala Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met 340 345 350 Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile 355 360 365 Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly 370 375 380 Tyr Lys Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr 385 390 395 400 Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe 405 410 415 Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln 420 425 430 Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile 435 440 445 Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly 450 455 460 Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn 465 470 475 480 Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys 485 490 495 Gly Ile Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly 500 505 510 Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr 515 520 525 Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu 530 535 540 Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala 545 550 555 560 Ile Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His 565 570 575 Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile 580 585 590 Pro Gln Gly Thr Gln Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala 595 600 605 Ala Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ala Trp Leu Ala 610 615 620 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln 1 5 10 15 Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val 20 25 30 Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg 35 40 45 Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn 50 55 60 Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg 85 90 95 Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala 115 120 125 Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu 130 135 140 Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu 145 150 155 160 Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg 165 170 175 Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu 180 185 190 Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu 195 200 205 Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp 210 215 220 Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly 225 230 235 240 Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu 245 250 255 Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln 260 265 270 Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu 275 280 285 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys 290 295 <210> 3 <211> 80 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser 1 5 10 15 Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu 20 25 30 Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln 35 40 45 Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu 50 55 60 Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr Pro Phe Thr Pro Asp Asn Glu 65 70 75 80 <210> 4 <211> 348 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Val Thr Gly Val Asn Glu Cys Ser Arg Ser Thr Cys Asn Leu Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Glu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser Met Gln Tyr Asn Pro Leu Gly Lys 20 25 30 Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly Cys Met Thr Phe Gly 35 40 45 Glu Pro Asp Arg Gly Asn His Ala Trp Thr Leu Pro Glu Glu Ser Ser 50 55 60 Arg Pro Ile Ile Lys Arg Ala Leu Glu Gly Gly Ile Asn Phe Phe Asp 65 70 75 80 Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu Glu Ile Val Gly Arg 85 90 95 Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val Val Val Ala Thr Lys 100 105 110 Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly Leu Ser Arg Ala Gln 115 120 125 Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg Leu Gly Met Asp Tyr 130 135 140 Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr Asn Thr Pro Ile Glu 145 150 155 160 Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys Ala Gly Lys Ala Arg 165 170 175 Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln Phe Ala Gln Ala Leu 180 185 190 Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe Val Ser Met Gln Asp 195 200 205 His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg Glu Met Leu Pro Leu 210 215 220 Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp Ser Pro Leu Ala Arg 225 230 235 240 Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr Ala Arg Leu Val Ser 245 250 255 Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser Asp Glu Asn Asp Ala 260 265 270 Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu Glu Leu Gly Ala Thr 275 280 285 Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser Lys Pro Gly Ile Ala 290 295 300 Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln Leu Asp Glu Leu Leu 305 310 315 320 Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln Ile Ala Glu Leu Glu 325 330 335 Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe Lys 340 345 <210> 5 <211> 398 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met Lys Gln Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Cys Ser 1 5 10 15 Thr Leu Asp Val Val Arg His Asn Pro Glu His Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 Leu Val Ala Gly Lys Asn Val Thr Arg Met Val Glu Gln Cys Leu Glu 35 40 45 Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Val Met Asp Asp Glu Ala Ser Ala Lys Leu 50 55 60 Leu Lys Thr Met Leu Gln Gln Gln Gly Ser Arg Thr Glu Val Leu Ser 65 70 75 80 Gly Gln Gln Ala Ala Cys Asp Met Ala Ala Leu Glu Asp Val Asp Gln 85 90 95 Val Met Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Pro Thr Leu Ala 100 105 110 Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu 115 120 125 Val Thr Cys Gly Arg Leu Phe Met Asp Ala Val Lys Gln Ser Lys Ala 130 135 140 Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu 145 150 155 160 Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn 165 170 175 Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu 180 185 190 Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg 195 200 205 His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr 210 215 220 Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn 225 230 235 240 Ala Ser Ala Ser Gln Met Glu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val Ile 245 250 255 His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly 260 265 270 Glu Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Pro Thr Pro Trp Ala Trp Pro Asn 275 280 285 Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala 290 295 300 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu 305 310 315 320 Ala Met Glu Ala Phe Glu Gln Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn 325 330 335 Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg 340 345 350 Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp 355 360 365 Met Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn 370 375 380 Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser 385 390 395 <210> 6 <211> 1860 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1860) <400> 6 atg agt ttt gat att gcc aaa tac ccg acc ctg gca ctg gtc gac tcc 48 Met Ser Phe Asp Ile Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser 1 5 10 15 acc cag gag tta cga ctg ttg ccg aaa gag agt tta ccg aaa ctc tgc 96 Thr Gln Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys 20 25 30 gac gaa ctg cgc cgc tat tta ctc gac agc gtg agc cgt tcc agc ggg 144 Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly 35 40 45 cac ttc gcc tcc ggg ctg ggc acg gtc gaa ctg acc gtg gcg ctg cac 192 His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His 50 55 60 tat gtc tac aac acc ccg ttt gac caa ttg att tgg gat gtg ggg cat 240 Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His 65 70 75 80 cag gct tat ccg cat aaa att ttg acc gga cgc cgc gac aaa atc ggc 288 Gln Ala Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly 85 90 95 acc atc cgt cag aaa ggc ggt ctg cac ccg ttc ccg tgg cgc ggc gaa 336 Thr Ile Arg Gln Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu 100 105 110 agc gaa tat gac gta tta agc gtc ggg cat tca tca acc tcc atc agt 384 Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser 115 120 125 gcc gga att ggt att gcg gtt gct gcc gaa aaa gaa ggc aaa aat cgc 432 Ala Gly Ile Gly Ile Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg 130 135 140 cgc acc gtc tgt gtc att ggc gat ggc gcg att acc gca ggc atg gcg 480 Arg Thr Val Cys Val Ile Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala 145 150 155 160 ttt gaa gcg atg aat cac gcg ggc gat atc cgt cct gat atg ctg gtg 528 Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val 165 170 175 att ctc aac gac aat gaa atg tcg att tcc gaa aat gtc ggc gcg ctc 576 Ile Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu 180 185 190 aac aac cat ctg gca cag ctg ctt tcc ggt aag ctt tac tct tca ctg 624 Asn Asn His Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu 195 200 205 cgc gaa ggc ggg aaa aaa gtt ttc tct ggc gtg ccg cca att aaa gag 672 Arg Glu Gly Gly Lys Lys Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu 210 215 220 ctg ctc aaa cgc acc gaa gaa cat att aaa ggc atg gta gtg cct ggc 720 Leu Leu Lys Arg Thr Glu Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly 225 230 235 240 acg ttg ttt gaa gag ctg ggc ttt aac tac atc ggc ccg gtg gac ggt 768 Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly 245 250 255 cac gat gtg ctg ggg ctt atc acc acg cta aag aac atg cgc gac ctg 816 His Asp Val Leu Gly Leu Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu 260 265 270 aaa ggc ccg cag ttc ctg cat atc atg acc aaa aaa ggt cgt ggt tat 864 Lys Gly Pro Gln Phe Leu His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr 275 280 285 gaa ccg gca gaa aaa gac ccg atc act ttc cac gcc gtg cct aaa ttt 912 Glu Pro Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe 290 295 300 gat ccc tcc agc ggt tgt ttg ccg aaa agt agc ggc ggt ttg ccg agc 960 Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser 305 310 315 320 tat tca aaa atc ttt ggc gac tgg ttg tgc gaa acg gca gcg aaa gac 1008 Tyr Ser Lys Ile Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp 325 330 335 aac aag ctg atg gcg att act ccg gcg atg cgt gaa ggt tcc ggc atg 1056 Asn Lys Leu Met Ala Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met 340 345 350 gtc gag ttt tca cgt aaa ttc ccg gat cgc tac ttc gac gtg gca att 1104 Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile 355 360 365 gcc gag caa cac gcg gtg acc ttt gct gcg ggt ctg gcg att ggt ggg 1152 Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly 370 375 380 tac aaa ccc att gtc gcg att tac tcc act ttc ctg caa cgc gcc tat 1200 Tyr Lys Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr 385 390 395 400 gat cag gtg ctg cat gac gtg gcg att caa aag ctt ccg gtc ctg ttc 1248 Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe 405 410 415 gcc atc gac cgc gcg ggc att gtt ggt gct gac ggt caa acc cat cag 1296 Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln 420 425 430 ggt gct ttt gat ctc tct tac ctg cgc tgc ata ccg gaa atg gtc att 1344 Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile 435 440 445 atg acc ccg agc gat gaa aac gaa tgt cgc cag atg ctc tat acc ggc 1392 Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly 450 455 460 tat cac tat aac gat ggc ccg tca gcg gtg cgc tac ccg cgt ggc aac 1440 Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn 465 470 475 480 gcg gtc ggc gtg gaa ctg acg ccg ctg gaa aaa cta cca att ggc aaa 1488 Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys 485 490 495 ggc att gtg aag cgt cgt ggc gag aaa ctg gcg atc ctt aac ttt ggt 1536 Gly Ile Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly 500 505 510 acg ctg atg cca gaa gcg gcg aaa gtc gcc gaa tcg ctg aac gcc acg 1584 Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr 515 520 525 ctg gtc gat atg cgt ttt gtg aaa ccg ctt gat gaa gcg tta att ctg 1632 Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu 530 535 540 gaa atg gcc gcc agc cat gaa gcg ctg gtc acc gta gaa gaa aac gcc 1680 Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala 545 550 555 560 att atg ggc ggc gca ggc agc ggc gtg aac gaa gtg ctg atg gcc cat 1728 Ile Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His 565 570 575 cgt aaa cca gta ccc gtg ctg aac att ggc ctg ccg gac ttc ttt att 1776 Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile 580 585 590 ccg caa gga act cag gaa gaa atg cgc gcc gaa ctc ggc ctc gat gcc 1824 Pro Gln Gly Thr Gln Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala 595 600 605 gct ggt atg gaa gcc aaa atc aag gcc tgg ctg gca 1860 Ala Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ala Trp Leu Ala 610 615 620 <210> 7 <211> 897 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(897) <400> 7 atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag 48 Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln 1 5 10 15 gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg 96 Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val 20 25 30 gtc gaa acc atg cag tat ggc gca tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga 144 Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg 35 40 45 cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt cat atg ttc ggc gtt agc aca aac 192 Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn 50 55 60 acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc gtt gag tgt atc cac gct tac tca 240 Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser 65 70 75 80 tta att cat gat gat tta ccg gca atg gat gat gac gat ctg cgt cgc 288 Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg 85 90 95 ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc 336 Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 gct ggc gac gct tta caa acg ctg gcg ttc tcg att tta agc gat gcc 384 Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala 115 120 125 gat atg ccg gaa gtg tcg gac cgc gac aga att tcg atg att tct gaa 432 Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu 130 135 140 ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc gga atg tgc ggt ggt cag gca tta 480 Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu 145 150 155 160 gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt 528 Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg 165 170 175 att cat cgt cat aaa acc ggc gca ttg att cgc gcc gcc gtt cgc ctt 576 Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu 180 185 190 ggt gca tta agc gcc gga gat aaa gga cgt cgt gct ctg ccg gta ctc 624 Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu 195 200 205 gac aag tat gca gag agc atc ggc ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac 672 Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp 210 215 220 atc ctg gat gtg gtg gga gat act gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt 720 Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly 225 230 235 240 gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt 768 Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu 245 250 255 gag caa gcc cgg aag aaa gcc cgg gat ctg atc gac gat gcc cgt cag 816 Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln 260 265 270 tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa 864 Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu 275 280 285 gcg cta gcg gac tac atc atc cag cgt aat aaa 897 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys 290 295

【０２２２】 <210> 8 <211> 240 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(240) <400> 8 atg ccg aag aaa aat gag gcg ccc gcc agc ttt gaa aag gcg ctg agc 48 Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser 1 5 10 15 gag ctg gaa cag att gta acc cgt ctg gaa agt ggc gac ctg ccg ctg 96 Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu 20 25 30 gaa gag gcg ctg aac gag ttc gaa cgc ggc gtg cag ctg gca cgt cag 144 Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln 35 40 45 ggg cag gcc aaa tta caa caa gcc gaa cag cgc gta caa att ctg ctg 192 Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu 50 55 60 tct gac aat gaa gac gcc tct cta acc cct ttt aca ccg gac aat gag 240 Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr Pro Phe Thr Pro Asp Asn Glu 65 70 75 80 <210> 9 <211> 1044 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1044) <400> 9 gtg act ggg gtg aac gaa tgc agc cgc agc aca tgc aac ttg aag tat 48 Val Thr Gly Val Asn Glu Cys Ser Arg Ser Thr Cys Asn Leu Lys Tyr 1 5 10 15 gac gag tat agc agg agt ggc agc atg caa tac aac ccc tta gga aaa 96 Asp Glu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser Met Gln Tyr Asn Pro Leu Gly Lys 20 25 30 acc gac ctt cgc gtt tcc cga ctt tgc ctc ggc tgt atg acc ttt ggc 144 Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly Cys Met Thr Phe Gly 35 40 45 gag cca gat cgc ggt aat cac gca tgg aca ctg ccg gaa gaa agc agc 192 Glu Pro Asp Arg Gly Asn His Ala Trp Thr Leu Pro Glu Glu Ser Ser 50 55 60 cgt ccc ata att aaa cgt gca ctg gaa ggc ggc ata aat ttc ttt gat 240 Arg Pro Ile Ile Lys Arg Ala Leu Glu Gly Gly Ile Asn Phe Phe Asp 65 70 75 80 acc gcc aac agt tat tct gac ggc agc agc gaa gag atc gtc ggt cgc 288 Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu Glu Ile Val Gly Arg 85 90 95 gca ctg cgg gat ttc gcc cgt cgt gaa gac gtg gtc gtt gcg acc aaa 336 Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val Val Val Ala Thr Lys 100 105 110 gtg ttc cat cgc gtt ggt gat tta ccg gaa gga tta tcc cgt gcg caa 384 Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly Leu Ser Arg Ala Gln 115 120 125 att ttg cgc tct atc gac gac agc ctg cga cgt ctc ggc atg gat tat 432 Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg Leu Gly Met Asp Tyr 130 135 140 gtc gat atc ctg caa att cat cgc tgg gat tac aac acg ccg atc gaa 480 Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr Asn Thr Pro Ile Glu 145 150 155 160 gag acg ctg gaa gcc ctc aac gac gtg gta aaa gcc ggg aaa gcg cgt 528 Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys Ala Gly Lys Ala Arg 165 170 175 tat atc ggc gcg tca tca atg cac gct tcg cag ttt gct cag gca ctg 576 Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln Phe Ala Gln Ala Leu 180 185 190 gaa ctc caa aaa cag cac ggc tgg gcg cag ttt gtc agt atg cag gat 624 Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe Val Ser Met Gln Asp 195 200 205 cac tac aat ctg att tat cgt gaa gaa gag cgc gag atg cta cca ctg 672 His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg Glu Met Leu Pro Leu 210 215 220 tgt tat cag gag ggc gtg gcg gta att cca tgg agc ccg ctg gca agg 720 Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp Ser Pro Leu Ala Arg 225 230 235 240 ggc cgt ctg acg cgt ccg tgg gga gaa act acc gca cga ctg gtg tct 768 Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr Ala Arg Leu Val Ser 245 250 255 gat gag gtg ggg aaa aat ctc tat aaa gaa agc gat gaa aat gac gcg 816 Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser Asp Glu Asn Asp Ala 260 265 270 cag atc gca gag cgg tta aca ggc gtc agt gaa gaa ctg ggg gcg aca 864 Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu Glu Leu Gly Ala Thr 275 280 285 cga gca caa gtt gcg ctg gcc tgg ttg ttg agt aaa ccg ggc att gcc 912 Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser Lys Pro Gly Ile Ala 290 295 300 gca ccg att atc gga act tcg cgc gaa gaa cag ctt gat gag cta ttg 960 Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln Leu Asp Glu Leu Leu 305 310 315 320 aac gcg gtg gat atc act ttg aag ccg gaa cag att gcc gaa ctg gaa 1008 Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln Ile Ala Glu Leu Glu 325 330 335 acg ccg tat aaa ccg cat cct gtc gta gga ttt aaa 1044 Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe Lys 340 345 <210> 10 <211> 1194 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1194) <400> 10 atg aag caa ctc acc att ctg ggc tcg acc ggc tcg att ggt tgc agc 48 Met Lys Gln Leu Thr Ile Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Gly Cys Ser 1 5 10 15 acg ctg gac gtg gtg cgc cat aat ccc gaa cac ttc cgc gta gtt gcg 96 Thr Leu Asp Val Val Arg His Asn Pro Glu His Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 ctg gtg gca ggc aaa aat gtc act cgc atg gta gaa cag tgc ctg gaa 144 Leu Val Ala Gly Lys Asn Val Thr Arg Met Val Glu Gln Cys Leu Glu 35 40 45 ttc tct ccc cgc tat gcc gta atg gac gat gaa gcg agt gcg aaa ctt 192 Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Val Met Asp Asp Glu Ala Ser Ala Lys Leu 50 55 60 ctt aaa acg atg cta cag caa cag ggt agc cgc acc gaa gtc tta agt 240 Leu Lys Thr Met Leu Gln Gln Gln Gly Ser Arg Thr Glu Val Leu Ser 65 70 75 80 ggg caa caa gcc gct tgc gat atg gca gcg ctt gag gat gtt gat cag 288 Gly Gln Gln Ala Ala Cys Asp Met Ala Ala Leu Glu Asp Val Asp Gln 85 90 95 gtg atg gca gcc att gtt ggc gct gct ggg ctg tta cct acg ctt gct 336 Val Met Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Pro Thr Leu Ala 100 105 110 gcg atc cgc gcg ggt aaa acc att ttg ctg gcc aat aaa gaa tca ctg 384 Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu 115 120 125 gtt acc tgc gga cgt ctg ttt atg gac gcc gta aag cag agc aaa gcg 432 Val Thr Cys Gly Arg Leu Phe Met Asp Ala Val Lys Gln Ser Lys Ala 130 135 140 caa ttg tta ccg gtc gat agc gaa cat aac gcc att ttt cag agt tta 480 Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu 145 150 155 160 ccg caa cct atc cag cat aat ctg gga tac gct gac ctt gag caa aat 528 Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn 165 170 175 ggc gtg gtg tcc att tta ctt acc ggg tct ggt ggc cct ttc cgt gag 576 Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu 180 185 190 acg cca ttg cgc gat ttg gca aca atg acg ccg gat caa gcc tgc cgt 624 Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg 195 200 205 cat ccg aac tgg tcg atg ggg cgt aaa att tct gtc gat tcg gct acc 672 His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr 210 215 220 atg atg aac aaa ggt ctg gaa tac att gaa gcg cgt tgg ctg ttt aac 720 Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn 225 230 235 240 gcc agc gcc agc cag atg gaa gtg ctg att cac ccg cag tca gtg att 768 Ala Ser Ala Ser Gln Met Glu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val Ile 245 250 255 cac tca atg gtg cgc tat cag gac ggc agt gtt ctg gcg cag ctg ggg 816 His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly 260 265 270 gaa ccg gat atg gta cgc caa ttg ccc aca cca tgg gca tgg ccg aat 864 Glu Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Pro Thr Pro Trp Ala Trp Pro Asn 275 280 285 cgc gtg aac tct ggc gtg aag ccg ctc gat ttt tgc aaa cta agt gcg 912 Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala 290 295 300 ttg aca ttt gcc gca ccg gat tat gat cgt tat cca tgc ctg aaa ctg 960 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu 305 310 315 320 gcg atg gag gcg ttc gaa caa ggc cag gca gcg acg aca gca ttg aat 1008 Ala Met Glu Ala Phe Glu Gln Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn 325 330 335 gcc gca aac gaa atc acc gtt gct gct ttt ctt gcg caa caa atc cgc 1056 Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg 340 345 350 ttt acg gat atc gct gcg ttg aat tta tcc gta ctg gaa aaa atg gat 1104 Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp 355 360 365 atg cgc gaa cca caa tgt gtg gac gat gtg tta tct gtt gat gcg aac 1152 Met Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn 370 375 380 gcg cgt gaa gtc gcc aga aaa gag gtg atg cgt ctc gca agc 1194 Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser 385 390 395 <210> 11 <211> 4390 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (208)..(447) <220> <221> CDS <222> (450)..(1346) <220> <221> CDS <222> (1374)..(3233) <220> <221> CDS <222> (3344)..(4390) <400> 11 atggcggcaa tggttcgttg gcaagcctta agcgacttgt atagggaaaa atacagcagc 60 ccacacctgc ggctgcatcc aggcgcggaa gtataccact aacatcgctt tgctgtgcac 120 atcaccttac cattgcgcgt tatttgctat ttgccctgag tccgttacca tgacggggcg 180 aaaaatattg agagtcagac attcatt atg ccg aag aaa aat gag gcg ccc gcc 234 Met Pro Lys Lys Asn Glu Ala Pro Ala 1 5 agc ttt gaa aag gcg ctg agc gag ctg gaa cag att gta acc cgt ctg 282 Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu 10 15 20 25 gaa agt ggc gac ctg ccg ctg gaa gag gcg ctg aac gag ttc gaa cgc 330 Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg 30 35 40 ggc gtg cag ctg gca cgt cag ggg cag gcc aaa tta caa caa gcc gaa 378 Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu 45 50 55 cag cgc gta caa att ctg ctg tct gac aat gaa gac gcc tct cta acc 426 Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr 60 65 70 cct ttt aca ccg gac aat gag ta atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa 473 Pro Phe Thr Pro Asp Asn Glu Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu 75 80 1 5 gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca 521 Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro 10 15 20 ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg gtc gaa acc atg cag tat ggc gca 569 Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala 25 30 35 40 tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt 617 Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly 45 50 55 cat atg ttc ggc gtt agc aca aac acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc 665 His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala 60 65 70 gtt gag tgt atc cac gct tac tca tta att cat gat gat tta ccg gca 713 Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala 75 80 85 atg gat gat gac gat ctg cgt cgc ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag 761 Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys 90 95 100 ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc gct ggc gac gct tta caa acg ctg 809 Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu 105 110 115 120 gcg ttc tcg att tta agc gat gcc gat atg ccg gaa gtg tcg gac cgc 857 Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg 125 130 135 gac aga att tcg atg att tct gaa ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc 905 Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala 140 145 150 gga atg tgc ggt ggt cag gca tta gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac 953 Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His 155 160 165 gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt att cat cgt cat aaa acc ggc gca 1001 Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala 170 175 180 ttg att cgc gcc gcc gtt cgc ctt ggt gca tta agc gcc gga gat aaa 1049 Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys 185 190 195 200 gga cgt cgt gct ctg ccg gta ctc gac aag tat gca gag agc atc ggc 1097 Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly 205 210 215 ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac atc ctg gat gtg gtg gga gat act 1145 Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr 220 225 230 gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt 1193 Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser 235 240 245 acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt gag caa gcc cgg aag aaa gcc cgg 1241 Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg 250 255 260 gat ctg atc gac gat gcc cgt cag tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag 1289 Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln 265 270 275 280 tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa gcg cta gcg gac tac atc atc cag 1337 Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln 285 290 295 cgt aat aaa taaacaataa gtattaatag gcccctg atg agt ttt gat att gcc 1391 Arg Asn Lys Met Ser Phe Asp Ile Ala 1 5 aaa tac ccg acc ctg gca ctg gtc gac tcc acc cag gag tta cga ctg 1439 Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser Thr Gln Glu Leu Arg Leu 10 15 20 ttg ccg aaa gag agt tta ccg aaa ctc tgc gac gaa ctg cgc cgc tat 1487 Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys Asp Glu Leu Arg Arg Tyr 25 30 35 tta ctc gac agc gtg agc cgt tcc agc ggg cac ttc gcc tcc ggg ctg 1535 Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly His Phe Ala Ser Gly Leu 40 45 50 ggc acg gtc gaa ctg acc gtg gcg ctg cac tat gtc tac aac acc ccg 1583 Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Tyr Asn Thr Pro 55 60 65 70 ttt gac caa ttg att tgg gat gtg ggg cat cag gct tat ccg cat aaa 1631 Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Pro His Lys 75 80 85 att ttg acc gga cgc cgc gac aaa atc ggc acc atc cgt cag aaa ggc 1679 Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly Thr Ile Arg Gln Lys Gly 90 95 100 ggt ctg cac ccg ttc ccg tgg cgc ggc gaa agc gaa tat gac gta tta 1727 Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu Ser Glu Tyr Asp Val Leu 105 110 115 agc gtc ggg cat tca tca acc tcc atc agt gcc gga att ggt att gcg 1775 Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala Gly Ile Gly Ile Ala 120 125 130 gtt gct gcc gaa aaa gaa ggc aaa aat cgc cgc acc gtc tgt gtc att 1823 Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg Arg Thr Val Cys Val Ile 135 140 145 150 ggc gat ggc gcg att acc gca ggc atg gcg ttt gaa gcg atg aat cac 1871 Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala Phe Glu Ala Met Asn His 155 160 165 gcg ggc gat atc cgt cct gat atg ctg gtg att ctc aac gac aat gaa 1919 Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val Ile Leu Asn Asp Asn Glu 170 175 180 atg tcg att tcc gaa aat gtc ggc gcg ctc aac aac cat ctg gca cag 1967 Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu Asn Asn His Leu Ala Gln 185 190 195 ctg ctt tcc ggt aag ctt tac tct tca ctg cgc gaa ggc ggg aaa aaa 2015 Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu Arg Glu Gly Gly Lys Lys 200 205 210 gtt ttc tct ggc gtg ccg cca att aaa gag ctg ctc aaa cgc acc gaa 2063 Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu Leu Leu Lys Arg Thr Glu 215 220 225 230 gaa cat att aaa ggc atg gta gtg cct ggc acg ttg ttt gaa gag ctg 2111 Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu 235 240 245 ggc ttt aac tac atc ggc ccg gtg gac ggt cac gat gtg ctg ggg ctt 2159 Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly His Asp Val Leu Gly Leu 250 255 260 atc acc acg cta aag aac atg cgc gac ctg aaa ggc ccg cag ttc ctg 2207 Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu Lys Gly Pro Gln Phe Leu 265 270 275 cat atc atg acc aaa aaa ggt cgt ggt tat gaa ccg gca gaa aaa gac 2255 His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr Glu Pro Ala Glu Lys Asp 280 285 290 ccg atc act ttc cac gcc gtg cct aaa ttt gat ccc tcc agc ggt tgt 2303 Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe Asp Pro Ser Ser Gly Cys 295 300 305 310 ttg ccg aaa agt agc ggc ggt ttg ccg agc tat tca aaa atc ttt ggc 2351 Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser Tyr Ser Lys Ile Phe Gly 315 320 325 gac tgg ttg tgc gaa acg gca gcg aaa gac aac aag ctg atg gcg att 2399 Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp Asn Lys Leu Met Ala Ile 330 335 340 act ccg gcg atg cgt gaa ggt tcc ggc atg gtc gag ttt tca cgt aaa 2447 Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met Val Glu Phe Ser Arg Lys 345 350 355 ttc ccg gat cgc tac ttc gac gtg gca att gcc gag caa cac gcg gtg 2495 Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile Ala Glu Gln His Ala Val 360 365 370 acc ttt gct gcg ggt ctg gcg att ggt ggg tac aaa ccc att gtc gcg 2543 Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly Tyr Lys Pro Ile Val Ala 375 380 385 390 att tac tcc act ttc ctg caa cgc gcc tat gat cag gtg ctg cat gac 2591 Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Val Leu His Asp 395 400 405 gtg gcg att caa aag ctt ccg gtc ctg ttc gcc atc gac cgc gcg ggc 2639 Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly 410 415 420 att gtt ggt gct gac ggt caa acc cat cag ggt gct ttt gat ctc tct 2687 Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln Gly Ala Phe Asp Leu Ser 425 430 435 tac ctg cgc tgc ata ccg gaa atg gtc att atg acc ccg agc gat gaa 2735 Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile Met Thr Pro Ser Asp Glu 440 445 450 aac gaa tgt cgc cag atg ctc tat acc ggc tat cac tat aac gat ggc 2783 Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly Tyr His Tyr Asn Asp Gly 455 460 465 470 ccg tca gcg gtg cgc tac ccg cgt ggc aac gcg gtc ggc gtg gaa ctg 2831 Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Ala Val Gly Val Glu Leu 475 480 485 acg ccg ctg gaa aaa cta cca att ggc aaa ggc att gtg aag cgt cgt 2879 Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys Gly Ile Val Lys Arg Arg 490 495 500 ggc gag aaa ctg gcg atc ctt aac ttt ggt acg ctg atg cca gaa gcg 2927 Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly Thr Leu Met Pro Glu Ala 505 510 515 gcg aaa gtc gcc gaa tcg ctg aac gcc acg ctg gtc gat atg cgt ttt 2975 Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr Leu Val Asp Met Arg Phe 520 525 530 gtg aaa ccg ctt gat gaa gcg tta att ctg gaa atg gcc gcc agc cat 3023 Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu Glu Met Ala Ala Ser His 535 540 545 550 gaa gcg ctg gtc acc gta gaa gaa aac gcc att atg ggc ggc gca ggc 3071 Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala Ile Met Gly Gly Ala Gly 555 560 565 agc ggc gtg aac gaa gtg ctg atg gcc cat cgt aaa cca gta ccc gtg 3119 Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His Arg Lys Pro Val Pro Val 570 575 580 ctg aac att ggc ctg ccg gac ttc ttt att ccg caa gga act cag gaa 3167 Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile Pro Gln Gly Thr Gln Glu 585 590 595 gaa atg cgc gcc gaa ctc ggc ctc gat gcc gct ggt atg gaa gcc aaa 3215 Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala Ala Gly Met Glu Ala Lys 600 605 610 atc aag gcc tgg ctg gca taatccctac tccactcctg ctatgcttaa 3263 Ile Lys Ala Trp Leu Ala 615 620 gaaattattc atagactcta aataattcga gttgcaggaa ggcggcaaac gagtgaagcc 3323 ccaggagctt acataagtaa gtg act ggg gtg aac gaa tgc agc cgc agc aca 3376 Val Thr Gly Val Asn Glu Cys Ser Arg Ser Thr 1 5 10 tgc aac ttg aag tat gac gag tat agc agg agt ggc agc atg caa tac 3424 Cys Asn Leu Lys Tyr Asp Glu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser Met Gln Tyr 15 20 25 aac ccc tta gga aaa acc gac ctt cgc gtt tcc cga ctt tgc ctc ggc 3472 Asn Pro Leu Gly Lys Thr Asp Leu Arg Val Ser Arg Leu Cys Leu Gly 30 35 40 tgt atg acc ttt ggc gag cca gat cgc ggt aat cac gca tgg aca ctg 3520 Cys Met Thr Phe Gly Glu Pro Asp Arg Gly Asn His Ala Trp Thr Leu 45 50 55 ccg gaa gaa agc agc cgt ccc ata att aaa cgt gca ctg gaa ggc ggc 3568 Pro Glu Glu Ser Ser Arg Pro Ile Ile Lys Arg Ala Leu Glu Gly Gly 60 65 70 75 ata aat ttc ttt gat acc gcc aac agt tat tct gac ggc agc agc gaa 3616 Ile Asn Phe Phe Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu 80 85 90 gag atc gtc ggt cgc gca ctg cgg gat ttc gcc cgt cgt gaa gac gtg 3664 Glu Ile Val Gly Arg Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val 95 100 105 gtc gtt gcg acc aaa gtg ttc cat cgc gtt ggt gat tta ccg gaa gga 3712 Val Val Ala Thr Lys Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly 110 115 120 tta tcc cgt gcg caa att ttg cgc tct atc gac gac agc ctg cga cgt 3760 Leu Ser Arg Ala Gln Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg 125 130 135 ctc ggc atg gat tat gtc gat atc ctg caa att cat cgc tgg gat tac 3808 Leu Gly Met Asp Tyr Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr 140 145 150 155 aac acg ccg atc gaa gag acg ctg gaa gcc ctc aac gac gtg gta aaa 3856 Asn Thr Pro Ile Glu Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys 160 165 170 gcc ggg aaa gcg cgt tat atc ggc gcg tca tca atg cac gct tcg cag 3904 Ala Gly Lys Ala Arg Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln 175 180 185 ttt gct cag gca ctg gaa ctc caa aaa cag cac ggc tgg gcg cag ttt 3952 Phe Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe 190 195 200 gtc agt atg cag gat cac tac aat ctg att tat cgt gaa gaa gag cgc 4000 Val Ser Met Gln Asp His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg 205 210 215 gag atg cta cca ctg tgt tat cag gag ggc gtg gcg gta att cca tgg 4048 Glu Met Leu Pro Leu Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp 220 225 230 235 agc ccg ctg gca agg ggc cgt ctg acg cgt ccg tgg gga gaa act acc 4096 Ser Pro Leu Ala Arg Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr 240 245 250 gca cga ctg gtg tct gat gag gtg ggg aaa aat ctc tat aaa gaa agc 4144 Ala Arg Leu Val Ser Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser 255 260 265 gat gaa aat gac gcg cag atc gca gag cgg tta aca ggc gtc agt gaa 4192 Asp Glu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu 270 275 280 gaa ctg ggg gcg aca cga gca caa gtt gcg ctg gcc tgg ttg ttg agt 4240 Glu Leu Gly Ala Thr Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser 285 290 295 aaa ccg ggc att gcc gca ccg att atc gga act tcg cgc gaa gaa cag 4288 Lys Pro Gly Ile Ala Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln 300 305 310 315 ctt gat gag cta ttg aac gcg gtg gat atc act ttg aag ccg gaa cag 4336 Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln 320 325 330 att gcc gaa ctg gaa acg ccg tat aaa ccg cat cct gtc gta gga ttt 4384 Ile Ala Glu Leu Glu Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe 335 340 345 aaa taa 4390 Lys <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 12 ccggatccat ggcggcaatg gttcgttggc aag 33 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 13 ccgaattctt atttaaatcc tacgacagga tgcg 34 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 14 ccggatccat gagttttgat attgccaaat acc 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 15 ccgaattctt atgccagcca ggccttgatt ttg 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 16 ccgaattctt actcattgtc cggtgtaaaa ggg 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 17 ccggatccat ggactttccg cagcaactcg aag 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 18 ccgaattctt atttattacg ctggatgatg tag 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 19 ccggatccta atccctactc cactcctgct atg 33 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 20 gggggatcca agcaactcac cattctgggc 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 21 gggggatccg cttgcgagac gcatcacctc 30 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 22 gggggatcca gttttgatat tgccaaatac cc 32 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 23 gggggatcct gccagccagg ccttgatttt gg 32

【０２２３】 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 24 gggggatccg agcaactcac cattctgggc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic DNA <400> 25 gggggatccg cttgcgagac gcatcacctc 30 <210> 26 <211> 637 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 26 Met Thr Asp Arg Pro Cys Thr Pro Thr Leu Asp Arg Val Thr Leu Pro 1 5 10 15 Val Asp Met Lys Gly Leu Thr Asp Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala Asp 20 25 30 Glu Leu Arg Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Ser Val Thr Gly Gly His 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Ala 50 55 60 Val Phe Asp Ala Pro Arg Asp Lys Ile Ile Trp Asp Val Gly His Gln 65 70 75 80 Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ile Arg Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Gly Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser 100 105 110 Pro Tyr Asp Cys Phe Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala 115 120 125 Ala Val Gly Phe Ala Ala Ala Arg Glu Met Gly Gly Asp Thr Gly Asp 130 135 140 Ala Val Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Met Ser Ala Gly Met Ala Phe 145 150 155 160 Glu Ala Leu Asn His Gly Gly His Leu Lys Asn Arg Val Ile Val Ile 165 170 175 Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser 180 185 190 Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Gln Asp Phe Lys 195 200 205 Ala Ala Ala Lys Gly Ala Leu Gly Leu Leu Pro Glu Pro Phe Gln Glu 210 215 220 Gly Ala Arg Arg Ala Lys Glu Met Leu Lys Ser Val Thr Val Gly Gly 225 230 235 240 Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro Ile Asp Gly 245 250 255 His Asp Leu Asp Gln Leu Leu Pro Val Leu Arg Thr Val Lys Gln Arg 260 265 270 Ala His Ala Pro Val Leu Ile His Val Ile Thr Lys Lys Gly Arg Gly 275 280 285 Tyr Ala Pro Ala Glu Ala Ala Arg Asp Arg Gly His Ala Thr Asn Lys 290 295 300 Phe Asn Val Leu Thr Gly Ala Gln Val Lys Pro Val Ser Asn Ala Pro 305 310 315 320 Ser Tyr Thr Lys Val Phe Ala Gln Ser Leu Ile Lys Glu Ala Glu Val 325 330 335 Asp Glu Arg Ile Cys Ala Val Thr Ala Ala Met Pro Asp Gly Thr Gly 340 345 350 Leu Asn Leu Phe Gly Glu Arg Phe Pro Lys Arg Thr Phe Asp Val Gly 355 360 365 Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly 370 375 380 Gly Met Arg Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Gly 385 390 395 400 Tyr Asp Gln Ile Val His Asp Val Ala Ile Gln Arg Leu Pro Val Arg 405 410 415 Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Ala Thr His 420 425 430 Ala Gly Ser Phe Asp Val Ala Phe Leu Ser Asn Leu Pro Gly Ile Val 435 440 445 Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Val His Met Val Ala Thr 450 455 460 Ala Ala Ala His Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Tyr Pro Arg Gly 465 470 475 480 Asp Gly Val Gly Val Glu Met Pro Val Lys Gly Val Pro Leu Gln Ile 485 490 495 Gly Arg Gly Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Arg Ile Ala Leu Leu Ser 500 505 510 Phe Gly Thr Arg Leu Ala Glu Val Gln Val Ala Ala Glu Ala Leu Arg 515 520 525 Ala Arg Gly Ile Ser Pro Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Lys Pro 530 535 540 Leu Asp Arg Asp Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ala His His Glu Ala Leu 545 550 555 560 Ile Thr Ile Glu Glu Gly Ala Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala 565 570 575 Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gly Val Phe Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Arg 580 585 590 Ser Met Val Leu Pro Asp Thr Phe Ile Asp His Asn Ser Ala Glu Val 595 600 605 Met Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp Ile Glu Arg Lys Ala 610 615 620 Leu Glu Thr Leu Gly Val Glu Val Leu Ala Arg Arg Ala 625 630 635 <210> 27 <211> 1911 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <220> <221> CDS <222> (1)..(1911) <400> 27 atg acc gac aga ccc tgc acg ccg acg ctc gac cgg gtg acg ctc ccg 48 Met Thr Asp Arg Pro Cys Thr Pro Thr Leu Asp Arg Val Thr Leu Pro 1 5 10 15 gtg gac atg aag ggc ctc acg gac cgt gag ctg cgc tcg ctg gcc gac 96 Val Asp Met Lys Gly Leu Thr Asp Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala Asp 20 25 30 gag ctg cgg gcc gaa acg atc tcg gcc gtg tcg gtg acg ggc ggg cat 144 Glu Leu Arg Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Ser Val Thr Gly Gly His 35 40 45 ctg ggc gca ggc ctc ggc gtg gtg gag ttg acg gtt gcg ctg cat gcg 192 Leu Gly Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Ala 50 55 60 gtc ttc gat gcg ccg cgc gac aag atc atc tgg gac gtg ggc cac cag 240 Val Phe Asp Ala Pro Arg Asp Lys Ile Ile Trp Asp Val Gly His Gln 65 70 75 80 tgc tac ccc cac aag atc ctg acc ggg cgg cgc gac cgc atc cgc aca 288 Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ile Arg Thr 85 90 95 ctg cgg cag ggc ggg ggt ctc tcg ggc ttc acc aag cgc tcc gag agc 336 Leu Arg Gln Gly Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser 100 105 110 ccc tac gac tgt ttc ggc gcg ggc cat tcc tcg acc tcg atc tcg gcc 384 Pro Tyr Asp Cys Phe Gly Ala Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala 115 120 125 gcg gtg ggc ttt gcc gcg gcg cgc gag atg ggc ggc gac acg ggc gac 432 Ala Val Gly Phe Ala Ala Ala Arg Glu Met Gly Gly Asp Thr Gly Asp 130 135 140 gcg gtg gcg gtg atc ggc gat ggc tcg atg tcg gcc ggc atg gcc ttc 480 Ala Val Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Met Ser Ala Gly Met Ala Phe 145 150 155 160 gag gcg ctg aac cac ggc ggg cac ctg aag aac cgg gtg atc gtg atc 528 Glu Ala Leu Asn His Gly Gly His Leu Lys Asn Arg Val Ile Val Ile 165 170 175 ctg aac gac aat gag atg agc atc gcg ccg ccg gtg ggg gcg ctg tcg 576 Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser 180 185 190 tcc tat ctc tcg cgg ctc tat gcg ggc gcg ccg ttc cag gac ttc aag 624 Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gly Ala Pro Phe Gln Asp Phe Lys 195 200 205 gcg gcc gcc aag gga gcg ctc ggg ctt ctg ccc gaa ccg ttc cag gag 672 Ala Ala Ala Lys Gly Ala Leu Gly Leu Leu Pro Glu Pro Phe Gln Glu 210 215 220 ggc gcg cgc cgc gcc aag gag atg ctg aag agc gtc acc gtc ggc ggc 720 Gly Ala Arg Arg Ala Lys Glu Met Leu Lys Ser Val Thr Val Gly Gly 225 230 235 240 acg ctc ttc gag gag ctg ggt ttc tcc tat gtc ggc ccg atc gac ggg 768 Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Ser Tyr Val Gly Pro Ile Asp Gly 245 250 255 cac gat ctc gac cag ctt ctg ccg gtg ctg cgg acc gtc aag cag cgg 816 His Asp Leu Asp Gln Leu Leu Pro Val Leu Arg Thr Val Lys Gln Arg 260 265 270 gcg cat gcg ccg gtg ctg atc cat gtc atc acc aag aag ggc agg ggc 864 Ala His Ala Pro Val Leu Ile His Val Ile Thr Lys Lys Gly Arg Gly 275 280 285 tat gct ccg gcc gag gcc gcg cgc gac cgc ggc cat gcc acg aac aag 912 Tyr Ala Pro Ala Glu Ala Ala Arg Asp Arg Gly His Ala Thr Asn Lys 290 295 300 ttc aac gtc ctg acc ggc gcg cag gtg aag ccg gtc tcg aac gcc ccc 960 Phe Asn Val Leu Thr Gly Ala Gln Val Lys Pro Val Ser Asn Ala Pro 305 310 315 320 tcc tac acc aag gtc ttc gcc cag agc ctc atc aag gag gcc gag gtc 1008 Ser Tyr Thr Lys Val Phe Ala Gln Ser Leu Ile Lys Glu Ala Glu Val 325 330 335 gac gag cgg atc tgc gcg gtg acg gcc gcc atg ccg gac ggg acg ggg 1056 Asp Glu Arg Ile Cys Ala Val Thr Ala Ala Met Pro Asp Gly Thr Gly 340 345 350 ctc aac ctc ttc ggc gag cgg ttt ccg aag cgc acc ttc gac gtg ggc 1104 Leu Asn Leu Phe Gly Glu Arg Phe Pro Lys Arg Thr Phe Asp Val Gly 355 360 365 atc gcg gaa cag cat gcg gtg acc ttc tcg gcg gcg ctt gcg gca ggc 1152 Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly 370 375 380 ggc atg cgg ccc ttc tgc gcg atc tat tcc acc ttc ctc cag cgc ggc 1200 Gly Met Arg Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Gly 385 390 395 400 tac gac cag atc gtg cat gac gtg gcg atc cag cgc ctg ccg gtg cgc 1248 Tyr Asp Gln Ile Val His Asp Val Ala Ile Gln Arg Leu Pro Val Arg 405 410 415 ttc gcc atc gat cgc gcg ggc ctc gtg ggg gcg gac ggc gcc acc cat 1296 Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Ala Thr His 420 425 430 gcg ggc tcg ttc gac gtg gcc ttc ctg tcg aac ctg ccc ggc atc gtg 1344 Ala Gly Ser Phe Asp Val Ala Phe Leu Ser Asn Leu Pro Gly Ile Val 435 440 445 gtg atg gcc gcc gcc gac gag gcc gag ctc gtc cat atg gtg gcc acc 1392 Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Val His Met Val Ala Thr 450 455 460 gcc gcc gcc cat gac gaa ggg ccc atc gcc ttc cgc tac ccg cgc ggc 1440 Ala Ala Ala His Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Tyr Pro Arg Gly 465 470 475 480 gac ggc gtg ggg gtc gag atg ccg gtg aag ggc gtg ccg ctc cag atc 1488 Asp Gly Val Gly Val Glu Met Pro Val Lys Gly Val Pro Leu Gln Ile 485 490 495 ggc cgc ggc cgt gtg gtg cgc gag ggc acg cga atc gcg ctt ttg tcc 1536 Gly Arg Gly Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Arg Ile Ala Leu Leu Ser 500 505 510 ttc ggc acc cgt ctg gcc gag gtg cag gtg gcc gcc gag gcg ctg cgt 1584 Phe Gly Thr Arg Leu Ala Glu Val Gln Val Ala Ala Glu Ala Leu Arg 515 520 525 gcg cgc ggg atc tct ccc acg gtt gcg gat gcg cgc ttt gca aag ccg 1632 Ala Arg Gly Ile Ser Pro Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Lys Pro 530 535 540 ctc gac cgg gat ctg atc ctg cag ctc gcg gcc cat cac gag gcg ctt 1680 Leu Asp Arg Asp Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ala His His Glu Ala Leu 545 550 555 560 atc acc atc gag gag ggc gcc atc ggc ggt ttc ggc agc cat gtg gcg 1728 Ile Thr Ile Glu Glu Gly Ala Ile Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala 565 570 575 cag ctt ctg gcc gag gcc ggg gtc ttc gac cgc ggc ttc cgg tat cgc 1776 Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gly Val Phe Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Arg 580 585 590 tcg atg gtg ctg ccc gac acg ttc atc gac cac aac agc gcg gag gtg 1824 Ser Met Val Leu Pro Asp Thr Phe Ile Asp His Asn Ser Ala Glu Val 595 600 605 atg tat gcc acc gcc ggg ctg aat gcg gcc gac ata gag cgg aag gcg 1872 Met Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Asn Ala Ala Asp Ile Glu Arg Lys Ala 610 615 620 ctg gag acg ctg ggg gtg gag gtc ctc gcc cgc cgc gcc 1911 Leu Glu Thr Leu Gly Val Glu Val Leu Ala Arg Arg Ala 625 630 635 <210> 28 <211> 648 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 28 Met Thr Asn Pro Thr Pro Arg Pro Glu Thr Pro Leu Leu Asp Arg Val 1 5 10 15 Cys Cys Pro Ala Asp Met Lys Ala Leu Ser Asp Ala Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Leu Ala Asp Glu Val Arg Ser Glu Val Ile Ser Val Val Ala Glu Thr 35 40 45 Gly Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala 50 55 60 Leu His Ala Val Phe Asn Thr Pro Thr Asp Lys Leu Val Trp Asp Val 65 70 75 80 Gly His Gln Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Glu Gln 85 90 95 Met Arg Thr Leu Arg Gln Lys Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg 100 105 110 Ser Glu Ser Ala Tyr Asp Pro Phe Gly Ala Ala His Ser Ser Thr Ser 115 120 125 Ile Ser Ala Ala Leu Gly Phe Ala Met Gly Arg Glu Leu Gly Gln Pro 130 135 140 Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ile Thr Ala Gly 145 150 155 160 Met Ala Tyr Glu Ala Leu Asn His Ala Gly His Leu Asn Lys Arg Leu 165 170 175 Phe Val Ile Leu Asn Asp Asn Asp Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly 180 185 190 Ala Leu Ala Arg Tyr Leu Val Asn Leu Ser Ser Lys Ala Pro Phe Ala 195 200 205 Thr Leu Arg Ala Ala Ala Asp Gly Leu Glu Ala Ser Leu Pro Gly Pro 210 215 220 Leu Arg Asp Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gln Leu Val Thr Gly Met Pro 225 230 235 240 Gly Gly Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Thr Tyr Val Gly Pro 245 250 255 Ile Asp Gly His Asp Met Glu Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Ala Ala 260 265 270 Arg Ala Arg Thr Thr Gly Pro Val Leu Ile His Val Val Thr Lys Lys 275 280 285 Gly Lys Gly Tyr Ala Pro Ala Glu Asn Ala Pro Asp Lys Tyr His Gly 290 295 300 Val Asn Lys Phe Asp Pro Val Thr Gly Glu Gln Lys Lys Ser Val Ala 305 310 315 320 Asn Ala Pro Asn Tyr Thr Lys Val Phe Gly Ser Thr Leu Thr Glu Glu 325 330 335 Ala Ala Arg Asp Pro Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Ala Met Pro Ser 340 345 350 Gly Thr Gly Val Asp Ile Met Gln Lys Arg Phe Pro Asn Arg Val Phe 355 360 365 Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu 370 375 380 Ala Gly Ala Gly Met Lys Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Ser Phe Leu 385 390 395 400 Gln Arg Gly Tyr Asp Gln Ile Ala His Asp Val Ala Leu Gln Asn Leu 405 410 415 Pro Val Arg Phe Val Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly 420 425 430 Ala Thr His Ala Gly Ala Phe Asp Val Gly Phe Leu Thr Ser Leu Pro 435 440 445 Asn Met Thr Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Ile His Met 450 455 460 Ile Ala Thr Ala Val Ala Phe Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Phe 465 470 475 480 Pro Arg Gly Glu Gly Val Gly Val Glu Met Pro Glu Arg Gly Thr Val 485 490 495 Leu Glu Pro Gly Arg Gly Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Asp Val Ala 500 505 510 Ile Leu Ser Phe Gly Ala His Leu His Glu Ala Leu Gln Ala Ala Lys 515 520 525 Leu Leu Glu Ala Glu Gly Val Ser Val Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe 530 535 540 Ser Arg Pro Leu Asp Thr Gly Leu Ile Asp Gln Leu Val Arg His His 545 550 555 560 Ala Ala Leu Val Thr Val Glu Gln Gly Ala Met Gly Gly Phe Gly Ala 565 570 575 His Val Met His Tyr Leu Ala Asn Ser Gly Gly Phe Asp Gly Gly Leu 580 585 590 Ala Leu Arg Val Met Thr Leu Pro Asp Arg Phe Ile Glu Gln Ala Ser 595 600 605 Pro Glu Asp Met Tyr Ala Asp Ala Gly Leu Arg Ala Glu Asp Ile Ala 610 615 620 Ala Thr Ala Arg Gly Ala Leu Ala Arg Gly Arg Val Met Pro Leu Arg 625 630 635 640 Gln Thr Ala Lys Pro Arg Ala Val 645

【０２２４】 <210> 29 <211> 1944 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <220> <221> CDS <222> (1)..(1944) <400> 29 atg acc aat ccc acc ccg cga ccc gaa acc ccg ctt ttg gat cgc gtc 48 Met Thr Asn Pro Thr Pro Arg Pro Glu Thr Pro Leu Leu Asp Arg Val 1 5 10 15 tgc tgc ccg gcc gac atg aag gcg ctg agt gac gcc gaa ctg gag cgg 96 Cys Cys Pro Ala Asp Met Lys Ala Leu Ser Asp Ala Glu Leu Glu Arg 20 25 30 ctg gcc gac gaa gtg cgt tcc gag gtg att tcg gtc gtt gcc gag acg 144 Leu Ala Asp Glu Val Arg Ser Glu Val Ile Ser Val Val Ala Glu Thr 35 40 45 gga gga cat ctg ggg tcc tcg ctg ggg gtg gtc gag ctg acc gtc gcg 192 Gly Gly His Leu Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala 50 55 60 ctg cat gca gtc ttc aac acg ccc acc gac aag ctc gtc tgg gac gtg 240 Leu His Ala Val Phe Asn Thr Pro Thr Asp Lys Leu Val Trp Asp Val 65 70 75 80 ggc cac cag tgc tac ccc cac aag atc ctc acc ggc cgg cgc gag cag 288 Gly His Gln Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Glu Gln 85 90 95 atg cgc acc ctg cgc cag aag ggc ggc ctc tcg ggc ttc acc aag cgc 336 Met Arg Thr Leu Arg Gln Lys Gly Gly Leu Ser Gly Phe Thr Lys Arg 100 105 110 tcg gaa tcc gcc tac gac ccg ttc ggc gcg gcc cat tcc tcg acc tcg 384 Ser Glu Ser Ala Tyr Asp Pro Phe Gly Ala Ala His Ser Ser Thr Ser 115 120 125 atc tcg gcc gcg ctc ggc ttt gcc atg ggc cgc gag ctg ggc caa ccc 432 Ile Ser Ala Ala Leu Gly Phe Ala Met Gly Arg Glu Leu Gly Gln Pro 130 135 140 gtg ggc gac acg atc gcc gtg atc ggc gac ggc tcg atc acc gcg ggc 480 Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ile Thr Ala Gly 145 150 155 160 atg gcc tac gag gcg ctg aac cac gcg ggc cat ctg aac aag cgc ctg 528 Met Ala Tyr Glu Ala Leu Asn His Ala Gly His Leu Asn Lys Arg Leu 165 170 175 ttc gtg atc ctg aac gac aat gac atg agc atc gcg ccg ccc gtg ggg 576 Phe Val Ile Leu Asn Asp Asn Asp Met Ser Ile Ala Pro Pro Val Gly 180 185 190 gct ctg gcg cgc tat ctc gtg aat ctc tcc tcg aag gcg ccc ttc gcc 624 Ala Leu Ala Arg Tyr Leu Val Asn Leu Ser Ser Lys Ala Pro Phe Ala 195 200 205 acg ctg cgc gcg gcc gcc gac ggg ctc gag gcc tcg ctg ccg ggg ccg 672 Thr Leu Arg Ala Ala Ala Asp Gly Leu Glu Ala Ser Leu Pro Gly Pro 210 215 220 ctc cgc gac ggg gcg cgc cgg gcg cgc cag ctc gtg acc ggg atg ccg 720 Leu Arg Asp Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gln Leu Val Thr Gly Met Pro 225 230 235 240 ggc ggg ggc acg ctc ttc gag gag ctg ggc ttc acc tat gtg ggt ccc 768 Gly Gly Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Thr Tyr Val Gly Pro 245 250 255 atc gac ggc cac gac atg gag gcg ctg ctc cag acg ctg cgc gcg gcg 816 Ile Asp Gly His Asp Met Glu Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Ala Ala 260 265 270 cgg gcc cgg acc acg ggg ccg gtg ctc atc cat gtg gtc acg aag aag 864 Arg Ala Arg Thr Thr Gly Pro Val Leu Ile His Val Val Thr Lys Lys 275 280 285 ggc aag ggc tac gcc cct gcc gag aat gcc ccc gac aag tat cac ggg 912 Gly Lys Gly Tyr Ala Pro Ala Glu Asn Ala Pro Asp Lys Tyr His Gly 290 295 300 gtg aac aag ttc gac ccc gtc acg ggc gag cag aag aag tcg gtc gcc 960 Val Asn Lys Phe Asp Pro Val Thr Gly Glu Gln Lys Lys Ser Val Ala 305 310 315 320 aac gcg ccg aac tac acc aag gtc ttc ggc tcc acc ctg acc gag gag 1008 Asn Ala Pro Asn Tyr Thr Lys Val Phe Gly Ser Thr Leu Thr Glu Glu 325 330 335 gcc gcg cgc gat ccg cgc atc gtg gcc atc acc gcg gcc atg ccc tcg 1056 Ala Ala Arg Asp Pro Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Ala Met Pro Ser 340 345 350 ggc acc ggc gtc gac atc atg cag aag cgt ttc ccg aac cgc gtc ttc 1104 Gly Thr Gly Val Asp Ile Met Gln Lys Arg Phe Pro Asn Arg Val Phe 355 360 365 gac gtg ggc atc gcc gag cag cat gcc gtg acc ttc gcg gcg ggc ctt 1152 Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu 370 375 380 gcc ggg gcc ggg atg aag ccc ttc tgc gcg atc tat tcc tcg ttc ctg 1200 Ala Gly Ala Gly Met Lys Pro Phe Cys Ala Ile Tyr Ser Ser Phe Leu 385 390 395 400 caa cgg ggc tac gac cag atc gcc cat gac gtg gcg ctg cag aac ctt 1248 Gln Arg Gly Tyr Asp Gln Ile Ala His Asp Val Ala Leu Gln Asn Leu 405 410 415 ccc gtc cgc ttc gtg atc gac cgg gcg ggg ctc gtg ggg gcc gac ggt 1296 Pro Val Arg Phe Val Ile Asp Arg Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly 420 425 430 gcg acc cat gcg ggg gcc ttc gat gtg ggc ttc ctc acg tcg ctg ccc 1344 Ala Thr His Ala Gly Ala Phe Asp Val Gly Phe Leu Thr Ser Leu Pro 435 440 445 aat atg acc gtg atg gcc gcg gcc gac gag gcc gag ctc atc cac atg 1392 Asn Met Thr Val Met Ala Ala Ala Asp Glu Ala Glu Leu Ile His Met 450 455 460 atc gcc acc gcc gtg gcc ttc gac gag ggc ccc att gcc ttc cgc ttc 1440 Ile Ala Thr Ala Val Ala Phe Asp Glu Gly Pro Ile Ala Phe Arg Phe 465 470 475 480 ccg cgg ggc gag ggg gtg ggc gtc gag atg ccc gag cgc ggg acc gtg 1488 Pro Arg Gly Glu Gly Val Gly Val Glu Met Pro Glu Arg Gly Thr Val 485 490 495 ctg gaa ccc ggc cgg ggc cgc gtg gtg cgc gag ggg acg gat gtg gcg 1536 Leu Glu Pro Gly Arg Gly Arg Val Val Arg Glu Gly Thr Asp Val Ala 500 505 510 atc ctt tcc ttc ggc gcg cat ctg cac gag gcc ttg cag gcg gcg aaa 1584 Ile Leu Ser Phe Gly Ala His Leu His Glu Ala Leu Gln Ala Ala Lys 515 520 525 ctc ctc gag gcc gag ggg gtg agc gtg acc gtg gcc gac gcc cgc ttc 1632 Leu Leu Glu Ala Glu Gly Val Ser Val Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe 530 535 540 tcg cgc ccg ctc gac acg ggg ctc att gac cag ctc gtg cgc cat cac 1680 Ser Arg Pro Leu Asp Thr Gly Leu Ile Asp Gln Leu Val Arg His His 545 550 555 560 gcc gcg ctg gtg acg gtg gag cag ggg gcc atg ggc ggc ttc ggc gct 1728 Ala Ala Leu Val Thr Val Glu Gln Gly Ala Met Gly Gly Phe Gly Ala 565 570 575 cat gtc atg cac tat ctc gcc aat tcc ggc ggc ttc gac ggg ggc ctc 1776 His Val Met His Tyr Leu Ala Asn Ser Gly Gly Phe Asp Gly Gly Leu 580 585 590 gcg ctc cgg gtc atg acg ctg ccc gac cgc ttc atc gag cag gcg agc 1824 Ala Leu Arg Val Met Thr Leu Pro Asp Arg Phe Ile Glu Gln Ala Ser 595 600 605 ccc gag gac atg tat gcc gat gcg ggg ctg cgg gcc gag gat atc gcg 1872 Pro Glu Asp Met Tyr Ala Asp Ala Gly Leu Arg Ala Glu Asp Ile Ala 610 615 620 gcc acc gcg cgg ggc gcg ctc gcc cgg ggg cgc gtg atg ccg ctc cgg 1920 Ala Thr Ala Arg Gly Ala Leu Ala Arg Gly Arg Val Met Pro Leu Arg 625 630 635 640 cag acg gca aag ccg cgg gcg gtc 1944 Gln Thr Ala Lys Pro Arg Ala Val 645 <210> 30 <211> 394 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 30 Met Arg Ser Leu Ser Ile Phe Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Glu Ser 1 5 10 15 Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr 20 25 30 Val Ala Leu Thr Gly Gly Arg Asn Ile Arg Arg Leu Ala Glu Met Ala 35 40 45 Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala Val Thr Ala His Glu Asp Cys Leu 50 55 60 Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr 85 90 95 Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala 100 105 110 Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val 115 120 125 Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thr 130 135 140 Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Ala 145 150 155 160 Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly 165 170 175 Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val 180 185 190 Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser 195 200 205 Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr 210 215 220 Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His 225 230 235 240 Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu 245 250 255 Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala 260 265 270 Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu 275 280 285 Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe 290 295 300 Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser 305 310 315 320 Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile 325 330 335 Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr 340 345 350 Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala 355 360 365 Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu 370 375 380 Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg 385 390 <210> 31 <211> 1182 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <220> <221> CDS <222> (1)..(1182) <400> 31 atg cgc agc ctg tcg atc ttt ggg gcc acc ggc tcc atc ggc gaa tcc 48 Met Arg Ser Leu Ser Ile Phe Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Glu Ser 1 5 10 15 acc ttc gac ctc gtc atg cgg aag ggc ggg ccc gag gcg ttc cgc acc 96 Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr 20 25 30 gtc gct ctg acc ggc ggg cgc aac atc cgg cga ctg gcc gaa atg gcg 144 Val Ala Leu Thr Gly Gly Arg Asn Ile Arg Arg Leu Ala Glu Met Ala 35 40 45 cgt gcg ctg aag gcg gag ctt gcc gtc acc gcg cat gag gac tgc ctg 192 Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala Val Thr Ala His Glu Asp Cys Leu 50 55 60 ccc gcg ctg cgc gag gcg ctg gcc ggg acg ggc acc gag gtc gcg ggc 240 Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly 65 70 75 80 ggg gcg cag gcc atc gcc gag gcc gcc gac cgg ccg gcc gac tgg acc 288 Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr 85 90 95 atg tcg gcc atc gtg ggc gcc gcg ggc ctc gtg ccc gga atg cgg gcg 336 Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala 100 105 110 ctg aag cac ggc cgc acg ctg gcg ctc gcc aac aag gaa agc ctc gtg 384 Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val 115 120 125 acg gca ggg caa ctc ctg atg cgg acg gcc cag gag aac ggc gcc acg 432 Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thr 130 135 140 atc ctg ccg gtg gac agc gag cac tcc gcg gtc ttt cag gcg ctg gcg 480 Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Ala 145 150 155 160 ggc gag gac acg gcc tgc gtc gag cgc gtc atc atc acg gcg tcc ggc 528 Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly 165 170 175 ggg ccg ttc cgc gac tgg agc ctc gag cgc atc cgc gcc tgc acc gtg 576 Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val 180 185 190 gcc gag gcg cag gcc cat ccc aac tgg tcc atg ggc cag cgg atc tcc 624 Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser 195 200 205 atc gac agc gcc tcg atg ttc aac aag gcg ctc gag ctg atc gag acg 672 Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr 210 215 220 cgc gaa ttc ttc ggc ttc gag ccg gac cgg atc gag gcg gtc gtc cat 720 Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His 225 230 235 240 ccg caa tcc atc gtc cat gcg atg gtg ggc ttc tgc gac ggg ggc ctg 768 Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu 245 250 255 atg gcc cat ctc ggc ccc gcc gac atg cgc cac gcc atc gga ttc gcg 816 Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala 260 265 270 ctg aac tgg ccg ggt cgc ggc gag gtg ccc gtc gcc cgg atc gac ctc 864 Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu 275 280 285 gca cag att gcg agc ctc acc ttc cag aag cct gac gag gaa cgc ttt 912 Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe 290 295 300 ccg gcc ctg agg ctt gcg cga gac gtc atg gcg gcg cgc ggc ctg tcg 960 Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser 305 310 315 320 ggc gcc gcc ttc aac gcg gcc aag gag atc gcg ctc gat cat ttc atc 1008 Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile 325 330 335 gcc gga cgc atc ggg ttt ctg gac atg gcg gcg gtg gtc gag gag acg 1056 Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr 340 345 350 ctc gcg ggc gtt tcg acc gac ccc ctg ttc gga aaa gtg ccc gac gcc 1104 Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala 355 360 365 ctt gag gaa gtg ctg gcc atg gac cat ctc gct cgg aga gcg gca gag 1152 Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu 370 375 380 gaa gcc gcc ggt ctc cgc cag cag aaa agg 1182 Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg 385 390 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 32 aagctgatct gggacgtggg gca 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 33 tgctatccgc acaagatcct gac 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 34 gcatgctgtt ccgcgatgcc gac 23

【０２２５】

【配列表フリーテキスト】配列番号１２：合成ＤＮＡ 配列番号１３：合成ＤＮＡ 配列番号１４：合成ＤＮＡ 配列番号１５：合成ＤＮＡ 配列番号１６：合成ＤＮＡ 配列番号１７：合成ＤＮＡ 配列番号１８：合成ＤＮＡ 配列番号１９：合成ＤＮＡ 配列番号２０：合成ＤＮＡ 配列番号２１：合成ＤＮＡ 配列番号２２：合成ＤＮＡ 配列番号２３：合成ＤＮＡ 配列番号２４：合成ＤＮＡ 配列番号２５：合成ＤＮＡ 配列番号３２：合成ＤＮＡ 配列番号３３：合成ＤＮＡ 配列番号３４：合成ＤＮＡ

【図面の簡単な説明】

【図１】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レ
ダクトイソメラーゼの活性に対する反応温度の影響を示
した図である。

【図２】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レ
ダクトイソメラーゼの活性に対する反応液ｐＨの影響を
示した図である。１００ｍＭトリス塩酸緩衝液中の各ｐ
Ｈにおける活性を示した。ｐＨ８．０での活性を１００
％として、各ｐＨにおける活性を相対活性として示し
た。

【図３】相同組換えを利用した染色体上のｙａｅＭ遺伝
子破壊方法を示した図である。

【図４】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レ
ダクトイソメラーゼ活性に及ぼすフォスミドマイシンの
影響を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｑ 1/18 ４Ｈ０１１ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:18） (72)発明者 尾崎 明夫 東京都町田市中町３−９−13 (72)発明者 瀬戸 治男 東京都八王子市上野町100−５ (72)発明者 葛山 智久 東京都世田谷区代沢２−11−５ (72)発明者 高橋 俊二 千葉県千葉市中央区矢作町641 グリーン ハウスＢ棟102号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA07 CA03 DA05 DA06 EA04 GA11 GA14 GA19 HA01 HA03 4B050 CC03 CC10 DD02 LL01 LL02 LL05 4B063 QA18 QQ95 QR19 QR69 QR75 QS36 QX01 4B064 AB04 AB05 AD92 AD94 AH01 CA02 CA19 CC24 CE08 DA01 DA10 4B065 AA01Y AA25X AA26X AA26Y AB01 AC14 BA03 BA18 BA25 CA03 CA27 CA44 4H011 AA01 AA02 AB01

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン
   酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生
   合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−
   リン酸の生合成を経由しイソペンテニルピロリン酸を生
   合成するための非メバロン酸経路上に存在する酵素から
   選ばれる酵素の有する活性を有している蛋白質の反応を
   阻害する物質を探索することを特徴とする抗菌活性を有
   する物質の探索方法。
2. 【請求項２】 ピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン
   酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生
   合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−
   リン酸の生合成を経由しイソペンテニルピロリン酸を生
   合成するための非メバロン酸経路上に存在する酵素から
   選ばれる酵素の有する活性を有している蛋白質の反応を
   阻害する物質を探索することを特徴とする除草活性を有
   する物質の探索方法。
3. 【請求項３】 蛋白質が、以下の（ａ）または（ｂ）の
   蛋白質であることを特徴とする、請求項１または２記載
   の探索方法。 （ａ）ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から
   １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する
   反応を触媒する活性を有する蛋白質 （ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から
   ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じ
   る反応を触媒する活性を有する蛋白質
4. 【請求項４】 ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リ
   ン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を
   生成する反応を触媒する蛋白質が、配列番号１記載のア
   ミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するア
   ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、
   置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピ
   ルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオ
   キシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触
   媒する活性を有する蛋白質である、請求項３記載の探索
   方法。
5. 【請求項５】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リ
   ン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン
   酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質が、配列
   番号５記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋
   白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン
   酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸
   を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質である、
   請求項３記載の探索方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の探索方法により取得され
   る抗菌活性を有する物質。
7. 【請求項７】 請求項２記載の探索方法により取得され
   る除草活性を有する物質。
8. 【請求項８】 請求項６記載の物質を含む抗菌剤。
9. 【請求項９】 請求項７記載の物質を含む除草剤。