ITRM960805A1 - Peptidi sintetici immunodominanti della proteina caga di helicobacter pylori e loro impiego per la realizzazione di diagnostici e vaccini - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "PEPTIDI SINTETICI IMMUNODOMINANTI DELLA PROTEINA CagA DI Helicobacter pylori E LORO IMPIEGO PER LA REALIZZAZIONE DI DIAGNOSTICI E VACCINI"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale a peptidi sintetici che sono riconosciuti da anticorpi sierici di pazienti infettati da Helicobacter pylori CagA+, ed all'uso di questi peptidi sintetici per applicazioni diagnostiche e vaccinali.

Come é noto l 'Helicobacter pylori é un batterio che colonizza la mucosa gastrica umana (1). Questo batterio si comporta essenzialmente come un batterio extracellulare, ed alcuni ceppi inducono danno alle cellule dell'epitelio gastrico mediante la produzione di una esotossina ad azione vacuolizzante (VacA) (2,3) cui é associata la proteina CagA (4,5). L'infezione da Helicobacter pylori é stata segnalata in tutto il mondo con una diffusione nella popolazione che varia a seconda dell'area geografica: dal 15% dell'Australia fino al 96% dell'Algeria. In Europa l'infezione colpisce a seconda dell'età, in media il 35% delle persone, ed é più frequente negli uomini che nelle donne. La gastrite da Helicobacter pylori è più diffusa nei paesi in via di sviluppo, in cui l'infezione del batterio è presente fin dall'infanzia, che in quelli industrializzati (6) . Dati epidemiologici recenti inducono a sospettare che l'infezione con Helicobacter pylori comporti un aumento del rischio di sviluppare cancro gastrico (7,8), benché non sia ancora chiaro se il batterio costituisca un fattore predominante o solo uno dei numerosi fattori coinvolti nell'induzione della cancerogenesi . Più sicura appare invece 1 'associazione di questo_bat,terio_all.lezioqenesi di alcune diffuse patologie gastriche, quali la r- — - τ<1>"<1>* — :— - «

gastn te di tipo B e l'ulcera duodenale, poiché rispetta i quattro postulati di Koch per i batteri patogeni. Sulla base di tale assunto, gli atti conclusivi del Consensus Statement dell'Istituto di Sanità Statunitense (9) hanno stabilito che, nei casi di ulcera peptica, la terapia antibiotica dovesse sostituire l'uso di farmaci antiacidi, anche se l'uso massiccio di antibiotici ha il grande svantaggio di indurre inevitabilmente l'insorgenza di ceppi resistenti. Questa limitazione, unita alla ‘grande diffusione dell 'Helicobacter pylori, pone pertanto la necessità di comprendere i determinanti antigenici o epitopi coinvolti nella risposta immunitaria per poter avviare ricerche tese allo sviluppo di appropiati saggi diagnostici e di idonei vaccini.

La sieropositività verso lisati crudi di Helicobacter pylori usando saggi ELISA {Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) commerciali permette di identificare soggetti venuti a contatto con questo batterio, ma non di definire se .il ceppo infettante sia produttore di citotossine e quindi in grado di causare la malattia. Benché, come già detto in precedenza, sia stata identificata la tossina (VacA) responsabile della vacuolizzazione delle cellule dell'epitelio gastrico (2,3) ed un'altra proteina ad essa associata (4,5), non si ha a disposizione un saggio ELISA commerciale in grado di determinare la presenza di anticorpi verso CagA. Un frammento della proteina CagA ricombinante in grado di essere riconosciuto da sieri di pazienti infetti è stato descritto (10) in W093/1815 (del 2 marzo 1993, pubblicato il 16 settembre 1993) ma questo risultato non é mai approdato alla definizione di saggi diagnostici di interesse commerciale.

Esiste pertanto, l'esigenza di sviluppare un saggio immunoenzimatico in grado di distinguere l'infezione determinata dal ceppo citotossico (VacA+, CagA+) (tipol) da quella con il ceppo saprofita (VacA-, CagA-) (tipo II). Questa distinzione é di notevole rilevanza clinica per la scelta del trattamento farmacologico, perché solo l'infezione con ceppi di tipo I, in grado di causare la malattia, deve essere trattata con antibiotici .

I peptidi sintetici (derivati dall a seguenza della proteina CagA) secondo la seguente invenzione perme 11ono di identificare anticorpi prodotti nel corso di infezioni determinate dal ceppo citotossico (tipo I) distinguendole da quelle determinate dal ceppo saprofita (tipo II).

Oggetto della presente invenzione sono pertanto peptidi sintetici, immunodominant i in corso di infezione naturale, caratterizzati dal fatto di essere costituiti da una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente^SEQ^ID NO: 1 fino a SEQ ID NO: 17, oppure derivati, frammenti di dette sequenze o peptidi modificati dalle sequenze brevettate.

L'invenzione non si limita a questi peptidi ma si estende ad un saggio immunodiagnostico per rilevare la presenza di anticorpi verso Helicobacter pylori CagA+ caratterizzato dal fatto di usare almeno uno dei peptidi sopra menzionati. E' anche oggetto della presente invenzione un kit immunodiagnostico per rilevare la presenza di anticorpi verso Helicobacter pylori CagA+ caratterizzato dal fatto che almeno uno dei suoi componenti è almeno uno dei peptidi sintetici sopra menzionati. E' ancora oggetto della presente invenzione un vaccino sintetico per la protezione dall'infezione di Helicobacter pylori CagA+ caratterizzato dal fatto di contenere almeno uno dei peptidi sopra menzionati oppure derivati, frammenti di dette sequenze o peptidi modificati dalle sequenze originarie unitamente ad un veicolo farmaceutico accettabile.

Negli esempi che seguono le sequenze amminoacidiche SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:13 verranno anche indicate rispettivamente come ML-63, ML-70 ed ML-75.

Figura 1 mostra WESTERN Blotting contro lisato batterico di Helicobaceter pylori di sieri provenienti da pazienti dispeptici.

Figura 2 mostra l'individuazione di epitopi immunodominanti della proteina CagA.

Figura 3 mostra la reattività anticorpale contro i peptidi ML-63 (SEQ ID N0:8), ML-70 (SEQ ID NO :11) e ML-75 (SEQ ID N0:13) della proteina CagA.

Figura 4 mostra la reattività anticorpale contro il peptide ML-70, in individui HP+/CagA+ e HP+/CagA-, dispeptici e non.

ESEMPIO 1

Caratterizzazione microbiologica. _ biomolecolare di biopsie e sierologica di Helicobacter pylori Allo scopo di collezionare sieri contenenti anticorpi anti-CagA, sono stati studiati, dal punto divista clinico, microbiologico e biomelecolare , 63 pazienti dispeptici sottoposti ad esame endoscopico e prelievo bioptico. Dagli esami effettuati sui campioni bioptici risultavano 36 soggetti positivi al test dell'ureasi, in 31 di questi è stato possibile osservare il batterio al microscopio ottico, mentre solo 21 hanno sviluppato colonie di Helicobacter pylori quando messi in coltura su agar sangue.

Una selezione più accurata dei campioni su cui studiare la risposta anticorpale è stata eseguita verificando nelle biopsie la presenza del gene ureA e cagA di Helicobacter pylori mediante la tecnica della PCR.

L'analisi dei campioni ha permesso di indivuare 49 pazienti positivi per il gene ureA di cui 36 positivi per cagA e quindi per Helicobacter pylori di tipo I.

In base ai risultati così ottenuti sotto stati identificati 21 pazienti positivi a tutte le indagini effettuate.

I sieri di 8 dei 21 pazienti così selezionati Osono stati analizzati in Western blot per caratterizzare la risposta anticorpale contro le diverse proteine batteriche. La frazione proteica di 128 kDa, riconosciuta dagli 8 sieri esaminati, indica la presenza di anticorpi anti-CagA in tali sieri che vengono quindi acquisiti come controllo positivo per i successivi esperimenti di identificazione di epitopi immunodominanti della proteina CagA.

ESEMPIO 2

Identificazione di epitopi_ immunodominanti compresi nella regione_ 335-1147_ della_ proteina_ CagA, mediante_ sieri_ di_ paiaienti_ infettati con Hlicobacter pylori di tino I_ (VacA+/CagA+)

Allo scopo di identificare epitopi immunodominanti della proteina CagA, e' stato sintetizzato un pannello di 64 peptidi di 16 amminoacidi che comprendono la regione proteica dall1amminoacido 385 al 1147. La reattività' anticorpale contro i peptidi sintetici e' stata studiata mediante Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), utilizzando sieri provenienti da pazienti con infezione da H.pylori CagA+ve accertata come riportato nel paragrafo precedente, e anticorpi anti-CagA determinati mediante Western blot (fig.l).·

I sieri testati mostrano una reattività anticorpale verso la gran parte dei peptidi confermando 1'immunogenicita1 della proteina CagA (10). Nella figura 2 si osserva che 17 peptidi compresi nella regione dall 'amminoacido 737 all'amminoacido 1136 sono riconosciuti da almeno il 75% dei sieri analizzati (6/8). .1 campioni sono stati considerati positivi quando il valore di densità ottica era maggiore della media più 3 deviazioni standard del valore di densità ottica mostrato dai controlli negativi.

ESEMPIO 3 '

Sensibilità del peptide ELISA

Lo studio della reattività anticorpale contro tre dei peptidi immunodominanti identificati dalle sequenze ML63, ML70 e ML75, é stato esteso ad un gruppo di 27 pazienti dispeptici sieropositivi per la proteina CagA.

I risultati dell'analisi, mostrati in figura 3, hanno dimostrato che i peptidi ML63, -70 e -75 sono riconosciuti rispettivamente dal 67, 81 e 70% dei sieri che presentano anticorpi anti-CagA, mentre la percentuale dei sieri positivi aumenta fino al 93% utilizzando la combinazione dei tre peptidi .

I campioni sono stati considerati positivi quando il valore di densità ottica era maggiore della media più 2 deviazioni standard del valore di densità ottica mostrato dai controlli negativi.

ESEMPXQ_&

Specificità_ dei_ riconoscimento dei peptidi immunodominanti della proteina CagA

La reattività contro i peptidi immunodominanti ML63, -70 e -75 é stata inoltre analizzata, in termini di titolo anticorpale, in sieri di individui non dispeptici, ma con anticorpi antiHelicobacter pylori ed anti-CagA (HP+/CagA+) ed in sieri di individui non dispeptici con anticorpi anti-Helicobacter pylori, ma non anti-CagA (HP+/CagA-) .

La figura 4 dimostra che i peptidi vengono specificamente riconosciuti solo dai sieri che riconoscono la proteina CagA e che quindi sono stati infettati con Helicobacter di tipo citotossico, a prescindere dalla presenza di disturbi gastrointestinali.

ESEMPIO 5

Condizioni di adsorbimento dei peptidi alle piastre da saggio e loro stabilità

Parte del lavoro ha avuto come obiettivo quello di individuare le condizioni ed i tempi di conservazione dei peptidi sintetici adsorbiti a micropiastre da saggio.

Saggi ELISA sono stati eseguiti su micropiastre preparate con peptide in cui il tampone di coating e' stato eliminato mediante essiccamento a 37°C dopo il periodo di incubazione necessario all’adsorbimento dell1antigene alla piastra. I risultati dei saggi (tabella II), eseguiti su piastre con antigene conservato per 15 giorni, sono statisticamente equivalenti a quelli ottenuti con piastre preparate al momento dell'uso, dimostrando che l'essiccamento non altera il preparato antigenico e ne permette una agevole e prolungata conservazione.

Le differenze tra i gruppi sono state determinate mediante il t .Test di Student e considerate significative quando p<0.05.

TABELLA I

ESEMPIO 6

Determinazione di_ anticorpi_ anti-CagA_ mediante Enzyme Linked_ ImmunoSorbent_ Assay. (ELISA) uitlizzando i peptidi ML-63. ML-70 ed ML-75

I peptidi sintetici ML-63, ML-70 e ML-75 della proteina CagA di Helicobacter pylori, sia singolarmente che insiene (vedi figura 3), sono stati dispensati in micropiastre piastre Becton Dickinson in quantità di 1 μg per pozzetto in 100 μΐ di una soluzione tampone bicarbonato sodica

0.05M a pH 9.6 e lasciati per 24 ore a temperatura ambiente e a 4°C fino al momento dell'uso. Al momento del saggio, dopo aver lavato le piastre 5 volte con una soluzione PBS-Tween 0.05, sono stati dispensati i sieri, diluiti 1:100 in una soluzione PBS-Tween 0.05%-BSA 1% (soluzione diluente), in un volume di 100 μΐ/pozzetto e le piastre lasciate incubare 1 ora a 37°C. Dopo aver effettuato 5 lavaggi come sopra, sono stati aggiunti 100 μΐ/pozzetto di anticorpo specifico per le IgG umane, coniugato con perossidasi (DAKO) e diluito 1:6000 nella soluzione diluente; le piastre sono state lasciate incubare per 1 ora a 37°C. Dopo aver effettuato 5 lavaggi come sopra sono stati aggiunti 100 μΐ di una soluzione di tampone citrato a pH 5.5 con H2O2 allo 0.015% ed OPD (orto-phenilendiammina, DAKO) alla concentrazione di 3 mg/ml e le piastre lasciate incubare per 20-30 minuti a 37°C. La reazione enzimatica é stata bloccata aggiungendo 50 μΐ di HCl IN. Alla fine l'intensità della colorazione verrà rilevata per mezzo di un lettore ELISA (BIO-RAD 450 EIA reader) . alla lunghezza d'onda di 490 nm. I campioni sono stati considerati positivi quando il valore di densità ottica superava la media più 2 o 3 deviazioni standard del valore di densità ottica mostrato dai controlli negativi .

ABBREVIAZIONI USATE NEL TESTO

bp, base pair, paia di basi

CagA, Cytotoxin-associated-protein

cagrA, gene che codifica per CagA

ELISA, Enzyma Linked ImmunoSorbent Assay

H. Pylori, Helicobacter pylori

O.D., Optical Density

P, Significatività statistica (t Test)

POR, Polymerase Chain Reaction

UreA,subunità A dell'enzima ureasi

ureA, gene che codifica per UreA

VacA,Vacuolating cytotoxin

vacA, gene che codifica per VacA

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptidi sintetici immunodominanti nel modello di immunizzazione murino e nel corso di infezione naturale, caratterizzati dal fatto di essere costituiti da una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente SEQ ID N0:1 fino a SEQ ID NO:17, oppure derivati o frammenti di dette sequenze .
2. 2. Saggio immunodiagnostico per rilevare la presenza di anticorpi verso Helicobacter pylori CagA+, caratterizzato dal fatto di usare almeno uno dei peptidi di rivendicazione 1.
3. 3. Kit immunodiagnostico per rilevare la presenza di anticorpi verso Helicobacter pylori CagA+, caratterizzato dal fatto che almeno uno dei suoi componenti è almeno uno dei peptidi sintetici di rivendicazione 1.
4. 4. Vaccini sintetici per la protezione dalle infezioni di Helicobacter pylori comprendenti almeno un peptide come da rivendicazione 1 ed un veicolo farmaceuticamente accettabile.