JP2000201554A - ＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５遺伝子を含む多重疾病抵抗性のトランスジェニック植物 - Google Patents
ＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５遺伝子を含む多重疾病抵抗性のトランスジェニック植物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 大豆のカルモジュリンアイソフォーム（ＳＣ
ａＭ）遺伝子でトランスフォームされて、広範囲の植物
病原体に対して非常に高められた抵抗性を示すトランス
ジェニック植物と、その植物細胞を提供すること。 【解決手段】 本発明は、病原体抵抗性植物を作出する
ために、ＳＣａＭ遺伝子を有する発現ベクターと、発現
ベクター内の前記遺伝子が導入された宿主細胞を提供す
る。異種のＳＣａＭを発現するトランスフォームされた
植物は、通常は植物に感染する真菌類、バクテリアとウ
イルスに対して高められた抵抗性を示す。
ａＭ）遺伝子でトランスフォームされて、広範囲の植物
病原体に対して非常に高められた抵抗性を示すトランス
ジェニック植物と、その植物細胞を提供すること。 【解決手段】 本発明は、病原体抵抗性植物を作出する
ために、ＳＣａＭ遺伝子を有する発現ベクターと、発現
ベクター内の前記遺伝子が導入された宿主細胞を提供す
る。異種のＳＣａＭを発現するトランスフォームされた
植物は、通常は植物に感染する真菌類、バクテリアとウ
イルスに対して高められた抵抗性を示す。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大豆のカルモジュ
リン(calmodulin)アイソフォーム遺伝子であるＳＣａＭ
４またはＳＣａＭ５でトランスフォームされて、広範囲
の植物病原体に対する多重疾病抵抗性を示すトランスジ
ェニック植物と植物細胞とに関する。また本発明は、前
記の遺伝子を有する発現ベクターと、病原体抵抗性の植
物を作るために、発現ベクター内の前記遺伝子が導入さ
れた宿主細胞を提供する。異種のＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５を発現するトランスジェニック植物は、通常はその植
物が感染する真菌類、バクテリアとウイルスに対して高
められた抵抗性を示す。
リン(calmodulin)アイソフォーム遺伝子であるＳＣａＭ
４またはＳＣａＭ５でトランスフォームされて、広範囲
の植物病原体に対する多重疾病抵抗性を示すトランスジ
ェニック植物と植物細胞とに関する。また本発明は、前
記の遺伝子を有する発現ベクターと、病原体抵抗性の植
物を作るために、発現ベクター内の前記遺伝子が導入さ
れた宿主細胞を提供する。異種のＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５を発現するトランスジェニック植物は、通常はその植
物が感染する真菌類、バクテリアとウイルスに対して高
められた抵抗性を示す。
【０００２】
【従来の技術】漸次的に多くなる病原体が絶え間なく植
物を攻撃している。自然防御のメカニズムが不十分であ
るか、または病原体による損傷に対して対応して防御す
ることができない高等植物を病原体が攻撃すると、非常
に莫大な経済的な損失が発生する。従って、農業では多
様な植物病原体を抑制することがもっとも重要であり、
農作物の病原性疾病を抑制するために広範囲の努力が集
中されてきた。しかし、病原体に対してより抵抗性のあ
る農作物を選別するための育種プログラム等はほとんど
成功していない。その上、既に形成された植物防御のメ
カニズム等が不適切であるか、植物が病原体を認知でき
ない場合、さらに活性化された防御反応が効果のないよ
うな場合には、病原体が侵入してしまい、それによって
疾病が発生することになる。
物を攻撃している。自然防御のメカニズムが不十分であ
るか、または病原体による損傷に対して対応して防御す
ることができない高等植物を病原体が攻撃すると、非常
に莫大な経済的な損失が発生する。従って、農業では多
様な植物病原体を抑制することがもっとも重要であり、
農作物の病原性疾病を抑制するために広範囲の努力が集
中されてきた。しかし、病原体に対してより抵抗性のあ
る農作物を選別するための育種プログラム等はほとんど
成功していない。その上、既に形成された植物防御のメ
カニズム等が不適切であるか、植物が病原体を認知でき
ない場合、さらに活性化された防御反応が効果のないよ
うな場合には、病原体が侵入してしまい、それによって
疾病が発生することになる。
【０００３】侵入する病原体に対する植物の抵抗性は、
複雑な流れの防御反応等の進展に伴って起こることが知
られている（Jackson et al. 1996. Plant Cell, 8:165
1-1668）。病原体が特定の非病原性遺伝子(ａｖｒ遺伝
子という）を有しており、植物宿主が同じ系統の抵抗性
を有する場合は、病原体が感染した部位で局部的な病巣
が形成され、その結果、病原体の成長が阻害される［こ
れを、過敏性反応(hypersensitive response:ＨＲ）と
いう］（病原体に対する植物の過敏性反応：抵抗性現
象。Goodman, R.N. およびNovacky, A.J., APS Press,
St. Paul. 1994）。従って、特定の抵抗性遺伝子（Ｒ遺
伝子という）を発現する植物は、対応するａｖｒ遺伝子
を発現する病原体に対して特異的な抵抗性を有してい
る。過敏性反応に加えて、その植物中で感染されない部
分を多様な病原性病原体に抵抗するようにする２次的な
防御反応も開始され得る［これを、全体的な後天的抵抗
性(systematic acquired resistance:ＳＡＲという］。
植物と病原体と間の相互作用は、酸化的バースト、一過
性のＣａ2+の増加、サリチル酸の蓄積、発病関連タンパ
ク質の高レベルでの合成、フィトアレキシンの生合成及
び防御遺伝子の活性化を含む一連の防御シグナル伝達を
誘導する。現在までの研究結果は、いずれの植物防御反
応でもＣａ2+シグナルが関連していることを示してい
る。Ｃａ2+イオンの流入は、病原体の攻撃を受けた細胞
で真っ先に発生するものの１つであり（Dixson et al.,
1994. Annu. Rev. Phytopathol., 32:479-501）、フィ
トアレキシン生合成、防御関連遺伝子の誘導、過敏性細
胞の死滅などのような防御反応の活性化に必須的なもの
と見なされている（Levine et al., 1996. Curr. Bio
l., 6:427-437）。しかし、植物の疾病抵抗性反応でＣ
ａＭが関与しているという直接的な証拠は得られなかっ
た。
複雑な流れの防御反応等の進展に伴って起こることが知
られている（Jackson et al. 1996. Plant Cell, 8:165
1-1668）。病原体が特定の非病原性遺伝子(ａｖｒ遺伝
子という）を有しており、植物宿主が同じ系統の抵抗性
を有する場合は、病原体が感染した部位で局部的な病巣
が形成され、その結果、病原体の成長が阻害される［こ
れを、過敏性反応(hypersensitive response:ＨＲ）と
いう］（病原体に対する植物の過敏性反応：抵抗性現
象。Goodman, R.N. およびNovacky, A.J., APS Press,
St. Paul. 1994）。従って、特定の抵抗性遺伝子（Ｒ遺
伝子という）を発現する植物は、対応するａｖｒ遺伝子
を発現する病原体に対して特異的な抵抗性を有してい
る。過敏性反応に加えて、その植物中で感染されない部
分を多様な病原性病原体に抵抗するようにする２次的な
防御反応も開始され得る［これを、全体的な後天的抵抗
性(systematic acquired resistance:ＳＡＲという］。
植物と病原体と間の相互作用は、酸化的バースト、一過
性のＣａ2+の増加、サリチル酸の蓄積、発病関連タンパ
ク質の高レベルでの合成、フィトアレキシンの生合成及
び防御遺伝子の活性化を含む一連の防御シグナル伝達を
誘導する。現在までの研究結果は、いずれの植物防御反
応でもＣａ2+シグナルが関連していることを示してい
る。Ｃａ2+イオンの流入は、病原体の攻撃を受けた細胞
で真っ先に発生するものの１つであり（Dixson et al.,
1994. Annu. Rev. Phytopathol., 32:479-501）、フィ
トアレキシン生合成、防御関連遺伝子の誘導、過敏性細
胞の死滅などのような防御反応の活性化に必須的なもの
と見なされている（Levine et al., 1996. Curr. Bio
l., 6:427-437）。しかし、植物の疾病抵抗性反応でＣ
ａＭが関与しているという直接的な証拠は得られなかっ
た。
【０００４】有害な真菌類、バクテリア、ウイルスと線
虫類(nematode)を抑制するために多様なアプローチが利
用されてきた。１つのアプローチは、真菌類や線虫類を
抑制するかまたは妨害する機能を有する自然発生的なバ
クテリアを利用することである。別のアプローチは抵抗
性のものを育種することであって、これは主に植物の全
体的な抵抗性に大して寄与していないマイナーな抵抗性
遺伝子の操作に焦点を合わせたものである。しかし場合
によっては、植物が病原体を認識できなく、誘導による
植物の防御メカニズムを発生し得ない場合がある。その
上、このようなアプローチにより提供される保護は、正
式の全体的な後天的抵抗性により与えられる保護よりも
ずっと制限的であり、抵抗性の程度もあまり顕著ではな
い。
虫類(nematode)を抑制するために多様なアプローチが利
用されてきた。１つのアプローチは、真菌類や線虫類を
抑制するかまたは妨害する機能を有する自然発生的なバ
クテリアを利用することである。別のアプローチは抵抗
性のものを育種することであって、これは主に植物の全
体的な抵抗性に大して寄与していないマイナーな抵抗性
遺伝子の操作に焦点を合わせたものである。しかし場合
によっては、植物が病原体を認識できなく、誘導による
植物の防御メカニズムを発生し得ない場合がある。その
上、このようなアプローチにより提供される保護は、正
式の全体的な後天的抵抗性により与えられる保護よりも
ずっと制限的であり、抵抗性の程度もあまり顕著ではな
い。
【０００５】本発明のトランスジェニック植物は、野生
型植物で非常に保存されているＣａＭアイソフォームで
あるＳＣａＭ１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のタンパク質
に対して特定の分化したＳＣａＭ４やＳＣａＭ５タンパ
ク質を同様なレベルで保有している（溶解性の全葉タン
パク質１ｍｇ当たり０．３−０．５μｇ）。本発明によ
り提供されたトランスジェニック植物は、多様な病原
体、即ち、真菌性、ウイルス性及びバクテリア性病原体
の感染に対して、全体的な後天的抵抗性と類似した、長
期間持続する、広範囲の抵抗性を表すということが明ら
かになった。これはＣａＭアイソフォーム間の機能的な
差異だけでなく、ウイルス、バクテリア及び真菌類を含
む広範囲な病原体に対するＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の中
心的な役割に対するインビボでの最初の証拠である。
型植物で非常に保存されているＣａＭアイソフォームで
あるＳＣａＭ１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のタンパク質
に対して特定の分化したＳＣａＭ４やＳＣａＭ５タンパ
ク質を同様なレベルで保有している（溶解性の全葉タン
パク質１ｍｇ当たり０．３−０．５μｇ）。本発明によ
り提供されたトランスジェニック植物は、多様な病原
体、即ち、真菌性、ウイルス性及びバクテリア性病原体
の感染に対して、全体的な後天的抵抗性と類似した、長
期間持続する、広範囲の抵抗性を表すということが明ら
かになった。これはＣａＭアイソフォーム間の機能的な
差異だけでなく、ウイルス、バクテリア及び真菌類を含
む広範囲な病原体に対するＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の中
心的な役割に対するインビボでの最初の証拠である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＳＣａＭ４
やＳＣａＭ５遺伝子でトランスフォームされて１つ以上
の植物病原体による病原性の攻撃に対して高められた多
重抵抗性を示す高等植物細胞を提供する。また本発明に
よる高等植物の細胞をトランスフォームできるＳＣａＭ
４やＳＣａＭ５を有する発現ベクターを提供する。
やＳＣａＭ５遺伝子でトランスフォームされて１つ以上
の植物病原体による病原性の攻撃に対して高められた多
重抵抗性を示す高等植物細胞を提供する。また本発明に
よる高等植物の細胞をトランスフォームできるＳＣａＭ
４やＳＣａＭ５を有する発現ベクターを提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、大豆カルモジ
ュリンアイソフォーム４または５（ＳＣａＭ４またはＳ
ＣａＭ５）遺伝子でトランスフォームされ、広範囲な植
物病原体に対して非常に高められた抵抗性を有するトラ
ンスジェニック植物と植物細胞とに関する。また本発明
は、前記の遺伝子を有する発現ベクターと、病原体抵抗
性植物を作るために、発現ベクター内の前記遺伝子が導
入された宿主細胞を提供する。異種のＳＣａＭを発現す
るトランスジェニック植物は、通常は植物に感染する真
菌類、バクテリアとウイルスに対して、高められた抵抗
性を有している。
ュリンアイソフォーム４または５（ＳＣａＭ４またはＳ
ＣａＭ５）遺伝子でトランスフォームされ、広範囲な植
物病原体に対して非常に高められた抵抗性を有するトラ
ンスジェニック植物と植物細胞とに関する。また本発明
は、前記の遺伝子を有する発現ベクターと、病原体抵抗
性植物を作るために、発現ベクター内の前記遺伝子が導
入された宿主細胞を提供する。異種のＳＣａＭを発現す
るトランスジェニック植物は、通常は植物に感染する真
菌類、バクテリアとウイルスに対して、高められた抵抗
性を有している。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のより望ましい一実施例
で、タバコ植物の細胞を分岐したＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５遺伝子でトランスフォームした。トランスフォームさ
れたタバコ植物は、多様な病原体（真菌類、ウイルス及
びバクテリア）の感染に対して高められた多重疾病抵抗
性を示す。増加した多重疾病抵抗性により、農作物の生
産量が増大し、腐敗を抑制するために用いられる殺菌剤
の量は減少し、より競争力のある農産品の販売が可能に
なる。
で、タバコ植物の細胞を分岐したＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５遺伝子でトランスフォームした。トランスフォームさ
れたタバコ植物は、多様な病原体（真菌類、ウイルス及
びバクテリア）の感染に対して高められた多重疾病抵抗
性を示す。増加した多重疾病抵抗性により、農作物の生
産量が増大し、腐敗を抑制するために用いられる殺菌剤
の量は減少し、より競争力のある農産品の販売が可能に
なる。
【０００９】ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝子は、大豆に
由来した新規な分化したカルモジュリンアイソフォーム
であり、カルモジュリン−依存性酵素(calmodulin-depe
ndent enzyme)を活性化する特異的な能力を有する（Lee
et al., 1995, J. Bio. Chem., 270:21806-21812）。
ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４のヌクレオチド配列と約７８％
の同一性を有している。
由来した新規な分化したカルモジュリンアイソフォーム
であり、カルモジュリン−依存性酵素(calmodulin-depe
ndent enzyme)を活性化する特異的な能力を有する（Lee
et al., 1995, J. Bio. Chem., 270:21806-21812）。
ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４のヌクレオチド配列と約７８％
の同一性を有している。
【００１０】本発明によるトランスジェニック植物は、
少なくともＳＣａＭ４やＳＣａＭ５をコードする１個ま
たはその以上の遺伝可能な組換え核酸発現カセット(rec
ombinant nucleic acid expressing casette)を有する
植物または植物材料に関するものである。より望ましく
は本発明のトランスジェニックタバコ植物は、ＳＣａＭ
４やＳＣａＭ５のうち少なくともいずれか１つを有する
か、または両方のすべてを有する。
少なくともＳＣａＭ４やＳＣａＭ５をコードする１個ま
たはその以上の遺伝可能な組換え核酸発現カセット(rec
ombinant nucleic acid expressing casette)を有する
植物または植物材料に関するものである。より望ましく
は本発明のトランスジェニックタバコ植物は、ＳＣａＭ
４やＳＣａＭ５のうち少なくともいずれか１つを有する
か、または両方のすべてを有する。
【００１１】ここにおいて用いられた「過剰発現された
(overexpressed)」ＳＣａＭ４は、細胞内で産生される
量より多い量が産生されるタンパク質である。例えば、
形質転換遺伝子（transgene）を適切な構成プロモータ
ー(constitutive promoter)と結合させて、その形質転
換遺伝子を持続的に発現させることによって過剰発現さ
せることができる。必要な場合のみに選択的に過剰発現
され得るようにするためには、形質転換遺伝子を強力な
誘導性プロモーター(inducible promoter)に連結するよ
うにすることができる。適切なレベルの過剰発現とは、
好ましくは、形質転換遺伝子が内因性の遺伝子の自然的
に生じる発現レベルよりも少なくとも１０倍以上発現す
るものを含む。本発明の実施に使用するのに適した持続
性プロモーターには、当該技術において公知であり広く
利用できるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（Ｃａ
ＭＶ３５Ｓ）プロモーター等が含まれる（米国特許第5,
097,925号）。
(overexpressed)」ＳＣａＭ４は、細胞内で産生される
量より多い量が産生されるタンパク質である。例えば、
形質転換遺伝子（transgene）を適切な構成プロモータ
ー(constitutive promoter)と結合させて、その形質転
換遺伝子を持続的に発現させることによって過剰発現さ
せることができる。必要な場合のみに選択的に過剰発現
され得るようにするためには、形質転換遺伝子を強力な
誘導性プロモーター(inducible promoter)に連結するよ
うにすることができる。適切なレベルの過剰発現とは、
好ましくは、形質転換遺伝子が内因性の遺伝子の自然的
に生じる発現レベルよりも少なくとも１０倍以上発現す
るものを含む。本発明の実施に使用するのに適した持続
性プロモーターには、当該技術において公知であり広く
利用できるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（Ｃａ
ＭＶ３５Ｓ）プロモーター等が含まれる（米国特許第5,
097,925号）。
【００１２】本発明に記載したＳＣａＭ４とＳＣａＭ５
とは、組換え形質転換遺伝子分子によりコードされる。
ここにおいて用いられた「形質転換遺伝子(transgen
e)」という用語は、ＤＮＡやＲＮＡ分子のことを意味す
る。ここにおいて用いられた形質転換遺伝子は、生物学
的に活性なアミノ酸配列、即ちタンパク質をコードして
いる。
とは、組換え形質転換遺伝子分子によりコードされる。
ここにおいて用いられた「形質転換遺伝子(transgen
e)」という用語は、ＤＮＡやＲＮＡ分子のことを意味す
る。ここにおいて用いられた形質転換遺伝子は、生物学
的に活性なアミノ酸配列、即ちタンパク質をコードして
いる。
【００１３】一般的には、ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５タン
パク質をコードする形質転換遺伝子は発現カセットに含
まれている。発現カセットとは所望のタンパク質を合成
するように、構造遺伝子、即ちｃＤＮＡの転写と翻訳を
指示することができるＤＮＡ分子のことを意味する。発
現ベクターは、所望のタンパク質をコードする少なくと
も１つの形質転換遺伝子と、形質転換遺伝子が作動でき
るように結合された少なくとも１つのプロモーターと、
転写終結配列(transcription terminator sequence)と
から構成される。従って、タンパク質をコードする断片
は、プロモーター部位の調節下で、翻訳により所望のタ
ンパク質を提供することができる転写体に転写される。
発現カセットの多様な断片の適切なリーディングフレー
ムの位置と方向は、当該技術分野で通常の知識を有する
者らの知識の範囲内である。
パク質をコードする形質転換遺伝子は発現カセットに含
まれている。発現カセットとは所望のタンパク質を合成
するように、構造遺伝子、即ちｃＤＮＡの転写と翻訳を
指示することができるＤＮＡ分子のことを意味する。発
現ベクターは、所望のタンパク質をコードする少なくと
も１つの形質転換遺伝子と、形質転換遺伝子が作動でき
るように結合された少なくとも１つのプロモーターと、
転写終結配列(transcription terminator sequence)と
から構成される。従って、タンパク質をコードする断片
は、プロモーター部位の調節下で、翻訳により所望のタ
ンパク質を提供することができる転写体に転写される。
発現カセットの多様な断片の適切なリーディングフレー
ムの位置と方向は、当該技術分野で通常の知識を有する
者らの知識の範囲内である。
【００１４】ここにおいて用いられる「プラスミド」や
「ベクター」という用語は、染色体に結合されていない
環状の２本鎖のＤＮＡループのことを意味する。プラス
ミドはその中に含まれたＤＮＡ配列を発現できるように
するＤＮＡを有し、このような配列はそれらの発現に影
響を及ぼし得る別の配列、即ちプロモーター配列などと
作用的に連関するように配置されている。現在、本発明
のトランスジェニックタバコ植物を産出するためにより
望ましいベクターは、次の実施例部分で説明するプラス
ミドｐＬＥＳ９８０４とｐＬＥＳ９８０５である。
「ベクター」という用語は、染色体に結合されていない
環状の２本鎖のＤＮＡループのことを意味する。プラス
ミドはその中に含まれたＤＮＡ配列を発現できるように
するＤＮＡを有し、このような配列はそれらの発現に影
響を及ぼし得る別の配列、即ちプロモーター配列などと
作用的に連関するように配置されている。現在、本発明
のトランスジェニックタバコ植物を産出するためにより
望ましいベクターは、次の実施例部分で説明するプラス
ミドｐＬＥＳ９８０４とｐＬＥＳ９８０５である。
【００１５】「多重疾病抵抗性」という用語は、本発明
のトランスジェニック植物と別の植物と間で抵抗性のレ
ベルを比較する状況で用いる時に、トランスフォームさ
れていない植物や、単一の遺伝子のみがトランスフォー
ムされた植物と比較して、病原体の感染にも拘わらず所
望の表現形(phenotype)を維持することができる本発明
のトランスジェニック植物の能力を意味する。抵抗性の
レベルは、本発明による植物の物理的な特性を、病原体
の感染に暴露されているかもしくは暴露されていない非
トランスジェニック植物の物理的な特性と比較すること
によって決定することができる。
のトランスジェニック植物と別の植物と間で抵抗性のレ
ベルを比較する状況で用いる時に、トランスフォームさ
れていない植物や、単一の遺伝子のみがトランスフォー
ムされた植物と比較して、病原体の感染にも拘わらず所
望の表現形(phenotype)を維持することができる本発明
のトランスジェニック植物の能力を意味する。抵抗性の
レベルは、本発明による植物の物理的な特性を、病原体
の感染に暴露されているかもしくは暴露されていない非
トランスジェニック植物の物理的な特性と比較すること
によって決定することができる。
【００１６】異種のタンパク質をコードする遺伝子を含
む細胞を培養するのに用いる方法とともに、明細書に記
載されているような構築体を適切な宿主細胞に導入する
方法は当該分野で一般的に知られている。本発明による
と、ベクターはアグロバクテリウム・チュメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens)ＥＨＡ１０１により宿
主細胞に導入される。アグロバクテリウムから誘導した
植物のトランスフォーム用ベクターに加えて、高速の弾
道的貫通法（例えば、パーティクルガン法）を用いて植
物細胞に本発明のＤＮＡ構築体を挿入することもでき
る。また別の導入方法としては、プロトプラストを別の
プロトプラストと融合することもできる。エレクトロポ
レーションによってもＤＮＡを植物細胞に導入すること
ができる。
む細胞を培養するのに用いる方法とともに、明細書に記
載されているような構築体を適切な宿主細胞に導入する
方法は当該分野で一般的に知られている。本発明による
と、ベクターはアグロバクテリウム・チュメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens)ＥＨＡ１０１により宿
主細胞に導入される。アグロバクテリウムから誘導した
植物のトランスフォーム用ベクターに加えて、高速の弾
道的貫通法（例えば、パーティクルガン法）を用いて植
物細胞に本発明のＤＮＡ構築体を挿入することもでき
る。また別の導入方法としては、プロトプラストを別の
プロトプラストと融合することもできる。エレクトロポ
レーションによってもＤＮＡを植物細胞に導入すること
ができる。
【００１７】本発明の一実施形態で、それぞれＳＣａＭ
４やＳＣａＭ５をコードする形質転換遺伝子を有する２
個の発現カセットは、実施例に記載した通りに調製され
る。その発現カセットは、１つの発現ベクター中に結合
されて、ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５をコードする２個の個
々の遺伝子を含むＤＮＡ構築体を形成する。そのベクタ
ーは、機能を低下させた欠損Ｔｉプラスミドを含有する
アグロバクテリウム・チュメファシエンスの細胞に導入
される。
４やＳＣａＭ５をコードする形質転換遺伝子を有する２
個の発現カセットは、実施例に記載した通りに調製され
る。その発現カセットは、１つの発現ベクター中に結合
されて、ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５をコードする２個の個
々の遺伝子を含むＤＮＡ構築体を形成する。そのベクタ
ーは、機能を低下させた欠損Ｔｉプラスミドを含有する
アグロバクテリウム・チュメファシエンスの細胞に導入
される。
【００１８】トランスフォーメーションの後、前記のＤ
ＮＡ構築体を含むトランスフォームされた植物細胞や植
物は、選択マーカーにより確認することができる。その
細胞を、適切な抗生物質を含有する成長培地で培養する
ことによりトランスフォームされた植物細胞を選択する
ことができる。
ＮＡ構築体を含むトランスフォームされた植物細胞や植
物は、選択マーカーにより確認することができる。その
細胞を、適切な抗生物質を含有する成長培地で培養する
ことによりトランスフォームされた植物細胞を選択する
ことができる。
【００１９】トランスフォームされた細胞を選択した
後、所望の異種遺伝子の発現を確認することができる。
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法により挿入
されたＤＮＡによってコードされたｍＲＮＡを簡単に検
出することができる。また、サザンブロットハイブリダ
イゼーション法により挿入されたＤＮＡ配列を確認する
ことができる。一旦、所望の形質転換遺伝子の存在が確
認されれば、全植物への再生を達成することができる。
培養した細胞または組織から再生できるすべての植物
は、本発明によってトランスフォームすることができ
る。
後、所望の異種遺伝子の発現を確認することができる。
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法により挿入
されたＤＮＡによってコードされたｍＲＮＡを簡単に検
出することができる。また、サザンブロットハイブリダ
イゼーション法により挿入されたＤＮＡ配列を確認する
ことができる。一旦、所望の形質転換遺伝子の存在が確
認されれば、全植物への再生を達成することができる。
培養した細胞または組織から再生できるすべての植物
は、本発明によってトランスフォームすることができ
る。
【００２０】少なくとも１つの形質転換遺伝子を有する
発現カセットを含む２個の別個のトランスジェニック植
物を交差授粉法(cross-pollination method)を用い有性
交配することによって、本発明のトランスジェニック植
物を産出することができる。交配すべき種に従い、数多
い標準的な育種技術のいずれかを使用することができ
る。
発現カセットを含む２個の別個のトランスジェニック植
物を交差授粉法(cross-pollination method)を用い有性
交配することによって、本発明のトランスジェニック植
物を産出することができる。交配すべき種に従い、数多
い標準的な育種技術のいずれかを使用することができ
る。
【００２１】本発明の実施例に使用できる植物には、単
子葉植物と双子葉植物とが含まれる。本発明の実施に使
用できる典型的な単子葉植物には、コメ、コムギ、トウ
モロコシ、オオムギならびに他の穀物が含まれ、典型的
な双子葉植物にはタバコ、トマト、ジャガイモ、大豆そ
の他が含まれる。
子葉植物と双子葉植物とが含まれる。本発明の実施に使
用できる典型的な単子葉植物には、コメ、コムギ、トウ
モロコシ、オオムギならびに他の穀物が含まれ、典型的
な双子葉植物にはタバコ、トマト、ジャガイモ、大豆そ
の他が含まれる。
【００２２】本発明は、下記の非限定的な実施例等によ
ってより詳細に説明される。
ってより詳細に説明される。
【００２３】＜結果＞ＳＣａＭ４はその長さが１，４２
９ｂｐであり、６６４ｂｐの５′非翻訳領域と４５０ｂ
ｐのタンパク質をコードする配列と、３１５ｂｐの３′
非翻訳領域とを有する。タンパク質コード領域は、１４
９個のアミノ酸から構成される。ポリアデニル化シグナ
ル、ＡＴＴＡＡＡは３′非翻訳領域にみられた。
９ｂｐであり、６６４ｂｐの５′非翻訳領域と４５０ｂ
ｐのタンパク質をコードする配列と、３１５ｂｐの３′
非翻訳領域とを有する。タンパク質コード領域は、１４
９個のアミノ酸から構成される。ポリアデニル化シグナ
ル、ＡＴＴＡＡＡは３′非翻訳領域にみられた。
【００２４】ヌクレオチド配列について、別の植物のＣ
ａＭ、例えばＳＣａＭ−１、２、３とウシのＣａＭとを
比較すると、それらのタンパク質をコードする領域で７
０％以上の配列相同性を示した。しかし、ＳＣａＭ４の
５′と３′との非翻訳部位は、他のＳＣａＭと有意な相
同性を示さないことから判断すると、このｃＤＮＡクロ
ーンは大豆ゲノムの中で、別の遺伝子転写体から導かれ
たものであることを示している。アクチン遺伝子の場
合、ヌクレオチド配列の変化は植物アクチンと非植物ア
クチンと間で１１−１５％にすぎず、また、大豆のアク
チン遺伝子ファミリーメンバー内では６−９％にすぎな
い。ＳＣａＭ４はＳＣａＭ−１、２、３と比較して３０
％の差異があり、これは非常に驚くべきことである。
ａＭ、例えばＳＣａＭ−１、２、３とウシのＣａＭとを
比較すると、それらのタンパク質をコードする領域で７
０％以上の配列相同性を示した。しかし、ＳＣａＭ４の
５′と３′との非翻訳部位は、他のＳＣａＭと有意な相
同性を示さないことから判断すると、このｃＤＮＡクロ
ーンは大豆ゲノムの中で、別の遺伝子転写体から導かれ
たものであることを示している。アクチン遺伝子の場
合、ヌクレオチド配列の変化は植物アクチンと非植物ア
クチンと間で１１−１５％にすぎず、また、大豆のアク
チン遺伝子ファミリーメンバー内では６−９％にすぎな
い。ＳＣａＭ４はＳＣａＭ−１、２、３と比較して３０
％の差異があり、これは非常に驚くべきことである。
【００２５】高等植物のＣａＭおよびウシのＣａＭとＳ
ＣａＭ４との推測アミノ酸配列を比較すると、ＳＣａＭ
４がそれらの推測アミノ酸配列と８０％以上の配列同一
性を有するということが分かる。さらに、植物のＣａＭ
は互に９５％以上の配列同一性を有する。興味のあるこ
とは、ＳＣａＭ４の推測アミノ酸配列が非常に分岐して
いることである。ＳＣａＭ４はＳＣａＭ−１、２、３に
対して３２個のアミノ酸が置換されており、ジャガイモ
ＣａＭに対して２６個のアミノ酸が置換され、ウシのＣ
ａＭに対して２８個のアミノ酸が置換されたものであ
る。
ＣａＭ４との推測アミノ酸配列を比較すると、ＳＣａＭ
４がそれらの推測アミノ酸配列と８０％以上の配列同一
性を有するということが分かる。さらに、植物のＣａＭ
は互に９５％以上の配列同一性を有する。興味のあるこ
とは、ＳＣａＭ４の推測アミノ酸配列が非常に分岐して
いることである。ＳＣａＭ４はＳＣａＭ−１、２、３に
対して３２個のアミノ酸が置換されており、ジャガイモ
ＣａＭに対して２６個のアミノ酸が置換され、ウシのＣ
ａＭに対して２８個のアミノ酸が置換されたものであ
る。
【００２６】注目すべき置換は、第３のＣａ2+結合ドメ
インでフェニルアラニン(Phe)がチロシン(Tyr)に置換さ
れたことである。ウシのＣａＭでは、チロシン(Tyr)残
基は、Ｃａ2+がない場合にチロシンが標的タンパク質と
反応する機能であるリン酸化と考えられる。２番目の注
目すべき置換は、第１のＣａ2+結合ドメインで陽電荷を
帯びているリジン(Lys)が陰電荷を帯びているグルタミ
ン酸(Glu)に置換され、第２のＣａ2+結合ドメインでプ
ロリン(Pro)がアスパラギン酸(Asp)に置換されているこ
とである。Ｃａ2+結合ドメインの置換は、Ｃａ2+−結合
親和力とコンホメーションの変化とに影響を与えるとい
うことを示した。また注目すべき置換は、グリシン41(G
ly41)がアスパラギン酸(Asp)に、セリン81(Ser81)がア
ラニン(Ala)に置換されていることである。この残基
は、多様な標的における塩基性の両極親和性のα−ヘリ
ックスの大きな変化に対する２個のローブ(lobe)を固定
させるために、ヘリックスの曲がった部位(helix bendi
ng sites)に必須である。グリシン41(Gly41)は、その大
きさが小さくて鋭く曲げることができるので、進化の過
程でよく保存されたと考えられる。より傘高く、荷電さ
れたアスパラギン酸(Asp)はこの曲がる現象を妨害する
と考えられる。また、バリン−１４５(Val-145)のメチ
オニン(Met)による置換、メチオニンは疎水性の部分
で、短く、そして分岐していないものであるが、これら
の３個のメチオニンの置換により、特定な標的の活性化
のために別個な接触が得られる。
インでフェニルアラニン(Phe)がチロシン(Tyr)に置換さ
れたことである。ウシのＣａＭでは、チロシン(Tyr)残
基は、Ｃａ2+がない場合にチロシンが標的タンパク質と
反応する機能であるリン酸化と考えられる。２番目の注
目すべき置換は、第１のＣａ2+結合ドメインで陽電荷を
帯びているリジン(Lys)が陰電荷を帯びているグルタミ
ン酸(Glu)に置換され、第２のＣａ2+結合ドメインでプ
ロリン(Pro)がアスパラギン酸(Asp)に置換されているこ
とである。Ｃａ2+結合ドメインの置換は、Ｃａ2+−結合
親和力とコンホメーションの変化とに影響を与えるとい
うことを示した。また注目すべき置換は、グリシン41(G
ly41)がアスパラギン酸(Asp)に、セリン81(Ser81)がア
ラニン(Ala)に置換されていることである。この残基
は、多様な標的における塩基性の両極親和性のα−ヘリ
ックスの大きな変化に対する２個のローブ(lobe)を固定
させるために、ヘリックスの曲がった部位(helix bendi
ng sites)に必須である。グリシン41(Gly41)は、その大
きさが小さくて鋭く曲げることができるので、進化の過
程でよく保存されたと考えられる。より傘高く、荷電さ
れたアスパラギン酸(Asp)はこの曲がる現象を妨害する
と考えられる。また、バリン−１４５(Val-145)のメチ
オニン(Met)による置換、メチオニンは疎水性の部分
で、短く、そして分岐していないものであるが、これら
の３個のメチオニンの置換により、特定な標的の活性化
のために別個な接触が得られる。
【００２７】ＳＣａＭ５は６８ｂｐの５′非翻訳領域
と、４５０ｂｐのオープンリーディングフレームと、３
９７ｂｐの３′非翻訳領域とから構成される。タンパク
質のコード部位は、１４９個のアミノ酸を構成する。ポ
リアデニル化シグナルは見いだされなかった。
と、４５０ｂｐのオープンリーディングフレームと、３
９７ｂｐの３′非翻訳領域とから構成される。タンパク
質のコード部位は、１４９個のアミノ酸を構成する。ポ
リアデニル化シグナルは見いだされなかった。
【００２８】他の植物のＣａＭ、すなわちＳＣａＭ−
１、−２、−３、−４とウシのＣａＭとのヌクレオチド
配列は、それらのタンパク質のコード領域で７０％以上
の配列相同性を示す。しかし、ＳＣａＭ５の５′と３′
非翻訳領域は、他のＳＣａＭと有意な相同性を示してい
ないので、これは、このｃＤＮＡクローンが大豆のゲノ
ム中の異なる遺伝子転写体から生じたものであることを
示している。ＳＣａＭ５は３′非翻訳領域でＡＴＴＴＡ
という興味のある配列モチーフ(motif)を有する。この
モチーフは、ＲＮアーゼや別の細胞性因子(cellular fa
ctors)によって認識される真核細胞中でのｍＲＮＡ不安
定化モチーフとして知られているものである。
１、−２、−３、−４とウシのＣａＭとのヌクレオチド
配列は、それらのタンパク質のコード領域で７０％以上
の配列相同性を示す。しかし、ＳＣａＭ５の５′と３′
非翻訳領域は、他のＳＣａＭと有意な相同性を示してい
ないので、これは、このｃＤＮＡクローンが大豆のゲノ
ム中の異なる遺伝子転写体から生じたものであることを
示している。ＳＣａＭ５は３′非翻訳領域でＡＴＴＴＡ
という興味のある配列モチーフ(motif)を有する。この
モチーフは、ＲＮアーゼや別の細胞性因子(cellular fa
ctors)によって認識される真核細胞中でのｍＲＮＡ不安
定化モチーフとして知られているものである。
【００２９】ＳＣａＭ５と、高等植物のＣａＭ及びウシ
のＣａＭとの推測アミノ酸配列の比較では、ＳＣａＭ５
がＳＣａＭ４と８０％以上の配列相同性有することがわ
かる。興味のあることに、ＳＣａＭ５の推測アミノ酸配
列は、他のＳＣａＭ及び植物ＣａＭとは非常に異なって
いる。ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４に対して１８個のアミノ
酸置換があり、もっとも分岐したＳＣａＭアイソフォー
ムである。このような置換には、ＳＣａＭ１とＳＣａＭ
２で発見されたように、５個のアスパラギン酸(Asp)が
グルタミン酸(Glu)に置換されるものが含まれている。
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とにおける注目すべきアミノ酸
残基の置換のうちの１つは、第３のＣａ2+結合ドメイン
で見いだされたチロシン99(Tyr99)残基である。第３の
Ｃａ2+結合ドメインでチロシン99(Tyr99)残基は動物の
ＣａＭでのみ見いだされており、植物のＣａＭ配列では
まだ見いだされてはいなかった。Tyr99はｓｒｃキナー
ゼとインシュリンレセプターキナーゼによる標的リン酸
化のための部位と考えられる。また、確認されたすべて
のＣａＭ配列で保存されたセリン81（Ser81)残基が、Ｓ
ＣａＭ４とＳＣａＭ５ではそれぞれアラニン(Ala)やグ
ルタミン酸(Glu)に置換されている。インビトロでセリ
ン81（Ser81)残基は、カゼインキナーゼIIによりリン酸
化されることが観察されている。配列の比較から明確に
確認された通り、ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４と共に新規な
タイプのＣａＭグループに分類され得る。
のＣａＭとの推測アミノ酸配列の比較では、ＳＣａＭ５
がＳＣａＭ４と８０％以上の配列相同性有することがわ
かる。興味のあることに、ＳＣａＭ５の推測アミノ酸配
列は、他のＳＣａＭ及び植物ＣａＭとは非常に異なって
いる。ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４に対して１８個のアミノ
酸置換があり、もっとも分岐したＳＣａＭアイソフォー
ムである。このような置換には、ＳＣａＭ１とＳＣａＭ
２で発見されたように、５個のアスパラギン酸(Asp)が
グルタミン酸(Glu)に置換されるものが含まれている。
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とにおける注目すべきアミノ酸
残基の置換のうちの１つは、第３のＣａ2+結合ドメイン
で見いだされたチロシン99(Tyr99)残基である。第３の
Ｃａ2+結合ドメインでチロシン99(Tyr99)残基は動物の
ＣａＭでのみ見いだされており、植物のＣａＭ配列では
まだ見いだされてはいなかった。Tyr99はｓｒｃキナー
ゼとインシュリンレセプターキナーゼによる標的リン酸
化のための部位と考えられる。また、確認されたすべて
のＣａＭ配列で保存されたセリン81（Ser81)残基が、Ｓ
ＣａＭ４とＳＣａＭ５ではそれぞれアラニン(Ala)やグ
ルタミン酸(Glu)に置換されている。インビトロでセリ
ン81（Ser81)残基は、カゼインキナーゼIIによりリン酸
化されることが観察されている。配列の比較から明確に
確認された通り、ＳＣａＭ５はＳＣａＭ４と共に新規な
タイプのＣａＭグループに分類され得る。
【００３０】大豆細胞の懸濁培養体をフザリウム・ソラ
ニー（Fusarium solani）から調製した非特異的な真菌
性誘発体により処理した結果、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５
によりコードされるｍＲＮＡが１０倍以上大きく増加し
た（図３Ａ）。この２つのＳＣａＭ遺伝子は他のＣａＭ
から最も変化している配列であり、実質的にＣａＭ分岐
体（divergent CaM）と呼ばれている。これらのｍＲＮ
Ａのレベルは１時間で最高値を示し、１２時間まで徐々
に減少してベースのレベル(basal level)となった。未
処理の細胞中でこれらの２個のＳＣａＭ遺伝子のベース
となる発現レベルは、非常に保存されているＳＣａＭ遺
伝子であるＳＣａＭ１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のそれ
に比較して低かった。ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５との比較
では、これらの３個の保存されたＳＣａＭ遺伝子の発現
は誘導体処理により活性化されなかった（図３Ａ）。Ｓ
ＣａＭ ｍＲＮＡのレベルの変化と一致して、ＳＣａＭ
１／２／３ではないＳＣａＭ４／５のタンパク質のレベ
ルも、その処理後３０分以内に増加した（図３Ｂ）。Ｓ
ＣａＭ４／５タンパク質レベルは２時間後に、それらの
最高値である水溶性タンパク質１ｍｇ当たり約０．５μ
ｇとなり、ついで１２時間後には徐々に減少した。対照
的に、ＳＣａＭ１／２／３タンパク質のレベルは、真菌
性誘発体処理によって大きな変化はなかった。興味のあ
ることは、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝子発現の誘導
は、処理後３時間からｍＲＮＡのレベルが増加し始める
フェニルアラニン・アンモニア−リアーゼ遺伝子の誘導
より先に発生した（図３Ａ参照）。フィトフトラ・パラ
シチカ変種のニコチアネ(Phytoph thora parasitica va
r.nicotianae)から製造された誘発体は、これらのＣａ
Ｍ遺伝子の発現に類似した効果がある（図３Ｃ参照）。
ニー（Fusarium solani）から調製した非特異的な真菌
性誘発体により処理した結果、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５
によりコードされるｍＲＮＡが１０倍以上大きく増加し
た（図３Ａ）。この２つのＳＣａＭ遺伝子は他のＣａＭ
から最も変化している配列であり、実質的にＣａＭ分岐
体（divergent CaM）と呼ばれている。これらのｍＲＮ
Ａのレベルは１時間で最高値を示し、１２時間まで徐々
に減少してベースのレベル(basal level)となった。未
処理の細胞中でこれらの２個のＳＣａＭ遺伝子のベース
となる発現レベルは、非常に保存されているＳＣａＭ遺
伝子であるＳＣａＭ１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のそれ
に比較して低かった。ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５との比較
では、これらの３個の保存されたＳＣａＭ遺伝子の発現
は誘導体処理により活性化されなかった（図３Ａ）。Ｓ
ＣａＭ ｍＲＮＡのレベルの変化と一致して、ＳＣａＭ
１／２／３ではないＳＣａＭ４／５のタンパク質のレベ
ルも、その処理後３０分以内に増加した（図３Ｂ）。Ｓ
ＣａＭ４／５タンパク質レベルは２時間後に、それらの
最高値である水溶性タンパク質１ｍｇ当たり約０．５μ
ｇとなり、ついで１２時間後には徐々に減少した。対照
的に、ＳＣａＭ１／２／３タンパク質のレベルは、真菌
性誘発体処理によって大きな変化はなかった。興味のあ
ることは、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝子発現の誘導
は、処理後３時間からｍＲＮＡのレベルが増加し始める
フェニルアラニン・アンモニア−リアーゼ遺伝子の誘導
より先に発生した（図３Ａ参照）。フィトフトラ・パラ
シチカ変種のニコチアネ(Phytoph thora parasitica va
r.nicotianae)から製造された誘発体は、これらのＣａ
Ｍ遺伝子の発現に類似した効果がある（図３Ｃ参照）。
【００３１】次に、我々はＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝
子発現の誘導に関連した分子シグナルに関して更に調査
するために、植物防御関連遺伝子のいろいろな潜在的な
誘発体の効果を調査した。フィトフトラ・パラシチカ誘
発体とバクテリア病原体であるａｖｒＣを有するシュー
ドモナス・シリンガエ変種のグリシニア(Psedomonas syr
ingae pv.glycinea,Ｐｓｇ)は、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ
５遺伝子発現を効果的に誘導した。タンパク質合成阻害
剤であるシクロヘキシミド(cycloheximide)は、フィト
フトラ・パラシチカ誘発体によるＳＣａＭ４とＳＣａＭ
５との誘導を遮断しなかった。その反対に、Ｃａ2+キレ
ート剤、1,2−ビス−(ｏ-アミノフェノキシ）−エタン
−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸[1,2-bis-(o-aminop
henoxy)-ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid;ＢＡＰ
ＴＡ]の添加は、このようなＳＣａＭ４とＳＣａＭ５と
の誘導ができない。一方、Ｃａ2+イオノホアであるＡ２
３１８７は単独で真菌性誘発体と同じく効果的にＳＣａ
Ｍ４とＳＣａＭ５との発現を十分に誘導した（図３
Ｃ）。しかし、外因性のサリチル酸(salicylic acid、
ＳＡ、１−５ｍＭ）や過酸化水素（Ｈ2Ｏ2、１−１０ｍ
Ｍ）を適用すると、２４時間が経過してもＳＣａＭ４と
ＳＣａＭ５遺伝子発現は誘導されなかった（データは示
していない）。過酸化水素生成システム［グルコースと
グルコースオキシダーゼ（Levine, A. et al., 1994, C
ell 79:583-593）］と過酸化物生成システム［キサンチ
ンとキサンチンオキシダーゼ（Jabs, T. et al., Scien
ce 273:1853-1856）］ともＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝
子発現の誘導ができなかった。２個の関連していないシ
グナル分子であるジャスモン酸(jasmonic acid、JA)（B
ergey, D.R. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93:12053-12508）とアブシシン酸(Abscisic acid、A
BA)（Giraudat, J. et al., 1994, Plant Mol. Biol. 2
6:1557-1558）ともＣＳａＭ４とＳＣａＭ５を誘導する
ことができなかった。これらの結果は、誘発によるＳＣ
ａＭ４とＳＣａＭ５遺伝子の転写活性化が、タンパク質
の合成が必要でない、非常に速い過程であり、反応性酸
素種(reactiveoxygen species、ＲＯＳ)とＳＡとの合成
と蓄積より先に発生するか、または別の疾病抵抗性シグ
ナル経路に属するということを示す。また、それらの活
性化は特異的であった；傷（ＪＡ）と欠乏（ＡＢＡ）の
ような別のストレス反応と関連したシグナル化合物等
は、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを誘導しなかった。しか
し、それらの誘導は、細胞内のＣａ2+濃度の増加により
媒介されるものと考えられる。
子発現の誘導に関連した分子シグナルに関して更に調査
するために、植物防御関連遺伝子のいろいろな潜在的な
誘発体の効果を調査した。フィトフトラ・パラシチカ誘
発体とバクテリア病原体であるａｖｒＣを有するシュー
ドモナス・シリンガエ変種のグリシニア(Psedomonas syr
ingae pv.glycinea,Ｐｓｇ)は、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ
５遺伝子発現を効果的に誘導した。タンパク質合成阻害
剤であるシクロヘキシミド(cycloheximide)は、フィト
フトラ・パラシチカ誘発体によるＳＣａＭ４とＳＣａＭ
５との誘導を遮断しなかった。その反対に、Ｃａ2+キレ
ート剤、1,2−ビス−(ｏ-アミノフェノキシ）−エタン
−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸[1,2-bis-(o-aminop
henoxy)-ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid;ＢＡＰ
ＴＡ]の添加は、このようなＳＣａＭ４とＳＣａＭ５と
の誘導ができない。一方、Ｃａ2+イオノホアであるＡ２
３１８７は単独で真菌性誘発体と同じく効果的にＳＣａ
Ｍ４とＳＣａＭ５との発現を十分に誘導した（図３
Ｃ）。しかし、外因性のサリチル酸(salicylic acid、
ＳＡ、１−５ｍＭ）や過酸化水素（Ｈ2Ｏ2、１−１０ｍ
Ｍ）を適用すると、２４時間が経過してもＳＣａＭ４と
ＳＣａＭ５遺伝子発現は誘導されなかった（データは示
していない）。過酸化水素生成システム［グルコースと
グルコースオキシダーゼ（Levine, A. et al., 1994, C
ell 79:583-593）］と過酸化物生成システム［キサンチ
ンとキサンチンオキシダーゼ（Jabs, T. et al., Scien
ce 273:1853-1856）］ともＳＣａＭ４とＳＣａＭ５遺伝
子発現の誘導ができなかった。２個の関連していないシ
グナル分子であるジャスモン酸(jasmonic acid、JA)（B
ergey, D.R. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 93:12053-12508）とアブシシン酸(Abscisic acid、A
BA)（Giraudat, J. et al., 1994, Plant Mol. Biol. 2
6:1557-1558）ともＣＳａＭ４とＳＣａＭ５を誘導する
ことができなかった。これらの結果は、誘発によるＳＣ
ａＭ４とＳＣａＭ５遺伝子の転写活性化が、タンパク質
の合成が必要でない、非常に速い過程であり、反応性酸
素種(reactiveoxygen species、ＲＯＳ)とＳＡとの合成
と蓄積より先に発生するか、または別の疾病抵抗性シグ
ナル経路に属するということを示す。また、それらの活
性化は特異的であった；傷（ＪＡ）と欠乏（ＡＢＡ）の
ような別のストレス反応と関連したシグナル化合物等
は、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを誘導しなかった。しか
し、それらの誘導は、細胞内のＣａ2+濃度の増加により
媒介されるものと考えられる。
【００３２】植物防御反応で一時的に誘導された、分岐
したＳＣａＭアイソフォームの生物学的な機能を調査す
るために、構成カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプ
ロモーターの制御下で、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを持
続的に発現するトランスジェニックタバコ植物を構築し
た。ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５を発現するトランスジェニ
ック植物をノーザン分析により選択して免疫ブロット分
析法で確認した（Lee,S.H. et al., 1995, J. Biol. Ch
em. 270:21806-21812）。興味のあることは、トランス
ジェニックＳＣａＭ４やＳＣａＭ５植物は、たまにそれ
らの葉から疾病のような壊死性斑点を自然に生成した
（図４Ａ，図４Ｂ）。このような病巣もしくは損傷は、
初期にはもっとも古い成熟葉で現れて、頭頂部の３−４
枚の若葉では病巣は確認されなかった。この結果は、ト
ランスジェニック植物で自発的な病巣（損傷）形成が発
生的に調節されているものであることを示唆する。同一
条件下で育ったトランスフォームされていない野生型
と、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを有しない空ベクターで
トランスフォームした対照群のトランスジェニック植物
とは、このような徴候を示さなかった。これらの病巣が
ＨＲのような病巣であるか否かを決定するために、蛍光
顕微鏡でそれらを調査した。ＨＲ様病巣は紫外線（Ｕ
Ｖ）を照射すると、容易に確認できる蛍光物質を細胞壁
に蓄積する反面（Greenberg, J.T. et al., 1994, Cell
77:551-564）、機械的な傷や結氷と解凍とにより発生
した壊死性領域は、そのような蛍光性を有しない（Mitt
ler, R. et al., 1995, Plant Cell 7:29-42）。トラン
スジェニック植物の葉は、それらの病巣に鮮明な紫外線
励起性の蛍光物質を蓄積していて、この壊死性損傷がＨ
Ｒ様病巣と似ていることを示唆している（図４Ｃ，図４
Ｄ）。
したＳＣａＭアイソフォームの生物学的な機能を調査す
るために、構成カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプ
ロモーターの制御下で、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを持
続的に発現するトランスジェニックタバコ植物を構築し
た。ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５を発現するトランスジェニ
ック植物をノーザン分析により選択して免疫ブロット分
析法で確認した（Lee,S.H. et al., 1995, J. Biol. Ch
em. 270:21806-21812）。興味のあることは、トランス
ジェニックＳＣａＭ４やＳＣａＭ５植物は、たまにそれ
らの葉から疾病のような壊死性斑点を自然に生成した
（図４Ａ，図４Ｂ）。このような病巣もしくは損傷は、
初期にはもっとも古い成熟葉で現れて、頭頂部の３−４
枚の若葉では病巣は確認されなかった。この結果は、ト
ランスジェニック植物で自発的な病巣（損傷）形成が発
生的に調節されているものであることを示唆する。同一
条件下で育ったトランスフォームされていない野生型
と、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを有しない空ベクターで
トランスフォームした対照群のトランスジェニック植物
とは、このような徴候を示さなかった。これらの病巣が
ＨＲのような病巣であるか否かを決定するために、蛍光
顕微鏡でそれらを調査した。ＨＲ様病巣は紫外線（Ｕ
Ｖ）を照射すると、容易に確認できる蛍光物質を細胞壁
に蓄積する反面（Greenberg, J.T. et al., 1994, Cell
77:551-564）、機械的な傷や結氷と解凍とにより発生
した壊死性領域は、そのような蛍光性を有しない（Mitt
ler, R. et al., 1995, Plant Cell 7:29-42）。トラン
スジェニック植物の葉は、それらの病巣に鮮明な紫外線
励起性の蛍光物質を蓄積していて、この壊死性損傷がＨ
Ｒ様病巣と似ていることを示唆している（図４Ｃ，図４
Ｄ）。
【００３３】この分岐したＣａＭアイソフォームである
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の構成的（持続的）な発現は、
抗−ＳＣａＭ１抗体により認識されるもので、非常に保
存された細胞内のタバコＣａＭのレベルには影響を及ぼ
さなかった（図５Ａ）。抗−ＳＣａＭ１抗体は、非常に
保存されたＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ１、Ｓ
ＣａＭ２とＳＣａＭ３タンパク質を等しく認識したが、
分岐したＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とは認識できなかっ
た。抗−ＳＣａＭ４抗体は、ＳＣａＭ５と交差反応する
が、非常に保存されたＳＣａＭアイソフォームとは交差
反応しなかった（１６、データは示さない）。このトラ
ンスジェニック植物におけるＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の
量は、水溶性の全葉タンパク質１ｍｇ当たり０．３−
０．５μｇであると推定され、これは大豆細胞から真菌
性誘発体により誘発されたＳＣａＭ４／５タンパク質の
最高レベルと類似する（図３Ｂ参照）。また、トランス
ジェニック植物でＳＣａＭ４とＳＣａＭ５のレベルは、
非常に保存されたＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ
１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のタンパク質のレベルより
多くはなかった。従って、このようなトランスジェニッ
ク植物の表現型は、異常な細胞反応を引き起こす可能性
があるＳＣａＭ４やＳＣａＭ５の高いレベルの過剰発現
のためでなく（Durner, J. et al., 1997, Trends Plan
t Sci. 2:266-274）、むしろ病原体の攻撃によりこれら
の遺伝子が活性化された後の細胞反応と類似した、分岐
したこれらのＣａＭアイソフォームのレベルによるもの
であると考えられる。
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の構成的（持続的）な発現は、
抗−ＳＣａＭ１抗体により認識されるもので、非常に保
存された細胞内のタバコＣａＭのレベルには影響を及ぼ
さなかった（図５Ａ）。抗−ＳＣａＭ１抗体は、非常に
保存されたＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ１、Ｓ
ＣａＭ２とＳＣａＭ３タンパク質を等しく認識したが、
分岐したＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とは認識できなかっ
た。抗−ＳＣａＭ４抗体は、ＳＣａＭ５と交差反応する
が、非常に保存されたＳＣａＭアイソフォームとは交差
反応しなかった（１６、データは示さない）。このトラ
ンスジェニック植物におけるＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の
量は、水溶性の全葉タンパク質１ｍｇ当たり０．３−
０．５μｇであると推定され、これは大豆細胞から真菌
性誘発体により誘発されたＳＣａＭ４／５タンパク質の
最高レベルと類似する（図３Ｂ参照）。また、トランス
ジェニック植物でＳＣａＭ４とＳＣａＭ５のレベルは、
非常に保存されたＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ
１、ＳＣａＭ２とＳＣａＭ３のタンパク質のレベルより
多くはなかった。従って、このようなトランスジェニッ
ク植物の表現型は、異常な細胞反応を引き起こす可能性
があるＳＣａＭ４やＳＣａＭ５の高いレベルの過剰発現
のためでなく（Durner, J. et al., 1997, Trends Plan
t Sci. 2:266-274）、むしろ病原体の攻撃によりこれら
の遺伝子が活性化された後の細胞反応と類似した、分岐
したこれらのＣａＭアイソフォームのレベルによるもの
であると考えられる。
【００３４】突然変異体を形成する自発的な損傷（病
巣）は、時には発病関連（pathogenesis-related）（Ｐ
Ｒ）タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加と、病
原体に対する抵抗性の増加とを表す（Durner, J. et a
l., Trends Plant Sci. 2:266-274）。興味のあること
に、病原体がない時、トランスジェニックＳＣａＭ４と
ＳＣａＭ５植物は、ＳＡＲの進展の間に正常に活性化さ
れるタバコ内の９個のＳＡＲマーカー遺伝子のすべてを
高レベルで発現した（Ryals, J.A. et al., 1996,Plant
Cell 8:1809-1819）（図５Ｂ）。野生型植物と同一条
件下で生育したＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを有しない対
照群の空ベクターでトランスフォームした植物は、これ
らの遺伝子を発現しなかった。ＳＡＲ−関連遺伝子は、
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニック植物との成
長と発達の間、構成的に発現され、病巣が進展しない無
菌的に育った幼い苗木の葉でも明らかに発現した（図５
Ｃ）。従って、トランスジェニックＳＣａＭ４とＳＣａ
Ｍ５植物とにおけるＰＲ遺伝子の発現は病巣の形成とは
独立であり、これはトランスジェニック植物でＰＲ遺伝
子発現が細胞死滅の結果でないということを示唆してい
る。
巣）は、時には発病関連（pathogenesis-related）（Ｐ
Ｒ）タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加と、病
原体に対する抵抗性の増加とを表す（Durner, J. et a
l., Trends Plant Sci. 2:266-274）。興味のあること
に、病原体がない時、トランスジェニックＳＣａＭ４と
ＳＣａＭ５植物は、ＳＡＲの進展の間に正常に活性化さ
れるタバコ内の９個のＳＡＲマーカー遺伝子のすべてを
高レベルで発現した（Ryals, J.A. et al., 1996,Plant
Cell 8:1809-1819）（図５Ｂ）。野生型植物と同一条
件下で生育したＳＣａＭ４とＳＣａＭ５とを有しない対
照群の空ベクターでトランスフォームした植物は、これ
らの遺伝子を発現しなかった。ＳＡＲ−関連遺伝子は、
ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニック植物との成
長と発達の間、構成的に発現され、病巣が進展しない無
菌的に育った幼い苗木の葉でも明らかに発現した（図５
Ｃ）。従って、トランスジェニックＳＣａＭ４とＳＣａ
Ｍ５植物とにおけるＰＲ遺伝子の発現は病巣の形成とは
独立であり、これはトランスジェニック植物でＰＲ遺伝
子発現が細胞死滅の結果でないということを示唆してい
る。
【００３５】ＳＡは、ある植物防御反応の活性化に必要
な自然のシグナル分子として知られている（Durner, J.
et al., Trends Plant Sci. 2:266-274）。タバコの葉
に外因性ＳＡを適用すると、ＰＲタンパク質合成のよう
に病原体誘発性ＳＡＲ反応と類似した反応が起こる。ま
た、いろいろの病巣部を真似たような突然変異体におけ
る内因性のＳＡのレベルは、病原体の感染のない野生型
植物のＳＡのレベルより実質的に高い（Ryals, J.A. et
al., 1996, Plant Cell 8:1809-1819）。またＳＡ分解
酵素をコードするバクテリアのｎａｈＧ遺伝子を持続的
に発現するトランスジェニック植物は、ＳＡＲを誘導す
る能力が劣る（Delaney, T.P. et al.,1994, Science 2
66:1247-1250）。従って、我々はＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５トランスジェニック植物における疾病抵抗反応が内因
性のＳＡレベルの向上によるものであるか否かを調査し
た。意外にも、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニ
ック植物におけるＳＡのレベルは、野生型植物のＳＡの
レベルと類似していた（表１）。
な自然のシグナル分子として知られている（Durner, J.
et al., Trends Plant Sci. 2:266-274）。タバコの葉
に外因性ＳＡを適用すると、ＰＲタンパク質合成のよう
に病原体誘発性ＳＡＲ反応と類似した反応が起こる。ま
た、いろいろの病巣部を真似たような突然変異体におけ
る内因性のＳＡのレベルは、病原体の感染のない野生型
植物のＳＡのレベルより実質的に高い（Ryals, J.A. et
al., 1996, Plant Cell 8:1809-1819）。またＳＡ分解
酵素をコードするバクテリアのｎａｈＧ遺伝子を持続的
に発現するトランスジェニック植物は、ＳＡＲを誘導す
る能力が劣る（Delaney, T.P. et al.,1994, Science 2
66:1247-1250）。従って、我々はＳＣａＭ４やＳＣａＭ
５トランスジェニック植物における疾病抵抗反応が内因
性のＳＡレベルの向上によるものであるか否かを調査し
た。意外にも、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニ
ック植物におけるＳＡのレベルは、野生型植物のＳＡの
レベルと類似していた（表１）。
【００３６】下記の表１でＳＡのレベル（１ｇ重当たり
のμｇ）は、前記の説明の通り、成熟した植物の頂部か
ら４−５番目の中間葉で測定した。データは５個の別個
のトランスジェニック植物から２回測定して平均したも
のである。結合したＳＡのレベルは、感染していない植
物では検出限界以下であった。タバコモザイクウイルス
（ＴＭＶ）で感染した植物を用いて、内因性のＳＡレベ
ルを接種後１０日目に測定した。
のμｇ）は、前記の説明の通り、成熟した植物の頂部か
ら４−５番目の中間葉で測定した。データは５個の別個
のトランスジェニック植物から２回測定して平均したも
のである。結合したＳＡのレベルは、感染していない植
物では検出限界以下であった。タバコモザイクウイルス
（ＴＭＶ）で感染した植物を用いて、内因性のＳＡレベ
ルを接種後１０日目に測定した。
【００３７】
【表１】 また、タバコモザイクウイルスを感染させた結果、トラ
ンスジェニック植物と野生型植物とにおけるＳＡのレベ
ルが同じように増加して、トランスジェニック植物にお
けるＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の発現が内因性のＳＡ蓄積
に影響を及ぼさなかったことを示した。この観察と一致
して、ｎａｈＧ遺伝子の存在と発現は、ＳＣａＭ４とＳ
ＣａＭ５トランスジェニック植物でＰＲ遺伝子が持続的
に発現することを抑制しなかった（図５Ｄ）。この結果
は、ＳＡがＳＣａＭ４やＳＣａＭ５により媒介された植
物の疾病抵抗反応に関与しないということを強力に示し
ている。
ンスジェニック植物と野生型植物とにおけるＳＡのレベ
ルが同じように増加して、トランスジェニック植物にお
けるＳＣａＭ４とＳＣａＭ５の発現が内因性のＳＡ蓄積
に影響を及ぼさなかったことを示した。この観察と一致
して、ｎａｈＧ遺伝子の存在と発現は、ＳＣａＭ４とＳ
ＣａＭ５トランスジェニック植物でＰＲ遺伝子が持続的
に発現することを抑制しなかった（図５Ｄ）。この結果
は、ＳＡがＳＣａＭ４やＳＣａＭ５により媒介された植
物の疾病抵抗反応に関与しないということを強力に示し
ている。
【００３８】最後に、我々はトランスジェニックＳＣａ
Ｍ４とＳＣａＭ５植物が、病原体に対して抵抗性が変化
するか否かについて評価した。我々は、トランスジェニ
ック植物と野生植物に卵菌類（oomycete）の真菌性病原
体であるフィトフトラ・パラシチカ変種のニコチアネ(P
hytophthora parasitica var.nicotianae)［黒枯病(bla
ck shank disease)の病因原］を接種した。フィトフト
ラ・パラシチカの接種後５日までには、野生型の植物で
は疾病徴候が現れ始めたが、トランスジェニック植物で
は現れなかった。接種後７日までには野生型の植物は、
葉が萎れ、幹が腐る等の深刻な疾病徴候を有し、接種後
８日には枯れてしまった。しかし、トランスジェニック
植物は、認めうるほどの疾病徴候がなく健全に生存した
（図６Ａ）。真菌が感染した野生型植物の葉は、癒傷組
織(callose)がほとんどなく、真菌の菌糸(hyphae)が中
断することなく広がっていた（図６Ｂ）。それに対し
て、接種されたトランスジェニック植物では、かかる真
菌の菌糸の成長がなく、その代わりに真菌性浸透部位を
取り囲む細胞で、自己蛍光物質の沈着及び癒傷組織の沈
着と関連した明るい蛍光が現れた（図６Ｃ）。これはＨ
Ｒの特徴である。興味のあることに、フィトフトラ・パ
ラシチカ変種のニコチアネは、親のトランスフォームさ
れなかったキサンチ−ｎｃ(Xanthi-nc)タバコ栽培種に
対する病原性の病原体であるが、通常はＨＲを発生させ
ない。トランスジェニック植物は、病原性のバクテリア
性病原体であるシュードモナス・シリンガエ変種のタバ
ッシ(Peudomonas syringae pv.tabacci,Ｐｓｔ)に対し
ても高められた抵抗性を示した。それらのトランスジェ
ニック植物は疾病徴候の進展を成功裏に遮断し、Ｐｓｔ
のトランスジェニック植物内でのＰｓｔの増殖は、野生
型植物における増殖と比較して１０倍以上に遅滞した
（図６Ｄ）。またトランスジェニックＳＣａＭ４とＳＣ
ａＭ５植物は、病原性のウイルス性病原体であるＴＭＶ
に対して高められた抵抗性を示した。トランスジェニッ
ク植物では、野生型植物に比較して約１２時間ほど速く
ＴＭＶで誘導されるＨＲ病巣が進展した。また、トラン
スジェニック植物では更に小さく（約５倍）、更に少な
いＴＭＶで誘導される病巣を有しており（図６Ｅ）、こ
れはＴＭＶに対する高められた抵抗性と関連された２つ
の特徴である。
Ｍ４とＳＣａＭ５植物が、病原体に対して抵抗性が変化
するか否かについて評価した。我々は、トランスジェニ
ック植物と野生植物に卵菌類（oomycete）の真菌性病原
体であるフィトフトラ・パラシチカ変種のニコチアネ(P
hytophthora parasitica var.nicotianae)［黒枯病(bla
ck shank disease)の病因原］を接種した。フィトフト
ラ・パラシチカの接種後５日までには、野生型の植物で
は疾病徴候が現れ始めたが、トランスジェニック植物で
は現れなかった。接種後７日までには野生型の植物は、
葉が萎れ、幹が腐る等の深刻な疾病徴候を有し、接種後
８日には枯れてしまった。しかし、トランスジェニック
植物は、認めうるほどの疾病徴候がなく健全に生存した
（図６Ａ）。真菌が感染した野生型植物の葉は、癒傷組
織(callose)がほとんどなく、真菌の菌糸(hyphae)が中
断することなく広がっていた（図６Ｂ）。それに対し
て、接種されたトランスジェニック植物では、かかる真
菌の菌糸の成長がなく、その代わりに真菌性浸透部位を
取り囲む細胞で、自己蛍光物質の沈着及び癒傷組織の沈
着と関連した明るい蛍光が現れた（図６Ｃ）。これはＨ
Ｒの特徴である。興味のあることに、フィトフトラ・パ
ラシチカ変種のニコチアネは、親のトランスフォームさ
れなかったキサンチ−ｎｃ(Xanthi-nc)タバコ栽培種に
対する病原性の病原体であるが、通常はＨＲを発生させ
ない。トランスジェニック植物は、病原性のバクテリア
性病原体であるシュードモナス・シリンガエ変種のタバ
ッシ(Peudomonas syringae pv.tabacci,Ｐｓｔ)に対し
ても高められた抵抗性を示した。それらのトランスジェ
ニック植物は疾病徴候の進展を成功裏に遮断し、Ｐｓｔ
のトランスジェニック植物内でのＰｓｔの増殖は、野生
型植物における増殖と比較して１０倍以上に遅滞した
（図６Ｄ）。またトランスジェニックＳＣａＭ４とＳＣ
ａＭ５植物は、病原性のウイルス性病原体であるＴＭＶ
に対して高められた抵抗性を示した。トランスジェニッ
ク植物では、野生型植物に比較して約１２時間ほど速く
ＴＭＶで誘導されるＨＲ病巣が進展した。また、トラン
スジェニック植物では更に小さく（約５倍）、更に少な
いＴＭＶで誘導される病巣を有しており（図６Ｅ）、こ
れはＴＭＶに対する高められた抵抗性と関連された２つ
の特徴である。
【００３９】本発明では、植物防御シグナルで主なＣａ
2+シグナルトランデューサーであるＣａＭの主な役割を
証明することに目的があり、その結果、分化したＣａＭ
アイソフォームが病原体誘導性Ｃａ2+シグナルに対する
シグナル収容体と伝達体との役割を担っていることが分
かる。分化したＣａＭアイソフォームは、ある外部刺激
が直ちに、細胞反応を誘導する遺伝子の発現を活性化す
る動物の系での、ｆｏｓやｊｕｎのような即応的な初期
遺伝子と類似している（Morgan, J.I. およびCurran,
T. 1989, Trends Neurosci. 12:459-462）。従って、分
化したＣａＭアイソフォームは、植物防御反応の新規な
誘導性構成要素の中の代表的なものである。
2+シグナルトランデューサーであるＣａＭの主な役割を
証明することに目的があり、その結果、分化したＣａＭ
アイソフォームが病原体誘導性Ｃａ2+シグナルに対する
シグナル収容体と伝達体との役割を担っていることが分
かる。分化したＣａＭアイソフォームは、ある外部刺激
が直ちに、細胞反応を誘導する遺伝子の発現を活性化す
る動物の系での、ｆｏｓやｊｕｎのような即応的な初期
遺伝子と類似している（Morgan, J.I. およびCurran,
T. 1989, Trends Neurosci. 12:459-462）。従って、分
化したＣａＭアイソフォームは、植物防御反応の新規な
誘導性構成要素の中の代表的なものである。
【００４０】かかる分化したＣａＭアイソフォームを持
続的に発現するトランスジェニック植物は、自然に生じ
る、病巣部を真似た突然変異体（lesion-mimic mutan
t）の表現形と類似した表現形を有するが、そこには種
々の注目するべき差異がある。１番目は、細胞死とＰＲ
遺伝子発現との間の因果関係に関する。ＰＲ遺伝子の発
現はｌｓｄとａｃｄの突然変異体における細胞死と密接
に関連するが、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニ
ック植物における細胞死とは独立的である。２番目の主
な差異はＳＡ依存性である。病巣部が似たほとんどの突
然変異体におけるＳＡレベルは、通常の植物におけるＳ
Ａレベルより実質的にずっと高い（Dangl,J.L. et al.,
1996, Plant Cell 8:1793-1807）。その反対にＳＣａ
Ｍ４とＳＣａＭ５トランスジェニック植物で、疾病抵抗
反応は内因性のＳＡレベルを同時に増加させることなく
活性化された。またｎａｈＧ遺伝子の共発現によるこれ
らのトランスジェニック植物でＳＡを除去してもＰＲ遺
伝子の持続的は発現は遮断されなかった。かかる観察
は、分化したＣａＭアイソフォームがＳＡ−非依存性経
路を介して植物の疾病抵抗反応を活性化することを強力
に示す。
続的に発現するトランスジェニック植物は、自然に生じ
る、病巣部を真似た突然変異体（lesion-mimic mutan
t）の表現形と類似した表現形を有するが、そこには種
々の注目するべき差異がある。１番目は、細胞死とＰＲ
遺伝子発現との間の因果関係に関する。ＰＲ遺伝子の発
現はｌｓｄとａｃｄの突然変異体における細胞死と密接
に関連するが、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジェニ
ック植物における細胞死とは独立的である。２番目の主
な差異はＳＡ依存性である。病巣部が似たほとんどの突
然変異体におけるＳＡレベルは、通常の植物におけるＳ
Ａレベルより実質的にずっと高い（Dangl,J.L. et al.,
1996, Plant Cell 8:1793-1807）。その反対にＳＣａ
Ｍ４とＳＣａＭ５トランスジェニック植物で、疾病抵抗
反応は内因性のＳＡレベルを同時に増加させることなく
活性化された。またｎａｈＧ遺伝子の共発現によるこれ
らのトランスジェニック植物でＳＡを除去してもＰＲ遺
伝子の持続的は発現は遮断されなかった。かかる観察
は、分化したＣａＭアイソフォームがＳＡ−非依存性経
路を介して植物の疾病抵抗反応を活性化することを強力
に示す。
【００４１】本発明は、植物ＣａＭアイソフォーム間の
機能的な差異に対する最初のインビボにおける証拠を提
供する。分化したＣａＭアイソフォームのみが病原体に
より誘導され、トランスジェニック植物で防御反応の引
き金を引くことができる反面、ＳＣａＭ１とやＣａＭ２
のような他の非常に保存されたＣａＭアイソフォームは
かかる特性を有していなかった（データは示していな
い）。分化したＣａＭアイソフォームは、ＮＡＤキナー
ゼを活性化できないので（Lee, S.H. et al., 1997, J.
Biol. Chem. 272:9252-9259）、ＲＯＳ産生でＣａ2+／
ＣａＭの経路は非常に保存されたＣａＭアイソフォーム
により媒介されるものと考えられる。この観察結果は、
分岐したＣａＭアイソフォームが予定された細胞死と防
御遺伝子の発現とを活性化する一方、非常に保存された
ＣａＭアイソフォームがＲＯＳの増加を媒介するとい
う、病原体に対する植物防御反応おけるＣａＭアイソフ
ォームの協奏的な役割に関するモデルを支持するもので
ある。
機能的な差異に対する最初のインビボにおける証拠を提
供する。分化したＣａＭアイソフォームのみが病原体に
より誘導され、トランスジェニック植物で防御反応の引
き金を引くことができる反面、ＳＣａＭ１とやＣａＭ２
のような他の非常に保存されたＣａＭアイソフォームは
かかる特性を有していなかった（データは示していな
い）。分化したＣａＭアイソフォームは、ＮＡＤキナー
ゼを活性化できないので（Lee, S.H. et al., 1997, J.
Biol. Chem. 272:9252-9259）、ＲＯＳ産生でＣａ2+／
ＣａＭの経路は非常に保存されたＣａＭアイソフォーム
により媒介されるものと考えられる。この観察結果は、
分岐したＣａＭアイソフォームが予定された細胞死と防
御遺伝子の発現とを活性化する一方、非常に保存された
ＣａＭアイソフォームがＲＯＳの増加を媒介するとい
う、病原体に対する植物防御反応おけるＣａＭアイソフ
ォームの協奏的な役割に関するモデルを支持するもので
ある。
【００４２】数種の他の形質転換遺伝子を持続的に発現
するトランスジェニック植物は、病巣部が似た表現形
と、変化した疾病抵抗性とを有するものであった。この
遺伝子には、ハロバクテリウム（Halobacterium）のオ
プシン(opsin)遺伝子、突然変異ユビキチン(mutant ubi
quitine)ｕｂＲ４８遺伝子、コレラ毒素サブユニットＡ
１(cholera toxin subunit A1)遺伝子及び酵母のインベ
ルターゼ(invertase)が含まれる（Beffa, R. et al., 1
995, EMBO J. 14:5753-5761）。かかるトランスジェニ
ック植物は内因性のＳＡレベルを増加し、これは、それ
らの変化した疾病抵抗性反応がかかる形質転換遺伝子に
より誘導された代謝的なストレスに属するものと見なし
得るＳＡ蓄積の結果であることを示す（Durner, J. et
al., 1997,Trends Plant Sci. 2:266-274）。従って、
この遺伝子が植物防御反応経路の真正な構成要素である
か否かは明確でない。従って、分化したＣａＭアイソフ
ォームは、植物防御シグナルの中で、最初の「自然的
な」病原体誘導性の成分の１つであり、それらの持続的
発現が高められた疾病抵抗性を導くものであるというこ
とがわかる。本発明は、植物の疾病抵抗性を誘導する経
路に対する我々の理解の増進させるだけでなく、広範囲
の病原体に対して抵抗性を有する遺伝的に操作された新
しい植物を提供するものである。
するトランスジェニック植物は、病巣部が似た表現形
と、変化した疾病抵抗性とを有するものであった。この
遺伝子には、ハロバクテリウム（Halobacterium）のオ
プシン(opsin)遺伝子、突然変異ユビキチン(mutant ubi
quitine)ｕｂＲ４８遺伝子、コレラ毒素サブユニットＡ
１(cholera toxin subunit A1)遺伝子及び酵母のインベ
ルターゼ(invertase)が含まれる（Beffa, R. et al., 1
995, EMBO J. 14:5753-5761）。かかるトランスジェニ
ック植物は内因性のＳＡレベルを増加し、これは、それ
らの変化した疾病抵抗性反応がかかる形質転換遺伝子に
より誘導された代謝的なストレスに属するものと見なし
得るＳＡ蓄積の結果であることを示す（Durner, J. et
al., 1997,Trends Plant Sci. 2:266-274）。従って、
この遺伝子が植物防御反応経路の真正な構成要素である
か否かは明確でない。従って、分化したＣａＭアイソフ
ォームは、植物防御シグナルの中で、最初の「自然的
な」病原体誘導性の成分の１つであり、それらの持続的
発現が高められた疾病抵抗性を導くものであるというこ
とがわかる。本発明は、植物の疾病抵抗性を誘導する経
路に対する我々の理解の増進させるだけでなく、広範囲
の病原体に対して抵抗性を有する遺伝的に操作された新
しい植物を提供するものである。
【００４３】以下の実施例を通して本発明をより詳細に
説明する。しかし、下記の実施例等は本発明を例示する
もので、本発明の範囲を限定するものではない。
説明する。しかし、下記の実施例等は本発明を例示する
もので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
【実施例】下記において説明するＤＮＡ組換え技術の手
法は、当該技術分野において公知であり日常的に適用さ
れるものである。この技術と多様な別の技術は、「分子
クローニング−実験マニュアル(Sambrook et al.,著、1
989）」に従って一般的に行われる。すべての一般的な
引用文献はこの著書を介して提供される。ここに含まれ
たすべての情報は、引用により明細書に組み込まれる。
法は、当該技術分野において公知であり日常的に適用さ
れるものである。この技術と多様な別の技術は、「分子
クローニング−実験マニュアル(Sambrook et al.,著、1
989）」に従って一般的に行われる。すべての一般的な
引用文献はこの著書を介して提供される。ここに含まれ
たすべての情報は、引用により明細書に組み込まれる。
【００４５】実施例１−大豆からカルモジュリンｃＤＮ
Ａの分離 １．大豆からＳＣａＭ４ｃＤＮＡクローンの分離 ＳＣａＭ ｃＤＮＡクローンを分離するために、４日齢
の苗木の半−頂部（half-apical region）および半−生
長部（half-elongating region）からのポリ（Ａ）+Ｒ
ＮＡで構成されたストラタジーン(Stratagene)社のλＺ
ＡＰ大豆ｃＤＮＡライブラリーを用いた。ライブラリー
スクリーニングは、アマーシャム(Amersham)社のＥＣＬ
遺伝子検出システムを用い、製造者のマニュアルに従い
行った。コメのゲノムカルモジュリンクローンであるｃ
ａｍ−２をプローブＤＮＡとして用いた。約３５，００
０個のファージを大腸菌ＸＬ１−ブルー(E.coli XL1-Bl
ue)上にプレートし、アマーシャム社のハイボンド(Hybo
nd)Ｎ+ナイロン膜に移した。移した膜を、０．５Ｍ水酸
化ナトリウム水溶液、１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
５分間浸けて変性した。次いで、該膜を室温で０．５Ｍ
のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液に３分ずつ２回浸けて中性にした。該膜を
０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に２分間浸けてアルカ
リ固定した。該膜を０．５Ｍ塩化ナトリウムと５％の遮
断剤(blocking agent)とを含むハイブリダイゼーション
用緩衝溶液により３７℃で２時間プレハイブリダイゼー
ションを行った。それから該膜を穏やかに振とうしなが
ら、３７℃で６時間にかけて西洋ワサビペルオキシダー
ゼ(horseradish peroxidase)によりラベルされたＤＮＡ
プローブでハイブリダイゼーションした。ハイブリダイ
ゼーション後の洗浄は、６Ｍ尿素、０．４×ＳＳＣ、
０．５％のＳＤＳにより３７℃で２０分間行い、その
後、２×ＳＳＣを用い、室温で５分間、２回洗浄した。
その後、該膜を検出試薬Ａ、Ｂにより１分間かけて検出
し、次にコダック（Kodak）社のＸ−ＯＭＡＴＡＲフィ
ルムに１０分間露出した。ハイブリダイゼーションした
陽性のプラークを次のラウンドのプラークハイブリダイ
ゼーションにより更に精製した。
Ａの分離 １．大豆からＳＣａＭ４ｃＤＮＡクローンの分離 ＳＣａＭ ｃＤＮＡクローンを分離するために、４日齢
の苗木の半−頂部（half-apical region）および半−生
長部（half-elongating region）からのポリ（Ａ）+Ｒ
ＮＡで構成されたストラタジーン(Stratagene)社のλＺ
ＡＰ大豆ｃＤＮＡライブラリーを用いた。ライブラリー
スクリーニングは、アマーシャム(Amersham)社のＥＣＬ
遺伝子検出システムを用い、製造者のマニュアルに従い
行った。コメのゲノムカルモジュリンクローンであるｃ
ａｍ−２をプローブＤＮＡとして用いた。約３５，００
０個のファージを大腸菌ＸＬ１−ブルー(E.coli XL1-Bl
ue)上にプレートし、アマーシャム社のハイボンド(Hybo
nd)Ｎ+ナイロン膜に移した。移した膜を、０．５Ｍ水酸
化ナトリウム水溶液、１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
５分間浸けて変性した。次いで、該膜を室温で０．５Ｍ
のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液に３分ずつ２回浸けて中性にした。該膜を
０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に２分間浸けてアルカ
リ固定した。該膜を０．５Ｍ塩化ナトリウムと５％の遮
断剤(blocking agent)とを含むハイブリダイゼーション
用緩衝溶液により３７℃で２時間プレハイブリダイゼー
ションを行った。それから該膜を穏やかに振とうしなが
ら、３７℃で６時間にかけて西洋ワサビペルオキシダー
ゼ(horseradish peroxidase)によりラベルされたＤＮＡ
プローブでハイブリダイゼーションした。ハイブリダイ
ゼーション後の洗浄は、６Ｍ尿素、０．４×ＳＳＣ、
０．５％のＳＤＳにより３７℃で２０分間行い、その
後、２×ＳＳＣを用い、室温で５分間、２回洗浄した。
その後、該膜を検出試薬Ａ、Ｂにより１分間かけて検出
し、次にコダック（Kodak）社のＸ−ＯＭＡＴＡＲフィ
ルムに１０分間露出した。ハイブリダイゼーションした
陽性のプラークを次のラウンドのプラークハイブリダイ
ゼーションにより更に精製した。
【００４６】ｃＤＮＡ挿入体を得るために、精製された
陽性プラークをヘルパーファージＲ４０８でブルースク
リプト−ＳＫ（−）（pBluescript-SK(-)）にインビボ
で切り出した。２００μlのＸＬ１−ブルー宿主細胞
（Ｏ．Ｄ600=1.0)を、約１×１０6pfu/mlを含む２００
μlのλＺＡＰファージストック液と、１μlのＲ４０８
ヘルパーファージ（１×１０6pfu/ml）とに混合した。
該混合体を３７℃で１５分間インキュベーションした
後、５ｍｌの２×ＹＴ培地［１Ｌ当たり、バクトトリプ
トン１６g、バクト酵母抽出物１０gと塩化ナトリウム１
０gとを含有する］を添加した。振とうしながら３７℃
で３時間インキュベーションした後、混合液を７０℃で
２０分間加熱し、ヘルパーファージを不活性化させ、バ
クテリアを死滅させた。次に、該混合液を４０００gで
１０分間遠心分離して、上清液を滅菌試験管に移して４
℃で貯蔵した。このストックから、切り出されたファー
ジミドを得るために、２００μlのＸＬ−１ブルー宿主
細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)と２００μlのファージストック
とを合わせ、その後、３７℃で１５分間インキュベート
した。５０μlの混合体をＬＢ/アンピシリンプレートに
塗布し、３７℃で１２時間にかけてインキュベートし
た。回復したファージミドを含有するアンピシリン耐性
コロニーを得た。
陽性プラークをヘルパーファージＲ４０８でブルースク
リプト−ＳＫ（−）（pBluescript-SK(-)）にインビボ
で切り出した。２００μlのＸＬ１−ブルー宿主細胞
（Ｏ．Ｄ600=1.0)を、約１×１０6pfu/mlを含む２００
μlのλＺＡＰファージストック液と、１μlのＲ４０８
ヘルパーファージ（１×１０6pfu/ml）とに混合した。
該混合体を３７℃で１５分間インキュベーションした
後、５ｍｌの２×ＹＴ培地［１Ｌ当たり、バクトトリプ
トン１６g、バクト酵母抽出物１０gと塩化ナトリウム１
０gとを含有する］を添加した。振とうしながら３７℃
で３時間インキュベーションした後、混合液を７０℃で
２０分間加熱し、ヘルパーファージを不活性化させ、バ
クテリアを死滅させた。次に、該混合液を４０００gで
１０分間遠心分離して、上清液を滅菌試験管に移して４
℃で貯蔵した。このストックから、切り出されたファー
ジミドを得るために、２００μlのＸＬ−１ブルー宿主
細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)と２００μlのファージストック
とを合わせ、その後、３７℃で１５分間インキュベート
した。５０μlの混合体をＬＢ/アンピシリンプレートに
塗布し、３７℃で１２時間にかけてインキュベートし
た。回復したファージミドを含有するアンピシリン耐性
コロニーを得た。
【００４７】アプライドバイオシステム（Applied Bios
ystems）社の３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーを用い
て、アプライドバイオシステム社のＴａｑ染料プライマ
ーサイクリングシーケンシングキット(Taq Dye Primer
Cycling Sequencing Kit)で、２本鎖プラスミドＤＮＡ
に対してシーケンシング反応を行った。ＩＢＭ ＰＣで
の日立(Hitachi)社のＤＮＡＳＩＳか、またはＤＥＣス
テーション３３００/ウルトリックスシステム(DECstati
on 3300/Ultrix system)でのＧＣＧパッケージ（ジェネ
ティクス コンピュータ グループ、ウイスコンシン大
学(Genetics Computer Group, Univ. of Wisconsin））
かのいずれかを用いてヌクレオチド配列を分析した。
ystems）社の３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーを用い
て、アプライドバイオシステム社のＴａｑ染料プライマ
ーサイクリングシーケンシングキット(Taq Dye Primer
Cycling Sequencing Kit)で、２本鎖プラスミドＤＮＡ
に対してシーケンシング反応を行った。ＩＢＭ ＰＣで
の日立(Hitachi)社のＤＮＡＳＩＳか、またはＤＥＣス
テーション３３００/ウルトリックスシステム(DECstati
on 3300/Ultrix system)でのＧＣＧパッケージ（ジェネ
ティクス コンピュータ グループ、ウイスコンシン大
学(Genetics Computer Group, Univ. of Wisconsin））
かのいずれかを用いてヌクレオチド配列を分析した。
【００４８】コメのゲノムクローンであるｃａｍ２をプ
ローブとして用いて、λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングして、大豆ＣａＭをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。３．５×１０4クローン中６２個の陽性
クローンから、ＳＣａＭ１、２および３を分離して前も
って配列を確認した。非常に弱い強度の１５個のクロー
ンをランダムに選択し、２−３回スクリーニングした。
これらのクローンの部分的なヌクレオチド配列と制限酵
素地図の分析により、非常に長いｃＤＮＡのサイズと、
他のＳＣａＭと比較して異なる制限酵素地図パターンと
を有する１つのクローンを選択した。
ローブとして用いて、λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングして、大豆ＣａＭをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。３．５×１０4クローン中６２個の陽性
クローンから、ＳＣａＭ１、２および３を分離して前も
って配列を確認した。非常に弱い強度の１５個のクロー
ンをランダムに選択し、２−３回スクリーニングした。
これらのクローンの部分的なヌクレオチド配列と制限酵
素地図の分析により、非常に長いｃＤＮＡのサイズと、
他のＳＣａＭと比較して異なる制限酵素地図パターンと
を有する１つのクローンを選択した。
【００４９】最終的に選択されたクローンは全長のｃＤ
ＮＡであり、ＳＣａＭ４と命名した（配列番号１）、内
部の配列には２個のＨｉｎｄIII酵素部位と１つのＥｃ
ｏＲＩ酵素部位とがある。従って、ＨｉｎｄIII断片、
２個のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片は、ｐＢｌｕｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ（−）でサブクローニングされ、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＸｈｏＩ断片はｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（−）上で自己結合された。その後、両方向にその断片
の塩基配列を決定した。長いＨｉｎｄIII断片はＥｘｏI
II酵素を用いる削除塩基配列決定法(deletion sequenci
ng method)により塩基配列を確認した。
ＮＡであり、ＳＣａＭ４と命名した（配列番号１）、内
部の配列には２個のＨｉｎｄIII酵素部位と１つのＥｃ
ｏＲＩ酵素部位とがある。従って、ＨｉｎｄIII断片、
２個のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片は、ｐＢｌｕｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ（−）でサブクローニングされ、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＸｈｏＩ断片はｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（−）上で自己結合された。その後、両方向にその断片
の塩基配列を決定した。長いＨｉｎｄIII断片はＥｘｏI
II酵素を用いる削除塩基配列決定法(deletion sequenci
ng method)により塩基配列を確認した。
【００５０】２．大豆からＳＣａＭ５ｃＤＮＡクローン
の分離 ＳＣａＭｃＤＮＡクローンを分離するために、４日齢の
苗木の半−頂部と半−生長部からのポリ（Ａ）+ＲＮＡ
で構成されたストラタジーン(Stratagene)社のλＺＡＰ
大豆ｃＤＮＡライブラリーを用いた。ライブラリーを、
アマーシャム社のＥＣＬ遺伝子検出システムを用いて、
製造者のマニュアルに従いスクリーニングした。コメの
ゲノムカルモジュリンクローンであるｃａｍ−２をプロ
ーブＤＮＡとして用いた。約５０，０００個のファージ
を大腸菌ＫＬ１−ブルー(E.coliXL1-Blue)にプレート
し、アマーシャム社のハイボンドＮ+(Hybond N+)ナイロ
ン膜に移した。移した膜を、０．５Ｍ水酸化ナトリウム
水溶液、１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に７分間浸けて
変性した。次に該膜を室温で０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ
(Tris-HCl)（ｐＨ７．５）と１．５Ｍ塩化ナトリウム水
溶液に７分間浸けて中性の状態にした。その後、該膜
を、０．５Ｍ塩化ナトリウムと５％の遮断剤(blocking
agent)とを含むハイブリダイゼーション用緩衝液(hybri
dization buffer)により、３７℃で２時間、プレハイブ
リダイゼーションを行った。それから、該膜を穏やかに
振とうしながら、３７℃で１２時間、西洋ワサビペルオ
キシダーゼによりラベルされたＤＮＡプローブでハイブ
リダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後の洗
浄は、６Ｍの尿素、０．４×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ
により３７℃で２０分間、２回行い、ついで、３７℃で
２×ＳＳＣで５分間、２回洗浄した。ハイブリダイゼー
ションした陽性プラークを、検出試薬Ａ、Ｂを用い１分
間かけて可視化し、コダック社のＸ−ＯＭＡＴ ＡＲフ
ィルムに１０分間露出した。ハイブリダイゼーションし
た陽性プラークを、次のラウンドのプラークハイブリダ
イゼーションにより更に精製した。
の分離 ＳＣａＭｃＤＮＡクローンを分離するために、４日齢の
苗木の半−頂部と半−生長部からのポリ（Ａ）+ＲＮＡ
で構成されたストラタジーン(Stratagene)社のλＺＡＰ
大豆ｃＤＮＡライブラリーを用いた。ライブラリーを、
アマーシャム社のＥＣＬ遺伝子検出システムを用いて、
製造者のマニュアルに従いスクリーニングした。コメの
ゲノムカルモジュリンクローンであるｃａｍ−２をプロ
ーブＤＮＡとして用いた。約５０，０００個のファージ
を大腸菌ＫＬ１−ブルー(E.coliXL1-Blue)にプレート
し、アマーシャム社のハイボンドＮ+(Hybond N+)ナイロ
ン膜に移した。移した膜を、０．５Ｍ水酸化ナトリウム
水溶液、１．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に７分間浸けて
変性した。次に該膜を室温で０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ
(Tris-HCl)（ｐＨ７．５）と１．５Ｍ塩化ナトリウム水
溶液に７分間浸けて中性の状態にした。その後、該膜
を、０．５Ｍ塩化ナトリウムと５％の遮断剤(blocking
agent)とを含むハイブリダイゼーション用緩衝液(hybri
dization buffer)により、３７℃で２時間、プレハイブ
リダイゼーションを行った。それから、該膜を穏やかに
振とうしながら、３７℃で１２時間、西洋ワサビペルオ
キシダーゼによりラベルされたＤＮＡプローブでハイブ
リダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後の洗
浄は、６Ｍの尿素、０．４×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ
により３７℃で２０分間、２回行い、ついで、３７℃で
２×ＳＳＣで５分間、２回洗浄した。ハイブリダイゼー
ションした陽性プラークを、検出試薬Ａ、Ｂを用い１分
間かけて可視化し、コダック社のＸ−ＯＭＡＴ ＡＲフ
ィルムに１０分間露出した。ハイブリダイゼーションし
た陽性プラークを、次のラウンドのプラークハイブリダ
イゼーションにより更に精製した。
【００５１】ｃＤＮＡ挿入体を得るために、精製された
陽性プラークをヘルパーファージＲ４０８でｐＢｌｕｓ
ｃｒｉｐｔ-ＳＫ(-)にインビボで切り出した。２００μ
lのＸＬ１−ブルー宿主細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)を、約１
×１０6pfu/mlを含むλＺＡＰファージストック液２０
０μlと、１μlのヘルパーファージＲ４０８とに混合し
た。該混合体を３７℃で１５分間インキュベートした
後、５ｍｌの２×ＹＴ培地を添加した。振とうしながら
３７℃で３時間、インキュベートした後、該混合液を７
０℃で２０分間加熱してヘルパーファージを不活性化
し、バクテリアを死滅させた。次に、その混合液を４０
００gで１０分間遠心分離して、上清液を滅菌試験管に
移して４℃で貯蔵した。このストックから、切除された
ファージミドを得るために、２００μlのＸＬ１−ブル
ー宿主細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)と１００μlのファージス
トックとを混合した後、３７℃で２０分間インキュベー
トした。５０μlの混合体をＬＢ/アンピシリンプレート
に塗布し、３７℃で１５時間、インキュベートした。ア
ルカリ溶解ミニプレップ法(alkaline lysis minipreps)
により適切なファージミドを有するか否かについてアン
ピシリン耐性コロニーを調べた。
陽性プラークをヘルパーファージＲ４０８でｐＢｌｕｓ
ｃｒｉｐｔ-ＳＫ(-)にインビボで切り出した。２００μ
lのＸＬ１−ブルー宿主細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)を、約１
×１０6pfu/mlを含むλＺＡＰファージストック液２０
０μlと、１μlのヘルパーファージＲ４０８とに混合し
た。該混合体を３７℃で１５分間インキュベートした
後、５ｍｌの２×ＹＴ培地を添加した。振とうしながら
３７℃で３時間、インキュベートした後、該混合液を７
０℃で２０分間加熱してヘルパーファージを不活性化
し、バクテリアを死滅させた。次に、その混合液を４０
００gで１０分間遠心分離して、上清液を滅菌試験管に
移して４℃で貯蔵した。このストックから、切除された
ファージミドを得るために、２００μlのＸＬ１−ブル
ー宿主細胞（Ｏ．Ｄ600=1.0)と１００μlのファージス
トックとを混合した後、３７℃で２０分間インキュベー
トした。５０μlの混合体をＬＢ/アンピシリンプレート
に塗布し、３７℃で１５時間、インキュベートした。ア
ルカリ溶解ミニプレップ法(alkaline lysis minipreps)
により適切なファージミドを有するか否かについてアン
ピシリン耐性コロニーを調べた。
【００５２】アプライドバイオシステム社の３７３Ａ自
動ＤＮＡシーケンサーを用いて、アプライドバイオシス
テム社のＴａｑ染料プライマーサイクリングシーケンシ
ングキットで、２本鎖プラスミドＤＮＡに対して、製造
者により指定されたようにして、シーケンシング反応を
行った。ＩＢＭ ＰＣでの日立(Hitachi)社のＤＮＡＳ
ＩＳか、またはＤＥＣステーション３３００/ウルトリ
ックスシステムでのＧＣＧパッケージ(ジェネティクス
コンピュータ グループ；ウイスコンシン大学）のい
ずれかを用いてヌクレオチド配列を分析した。
動ＤＮＡシーケンサーを用いて、アプライドバイオシス
テム社のＴａｑ染料プライマーサイクリングシーケンシ
ングキットで、２本鎖プラスミドＤＮＡに対して、製造
者により指定されたようにして、シーケンシング反応を
行った。ＩＢＭ ＰＣでの日立(Hitachi)社のＤＮＡＳ
ＩＳか、またはＤＥＣステーション３３００/ウルトリ
ックスシステムでのＧＣＧパッケージ(ジェネティクス
コンピュータ グループ；ウイスコンシン大学）のい
ずれかを用いてヌクレオチド配列を分析した。
【００５３】コメのゲノムクローンであるｃａｍ２をプ
ローブとして用いて、λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングして、大豆ＣａＭをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。３．５×１０4クローン中６２個の陽性
クローンから、ＳＣａＭ１、２、３および４を分離して
前もって配列を確認した。しかし、５番目のクローンは
５′部位がトランケートされていた。全長クローンを得
るために、ライブラリーを３′非翻訳領域から作成され
た特定のプローブで再びスクリーニングした。４個のク
ローンの部分的なヌクレオチド配列と制限酵素地図の分
析とにより、トランケートされたクローンと同一なヌク
レオチド配列を有する１つのクローンを選択した。選択
したクローンは全長のｃＤＮＡであり、該クローンをＳ
ＣａＭ５と命名した（配列番号３）。内部配列には、１
つのＥｃｏＲＩ酵素部位と１つのＳａｃＩ酵素部位とが
ある。
ローブとして用いて、λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングして、大豆ＣａＭをコードするｃＤＮ
Ａを分離した。３．５×１０4クローン中６２個の陽性
クローンから、ＳＣａＭ１、２、３および４を分離して
前もって配列を確認した。しかし、５番目のクローンは
５′部位がトランケートされていた。全長クローンを得
るために、ライブラリーを３′非翻訳領域から作成され
た特定のプローブで再びスクリーニングした。４個のク
ローンの部分的なヌクレオチド配列と制限酵素地図の分
析とにより、トランケートされたクローンと同一なヌク
レオチド配列を有する１つのクローンを選択した。選択
したクローンは全長のｃＤＮＡであり、該クローンをＳ
ＣａＭ５と命名した（配列番号３）。内部配列には、１
つのＥｃｏＲＩ酵素部位と１つのＳａｃＩ酵素部位とが
ある。
【００５４】実施例２−発現ベクターの構築 １．プラスミドｐＬＥＳ９８０４の構築 タバコ植物でＳＣａＭ−４（配列番号１）を過剰に発現
させるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓサ
ブユニット（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター領域と、ア
グロバクテリウム・ノパリンシンターゼ・ターミネータ
ー(Agrobacterium nopaline synthase terminator)との
制御下に、ＳＣａＭ−４を含むバイナリーベクターを構
築した。ｐＧＡ６４３バイナリーベクター（An, G. et
al., 1988, In Plan Molecular Biology Manual Gelvi
n, S. B.およびSchilperoot, R. A.編, Kluwer Acadmi
c, Dordrecht, A3）をＨｐａＩで消化した。ＳＣａＭ−
４ｃＤＮＡはＲｓａＩで消化した。ＲｓａＩで消化した
ＳＣａＭ−４ ｃＤＮＡからの８５４ｂｐのＤＮＡ断片
を、ＨｐａＩで消化されたｐＧＡ６４３ベクターに直接
クローニングし、ｐＬＥＳ９８０４を得た。アグロバク
テリウム・チュメファシエンスＥＨＡ１０１/ｐＬＥＳ
９８０４中の前記ベクターを、ブダペスト条約に従いＫ
ＣＴＣ(Korean Collection for Type Culture)に受託番
号、ＫＣＴＣ０５４５ＢＰで寄託した。
させるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓサ
ブユニット（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター領域と、ア
グロバクテリウム・ノパリンシンターゼ・ターミネータ
ー(Agrobacterium nopaline synthase terminator)との
制御下に、ＳＣａＭ−４を含むバイナリーベクターを構
築した。ｐＧＡ６４３バイナリーベクター（An, G. et
al., 1988, In Plan Molecular Biology Manual Gelvi
n, S. B.およびSchilperoot, R. A.編, Kluwer Acadmi
c, Dordrecht, A3）をＨｐａＩで消化した。ＳＣａＭ−
４ｃＤＮＡはＲｓａＩで消化した。ＲｓａＩで消化した
ＳＣａＭ−４ ｃＤＮＡからの８５４ｂｐのＤＮＡ断片
を、ＨｐａＩで消化されたｐＧＡ６４３ベクターに直接
クローニングし、ｐＬＥＳ９８０４を得た。アグロバク
テリウム・チュメファシエンスＥＨＡ１０１/ｐＬＥＳ
９８０４中の前記ベクターを、ブダペスト条約に従いＫ
ＣＴＣ(Korean Collection for Type Culture)に受託番
号、ＫＣＴＣ０５４５ＢＰで寄託した。
【００５５】２．プラスミドｐＬＥＳ９８０５の構築 タバコ植物でＳＣａＭ−５（配列番号３）を過剰に発現
させるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓサ
ブユニット（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター領域とアグ
ロバクテリウム・ノパリンシンターゼ・ターミネーター
との制御下に、ＳＣａＭ−５を含むバイナリーベクター
を構築した。ｐＧＡ６４３バイナリーベクターをＨｐａ
Ｉで消化した。ＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩで
消化した。ＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡからの断片（５６２
ｂｐ）の両末端を、適切なクレノウフラグメントで平滑
末端(blunt end)に転換し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより
連結し、バイナリーベクター中でクローン化して、ｐＬ
ＥＳ９８０５を得た。アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＥＨＡ１０１/ｐＬＥＳ９８０５中の前記ベク
ターを、ブダペスト条約に従い、ＫＣＴＣ(Korean Coll
ection for Type Culture)に受託番号、ＫＣＴＣ ０５
４６ＢＰで寄託した。
させるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓサ
ブユニット（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター領域とアグ
ロバクテリウム・ノパリンシンターゼ・ターミネーター
との制御下に、ＳＣａＭ−５を含むバイナリーベクター
を構築した。ｐＧＡ６４３バイナリーベクターをＨｐａ
Ｉで消化した。ＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩで
消化した。ＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡからの断片（５６２
ｂｐ）の両末端を、適切なクレノウフラグメントで平滑
末端(blunt end)に転換し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより
連結し、バイナリーベクター中でクローン化して、ｐＬ
ＥＳ９８０５を得た。アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＥＨＡ１０１/ｐＬＥＳ９８０５中の前記ベク
ターを、ブダペスト条約に従い、ＫＣＴＣ(Korean Coll
ection for Type Culture)に受託番号、ＫＣＴＣ ０５
４６ＢＰで寄託した。
【００５６】実施例３−トランスジェニックタバコ植物
の産出 ＳＣａＭ−４を発現するトランスジェニックタバコ植物
は、アグロバクテリウムにより媒介された葉花盤(leaf
disc)トランスフォーメーションにより作出された（Hor
sch, R. B. et al., 1988, In Plant Molecular Biolog
y Mannual, Gelvin, S. B. およびSchilperoort, R. A.
編, Kluwer Academic, Dordrecht, A5）。タバコ葉花盤
を、８週齢の若いタバコ植物から作り、ＭＳ塩、３％の
スクロース、２mg/lのＮＡＡ、０．５mg/lのＢＡおよび
０．０５％のＭＥＳとを含む溶液に５分間漬けた。ｐＬ
ＥＳ９８０４の構築体を含むアグロバクテリウム・チュ
メファシエンスＥＨＡ１０１を葉花盤に２日間接種し
た。滅菌したＭＳ基本培地(MS basal medium)で洗浄し
た後、葉花盤を選択培地[０．５mg/l ＢＡ、ＭＳ塩、
３％のスクロース、１００mg/lのカナマイシン、２５０
mg/lのシュドペン(Sudopen)と０．８％の寒天(agar)と
を含む]上に移した。一ヶ月後、再生された発芽体(shoo
t)を、ＭＳ塩、３％スクロース、１００mg/lのカナマイ
シン、２５０mg/lのシュドペンと０．８％の寒天とを含
む根形成培地(rooting medium)に移した。根のある植物
をバーミキュライト(vermiculite)、パーライト(perlit
e)及びピートモス(peat moss)とを１：１：１の比率で
混合した苗床に移して、成長チャンバーで１６時間の昼
の長さを周期として２５℃で成長させた。３２個の再生
植物が成長した。その中で１３個の植物はＳＣａＭ−４
転写体とＳＣａＭ−４タンパク質とを発現した。
の産出 ＳＣａＭ−４を発現するトランスジェニックタバコ植物
は、アグロバクテリウムにより媒介された葉花盤(leaf
disc)トランスフォーメーションにより作出された（Hor
sch, R. B. et al., 1988, In Plant Molecular Biolog
y Mannual, Gelvin, S. B. およびSchilperoort, R. A.
編, Kluwer Academic, Dordrecht, A5）。タバコ葉花盤
を、８週齢の若いタバコ植物から作り、ＭＳ塩、３％の
スクロース、２mg/lのＮＡＡ、０．５mg/lのＢＡおよび
０．０５％のＭＥＳとを含む溶液に５分間漬けた。ｐＬ
ＥＳ９８０４の構築体を含むアグロバクテリウム・チュ
メファシエンスＥＨＡ１０１を葉花盤に２日間接種し
た。滅菌したＭＳ基本培地(MS basal medium)で洗浄し
た後、葉花盤を選択培地[０．５mg/l ＢＡ、ＭＳ塩、
３％のスクロース、１００mg/lのカナマイシン、２５０
mg/lのシュドペン(Sudopen)と０．８％の寒天(agar)と
を含む]上に移した。一ヶ月後、再生された発芽体(shoo
t)を、ＭＳ塩、３％スクロース、１００mg/lのカナマイ
シン、２５０mg/lのシュドペンと０．８％の寒天とを含
む根形成培地(rooting medium)に移した。根のある植物
をバーミキュライト(vermiculite)、パーライト(perlit
e)及びピートモス(peat moss)とを１：１：１の比率で
混合した苗床に移して、成長チャンバーで１６時間の昼
の長さを周期として２５℃で成長させた。３２個の再生
植物が成長した。その中で１３個の植物はＳＣａＭ−４
転写体とＳＣａＭ−４タンパク質とを発現した。
【００５７】ＳＣａＭ−５を発現するトランスジェニッ
クタバコ植物は、アグロバクテリウムにより媒介された
葉花盤トランスフォーメーションにより作出された。タ
バコの葉花盤は、８週齢の若いタバコ植物から作られ、
ＭＳ塩、３％スクロース、２mg/lのＮＡＡ、０．５mg/l
のＢＡと０．０５％のＭＥＳを含む溶液に５分間漬け
た。ｐＬＥＳ９８０５の構築体を含むアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスを葉花盤に２日間接種した。滅
菌したＭＳ基本培地(MS basal medium)で洗浄した後、
葉花盤を選択培地[０．５mg/lのＢＡ、ＭＳ塩、３％の
スクロース、１００mg/lのカナマイシン、２５０mg/lの
シュドペン(Sudopen)と０．８％の寒天(agar)とを含む]
に移した。一ヶ月後、再生された発芽体(shoot)をＭＳ
塩、３％のスクロース、１００mg/lのカナマイシン、２
５０mg/lのシュドペンと０．８％の寒天を含む根形成培
地(rooting medium)に移した。根のある植物をバーミキ
ュライト、パーライト及びピートモスとを１：１：１の
比率で混合した苗床に移して、成長チャンバーで１６時
間の昼の長さを周期として２５℃で成長させた。２７個
の再生植物が土壌で成長した。その中の１９個の独立し
たトランスジェニック植物系統は、ＳＣａＭ−５転写体
とタンパク質とを発現した。
クタバコ植物は、アグロバクテリウムにより媒介された
葉花盤トランスフォーメーションにより作出された。タ
バコの葉花盤は、８週齢の若いタバコ植物から作られ、
ＭＳ塩、３％スクロース、２mg/lのＮＡＡ、０．５mg/l
のＢＡと０．０５％のＭＥＳを含む溶液に５分間漬け
た。ｐＬＥＳ９８０５の構築体を含むアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスを葉花盤に２日間接種した。滅
菌したＭＳ基本培地(MS basal medium)で洗浄した後、
葉花盤を選択培地[０．５mg/lのＢＡ、ＭＳ塩、３％の
スクロース、１００mg/lのカナマイシン、２５０mg/lの
シュドペン(Sudopen)と０．８％の寒天(agar)とを含む]
に移した。一ヶ月後、再生された発芽体(shoot)をＭＳ
塩、３％のスクロース、１００mg/lのカナマイシン、２
５０mg/lのシュドペンと０．８％の寒天を含む根形成培
地(rooting medium)に移した。根のある植物をバーミキ
ュライト、パーライト及びピートモスとを１：１：１の
比率で混合した苗床に移して、成長チャンバーで１６時
間の昼の長さを周期として２５℃で成長させた。２７個
の再生植物が土壌で成長した。その中の１９個の独立し
たトランスジェニック植物系統は、ＳＣａＭ−５転写体
とタンパク質とを発現した。
【００５８】高レベルのＳＣａＭ４やＳＣａＭ５発現す
るトランスジェニック植物のＲ1子孫を実験に用い、２
５℃の日中温度、２０℃の夜間温度で、１６時間の光照
射周期(photoperiod)と６５％の相対湿度とを維持し
た。
るトランスジェニック植物のＲ1子孫を実験に用い、２
５℃の日中温度、２０℃の夜間温度で、１６時間の光照
射周期(photoperiod)と６５％の相対湿度とを維持し
た。
【００５９】実施例４−トランスジェニック植物におけ
るＳＣａＭ発現の分析 ２つのＳＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ−１とＳ
ＣａＭ−４に対する免疫ブロッティング−ポリクローナ
ル抗体を、フロイントの完全アジュバントとともに精製
したＳＣａＭタンパク質各々１０ｍｇをヤギに皮下注射
し、免疫することによって調製した。ついで、フロイン
ト不完全アジュバントとともにタンパク質を１ｍｇで３
週間の間隔をあけて追加免疫を行った。野生型植物と個
々のトランスジェニック植物系とから分離された全水溶
性タンパク質の５０μgを、１３．５％のＳＤＳポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質をミリポ
アー(Millipore)社のＰＶＤＦメンブランに移して、抗
−ＳＣａＭ−１または抗−ＳＣａＭ−４抗体のいずれか
とともにインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合抗−ヤギＩｇＧ（ＩＣＮバイオメディカル社、
ICN Biomedicals）とともにインキュベートし、ＥＣＬ
システムを用いてタンパク質のバンドを検出した。トラ
ンスジェニックタバコ植物において、ＳＣａＭ−４やＳ
ＣａＭ−５タンパク質の量は、それぞれ全水溶性葉タン
パク質１ｍｇ当たり０．３−０．５μgであった。
るＳＣａＭ発現の分析 ２つのＳＣａＭアイソフォームであるＳＣａＭ−１とＳ
ＣａＭ−４に対する免疫ブロッティング−ポリクローナ
ル抗体を、フロイントの完全アジュバントとともに精製
したＳＣａＭタンパク質各々１０ｍｇをヤギに皮下注射
し、免疫することによって調製した。ついで、フロイン
ト不完全アジュバントとともにタンパク質を１ｍｇで３
週間の間隔をあけて追加免疫を行った。野生型植物と個
々のトランスジェニック植物系とから分離された全水溶
性タンパク質の５０μgを、１３．５％のＳＤＳポリア
クリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク質をミリポ
アー(Millipore)社のＰＶＤＦメンブランに移して、抗
−ＳＣａＭ−１または抗−ＳＣａＭ−４抗体のいずれか
とともにインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合抗−ヤギＩｇＧ（ＩＣＮバイオメディカル社、
ICN Biomedicals）とともにインキュベートし、ＥＣＬ
システムを用いてタンパク質のバンドを検出した。トラ
ンスジェニックタバコ植物において、ＳＣａＭ−４やＳ
ＣａＭ−５タンパク質の量は、それぞれ全水溶性葉タン
パク質１ｍｇ当たり０．３−０．５μgであった。
【００６０】野生型、ＳＣａＭ−４やＳＣａＭ−５遺伝
子を有しない空ベクターを含有する対照群のトランスジ
ェニック植物及び、ＳＣａＭ−４やＳＣａＭ−５を発現
する３個の代表的な別系統のトランスジェニック植物か
ら全ＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分離した。分離した全ＲＮＡの１０μgを、１．５
％アガロースホルムアルデヒド変性ゲルで分離した。エ
チジウムブロマイドを含ませ、ローディングしたＲＮＡ
が同一のものであることを確認した。ジーンスクリーン
メンブラン(Gene Screen Membrane)に移した後、６５℃
で１６時間、チャーチの緩衝液(Church's buffer)中、
32Ｐで標識された遺伝子特異的プローブによりハイブリ
ダイゼーションさせた。ＳＣａＭ−４などの特異的プロ
ーブは、ＳＣａＭ−４やＳＣａＭ−５から、ＥｃｏＲＩ
またはＸｈｏＩを用いて切り出し、切り出したＳＣａＭ
−４やＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡをゲルを用いて精製して
得たものである。インキュベーション後、フィルターを
２×ＳＳＣで２０分間２回、１×ＳＳＣで２０分間２
回、０．５×ＳＳＣで２０分間１回洗浄し、その後６０
℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで２０分間１回
洗浄した。フィルターを−８０℃で１時間から６日間、
Ｘ線フィルムに露光させた。
子を有しない空ベクターを含有する対照群のトランスジ
ェニック植物及び、ＳＣａＭ−４やＳＣａＭ−５を発現
する３個の代表的な別系統のトランスジェニック植物か
ら全ＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分離した。分離した全ＲＮＡの１０μgを、１．５
％アガロースホルムアルデヒド変性ゲルで分離した。エ
チジウムブロマイドを含ませ、ローディングしたＲＮＡ
が同一のものであることを確認した。ジーンスクリーン
メンブラン(Gene Screen Membrane)に移した後、６５℃
で１６時間、チャーチの緩衝液(Church's buffer)中、
32Ｐで標識された遺伝子特異的プローブによりハイブリ
ダイゼーションさせた。ＳＣａＭ−４などの特異的プロ
ーブは、ＳＣａＭ−４やＳＣａＭ−５から、ＥｃｏＲＩ
またはＸｈｏＩを用いて切り出し、切り出したＳＣａＭ
−４やＳＣａＭ−５ ｃＤＮＡをゲルを用いて精製して
得たものである。インキュベーション後、フィルターを
２×ＳＳＣで２０分間２回、１×ＳＳＣで２０分間２
回、０．５×ＳＳＣで２０分間１回洗浄し、その後６０
℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで２０分間１回
洗浄した。フィルターを−８０℃で１時間から６日間、
Ｘ線フィルムに露光させた。
【００６１】実施例５−トランスジェニック植物の疾病
抵抗性の分析 前記において説明した本発明のトランスジェニックタバ
コ植物に対して、真菌性、バクテリア性及びウイルス性
感染に対する分析を行った。結果は図４に図示した。
抵抗性の分析 前記において説明した本発明のトランスジェニックタバ
コ植物に対して、真菌性、バクテリア性及びウイルス性
感染に対する分析を行った。結果は図４に図示した。
【００６２】１．ＴＭＶ処理 タバコ植物［ニコチアナ・タバキュム品種のキサンチｎ
ｃ(Nicotiana tabacumcv. Xanthi nc)、（ＮＮ）／ＳＣ
ａＭ−４またはＳＣａＭ-５トランスジェニック体］を
１６時間の光周期にプログラムされた成長チャンバー内
で２５℃で成長させた。７−８週目のタバコ植物に、カ
ーボランダムとＴＭＶ（Ｕ１種、指示されたように、５
０ｍＭのリン酸緩衝液に２μg/ｍｌ、ｐＨ７．０）とを
用いて、または緩衝液のみを用いて十分に伸張した葉に
擦り付けることにより接種した。感染後、滅菌水を噴霧
して植物体を洗浄し、葉からカーボランダムを除去し
た。植物は成長チャンバー内で感染の間、２５℃に保た
れた。５日にわたって、ＨＲ病巣の進展を観察した。Ｓ
ＣａＭ−４やＳＣａＭ−５遺伝子を有しない空ベクター
でトランスフォームされた植物を対照群として同時に試
験した。
ｃ(Nicotiana tabacumcv. Xanthi nc)、（ＮＮ）／ＳＣ
ａＭ−４またはＳＣａＭ-５トランスジェニック体］を
１６時間の光周期にプログラムされた成長チャンバー内
で２５℃で成長させた。７−８週目のタバコ植物に、カ
ーボランダムとＴＭＶ（Ｕ１種、指示されたように、５
０ｍＭのリン酸緩衝液に２μg/ｍｌ、ｐＨ７．０）とを
用いて、または緩衝液のみを用いて十分に伸張した葉に
擦り付けることにより接種した。感染後、滅菌水を噴霧
して植物体を洗浄し、葉からカーボランダムを除去し
た。植物は成長チャンバー内で感染の間、２５℃に保た
れた。５日にわたって、ＨＲ病巣の進展を観察した。Ｓ
ＣａＭ−４やＳＣａＭ−５遺伝子を有しない空ベクター
でトランスフォームされた植物を対照群として同時に試
験した。
【００６３】２．真菌処理 フィトフトラ・パラシチカ変種のニコチアネの菌糸体を
滅菌した水に懸濁させ、１Ｌ当たり乾燥タバコ葉１ｇを
加えたＶ８寒天プレート［１Ｌ当たり２００mlのＶ８ジ
ュース、３．０ｇの炭酸カルシウム及び１８ｇの寒天
（ｐＨ６．１５)からなる］に塗布して、継続して光を
照射しながら２５℃でインキュベートした。２−４週か
けて菌糸を繁殖させた後、約８mm2の小さい正方形に切
り取り寒天培地（４週齢以下のタバコ植物）に付着し
た。それらを２５℃、１６時間の光周期のインキュベー
ションチャンバーに移した。５日にわたってＨＲ病巣の
進展を観察した。空ベクターでトランスフォームされた
植物を対照群として同時に試験した。
滅菌した水に懸濁させ、１Ｌ当たり乾燥タバコ葉１ｇを
加えたＶ８寒天プレート［１Ｌ当たり２００mlのＶ８ジ
ュース、３．０ｇの炭酸カルシウム及び１８ｇの寒天
（ｐＨ６．１５)からなる］に塗布して、継続して光を
照射しながら２５℃でインキュベートした。２−４週か
けて菌糸を繁殖させた後、約８mm2の小さい正方形に切
り取り寒天培地（４週齢以下のタバコ植物）に付着し
た。それらを２５℃、１６時間の光周期のインキュベー
ションチャンバーに移した。５日にわたってＨＲ病巣の
進展を観察した。空ベクターでトランスフォームされた
植物を対照群として同時に試験した。
【００６４】３．バクテリア処理 シュードモナス・シリンゼ(Pseudomonas syringae)変種
のタバッシ（ＡＣＴＣ１１５２８）を、５０μg/ｍｌの
リファンピシンを含有するキングのＢ培地(King′s B m
edium)で２８℃で一晩成長させ、２回洗浄し、再懸濁
し、１０ｍＭの塩化マグネシウムで希釈した。健全な葉
の小さな領域に、針のない１ｍｌの皮下用注射器を用い
て、１ｍｌ当たり１０5バクテリア細胞の懸濁液をしみ
込ませることにより接種した。各葉の一側面に、傷当た
り約２０μｌのバクテリア懸濁液をそれぞれ別の部位の
４カ所に接種し、他の一側面は１０ｍＭの塩化マグネシ
ウム２０μlを模擬接種した。パンチャー(puncher)によ
り直径６ｍｍの葉花盤を作った。葉花盤を１０ｍＭの塩
化マグネシウムに入れて柔らかくして、バクテリアを抽
出し、１ｍｌ当たり５０μｇのリファンピシンと、１ｍ
ｌ当たり１０μｇのマリジック酸(Malidixic acid)を添
加したキングのＢ培地に、一連の希釈液として塗布し
た。２８℃でインキュベートした後、４８時間目にコロ
ニー数を数えた。植物内のバクテリアの成長を５日にわ
たって観察した。ＨＲ病巣の進展も５日にわたって観察
した。空ベクターでトランスフォームされた植物を対照
群として同時に試験した。
のタバッシ（ＡＣＴＣ１１５２８）を、５０μg/ｍｌの
リファンピシンを含有するキングのＢ培地(King′s B m
edium)で２８℃で一晩成長させ、２回洗浄し、再懸濁
し、１０ｍＭの塩化マグネシウムで希釈した。健全な葉
の小さな領域に、針のない１ｍｌの皮下用注射器を用い
て、１ｍｌ当たり１０5バクテリア細胞の懸濁液をしみ
込ませることにより接種した。各葉の一側面に、傷当た
り約２０μｌのバクテリア懸濁液をそれぞれ別の部位の
４カ所に接種し、他の一側面は１０ｍＭの塩化マグネシ
ウム２０μlを模擬接種した。パンチャー(puncher)によ
り直径６ｍｍの葉花盤を作った。葉花盤を１０ｍＭの塩
化マグネシウムに入れて柔らかくして、バクテリアを抽
出し、１ｍｌ当たり５０μｇのリファンピシンと、１ｍ
ｌ当たり１０μｇのマリジック酸(Malidixic acid)を添
加したキングのＢ培地に、一連の希釈液として塗布し
た。２８℃でインキュベートした後、４８時間目にコロ
ニー数を数えた。植物内のバクテリアの成長を５日にわ
たって観察した。ＨＲ病巣の進展も５日にわたって観察
した。空ベクターでトランスフォームされた植物を対照
群として同時に試験した。
【００６５】ｐＬＥＳ９８０４またはｐＬＥＳ９８０５
でトランスフォームされ、広範囲な病原体に対して多重
疾病抵抗性を示すトランスジェニックタバコ植物は、ニ
コチアナ・タバキュム品種のキサンチｎｃ(Nicotiana t
abacum cv. Xanthi nc)／ｐＬＥＳ９８０４、およびニ
コチアナ・タバキュム品種のキサンチｎｃ(Nicotianata
bacum cv. Xanthi nc)／ｐＬＥＳ９８０５として、ブダ
ペスト条約に従い、ＫＣＴＣ(Korean Collection for T
ype Cultures)に、それぞれ、受託番号ＫＣＴＣ ０５
４３ＢＰとＫＣＴＣ ０５４４ＢＰとして寄託した。
でトランスフォームされ、広範囲な病原体に対して多重
疾病抵抗性を示すトランスジェニックタバコ植物は、ニ
コチアナ・タバキュム品種のキサンチｎｃ(Nicotiana t
abacum cv. Xanthi nc)／ｐＬＥＳ９８０４、およびニ
コチアナ・タバキュム品種のキサンチｎｃ(Nicotianata
bacum cv. Xanthi nc)／ｐＬＥＳ９８０５として、ブダ
ペスト条約に従い、ＫＣＴＣ(Korean Collection for T
ype Cultures)に、それぞれ、受託番号ＫＣＴＣ ０５
４３ＢＰとＫＣＴＣ ０５４４ＢＰとして寄託した。
【００６６】
【発明の効果】前記のごとき本発明の異種のＳＣａＭ遺
伝子らは、植物体内で持続的に発現して、植物の病原体
に対する疾病抵抗性を誘導する植物防御シグナルの構成
要素の１つであって、異種のＳＣａＭを発現するトラン
スフォームされた植物は、通常は植物に感染する真菌
類、バクテリアとウイルスとに対して高められた抵抗性
を示す。
伝子らは、植物体内で持続的に発現して、植物の病原体
に対する疾病抵抗性を誘導する植物防御シグナルの構成
要素の１つであって、異種のＳＣａＭを発現するトラン
スフォームされた植物は、通常は植物に感染する真菌
類、バクテリアとウイルスとに対して高められた抵抗性
を示す。
【００６７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KOREA KUMHO PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> Transgenic plants with divergent SCaM4 or SCaM5 Gene to achieve multiple disease resistance <130> HYP9901S <140> <141> <150> EP 99300136.1 <151> 1999-01-08 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (657)..(1106) <223> /Product = G. max calmodulin4 (SCaM4) <400> 1 atttcttacc tctgtaggaa aaatcaaact cacatactta ccggatgagt ctgtttctta 60 ccgaggacaa gctttataag tgtctgagtc agtcttctgg tgcaagcaaa gcaaccagct 120 agcgtggtct ttgggtgggt ggtgtgtgga aattggatat tgatgagaac gcagactcta 180 cacacctccc catactccat actccatacc cttttcaagt ttgaattaat cccttcttgt 240 tttgtcccct aaacaccaaa cccttccagc tgtcaagatt ttctccgtat tatactaatc 300 aaattaaata tcatcataca ttaaaaaatc attcagcgca tttaaaccat cgtgccccac 360 cccatttgta ctatactact atgtaacaat tacaattaca atgtgattct tttttacaca 420 ataaagccac gagtatggca acaaaatgca agtcatatac ttaatttgac tcggtaaatt 480 aaaattttaa aagaaatctt gcaagactag ctagctagca tcacctaagt tctacaatat 540 agcccagcta ggattgagct atactcaact caacacatca ttctctcttt ccctctctat 600 ctctatctct ctttctctgt ctcttttctg gttgaagttt gaaagacaaa tacacc atg 659 Met 1 gca gat atc ctg agt gaa gaa cag att gtt gat ttt aaa gag gcc ttt 707 Ala Asp Ile Leu Ser Glu Glu Gln Ile Val Asp Phe Lys Glu Ala Phe 5 10 15 ggc ttg ttt gac aaa gat gga gat ggt tgc att act gtg gaa gaa ctt 755 Gly Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Val Glu Glu Leu 20 25 30 gcc act gtc att cgg tca ttg gat cag aac ccc act gaa gaa gag ctc 803 Ala Thr Val Ile Arg Ser Leu Asp Gln Asn Pro Thr Glu Glu Glu Leu 35 40 45 caa gat atg ata agc gaa gtc gat gca gat ggc aat gga acc att gaa 851 Gln Asp Met Ile Ser Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile Glu 50 55 60 65 ttt gac gag ttc ttg agc ttg atg gcc aag aaa gtt aaa gac act gat 899 Phe Asp Glu Phe Leu Ser Leu Met Ala Lys Lys Val Lys Asp Thr Asp 70 75 80 gca gag gag gag ctc aaa gaa gct ttc aag gtt ttt gac aaa gat caa 947 Ala Glu Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Lys Val Phe Asp Lys Asp Gln 85 90 95 aat ggc tac ata tca gct agt gag ttg aga cac gta atg atc aat cta 995 Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Arg His Val Met Ile Asn Leu 100 105 110 ggg gaa aaa cta acc gat gaa gag gtg gag cag atg att aaa gaa gca 1043 Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Glu Gln Met Ile Lys Glu Ala 115 120 125 gat ttg gac ggt gat ggc caa gtt aac tat gag gaa ttc gtc aag atg 1091 Asp Leu Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Lys Met 130 135 140 145 atg atg acc gtt cga tgaaacactc tcacctaatt aattggattg gacaccaatt 1146 Met Met Thr Val Arg 150 tgttaattca aaattcattg gcttccaacc tcccaatgaa ataagtgttc tttctttatt 1206 attgtttgtt gtattgtact attattctac ttgtacttag taatgaccaa gcagtagatt 1266 ggcaccccca ttccatttga tccattccaa aattaaatta ctattcttgt aattttagtt 1326 cagtacattt tctatcctcc gagagtaaga aacccaagga gcatatctac ccattaatta 1386 tgcatgactt ttacc 1401 <210> 2 <211> 150 <212> PRT <213> Glycine max <400> 2 Met Ala Asp Ile Leu Ser Glu Glu Gln Ile Val Asp Phe Lys Glu Ala 1 5 10 15 Phe Gly Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Val Glu Glu 20 25 30 Leu Ala Thr Val Ile Arg Ser Leu Asp Gln Asn Pro Thr Glu Glu Glu 35 40 45 Leu Gln Asp Met Ile Ser Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile 50 55 60 Glu Phe Asp Glu Phe Leu Ser Leu Met Ala Lys Lys Val Lys Asp Thr 65 70 75 80 Asp Ala Glu Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Lys Val Phe Asp Lys Asp 85 90 95 Gln Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Arg His Val Met Ile Asn 100 105 110 Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Glu Gln Met Ile Lys Glu 115 120 125 Ala Asp Leu Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Lys 130 135 140 Met Met Met Thr Val Arg 145 150 <210> 3 <211> 916 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (69)..(518) <223> /Product = G. max calmodulin 5 (SCaM 5) <400> 3 ctccctctct cttttctaag tcacaaaata ttgtcttagt tttcatttga agctcaaaca 60 ttaacacc atg gca gat gtt ctg agt gaa gaa cag att agt gag atc aaa 110 Met Ala Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Ser Glu Ile Lys 1 5 10 gaa gcc ttt ggc ttg ttt gac aaa gat ggt gat ggg tgc att act gtg 158 Glu Ala Phe Gly Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Val 15 20 25 30 gac gaa ttt gtc acg gtt atc cgg tca ttg gtt cag aac ccc aca gaa 206 Asp Glu Phe Val Thr Val Ile Arg Ser Leu Val Gln Asn Pro Thr Glu 35 40 45 gaa gag ctc caa gac atg ata aac gag gta gat gca gat ggt aat gga 254 Glu Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly 50 55 60 acc att gaa ttt gtt gag ttt ttg aac tta atg gcc aag aaa atg aag 302 Thr Ile Glu Phe Val Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Lys Lys Met Lys 65 70 75 gaa act gat gaa gag gaa gat ctc aaa gag gct ttc aag gtg ttt gac 350 Glu Thr Asp Glu Glu Glu Asp Leu Lys Glu Ala Phe Lys Val Phe Asp 80 85 90 aag gat caa aat ggc tac att tca gca agt gag ttg aga cac gtt atg 398 Lys Asp Gln Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Arg His Val Met 95 100 105 110 atc aat ctg ggt gaa aaa cta act gat gag gag gtg gag cag atg att 446 Ile Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Glu Gln Met Ile 115 120 125 gaa gaa gca gat ttg gat ggt gat ggt caa gtt aat tat gat gaa ttt 494 Glu Glu Ala Asp Leu Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Asp Glu Phe 130 135 140 gtc aag atg atg atg act att gga tgaaattttc aaacaacaaa tttattgttc 548 Val Lys Met Met Met Thr Ile Gly 145 150 gaattcgatc atttgggccc caatctcatt cactcgcatg aaataataag tcttccaatc 608 aatttttggt gtattttact tgtagcacat gatatgaatg accaatgtat tagagtgaca 668 tctcagccaa tttgatttgt tcaaactcca acccataatt attctttcag ttttagttta 728 gcattcctta tgttttaaaa ttaattagag ggaatttatt caagaacttc tgaaattaga 788 ctcttttttg aaagattaat gtatgctaca atttattctt tctcttgtga acatggtatt 848 gctacaattt atttatatca ttcagaaaaa taaaaaacag cacaagaatt aaacaaaaaa 908 aaaaaaaa 916 <210> 4 <211> 150 <212> PRT <213> Glycine max <400> 4 Met Ala Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Ser Glu Ile Lys Glu Ala 1 5 10 15 Phe Gly Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Val Asp Glu 20 25 30 Phe Val Thr Val Ile Arg Ser Leu Val Gln Asn Pro Thr Glu Glu Glu 35 40 45 Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile 50 55 60 Glu Phe Val Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Lys Lys Met Lys Glu Thr 65 70 75 80 Asp Glu Glu Glu Asp Leu Lys Glu Ala Phe Lys Val Phe Asp Lys Asp 85 90 95 Gln Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ser Glu Leu Arg His Val Met Ile Asn 100 105 110 Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Glu Gln Met Ile Glu Glu 115 120 125 Ala Asp Leu Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Asp Glu Phe Val Lys 130 135 140 Met Met Met Thr Ile Gly 145 150
【図１】ＳＣａＭ４タンパク質をコードする外因性形質
転換遺伝子を有する植物発現ベクターｐＬＥＳ９８０４
の概略図である。
転換遺伝子を有する植物発現ベクターｐＬＥＳ９８０４
の概略図である。
【図２】ＳＣａＭ５タンパク質をコードする外因性形質
転換遺伝子を有する植物発現ベクターｐＬＥＳ９８０５
の概略図である。
転換遺伝子を有する植物発現ベクターｐＬＥＳ９８０５
の概略図である。
【図３】植物防御反応に際して、ＳＣａＭ４とＳＣａＭ
５の速い誘導を図示したものである。（Ａ）は、大豆の
カルモジュリン（ＳＣａＭ）遺伝子の発現に対する真菌
性誘発体(fungal elicitor)の効果を示す。大豆細胞の
懸濁培養物(Soybean cell suspension culture、ＳＢ−
Ｐという）をフサリウム・ソラニ(Fusarium solani)か
ら調製した真菌性誘発体で処理し、表示の時間によって
全ＲＮＡを分離して、ＳＣａＭ１、ＳＣａＭ４、ＳＣａ
Ｍ５、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ(Phenyla
lanine ammonia-lyase:ＰＡＬ)及びβ−チューブリン
(β-tubulin)のｍＲＮＡに関して分析したものである。
（Ｂ）は、真菌性誘発体処理によるＳＣａＭタンパク質
レベルの変化を示す。ＳＢ−Ｐ細胞を（Ａ）に記載した
ように処理し、それぞれの抗−ＳＣａＭ４抗体または抗
−ＳＣａＭ１抗体を使用して免疫ブロット分析法によ
り、ＳＣａＭ１／２／３またはＳＣａＭ４／５の相対的
なタンパク質レベルを調べた（１６）。公知の量の標準
ＳＣａＭ１またはＳＣａＭ４タンパク質のオートラジオ
グラムのバンドの強度及び領域と比較することにより、
ＳＣａＭアイソフォームの相対的なタンパク質レベルを
スキャニング濃度計を用いて算出した。（Ｃ）は、ＳＣ
ａＭ４遺伝子の発現に対する多様な防御シグナル分子の
効果を示すものである。ＳＢ−Ｐ細胞は、前記で表示し
たとおり１時間処理し、ノーザンブロット分析法でＳＣ
ａＭ遺伝子のｍＲＮＡレベルを調査した。図面中の（ｄ
Ｈ２Ｏ）は水を用いた対照群、（Ｐｓｇ）はａｖｒＣ遺
伝子を有するシュードモナス・シリンゼ変種のグリシニ
ア(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、（ＦＥ）は
フィトフトラ・パラシチカ変種のニコチアネ(phytophth
ora paracitica v ar.nicotianae)から調製された真菌性
誘発体、（ＦＥ＋ＣＨＸ）は真菌性誘発体＋１μｇ/ｍ
ｌのシクロヘキシミド(cycloheximide)、（ＦＥ＋ＢＡ
ＰＴＡ）は真菌性誘発体＋５ｍＭの 1,2−ビス−（ｏ-
アミノフェノキシ）−エタン−N,N,N',N'−テトラ酢酸
［1,2-bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraa
cetic acid)]、(Ｃａ2+＋Ａ２３１８７）は２５μＭの
Ｃａ2+イオノホア(ionopore)Ａ２３１８７＋５ｍＭ塩化
カルシウム、（Ｈ２０２）は２ｍＭ過酸化水素、（Ｇ−
ＧＯ）はグルコースとグルコースオキシダーゼの系、
（Ｘ−ＸＯ）はキサンチンとキサンチンオキシダーゼの
系、（ＳＡ）は２ｍＭサリチル酸、（ＪＡ）は１０μＭ
ジャスモン酸(jasmonic acid)、（ＡＢＡ）は１００μ
Ｍアブシシン酸(absicisic acid)を示す。
５の速い誘導を図示したものである。（Ａ）は、大豆の
カルモジュリン（ＳＣａＭ）遺伝子の発現に対する真菌
性誘発体(fungal elicitor)の効果を示す。大豆細胞の
懸濁培養物(Soybean cell suspension culture、ＳＢ−
Ｐという）をフサリウム・ソラニ(Fusarium solani)か
ら調製した真菌性誘発体で処理し、表示の時間によって
全ＲＮＡを分離して、ＳＣａＭ１、ＳＣａＭ４、ＳＣａ
Ｍ５、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ(Phenyla
lanine ammonia-lyase:ＰＡＬ)及びβ−チューブリン
(β-tubulin)のｍＲＮＡに関して分析したものである。
（Ｂ）は、真菌性誘発体処理によるＳＣａＭタンパク質
レベルの変化を示す。ＳＢ−Ｐ細胞を（Ａ）に記載した
ように処理し、それぞれの抗−ＳＣａＭ４抗体または抗
−ＳＣａＭ１抗体を使用して免疫ブロット分析法によ
り、ＳＣａＭ１／２／３またはＳＣａＭ４／５の相対的
なタンパク質レベルを調べた（１６）。公知の量の標準
ＳＣａＭ１またはＳＣａＭ４タンパク質のオートラジオ
グラムのバンドの強度及び領域と比較することにより、
ＳＣａＭアイソフォームの相対的なタンパク質レベルを
スキャニング濃度計を用いて算出した。（Ｃ）は、ＳＣ
ａＭ４遺伝子の発現に対する多様な防御シグナル分子の
効果を示すものである。ＳＢ−Ｐ細胞は、前記で表示し
たとおり１時間処理し、ノーザンブロット分析法でＳＣ
ａＭ遺伝子のｍＲＮＡレベルを調査した。図面中の（ｄ
Ｈ２Ｏ）は水を用いた対照群、（Ｐｓｇ）はａｖｒＣ遺
伝子を有するシュードモナス・シリンゼ変種のグリシニ
ア(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、（ＦＥ）は
フィトフトラ・パラシチカ変種のニコチアネ(phytophth
ora paracitica v ar.nicotianae)から調製された真菌性
誘発体、（ＦＥ＋ＣＨＸ）は真菌性誘発体＋１μｇ/ｍ
ｌのシクロヘキシミド(cycloheximide)、（ＦＥ＋ＢＡ
ＰＴＡ）は真菌性誘発体＋５ｍＭの 1,2−ビス−（ｏ-
アミノフェノキシ）−エタン−N,N,N',N'−テトラ酢酸
［1,2-bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraa
cetic acid)]、(Ｃａ2+＋Ａ２３１８７）は２５μＭの
Ｃａ2+イオノホア(ionopore)Ａ２３１８７＋５ｍＭ塩化
カルシウム、（Ｈ２０２）は２ｍＭ過酸化水素、（Ｇ−
ＧＯ）はグルコースとグルコースオキシダーゼの系、
（Ｘ−ＸＯ）はキサンチンとキサンチンオキシダーゼの
系、（ＳＡ）は２ｍＭサリチル酸、（ＪＡ）は１０μＭ
ジャスモン酸(jasmonic acid)、（ＡＢＡ）は１００μ
Ｍアブシシン酸(absicisic acid)を示す。
【図４】ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５を持続的に発現するト
ランスジェニックタバコ植物の表現形を示すものであ
る。（Ａ）はトランスジェニック植物の自然に生じた疾
病病巣のような壊死性部位の発生的に調節された形成を
示す。８週齢の代表的なトランスジェニックＳＣａＭ４
植物（右側）の全体的な植物形態を示し、病巣部は植物
の最下部に近いより古い葉のみでみられる。左側に同様
な齢の正常な野生型植物を示した。（Ｂ）は、１０週齢
のＳＣａＭ５トランスジェニック植物（右側）の葉に形
成された斑点模様の自然に生じた病巣の拡大図である。
比較のために、同様な齢の正常な葉を左側に示した。
（ＣとＤ）自然に形成された病巣の細胞壁内のＵＶで励
起される蛍光物質の蓄積を示す。示差干渉照明（differ
ential interferance constant）で自然発生病巣の顕微
鏡試験（Ｃ）と、４′,6−ジアミジノ-２-フェニルイン
ドールにより葉組織の核染色した後の外皮の蛍光(epifl
uorecence)写真（Ｄ）。
ランスジェニックタバコ植物の表現形を示すものであ
る。（Ａ）はトランスジェニック植物の自然に生じた疾
病病巣のような壊死性部位の発生的に調節された形成を
示す。８週齢の代表的なトランスジェニックＳＣａＭ４
植物（右側）の全体的な植物形態を示し、病巣部は植物
の最下部に近いより古い葉のみでみられる。左側に同様
な齢の正常な野生型植物を示した。（Ｂ）は、１０週齢
のＳＣａＭ５トランスジェニック植物（右側）の葉に形
成された斑点模様の自然に生じた病巣の拡大図である。
比較のために、同様な齢の正常な葉を左側に示した。
（ＣとＤ）自然に形成された病巣の細胞壁内のＵＶで励
起される蛍光物質の蓄積を示す。示差干渉照明（differ
ential interferance constant）で自然発生病巣の顕微
鏡試験（Ｃ）と、４′,6−ジアミジノ-２-フェニルイン
ドールにより葉組織の核染色した後の外皮の蛍光(epifl
uorecence)写真（Ｄ）。
【図５】トランスジェニックＳＣａＭ４とＳＣａＭ５タ
バコ植物のＰＲタンパク質遺伝子の持続的もしくは構成
的な発現を示すものである。（Ａ）は、トランスジェニ
ック植物における高められたＳＣａＭ４とＳＣａＭ５タ
ンパク質のレベルを示す免疫ブロットである。抗−ＳＣ
ａＭ４または抗−ＳＣａＭ５抗体のいずれかを用いて、
３種の別個のトランスジェニック植物系から得られた全
水溶性タンパク質（50μg）に対するＳＣａＭタンパク
質のレベルを分析したものである。（Ｂ）は、トランス
ジェニック植物内のＰＲタンパク質遺伝子の持続的な発
現を示すものである。野生型（ＷＴ）、ＳＣａＭ遺伝子
を有していない空ベクターを有する対照群のトランスジ
ェニック植物（ＣＴ）と、ＳＣａＭ４を発現する、また
はＳＣａＭ５を発現する３個の別個の代表的なトランス
ジェニック植物（それぞれ、Ｓ４ＴＧ、Ｓ５ＴＧ）から
の全ＲＮＡを分離して、タバコＳＡＲ遺伝子のｍＲＮＡ
レベルを調査した（３１）。＃はトランスジェニック植
物系の番号を示す。（Ｃ）は、病巣部がないトランスジ
ェニックＳＣａＭ４とＳＣａＭ５植物におけるＰＲタン
パク質遺伝子の発現を示す。病巣なし、または病巣あり
（それぞれ−または＋としてレーンを示す）の健全なト
ランスジェニック植物の葉におけるＰＲ１遺伝子の発現
のＲＮＡブロット分析である。（Ｄ）は、ＳＡ−非依存
性ＰＲタンパク質の遺伝子発現を示す。野生型植物また
はｎａｈＧトランスジェニック植物（３３）で持続的に
発現するＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５のＰＲタンパク質
遺伝子発現に対する効果を、ＰＲ１ａとＰＲ５プローブ
を用いてＲＮＡゲルブロット分析法により調査した。図
示のデータは、少なくとも１０個の代表的な個別のトラ
ンスジェニック植物系から得られた結果である。
バコ植物のＰＲタンパク質遺伝子の持続的もしくは構成
的な発現を示すものである。（Ａ）は、トランスジェニ
ック植物における高められたＳＣａＭ４とＳＣａＭ５タ
ンパク質のレベルを示す免疫ブロットである。抗−ＳＣ
ａＭ４または抗−ＳＣａＭ５抗体のいずれかを用いて、
３種の別個のトランスジェニック植物系から得られた全
水溶性タンパク質（50μg）に対するＳＣａＭタンパク
質のレベルを分析したものである。（Ｂ）は、トランス
ジェニック植物内のＰＲタンパク質遺伝子の持続的な発
現を示すものである。野生型（ＷＴ）、ＳＣａＭ遺伝子
を有していない空ベクターを有する対照群のトランスジ
ェニック植物（ＣＴ）と、ＳＣａＭ４を発現する、また
はＳＣａＭ５を発現する３個の別個の代表的なトランス
ジェニック植物（それぞれ、Ｓ４ＴＧ、Ｓ５ＴＧ）から
の全ＲＮＡを分離して、タバコＳＡＲ遺伝子のｍＲＮＡ
レベルを調査した（３１）。＃はトランスジェニック植
物系の番号を示す。（Ｃ）は、病巣部がないトランスジ
ェニックＳＣａＭ４とＳＣａＭ５植物におけるＰＲタン
パク質遺伝子の発現を示す。病巣なし、または病巣あり
（それぞれ−または＋としてレーンを示す）の健全なト
ランスジェニック植物の葉におけるＰＲ１遺伝子の発現
のＲＮＡブロット分析である。（Ｄ）は、ＳＡ−非依存
性ＰＲタンパク質の遺伝子発現を示す。野生型植物また
はｎａｈＧトランスジェニック植物（３３）で持続的に
発現するＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５のＰＲタンパク質
遺伝子発現に対する効果を、ＰＲ１ａとＰＲ５プローブ
を用いてＲＮＡゲルブロット分析法により調査した。図
示のデータは、少なくとも１０個の代表的な個別のトラ
ンスジェニック植物系から得られた結果である。
【図６】ＳＣａＭ４やＳＣａＭ５を持続的に発現するト
ランスジェニックタバコ植物の高められた疾病抵抗性を
示す。（Ａ）は、病原性真菌病原体であるフィトフトラ
・パラシチカ変種のニコチアネに対する疾病反応を示
す。接種後７日目に植物に疾病の徴候について調べた。
野生型（ＷＴ）とＳＣａＭ４を発現するトランスジェニ
ック植物（Ｓ４ＴＧ）またはＳＣａＭ５を発現するトラ
ンスジェニック植物（Ｓ５ＴＧ）に対する代表的な結果
を示した。（ＢとＣ）は、病原性フィトフトラ・パラシ
チカ変種のニコチアネが感染した葉の蛍光顕微鏡写真で
ある。感染した葉をきれいにして、アニリンブルーで染
色してＵＶ光の蛍光顕微鏡で観察した。野生型植物の葉
（Ｂ）では、真菌性菌糸が明確に広がっているが、トラ
ンスジェニック植物の葉（Ｃ）では、真菌性菌糸が認め
うるほどに成長してはおらず、真菌が侵入した部位を取
り囲む細胞中にＵＶで励起される蛍光性物質が蓄積され
ていることがわかる。スケールバーは１００μmを示し
ている。（Ｄ）は、植物内でのバクテリア成長を示す。
成熟した野生型（ＷＴ）とトランスジェニックＳＣａＭ
４植物（Ｓ４ＴＧ）とトランスジェニックＳＣａＭ５植
物（Ｓ５ＴＧ）の葉に、シュードモナス・シリンゼ変種
のタバッシ(Psedomonasu syringae pv.tabacci)を１０5
cfu/mlで接種し、５日にわたって植物内のバクテリアの
成長を観察した。データは、５個の独立した２種類の植
物系の測定を示している。（Ｅ）は、非病毒性病原体で
あるＴＭＶに対するＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジ
ェニック植物の高められた抵抗性を示す。植物の最頂部
から２番目または３番目の完全に開いた若葉に、カーボ
ランダムと若葉の１枚当たり２μgのＴＭＶとを穏やか
に擦りつけることにより、ＴＭＶを接種し、ＨＲ病巣の
進展を５日にわたって観察した。図示したデータは、こ
れらの植物に形成されたＨＲ病巣の数である。このよう
なすべての病原体に対する試験において、ＳＣａＭ遺伝
子を有しない空ベクターでトランスフォームした対照群
のトランスジェニック植物は、野生型植物の結果と本質
的に類似した結果を示した（データは図示していな
い）。
ランスジェニックタバコ植物の高められた疾病抵抗性を
示す。（Ａ）は、病原性真菌病原体であるフィトフトラ
・パラシチカ変種のニコチアネに対する疾病反応を示
す。接種後７日目に植物に疾病の徴候について調べた。
野生型（ＷＴ）とＳＣａＭ４を発現するトランスジェニ
ック植物（Ｓ４ＴＧ）またはＳＣａＭ５を発現するトラ
ンスジェニック植物（Ｓ５ＴＧ）に対する代表的な結果
を示した。（ＢとＣ）は、病原性フィトフトラ・パラシ
チカ変種のニコチアネが感染した葉の蛍光顕微鏡写真で
ある。感染した葉をきれいにして、アニリンブルーで染
色してＵＶ光の蛍光顕微鏡で観察した。野生型植物の葉
（Ｂ）では、真菌性菌糸が明確に広がっているが、トラ
ンスジェニック植物の葉（Ｃ）では、真菌性菌糸が認め
うるほどに成長してはおらず、真菌が侵入した部位を取
り囲む細胞中にＵＶで励起される蛍光性物質が蓄積され
ていることがわかる。スケールバーは１００μmを示し
ている。（Ｄ）は、植物内でのバクテリア成長を示す。
成熟した野生型（ＷＴ）とトランスジェニックＳＣａＭ
４植物（Ｓ４ＴＧ）とトランスジェニックＳＣａＭ５植
物（Ｓ５ＴＧ）の葉に、シュードモナス・シリンゼ変種
のタバッシ(Psedomonasu syringae pv.tabacci)を１０5
cfu/mlで接種し、５日にわたって植物内のバクテリアの
成長を観察した。データは、５個の独立した２種類の植
物系の測定を示している。（Ｅ）は、非病毒性病原体で
あるＴＭＶに対するＳＣａＭ４とＳＣａＭ５トランスジ
ェニック植物の高められた抵抗性を示す。植物の最頂部
から２番目または３番目の完全に開いた若葉に、カーボ
ランダムと若葉の１枚当たり２μgのＴＭＶとを穏やか
に擦りつけることにより、ＴＭＶを接種し、ＨＲ病巣の
進展を５日にわたって観察した。図示したデータは、こ
れらの植物に形成されたＨＲ病巣の数である。このよう
なすべての病原体に対する試験において、ＳＣａＭ遺伝
子を有しない空ベクターでトランスフォームした対照群
のトランスジェニック植物は、野生型植物の結果と本質
的に類似した結果を示した（データは図示していな
い）。
【図７】ＳＣａＭ４の完全なヌクレオチド配列および推
測アミノ酸配列を示す図である。
測アミノ酸配列を示す図である。
【図８】ＳＣａＭ５の完全なヌクレオチド配列および推
測アミノ酸配列を示す図である。
測アミノ酸配列を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 ピル−スーン ソン 大韓民国 クワンジュ市 クワンサン−グ ウォルゲ−ドン 756−２ シンドンガ −アパートメント 102−906 (72)発明者 チャン−ホ チュン 大韓民国 クワンジュ市 ソ−グ ホワジ ュン−ドン 572 ヒュンダイ−アパート メント 100−1003 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD10 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 FA02 FA06 FA07 GA11 GA17 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC20 BA02 CA24 CA53
Claims (9)
- 【請求項１】 大豆カルモジュリン４（ＳＣａＭ４）ま
たは大豆カルモジュリン５（ＳＣａＭ５）をコードする
遺伝子でトランスフォームされ、これを発現するトラン
スジェニック植物細胞および前記細胞の子孫。 - 【請求項２】 トランスジェニック植物細胞は、タバコ
植物と双子葉植物種であることを特徴とする請求項１記
載のトランスジェニック植物細胞。 - 【請求項３】 ＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５をコードす
る遺伝子を発現するトランスジェニック植物、その細胞
または前記植物の子孫。 - 【請求項４】 トランスジェニック植物は双子葉植物種
であることを特徴とする請求項３記載のトランスジェニ
ック植物。 - 【請求項５】 植物をＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５をコ
ードする遺伝子でトランスフォームして、１つまたはそ
れ以上の植物病原体の感染に対する高等植物の多重疾病
抵抗性を増進させる方法。 - 【請求項６】 前記植物が双子葉植物種であることを特
徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記植物の細胞を、ＳＣａＭ４遺伝子バ
イナリーベクターまたはＳＣａＭ５遺伝子バイナリーベ
クターを用いてトランスフォームされたものであること
を特徴とする請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 ＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５をコードす
るｃＤＮＡヌクレオチド配列と、植物細胞でＳＣａＭ４
またはＳＣａＭ５の発現のための調節要素を含むＳＣａ
Ｍ４遺伝子バイナリーベクターまたはＳＣａＭ５遺伝子
バイナリーベクターが、それぞれ、受託番号ＫＣＴＣ
０５４５ＢＰで寄託されたｐＬＥＳ９８０４、受託番号
ＫＣＴＣ ０５４６ＢＰで寄託されたｐＬＥＳ９８０５
であることを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記の調節要素は、カリフラワーモザイ
クウイルスの３５Ｓプロモーター、エンハンサー及びノ
パリンシンターゼ終結シグナルからなるグループから選
択されたものであることを特徴とする請求項８記載のベ
クター。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99300136A EP1018553B1 (en) | 1999-01-08 | 1999-01-08 | Transgenic plants with divergent SCaM4 or SCaM5 gene to achieve multiple disease resistance |
| EP99300136.1 | 1999-01-08 | ||
| US09/239,909 US6284952B1 (en) | 1999-01-08 | 1999-01-29 | Transgenic plants with divergent [ScaM4 or] SCaM5 gene to achieve multiple disease resistance |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000201554A true JP2000201554A (ja) | 2000-07-25 |
Family
ID=26153423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11069302A Pending JP2000201554A (ja) | 1999-01-08 | 1999-03-15 | ＳＣａＭ４またはＳＣａＭ５遺伝子を含む多重疾病抵抗性のトランスジェニック植物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6284952B1 (ja) |
| EP (1) | EP1018553B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000201554A (ja) |
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| AR075466A1 (es) | 2008-10-22 | 2011-04-06 | Basf Se | Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas |
| BR112015004074A2 (pt) | 2012-10-01 | 2017-07-04 | Basf Se | método para controlar pragas, uso e semente de uma planta cultivada. |
| WO2014079820A1 (en) | 2012-11-22 | 2014-05-30 | Basf Se | Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections |
| WO2015048087A1 (en) * | 2013-09-25 | 2015-04-02 | Novozymes A/S | Processes of producing fermentation products |
| EP3028573A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-08 | Basf Se | Use of a triazole fungicide on transgenic plants |
| WO2016091674A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Basf Se | Use of cyclaniliprole on cultivated plants |
| BR112017021450B1 (pt) | 2015-04-07 | 2021-12-28 | Basf Agrochemical Products B.V. | Métodos de controle de pragas, método de melhoria da saúde vegetal e semente revestida |
| EP3338552A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-27 | Basf Se | Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants |
| CN114317591A (zh) * | 2021-09-17 | 2022-04-12 | 中国农业大学 | 一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5530187A (en) | 1993-07-16 | 1996-06-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes |
| US5629470A (en) | 1995-01-20 | 1997-05-13 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Transgenic plants and plant cells with enhanced pathogen resistance and related methods |
-
1999
- 1999-01-08 EP EP99300136A patent/EP1018553B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-29 US US09/239,909 patent/US6284952B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-15 JP JP11069302A patent/JP2000201554A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6284952B1 (en) | 2001-09-04 |
| EP1018553B1 (en) | 2005-03-30 |
| EP1018553A1 (en) | 2000-07-12 |
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