JP2000184882A

JP2000184882A - 新規アミラーゼ

Info

Publication number: JP2000184882A
Application number: JP10362487A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hagiwara; 萩原　　浩; Kaori Kitayama; 香織北山; Yasuhiro Hayashi; 康弘林; Kazuaki Igarashi; 一暁五十嵐; Keiji Endo; 圭二遠藤; Katsuya Ozaki; 克也尾崎
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2000-07-04
Anticipated expiration: 2018-12-21
Also published as: JP4077095B2

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の洗剤用アミラーゼに比べて高度なキレ
ート剤耐性能を有するアルカリ液化型アミラーゼの提
供。【解決手段】１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴ
Ａ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性
が７０％以上であるアルカリ液化型アミラーゼ及びこれ
を含有する洗浄剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高度なキレート剤
耐性能を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液
化型アミラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】α−ア
ミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業
及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗
浄剤への配合の適性が知られており、洗浄力増強成分と
して自動食器洗浄機用洗剤や衣料用洗剤などへも配合が
行われている（Enzymes in Detergency, P203. Marcel
Dekker Inc., New York(1995））。

【０００３】洗浄剤用として有用なアルカリ側に最適作
用を有している液化型α−アミラーゼとしては、本発明
者らが以前に見出したバチルスエスピー（Bacillus s
p.）ＫＳＭ−１３７８（ＦＥＲＭＢＰ−３０４８）株
由来のものが知られていた（ＷＯ９４／２６８８１）。
また、最近、至適pHを８〜８．５付近に有するα−アミ
ラーゼが開示された（ＷＯ９５／２６３９）が、これは
ＫＳＭ−１３７８株のアミラーゼとその性質及び構造が
酷似しているものであった。

【０００４】一方、洗剤には、洗浄妨害イオンであるカ
ルシウム等を洗浄液中から除く為にリン酸、クエン酸あ
るいはゼオライト等のキレート剤が配合されており、液
化型α−アミラーゼはＥＤＴＡにより失活することが知
られていた〔HANDOBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZY
MES, P43. The Amylase Research Society of Japan(19
88）〕。前述のバチルスエスピーＫＳＭ−１３７８
（ＦＥＲＭＢＰ−３０４８）株由来のアルカリ液化型
α−アミラーゼに関してもキレート剤による酵素活性の
阻害が認められ、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗剤
に配合すると必ずしもその効果は十分とはいえなかっ
た。また、最適作用pHは中酸性であるがアルカリ性でも
活性を示し、現在、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗
剤の配合成分として最もよく用いられているバチルス
リケニフォルミス由来の液化型α−アミラーゼ（ターマ
ミル及びデュラミル、いずれもノボ社製）に関しても、
そのキレート剤耐性能は十分とはいえなかった。これま
でに知られている液化型アミラーゼのうち、キレート剤
に対して影響されないものとしては、パイロコッカス
（Pyrococcus）属の株由来の液化型α−アミラーゼ（Ｗ
Ｏ９０／１１３５２）及び澱粉の液化工程に有効なスル
ホロブス（Sulfolobus）属の株由来のα−アミラーゼ
（ＷＯ９６／０２６３３）が挙げられるが、これら酵素
の最適作用pHはそれぞれ、pH４〜６及びpH２．５〜４．
５にあり、アルカリ性では作用しないため、洗浄剤の配
合成分としては適していなかった。

【０００５】従って、本発明は、従来の洗剤用アミラー
ゼに比べて高度なキレート剤耐性能を有し、洗浄剤配合
成分として有用なアルカリ液化型アミラーゼ、及びこれ
を配合した洗浄剤組成物を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、１〜１００mM
のＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、
３０分間処理後の残存活性が７０％以上であるアルカリ
液化型アミラーゼを提供するものである。

【０００７】また、本発明は当該アルカリ液化型アミラ
ーゼをコードするＤＮＡ断片を提供するものである。更
にまた、本発明は当該アルカリ液化型アミラーゼを含有
する洗浄剤組成物を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明において、アルカリα−ア
ミラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものをい
う。また、中性とはpH６〜８の範囲をいい、アルカリ性
とはそれ以上の範囲をいう。更に、HANDBOOK OF AMYLAS
ES AND RELATED ENZYMES〔Ｐ４０〜４１．The Amylase
Research Society of Japan(1988）〕に記載されている
ように、液化型とは澱粉及び澱粉系多糖類を高ランダム
に分解するものをいう。

【０００９】本発明酵素は１〜１００mMのＥＤＴＡある
いはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後
の残存活性が７０％以上であるアルカリ液化型アミラー
ゼであり、当該残存活性は、８０％以上が好ましく、９
０％以上がより好ましい。

【００１０】本発明酵素は上記のキレート剤耐性を有す
ればよいが、更に下記１）及び２）の性質を有するも
の、特に１）〜５）の性質を有するものが好ましい。１）最適作用pH 最適作用pHが８．０を超える（可溶性澱粉を基質、５０
℃、１５分間反応）。２）作用澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロース
からはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マル
トトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、
マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ
６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただ
しプルランには作用しない。３）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の
範囲で７０％以上の残存活性を示す。４）作用温度範囲及び最適作用温度２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜
６０℃である。５）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中、
３０分間処理で、４０℃で８０％以上の残存活性を示
し、４５℃でも約６０％の残存活性を示す。

【００１１】また本発明酵素の例としては、配列番号１
又は２に記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸の
１もしくは２以上が置換、欠失もしくは付加したアミノ
酸配列を有するものが挙げられる。当該置換、欠失又は
付加の範囲は、相同性８０％以上が好ましく、９０％以
上が特に好ましい。なお、相同性はLipman-Pearson法(S
cience, 227, 1435(1985))により計算される。

【００１２】本発明の酵素は、例えばバチルス属に属す
るその生産菌を培養した後培養物から採取することによ
り製造される。かかる生産菌としては、例えば下記の菌
学的性質を有するＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８
株が挙げられる。

【００１３】

【表１】

【００１４】以上の菌学的性質に関する検討に基づき、
バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジー〔Bergey's Mannual of Systematic Bac
teriology, Williams & Wilkins, United States of Am
erica(1986）〕及びジーナス・バチルス〔The Genus Ba
cillus, Agricultural Research Service, Washington,
D. C.(1973)〕を参照し、比較検討した結果、両菌株は
有胞子桿菌であるバチルス（Bacillus）属の一種である
と認められる。しかし、両菌株は中性領域では生育でき
ず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことから、
いわゆる好アルカリ性（Alkaliphilic）微生物に属し、
従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。
更に、菌学的及び生理学的性質を公知の好アルカリ性バ
チルスと比較した〔Microbiol., 141, 1745(1995）〕結
果、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株は公知の好
アルカリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これ
らを新規菌株と判断して、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ
−Ｋ３８株をそれぞれ、第１６８１６号（ＦＥＲＭＰ
−１６８１６）及び第１６８１７号（ＦＥＲＭＰ−１
６８１７）として通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託した。

【００１５】上記の微生物を用いて本発明のアルカリ液
化型アミラーゼを得るには、培地に微生物を接種し、常
法に従って培養すればよく、好アルカリ性菌である為
に、培地のpHがアルカリ性であることが望ましい。斯く
して得られた培養物中から目的のアルカリ液化型アミラ
ーゼを採取することができる。この培養上清液は、その
まま使用することができるが、必要に応じて、塩析法、
沈殿法、限外濾過法の分離手段により粗酵素を得、更に
公知の方法により精製結晶化することにより精製酵素と
して使用することも可能である。

【００１６】以下、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ
の精製法の一例を挙げる。培養上清液について、（１）
硫安沈殿、（２）ＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー社
製）カラムクロマトグラフィー、（３）ゲル濾過をする
ことにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気
泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができ
る。

【００１７】更に、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ
は、例えば、本発明アルカリ液化型アミラーゼをコード
する遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを取
得し、次いで該プラスミドを用いて、適当な微生物、好
ましくはバチルス属細菌を形質転換し、これを培養する
ことにより得ることもできる。本発明のアルカリ液化型
アミラーゼをコードする遺伝子の例としては、配列番号
３及び４に記載した塩基配列を有するものが挙げられ
る。

【００１８】前記の如く本発明のアルカリ液化型アミラ
ーゼはアルカリ側に最適作用pHを有し、かつ高いキレー
ト剤耐性能を有するので、洗浄剤配合用酵素として特に
有用である。また、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３
８株由来のアミラーゼは、更に強力な酸化剤耐性も有す
るので、漂白剤等の酸化剤を配合する洗浄剤にも配合可
能である。本発明酵素の洗浄剤への配合量は、０．００
１〜５重量％が好ましい。

【００１９】本発明洗浄剤組成物には、前記アルカリ液
化型アミラーゼのほかに、公知の洗浄剤成分を配合する
ことができ、当該公知の洗浄成分としては、ＷＯ９４／
２６８８１の第５頁、右上欄、第１４行〜右下欄、第２
９行記載のもの、例えば界面活性剤、キレート剤、アル
カリ剤及び無機塩、漂白剤、蛍光剤等を使用することが
できる。

【００２０】界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６
０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗
浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物
については２０〜５０％配合することが好ましい。ま
た、本発明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄
機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、
好ましくは１〜５％配合される。二価金属イオン捕捉剤
は０．０１〜５０％、好ましくは５〜４０％配合され
る。アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０％、好まし
くは１〜４０％配合される。再汚染防止剤は０．００１
〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。本発明のア
ミラーゼ以外にプロテアーゼ、セルラーゼ、プロトペク
チナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、
β−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ等を使用することができる。これ
らの酵素は０．００１〜５％、好ましくは０．１〜３％
配合される。漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）
は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用する
とき漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０
％配合することができる。蛍光剤はビフェニル型蛍光剤
（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤
（例えばＤＭ型蛍光染）等が挙げられる。蛍光剤は０．
００１〜２％配合するのが好ましい。

【００２１】上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液
体、粉末、顆粒等とすることができる。また、この洗浄
剤組成物は、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、排水
管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することが
できる。

【００２２】

【実施例】酵素活性の測定には次の緩衝液を用い、以下
の方法に従って行った。 pH４．５〜６．０酢酸緩衝液 pH６．０〜８．０リン酸カリウム緩衝液 pH９．０〜１０．５グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 pH１０．０〜１２．０炭酸緩衝液 pH４．０〜１２．０ブリットン−ロビンソン緩衝液

【００２３】〔アミラーゼ活性測定方法〕１．試薬の調製法（１％可溶性澱粉水溶液の調製法）可溶性澱粉（ポテト
由来、シグマ社製）５ｇをイオン交換水４００mLに懸濁
した後、沸騰水中で攪拌しながら約１０分間加熱溶解
し、イオン交換水にて５００mLに定容する。（２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）
の調製法）グリシン（和光純薬社製特級）９．３８ｇを
イオン交換水約３００mLに溶解した後、pHメーターを用
い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを１０に調
整する。更にイオン交換水にて５００mLに定容する。（ＤＮＳ試薬の調製法）水酸化ナトリウム（和光純薬社
製特級）８ｇをイオン交換水３００mLに溶解する。これ
に３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ、和光純薬社製
特級）２．５ｇを徐々に添加しながら溶解する。ＤＮＳ
を完全に溶解させた後、酒石酸ナトリウムカリウム（和
光純薬社製特級）を１５０ｇ加える。完全に溶解させた
後、イオン交換水にて５００mLに定容する。（検量線作成用ブドウ糖溶液の調製法）ブドウ糖標準液
（光電用、和光純薬社製）とイオン交換水を用い、０、
１、２、３、４、５（μmol／０．１mL）のブドウ糖溶
液を調製する。２．アミラーゼ活性の測定法（酵素溶液の希釈）精製酵素を、δ吸光度〔＝（サンプ
ルの吸光度）−（ブランクの吸光度）〕が０．６以下に
なるように１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０）で希釈する。（サンプルの測定）試験管に１％可溶性澱粉水溶液０．
５mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）０．２mL、イオン交換水０．２mLを加え（以下、基
質溶液と略す）、これを５０℃の水浴中で約５分間予熱
する。予熱後、適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加
え、５０℃で、１５分間反応させる。反応終了後、ＤＮ
Ｓ試薬１．０mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色さ
せ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換
水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を
測定する。（ブランクの測定）試験管に基質溶液０．９mLを入れ、
これにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に酵素溶液０．
１mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色させ、直ちに氷
水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水４．０mLを
加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を測定する。（検量線の作成）試験管に基質溶液０．９mLを入れ、こ
れにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に各濃度の検量線
作成用ブドウ糖溶液０．１mLを加え、沸騰水中で５分間
加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、
イオン交換水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおけ
る吸光度を測定する。横軸にブドウ糖溶液の濃度（μmo
l／０．１mL）、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法によ
り傾きを求め、換算係数（Ｆ）を次式に従って算出す
る。換算係数（Ｆ）＝〔１／傾き〕×〔１／１５〕×〔１０
００／０．１〕尚、検量線は活性測定毎に作成するものとする。（活性の算出）酵素の力価は、１分間に１μmolのブド
ウ糖に相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（Ｕ）
とし、次式に従って算出する。アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ）＝〔δ吸光度〕×〔換算係数
（Ｆ）〕×〔酵素希釈倍率〕

【００２４】〔キレート剤耐性能試験方法〕（ＥＤＴＡ溶液の調製）ＥＤＴＡ（シグマ社製）９．３
ｇをイオン交換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを
用い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調
整する。更にイオン交換水にて１００mLに定容すること
によって２５０mM ＥＤＴＡ溶液を調製する。次にこれ
をイオン交換水で希釈して１０〜１００mMのＥＤＴＡを
調製する。ＥＧＴＡ（シグマ社製）９．５ｇをイオン交
換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを用い、約５Ｎ
の水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調整する。更に
イオン交換水にて１００mLに定容することによって２５
０mM ＥＧＴＡ溶液を調製する。次にこれをイオン交換
水で希釈して、１０〜１００mMのＥＧＴＡ溶液を調製す
る。（キレート剤耐性能の試験法）１mM ＥＤＴＡ、４０℃、３０分間処理の場合試験管に１０mM ＥＤＴＡ溶液０．１mL、２５０mMグリ
シン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．２mL、イオ
ン交換水０．１mLを加え、４５℃の水浴中で約５分間予
熱する。予熱後、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０）で適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加
え、４５℃で、３０分間保温する。３０分後、予め５０
℃の水浴中で予熱した基質溶液０．９mLに処理溶液０．
１mLを加え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素
活性を測定する。

【００２５】〔酸化剤耐性能試験方法〕試験管に過酸化
水素（３０％過酸化水素水、和光純薬社製）０．０６
７mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）０．２mL、イオン交換水０．６３３mLを加え、３０
℃の水浴中で約５分間予熱する。予熱後、１０mMグリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した
酵素溶液０．１mLを加え、３０℃で、６０分間保温す
る。６０分後、予め氷水中に準備したカタラーゼ（牛肝
臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）１μＬ添加試験
管に処理溶液０．２mLを加え、過酸化水素を失活させ反
応を停止する。その後、予め５０℃の水浴中で予熱した
基質溶液０．９mLにこの反応停止処理溶液０．１mLを加
え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測
定する。〔タンパク質定量法〕タンパク質は、バイオラッド社製
のプロテインアッセイキットII（カタログ番号５００−
０００２）を用い、標準アッセイ法に従って、キットに
添付されたウシ血清アルブミンを標準タンパク質として
定量した。

【００２６】実施例１キレート剤耐性能を有するアル
カリ液化型アミラーゼのスクリーニング土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加
熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈
して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、
これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落
の周に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出
し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分
離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培
養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレー
ト剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測
定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をス
クリーニングした。

【００２７】上述の方法により、バチルスエスピー
（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３６株及びバチルスエス
ピー（Bacillus sp.) ＫＳＭ−Ｋ３８株を取得すること
ができた。

【００２８】

【００３０】実施例２ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−
Ｋ３８株の培養実施例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３６株あるいはＫ
ＳＭ−Ｋ３８株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪
培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（pH
８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ
１１７７Ｕ及び５５７Ｕの活性を有していた。

【００３１】実施例３本発明のアルカリ液化型アミラ
ーゼの精製実施例２で得られたバチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３
６株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸ア
ンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、２
mM ＣａＣｌ₂を含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られ
た透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いてＯ−１Ｍ
の食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分
を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析すること
によってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１
０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動
で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。
尚、バチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清
液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。

【００３２】実施例４本発明アルカリ液化型アミラー
ゼのキレート剤耐性能実施例３でＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培
養上清液から得た本発明のアルカリ液化型アミラーゼ精
製品（以下、それぞれＫ３６及びＫ３８と略す）を用
い、各種キレート剤に対する耐性能を測定した。

【００３３】１）ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ耐性能終濃度０〜１００mMのＥＤＴＡ（シグマ社製）あるいは
ＥＧＴＡ（シグマ社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化
ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素
を添加し、所定の温度（３０℃、４０℃及び４５℃）で
３０分間処理を行った後、アミラーゼ活性測定法〔５０
mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に
準じて残存酵素活性を測定した。尚、対照として、バチ
ルスリケニフォルミス由来のアミラーゼである、ター
マミル及びデュラミル（いずれもノボ社製の造粒物より
精製したもの）を使用した。その結果、図１及び２に示
したように、Ｋ３６及びＫ３８とも高濃度のＥＤＴＡ及
びＥＧＴＡによっても全く影響を受けず、ターマミル及
びデュラミルと比べて、高度な耐性能を有することが明
らかになった。

【００３４】２）クエン酸及びゼオライト耐性能終濃度０〜０．５％のクエン酸三ナトリウム二水和物
（和光純薬社製特級）あるいは合成ゼオライトＡ−３
（和光純薬社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素を添加
し、所定の温度（４０℃及び４５℃）で３０分間処理を
行った後、アミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸
化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存酵素
活性を測定した。

【００３５】その結果、Ｋ３６及びＫ３８ともクエン酸
及びゼオライトにより全く影響を受けないことが示され
た（図３〜６）。

【００３６】実施例５本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの作用pH及び最適作用pH 終濃度５０mMの各種緩衝液〔酢酸緩衝液（pH４．５〜
６．０）、リン酸カリウム緩衝液（pH６．０〜８．
０）、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１
０．５）及び炭酸緩衝液（pH１０．０〜１２．０）〕を
用い、アミラーゼ活性測定法に準じてＫ３６及びＫ３８
を測定し、それぞれ最大の活性を１００％として、相対
活性で示した。この結果（図７及び８）、いずれも、pH
６．０〜１０．０の範囲で作用し、最適作用pHは８．０
〜９．０であることが明らかになった。尚、pHは反応液
の実測値を測定して示した。

【００３７】実施例６本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの酸化剤耐性能及び酵素比活性終濃度２％（５８０mM）のＨ₂Ｏ₂を含む５０mMグリシン
水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した
酵素（Ｋ３６、Ｋ３８、ターマミル及びデュラミル）を
添加し、３０℃で６０分間処理を行い、経時的にアミラ
ーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０）使用〕に準じて残存活性を測定した。酸化
剤耐性能はそれぞれ、未処理での活性を１００％とし
て、残存活性で示した。

【００３８】その結果（図９）、Ｋ３６及びＫ３８はい
ずれも、２％Ｈ₂Ｏ₂存在下、pH１０、３０℃、６０分間
処理後でも７０％以上、特に９４％以上の残存活性を維
持しており、充分な酸化剤耐性能を有することが認めら
れた。また、pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱
粉を基質）での酵素活性値と、プロテインアッセイキッ
ト（バイオラド社製）により測定したタンパク質量より
算出したＫ３６及びＫ３８の酵素比活性は、それぞれ、
４３００Ｕ／mg及び３６００Ｕ／mgとなり（表２）、両
酵素はいずれも３０００Ｕ／mg以上の比活性を有してお
り、タンパク工学によって構築された酸化剤耐性酵素
（ＬＡＭＹ・Ｍ２０２Ｔ（ＷＯ９８／４４１２６）及び
デュラミル）と比較して、極めて高い酵素比活性を有す
ることが明らかになった。従って、本発明のアルカリ液
化型アミラーゼは、洗剤への配合量などの面や工業的発
酵生産の面に於いて優位である。

【００３９】

【表２】

【００４０】実施例７本発明アルカリ液化型アミラー
ゼ（Ｋ３６及びＫ３８）のその他の酵素学的性質両精製酵素の解析を行った結果、以下の特性が明らかに
なった。

【００４１】（１）作用いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれ
らの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、
アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ
２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース
（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサ
オース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成
する。ただしプルランには作用しない。（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜
１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。（３）作用温度範囲及び最適作用温度いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温
度は５０〜６０℃である。（４）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に
て温度を変化させ、各温度で３０分間処理することによ
り失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以上
の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示
した。（５）分子量いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±
５，０００である。（６）等電点いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は
４．２付近である。（７）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル
硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン
酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウ
ム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及び
ソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、pH
１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活性
阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。（８）金属塩の影響各種金属塩と共存させて、pH１０、３０℃で３０分間処
理してその影響を調べた。Ｋ３６は、１mMのＭｎ²⁺によ
り阻害され（阻害率約９５％）、１mMのＨｇ²⁺、Ｂｅ²⁺
及びＣｄ²⁺により若干阻害される（阻害率３０〜４０
％）。Ｋ３８は、１mMのＭｎ²⁺により阻害され（阻害率
約７５％）、１mMのＳｒ²⁺及びＣｄ²⁺により若干阻害さ
れる（阻害率約３０％）。（９）Ｎ末端アミノ酸配列両アミラーゼのＮ末端アミノ酸配列をエンドマン分解法
〔Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 283,(1948）〕に
よりプロテイン−ケンサー（ＡＢＩ社製）４７７Ａを用
いて測定した結果、いずれも、Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Th
r-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu の配列を有す
ることが判った。

【００４２】実施例８本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの自動食器洗浄機用洗剤洗浄力評価本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３
８）の自動食器洗浄機用洗剤での洗浄評価を下記条件で
行った。別に対照として本発明酵素を含有しない洗剤を
用いた。１）汚染皿の調製沸騰水道水で煮沸した後、水道水を加えて溶液状にした
オートミール（クエーカー社製）１mLを磁性皿に塗布
し、室温で約３時間乾燥させた後、使用直前まで５℃
（半密閉状態）にて保存した。１回の洗浄には３枚供し
た。２）洗浄条件・使用機種；松下電器（株）製全自動食器洗い機ＮＰ−
８１０・洗浄温度；水温から約５５℃まで徐々に昇温する。・洗浄用水；水道水・洗浄剤濃度；０．２重量％・洗浄時間；洗浄約２０分→すすぎ約２０分（標準コー
ス）・洗浄時の循環水量；３．５Ｌ３）洗剤組成（％は重量％を示す）プルロニックＬ−６１２．２％、炭酸ナトリウム２
４．７％、炭酸水素ナトリウム２４．７％、過炭酸ナト
リウム１０．０％、１号珪酸ナトリウム１２．０％及び
クエン酸３ナトリウム２０．０％、ポリプロピレングリ
コール３０００２．２％、シリコーンＫＳＴ−０４（東
芝シリコーン社製）０．２％、ソカランＣＰ−４５（Ｂ
ＡＳＦ社製）４．０％。４）添加酵素量緩衝液としてグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）を用い、上述のアミラーゼ活性測定法により実施例
３で得られた精製酵素の活性値を測定し、洗浄当たり１
５０Ｕ添加した。５）洗浄力評価方法洗浄後の皿にヨウ素溶液を塗布し、ヨウ素−澱粉反応に
よる色を目視で判定した。

【００４３】その結果、本発明酵素含有洗剤を用いた場
合汚れを完全に除去でき、本発明酵素を含有しない場合
と比べ極めて優れた洗浄性能を有していた。

【００４４】実施例９ SaitoとMiuraの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 61
9(1961）〕によって抽出したＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳ
Ｍ−Ｋ３８株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、既知のバチル
ス属細菌由来の液化型アミラーゼに於いて保存性が高い
Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp配列、及びTrp-Phe-Lys-Pro-L
eu-Tyr配列を基にしてデザインした２種類のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、常法に従ってＰＣＲを行
った結果、いずれの場合も約１．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断
片が得られた。両ＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、次い
で、両断片の上流側、下流側のＤＮＡ断片を逆ＰＣＲ法
〔T. Trigliaら, Nucleic Acids Res., 16, 81(1988)〕
及びＰＣＲインビトロクローニングキット（ベーリンガ
ーマンハイム社製）を用いて取得し、その塩基配列の解
析を行った。この結果、両株ともに約１．７ｋｂの遺伝
子領域中に配列番号１及び２に示した５０１アミノ酸残
基をコードする唯一のオープンリーディングフレー
ム（Open reading frame, ORF)が見出され、アミノ末端
領域の配列（アミノ酸番号Asp1〜Leu15)が、ＫＳＭ−Ｋ
３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養液から精製されたア
ミラーゼＫ３６及びＫ３８のアミノ末端配列（１５アミ
ノ酸残基）と完全に一致することが明らかになった。決
定されたＫ３６及びＫ３８アミラーゼ遺伝子は、それぞ
れ、配列番号３及び４に示した塩基配列を有していた。

【００４５】実施例１０両株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、開
始コドンの０．７ｋｂ上流から終始コドンの０．１ｋｂ
下流までの１．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、シャトル
ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）を用い
て、枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入した。得られた組換
え体枯草菌株は、いずれも液体培養に於いて培養液中に
アミラーゼを生産した。実施例３に示した方法によって
培養上清からアミラーゼを精製し、その特性を解析した
ところ、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養
液から精製されたアミラーゼの特性と良く一致し、いず
れも作用至適pHはpH８〜９に認められ、pH１０に於いて
約４０００Ｕ／mgの比活性を有し、更に、キレート剤及
び酸化剤に対して高い耐性を有していることが明らかに
なった。

【００４６】

【発明の効果】本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、
今までに知られている洗剤用アミラーゼに比べて、高度
なキレート剤耐性能を有する。また最適作用pHは８を超
える。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼはア
ルカリ領域で澱粉を加工する工程など極めて広範囲の産
業分野で使用され得る。特に、キレート剤を含有する自
動食器洗浄機用洗剤、衣料用洗剤及び漂白剤等に配合す
ることにより有利に使用することができるものであり、
工業的に極めて大きな意義を有するものである。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Novel Amylase <130> P05631012 <160> 4 <210> 1 <211> 501 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Lys Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe Pro 5 10 15 Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr 20 25 30 Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp 35 40 45 Asp Ala Glu Ala Leu Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro 50 55 60 Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr 85 90 95 Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys 100 105 110 Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Leu 115 120 125 Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Ser 130 135 140 Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr 145 150 155 160 Gly Phe Asp Phe Pro Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp 165 170 175 Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu 180 185 190 Asn His Leu Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp 195 200 205 Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe 210 215 220 Ser His Pro Glu Val Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe 225 230 235 240 Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His 245 250 255 Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser Glu 260 265 270 Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val 275 280 285 Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu 290 295 300 Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln Gly 305 310 315 320 Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala 325 330 335 His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro 340 345 350 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala 355 360 365 Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr 370 375 380 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp 385 390 395 400 Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr 405 410 415 Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu 420 425 430 Gly Thr Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn 435 440 445 Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala Gly 450 455 460 Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr Ile 465 470 475 480 Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser 485 490 495 Val Tyr Val Asn Gln 500

【００４８】 <210> 2 <211> 501 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Arg Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe Pro 5 10 15 Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr 20 25 30 Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp 35 40 45 Asp Ala Ala Ala Leu Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro 50 55 60 Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr 65 70 75 80 Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr 85 90 95 Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys 100 105 110 Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met 115 120 125 Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr 130 135 140 Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr 145 150 155 160 Gly Phe Asp Phe Ser Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp 165 170 175 Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu 180 185 190 Asn His Ile Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp 195 200 205 Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe 210 215 220 Ser His Pro Glu Val Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe 225 230 235 240 Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His 245 250 255 Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu 260 265 270 Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val 275 280 285 Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu 290 295 300 Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly 305 310 315 320 Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala 325 330 335 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro 340 345 350 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala 355 360 365 Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr 370 375 380 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp 385 390 395 400 Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr 405 410 415 Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu 420 425 430 Gly Ser Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn 435 440 445 Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly 450 455 460 Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile 465 470 475 480 Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser 485 490 495 Val Tyr Val Asn Gln 500

【００４９】 <210> 3 <211> 1650 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 3 cttgaatcat tatttaaagc tggttatgat atatgtaagc gttatcatta aaaggaggta 60 tttg atg aaa aga tgg gta gta gca atg ctg gca gtg tta ttt tta ttt 109 Met Lys Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu Phe 5 10 15 cct tcg gta gta gtt gca gat ggc ttg aat gga acg atg atg cag tat 157 Pro Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr 20 25 30 tat gag tgg cat cta gag aat gat ggg caa cac tgg aat cgg ttg cat 205 Tyr Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His 35 40 45 gat gat gcc gaa gct tta agt aat gcg ggt att aca gct att tgg ata 253 Asp Asp Ala Glu Ala Leu Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile 50 55 60 ccc cca gcc tac aaa gga aat agt cag gct gat gtt ggg tat ggt gca 301 Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala 65 70 75 tac gac ctt tat gat tta ggg gag ttt aat caa aaa ggt acc gtt cga 349 Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg 80 85 90 95 acg aaa tac ggg aca aag gct cag ctt gag cga gct ata ggg tcc cta 397 Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu 100 105 110 aag tcg aat gat atc aat gtt tat ggg gat gtc gta atg aat cat aaa 445 Lys Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys 115 120 125 tta gga gct gat ttc acg gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cct 493 Leu Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro 130 135 140 tcg aac cgt tgg cag gat att tca ggt gtc tac acg att gat gca tgg 541 Ser Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp 145 150 155 acg gga ttt gac ttt cca ggg cgc aac aat gcc tat tcc gat ttt aaa 589 Thr Gly Phe Asp Phe Pro Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys 160 165 170 175 tgg aga tgg ttc cat ttt aat ggc gtt gac tgg gat caa cgc tat caa 637 Trp Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln 180 185 190 gaa aac cat ctt ttt cgc ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg 685 Glu Asn His Leu Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val 195 200 205 gat gaa gag aat ggt aat tat gac tat tta tta gga tcg aac att gac 733 Asp Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp 210 215 220 ttt agc cac cca gag gtt caa gag gaa tta aag gat tgg ggg agc tgg 781 Phe Ser His Pro Glu Val Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp 225 230 235 ttt acg gat gag cta gat tta gat ggg tat cga ttg gat gct att aag 829 Phe Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys 240 245 250 255 cat att cca ttc tgg tat acg tca gat tgg gtt agg cat cag cga agt 877 His Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser 260 265 270 gaa gca gac caa gat tta ttt gtc gta ggg gag tat tgg aag gat gac 925 Glu Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp 275 280 285 gta ggt gct ctc gaa ttt tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct 973 Val Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser 290 295 300 cta ttc gat gtt ccg ctc aat tat aat ttt tac cgg gct tca aag caa 1021 Leu Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln 305 310 315 ggc gga agc tat gat atg cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa 1069 Gly Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu 320 325 330 335 gca cat ccg att cat gca gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag 1117 Ala His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln 340 345 350 cca gga gag tca tta gaa tca tgg gtc gct gat tgg ttt aag cca ctt 1165 Pro Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu 355 360 365 gct tat gcg aca atc ttg acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt 1213 Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe 370 375 380 tac ggt gac tac tat ggg att cct aac gat aac att tca gct aag aag 1261 Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys 385 390 395 gat atg att gat gag ttg ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc 1309 Asp Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly 400 405 410 415 aca caa cat gac tat ttt gat cat tgg gat atc gtt gga tgg aca aga 1357 Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg 420 425 430 gaa ggt aca tcc tca cgt cct aat tcg ggt ctt gct act att atg tcc 1405 Glu Gly Thr Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser 435 440 445 aat ggt cct gga gga tca aaa tgg atg tac gta gga cag caa cat gca 1453 Asn Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala 450 455 460 gga caa acg tgg aca gat tta act ggc aat cac gcg gcg tcg gtt acg 1501 Gly Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr 465 470 475 att aat ggt gat ggc tgg ggc gaa ttc ttt aca aat gga gga tct gta 1549 Ile Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val 480 485 490 495 tcc gtg tat gtg aac caa taataaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactca 1605 Ser Val Tyr Val Asn Gln 500 aggctttctt tatgtcgttt agctcaacgc ttctacgaag cttta 1650

【００５０】 <210> 4 <211> 1745 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 4 aactaagtaa catcgattca ggataaaagt atgcgaaacg atgcgcaaaa ctgcgcaact 60 actagcactc ttcagggact aaaccacctt ttttccaaaa atgacatcat ataaacaaat 120 ttgtctacca atcactattt aaagctgttt atgatatatg taagcgttat cattaaaagg 180 aggtatttg atg aga aga tgg gta gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta 231 Met Arg Arg Trp Val Val Ala Met Leu Ala Val Leu Phe Leu 5 10 ttt cct tcg gta gta gtt gca gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag 279 Phe Pro Ser Val Val Val Ala Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln 15 20 25 30 tat tat gag tgg cat ttg gaa aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg 327 Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu 35 40 45 cac gat gat gcc gca gct ttg agt gat gct ggt att aca gct att tgg 375 His Asp Asp Ala Ala Ala Leu Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp 50 55 60 att ccg cca gcc tac aaa ggt aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt 423 Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly 65 70 75 gca tac gat ctt tat gat tta gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt 471 Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val 80 85 90 cga acg aaa tac gga act aag gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc 519 Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser 95 100 105 110 ctt aaa tct aat gat atc aat gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat 567 Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His 115 120 125 aaa atg gga gct gat ttt acg gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat 615 Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn 130 135 140 cca acg aat cgt tgg cag gat att tca ggt gcc tac acg att gat gcg 663 Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala 145 150 155 tgg acg ggt ttc gac ttt tca ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt 711 Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe 160 165 170 aag tgg aga tgg ttc cat ttt aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat 759 Lys Trp Arg Trp Phe His Phe Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr 175 180 185 190 caa gaa aat cat att ttc cgc ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga 807 Gln Glu Asn His Ile Phe Arg Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg 195 200 205 gtg gat gaa gag aac ggt aat tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc 855 Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile 210 215 220 gac ttt agt cat cca gaa gta caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc 903 Asp Phe Ser His Pro Glu Val Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser 225 230 235 tgg ttt acc gat gag tta gat ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att 951 Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile 240 245 250 aaa cat att cca ttc tgg tat aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc 999 Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg 255 260 265 270 aac gaa gca gat caa gat tta ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat 1047 Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp 275 280 285 gac gta ggt gct ctc gaa ttt tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg 1095 Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met 290 295 300 tct cta ttc gat gtt cca ctt aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa 1143 Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln 305 310 315 caa ggt gga agc tat gat atg cgt aat att tta cga gga tct tta gta 1191 Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val 320 325 330 gaa gcg cat ccg atg cat gca gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act 1239 Glu Ala His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr 335 340 345 350 cag cca ggg gag tca tta gag tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca 1287 Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro 355 360 365 ctt gct tat gcg aca att ttg acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta 1335 Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val 370 375 380 ttt tac ggt gat tac tat ggg att cct aac gat aac att tca gct aaa 1383 Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys 385 390 395 aaa gat atg att gat gag ctg ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat 1431 Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr 400 405 410 ggc acg cag cat gac tat ttt gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act 1479 Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr 415 420 425 430 agg gaa gga tct tcc tcc aga cct aat tca ggc ctt gcg act att atg 1527 Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met 435 440 445 tcg aat gga cct ggt ggt tcc aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat 1575 Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn 450 455 460 gca gga caa aca tgg aca gat tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt 1623 Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val 465 470 475 aca att aat ggc gat gga tgg ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct 1671 Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser 480 485 490 gta tcc gtg tac gtg aac caa taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaa 1726 Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 495 500 ctcaaggctt tctttatgt 1745

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＤＴＡ処理濃
度と残存活性との関係を示す図面である。

【図２】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＧＴＡ処理濃
度と残存活性との関係を示す図面である。

【図３】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のゼ
オライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面であ
る。

【図４】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のク
エン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。

【図５】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のゼ
オライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面であ
る。

【図６】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のク
エン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。

【図７】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６の反
応pHと相対活性との関係を示す図面である。

【図８】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８の反
応pHと相対活性との関係を示す図面である。

【図９】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＨ₂Ｏ₂処理時間
と残存活性との関係を示す図面である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者林康弘栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者五十嵐一暁栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者遠藤圭二栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者尾崎克也栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA13 CA01 CA20 DA07 EA04 FA15 GA11 GA19 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 FF03E FF04E FF05E FF11E FF12E FF13E KK02 KK06 KK14 LL04 4H003 EC01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴ
Ａ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性
が７０％以上であるアルカリ液化型アミラーゼ。
【請求項２】更に次の酵素学的性質を有するものであ
る請求項１記載のアルカリ液化型アミラーゼ。１）最適作用pH 最適作用pHが８．０を超える（可溶性澱粉を基質、５０
℃、１５分間反応）。２）作用澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロース
からはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マル
トトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、
マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ
６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただ
しプルランには作用しない。３）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の
範囲で７０％以上の残存活性を示す。４）作用温度範囲及び最適作用温度２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜
６０℃である。５）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中、
３０分間処理で、４０℃で８０％以上の残存活性を示
し、４５℃でも約６０％の残存活性を示す。
【請求項３】配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列
と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するも
のである請求項１又は２記載のアルカリ液化型アミラー
ゼ。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載のアル
カリ液化型アミラーゼをコードするＤＮＡ断片。
【請求項５】請求項１〜３のいずれか１項記載のアル
カリ液化型アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。