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JP2000081434A - サイログロブリンの測定方法 - Google Patents

サイログロブリンの測定方法

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Publication number
JP2000081434A
JP2000081434A JP11180130A JP18013099A JP2000081434A JP 2000081434 A JP2000081434 A JP 2000081434A JP 11180130 A JP11180130 A JP 11180130A JP 18013099 A JP18013099 A JP 18013099A JP 2000081434 A JP2000081434 A JP 2000081434A
Authority
JP
Japan
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sugar chain
binding protein
chain structure
thyroglobulin
binding
Prior art date
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Pending
Application number
JP11180130A
Other languages
English (en)
Inventor
Ryoji Kato
亮二 加藤
Masayuki Maruyama
正幸 丸山
Kenji Nakamura
賢治 中村
Kayoko Shimizu
佳代子 志水
Shinji Satomura
慎二 里村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Original Assignee
Wako Pure Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Wako Pure Chemical Industries Ltd filed Critical Wako Pure Chemical Industries Ltd
Priority to JP11180130A priority Critical patent/JP2000081434A/ja
Publication of JP2000081434A publication Critical patent/JP2000081434A/ja
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 容易に且つ簡便に生体由来試料中の各種Ｔｇ
を測定できる方法、この測定結果に基づき甲状腺腫瘍の
悪性度を鑑別し得る方法並びに試薬の提供。 【解決手段】 サイログロブリンの不変領域に結合する
タンパク質と、特定の糖鎖構造を有するサイログロブリ
ンの当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫
々１以上用いることを特徴とする、サイログロブリンの
測定方法、この測定結果に基づき甲状腺腫瘍の悪性度を
鑑別し得る方法並びに試薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サイログロブリン（以
下、「Ｔｇ」と略記する。）の測定方法に関するもので
あり、特に特定の糖鎖構造を有するＴｇの測定方法に関
する。また、本発明は、特定の糖鎖構造を有するＴｇの
量を求め、この量に基づいて、甲状腺腫瘍悪性度を鑑別
する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】Ｔｇは甲状腺組織から分泌され、分子量
33万のサブユニットのダイマーで構成される分子量66万
の糖タンパク質であり、良性または悪性の甲状腺疾患に
おいて、細胞中や血液中の濃度が上昇することが知られ
ている。このため血液中のＴｇ量の測定は甲状腺癌手術
後の経過観察に使用されている。しかしながら、血液中
のＴｇ量で、甲状腺腫瘍の良性、悪性を鑑別することは
できない。
【０００３】そのため、甲状腺腫瘍の悪性度の鑑別のた
めには、超音波診断、穿刺吸引細胞診がおこなわれてい
る。しかし、超音波診断では卓越した診断技術が要求さ
れ、また、穿刺吸引細胞診では、採取した細胞を培養す
る場合には鑑別までに数日間かかることや採取した細胞
を観察することにより鑑別する場合には熟練を要する、
等の問題がある。更に、穿刺吸引細胞診においては、濾
胞腺癌と濾胞腺腫との鑑別が困難であるという問題もあ
る。
【０００４】更に、甲状腺腫瘍の良性と悪性の違いにつ
いて腫瘍細胞表面の糖鎖をレクチンなどの糖認識タンパ
ク質を用いて鑑別する方法が試みられ、良性甲状腺腫瘍
と甲状腺癌とで糖鎖が変化していることが判明するに至
った。しかし、この方法は、採取した各細胞を標識糖鎖
認識タンパク質と反応後、顕微鏡下でこの標識物の量を
確認するというものであるため、検査に熟練を要すると
いうことや、定量的な評価をすることが難しい、等の問
題がある。
【０００５】一方、良性腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞より
Ｔｇを夫々精製し、その糖鎖構造を解析した結果、良性
腫瘍と悪性腫瘍とでは結合している糖鎖の構造が違って
いることが明らかになっている。しかしこの方法でも、
採取した細胞からＴｇを精製したり、その糖鎖構造を解
析するために長時間かかるという問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上のような状況か
ら、本発明が解決しようとする課題は、容易に且つ簡便
に生体由来試料中の各種Ｔｇを測定できる方法、この測
定結果に基づき甲状腺腫瘍の悪性度を鑑別し得る方法並
びに試薬の提供にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような課
題を解決するために成されたものであり、（１）Ｔｇの
不変領域に結合するタンパク質と、特定の糖鎖構造を有
するＴｇの当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質
を、夫々１以上用いることを特徴とする、Ｔｇの測定方
法、（２）Ｔｇの不変領域に結合するタンパク質と、特
定の糖鎖構造を有するＴｇの当該糖鎖構造に特異的に結
合するタンパク質を、夫々１以上含有してなる、Ｔｇ測
定用試薬、（３）特定の糖鎖構造を有するＴｇ量又はそ
れ以外の糖鎖構造を有するＴｇ量に基づいて鑑別を行う
ことを特徴とする、甲状腺腫瘍の悪性度鑑別方法、
（４）Ｔｇの不変領域に特異的に結合するタンパク質
と、特定の糖鎖構造を有するＴｇの当該糖鎖構造に特異
的に結合するタンパク質を、夫々１以上含有してなる、
甲状腺腫瘍の悪性度鑑別用試薬、に関する。
【０００８】即ち、本発明者らは、上記した如き課題を
解決するために鋭意研究した結果、Ｔｇに特異的に結合
するタンパク質と、特定の糖鎖構造を有するＴｇの当該
糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫々１以上
用いることにより、生体試料中のＴｇの総量、特定の糖
鎖構造を有するＴｇ量又は／及びそれ以外の糖鎖構造を
有するＴｇ量を測定し得ることを見出し、更に研究を重
ねた結果、得られる、特定の糖鎖構造を有するＴｇ量又
はそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇ量、或いは全Ｔｇ中
の特定の糖鎖構造を有するＴｇ又はそれ以外の糖鎖構造
を有するＴｇの割合が、甲状腺腫瘍の悪性度鑑別に有用
であることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００９】本発明に係るＴｇの不変領域に結合するタ
ンパク質（以下、「Ｔｇ結合タンパク質」と略記す
る。）としては、例えばＴｇの不変領域に結合する抗Ｔ
ｇ抗体、Ｔｇ結合レセプター等が挙げられる。また、こ
れらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いてもよ
い。尚、Ｔｇの不変領域とは、生体試料中の全てのＴｇ
に共通な構造領域のことを指す。また、本発明に係るＴ
ｇ結合タンパク質は、Ｔｇの不変領域以外の領域にも結
合する性質を有していてもよい。
【００１０】Ｔｇ結合タンパク質には、特定の糖鎖構造
を有するＴｇの当該特定糖鎖構造に特異的に結合するタ
ンパク質（以下、「特定糖鎖結合タンパク質」と略記す
る。）が結合したＴｇとは結合しない性質を有するＴｇ
結合タンパク質（以下、「競合性Ｔｇ結合タンパク質」
と略記する。）や特定糖鎖結合タンパク質の結合の有無
に拘わらず、全てのＴｇと結合し得る性質を有するＴｇ
結合タンパク質（以下、「非競合性Ｔｇ結合タンパク
質」と略記する。）等が含まれる。
【００１１】Ｔｇの不変領域に結合する抗Ｔｇ抗体は、
このような性質を有する抗体であれば、常法、例えば
［免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版
センター、1981］等に記載の方法に従って、例えば馬、
牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象
を免役して作製されるポリクローナル性抗体でも、或い
はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Nature、256
巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従っ
て、例えばマウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対象物
で予め免役されたマウスの脾臓細胞を融合させて得られ
るハイブリドーマが産出する単クローン性抗体でもよ
い。
【００１２】本発明に係る特定糖鎖結合タンパク質とし
ては、例えばＴｇの特定糖鎖構造に特異的に結合する抗
体、レクチンなどが挙げられる。より具体的には、例え
ばルイス型糖鎖に反応する、例えば抗Ｌｅa抗体、抗Ｌ
ｅb抗体、抗Ｌｅx抗体、抗Ｌｅy抗体、抗Ｓ−Ｌｅa抗体
等の抗体類、例えばミヤコグサレクチン等のＬ−フコー
ス結合性レクチン、例えばピーナッツレクチン，ダイズ
レクチン，ヒマレクチン，インゲンマメレクチン等のＤ
−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン
結合性レクチン、例えばコンカナバリンＡ，レンズマメ
レクチン，エンドウマメレクチン等のＤ−マンノース結
合性レクチン、例えば小麦胚芽レクチン，ダツラレクチ
ン等のＮ−アセチルグルコサミン結合性レクチン、例え
ばカブトガニレクチン等のシアル酸結合性レクチン等の
レクチン類が挙げられる。中でもＤ−ガラクトース又は
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチン、Ｄ
−マンノース結合性レクチン等が好ましい。また、これ
らは単独で用いても、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００１３】尚、上記のレクチンの分類に於いて、結合
性とは、適当な糖鎖を結合させたアフィニティーカラム
に一旦結合させたレクチンがどのような糖で溶出され易
いかを示すもので、例えばＤ−ガラクトース又はＮ−ア
セチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチンとは、アフ
ィニティーカラムに一旦結合させた後、Ｄ−ガラクトー
ス若しくはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンにより溶
出されるレクチンのことを意味する。
【００１４】また、特定糖鎖構造に特異的に結合する抗
体も、上記した如き常法に準じて調製されたポリクロー
ン性抗体でも単クローン性抗体でもよい。
【００１５】本発明において、特定糖鎖構造とは、より
具体的には、上記した如きレクチンが結合し得る糖鎖
構造、例えば甲状腺腫瘍細胞等の腫瘍細胞が産生する
Ｔｇが有する糖鎖構造、等であり、更に具体的には例え
ば Yamamoto, K., Eur. J.Biochem.,vol.143,133-144,
1984等の文献に記載された如き糖鎖構造である。
【００１６】本発明の測定方法は、Ｔｇ結合タンパク質
と特定糖鎖結合タンパク質とを適宜組み合わせて、例え
ば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、尿等
の生体由来試料中の種々のＴｇを測定することを特徴と
するものであり、その具体的な測定対象は、例えば総Ｔ
ｇ、特定の糖鎖構造を有するＴｇ、それ以外の糖鎖構造
を有するＴｇ等である。尚、Ｔｇは、生体中で分解作用
により、種々のフラグメントになるが、このようなもの
であってもＴｇ結合タンパク質又は／及び特定糖鎖結合
タンパク質が結合し得るものは、本発明の測定対象であ
る。これら測定対象は、別々に測定してもよいし、一度
の測定で同時に測定してもよい。
【００１７】以下に、本発明の実施態様について述べ
る。 （１）生体由来試料と、Ｔｇ結合タンパク質又は特定
糖鎖結合タンパク質とを反応させて、[Ｔｇ結合タンパ
ク質]−[Ｔｇ]又は[特定糖鎖結合タンパク質]−[Ｔｇ]
の複合体を形成させる。 次いで、得られた複合体に、適当な標識物質が結合し
た特定糖鎖結合タンパク質（以下、「標識特定糖鎖結合
タンパク質」と略記する。）又は適当な標識物質が結合
したＴｇ結合タンパク質（以下、「標識Ｔｇ結合タンパ
ク質」と略記する）を反応させて、[Ｔｇ結合タンパク
質]−[Ｔｇ]−[標識特定糖鎖結合タンパク質]又は[特定
糖鎖結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[標識Ｔｇ結合タンパク
質]の複合体を形成させる。 次いで、遊離の標識特定糖鎖結合タンパク質又は標識
Ｔｇ結合タンパク質を除去した後、 で得られた複合体中の標識物質量を測定し、その値
をもとに特定糖鎖構造を有するＴｇ量を求める。
【００１８】（２）生体由来試料と、標識特定糖鎖結
合タンパク質と、非競合性Ｔｇ結合タンパク質とを反応
させて、[標識特定糖鎖結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[非
競合性Ｔｇ結合タンパク質]の複合体を形成させる。 次いで、得られた複合体と遊離の標識特定糖鎖結合タ
ンパク質とを分離した後、 で得られた複合体中の標識物質量を測定し、その値
をもとに特定糖鎖構造を有するＴｇ量を求める。
【００１９】（３）生体由来試料と、特定糖鎖結合タ
ンパク質とを反応させて、[Ｔｇ]−[特定糖鎖結合タン
パク質]の複合体を形成させる。 次いで、得られた複合体と、特定糖鎖結合タンパク質
が結合しなかったＴｇとを分離し、 複合体中の特定糖鎖構造を有するＴｇ量又は特定の糖
鎖構造以外の糖鎖構造を有するＴｇ量を求める。
【００２０】（４）生体由来試料と、Ｔｇ結合タンパ
ク質とを反応させて、[Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]の
複合体を形成させる。 次いで、特定糖鎖結合タンパク質と、適当な標識物質
を結合させた競合性Ｔｇ結合タンパク質（以下、「標識
競合性Ｔｇ結合タンパク質」と略記する。）を反応させ
て、[Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[特定糖鎖結合タ
ンパク質]と、[Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[標識競
合性Ｔｇ結合タンパク質]の複合体を形成させる。 次いで、遊離の標識競合性Ｔｇ結合タンパク質を除去
した後、 で得られた複合体中の標識物質量を測定し、その値
をもとに特定の糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＴｇ量
を求める。
【００２１】（５）生体由来試料と、特定糖鎖結合タ
ンパク質とを反応させ、次いで競合性Ｔｇ結合タンパク
質を反応させて、複合体(a)[特定糖鎖結合タンパク質]
−[Ｔｇ]と複合体(b)[競合性Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔ
ｇ]の複合体を形成させる。 次いで、得られた複合体(b)を分離し、 該複合体(b)に標識Ｔｇ結合タンパク質を反応させ
て、複合体(c)[競合性Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−
[標識Ｔｇ結合タンパク質]の複合体を形成させた後、 遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質を分離し、 で得られた複合体(c)中の標識物質量を測定し、そ
の値をもとに特定の糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＴ
ｇ量を求める。
【００２２】（６）生体由来試料と、特定糖鎖結合タ
ンパク質と、標識競合性Ｔｇ結合タンパク質とを反応さ
せて、複合体(a)[特定糖鎖結合タンパク質]−[Ｔｇ]と
複合体(b)[標識競合性Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]の
複合体を形成させる。 次いで、複合体(b)を遊離の標識競合性Ｔｇ結合タン
パク質及び複合体(a)から分離し、 複合体(b)中の標識物質の量を測定し、その値をもと
に特定の糖鎖構造以外の糖鎖構造を有するＴｇ量を求め
る。
【００２３】（７）生体由来試料と、標識Ｔｇ結合タ
ンパク質と、特定糖鎖結合タンパク質とを反応させて、
複合体(a)[標識Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]と、複合
体(b)[標識Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[特定糖鎖結
合タンパク質]の複合体を形成させる。 次いで、遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質を除去した
後、 で得られた複合体(a)と複合体(b)中の標識物質量を
夫々測定し、その値をもとに特定の糖鎖構造を有するＴ
ｇ量、それ以外の糖鎖構造を有するＴｇ量、及び総Ｔｇ
量を求める。
【００２４】（８）生体由来試料と、適当な標識物質
が結合した非競合性Ｔｇ結合タンパク質（以下、「標識
非競合性Ｔｇ結合タンパク質」と略記する。）と特定糖
鎖結合タンパク質と、競合性Ｔｇ結合タンパク質とを反
応させて、複合体(a)[標識非競合性Ｔｇ結合タンパク
質]−[Ｔｇ]−[競合性Ｔｇ結合タンパク質]と複合体(b)
[標識非競合性Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[特定糖
鎖結合タンパク質]の複合体を形成させる。 次いで、遊離の標識非競合性Ｔｇ結合タンパク質、複
合体(a)及び複合体(b)を分離し、 で得られた複合体(ａ)又は複合体(b)中の標識物質
量を夫々測定し、その値をもとに特定の糖鎖構造を有す
るＴｇ量、それ以外の糖鎖構造を有するＴｇ量及び総Ｔ
ｇ量を求める。
【００２５】（９）生体由来試料と、標識Ｔｇ結合タ
ンパク質と特定糖鎖結合タンパク質と、競合性Ｔｇ結合
タンパク質とを反応させて、複合体(a)[標識Ｔｇ結合タ
ンパク質]−[Ｔｇ]−[競合性Ｔｇ結合タンパク質]と複
合体(b)[標識Ｔｇ結合タンパク質]−[Ｔｇ]−[特定糖鎖
結合タンパク質]の複合体を形成させる。 次いで、遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質、複合体(a)
及び複合体(b)を分離し、 で得られた複合体(ａ)又は複合体(b)中の標識物質
量を夫々測定し、その値をもとに特定の糖鎖構造を有す
るＴｇ量、それ以外の糖鎖構造を有するＴｇ量及び総Ｔ
ｇ量を求める。
【００２６】以下に測定方法の具体例を述べる。 Ｉ．測定対象を別々に測定する方法。 測定対象、即ち、例えば総Ｔｇ、特定の糖鎖構造を有す
るＴｇ、それ以外の糖鎖構造を有するＴｇ等は、夫々例
えば以下のようにして測定される。 Ｉ−１．総Ｔｇの測定 Ｔｇ結合タンパク質を用いる自体公知の測定法により測
定すればよい。
【００２７】Ｉ−２．特定の糖鎖構造を有するＴｇの測
定 Ｉ−２−１）Ｔｇ結合タンパク質固定化不溶性担体を用
いる方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
尿等の生体由来試料と、Ｔｇ結合タンパク質固定化不溶
性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形成させ
る。 ［不溶性担体］−Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識特定糖鎖結合タンパク質を反応
させて、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−標識特定
糖鎖結合タンパク質次いで、当該固定化複合体を洗浄す
る等して遊離の標識特定糖鎖結合タンパク質を除去した
後、当該固定化複合体中の標識物質量を適当な方法によ
り測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既知の特
定糖鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用いて同様の方
法により測定を行って得られた、標識物質量（測定値）
とＴｇ濃度との関係を表す検量線等に当てはめる等する
ことにより、試料中の特定糖鎖構造を有するＴｇ量を求
めることができる。
【００２８】Ｉ−２−２）特定糖鎖結合タンパク質固定
化不溶性担体を用いる方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合タンパク質固定化
不溶性担体とを反応させて、下記の固定化複合体を形成
させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合タンパク質−Ｔｇ 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に、更に標識Ｔｇ結合タンパク質を反応させ
て、下記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−特定糖鎖結合タンパク質−Ｔｇ−標識
Ｔｇ結合タンパク質次いで、当該固定化複合体を洗浄す
る等して遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質を除去した後、
当該固定化複合体中の標識物質量を適当な方法により測
定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既知の特定糖
鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用いて同様の方法に
より測定を行って得られた、標識物質量（測定値）とＴ
ｇ濃度との関係を表す検量線等に当てはめる等すること
により、試料中の特定糖鎖構造を有するＴｇ量を求める
ことができる。
【００２９】Ｉ−２−３）標識特定糖鎖結合タンパク質
と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等とを用い
る方法。 例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
尿等の生体由来試料と、標識特定糖鎖結合タンパク質と
非競合性Ｔｇ結合タンパク質とを反応させて、試料中に
下記の複合体を形成させる。 標識特定糖鎖結合タンパク質−Ｔｇ−非競合性Ｔｇ結合
タンパク質 次いで、この複合体と遊離の標識特定糖鎖結合タンパク
質とを、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法
等を用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な方
法により測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既
知の特定糖鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用いて同
様の方法により測定を行って得られた、標識物質量（測
定値）とＴｇ濃度との関係を表す検量線等に当てはめる
等することにより、試料中の特定糖鎖構造を有するＴｇ
量を求めることができる。
【００３０】Ｉ−３．特定の糖鎖構造以外の糖鎖構造を
有するＴｇの測定 Ｉ−３−１）遊離の特定糖鎖結合タンパク質を用いる方
法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合タンパク質
とを反応させ、試料中の特定糖鎖構造を有するＴｇと特
定糖鎖結合タンパク質との複合体（以下、「糖鎖結合Ｔ
ｇ」と略記する場合がある。）を生成させる。次いで、
糖鎖結合Ｔｇと、特定糖鎖結合タンパク質が結合しなか
ったＴｇ、言い換えれば、特定の糖鎖構造以外の糖鎖構
造を有するＴｇ（以下、「非結合Ｔｇ」と略記する場合
がある。）とを、例えば、遠心分離法、ゲル濾過法、分
子分画膜法、電気泳動法等の自体公知の分離方法を利用
して試料から分離することにより非結合Ｔｇのみを含む
試料を調製する。このようにして得られた、非結合Ｔｇ
のみを含む試料中のＴｇ量を、Ｔｇ結合タンパク質を用
いる自体公知の測定法により測定することにより、非結
合Ｔｇ量を求めることができる。尚、非結合Ｔｇのみを
含有する試料は、特定糖鎖結合タンパク質を固定化した
担体を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって
試料を処理することにより調製してもよい。
【００３１】Ｉ−３−２）競合性Ｔｇ結合タンパク質を
用いる方法 先ず、Ｔｇ結合タンパク質を固定化した不溶性担体と、
例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、
尿等の生体由来試料とを反応させ、下記の固定化複合体
を形成させる。 ［不溶性担体］−Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に特定糖鎖結合タンパク質を反応させ、更に
標識競合性Ｔｇ結合タンパク質を反応させて、下記の固
定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−特定糖鎖
結合タンパク質 ［不溶性担体］−Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−標識競合
性Ｔｇ結合タンパク質 次いで、当該固定化複合体を洗浄する等して遊離の標識
競合性Ｔｇ結合タンパク質を除去した後、当該固定化複
合体中の標識物質量を適当な方法により測定し、得られ
た測定値を、例えば予め濃度既知の特定糖鎖構造以外の
糖鎖構造を有するＴｇ、即ち、非結合Ｔｇを含む標準液
を用いて同様の方法により測定を行って得られた、標識
物質量（測定値）とＴｇ濃度との関係を表す検量線等に
当てはめる等することにより、試料中の非結合Ｔｇ量を
求めることができる。
【００３２】Ｉ−３−３）競合性Ｔｇ結合タンパク質固
定化不溶性担体を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合タンパク質
とを反応させ、試料中に糖鎖結合Ｔｇを生成させる。次
いで、この試料と、競合性Ｔｇ結合タンパク質固定化不
溶性担体とを反応させて下記の固定化複合体を生成させ
る。 ［不溶性担体］−競合性Ｔｇ結合タンハ゜ク質−非結合Ｔｇ 次いで、不要な共存物質を洗浄等で除去した後、当該固
定化複合体に標識Ｔｇ結合タンパク質を反応させて、下
記の固定化複合体を形成させる。 ［不溶性担体］−競合性Ｔｇ結合タンハ゜ク質−非結合Ｔｇ
−標識Ｔｇ結合タンハ゜ク質次いで、当該固定化複合体を洗
浄する等して遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質を除去した
後、当該固定化複合体中の標識物質量を適当な方法によ
り測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度既知の非
結合Ｔｇを含む標準液を用いて同様の方法により測定を
行って得られた、標識物質量（測定値）とＴｇ濃度との
関係を表す検量線等に当てはめる等することにより、試
料中の非結合Ｔｇ量を求めることができる。
【００３３】Ｉ−３−４）標識競合性Ｔｇ結合タンパク
質とＨＰＬＣ等を用いる方法。 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、尿等の生体由来試料と、特定糖鎖結合タンパク質
とを反応させ、糖鎖結合Ｔｇを生成させる。次いで、こ
の試料と、標識競合性Ｔｇ結合タンパク質とを反応させ
て下記の複合体を生成させる。 非結合Ｔｇ−標識競合性Ｔｇ結合タンパク質 次いで、この複合体と遊離の標識競合性Ｔｇ結合タンパ
ク質とを、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動
法等を用いて分離し、該複合体中の標識物質量を適当な
方法により測定し、得られた測定値を、例えば予め濃度
既知の非結合Ｔｇを含む標準液を用いて同様の方法によ
り測定を行って得られた、標識物質量（測定値）とＴｇ
濃度との関係を表す検量線等に当てはめること等によ
り、試料中の非結合Ｔｇ量を求めることができる。尚、
当然のことながら、特定糖鎖構造を有するＴｇ（糖鎖結
合Ｔｇ）量は、総Ｔｇ量から特定糖鎖構造以外の糖鎖構
造を有するＴｇ（非結合Ｔｇ）量を差し引くことによっ
ても求めることができるし、特定糖鎖構造以外の糖鎖構
造を有するＴｇ（非結合Ｔｇ）量は、総Ｔｇ量から特定
糖鎖構造を有するＴｇ（糖鎖結合Ｔｇ）量を差し引くこ
とによっても求めることができる。
【００３４】II．測定対象を一度の測定操作で測定する
方法。 II−１．標識Ｔｇ結合タンパク質と特定糖鎖結合タンパ
ク質を用いる方法 特開平７−１９１０２７号公報に開示された方法に準じ
て以下の如く行えばよい。即ち、先ず、例えば血漿、
血清、髄液、各種生体組織の成分抽出液、尿等の生体由
来試料と、標識Ｔｇ結合タンパク質及び特定糖鎖結合タ
ンパク質とを反応させるか、又は、生体由来試料と、
標識Ｔｇ結合タンパク質を反応させた後、当該反応液に
更に特定糖鎖結合タンパク質を添加して反応させて、以
下の複合体を形成させる。 標識Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ 標識Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−特定糖鎖結合タンパク
質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識Ｔｇ結合タンパ
ク質を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法
等を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を
適当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予
め濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＴｇ又は／及びそ
れ以外の糖鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用いて同
様の方法により測定を行って得られた、標識物質量（測
定値）と各種Ｔｇ濃度との関係を表す検量線等に当ては
める等することにより、試料中の特定糖鎖構造を有する
Ｔｇ及びそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇ、並びにこれ
らＴｇの合計、即ち総Ｔｇを一度の測定で求めることが
できる。尚、複合体並びに遊離の標識Ｔｇ結合タンパク
質を分離する方法としては、操作性や繰り返し使用でき
ること等を考慮するとＨＰＬＣを用いる方法が好まし
い。また、使用するＴｇ結合タンパク質は、非競合性の
ものが好ましい。
【００３５】II−２．非競合性Ｔｇ結合タンパク質、競
合性タンパク質及び特定糖鎖結合タンパク質とを用いる
方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分抽
出液、尿等の生体由来試料と、標識非競合性Ｔｇ結合タ
ンパク質、競合性Ｔｇ結合タンパク質及び特定糖鎖結合
タンパク質とを反応させて、以下の複合体を形成させ
る。 標識非競合性Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−競合性Ｔｇ結
合タンパク質 標識非競合性Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−特定糖鎖結合
タンパク質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識非競合性Ｔｇ結
合タンパク質を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電
気泳動法等を用いて分離し、夫々の複合体中の標識物質
量を適当な方法により測定し、得られた測定値を、例え
ば予め濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＴｇ又は／及
びそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用い
て同様の方法により測定を行って得られた、標識物質量
（測定値）と各種Ｔｇ濃度との関係を表す検量線等に当
てはめる等することにより、試料中の特定糖鎖構造を有
するＴｇ及びそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇ、並びに
これらＴｇの合計、即ち総Ｔｇを一度の測定で求めるこ
とができる。さらに、標識非競合Ｔｇ結合タンパク質と
エピト−プの違う非競合Ｔｇ結合タンパク質を同時に反
応させることにより、複合体の性質を測定に影響する血
清成分の性質との違いを大きくすることができ、血清成
分の影響が少なくなり、測定精度が向上するため好まし
い。尚、複合体並びに遊離の標識非競合性Ｔｇ結合タン
パク質を分離する方法としては、操作性や繰り返し使用
できること等を考慮するとＨＰＬＣを用いる方法が好ま
しい。
【００３６】II−３．標識Ｔｇ結合タンパク質と競合性
Ｔｇ結合タンパク質を用いる方法 先ず、例えば血漿、血清、髄液、各種生体組織の成分
抽出液、尿等の生体由来試料と、標識Ｔｇ結合タンパク
質を反応させた後、当該反応液にさらに特定糖鎖結合タ
ンパク質及び競合性Ｔｇ結合タンパク質を反応させて、
以下の複合体を形成させる。 標識Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−競合性Ｔｇ結合タンパ
ク質 標識Ｔｇ結合タンパク質−Ｔｇ−特定糖鎖結合タンパク
質 次いで、これら複合体並びに遊離の標識Ｔｇ結合タンパ
ク質を、適当な充填剤を充填したＨＰＬＣや電気泳動法
等を用いて夫々分離し、夫々の複合体中の標識物質量を
適当な方法により測定し、得られた測定値を、例えば予
め濃度既知の、特定糖鎖構造を有するＴｇ又は／及びそ
れ以外の糖鎖構造を有するＴｇを含む標準液を用いて同
様の方法により測定を行って得られた、標識物質の測定
値と各種Ｔｇ濃度との関係を表す検量線等に当てはめる
ことにより、試料中の特定糖鎖構造を有するＴｇ及びそ
れ以外の糖鎖構造を有するＴｇ、並びにこれらＴｇの合
計、即ち総Ｔｇを一度の測定で求めることができる。さ
らに標識Ｔｇ結合タンパク質の反応後に、標識Ｔｇ結合
タンパク質とエピト−プの違うＴｇ結合タンパク質を反
応させることにより、複合体の性質を測定に影響する血
清成分の性質との違いを大きくすることができ、血清成
分の影響が少なくなり、測定精度が向上するため好まし
い。尚、複合体並びに遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質を
分離する方法としては、操作性や繰り返し使用できるこ
と等を考慮するとＨＰＬＣを用いる方法が好ましい。
【００３７】Ｔｇ結合タンパク質を用いる自体公知のＴ
ｇ測定法は、例えばＴｇ結合タンパク質として抗Ｔｇ抗
体を用いて、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放射免
疫測定法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、
蛍光免疫測定法（FIA）、ＨＰＬＣを用いる測定方法
（特開平９−３０１９９５号公報等）等の免疫学的測定
法に準じて行えばよい。また、その測定原理も、サンド
イッチ法、競合法、二抗体法等のいずれにてもよい。
【００３８】種々のＴｇ結合タンパク質や特定糖鎖結合
タンパク質を固定化するために用いられる不溶性担体と
しては、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用い
られるものでよく、例えば金属、ガラス、セラミック、
シリコンラバー、例えばポリスチレン，ポリ塩化ビニ
ル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，ポリメチルメタク
リレート等の合成高分子等で調製された、ビーズ、チュ
ーブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、
マイクロタイタープレート等が挙げられ、固定化方法と
しても、上記した如き免疫学的測定法の分野で通常用い
られる、例えば物理的吸着法、化学的結合法等が挙げら
れる。
【００３９】本発明に係るＴｇ結合タンパク質や特定糖
鎖結合タンパク質に結合させる標識物質としては、例え
ばＥＩＡに於いて用いられるアルカリホスファターゼ，
β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロペ
ルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース
-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，
リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例え
ばＲＩＡで用いられる 99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3
Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフル
オレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，
ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例
えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス
(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物
質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或は
これらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば
4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシ
ル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキ
シル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ
-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシ
ル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラ
ベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【００４０】また、上記した如き標識物質を、Ｔｇ結合
タンパク質や特定糖鎖結合タンパク質に結合させる（標
識する）方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或は
ＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方
法に準じて行えばよい。また、標識方法として、アビジ
ン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用
した常法を利用しても良い。
【００４１】本発明のＨＰＬＣを利用する測定法に於い
て用いられるＨＰＬＣ用装置も、通常この分野で用いら
れるものであればよい。
【００４２】本発明のＨＰＬＣを利用する測定法に於い
ては、複合体と遊離の標識Ｔｇ結合タンパク質（或いは
標識特定糖鎖結合タンパク質）とをより明確に分離する
ために、例えば特開平７−１９１０２７号公報、特開平
９−３０１９９５号公報等に開示された、これらの分離
を向上させるための物質（以下、「分離向上物質」と略
記する。）を結合させた、Ｔｇ結合タンパク質や特定糖
鎖結合タンパク質等を用いてもよい。
【００４３】このような目的に用いられる分離向上物質
としては、例えばα−キモトリプシノーゲン，β−ガラ
クトシダーゼ，リゾチーム，チトクロームＣ，トリプシ
ンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニルアラニ
ン，プロリン，アルギニン，リジン，アスパラギン酸，
グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例えば臭
素，塩素，沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチレン
グリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミン酸，
ポリアスパラギン酸，ポリリジン，ポリアルギニン，ポ
リフェニルアラニン，ポリチロシン等のポリアミノ酸、
炭素数３〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン酸，オレ
イン酸，ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-(ε-マレイ
ミドカプロイルオキシ)スクシンイミド［N-(ε-maleimi
docaproyloxy)succinimide］（ＥＭＣＳ）,N-スクシン
イミヂル-6-マレイミドヘキサノエイト（N-Succinimidy
l-6-maleimidohexanoate），ビスマレイミドヘキサン
（Bismaleimidohexane）（ＢＭＨ），オクチルアミン等
のＴｇ結合タンパク質や特定糖鎖結合タンパク質に結合
し得る反応基を有し且つ疎水性若しくはイオン性を有す
る化学物質、例えば特開平9-301995号公報に記載された
4-(p-マレイミドフェニル）ブチリルAla-(Tyr(SO
3H))5、4-(p-マレイミドフェニル）ブチリルAla-(Tyr(S
O3H))8等の強酸残基含有ペプチド等が好ましく挙げられ
る。尚、分離向上物質は、測定対象であるＴｇ、Ｔｇ結
合タンパク質、特定糖鎖結合タンパク質の性質（例えば
ｐＨ安定性，疎水度，水溶液への溶解度，等電点等）を
考慮した上で適宜選択して用いればよい。
【００４４】分離向上物質と、Ｔｇ結合タンパク質又は
／及び特定糖鎖結合タンパク質とのの結合方法も、
（１）自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等におい
て一般に行われている自体公知の標識物質と抗体との結
合方法（例えば、医学実験口座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明
著、第１版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫
測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書
院、1982、等）、（２）自体公知の物質の修飾および結
合方法（例えば、蛋白質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷
郁三、志村憲助、中村道徳、船津勝編集、第１版、(株)
学会出版センター、1981；ポリエチレングリコール修飾
タンパク質、稲田祐二他、生化学、第62巻、第11号、P1
351ー1362、（社）日本生化学会、1990；DNA PROBES, Ge
orge H.K. and Mark M.M. STOCKTON PRESS,1989、等）
等に準じて行えばよい。
【００４５】本発明の測定方法により得られた、総Ｔ
ｇ、特定の糖鎖構造を有するＴｇ、それ以外の糖鎖構造
を有するＴｇ等の値を適宜組み合わせることにより甲状
腺腫瘍の悪性度を鑑別することが可能である。
【００４６】即ち、例えば総Ｔｇ中の特定の糖鎖構造を
有するＴｇ又はそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇの割合
を求めることにより、甲状腺腫瘍の悪性度、言い換えれ
ば、その腫瘍が良性か悪性かを鑑別することができる。
【００４７】更に具体的に述べれば、例えば特定糖鎖結
合タンパク質として、例えばピーナッツレクチン，ダイ
ズレクチン，ヒマレクチン，インゲンマメレクチン等の
Ｄ−ガラクトース又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミ
ン結合性レクチン、例えばコンカナバリンＡ，レンズマ
メレクチン，エンドウマメレクチン等のＤ−マンノース
結合性レクチン等を用いて、総Ｔｇ中の、特定の糖鎖構
造を有するＴｇ又はそれ以外の糖鎖構造を有するＴｇの
割合を求めれば、その値に基づいて甲状腺乳頭癌と例え
ば良性甲状腺腫瘍、バセドウ病等との鑑別や、甲状腺濾
胞癌と甲状腺濾胞腺腫との鑑別等が可能となる。
【００４８】即ち、本発明の甲状腺腫瘍の悪性度鑑別方
法は、本発明者らが初めて見出したこれらの事実に基づ
いて成されたものである。
【００４９】本発明のＴｇ測定用試薬は、Ｔｇの不変領
域に結合するタンパク質と、特定の糖鎖構造を有するＴ
ｇの当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫
々１以上含有してなるものであり、その構成要素の好ま
しい態様と具体例は上で述べたとおりである。
【００５０】また、本発明の甲状腺腫瘍の悪性度鑑別用
試薬は、Ｔｇの不変領域に特異的に結合するタンパク質
と、特定の糖鎖構造を有するＴｇの当該糖鎖構造に特異
的に結合するタンパク質を、夫々１以上含有してなるも
のであり、その構成要素の好ましい態様と具体例は上で
述べたとおりである。
【００５１】これら試薬中には、通常この分野で用いら
れる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパ
ク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であっ
て、共存する試薬等の安定性を阻害したり、Ｔｇと、Ｔ
ｇ結合タンパク質又は／及び特定糖鎖結合タンパク質と
の反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、
その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲か
ら適宜選択すればよい。
【００５２】また、マグネシウム等の金属イオンがレク
チン活性や安定性に影響を与えることはよく知られてお
り、これらを含んでいてもよい。
【００５３】本発明の試薬に於いて用いることのできる
緩衝剤としては、例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、
ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常
免疫比濁法、免疫比ろう法、ＲＩＡ、ＥＩＡに用いられ
ている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとして
は抗原抗体反応やＴｇとレクチン等との反応を抑制しな
い範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０であ
る。
【００５４】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例により何等制限され
るものではない。
【００５５】
【実施例】実施例１ コンカナバリンA（ConA）を用い
た乳頭癌の鑑別方法 （パーオキシダーゼ標識抗Ｔｇ抗体） 抗Tg抗体（以下、「抗Tg-1」と略記する。）とパーオキ
シダーゼとを常法により結合させてパーオキシダーゼ標
識抗Tg抗体（以下、「抗Tg-1・POD」略記する。）を調
製した。 （試料）ヒト甲状腺組織小片0.1ｇ（湿重量）を0.1Ｍり
ん酸緩衝液(pH7.5、0.9％NaCl含有、以下「PBS」と略
す)１ml中でガラスホモジナイザーを用いてホモジナイ
ズ後、4℃、30000g、5分間遠心分離を行い、得られた上
清を試料とした。使用したヒト甲状腺組織は、乳頭癌11
例、良性甲状腺腫5例、バセドウ病5例、正常5例であっ
た。 （試液1）ConA（株式会社ホーネンコーポレーション社
製）をPBSに15mg/mLとなるように溶解したものを試液1
とした。 （試料の前処理）試料と試液1の各50μLを混合し、4℃
で一晩インキュベーションを行い、4℃、3000g、20min
で遠心分離し、沈殿物を除去し、得られた上清を前処理
液１とした。尚、遠心分離処理により、ConAと結合した
Ｔｇは除去される。また試液1のかわりにPBSを用い、同
様の方法で得た上清を前処理液2とした。 （Tg濃度の測定）抗Tg-１とエピトープの違う抗Tg抗体
（以下、「抗Tg-2」と略記する）を５μｇ含むPBS１ml
を９６穴マイクロプレートの各ウエルに注入し、２０℃
で１時間放置した後PBSで洗浄して、抗Tg-2を固定化し
た。次いで、1％牛胎児血清含有PBS 0.2mlをこのマイク
ロプレートの各ウエルに注入し、２０℃で１時間放置し
た後PBSで洗浄して、ブロッキング処理を行った。1％牛
胎児血清含有PBS 100μL、及び前処理液１または前処理
液２の50μLとを、このマイクロプレートのウエルに注
入し、20℃で１時間反応させた。反応終了後、マイクロ
プレートの各ウエルをPBSで洗浄した後、10000倍に希釈
した抗Tg-1・POD100μLを注入し、20℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、PBSで洗浄後、3.3'5.5'-tetramethy
lbenzidine（Kirkegaad and Perry Labs Inc社製）溶液
100μL加え、20℃、30分反応させ、次いで１Ｍりん酸50
μLを加え反応を停止させた。各ウエルの450nmの吸光度
をマイクロプレートリーダー スペクトラ１（和光純薬
工業（株）製）で測定し、得られた吸光度を、予め濃度
既知のＴｇ溶液を用いて同様の操作を行って得られたＴ
ｇ濃度と吸光度との関係を表す検量線に当てはめ、前処
理液１及び２のTg濃度を算出した。尚、前処理液１中の
Ｔｇ濃度は、ConA非結合性Tg量を表し、前処理液２中の
Ｔｇ濃度は、総Tg量を表す。 （ConA非結合性Tg割合の算出）下記の式によりConA非結
合性Tg割合（％）を算出した。 ConA非結合性Tg割合(％)＝［(ConA非結合性Tg量)／(総
Ｔｇ量)］×100 （結果）測定したConA非結合性Tg割合（％）を図１に示
す。図１から明らかな如く、乳頭癌組織抽出液ではConA
非結合性Tg割合（％）が、良性甲状腺腫組織抽出液、バ
セドウ病組織抽出液又は正常組織抽出液のそれに比べ有
意に高いことが判る。また、良性甲状腺腫組織抽出液、
バセドウ病組織抽出液及び正常組織抽出液間では、ConA
非結合性Ｔｇ割合（％）に差は認められないことも判
る。即ち、乳頭癌組織では糖鎖の変化したＴｇ、即ちCo
nA非結合性Tgが増加すること、言い換えれば、ConA非結
合性Tg割合（％）は、良性甲状腺腫瘍と乳頭癌の鑑別に
非常に有用であることが判った。
【００５６】実施例２ ヒマレクチン−120（RCA120）
を用いた乳頭癌の鑑別方法 （パーオキシダーゼ標識抗Tg抗体）実施例１と同じ。 （試料）実施例１の試料と同様にして調製した。尚、使
用したヒト甲状腺組織は、乳頭癌7例、バセドウ病5例、
及び正常4例であった。 （試液1）RCA120（株式会社ホーネンコーポレーション
社製）をPBSに2.5mg/mLとなるように溶解したものを試
液1とした。 （試料の前処理）実施例１の試料の前処理方法と同様に
して、前処理液１及び２を調製した。 （Tg濃度の測定）実施例１のTg濃度の測定方法と同様に
して行った。即ち、前処理液１中のＴｇ濃度は、RCA120
非結合性Tg量を表し、前処理液２中のＴｇ濃度は、総Tg
量を表す。 （RCA120非結合性Tg割合の算出）下記の式によりRCA120
非結合性Tg割合（％）を算出した。 RCA120非結合性Tg割合(％)＝［(RCA120非結合性Tg量)／
(総Ｔｇ量)］×100 （結果）測定したRCA120非結合性Tg割合（％）を図２に
示す。図２から明らかな如く、乳頭癌組織抽出液ではRC
A120非結合性Tg割合（％）が、バセドウ病組織抽出液又
は正常組織抽出液のそれに比べ有意に高いことが判る。
即ち、乳頭癌組織では糖鎖の変化したＴｇ、即ちRCA120
非結合性Tgが増加すること、言い換えれば、RCA120非結
合性Tg割合（％）は、乳頭癌の鑑別に有用であることが
判った。
【００５７】実施例３ コンカナバリンA（ConA）を用
いた濾胞癌と濾胞腺腫の鑑別 （パーオキシダーゼ標識抗Tg抗体の調製）実施例１と同
じ。 （試料）実施例１の試料と同様にして調製した。尚、使
用したヒト甲状腺組織は、濾胞癌4例、濾胞腺腫7例、及
び正常5例であった。 （試液1）実施例１と同じ。 （試料の前処理）実施例１の試料の前処理方法と同様に
して、前処理液１及び２を調製した。 （Tg濃度の測定）実施例１のTg濃度の測定方法と同様に
して行った。即ち、前処理液１中のＴｇ濃度は、ConA非
結合性Tg量を表し、前処理液２中のＴｇ濃度は、総Tg量
を表す。 （ConA非結合性Tg割合の算出）実施例１と同様にしてCo
nA非結合性Tg割合（％）を算出した。 （結果）測定したConA非結合性Tg割合（％）を図３に示
す。図３から明らかな如く、ConA非結合性Tg割合（％）
は、正常組織抽出液、濾胞癌組織抽出液、濾胞腺腫組織
抽出液の順に高くなり、濾胞癌組織抽出液中のそれと濾
胞腺腫組織抽出液中のそれとでは有意に差があることが
判る。即ち、この結果から、ConA非結合性Tg割合（％）
を測定するにより、細胞診でも診断が難しい濾胞癌と濾
胞腺腫の鑑別を、簡単に行うことができることが判っ
た。
【００５８】実施例４ レンズマメレクチン（LCA)を用
いた糖鎖構造の異なるTgの分別測定 （パーオキシダーゼ標識抗Tg抗体Fab'フラグメント）LC
Aが結合したＴｇとは結合せず且つ認識するエピトープ
の異なる2種類の抗Tg抗体（以下、「抗Tg-86」と「抗Tg
-78」と略記する。）を常法により処理してFab'フラグ
メントとし、これに常法によりパーオキシダーゼ（東洋
紡社製）を結合させてパーオキシダーゼ標識抗Tg抗体Fa
b'フラグメント（以下、夫々「抗Tg-86・Fab'-POD」及
び「抗Tg-78・Fab'-POD」と略記する。）を調製した。 （抗体液１）抗Tg-86・Fab-PODを2nM含有する50mMりん
酸緩衝液（pH7.5、0.15M NaCl,0.5（w/v）％牛血清アル
ブミン含有）を調製し、抗体液1とした。 （抗体液2）抗Tg-78・Fab-PODを3nM含有する50mMりん酸
緩衝液（pH7.5、0.15M NaCl,0.5（w/v）％牛血清アルブ
ミン含有）を調製し、抗体液2とした。 （試液１）LCA（株式会社ホーネンコーポレーション社
製）を15μＭ含有する50mMりん酸緩衝液 pH7.5、0.15M
NaCl調製し、試液１とした。 （試料）ヒト甲状腺組織小片0.1ｇ（湿重量）を0.1Mり
ん酸緩衝液(pH7.2、0.9％NaCl含有)１ml中でガラスホモ
ジナイザーを用いてホモジナイズ後、４℃、100000g、6
0分間遠心して上清を得、これを更に50mMりん酸緩衝液
（pH7.5、0.15M NaCl,0.5（w/v）％牛血清アルブミン含
有）で200〜1100倍に希釈したものを試料とした。尚、
使用したヒト甲状腺組織は、良性疾患4例（濾胞腺腫、
腺腫様甲状腺腫2例、バセドウ病）、乳頭癌４例であっ
た。 （測定方法）試料25μLと試液１ 15μLとを混合し、8℃
で１時間反応させた。この反応液15μLに抗体液１ 90μ
Lを混合し、更に8℃で30分間反応させた。得られた反応
液50μLを下記条件の高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）を用いて分析し、LCA非結合性Ｔｇ量を求めた。同じ
試料について、LCA含有の試液１の代わりに50mMりん酸
緩衝液（pH7.5、0.15M NaCl, 0.5（w/v）％牛血清アル
ブミン含有）を用いて同様に測定を行って、総Ｔｇ量を
測定した。この２つの測定結果下記式に代入し、抗Tg-8
6・Fab-PODを用いた場合のLCA非結合性Tg割合（％）を
算出した。 LCA非結合性Tg割合(％)＝［(LCA非結合性Tg量)／(総Ｔ
ｇ量)］×100 また、抗体液１の代わりに抗体液２を用いた以外は、同
様に操作を行って、抗Tg-78・Fab'-PODを用いた場合のL
CA非結合性Tg割合（％）の併せて算出した。 （ＨＰＬＣ条件） カラム ： Wakopack Wakosil-5Diol-200 8.0mm×300mm（w） 溶離液 ： 50mMりん酸緩衝液 pH7.5、0.15M NaCl 基質液 ： 15mMクエン酸緩衝液（pH5.5,313mMアセトアミノフェノール （同仁化学研究所（株）社製）、0.12%H2O2含有） 流速 ： 溶離液 1.0mL/min、基質液 0.1 mL/min 検出 ： Ex 328nm、Em 432nm （結果）抗Tg-86・Fab-POD及び抗Tg-78・Fab-PODを用い
た場合のLCA非結合性Tg割合（％）を図４と図５に夫々
示す。図４及び図５から、良性疾患組織抽出液中のLCA
非結合性Tg割合（％）に比較して、乳頭癌組織抽出液中
のそれは有意に高いことが判る。即ち、LCAを用いるこ
とにより、良性疾患と乳頭癌の鑑別診断が可能となるこ
とが判る。
【００５９】実施例５ ConAを用いた糖鎖構造の異なる
Tg（Ｔｇ）の分別測定 （パーオキシダーゼ標識抗Tg抗体Fab'フラグメント）実
施例４で調製した抗Tg-86・Fab'-PODを使用した。 （抗体液１）抗Tg-86・Fab-PODを4nM含有する50mMりん
酸緩衝液（pH7.5、0.15M NaCl, 0.5（w/v）％牛血清ア
ルブミン含有）を調製し、抗体液1とした。 （試液１）ConA（株式会社ホーネンコーポレーション社
製）を15μＭ含有する50mMりん酸緩衝液 pH7.5、0.15M
NaClを調製し、試液１とした。 （試料）実施例4と同じものを用いた。 （測定方法）試料10μLと試液１45μLとを混合した後、
8℃で１時間反応させた。この反応液に抗体液１ 45μL
を加え、更に8℃で1時間反応させた。得られた反応液50
μLを下記条件の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
を用いて分析し、ConA非結合性Ｔｇ量を求めた。同じ試
料について、試液１の代わりに50mMりん酸緩衝液（pH7.
5、0.15M NaCl, 0.5（w/v）％牛血清アルブミン含有）
を用いて同様に測定を行って、総Ｔｇ量を測定した。こ
の２つの測定結果下記式に代入し、ConA非結合性Tg割合
（％）を算出した。 ConA非結合性Tg割合(％)＝［(ConA非結合性Tg量)／(総
Ｔｇ量)］×100 （ＨＰＬＣ条件）実施例４と同じ。 （結果）得られたConA非結合性Tg割合（％）を図６に示
す。図６から、良性疾患組織抽出液中のConA非結合性Tg
割合（％）に比較して、乳頭癌組織抽出液中のそれは有
意に高いことが判る。即ち、ConAを用いることにより、
良性疾患と乳頭癌の鑑別診断が可能となることが判る。
【００６０】
【発明の効果】本発明は、簡便且つ高精度に各種生体由
来試料中の各種Ｔｇを測定し得る測定方法並びにその為
の試薬を提供するものであり、本発明の測定方法により
得られた各種Ｔｇの測定値を適宜組み合わせて用いるこ
とにより、甲状腺乳頭癌と良性甲状腺腫瘍との鑑別や甲
状腺濾胞癌と甲状腺濾胞腺腫との鑑別をすることができ
る。
【００６１】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた、各種甲状腺組織抽出液中
のコンカナバリンＡ(ConA)非結合性サイログロブリン
（Ｔｇ）の割合（％）を示す。
【図２】実施例２で得られた、各種甲状腺組織抽出液中
のヒママメレクチン−１２０(RCA-120)非結合性Ｔｇの
割合（％）を示す。
【図３】実施例３で得られた、各種甲状腺組織抽出液中
のコンカナバリン(ConA)非結合性サイログロブリン（Ｔ
ｇ）の割合（％）を示す。
【図４】実施例４で得られた、抗Ｔｇ抗体として抗Tg-8
6を用いた場合の、各種甲状腺組織抽出液中のレンズマ
メレクチン(LCA)非結合性サイログロブリン（Ｔｇ）の
割合（％）を示す。
【図５】実施例４で得られた、抗Ｔｇ抗体として抗Tg-7
8を用いた場合の、各種甲状腺組織抽出液中のレンズマ
メレクチン(LCA)非結合性サイログロブリン（Ｔｇ）の
割合（％）を示す。
【図６】実施例５で得られた、各種甲状腺組織抽出液中
のコンカナバリン(ConA)非結合性サイログロブリン（Ｔ
ｇ）の割合（％）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 里村 慎二 大阪府大阪市中央区道修町三丁目１番２号 和光純薬工業株式会社内

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サイログロブリンの不変領域に結合するタ
    ンパク質と、特定の糖鎖構造を有するサイログロブリン
    の当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫々
    １以上用いることを特徴とする、サイログロブリンの測
    定方法。
  2. 【請求項２】測定すべきサイログロブリンが、総サイロ
    グロブリン、特定の糖鎖構造を有するサイログロブリン
    又は／及びそれ以外の糖鎖構造を有するサイログロブリ
    ンである、請求項１に記載の測定方法。
  3. 【請求項３】特定の糖鎖構造が、レクチン結合性糖鎖構
    造である、請求項１に記載の測定方法。
  4. 【請求項４】レクチンが、Ｄ−ガラクトース又はＮ−ア
    セチル−Ｄ−ガラクトサミン結合性レクチン、又はＤ−
    マンノース結合性レクチンである、請求項３に記載の測
    定方法。
  5. 【請求項５】レクチンが、コンカナバリンＡ、レンズマ
    メレクチン又はヒマレクチン−１２０である、請求項３
    に記載の測定方法。
  6. 【請求項６】特定の糖鎖構造が、腫瘍細胞が産生するサ
    イログロブリンが有する糖鎖構造である、請求項１に記
    載の測定方法。
  7. 【請求項７】腫瘍細胞が、甲状腺腫瘍由来のものであ
    る、請求項６に記載の測定方法。
  8. 【請求項８】サイログロブリンの不変領域に結合するタ
    ンパク質と、特定の糖鎖構造を有するサイログロブリン
    の当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫々
    １以上含有してなる、サイログロブリン測定用試薬。
  9. 【請求項９】特定の糖鎖構造を有するサイログロブリン
    量又はそれ以外の糖鎖構造を有するサイログロブリン量
    に基づいて鑑別を行うことを特徴とする、甲状腺腫瘍の
    悪性度鑑別方法。
  10. 【請求項１０】サイログロブリン中の、特定の糖鎖構造
    を有するサイログロブリン又はそれ以外の糖鎖構造を有
    するサイログロブリンの割合を、サイログロブリンの不
    変領域に結合するタンパク質と、特定の糖鎖構造を有す
    るサイログロブリンの当該糖鎖構造に特異的に結合する
    タンパク質を、夫々１以上用いて求める、請求項９に記
    載の鑑別方法。
  11. 【請求項１１】サイログロブリンの不変領域に結合する
    タンパク質と、特定の糖鎖構造を有するサイログロブリ
    ンの当該糖鎖構造に特異的に結合するタンパク質を、夫
    々１以上含有してなる、甲状腺腫瘍の悪性度鑑別用試
    薬。
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