JP2000041689A

JP2000041689A - イノシト―ルの製造方法

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Publication number: JP2000041689A
Application number: JP13341899A
Authority: JP
Inventors: Reiko Miyata; 令子宮田; Koji Igarashi; 浩司五十嵐; Toru Yonehara; 徹米原
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2000-02-15

Abstract

(57)【要約】【課題】より経済的にイノシトールを生産する。【解決手段】ハロゲン化ピルビン酸に耐性を有する微生
物を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】イノシトールは、高等動物に
おいてビタミンの一種として重要な物質で、栄養食品、
飼料添加物、医薬品などに利用される。

【０００２】

【従来の技術】従来イノシトールは、米糠、コーンステ
ィープリカーなどからの抽出（特開昭６１−５６１４２
号公報）、パン酵母を培養して製造する方法（欧州特許
公開第５０６２８９）などが知られている。また、本発
明者らによるキャンディダ属に属する微生物を培養して
製造する方法（特開平８−２５８号公報、特開平８−８
９２６６号公報、特開平８−３８１８８号公報）があ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】米糠、コーンスティー
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題があり、さらに工業的実績
もない。また、キャンディダ属に属する微生物を培養し
て製造する方法は、工業的に収率、収量の点で満足いく
ものではなかった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、キャンディダ属に属する微生物の変
異株がイノシトールを収率、収量良く蓄積する事を見い
出した。本発明者らはさらに生産性の高いイノシトール
の製造方法について鋭意研究した結果、イノシトールの
生産能を有する微生物に、ハロゲン化ピルビン酸に対す
る耐性を付与することにより、イノシトールの蓄積濃
度、生成収率が著しく向上することを見出し本発明に到
達した。

【０００５】すなわち、本発明はハロゲン化ピルビン酸
に耐性を有し、かつイノシトールを分泌する性質を持っ
た微生物を培養して、培養液中にイノシトールを蓄積せ
しめ、前記培養液よりイノシトールを採取することおよ
び、ハロゲン化ピルビン酸耐性を有し、かつイノシトー
ル生産能を有する微生物を培養して、得られた菌体、も
しくはそれらの処理物を用い、イノシトールを生成蓄積
せしめる反応を行い、前記反応液よりイノシトールを採
取することを特徴とするイノシトールの製造方法であ
る。

【０００６】ここでいうハロゲン化ピルビン酸とは、ピ
ルビン酸代謝拮抗物質である。すなわち、微生物の生育
を阻害する物質を添加し、ピルビン酸の生合成系あるい
は分解に関与する酵素の抑制あるいは阻害作用を示し、
その抑制あるいは阻害がピルビン酸の添加により回復す
る物質である。ハロゲン化ピルビン酸としては、ブロモ
ピルビン酸、フルオロピルビン酸、クロロピルビン酸な
どが挙げられ、各々の物質を単独、または組み合わせて
用いることができる。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明に使用する微生物は、イノ
シトールを分泌する微生物であるならばいずれでもよい
が、親株としては、本発明者らによりヘキサクロロシク
ロヘキサン耐性変異株として取得された、キャンディダ
・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）
δ−６５（ＦＥＲＭＰ−１５７３９）を用いることが
好ましい。イノシトールを分泌する性質があれば、他
に、薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があって
もよく、イノシトールを分泌する微生物はすべて本発明
に含まれるものである。

【０００８】変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤（たとえばＮ−メチル−Ｎ′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
など）で処理した後、親株が生育できないような濃度の
ハロゲン化ピルビン酸を含む固体培地で生育可能な菌株
を採取すればよい。

【０００９】ハロゲン化ピルビン酸耐性変異株は、親株
よりハロゲン化ピルビン酸に強い耐性を有する株のこと
である。本発明においては、親株の相対生育度の３０％
以下を示すハロゲン化ピルビン酸の濃度範囲において６
０％以上の相対生育度を示す変異株を取得するのが好ま
しい。ここでの相対生育度は培養液の６６０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し、ハロゲン化ピルビン酸を添加してい
ない培養液の吸光度を１００％とした時の相対値で示
す。耐性を検定する場合のハロゲン化ピルビン酸は市販
のものを用いればよい。

【００１０】本発明における培養方法について説明す
る。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素源、無
機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含
有する通常の培地である。

【００１１】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が
微量成分として添加される。また好ましくは消泡剤など
も添加し、培養条件の安定化をはかる。

【００１２】培養は通常、好気条件で行う。培養の間、
培地のｐＨ３〜８に、温度は２０〜３５℃に調節し、２
４〜９６時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好ましい
結果が得られる。

【００１３】次に本発明における酵素法でのイノシトー
ルの生産方法について説明する。前記発酵法における培
地と同様に培養し、菌体をえる。この菌体をそのまま反
応に用いてもよいが、好ましくは、公知の方法で原形質
分離化処理して行う。反応原料は、ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、アンモニア存在下で行い、ｐＨは
３〜８、温度は２０〜３５℃で１０〜７２時間振盪して
行う。

【００１４】培養液中に分泌蓄積されたイノシトール
は、そのまま単離採取することなく、飼料などに用いる
ことができる。また、培養液あるいは反応液からイノシ
トールを採取するには公知の方法で可能である。例え
ば、菌体を遠心分離などで除去した後、カチオンおよび
アニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば
結晶を取得することができる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例１（ブロモピルビン酸耐性変異株の分離）キャンディダ・
ボイディニイδ−６５株の菌体を常法によりＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理（３００
μg ／ml、３０℃１０分）した後、この細胞を適当に希
釈し、表１に示した培地に５mg／ｌの濃度でブロモピル
ビン酸（ＢＰ）を加えた平板培地に塗布し、３０℃で４
日間培養した。生育してきた変異処理したキャンディダ
・ボイディニイのコロニーを純粋な変異株として単離
し、キャンディダ・ボイディニイＢＰ２２（ＦＥＲＭ
Ｐ−１６７４３）を取得した。

【００１６】

【表１】（ブロモピルビン酸耐性変異株の耐性度）キャンディダ
・ボイディニイＢＰ２２及びキャンディダ・ボイディニ
イδ−６５の各菌株を表１に示す寒天培地を除いた培地
を用いて３０℃で２４時間振盪培養し、生育した菌体を
各々集菌し生理食塩水で洗浄した。これらの菌体懸濁液
を表２に示す濃度のブロモピルビン酸を添加した表１に
示す培地５ｍｌに各々植菌して、３０℃にて培養し、各
菌株の７２時間後の生育度を調べた。その結果は表２に
示すとおりである。本発明で使用するにブロモピルビン
酸耐性な変異株は親株と比較して、高濃度のブロモピル
ビン酸によって生育が阻害されず、強いブロモピルビン
酸耐性を獲得していることを示している。

【００１７】

【表２】実施例２（発酵法によるブロモピルビン酸耐性変異株の培養およ
びイノシトールの生産）キャンディダ・ボイディニイＢ
Ｐ２２及びキャンディダ・ボイディニイδ−６５を各々
表３に示した培地５ｍｌに一白金耳植菌し、３０℃で、
２４時間振とうして前培養した。この培養液を予め１１
５℃１０分蒸気滅菌した表４に示した組成の培地５０ml
を含む５００ml容の三角フラスコに植え継ぎ、１８０rp
m 、振幅３０cmの条件下で７２時間培養した後、予め滅
菌したグルコースを５０ｇ／ｌになるように添加し、総
計１２０時間培養した。

【００１８】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去
したろ液中のイノシトール濃度を高速液体クロマトグラ
フィ−で定量したところ、表４に示すような結果を得
た。親株と比較し、変異株ではイノシトールの生産量が
大幅に向上している結果を得た。

【００１９】

【表３】

【００２０】

【表４】実施例３実施例２での培養液１Ｌ分の上清をカチオン交換樹脂ダ
イヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学製）に通液し、その素通
り画分をあつめ、さらにアニオン交換樹脂ダイヤイオン
ＰＡ３１６（三菱化学製）に通液し、その素通り画分を
あつめ、濃縮晶析し、純度９８％以上のイノシトール結
晶１４．２ｇを得た。

【００２１】

【発明の効果】本発明の酵母を用い、発酵法によりイノ
シトールを培養液中に生産すると既存の方法と比較し、
より経済的なイノシトールの生産が可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:72）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ハロゲン化ピルビン酸に耐性を有し、かつ
イノシトール分秘生産能を有する微生物を用いることを
特徴とするイノシトールの製造方法。
【請求項２】ハロゲン化ピルビン酸に耐性を有し、かつ
イノシトール分秘生産能を有する微生物を培養して、培
養液中にイノシトールを蓄積せしめることを特徴とする
請求項１記載のイノシトールの製造方法。
【請求項３】ハロゲン化ピルビン酸に耐性を有し、かつ
イノシトール生産能を有する微生物を培養して、培養液
中にイノシトールを蓄積せしめ、前記培養液よりイノシ
トールを採取することを特徴とする請求項２記載のイノ
シトールの製造方法。
【請求項４】ハロゲン化ピルビン酸耐性を有し、かつイ
ノシトール分泌生産能を有する微生物を培養して、得ら
れた菌体、もしくはそれらの処理物を用い、イノシトー
ルを生成蓄積せしめる反応を行うことを特徴とする請求
項１記載のイノシトールの製造方法。
【請求項５】ハロゲン化ピルビン酸耐性を有し、かつイ
ノシトール分泌生産能を有する微生物を培養して、得ら
れた菌体、もしくはそれらの処理物を用い、イノシトー
ルを生成蓄積せしめる反応を行い、前記反応液よりイノ
シトールを採取することを特徴とする請求項４記載のイ
ノシトールの製造方法。
【請求項６】イノシトール分泌生産能を有する微生物が
キャンディダ属に属する微生物であることを特徴とする
請求項１から５のいずれか１項に記載のイノシトールの
製造方法。
【請求項７】キャンディダ属に属する微生物が、キャン
ディダ・ボイディニイであることを特徴とする請求項６
記載のイノシトールの製造方法。