JP2000019146A - 基質の定量法並びにそれに用いるバイオセンサおよび測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測定する環境の温度や被検試料の温度の影響
を受けずに、高精度で迅速かつ簡便に被検試料中の基質
を定量することができる方法を提供する。 【解決手段】 酵素を含む反応試薬層を加温しながら、
反応試薬層に基質を含む被検試料を供給して基質を反応
させ、その反応量を電気化学的または光学的に検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の基質の定
量法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】試料中の基質を迅速かつ高精度に定量す
る手段としては、例えば特公平７−１１４７０５号公報
に開示されたバイオセンサがある。同公報に開示された
バイオセンサを図５に示す。絶縁性の基板１１の表面に
は測定極１２、対極１３および参照極１０からなる電極
系が形成されている。これら電極系に接するように反応
試薬層１４が形成されている。反応試薬層１４は、親水
性高分子、酸化還元酵素および電子受容体を含む。この
バイオセンサは、スクリーン印刷等の方法で基板１１上
に測定極１２、対極１３および参照極１０を形成した
後、所定面積の開口部を有する絶縁層１５を形成し、こ
の開口部に反応試薬層１４を形成したものである。

【０００３】このバイオセンサは、以下のようにして用
いられる。測定しようとする基質を含む試料液を反応試
薬層１４に供給する。これにより反応試薬層１４が溶解
し、さらに酸化還元酵素によって基質が酸化される。こ
のとき、反応試薬層１４に含まれる電子受容体が還元さ
れる。試料液の供給より所定時間経過後、測定極１２と
対極１３の間に電圧を印加して、この還元された電子受
容体を電気化学的に酸化する。このとき、測定極１２に
流れる電流量すなわち酸化電流量を測定する。測定装置
には、あらかじめ基質濃度と酸化電流量の関係式が検量
線として記憶されていて、測定装置は、得られた酸化電
流量をこの検量線と比較して、試料液中の基質濃度を算
出するようになっている。このようなバイオセンサは、
測定対象となる物質を基質とする酵素を任意に選択する
ことによって、様々な物質に対する測定が可能である。
しかし、上記のようにして測定される酸化電流量は、そ
の時点での試料の酵素反応の進行の度合いに影響され
る。酵素反応の進行は、反応場の温度に大きく依存する
ことから、上記のような方法で得られる基質濃度の値
は、測定を行う際の室温や試料液の温度によって変動す
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、以上の問題
点を解決するものであり、環境の温度や試料液の温度の
影響を受けることなく、安定して試料液の基質濃度を定
量することができる基質の定量方法を提供することを目
的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によると、酵素反
応を行う場すなわち反応試薬層を一定の温度に加温保持
しながら、被検試料中の基質と酵素を反応させる。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の基質の定量法は、絶縁基
板と、絶縁基板上に形成された少なくとも一対の電極を
含む電極系と、電極系に接して形成された酵素を含む反
応試薬層とを具備するバイオセンサを用い、反応試薬層
を加温保持しながら反応試薬層に基質を含む被検試料を
供給して基質と酵素を反応させる工程と、電極間に電圧
を印加して一対の電極うちのいずれか一方に流れる電流
量に基づいて被検試料中の基質を定量する工程とを具備
する。酵素反応を利用した基質の定量法においては、酵
素の比活性は、反応場の温度により変動する。したがっ
て、反応場の温度が定量の精度に大きな影響を及ぼす。
反応場の温度が低いと酵素反応速度は遅くなり、温度が
高いと酵素反応速度は速くなる傾向がある。そこで、測
定の際に、酵素反応場すなわち反応試薬層を加温して酵
素の比活性を高くする。酵素の比活性が高くなれば、反
応速度が大きくなり、測定精度が著しく向上する。ま
た、センサの検出時間を短縮することも可能になる。

【０００７】特に、反応試薬層を特定温度に加温保持す
ることにより、測定する環境や被検試料の温度の影響を
受けることなく、常に一定の速度で酵素反応を進行させ
ることができる。これにより、温度格差に起因した測定
値のバラツキを抑制することができる。好ましくは、反
応試薬層の温度を、酵素の比活性が高くなる温度、例え
ばグルコースセンサであって酵素にグルコースオキシダ
ーゼを用いる場合には、３０〜５０℃に加温することが
好ましい。上記の定量法は、反応試薬層において基質を
酵素により反応させた後、酵素反応により生成された物
質に適当な電圧を印加してそのときに得られる酸化電流
あるいは還元電流の量、またはその電気量を検出する方
法に用いることができる。特に、酵素が基質と特異的に
反応する酸化還元酵素であって、反応試薬層がさらに電
子受容体を含むバイオセンサ、すなわち酵素反応により
測定しようとする基質を酸化させるとともに電子受容体
を還元させるタイプのバイオセンサを用いた定量法に用
いると、より精度の高い測定が可能になる。この他、反
応試薬層に含有させた電子受容体の酸化還元反応に伴う
吸光度の変化を検出する方法に用いることも可能であ
る。この場合、例えば酵素としてホスホキナーゼおよび
グルコース−６−リン酸脱水素酵素を用い、電子受容体
としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを用いる
組み合わせが挙げられる。

【０００８】本発明のバイオセンサは、絶縁基板と、絶
縁基板上に形成された少なくとも一対の電極を含む電極
系と、電極系に接して形成された酵素を含む反応試薬層
とを具備するバイオセンサと、反応試薬層を加温するた
めの加温部とを具備する。ここで、加温部は、ヒータ等
の直接発熱する熱源、またはセンサ外部の熱源からの熱
を伝える伝熱体である。特に、加温部として伝熱体を有
するバイオセンサは、反応試薬層の温度をより精度よく
制御することができる。また、加温部としてヒータ等を
配置するよりも安価でバイオセンサを製造することがで
きる。このような伝熱体は、反応試薬層の周辺部または
基板の反応試薬層の配された側の面と反対の側の面に形
成することが好ましい。特に、金属を主体とする伝熱体
を用いると、高い熱伝導率が得られ、効果的に反応試薬
層を加温することができる。伝熱体に用いる金属として
は、例えば、銀、アルミニウム、金、ニッケル、銅など
の単体およびこれらの合金が挙げられる。

【０００９】本発明の測定装置は、絶縁基板と、絶縁基
板上に形成された少なくとも一対の電極を含む電極系
と、電極系に接して形成された酵素を含む反応試薬層と
を具備するバイオセンサを用いて被検試料中の基質を定
量する測定装置であって、電極間に電圧を印加する手段
と、電極に流れる電流量を検出する手段と、反応試薬層
を加温する手段とを具備する。なお、上記のような伝熱
体を有するバイオセンサに限らず、絶縁基板上に反応試
薬層を備えたバイオセンサであれば、加温手段によって
反応試薬層を加温することが可能である。

【００１０】好ましくは、加温手段が、反応試薬層の温
度を検出し、反応試薬層の温度を所定温度に保持する温
度調節機能を有する。反応試薬層の温度を酵素の比活性
が高くなる温度いわゆる至適反応温度に保持すること
で、高精度の測定が可能となる。また、酵素反応に要す
る時間を短縮することもできる。このような温度調節
は、例えばマイクロコンピュータを用いたＰＩＤ制御に
より行う。

【００１１】

【実施例】以下、本発明の好ましい実施例を、図面を用
いて詳細に説明する。本実施例のバイオセンサの構成を
図１および図２に示す。ポリエチレンテレフタレートか
らなる絶縁性の基板１の一方の面には、図１の（ａ）に
示すように、測定極３および対極４からなる一対の電極
系が形成されている。これらは、例えば導電性カーボン
ペーストを用いたスクリーン印刷により形成する。リー
ド部２は、銀ペーストを用いたスクリーン印刷により形
成されたもので、一方のリード部２ａは測定極３と接続
されていて、他方のリード部２ｂは対極４と接続されて
いる。絶縁層５ａは、電極系を取り囲むように形成され
ていて、リード部２を部分的に覆っている。また、測定
極３の周縁部は絶縁層５ｂにより覆われていて、その露
出部分の面積は、絶縁層５ｂにより規定されている。図
１の（ａ）には示さないが、図２に示すように、絶縁層
５ａの開口部すなわちこれら電極系の表面には、酵素お
よび電子受容体を含む溶液を塗布、乾燥することにより
形成された反応試薬層７が配されている。基板１の他方
の面には、図１の（ｂ）に示すように、伝熱体６が形成
されている。伝熱体６は、例えば銀ペーストを用いたス
クリーン印刷により形成する。

【００１２】以下、本発明のバイオセンサの一例とし
て、グルコースセンサについて説明する。グルコースセ
ンサの場合、反応試薬層７に含ませる酵素としてグルコ
ースオキシダーゼを、電子受容体としてフェリシアン化
カリウムをそれぞれ用いる。このグルコースセンサは、
例えば以下のようにして用いられる。測定装置の一対の
測定端子間には、あらかじめベース電圧が印加されてい
て、測定装置は、端子間の抵抗値の変化によってセンサ
の装着を認識するようになっている。センサの装着が認
識されると、装置に内蔵されたヒータが作動する。ヒー
タの発した熱は、センサの伝熱体６を通じて反応試薬層
７に伝えられ、反応試薬層７の温度が上昇する。測定装
置は、センサの温度を検出しながら、ＰＩＤ制御により
センサを所定の温度例えば４０℃に加温保持するように
設定されている。ここで、制御部は、センサ温度が上記
温度に達すると、測定が可能であることを表示や警告音
等で使用者に通知する。使用者は、この通知を受ける
と、測定しようとする試料を反応試薬層に供給する。ま
た、あらかじめ採取した試料を自動的に供給するように
することもできる。

【００１３】試料が反応試薬層に供給されると、反応試
薬層が溶解し、試料に含まれていたグルコースがグルコ
ースオキシダーゼによって酸化されてグルコン酸にな
る。このときに反応試薬層中に共存させておいたフェリ
シアン化カリウムが還元されて、フェロシアン化カリウ
ムが生成される。装置は、端子間の電圧の変化によって
試料の供給による電極系の液絡を検知し、試料供給から
所定時間経過後に、電極間にパルス電圧を印加する。こ
れにより、フェロシアン化カリウムは電解酸化され、測
定極３には酸化電流が流れる。装置は、この測定極３に
流れる電流量を測定する。この酸化電流量は、フェロシ
アン化カリウム濃度に依存することから、試料中のグル
コース濃度に依存する。装置は、得られた値を、あらか
じめ用意された検量線と比較して試料のグルコース濃度
を判定することができる。

【００１４】なお、上記実施例では、絶縁性の基板の電
極系を備えた面と反対の面に伝熱体を形成したが、図３
に示すように基板１の電極系を備えた面と同一面に伝熱
体８を形成したり、図４に示すように基板１の側面に伝
熱体９を形成しても同様の効果が得られる。また、上記
実施例では、酵素として酸化還元酵素の一種であるグル
コースオキシダーゼを用いたグルコースセンサについて
述べたが、その他の各種酵素を用いたバイオセンサでも
同様の効果が得られる。

【００１５】

【発明の効果】本発明によると、測定する環境の温度
や、被検試料の温度の影響を受けずに、高精度で迅速か
つ簡便に被検試料に含まれる基質を定量することができ
る基質の定量法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のバイオセンサの構成を示す
図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は背面図である。

【図２】同バイオセンサのＡ−Ａ’線断面図である。

【図３】本発明の他の実施例のバイオセンサの平面図で
ある。

【図４】本発明のさらに他の実施例のバイオセンサの構
成を示す図であり、（ａ）は左側面図、（ｂ）は平面
図、（ｃ）は右側面図である。

【図５】従来のバイオセンサの構成を示す図であり、
（ａ）は平面図、（ｂ）はＢ−Ｂ’線断面図である。

【符号の説明】

１、１１ 基板 ２、２ａ、２ｂ リード部 ３、１２ 測定極 ４、１３ 対極 ５ａ、５ｂ、１５ 絶縁層 ６、８、９ 伝熱体 ７、１４ 反応試薬層 １０ 参照極

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絶縁基板と、前記絶縁基板上に形成され
   た少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系に
   接して形成された酵素を含む反応試薬層とを具備するバ
   イオセンサを用い、前記反応試薬層を加温保持しながら
   前記反応試薬層に基質を含む被検試料を供給して前記基
   質と前記酵素を反応させる工程と、前記電極間に電圧を
   印加して前記電極のいずれか一方に流れる電流量に基づ
   いて前記被検試料中の基質を定量する工程とを具備する
   基質の定量法。
2. 【請求項２】 前記酵素が前記基質と特異的に反応する
   酸化還元酵素であって、前記反応試薬層がさらに電子受
   容体を含む請求項１記載の基質の定量法。
3. 【請求項３】 酵素および電子受容体を含む反応試薬層
   を加温保持しながら、前記反応試薬層に基質を含む被検
   試料を供給する工程と、前記反応試薬層の吸光度の変化
   を検出する工程とを具備する基質の定量法。
4. 【請求項４】 前記酵素がグルコースオキシダーゼであ
   って、前記反応試薬層を３０〜５０℃に加温保持する請
   求項１または３に記載の基質の定量法。
5. 【請求項５】 絶縁基板と、前記絶縁基板上に形成され
   た少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系に
   接して形成された酵素を含む反応試薬層と、前記反応試
   薬層を加温するための加温部とを具備するバイオセン
   サ。
6. 【請求項６】 前記加温部が、外部の熱源からの熱を前
   記反応試薬層に伝えるための伝熱体であって、前記反応
   試薬層の周辺部または前記基板の反応試薬層を備えた面
   と反対の面に形成された請求項５記載のバイオセンサ。
7. 【請求項７】 前記加温部が、金属を含む請求項５記載
   のバイオセンサ。
8. 【請求項８】 前記酵素が前記基質と特異的に反応する
   酸化還元酵素であって、前記反応試薬層がさらに電子受
   容体を含む請求項５記載のバイオセンサ。
9. 【請求項９】 絶縁基板と、前記絶縁基板上に形成され
   た少なくとも一対の電極を含む電極系と、前記電極系に
   接して形成された酵素を含む反応試薬層とを具備するバ
   イオセンサを用いて被検試料中の基質を定量する測定装
   置であって、前記電極間に電圧を印加する手段と、前記
   電極に流れる電流量を検出する手段と、前記反応試薬層
   を加温する手段とを具備する測定装置。