ITRM950850A1

ITRM950850A1 - Prodotto derivato da latte, sostanzialmente esente da betacaseina di mammifero non umano e relativo uso

Info

Publication number: ITRM950850A1
Application number: IT95RM000850A
Authority: IT
Inventors: Paolo Pozzilli
Original assignee: Biosistema Di Pier Luigi Spara
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 1997-06-27
Also published as: ATE207079T1; NZ325826A; EP0871662A1; US20050176638A1; BR9612346A; DE69616088T2; DE69616088D1; EP0871662B1; CA2241171A1; IT1277964B1; US6750203B1; AU1306697A; NO314383B1; NO982777L; WO1997024371A1; US7091320B2; ES2164938T3; AU720411B2; ITRM950850A0; NO982777D0

Abstract

Oggetto dell'invenzione è un procedimento per formare un organo di albero di sterzo monopezzo, per esempio un organo di albero di sterzo maschio esternamente scanalato (o albero di giogo) oppure un organo di albero di sterzo femmina internamente scanalato (oppure giogo di scorrimento). Viene inizialmente fornito un tubo cilindrico cavo il quale è preferibilmente formato da un semilavorato di materiale metallico, come l'alluminio, avente un fattore di allungamento di almeno quindici percento. E' desiderabile che il tubo abbia una parete di spessore uniforme e definisca un diametro esterno che sia sostanzialmente uniforme per tutta la sua lunghezza. Il diametro esterno di una estremità del tubo viene ridotto dal suo diametro originario. Una superficie scanalata viene formata nella porzione di estremità di diametro ridotto del tubo. La superficie scanalata viene formata sulla superficie esterna dell'albero di giogo e sulla superficie interna del giogo di scorrimento. L'altra estremità del tubo viene quindi deformata in modo da fornire una forma di

Description

DESCRIZIONE

della domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo: "PRODOTTO DERIVATO DA LATTE, SOSTANZIALMENTE ESENTE DA BETA-CASEINA DI MAMMIFERO NON UMANO E RELATIVO USO"

Campo dell'invenzione

La presente invenzione è relativa ad un prodotto, derivato da latte, sostanzialmente esente da beta-caseina di mammifero non umano.

L'invenzione è anche relativa all'uso di tale prodotto, in particolare l'uso in campo dietetico-alimentare, più in particolare per la prima infanzia nella prevenzione del diabete insulino-dipendente.

Arte nota

E' tecnica ampiamente diffusa quella di ottenere prodotti, in particolare prodotti alimentari per la prima infanzia, a partire da latte di mammiferi non umani, quali mucche, pecore e capre. La componente base del latte è costituita dalle "caseine", che, nell'accezione più ampia del termine, sono un gruppo di proteine che si ottengono per precipitazione da latte a pH acido e temperatura fino a temperatura ambiente, in genere rispettivamente circa pH 4,6 e 20°C. Le caseine costituiscono circa l'80% del totale delle proteine nel latte vaccino e circa il 40% p/v nel latte umano. Esse si possono suddividere in tre gruppi principali: alfa-, beta- e kappa-. E' individuabile anche un quarto gruppo costituito dalle gamma-caseine, che derivano dalla beta-caseina a seguito della perdita dei primi 22 amminoacidi. Quindi, nell’abito della presente invenzione, le gamma-caseine saranno considerate come facenti parte del gruppo delle beta.

Le beta-caseine costituiscono circa il 70% p/v di tutte le caseine presenti nel latte umano, mentre nel latte vaccino sono circa il 25% p/v.

Delle beta-caseine bovine si conoscono e sono state caratterizzate alcune varianti genetiche, fra cui: A1, A2, A3, B, C, D ed E. Per la produzione industriale di latte è stata privilegiata la variante genetica Al, variante a più alto contenuto proteico rispetto alle altre, ottenuta per selezione di animali , specialmente mucche.

Da analisi eseguite su "gene data sequencing" si è individuata per la beta-caseina Al bovina una sequenza amminoacidica in posizione 63-68, omologa alla corrispondente sequenza 54-59 della beta-caseina umana.

Analoga situazione è stata riscontrata per la variante A2.

Le varianti Al e A2 della beta-caseina presentano inoltre omologia di sequenza in quel tratto (almeno al 90%) con una proteina specifica delle cellule producenti insulina del pancreas (GLUT 2).

Secondo gli autori, a carico della sequenza 63-68 delle betacaseine Al e A2, e più in generale a carico di sequenze analoghe in altri tipi di caseine, quali ad esempio la Al, A2, A3, B, C e D, si potrebbe determinare una risposta del sistema immunitario con produzione di anticorpi anti beta-caseina e con linfociti sensibilizzati alla suddetta sequenza. Nei neonati a cui nei primi mesi di vita venga somministrata una dieta a base di latte contenente tale caseina immunogenica , si verificherebbe il riconoscimento, da parte del sistema immunitario, di una proteina specifica delle cellule producenti insulina nel pancreas endocrino (GLUT 2) per un meccanismo di mimetismo molecolare appunto con la sequenza omologa della beta-caseina.

Sulla base di tale ipotesi si è sviluppata una ricerca, tesa a mettere a punto prodotti derivanti dal latte, o latte stesso, sostanzialmente esenti da beta-caseina non umana, e, più specificatamente, prodotti contenenti beta-caseina proveniente da mammiferi non umani che non risulti immunogenica per mimetismo molecolare (cross-reattività) con la proteina GLUT 2.

Sommario dell'invenzione.

Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione un prodotto derivato da latte, o latte stesso, sostanzialmente esente da beta-caseine di mammifero non umano avente caratteristiche immunogeniche nel senso sopra specificato.

Altro oggetto dell'invenzione è un prodotto derivato da latte, o latte stesso, comprendente, o additivato con, almeno una betacaseina modificata di mammifero non-umano senza caratteristiche immunogeniche nel senso sopra specificato.

Ancora altro oggetto dell'invenzione è l'uso di tale prodotto, in particolare l'uso in campo dietetico-alimentare.

Ulteriore oggetto dell'invenzione è l'uso di un prodotto derivato da latte, o latte stesso, sostanzialmente esente da beta-caseine di mammifero non umano, oppure comprendente almeno una betacaseina modificata e non immunogenica, per realizzare un alimento da somministrare, in genere nella prima infanzia, per la prevenzione del diabete insulino-dipendente.

Ancora altri oggetti dell'invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata dell'invenzione stessa.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Nel prosieguo della descrizione verranno sottolineate le sequenze amminoacidiche di interesse per il presente brevetto. Inoltre, la parola "sostanzialmente" sarà usata come sinonimo di presenza di una o più sostanze (quella(e) a cui la parola si riferisce) in quantità compresa fra 0 e 10% in peso).

Come accennato sopra, secondo gli autori esiste una correlazione fra esposizione a latte vaccino e insorgenza di diabete insulinodipendente a causa di un mimetismo molecolare fra le sequenze amminoacidiche delle beta-caseine Al e A2 e una proteina specifica delle cellule produttrici insulina, denominata GLUT 2.

Tale sequenza è identificata come:

per la beta-caseina A1 ed è inserita nel seguente frammento più ampio:

Per quanto detto precedentemente, tale sequenza è anche presente nella gamma-caseina.

A titolo di esempio vengono date altre corrispondenti sequenze di peptidi immunogenici di beta-caseine diverse da quella sopra menzionata.

Beta-caseina A2 bovina da bos taurus (63-68):

inserita nel frammento più ampio:

n

Beta-caseina da bos indicus (63-68):

Per confronto, la beta-caseina umana ha corrispondentemente la seguente sequenza (48-59):

la frazione peptidica presa in considerazione nella presente invenzione essendo identificata come la (54-59):

.

Corrispondentemente le sequenze peptidiche del GLUT 2, il trasportatore del glucosio all'interno delle cellule beta del pancreas producenti insulina, sono le seguenti:

Dalla descrizione delle sequenze di cui sopra e dagli studi epidemiologici degli stessi autori si ipotizza che la sequenza della beta-caseina Al, B e C e gamma-caseina:

e i frammenti più ampi che la contengono, come anche le sequenze della beta-caseina A2, A3 ed E: siano responsabili dell'induzione di una risposta immunitaria anti beta-caseina che, per mimetismo molecolare (cross-reazione) sarebbe rivolta verso la sequenza omologa del GLUT 2, determinando il danno delle cellule producenti insulina. Per cui realizzare un latte, o più in generale un prodotto alimentare, contenente beta-caseina non immunogenica e somministrarlo nelle diete, in particolare dei neonati o nella prima infanzia, costituisce una prevenzione del meccanismo patogenico alla base del diabete insulino-dipendente.

Rientrano nell'ambito della presente invenzione, nel senso che non sono considerate patogeniche e con le quali pertanto può essere realizzato un prodotto alimentare conforme all'invenzione, tutte le caseine che non presentano la sequenza:

nel senso che:

- alcuni o tutti gli amminoacidi sono modificati in detta sequenza,

- la beta-caseina non presenta tale sequenza in quanto, ad esempio, è stata rimossa,

- la beta-caseina è modificata in quanto tale sequenza è sostituita con la sequenza della beta-caseina umana.

Tutte le modifiche possono essere fatte applicando le tecniche note di ingegneria genetica e le tecniche classiche biologiche di selezione e incrocio, ad esempio come descritto in WO 93/04171.

Il latte ottenuto, contenente le caseine modificate di cui sopra, può essere somministrato tal quale, oppure può essere trattato con metodi noti in modo che la o le caseine interessate vengano separate e utilizzate per realizzare prodotti alimentari dietetici e farmaceutici.

In particolare i prodotti comprendenti tali caseine sono impiegabili per essere somministrati nella prima infanzia e successivamente come dieta preventiva per il diabete insulinodipendente.

E' preferibile che, nei prodotti secondo la presente invenzione, il livello di concentrazione della beta-caseina Al e/o A2 e/o altre beta-caseine immunogeniche , in particolare recanti la sequenza non sia superiore al 10% in peso.

I prodotti alimentari dell'invenzione possono ad esempio essere, paste alimentari, latte e suoi derivati, proteine tal quali da additivare a prodotti alimentari, il tutto ad esempio analogamente a quanto già esistente in commercio, l'unica modifica essendo la sostituzione delle caseine immunogeniche con le caseine dell'invenzione.

Rientrano nell'ambito della presente invenzione anche le proteine vegetali e/o sintetiche, ad esempio quelle derivabili dalla soia, impiegabile per gli scopi dell'invenzione.

Secondo l'insegnamento della presente invenzione è possibile realizzare un prodotto alimentare, farmaceutico, particolarmente per la prima infanzia sostanzialmente esente da beta-caseina recante la sequenza amminoacidica

Pro-Ile-Pro, oppure in cui queste sono inferiori al 10% in peso. Si può anche realizzare un prodotto o un latte secondo le seguenti alternative:

- in cui la beta-caseina è inferiore al 10% in peso, oppure in cui la beta-caseina recante la sequenza amminoacidica Gly-Pro- è inferiore al 10% in peso;

- sostanzialmente esente da beta-caseina recante la sequenza amminoacidica e integrato con peptidi derivati dall'idrolisi di proteine animali e/o vegetali e/o sintetiche, prive della suddetta sequenza e relative miscele (domanda di brevetto FR 86-00325, W094/06306, W0 pi/02539);

- in cui la beta-caseina recante la sequenza amminoacidica Gly- è inferiore al 10% in peso e integrato con peptidi derivati dall'idrolisi di proteine animali e/o vegetali e/o sintetiche, prive della suddetta sequenza e relative miscele;

- in cui la beta-caseina è priva della sequenza amminoacidica perchè prodotta da specie animali che geneticamente non producono proteine con detta sequenza;

- latte naturalmente privo di beta-caseine perchè prodotto con animali geneticamente modificati WO 93/04171;

- latte contenente beta-caseine umane ottenute a partire da microorganismi o animali geneticamente manipolati, come ad esempio descritto nella domanda di brevetto già citata.

Le frazioni proteiche possono derivare da trattamenti chimicofisici di latte e da caseine liofilizzate, ad esempio per solubilità differenziale, estrazione liquido-liquido, separazione su membrana, separazione cromatografica, come descritto in FR 86-00325 e WO 92/00017.

Le integrazioni possono essere effettuate utilizzando betacaseina ricombinante prodotta con uno qualsiasi dei metodi noti di clonaggio sfruttando lieviti, muffe, batteri, funghi o animali transgenici, come ad esempio descritto in WO 93/04171-Un processo per l'eliminazione della beta-caseina dal latte è quello cromatografico, come appresso descritto.

Per mezzo di tale processo si separa la beta-caseina a partire da caseina acida e, mediante cromatografia in due stadi, si recuperano poi le restanti frazioni di alfa- e kappa-caseine. Il processo può essere ottimizzato attraverso le conoscenze del tecnico del ramo.

Tale processo prevede l'impiego, come fase stazionaria, di una resina a scambio ionico, ad esempio del tipo noto in commercio come Sepharose(R) della ditta Pharmacia, con concentrazione nonché in colonna. La fase mobile è costituita da tampone A:

- Acetato di sodio con concentrazione non inferiore a 10 mM - urea con concentrazione non inferiore a 2M

- pH compreso fra 5 e 6.

La caseina acida viene sciolta in tampone A a pH non inferiore a 6, con aggiunta di un agente riducente specifico, il ditiotreitolo (DTT). Viene lasciata sotto agitazione per 24 ore, portata a un pH che sia compreso fra 5 e 6 e caricata in colonna. La frazione di beta-caseina non interagisce con la resina ed eluisce in colonna a concentrazione 0 M di NaCl. Non occorre, quindi, effettuare stadi a forza ionica crescente, considerato che si effettua una semplice separazione di beta-caseina dalle altre frazioni, le quali verranno recuperate in isocratica eluendo con tampone B:

- concentrazione 0,8 M di NaCl

- pH compreso fra 5 e 6.

Le frazioni vengno successivamente diafiltrate per eliminare urea ed altri sali presenti; dopo concentrazione si recuperano le caseine per precipitazione acida e il prodotto umido ottenuto viene liofilizzato.

Gli esempi appresso riportati sono da considerare illustrativi di essa e non limitativi della relativa portata.

Esempio 1

Separazione della beta-caseina dalla caseina acida e recupero delle restanti frazioni alfa- e Kappa-caseina.

Preparazione carica

- 200 g Caseina acida 3000 ml Tampone C: Acetato di Sodio 20mM, Urea 4 M, Ditioltreitolo (DTT) 10 mM, pH 7·

Occorre sciogliere lentamente la caseina nel tampone, mantenendo ad ogni aggiunta il pH al valore 7 con NaOH 2M.

Lasciare in agitazione a 5°C per circa 12 ore.

Filtrazione della soluzione in prefiltro Millex AP-50 (Millipore) .

Lavaggio del prefiltro com 1000 ml di Tampone C e recupero.

Portare il carico {4000 ml) a pH 5,5 con HC16 M e aggiustare la forza ionica (2,2 mS) a 4,5 mS.

Cromatografia Preparativa

- FPLC Waters 600 Controller

- Rivelatore: Spettrofotometro Perkin Elmer UV/VIS Lambda3B 280nm - Colonna: XK 50 Pharmacia (pressione limite 3 bar) 05cm, h 100cm - Resina: S-Sepharose Pharmacia h letto 85 cm, volume complessivo 1670 ml

- Eluenti: Tampone A Acetato di Sodio 20 mM

Urea 4 M

pH 5.5 forza ionica 1,5 mS

Tampone B Acetato di Sodio 20 mM

Urea 4 M

PH 5.5

Cloruro di Sodio 1 M forza ionica 57.1 mS

Tutti i tamponi vengono filtrati mediante un prefiltro Millex AP 50 collegato in serie con un filtro 0,45 μm Millipak 20 (Millipore).

- Temperatura: Ambiente

- Condizionamento: = 8000 ml

Tampone A 97% Tampone B 3% forza ionica mix 4,5 mS Flusso 30 ml/min P=42 PSI

Tempo 4h 25'

- Caricamento: 200 g Caseina Acida dissolta in Tampone C (volume totale 4000 ml)

Flusso 20ml/min P=50PSI

Tempo 3h 20'

- Eluizione: 1° Stadio (isocratica) ≈ 8000 ml

Tamp. A 97% Tamp. B 3% Flusso 30 ml/min P=42 PSI Tempo 4h 25'

2° Stadio (isocratica) ≈ 9000 ml

Tamp. A 20% Tamp. B 80% Flusso 30 ml/min P=42 PSI Tempo 5h

Esempio 2 - Prova di controllo

E' stata sottoposta a cromatografia un'aliquota del prodotto dell'esempio 1 per controllare l'assenza di beta-caseina nell 'isocratica del secondo stadio. Tale assenza è stata confermata come risulta dal cromatogramma di fig. 3. Per confronto in fig. 1 è illustrato il cromatogramma relativo alla carica iniziale, mentre fig. 2 mostra il picco relativo alla presenza della sola beta-caseina derivante dall'eluizione del primo stadio.

Cromatografia Analitica

- HPLC Perkin Elmer Biocompatibile Binary Pump 250

- Rivelatore: Perkin Elmer LC95 280 nm

- Colonna: Mono S HR 5/5 Pharmacia

- Loop: 100 μl

- Eluenti: Tampone A* Acetato di Sodio 20 mM

Urea 6 M

PH 5

Tampone B* Acetato di Sodio 20 mM

Urea 6 M

Cloruro di Sodio 1 M

PH 5

- Temperatura: Ambiente

- Flusso: 1 ml/min

- Condizionamento: 8'00" Tampone A* 100% Tampone B* 0%

- Eluizione: gradiente 5'00" Tampone A* 50% Tampone B* 50% (incremento di B* 1% minuto)

isocratica 2'00" Tampone A* 50% Tampone B* 50% isocratica 5'00" Tampone A* 0% Tampone B+ 100%

Esempio 3

Il prodotto dell'esempio 1 è stato purificazione dall'urea con il seguente metodo di diafiltrazione.

- Impianto di Ultrafiltrazione S.G.I.

- Membrana di Cellulosa S-1010.000 Da Amicon

- Tampone di dialisi: Acqua demineralizzata

Acetato di Sodio 10 mM pH 7

Forza ionica 0,8 mS

Volume complessivo 250 1 (5 lavaggi) - Flusso di permeato: 32+37 1/h

- Temperatura: 10°C

- Concentrazione prodotto 50 1 fino 20 1.

Il prodotto è stato quindi testato per verificare l'assenza di urea nel modo seguente.

Test Urea

- metodo UV Boehringer Mannheim

- Spettrofotometro: Perkin Elmer Lambda 3B 340 nm

REATTIVI BIANCO CAMPIONE

Soluzione 1 1.00 ml 1,00 ml

Soluzione campione 0,10 ml

Soluzione 2 0,02 ml 0,02 ml

Acqua bidist. 2.00 ml 1,90 ml

Incubare 5' a 20-25°C leggere l'assorbanza (Al)

Soluzione 3 0,02 ml 0,02 ml

Incubare 20' a 20-25°C leggere l'assorbanza (A2)

Soluzione 1 = Tampone trietanolammina pH 8,2-oxoglutarato, NADH Soluzione 2 = Ureasi

Soluzione 3 = Glutammato deidrogenasi

Sul prodotto privo di urea è stata condotta la liofilizzazione con apparecchiatura Christ modello Beta 1-16

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Beta-caseina o frammenti peptidici non immunogenici per mimetismo molecolare con la proteina GLUT 2 da impiegare per preparare prodotti dietetici o farmaceutici da impiegare nelle diete preventive del diabete insulino-dipendente.
2. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente sostanzialmente esente da beta-caseina non umana.
3- Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente sostanzialmente esente da beta-caseina proveniente da mammiferi non umani che risulti immunogenica per mimetismo molecolare con la proteina GLUT 2.
4. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente sostanzialmente esente da beta-caseina proveniente da mammiferi non umani che risulti immunogenica per mimetismo molecolare con la proteina GLUT 2 e additivato con beta-caseine non immunogeniche di tipo animale e/o vegetale e/o sintetico e relative miscele.
5. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente sostanzialmente esente da caseine che presentano la sequenza: o le sequenze che li contengono:
6. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente comprendente caseine che non presentano la sequenza: dette caseine essendo scelte fra quelle in cui: - alcuni o tutti gli amminoacidi di dette sequenze sono modificati - dette sequenze sono rimosse - dette sequenze sono sostituite con la sequenza omologa della beta-caseina umana e relative miscele.
7. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente comprendente caseine che presentano la sequenza Val-Glu-Pro-Ile-Pro o una sequenza più ampia che la comprende: Ser-
8. Prodotto secondo le riv. 1-7 comprendente beta-caseine immunogeniche in quantità inferiore al 10% in peso.
9· Prodotto secondo le riv. 2-8 e integrato con beta-caseine vegetali e/o animali e/o sintetiche e/o con peptidi derivati dall'idrolisi di proteine animali e/o vegetali e/o sintetiche, privi della sequenza e relative miscele.
10. Prodotto dietetico o farmaceutico, derivato da latte o latte stesso, da impiegare nelle diete preventive del diabete insulinodipendente comprendente caseine in cui la beta-caseina è priva della sequenza amminoacidica perchè prodotta da specie animali che geneticamente non producono proteine con detta sequenza.
11. Latte naturalmente privo di beta-caseine perchè prodotto con animali geneticamente modificati da impiegare nelle diete preventive del diabete insulino-dipendente.
12. Latte contenente beta-caseine umane ottenute a partire da microorganismi o animali geneticamente manipolati da impiegare nelle diete preventive del diabete insulino-dipendente.
13- Processo di estrazione della beta-caseina da latte comprendente l'impiego, come fase stazionaria, di una resina a scambio ionico, la fase mobile essendo costituita da tampone A: - Acetato di sodio con concentrazione non inferiore a 10 mM - urea con concentrazione non inferiore a 2M - pH compreso fra 5 e 6, detto metodo prevedendo l'utilizzo di caseina acida che viene preventivamente disciolta in tampone A a pH non inferiore a 6, additivata con ditiotreitolo e poi lasciata sotto agitazione per 24 ore, quindi portata a pH fra 5 e 6 e caricata in colonna, facendo poi eluire a concentrazione 0 M di NaCl; le altre frazioni contenenti beta-caseina essendo recuperate in isocratica eluendo con tampone B: - Acetato di sodio con concentrazione non inferiore a 10 mM urea con concentrazione non inferiore a 2M - concentrazione 0,8 M di NaCl - pH compreso fra 5 e 6, successiva eliminazione di urea ed altre impurezze per diafiltrazione e, dopo concentrazione, recupero delle caseine per precipitazione acida e liofilizzazione del prodotto umido ottenuto .
14. Procedimento per ottenere un prodotto alimentare secondo la riv. 6 in cui le sequenze amminoacidiche sono modificate applicando tecniche scelte fra quelle di ingegneria genetica e le tecniche biologiche di selezione e incrocio.
15· Uso di beta-caseine o frammenti peptidici secondo la riv. 1 per la prevenzione del diabete insulino-dipendente.
16. Uso di un prodotto alimentare, dietetico o farmaceutico secondo le riv. 2-10 per la prevenzione del diabete insulinodipendente .
17. Uso di latte secondo le riv. 11 e 12 per la prevenzione del diabete insulino-dipendente.