ITRM20100256A1

ITRM20100256A1 - Un nuovo biomarcatore per la diagnosi precoce e l'immunoterapia del cancro

Info

Publication number: ITRM20100256A1
Application number: IT000256A
Authority: IT
Inventors: Luigi Aurisicchio; Gennaro Ciliberto
Original assignee: Farmafin Spa
Priority date: 2010-05-19
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2011-11-20
Also published as: WO2011145125A1

Description

DESCRIZIONE

Il tumore al polmone rappresenta senza dubbio la più frequente neoplasia in uomini e donne. Si stimano circa 200.000 morti dovute al tumore al polmone ogni anno nei soli Stati Uniti. Tra tutti gli stadi e le tipologie di tumore al polmone, la sopravvivenza a 5 anni è solo del 15%. La prognosi peggiore è quella del carcinoma polmonare non a cellule piccole ( Non-small celi lung cancer, NSCLC) che rappresenta approssimativamente l 80% di tutti i casi di tumore al polmone. Per questi motivi, c’è assoluta necessità di sviluppare nuovi biomarcatori del tumore al polmone e identificare nuovi bersagli specifici per nuove terapie.

Una delle caratteristiche peculiari di molti tumori è che spesso esprimono proteine diverse da quelle dei tessuti normali. L’origine di tali proteine è attribuibile in larga parte ad uno o più dei seguenti meccanismi: instabilità e cambiamenti del genoma in seguito a delezioni, inversioni, traslocazioni; fenomeni epigenetici che portano a cambiamenti dei livelli di trascrizione genica; o a meccanismi di splìcing alternativo diversi da quelli che avvengono nelle cellule normali. Tutti questi processi possono dare origine a nuove proteine normalmente inesistenti o espresse a livelli inferiori in cellule normali, e che hanno la potenzialità di essere utilizzate come biomarcatori specifici del tumore e/o come nuovi bersagli di terapie oncologiche. Infatti, in seguito ad una delezione cromosomica, un’inversione o una traslocazione, porzioni di geni contenenti elementi regolatori dell’espressione come promotori della trascrizione e/o enhancer possono creare nuovi geni ibridi costituiti da regioni cromosomiche normalmente non adiacenti e generare fusioni geniche specifiche nelle cellule tumorali. In un numero crescente di scoperte, infatti, vengono individuate aberrazioni cromosomiche in tumori ematologici ed epiteliali, che generano fusioni geniche. Tra gli ultimi, fusioni ricorrenti caratterizzano, tra gli altri, sottogruppi di tumori alla prostata, al seno, al polmone e al rene {Curr Opin Genet & Develop, 2009, 19: 82-91). Nella prostata, ad esempio, sono state descritte fusioni ricorrenti tra geni che codificano per i fattori di trascrizione della famiglia Ets, ERG ed ETV1 e l androgen-regulated transmembrane serine protease, TMPRSS2. Tali fusioni, sono successivamente emerse come li maggiore fattore causale nella tumorigenesi della prostata. Recentemente, inoltre, chimerismi indotti dai meccanismi di trascrizione o di post-trascrizione sono stati osservati nei geni dei mammiferi. In particolare, una serie di condizioni ambientali e di fattori cellulari possono influenzare lo splicing. Nel cancro, infatti, il meccanismo di splicing è significativamente alterato e presenta un repertorio di varianti molto diverso da quello dei tessuti normali. Molte di queste derivano da geni che hanno un ruolo riconosciuto nella carcinogenesi e nella progressione tumorale e per questo si pensa che lo splicing alternativo possa avere un ruolo patogenico nel cancro. La figura 1 mostra i possibili chimerismi nel trascrittoma di cellule tumorali. Nel pannello A viene mostrato il cis- e trans -splicing intergenico. Nel pannello B sono indicate fusioni oncogeniche associate a mutazioni. Da una recente analisi della trascrizione genica con la tecnica del 5 '-RACE e dei microarrays, è emerso che circa il 50 per cento degli RNA messaggeri è costituito da esoni al 5' che possono formare giunzioni con altri esoni presenti in geni distanti fino a 200 kb di distanza sullo stesso cromosoma ( cis-splicing ) ovvero anche su cromosomi diversi ( trans -splicing). Ad esempio il cis-splicing intergenico tra i geni MDS1 e EVI sul cromosoma 3q è stato frequentemente osservato nei casi di leucemia acuta {Proc Nati Acad Sci USA 1996;93:1642-7). Inoltre, un RNA chimerico derivato dalla fusione tra il gene JAZF1 presente sul cromosoma 7pl5 ed il gene JJAZ1 sito sul cromosoma 17ql 1, teoricamente attribuibile a un potenziale riarrangiamento t(7; 17) e che tradotto dà origine alla proteina JAZF1/JJAZ1 con funzioni antiapoptotiche, è stato recentemente isolato in campioni di tumore stromale dell’endometrio con cromosomi 7 e 17 intatti per citogenetica, dimostrando l’evento del meccanismo di trans-splicing in tali cellule tumorali ( Science . 2008 Sep 5;321: 1357-61). Anche nei tumori al polmone questa è la direzione della ricerca scientifica: 1) è stata dimostrata l’espressione anormale dei regolatori dello splìcing come ASF/SF2 ed altre ribonucleoproteine (J Thorac Oncol. 2009 Jun;4:674-8)\ 2) ben 2369 su 17 800 geni noti generano forme alternative di splicing; e 3) circa il 30% di queste ha funzioni oncogeniche (Nucleic Acids Res.

2008 November; 36: 6535-6547 ).

La sequenza del peptide ottamerico RTNKEASI (qui denominato EASI-PRO) isolato alcuni decenni fa {J Celi Physiol. 2009 Oct; 22 1:26-30) non corrisponde ad alcuna proteina presente in banca dati. Inoltre, un cDNA parziale di 300 bp (SEQ ID: 1) è stato ottenuto per Polymerase Chain Reaction (PCR) utilizzando oligonucleotidi degenerati codificanti per Γ ottamero. Tale cDNA presenta una cornice di lettura aperta {open reading frame - ORF) di 93 aa che, anche in questo caso, non è stata ritrovata nell’attuale banca dati delle proteine. Questo risultato non permette l’isolamento di sequenze geniche e proteiche più lunghe assolutamente indispensabili per l’ottenimento di reagenti necessari allo sviluppo di diagnostici e di terapeutici che pertanto permettano la definizione di un nuovo biomarcatore. Da tenere presente che varie preparazioni di anticorpi generati contro il peptide EASI-PRO, hanno generato dati positivi preliminari di immunoistochimica (IHC) e di microarray di tessuti tumorali (TMA) in lesioni di polmone e di colon, evidenziando il concetto che la proteina riconosciuta potrebbe essere espressa in modo selettivo in un'alta percentuale di tumori in confronto a tessuti normali. La mancanza di un allineamento con una sequenza proteica nota è ancora più sorprendente alla luce del fatto che negli anni recenti è stata determinata la sequenza dell’intero genoma umano e molte più proteine ed ORF siano state caratterizzate.

La presente invenzione consiste in nuovi metodi per la rivelazione di un RNA messaggero (SEQ ID: 2) non canonico e specifico delle cellule tumorali rispetto alle cellule normali dello stesso tessuto, che unisce due regioni geniche distinte di cui una è localizzata nel cromosoma 1 umano, l’altra è localizzata preferenzialmente ma non limitatamente nel cromosoma 1 umano. In una applicazione specifica, questo RNA messaggero dà origine ad una nuova proteina di fusione (SEQ ID: 3), precedentemente ignota, contenente al suo interno il peptide RTNKEASI, dove i primi cinque residui aminoacidici (RTNKE) risiedono preferibilmente, ma non limitatamente, al interno del gene hmm 1820564 e gli altri tre (ASI) sono localizzati in una ORF localizzata all’interno di una regione intergenica, e pertanto in precedenza considerata come una regione di DNA non codificante per nessuna proteina.

La rilevazione di questo RNA atipico e/o della sua corrispondente sequenza proteica consentirà di fornire nuovi marcatori diagnostici e prognostici che possano contribuire alla diagnosi precoce del cancro, al monitoraggio della risposta alla terapia e all'individuazione della malattia residua minima. Inoltre, da tale scoperta si possono sviluppare terapie mirate ad inibire la funzione della proteina e vaccini antitumorali.

Gli esempi che seguono illustrano l’invenzione in maggiore dettaglio: ESEMPIO 1

Analisi Bioinformatica

Da una consultazione in banca dati utilizzando il motore di ricerca BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) abbiamo constatato per la prima volta in letteratura che la maggior parte della sequenza del cDNA codificante per EASI-PRO è identica ad una porzione del cromosoma 1 umano. In particolare, la sovrapposizione dei nucleotidi 16-300 del cDNA aviene sul contig genomico GRCh37 del cromosoma 1 di Homo sapiens Allineamento della sequenza nucleotidica del cDNA codificante per EASI-PRO è mostrato in Fig. 2. Il cDNA (query) è stato analizzato tramite il motore di ricerca BLASTn. In particolare, l’allineamento del contig avviene tra la posizione 36,909K e la 37,009K bp all’interno della banda citogenica lp34.2 (Fig. 3). In tale regione, non sono predette dal modello Gnomon sequenze geniche complete o parziali (Fig. 4, Model). I geni noti più vicini alla sequenza sono il colony stimulating factor 3 receptor isoform b che si trova 14253 bp al 5' e il glutamate receptor, ionotropic, kainate 3 posizionato 307818 bp al 3' (Fig. 2 e 4). La figura 4 mostra la posizione dei loci associati con fenotipi (JPheno) descritti nelle banche dati Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) e quantitative trait loci (QTLs). E’ interessante notare che modifiche a carico di questa regione sono state osservate per l’Inflammatory Bowel Disease-7 (IBD-7). Tra le numerose mutazioni osservate in questa regione (si veda Morbid, Fig. 4), alcune sono associate a poliposi multiple del colon e del retto con ereditarietà autosomica recessiva causata da mutazioni in omozigosi del gene MYH, che codifica per una DNA glicosilasi responsabile del riparo del danno ossidativo del DNA.

Tale osservazione dimostra che la SEQ ID: 1 è in larga parte presente in una regione intergenica del cromosoma 1, coinvolta in talune patologie. Da questa porzione di cromosoma, tuttavia, viene trascritto un RNA messaggero specifico in campioni tumorali.

ESEMPIO 2

Analisi Bioinformatica

In seguito ad una ricerca nella banca dati descritta sopra, si osserva che i primi 15 nucleotidi del cDNA danno una sovrapposizione con centinaia di sequenze contenute nel genoma umano, di cui un sottoinsieme è presente all’ interno del cromosoma 1. Tra queste ultime, le sovrapposizioni fisicamente più vicine alla regione contenente i nucleotidi 16-300 sono state selezionate (Fig. 5). Tali regioni si trovano a distanze variabili dai geni del colony stimulating factor 3 receptor isoform b e del glutamate receptor, ionotropic, kainate. In particolare, 3 di esse (si vedano le sequenze 6, 7 e 8 della Fig. 5) mappano al interno dell’ultimo gene. La figura 6 mostra la posizione di alcune tra queste sovrapposizioni in formato grafico. Risulta evidente che 2 di esse (Blast Hits), in particolare le sovrapposizioni 3 e 4, mappano all’intemo del gene hmml820564, mai identificato sperimentalmente ma predetto dall’ algoritmo Gnomon e del quale non è stato ipotizzato sinora alcun ruolo o funzione.

Tale analisi bioinformatica suggerisce che eventi di riarrangiamento molecolare tra una di queste sequenze e la regione intergenica del cromosoma 1 descritta nell’esempio 1, possano dare origine ad un mRNA che nel suo interno contiene una sequenza che codifica per il peptide EASI-PRO specifico delle cellule tumorali.

ESEMPIO 3

RT-PCR

Dall’analisi del cDNA clonato è possibile osservare che un potenziale sito di splicing è presente tra i codoni codificanti il peptide ottamerico RTNKEASI e in particolare tra i codoni per E ed A (Fig. 7). Da questa osservazione nasce l’ipotesi che uno splicing alternativo (cis -splicing o trans-splicing) che avviene solo nel contesto delle cellule tumorali, possa generare una proteina unica e specifica.

A tale scopo, abbiamo selezionato le sequenze delle regioni cromosomiche al fianco delle sovrapposizioni presenti nel gene presunto hmml820564 (SEQ ID: 4 e 6, sequenze invertite e complementari) e abbiamo disegnato degli oligonucleotidi per effettuare una RT-PCR e verificare sperimentalmente se avviene un evento di splicing alternativo che includa tali sequenze. In particolare, la SEQ ID: 5 e la SEQ ID: 7, derivate dalle SEQ ID: 4 e 6, rispettivamente, sono state utilizzate in coppia con un oligonucleotide disegnato all’intemo del cDNA contenente EASI-PRO (SEQ ID: 8). In particolare, l’RNA totale è stato estratto da 3 campioni di tessuto tumorale di NSCLC e 3 biopsie di polmone normale con il sistema Qiagen RNeasy columns (QIAGEN) e retrotrascritto con il Reverse Transcription System della PROMEGA. Una reazione di PCR è stata poi eseguita per 35 cicli (1 min a 95°C, 2 min a 50°C e 1 min a 72°C) utilizzando le combinazioni degli oligonucleotidi SEQ ID: 5 e 8 e SEQ ID: 7 e 8 . I prodotti di PCR sono stati analizzati per elettroforesi con un gel d’agarosio all’ 1%, contenente etidio bromuro. Una banda di circa 400 coppie di basi, corrispondente a SEQ ID: 2 è stata amplificata con la combinazione SEQ ID: 7 e 8, ma solo da RNA estratto da 2 su 3 campioni tumorali e non dai tessuti normali. Nessuna amplificazione è stata ottenuta con la combinazione SEQ ID: 5 e 8. Tale osservazione dimostra che è avvenuto un fenomeno di splicing tra due regioni trascritte situate ambedue nel cromosoma 1 ma localizzate a distanza: la prima situata all’ interno del gene hmml820564, la seconda situata in una regione comunemente considerata intergenica tra la posizione 36,909K e la 37,009K bp all’intemo della banda citogenica lp34. Tale meccanismo può avvenire all’intemo dello stesso pre-mRNA, ipotizzando una sequenza intronica di circa 167kb (cis -splicing) ovvero uno splicing tra due diversi pre-mRNA (trans-splicing).

Lista delle sequenze

SEQ ID: 1

ACCAACAAAG AAGCCTCCAT CTGTCCATCC GTATATCTAT CCACCCTACC ATCCATCCAT TCACCCACTA ATTCATCCAT TTATTATCCA TGCATCCATC TGTCCATAAG TCTATCCGTC CACCCACCAC TTATCCATCC ATCCATTTAC CCATCATACT CATCCATTCA TTCATCCAGC CACCACCCAT GCACTCACCT ATCCACCCAT TCAGTCATTA ATCCAGTAAA AAATTTTGAG CACCTACTAC CAATCAGGCC CTGCACTTGG ACCTTAGGGT AGTGTGTAAA TAAAACC<'>CCA

SEQ ID: 2

1 ACACTCTCAG ATCTTGCAGA GAATCTTCCA CACACTCACC TGCACACTAA GTGGTTGGAG ACTCACTCCC CAAGGTGCCA ATTTTCTTAC CATGGTAACA

101 AAACCAACAG AACCAACAAA GAAGCCTCCA TCTGTCCATC CGTATATCTA TCCACCCTAC CATCCATCCA TTCACCCACT AATTCATCCA TTTATTATCC

201 ATGCATCCAT CTGTCCATAA GTCTATCCGT CCACCCACCA CTTATCCATC _ CATCCATTTA CCCATCATAC TCATCCATTC ATTCATCCAG CCACCACCCA

301 TGCACTCACC TATCCACCCA TTCAGTCATT AATCCAGTAA AAAATTTTGA GCACCTACTA CCAATCAGGC CCTGCACTTG GACCTTAGGG TAGTGTGTAA

401 ATAAAACCCC A

In nero: sequenza del gene hmml820564

In rosso: sequenza del cDNA in SEQ ID: 1

SEQ ID : 3

1 TLSDLAENLP HTHLHTKWLE THSPRCQFSY HGNKTNRTNK EASICPSVYL

51 STLPSIHSPT NSSIYYPCIH LSISLSVHPP LIHPSIYPSY SSIHSSSHHP 101 CTHLSTHSVI NPVKNFEHLL PIRPCTWTLG

In nero: sequenza del polipeptide derivata dal gene hmml820564

In rosso: sequenza del polipeptide derivata dal cDNA in SEQ ID:1

SEQ ID: 4

Posizione 7104088-7104277 (reverse complemen&)

CCTGAAAGACT AGAAC AGCTTCT AATGGGGGAGGT GGGCAT GAAAAGACAGAGGAAAAGGGAAAGGCA CTGATCCCGGGCTGGAGGGGAGCATGAGGTAGTCATCAGGGATGATGCTTCATGGTTGGTTGTGGAGG GTTCTTGGCGGCCAAAGAGTTTCCAGTGACTACGAGGGATCAGAGGCAAAGAAGCC

SEQ ID: 5

CCTG AAAGACTAGAAC AGC

SEQ ID: 6

Posizione 7098577-7098700 (reverse complement) ACACTCTCAGATCTTGCAGAGAATCTTCCACACACTCACCTGCACACTAAGTGGTTGGAGACTCACTC CCCAAGGTGCCAATTTTCTTACCATGGTAACAAAACCAACAGAACCAACAAAGAA

SEQ ID: 7

ACACTCTCAGATCTTGC

SEQ ID: 8

GGGGTTTTATTTACACACTACCC

Claims

Rivendicazioni 1. Metodo per diagnosticare il cancro in un paziente che comprenda: (a) l’ottenimento di un campione da un paziente affetto da tumore epiteliale; e (b) il rilevamento della presenza o assenza nel campione del prodotto di un evento di fusione genica generato da splicing alternativo tra due sequenze geniche localizzate preferenzialmente ma non limitatamente aH’intemo del cromosoma 1.
2. Metodo della rivendicazione 1, dove il campione è selezionato da un gruppo consistente di tessuti, sangue, plasma, siero, urina, sopranatante di urina, pellet cellulare di urina, liquido seminale, secrezioni prostatiche, versamenti pleurici e liquido di bronco-lavaggio alveolare.
3. Metodo della rivendicazione 1, che nel passaggio (b) comprenda il rilevamento della presenza o assenza in un campione di un RNA messaggero derivante da uno splicing alternativo contenente al suo interno una sequenza nucleotidica codificante per il peptide EASI-PRO, dove il rilevamento della sequenza codificante per il peptide EASI-PRO identifichi la presenza del tumore preferenzialmente ma non limitatamente al polmone nel paziente.
4. Metodo della rivendicazione 1, che comprenda il rilevamento della presenza o assenza in un campione di un RNA messaggero, derivante da uno splicing alternativo, nel quale il segmento al 5' è contenuto all’interno del gene hmml 820564 ed il segmento al 3' deriva dalla trascrizione di una regione intergenica del cromosoma 1 e codificante tutta ò in parte il peptide EASI-PRO, e in cui il rilevamento del trascritto nel campione identifichi preferenzialmente ma non limitatamente la presenza del tumore al polmone nel paziente.
5. Metodo della rivendicazione 1, dove la regione regolatoria trascrizionale comprenda il gene hmml 820564 espresso preferenzialmente ma non limitatamente nel tumore del polmone.
6. Metodo della rivendicazione 1, che nel passaggio (b) comprenda il rilevamento di una proteina chimerica avente preferenzialmente ma non limitatamente una porzione del polipeptide codificato dal gene hmml820564 e contenente la sequenza peptidica EASI-PRO.
7. Metodo della rivendicazione 6, che comprenda il rilevamento di una proteina chimerica avente preferenzialmente ma non limitatamente una porzione del polipeptide codificato dal gene hmml820564 e contenente la sequenza peptidica EASI-PRO preferenzialmente ma non limitatamente tramite saggi di tipo immunologico come ELISA, RIA, Western Blot, immunoistochimica, citometria a flusso e immunofluorescenza.
8. Metodo che comprenda il rilevamento della presenza o assenza in un campione della rivendicazione 2 di una risposta immunologica contro una proteina chimerica avente preferenzialmente ma non limitatamente una porzione del polipeptide codificato dal gene hmml 820564 e contenente la sequenza peptidica EASI-PRO.
9. Composizione che comprenda almeno uno dei seguenti reagenti: (a) una sonda oligonucleotidica che comprenda una sequenza che ibridizza ad un mRNA chimerico codificante il peptide EASI-PRO; (b) oligonucleotidi che comprendano sequenze che ibridizzano ad mRNA chimerico codificante la sequenza EASI-PRO; (c) un anticorpo contro una proteina chimerica che contenga la sequenza peptidica EASI-PRO.
10. Composizione della rivendicazione 9, che comprenda almeno uno dei seguenti reagenti: (a) una sonda oligonucleotidica che ibridizza con la giunzione di mRNA chimerico riportata in SEQ ID:2 e codificante la sequenza peptidica EASI-PRO ; (b) oligonucleotidi che comprendano sequenze che ibridizzano con una porzione di un mRNA chimerico e/o elemento regolatorio del gene hmml820564 e codificante la sequenza EASI-PRO; (c) un anticorpo contro una proteina chimerica che contenga la sequenza EASI-PRO e una altra sequenza aminoacidica derivante dal gene hmml820564.
11. Una molecola di acido nucleico che contenga mRNA chimerico codificante la sequenza EASI-PRO e preferenzialmente ma non limitatamente una porzione del gene hmml820564.
12. Una proteina chimerica che contenga la sequenza EASI-PRO e preferenzialmente ma non limitatamente un prodotto del gene hmml820564.
13. Un vettore di espressione che comprenda DNA o cDNA chimerico codificante la sequenza EASI-PRO e preferenzialmente ma non limitatamente porzione del gene hmml820564, operativamente legato ad un promotore o elemento regolatorio trascrizionale.
14. Un vettore di espressione che comprenda DNA o cDNA chimerico codificante la sequenza EASI-PRO e/o preferenzialmente ma non limitatamente porzione del gene hmml820564 in cui uno o più codoni nucleotidici che codifichino con bassa frequenza proteine espresse nell’uomo siano stati sostituiti con codoni nucleotidici presenti su acidi nucleici che codifichino proteine altamente espresse, operativamente legato ad un promotore o elemento regolatorio trascrizionale.
15. Un polipeptide di fusione che comprenda una proteina chimerica avente una porzione contenente la sequenza EASI-PRO e/o preferenzialmente ma non limitatamente porzione del gene hmml820564 e sequenze immunostimolatorie, come l’heat shock protein (HSP) 70, il lysosome-associated membrane protein (LAMP), il frammento C della tossina del tetano (FrC), il dominio N-terminale di FrC (DOM), il frammento pesante della catena costante dell’immunoglobulina G (FcIgG), la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), la tossina del colera (CT) da Vibrio Cholerae e la subunità B della tossina Heat-labile di Escherìchia Coli (LTB).
16. Un vettore di espressione che comprenda DNA o cDNA chimerico avente una porzione contenente la sequenza EASI-PRO e/o preferenzialmente ma non limitatamente porzione del gene hmml820564 e sequenze immunostimolatorie, come l’heat shock protein (HSP) 70, il lysosome-associated membrane protein (LAMP), il frammento C della tossina del tetano (FrC), il dominio N-terminale di FrC (DOM), il frammento pesante della catena costante dell’immunoglobulina G (FcIgG), la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), la tossina del colera (CT) da Vibrio Cholerae e la subunìtà B della tossina Fleat-labile di Escherichia Coli (LTB).
17. Una linea cellulare, batteri e lieviti contenente i vettori delle rivendicazioni 13, 14 e 16.
18. Un processo che comprenda la linea cellulare, batteri e lieviti della rivendicazione 17 in un mezzo di coltura in condizioni per la produzione delle proteine delle rivendicazioni 12 e 15.
19. Una composizione secondo le rivendicazioni 11, 12, 13, 14, 15·, 16 e 17 sotto forma di vaccino..
20. Una composizione di vaccino che comprenda: (a) una proteina, un peptide immunogenico o un epitopo derivato dal polipeptide delle rivendicazioni 12 e 15; (b) un acido nucleico delle rivendicazioni 11, 13, 14 e 16 e codificante detta proteina, peptide o epitopo; (c) una linea cellulare, batteri e lieviti della rivendicazione 17 e un eccipiente, carrier, tampone o adiuvante farmacologicamente accettabile.
21. Un anticorpo terapeutico specifico per la proteina della rivendicazione 12 da somministrare ad un paziente affetto preferenzialmente ma non limitatamente da tumore al polmone.
22. Composizione farmaceutica attiva sulla proteina della rivendicazione 12 da somministrare ad un paziente affetto preferenzialmente ma non limitatamente da tumore al polmone.