ITRM20130248A1 - Formulazioni di riboflavina per il cross-linking transepiteliale. - Google Patents

Description

FORMULAZIONI DI RIBOFLAVINA PER IL CROSS-LINKING

TRANSEPITELIALE

DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda formulazioni di riboflavina per il cross-linking transepiteliale. Più in particolare, l’invenzione concerne preparati a base di riboflavina (vitamina B2) per l’uso nel trattamento del cheratocono con una variante della tecnica non invasiva già nota come crosslinking corneale, che consiste nell’indurre la reticolazione del collagene della zona centrale della cornea mediante irraggiamento con raggi UV-A in presenza di riboflavina. Nella variante di tale tecnica denominata crosslinking transepiteliale, in cui l’epitelio corneale non viene rimosso, il preparato a base di riboflavina da instillare sulla cornea nel corso del trattamento à ̈ in grado di passare attraverso l’epitelio corneale.

Antefatto dell’invenzione

Il cheratocono à ̈ una patologia oculare non infiammatoria di eziologia ancora incerta, caratterizzata da uno sfiancamento (ectasia) della parte centrale della cornea in seguito ad un suo progressivo assottigliamento e conseguente indebolimento. Con il decorso della malattia, la parte centrale della cornea si incurva progressivamente verso l’esterno perdendo la propria forma sferica e divenendo conica e sporgente verso l’esterno. Per effetto della curvatura irregolare della cornea si ha una significativa distorsione visuale e una progressiva diminuzione della vista per la perdita del potere refrattivo della cornea, e quest’ultima potrebbe arrivare infine a perforarsi con possibile rischio di perdere non solo la vista, ma anche l’integrità del bulbo oculare.

Il trattamento del cheratocono comporta, nella fase iniziale e nei casi più moderati, l’uso di lenti a contatto morbide per correggere il leggero astigmatismo e proteggere la superficie corneale, mentre con il progredire della malattia, che à ̈ irreversibile, diviene necessario l’uso di lenti a contatto rigide. Nei casi più severi, in cui la vista à ̈ gravemente compromessa, l’unica possibilità prevista fino qualche anno fa era il ricorso alla chirurgia, con il trapianto di cornea o altre tecniche di chirurgia oftalmica, come la cheratoplastica lamellare o la tecnica degli inserti intracorneali.

A partire dal 1997 à ̈ stata sviluppata una nuova tecnica per il trattamento del cheratocono, che à ̈ divenuta negli ultimi anni il trattamento di elezione in ragione della sua minore traumaticità rispetto ai trattamenti chirurgici: il cross-linking (reticolazione) corneale. Sulla base dell’osservazione che la riduzione di resistenza biomeccanica del tessuto corneale interessato à ̈ causata da una riduzione dei legami intra- e interfibrillari delle fibre di collagene dello stroma corneale, con la nuova tecnica si à ̈ mirato a rafforzare e incrementare tali legami così da rendere la cornea più rigida, contrastandone lo sfiancamento e scongiurando il pericolo di perforazione. La reticolazione del collagene corneale con la tecnica citata, indicata attualmente anche con l’acronimo CXL (corneal cross-linking, o anche, secondo alcuni autori, C3-R – corneal collagen crosslinking con riboflavina), si ottiene irradiando i tessuti corneali interessati con raggi UV-A di lunghezza d’onda di 370 nm in presenza di riboflavina-5’-fosfato (o flavin mononucleotide, indicato anche nel seguito con l’acronimo FMN) in qualità di agente fotosensibilizzante. Quest’ultima à ̈ la forma fosforilata della riboflavina o vitamina B2, il cui ruolo nel cross-linking corneale à ̈, più precisamente, sia quello di proteggere le strutture interne dell’occhio dai raggi UVA che quello di promuovere la formazione di legami e quindi la reticolazione del collagene all’interno dello stroma corneale (Spoerl, E., Huhle, M., Seiler, T. Induction of cross-links in corneal tissue. Exp. Eye Res. 66, 1998, 97-103; Wollensak G., Spoerl, E., Reber F. et al., Corneal endothelial cytotoxicity of ribofavin/UVA treatment in vitro. Ophthalmic Res 35, 2003, 324-328; Wollensak G., Spoerl, E., Seiler, T., Riboflavin/ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus. Am. J. Ophthalol. 135, 2003, 620-627 ).

L’applicazione di un agente fotosensibilizzante come la riboflavina-5’-fosfato ad un tessuto, come ad esempio la cornea, la pelle, i tendini, la cartilagine o il tessuto osseo, seguita da fotoattivazione per mezzo di irraggiamento con una fonte di energia elettromagnetica a lunghezze d’onda comprese tra 350 e 800 nm (campo che comprende l’intero spettro visibile, nonché l’ultravioletto e l’infrarosso vicini) à ̈ descritta anche nel brevetto US 7331350 (cessionaria The General Hospital Corporation di Boston, USA). Il documento riguarda una tecnica di riparazione tissutale che include anche diverse applicazioni oftalmiche, tra cui i trapianti di cornea, la cheratoplastica, la chirurgia refrattiva, il trattamento di lacerazioni corneali. Anche nel caso delle applicazioni oftalmiche l’obiettivo del trattamento à ̈ quello di accelerare la riparazione di lesioni e di saldare i tessuti evitando l’uso di suture.

Nel caso del trattamento di cross-linking corneale per la terapia del cheratocono, i parametri operativi per poter ottenere il risultato desiderato senza danneggiare i tessuti sottostanti dell’occhio sono calibrati con precisione, in modo tale che solo uno strato anteriore di stroma corneale di circa 300 µm sia raggiunto dal trattamento (Seiler, T., Hafezi, F., Corneal cross-linking–induced stromal demarcation line. Cornea 25, 2006, 1057-1059). Questa tecnica di irradiazione in presenza di riboflavina aumenta la forza biomeccanica della cornea di circa il 300%. Tuttavia, per i danni che il trattamento UVA procura alle strutture oculari più interne, la tecnica à ̈ sconsigliata ai pazienti con uno spessore dello stroma inferiore a 400 µm.

Come à ̈ noto, la riboflavina o vitamina B2(7,8-dimetil-10-ribitilisoallossazina, peso molecolare 376 Da) à ̈ un composto eterociclico ottenuto da una molecola di flavina cui à ̈ legata una catena formata da uno zucchero, il ribitolo.

Riboflavina (RF)

Si tratta di una sostanza di colore giallo praticamente insolubile in acqua (solubilità a 20°C 0,08-0,12 mg/ml cioà ̈ 0,008-0,012%, a seconda della struttura cristallina). Se colpita dalla luce fotolizza, producendo il distacco di un radicale ribitolo, e questa fotoreazione à ̈ alla base della formazione dei legami tra le fibrille di collagene, ed à ̈ quindi alla base della tecnica del cross-linking corneale.

La riboflavina si trova negli alimenti principalmente come forma solubile fosforilata. È solo grazie alla forma fosforilata solubile che à ̈ attualmente possibile formulare questo composto in acqua per l’applicazione della tecnica del cross-linking corneale.

Riboflavina-5’-fosfato (FMN)

Come dimostrato dalla letteratura scientifica e brevettuale del setto re, la riboflavina, o meglio la sua forma fosforilata in sale sodico (peso molecolare 456 Da, carica negativamente), à ̈ la molecola idrofila fotosensibilizzante correntemente utilizzata nell’attuazione della tecnica del crosslinking corneale. Ad esempio, una soluzione oftalmica contenente approssimativamente lo 0,1% di riboflavina come riboflavina fosfato (0,125 g di FMN per 100 ml di soluzione) e circa il 20% in peso di destrano à ̈ in commercio con il marchio Ricrolin® per il trattamento del cheratocono con la procedura del CXL. Nella formulazione citata il destrano svolge la funzione di garantire la mucoadesività del prodotto, in modo che esso possa aderire alla superficie oculare e assicurare una buona impregnazione dello stroma corneale con l’agente fotosensibilizzante.

Come notato, la riboflavina-5’-fosfato (o FMN) à ̈ una molecola idrosolubile che ha una scarsa capacità di penetrare attraverso l’epitelio in modo tale da raggiungere lo stroma corneale in quantità sufficiente, e quindi per consentire una efficiente imbibizione dello stroma, dove appunto la riboflavina fosfato agisce per formare nuovi legami, il trattamento deve essere preceduto dalla rimozione dell’epitelio, operazione che deve essere effettuata in anestesia locale.

L’epitelio corneale à ̈ uno strato lipofilo con uno spessore che può variare da 50 µm a 100 µm, che contribuisce per il 90% alla resistenza verso i farmaci idrofili e solo per il 10% alla resistenza ai farmaci lipofili (Washington, N.; Washington, C.; Wilson, C.G., Ocular Drug Delivery. Physiological Pharmaceutics: Barriers to Drug Absorption, 2<nd>ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, 2001, 249−269; Wilson, C.G., Zhu, Y.P.; Kumala, P.; Rao, L.S.; Dhillon, B., Ophthalmic Drug Delivery. In Drug Delivery and Targeting for Pharmacists and Pharmaceutical Scientists; Hillery, A. M., Lloyd, A. W., Swarbrick, J., Eds.; CRS Press: Boca Raton, FL, 2001, 329−353). Pertanto, le molecole idrofobiche grazie alla loro lipofilia possono permeare l’epitelio corneale, attraverso la via transcellulare, in maniera molto più efficace delle molecole idrofile. Per questa caratteristica di lipofilia tali molecole non sono formulabili nell’ambiente acquoso di una soluzione oftalmica.

La disepitelizzazione, che si rende necessaria per lasciar penetrare il FMN, espone il sottostante stroma alla azione lesiva di agenti patogeni, oltre che alla sintomatologia algica sempre presente nelle prime 24-48 ore dopo l’intervento. Diversi studi hanno dimostrato che dopo la disepitelizzazione l’acuità visiva, l’indice aberrometrico e quello topografico cominciano a migliorare solo dopo il sesto mese.

Per i problemi connessi alla rimozione dell’epitelio sarebbe desiderabile dunque eseguire il cross-linking corneale utilizzando composizioni in cui la riboflavina sia capace di attraversare l’epitelio corneale senza la necessità che questo venga rimosso. Questa tecnica di cross-linking effettuata senza disepitelizzare la cornea, detta anche cross-linking transepiteliale (anche indicata nel seguito con l’acronimo TE-CXL, transepithelial corneal cross-linking), permetterebbe anche l’accesso al trattamento a quei pazienti il cui stroma corneale si à ̈ ridotto a meno di 400 µm.

Al fine di ottenere composizioni oftalmiche a base di riboflavina fosfato (FMN) utili alla tecnica del cross-linking trans-epiteliale vengono attualmente aggiunti nelle formulazioni fotosensibilizzanti dei promotori di permeazione corneale (corneal permeation enhancer), ovvero sostanze capaci di favorire il passaggio trans-corneale della FMN, come ad esempio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), benzalconio cloruro, trometamolo (tris(idrossimetil)amminometano) o vitamina E TPGS. Ad esempio, nel tentativo di fornire sostanze utili nella cura del cheratocono con la tecnica CXL senza dover rimuovere l’epitelio corneale à ̈ stato suggerito l’uso di benzalconio cloruro come tensioattivo per aumentare la permeabilità dell’epitelio corneale (domanda di brevetto italiana MI2007/A002162 a nome R. Pinelli) e, successivamente, à ̈ stato proposto un collirio ipoosmolare contenente FMN e cloruro di benzalconio per il trattamento del cheratocono attraverso la tecnica del cross-linking trans-epiteliale (domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO2012/ 004726, a nome R. Pinelli).

Nello stesso filone, la domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO2011/012557 (Salvatore Troisi et al.), come pure la pubblicazione di Carmine Ostacolo e coll. (Ostacolo, C. et. al., Enhancement of corneal permeation of riboflavin-5’-phosphate through vitamin E TPGS: A promising approach in corneal trans-epithelial cross linking treatment. Int. J Pharm. 440, 2013, 148-153) propongono una soluzione oftalmica contenente un derivato della vitamina E, il d-alfa-tocoferil polietilenglicole 1000 succinato, anche noto come TPGS o vitamina E TPGS, come promotore della permeazione della riboflavina-5’-fosfato attraverso l’epitelio corneale, in procedure di cross-linking trans-epiteliale senza rimozione dell’epitelio corneale.

L’uso di simili agenti in qualità di promotori della permeazione di FMN attraverso l’epitelio corneale comporta un’azione citotossica sull’epitelio e sulle giunzioni intercellulari, che determina un temporaneo e reversibile indebolimento della funzione di barriera dell’epitelio, permettendo così il passaggio del FMN attraverso la cornea. È da notare, tuttavia, che l’effetto dei “corneal permeation enhancer†à ̈ comunque sempre proporzionale alla loro tossicità (Robert Gurny et al., Ocular Tolerance of Absorption Enhancers in Ophthalmic Preparations, AAPS PharmSciTech 4(1), 2002, 1-5).

Alla luce di quanto precede, sarebbe altamente conveniente poter effettuare un trattamento di cross-linking trans-epiteliale in cui la riboflavina possa penetrare attraverso la cornea superando la barriera dell’epitelio corneale senza doverlo rimuovere, e senza fare ricorso a promotori di permeazione. In quest’ottica, Morrison e coll. hanno studiato la possibilità di utilizzare la tecnica di solubilizzazione con ciclodestrine per veicolare attraverso l’epitelio corneale la riboflavina non fosforilata (RF, vitamina B2) (Peter W.J. Morrison, et al., Cyclodextrin-Mediated Enhancement of Riboflavin Solubility and Corneal Permeability. Mol. Pharm. 10(2), 2013, 756-62). Come à ̈ noto, le ciclodestrine sono oligosaccaridi di forma complessiva toroidale, con superfici esterne idrofile e una cavità interna lipofila, capaci di formare complessi di inclusione di tipo “guest-host†con composti idrofobi, rendendoli così più idrosolubili. Secondo i risultati di tale lavoro, in presenza di ciclodestrine la RF passa da una solubilità dello 0,008% ad una solubilità dello 0,012-0,019%: benché si tratti comunque di un risultato notevole, simili concentrazioni non sono inutilizzabili per il crosslinking trans-epiteliale.

Pertanto, gli studi connessi con la presente invenzione si sono focalizzati sulla realizzazione di sistemi per formulare la riboflavina (RF), molecola lipofila praticamente insolubile in acqua, in una forma non fosforilata che sia idrosolubile e bioassorbibile, in modo che possa passare la barriera dell’epitelio corneale e possa essere utilizzata direttamente nel trattamento del cheratocono mediante cross-linking trans-epiteliale.

Sommario dell’invenzione

Nell’ambito degli studi connessi con la presente invenzione, à ̈ stato preso in considerazione un lavoro di Douglas V. Frost del 1942 (Douglas V. Frost. The water-soluble riboflavin-boron complex. J. Biol. Chem. 145, 1942, 693-700), in cui si riporta che la solubilità della RF in acqua può essere incrementata riscaldando la stessa RF in presenza di acido borico (H3BO3o B(OH)3), acido metaborico (HBO2) o borace (Na2B4O7· 10 H2O, sodio tetraborato decaidrato). Tali soluzioni di riboflavina sono ottenute solo attraverso il protrarsi di un lungo riscaldamento a 95°C, temperatura alla quale una quantità significativa di RF si decompone. Inoltre, quando poi le soluzioni così ottenute vengono conservate a temperatura ambiente esse risultano fisicamente instabili, a causa della formazione di un precipitato cristallino che può presentarsi anche dopo svariate settimane o mesi. Nello stesso lavoro à ̈ riportato che tali soluzioni ottenute a pH alcalini sono più stabili, ma quando poi vengono addizionate con acido per fornire soluzioni con pH più fisiologici, e cioà ̈ neutre o debolmente acide, anch’esse danno origine alla precipitazione di RF.

Dell’anno precedente à ̈ il brevetto britannico GB 560431 a nome Winthop Chemical Co., in cui sono descritte composizioni idrosolubili di riboflavina con un sale borato di metallo alcalino, in cui la concentrazione della riboflavina eccede lo 0,02%, e in cui i composti ottenuti sono sali doppi di riboflavina e tetraborato di metallo alcalino. Si tratta però, in quel caso, di preparazioni ottenute in forma solida, in cui la dissoluzione in acqua à ̈ utilizzata solo in modo temporaneo per omogeneizzare i componenti, ed à ̈ seguita da essiccamento. I prodotti sono conservati in forma solida, per la somministrazione per iniezione dopo ricostituzione con acqua.

Sfruttando l’accenno di Frost alla possibile formazione di complessi solubili instabili tra la RF e i vari borati sotto l’effetto del prolungato riscaldamento, sono state studiate le possibili condizioni sperimentali per la preparazione a temperatura ambiente di una formulazione per uso oftalmico contenente RF, che sia stabile dal punto di vista chimico-fisico e possa essere utilizzata nel trattamento del cheratocono mediante la tecnica del cross-linking trans-epiteliale.

Secondo la presente invenzione, à ̈ stato ora trovato che utilizzando il tetraborato di sodio in concentrazioni in peso almeno 2,5 volte superiori e, preferibilmente, almeno 5 volte superiori alla concentrazione della RF si può ottenere la solubilizzazione della RF stessa come boro-complesso, già a temperatura ambiente e senza alcun riscaldamento. Inoltre, l’aggiunta successiva di acidi alla soluzione contenente la RF-borocomplesso allo scopo di portare tale soluzione a pH neutri o acidi, contrariamente alle aspettative, non dà origine ad un precipitato di riboflavina neanche quando la soluzione viene posta alla temperatura di 4°C per un tempo di 18 mesi.

Utilizzando la soluzione suddetta come base di partenza sono state realizzate numerose varianti di formulazioni oftalmiche, in presenza di vari eccipienti normalmente utilizzabili in simili formulazioni, come polimeri viscosizzanti e/o mucoadesivi, agenti osmotizzanti, tamponi e sostanze capaci di aumentare il passaggio trans-corneale, e tutte le formulazioni sono risultate stabili dal punto di vista chimico-fisico. Oltre a garantire la stabilità alla conservazione, i preparati secondo l’invenzione si sono rivelati notevolmente efficaci in termini di capacità di penetrazione attraverso l’epitelio corneale, cosa che li rende particolarmente adatti come preparati fotosensibilizzanti per il trattamento del cheratocono con la tecnica del crosslinking trans-epiteliale.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un preparato oftalmico per l’uso nel trattamento del cheratocono mediante la tecnica del cross-linking trans-epiteliale (TE-CXL) comprendente, in soluzione acquosa, riboflavina non fosforilata (7,8-dimetil-10-ribitil-isoallossazina o vitamina B2– qui denominata RF) e un composto del boro scelto tra tetraborati, ortoborati e metaborati di metalli alcalini e alcalino-terrosi, in cui la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,01 e il 2,0% in peso e il rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:2,5 e 1:25.

Come sarà più evidente con riferimento ai dati sperimentati presentati nel seguito, i risultati hanno mostrato che la RF contenuta in preparati formulati secondo la presente invenzione permea la cornea intatta in quantità significativamente maggiore di quanto faccia il corrispondente derivato fosforilato, FMN.

Secondo alcune soluzioni preferite dell’invenzione, il composto del boro utilizzato à ̈ un sale tetraborato di un metallo alcalino o alcalinoterroso, preferibilmente tetraborato di metallo alcalino decaidrato, e in maniera ancor più preferita tale composto à ̈ tetraborato di sodio decaidrato, di formula Na2B4O7· 10H2O.

Secondo alcune forme specifiche di realizzazione dell’invenzione, la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,01 e lo 0,1% in peso, e il rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:2,5 e 1:5. Secondo altre forme di realizzazione dell’invenzione la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,1 e l’1,5% in peso, e detto rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:5 e 1:15, il rapporto preferito essendo pari a 1:10.

Oltre alla riboflavina non fosforilata complessata con il sale di boro il preparato dell’invenzione contiene anche, in primo luogo, uno o più sali ionici scelti tra sali di potassio, sodio, magnesio o calcio, come cloruri, borati, citrati o solfati, ad esempio sodio cloruro o sodio borato, con cui si può controllare l’osmolarità del preparato, e i relativi acidi, necessari per regolare il pH del prodotto finale ad un valore nel campo fisiologico, compreso tra 6,7 e 7,4.

Il preparato di riboflavina per il TE-CXL secondo l’invenzione può contenere anche, nella soluzione acquosa, altri eccipienti utili per la sua applicazione, in particolare uno o più polimeri viscosizzanti (modificatori reologici) e/o mucoadesivi. Preferibilmente scelti tra: carbossimetilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, acido ialuronico, condroitinsolfato, acido alginico, polisaccaridi naturali, destrano, carbomeri, carbopol, alcool polivinilico, polietilenglicoli (preferibilmente PEG400), gomma di xantano.

Secondo alcune orme di realizzazione dell’invenzione, inoltre, il preparato può comprendere, un composto promotore della permeazione transcorneale non tossico per i tessuti corneali, in particolare scelto nel gruppo consistente in dimetitlsolfossido, etanolo o loro miscele.

Altri possibili eccipienti sono zuccheri semplici come glicerolo, trealosio, mannitolo o sorbitolo, e agenti antiossidanti, come acido ascorbico, sodio metabisolfito, tocoferolo acetato. Nella composizione possono essere previsti, inoltre, conservanti e/o antimicrobici come lattoferrina, sodio edetato (sale di sodio dell’acido etilendiamminotretraacetico, EDTA), benzalconio cloruro, poliesanide, TPGS (d-α-tocoferil polietilene glicol 1000 succinato, o vitamina E TPGS),

La preparazione del prodotto a base di riboflavina secondo l’invenzione può essere realizzata come segue.

Si sospende in acqua distillata, la quantità opportuna di riboflavina che si vuole formulare, compresa tra 0,01 e 2 g per 100 g d’acqua, si aggiunge una quantità di tetraborato di sodio decaidrato pari a n volte il peso della riboflavina (dove, secondo l’invenzione, n à ̈ un valore compreso tra 2,5 e 25), e si lascia sotto agitazione a temperatura ambiente fino a dissoluzione della sospensione di riboflavina (30 minuti circa).

A questo punto possono essere aggiunti gli altri eccipienti previsti nella formulazione, ad eccezione dell’eventuale polimero viscosizzante e/o mucoadesivo, quindi si regola il pH tra 6,7 e 7,4 con acido cloridrico o con acido borico e successivamente, dopo qualche minuto, si aggiunge il polimero viscosizzante e/o mucoadesivo fino a completa solubilizzazione.

Applicando la procedura sopra descritta à ̈ stato possibile ottenere la solubilizzazione della RF senza alcun riscaldamento e, inoltre, l’aggiunta di acidi al boro-complesso, operata per portare la soluzione a pH neutri o acidi, nel campo richiesto per una buona tollerabilità oculare, non dà origine ad un precipitato di riboflavina neanche quando la soluzione viene posta alla temperatura di 4°C per la conservazione.

Secondo l’invenzione à ̈ stato possibile ottenere in tal modo soluzioni stabili di RF fino alle sorprendenti concentrazioni dell’1% in peso e più, concentrazioni che oltre ad essere di gran lunga superiori alla solubilità della riboflavina in acqua distillata, sono anche ampiamente superiori al miglior risultato ottenuto finora per aumentare la solubilità della riboflavina in acqua, che à ̈ rappresentato dal lavoro di Peter W. J. Morrison, et al. già citato, dove in presenza di ciclodestrine la RF passa da una solubilità dello 0,008% ad una solubilità dello 0,012-0,019% in peso.

Come sarà evidente dai dati sperimentali che seguono, le formulazioni secondo la presente invenzione hanno anche dimostrato un sorprendente vantaggio sulla permeabilità corneale rispetto ad analoghe formulazioni contenenti riboflavina-5’-fosfato (FMN). Infatti, le permeabilità sperimentali ottenute per la RF sono risultate 10-15 volte superiori a quelle ottenute per la FMN, anche quando quest’ultima à ̈ formulata con destrano come nelle formulazioni commerciali attualmente utilizzate per il crosslinking corneale.

Le caratteristiche specifiche dell’invenzione, così come i vantaggi della stessa rispetto alle soluzioni della tecnica nota, risulteranno più evidenti con riferimento alla descrizione dettagliata di alcuni esempi di realizzazione della stessa, riportati nel seguito a scopo meramente illustrativo, e ai risultati della relativa sperimentazione.

ESEMPIO 1

Formulazione oftalmica base

Una formulazione base, contenente gli ingredienti essenziali per la realizzazione del preparato secondo l’invenzione, à ̈ illustrata nella tabella che segue.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 1,0

EDTA disodico x 2H2O 0,05

NaCl 0,14

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

Il preparato à ̈ stato ottenuto sospendendo 0,1 g di riboflavina in acqua distillata e aggiungendo alla sospensione 1 g di sodio tetraborato decaidrato, e lasciando quindi sotto agitazione a temperatura ambiente fino a dissoluzione completa della sospensione di riboflavina (30 minuti circa). A questo punto sono stati aggiunti 0,05 g di EDTA e 0,14 g di cloruro di sodio, e quindi si à ̈ regolato il pH della soluzione ad un valore tra 6,0 e 7,8 con acido cloridrico, ad ottenere il preparato di base.

ESEMPIO 2

Formulazione oftalmica addizionata con polimeri Una serie di preparati analoghi a quelli dell’Esempio 1 ma addizionati di un composto polimerico con funzioni di agente viscosizzante e/o mucoadesivo sono stati ottenuti secondo la formulazione indicata di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 1,0

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa * 0,3

NaCl 0,14

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

* carbopol 0,2%, ialuronato di sodio 0,18%, destrano 15%

La relativa procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 1. Una volta ottenuta la formulazione base, si à ̈ aggiunta la carbossimetilcellulosa, tenendo la miscela sotto agitazione fino a completa dissoluzione.

Come indicato nella tabella che precede, composizioni analoghe possono contenere ad esempio, al posto della carbossimetilcellulosa, uno 0,2% in peso di carbopol, oppure uno 0,15% in peso di sodio ialuronato, o anche il 15% in peso di destrano.

ESEMPIO 3

Formulazione oftalmica addizionata con etanolo Un preparato analogo a quello dell’Esempio 2 contenente in aggiunta alcool etilico con funzioni di promotore di permeazione à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 1,0

carbossimetilcellulosa 0,3

etanolo 12

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 4

Formulazione oftalmica addizionata con DMSO Un preparato analogo a quello dell’Esempio 2 contenente in aggiunta anche dimetilsolfossido (DMSO) con funzioni di promotore di permeazione à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 1,0

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa 0,3

NaCl 0,14

dimetilsolfossido 6,0

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 5

Formulazione oftalmica addizionata con DMSO ed etanolo Un preparato analogo a quelli degli Esempi 3 e 4 contenente in aggiunta sia etanolo che DMSO Ã ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 1,0

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa 0,3

etanolo 6,0

dimetilsolfossido 1,0

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 6

Formulazione oftalmica base ad alto rapporto RF/borato Un preparato analogo a quello dell’Esempio 1 con un più basso tenore di sodio tetraborato à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 0,5

EDTA disodico x 2H2O 0,05

NaCl 0,14

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 1.

ESEMPIO 7

Formulazione oftalmica ad alto rapporto RF/borato addizionata con polimeri

Preparati analoghi a quello dell’Esempio 6 ma addizionati con un composto polimerico con funzioni di agente viscosizzante e/o mucoadesivo sono stati ottenuti secondo la formulazione indicata di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 0,5

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa * 0,15

NaCl 0,2

HCl 2N fino a pH 6,0 -7,8

acqua distillata q.b. a 100

* carbopol 0,2%, ialuronato di sodio 0,18%, destrano 15%

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 8

Formulazione oftalmica ad alto tenore di RF Un preparato analogo a quello dell’Esempio 2 con un più elevato tenore di riboflavina à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,8

sodio tetraborato x 10H2O 4,0

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa* 0,3

NaCl 0,05

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

* carbopol 0,2%, ialuronato di sodio 0,18%, destrano 15%

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 9

Formulazione oftalmica a basso rapporto RF/borato Un preparato analogo a quello dell’Esempio 2 con un più basso tenore di sodio tetraborato à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10H2O 0,25

EDTA disodico x 2H2O 0,05

carbossimetilcellulosa* 0,3

NaCl 0,05

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

* carbopol 0,2%, ialuronato di sodio 0,18%, destrano 15%

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 10

Formulazione oftalmica a basso rapporto RF/borato senza EDTA Un preparato analogo a quello dell’Esempio 2 con un più basso tenore di sodio tetraborato à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10 H2O 0,25

carbossimetilcellulosa* 0,3

NaCl 0,05

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

* carbopol 0,2%, ialuronato di sodio 0,18%, destrano 15%

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 2.

ESEMPIO 11

Formulazione oftalmica base senza EDTA Un altro preparato base, analogo a quello dell’Esempio 1 ma privo del sodio edetato à ̈ stato ottenuto secondo la formulazione indicata qui di seguito.

Ingredienti % p/p

RF 0,1

sodio tetraborato x 10 H2O 1,0

NaCl 0,14

HCl 2N fino a pH 6,0-7,8

acqua distillata q.b. a 100

La procedura di preparazione era analoga a quella dell’Esempio 1.

A questa formulazione base possono poi essere aggiunti composti polimerici con funzioni di agenti viscosizzanti e/o mucoadesivi con le stesse modalità illustrate nell’esempio 2.

Prove di permeabilità transcorneale

Le formulazioni proposte secondo l’invenzione per il trattamento del cheratocono mediante cross-linking trans-epiteliale riportate negli esempi che precedono sono state sottoposte a sperimentazione per verificarne la capacità di permeare attraverso la cornea intatta.

La permeabilità corneale à ̈ stata valutata utilizzando celle di Franz secondo Reichl e coll. (Reichl, S. et. al., Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies, Br. J. Ophthalmol. 88, 2004, 560-565) sulle quali sono state posizionate cornee porcine. Nella camera donatore à ̈ stata posta la formulazione da testare e nella camera ricevente à ̈ stata invece posta una soluzione salina isotonica contenente un tampone fosfato a pH 7,2 (PBS, phopsphate-buffered saline).

Per ogni serie di prove, i campioni prelevati ogni 30 minuti dalla camera ricevente sono stati analizzati mediante HPLC. La quantificazione per HPLC ha permesso di stabilire la quantità di riboflavina che ha permeato la cornea nel tempo.

Nelle seguenti tabelle, come pure nelle Figure 1 e 2 dei disegni allegati, sono riportati i risultati delle prove di permeabilità transcorneale per le soluzioni secondo l’invenzione di cui agli Esempi 1-4, in confronto con soluzioni rispettivamente analoghe ma contenenti riboflavina-5’-fosfato (FMN) in luogo della riboflavina non fosforilata (RF).

Le quattro soluzioni di confronto sopra definite sono denominate nel seguito, rispettivamente, Es.1 FMN, Es.2 FMN, Es. 3 FMN e Es. 4 FMN. Come ulteriore confronto, à ̈ stata sottoposta alle stesse prove la soluzione commerciale già citata, contenente lo 0,1% di riboflavina come riboflavina fosfato (0,125 g di FMN per 100 ml di soluzione) e il 20% in peso di destrano, denominata in questa sede FMND (FMN-destrano)

Nella Tabella 1 che segue sono riportati i dati di permeazione delle varie formulazioni a confronto, ottenute riportando in ordinata la quantità di farmaco permeato (µg/cm<2>) in funzione del tempo (min).

TABELLA 1

Dati di permeabilità transcorneale – RF boro-complesso vs. FMN in formulazioni corrispondenti agli Esempi 1-4 FMND

Quantità permeata (µg/cm<2>)

Tempo (min) 30 60 90 120 150 180

Formulazione

Es. 1 RF 76,5 150,0 234,0 291,0 393,0 503,0 Es. 1 FMN 8,62 17,1 24,4 32,1 42,1 48,5 Es. 2 RF 66,0 135,0 199,0 253,0 315,0 359,0 Es. 2 FMN 6,95 14,2 21,2 27,5 34,1 38,2 Es. 3 RF 199,0 421,0 594,0 775,0 943,0 1135,0 Es. 3 FMN 15,5 30,5 44,1 58,6 72,9 85,4 Es. 4 RF 176,0 350,0 529,0 694,0 835,0 999,0 Es. 4 FMN 13,3 27,4 39,5 51,7 63,5 74,4 FMND 9,2 18,8 27 34,5 42,4 51,5

Gli stessi dati della Tabella 1 sono riportati nella Figura 1 allegata per il gruppo corrispondente alle formulazioni degli Esempi 1 e 2, e per il preparato FMND, e nella Figura 2 per il gruppo corrispondente alle formulazioni degli Esempi 3 e 4.

Con riferimento ai diagrammi illustrati, dalla parte lineare di ciascuna curva sono stati calcolati il coefficiente di permeabilità Kp, dividendo il flusso J (quantità permeata per unità di superficie) la concentrazione dell’agente (RF o FMN). I relativi risultati sono mostrati nella Tabella 2 che segue.

TABELLA 2

Valori del flusso J e del coefficiente di permeabilità Kpdai dati di permeabilità transcorneale della Tabella 1

Formulazione J (µg/cm<2>/s) Kp(cm/s)

Es. 1 RF 0,04250 4,25E-05 Es. 1 FMN 0,004789 4,79E-06 Es. 2 RF 0,036667 3,67E-05 Es. 2 FMN 0,003861 3,86E-06 Es. 3 RF 0,110556 11,1E-05 Es. 3 FMN 0,008611 8,61E-06 Es. 4 RF 0,097778 9,78E-05 Es. 4 FMN 0,007389 7,39E-06

FMND 0,005111 5,11E-06

Come risulta dall’esame dei dati che precedono e dall’esame delle Figure 1 e 2 allegate, a parità di eccipienti le formulazioni oftalmiche contenenti RF boro-complesso secondo l’invenzione hanno mostrato una permeabilità attraverso la cornea non disepitelizzata che à ̈ circa 10-15 volte superiore rispetto a quella mostrata da formulazioni contenenti FMN, ottenute nelle stesse condizioni sperimentali. La permeabilità corneale dei prodotti secondo l’invenzione à ̈ risultata anche notevolmente superiore alla permeabilità corneale della formulazione commerciale di riferimento FMND.

I prodotti dell’invenzione, contenenti riboflavina non fosforilata veicolata attraverso l’epitelio corneale per mezzo della formazione di un borocomplesso, rappresentano dunque un effettivo e reale vantaggio per il trattamento del cheratocono con la tecnica del cross-linking trans-epiteliale.

La presente invenzione à ̈ stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma à ̈ da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Preparato oftalmico per l’uso nel trattamento del cheratocono mediante la tecnica del cross-linking trans-epiteliale comprendente, in soluzione acquosa, riboflavina non fosforilata e un composto del boro scelto tra tetraborati, ortoborati e metaborati di metalli alcalini e alcalino-terrosi, in cui la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,01 e il 2,0% in peso e il rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:2,5 e 1:25.
2. 2. Preparato oftalmico secondo la rivendicazione 1, in cui detto composto del boro à ̈ un sale tetraborato di un metallo alcalino o alcalinoterroso.
3. 3. Preparato oftalmico secondo la rivendicazione 2, in cui detto sale tetraborato à ̈ tetraborato di sodio decaidrato.
4. 4. Preparato oftalmico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,01 e lo 0,1% in peso e detto rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:2,5 e 1:5.
5. 5. Preparato oftalmico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui la concentrazione della riboflavina à ̈ compresa tra lo 0,1 e l’1,5% in peso e detto rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ compreso tra 1:5 e 1:15.
6. 6. Preparato oftalmico secondo la rivendicazione 5, in cui detto rapporto ponderale tra il composto del boro e la riboflavina à ̈ 1:10.
7. 7. Preparato oftalmico secondo la rivendicazione 1 comprendente, inoltre, un polimero viscosizzante e/o mucoadesivo scelto dal gruppo consistente in: carbossimetilcellulosa, idrossipropilmetilcellulosa, acido ialuronico, condroitinsolfato, acido alginico, polisaccaridi naturali, destrano, carbomeri, carbopol, alcool polivinilico, polietilenglicoli, gomma di xantano.
8. 8. Preparato oftalmico secondo la rivendicazione 7 comprendente, inoltre, un composto promotore della permeazione transcorneale scelto nel gruppo consistente in: dimetitlsolfossido, etanolo o loro miscele.
9. 9. Preparato oftalmico secondo le rivendicazioni 7 o 8 comprendente, inoltre, uno o più composti antiossidanti, antimicrobici e/o conservanti scelto dal gruppo consistente in: acido ascorbico, sodio metabisolfito, tocoferolo acetato, lattoferrina, sodio edetato, benzalconio cloruro, poliesanide, TPGS.