ITRM20090650A1 - Peptidi e loro derivati che inibiscono il rilascio extracellulare dellaproteina tat di hiv-1 e la replicazione di hiv-1 - Google Patents

Description

“PEPTIDI E LORO DERIVATI CHE INIBISCONO IL RILASCIO EXTRACELLULARE DELLA PROTEINA TAT DI HIV-1 E LA REPLICAZIONE DI HIV-1â€

La presente invenzione si riferisce al settore medico e farmacologico, in particolare al trattamento di malattie infettive, più in particolare al trattamento di infezioni dal virus HIV-1.

Sfondo dell’invenzione

L’introduzione della moderna terapia antiretrovirale, nota come terapia antiretrovirale ad elevata attività (Highly Active Antiretroviral Therapy - HAART), ha drammaticamente cambiato la storia naturale dell’HIV/AIDS. HAART si basa sulla somministrazione simultanea di più farmaci (di solito due farmaci contro la trascrittasi virale inversa e uno contro la proteasi virale), al fine di minimizzare la probabilità del verificarsi di mutazioni simultanee che rendano il virus insensibile al trattamento. I pazienti trattati con la HAART vivono sostanzialmente più un lungo in assenza di importanti segni di immunodeficienza. Questo trattamento, tuttavia à ̈ affetto da almeno due grossi problemi: da una parte, esso sembra incapace di sradicare l’infezione, mentre, dall’altra parte, presenta importanti problemi di tossicità, che spesso determinano la scarsa partecipazione dei pazienti alla terapia. Inoltre, l’emergenza di mutanti virali sfuggenti (viral escape mutants) resistenti a più farmaci à ̈ spesso riportata in pazienti trattati per prolungati periodi di tempo con HAART. Per tutte queste ragioni, à ̈ d’obbligo lo sviluppo di nuovi farmaci e l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per l’infezione da HIV-1 e per l’AIDS.

In questo contesto, la Proteina Tat dell’HIV-1 si presenta come un bersaglio molto attraente per l’intervento terapeutico. In modelli sperimentali di coltura cellulare, la proteina sembra essere essenziale per la replicazione di HIV-1, dal momento che l’eliminazione o mutazioni puntiformi che ne impediscono la sua attività hanno un forte effetto negativo sulla replicazione virale. Questo fatto à ̈ essenzialmente dovuto al ruolo di Tat come attivatore trascrizionale dei geni virali, che agisce legando la sequenza di RNA TAR trascritta dal promotore virale integrato LTR. Inoltre, la proteina possiede l’insolita proprietà di essere rilasciata dalla cellula che la esprimono ed essere internalizzata da quelle vicine; come detto sopra, à ̈ stato riportato che la Tat extracellulare esercita diverse attività pleiotropiche sia nell’ambiente extracellulare sia in diversi tipi cellulari. Una crescente evidenza indica che queste attività potrebbero essere coinvolte nella patogenesi della malattia provocata dall’HIV-1, compreso il progressivo sviluppo della immunodeficienza e lo specifico danno cerebrale nel corso della neuropatia associata tutto’AIDS, una condizione molto frequente che accompagna l’infezione da HIV-1. Così, à ̈ altamente sentito il bisogno dello sviluppo di farmaci in grado di bloccare la funzione di Tat, o per via intracellulare o per via extracellulare, o meglio in entrambi i compartimenti.

Tuttavia, i tentativi fatti finora di progettare farmaci anti-Tat hanno portato a risultati in gran misura deludenti. La proteina non ha attività enzimatiche note e possiede una struttura molto flessibile – finora non sono stati ottenuti cristalli di Tat, fatto indicativo della sua conformazione flessibile che si adatta ai diversi partner cellulari della proteina – che impedisce la possibilità di una facile progettazione o selezione di farmaci ad elevata attività. Delle poche piccole molecole che negli anni passati sono state viste inibire la Tat o bloccare l’interazione Tat-TAR, nessuna à ̈ finora progredita verso la sperimentazione clinica. È stato descritto l’uso di una sequenza RNA esca, che consiste di un elemento TAR multimerizzato, come mezzo per deviare la Tat dal suo bersaglio naturale al promotore dell’HIV-1. Questa esca, che tuttavia à ̈ uno dei geni terapeutici usati in uno dei pochi studi di terapia genica, richiede di essere espressa per via intracellulare, dopo rilascio con vettori virali, con le ovvie limitazioni in termini di applicabilità. Infine, à ̈ stata proposta la vaccinazione anti-Tat come mezzo sia per prevenire la replicazione di HIV-1 sia per colpire la Tat extracellulare. Tuttavia, la sperimentazione ha per ora prodotto risultati molto scarsi.

La maggior parte delle proteine secrete contiene un peptide segnale N-terminale che promuove il loro traffico e successivo rilascio sulla superficie cellulare per mezzo del trasporto vescicolare attraverso il reticolo endoplasmatico (endoplasmic reticulum - ER) e l’apparato di Golgi. Per ragioni poco comprese, tuttavia, un gruppo eterogeneo di proteine extracellulari non utilizzano il trasporto secretorio dipendente dal peptide segnale, ed escono dalle cellule mediante un processo chiamato secrezione proteica “non convenzionale†o "non-classica" (Nickel, W 2007. J. Cell. Sci. 120, 2295). Questo gruppo comprende mediatori proangiogenici, tra cui FGF-1 e FGF-2, citochine infiammatorie (IL-1b e MIF); molecole della matrice extracellulare, comprendenti galectina-1; proteine virali o parassitiche, quali Leishmania HASPB; recensite in: Backhaus, R, e al. 2004. J. Cell Sci. 117, 1727; Nickel, W 2005. Traffic 6, 607; Nickel, W 2007. J. Cell Sci.

120, 2295; Nickel, W, e al. 2008. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.; Schafer, T, e al.

2004. J. Biol. Chem. 279, 6244; Seelenmeyer, C, e al. 2008. FEBS Lett. 582, 1362). È interessante notare che in diverse occasioni il processo di rilascio sembra essere in qualche modo regolato, ad esempio dall’heat shock nel caso di FGF-1 (Prudovsky, I, e al.2002. J. Cell Biol. 158, 201; Landriscina, M, e al.2001. J. Biol. Chem.276, 25549; Jackson, UN, e al.1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U S UN 89, 10691); trattamento con LPS per MIF (Flieger, O, e al. 2003. FEBS Lett. 551, 78) o attivazione di monociti per IL-1b (Auron, PE, e al. 1987. J. Immunol. 138, 1447).

Nonostante il numero crescente di proteine che si trovano essere rilasciate dalla cellula attraverso la secrezione non canonica, sia i meccanismi di rilascio extracellulare sia l’identità molecolare della macchina(e) secretoria(e) coinvolta rimangono elusive. Molteplici evidenze indipendenti indicano che possono esistere vari tipi di distinte vie di esportazione non classiche, un partire dal trasporto vescicolare alla traslocazione diretta di membrana.

La proteina Tat del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) à ̈ una piccola proteina (101 aa in diversi ceppi clinici, o 86 aa nell’ampiamente utilizzato ceppo da laboratorio HXB2), che agisce come potente attivatore trascrizionale della espressione genica virale. Al promotore delle sequenze terminali ripetute lunghe (Lungo Terminal Repeat - LTR), la proteina lega un elemento RNA che agisce in cis (cis-acting RNA) (trans-activation-responsive region, TAR) presente tutto’estremità 5'-end di ciascun trascritto virale (Berkhout, B, e al. 1989. Cell 59, 273). Attraverso questa interazione, Tat attiva la trascrizione di HIV-1, promuovendo l’assemblaggio di complessi attivi in modo trascrizionale tutto’LTR attraverso interazioni multiple proteina-proteina (recensito in: Marcello, UN, e al.

2001. IUBMB Life 51, 175; Brigati, C, e al.2003. FEMS Microbiol. Lett.220, 57).

Oltre alla sua azione sulla regolazione dell’espressione genica di HIV-1, fu dimostrato almeno 20 anni fa che Tat possiede anche l’insolita proprietà di entrare nelle cellule quando presente nel mezzo extracellulare. Fin da questi primi esperimenti, che furono eseguiti per stabilire la capacità della proteina di transattivare una cassetta di geni reporter LTR, i loro risultati implicavano anche che non solo la proteina entra nella cellula, ma anche che questa veniva trasportata al nucleo in una forma trascrizionalmente attiva (Frankel, AD, e al.

1988. Cell 55, 1189; Green, M, e al. 1988. Cell 55, 1179). Questa proprietà fu successivamente caratterizzata in modo esauriente e fu mostrato che dipende da una sequenza lunga 9 amminoacidi (aa 49-57), ricca di arginina, corrispondente al dominio basico di Tat, il quale anche mezzi trasporto nucleare e legame TAR. Il lavoro eseguito in diversi laboratori negli ultimi anni, ha mostrato che brevi peptidi corrispondenti a questo tratto amminoacidico può essere usato come uno strumento biotecnologico per il rilascio intracellulare di proteine eterologhe, farmaci, vettori virali, siRNA e nanoparticelle (recensito in: Fittipaldi, UN, e al.

2005. Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 597).

I presenti inventori ed altri hanno precedentemente mostrato che la Tat extracellulare lega l’eparina, e che l’interazione eparina/Tat richiede l’integrità del dominio basico di Tat (Rusnati, M, e al.1997. J. Biol. Chem.272, 11313; Rusnati, M, e al. 1999. J. Biol. Chem. 274, 28198; Rusnati, M, e al. 1998. J. Biol. Chem.

273, 16027; Hakansson, S, e al. 2001. Protein Sci. 10, 2138; Ziegler, UN, e al.

2004. Biophys J. 86, 254). In particolare, i presenti inventori hanno per primi dimostrato che proteoglicani eparan solfato legati alla membrana (membranebound heparan-sulphate proteoglycans - HSPG) sono i recettori di superficie della cellula per internalizzazione di Tat, dal momento che la cellula geneticamente impedita nella sintesi di queste molecole non riesce un internalizzare la proteina extracellulare (Tyagi, M, e al. 2001. J. Biol. Chem. 276, 3254). I presenti inventori hanno anche trovato che l’internalizzazione di Tat avviene attraverso un attico processo di endocitosi, che coinvolge principalmente la via di endocitosi caveolare (Ferrari, UN, e al. 2003. Mol. Ther.. 8, 284; Fittipaldi, UN, e al. 2003. J. Biol. Chem. 278, 34141).

Degni di nota, alcuni degli studi che hanno chiarito i meccanismi molecolari della internalizzazione extracellulare di Tat hanno anche notato che la cellula che esprime Tat in maniera costitutiva rilascia la proteina nel surnatante della coltura cellulare (Chang, HC, e al. 1997. AIDS 11, 1421; Tyagi, M, e al. 2001. J. Biol. Chem. 276, 3254; Tasciotti, E, e al. 2005. Hum. Gene Ther.16, 1389), che rimane concentrata sulla superficie cellulare e protetta dalla degradazione proteolitica (Tasciotti, E, e al.2003. Cancer Gene Ther.10, 64; Marchio, S, e al.2005. Blood 105, 2802). Da questa posizione, la proteina si à ̈ mostrata in grado sia di modulare l’infezione del virus HIV-1 ed entrare in una forma trascrizionalmente attiva nelle cellule vicine.

I meccanismi sottostanti il rilascio di Tat dalla cellula che lo esprime sono tuttavia rimasti ampiamente inspiegati. La proteina non contiene un peptide segnale N-terminale che guidi la sua secrezione dalla via ER-Golgi e, di conseguenza, esportazione della proteina sembra essere insensibile ai farmaci che distruggono l’integrità di questi organelli (Chang, HC, e al.1997. Aids 11, 1421). Analogamente tutto’ingresso nella cellula, quando presente nel mezzo extracellulare, anche il rilascio di Tat dipende dall’integrità della regione basica della proteina (Tasciotti, E, e al.2005. Hum. Gene Ther.16, 1389; Tasciotti, E, e al.2003. Cancer Gene Ther.

10, 64). Tuttavia, il rilascio sembra essere indipendente dalla produzione e traffico di HSPG, dal momento che esso avviene anche in una cellula geneticamente difettosa nella biosintesi di tutti i proteoglicani (Tyagi, M, e al.2001. J. Biol. Chem.

276, 3254).

Una molteplice evidenza sperimentale indica che l’esportazione extracellulare di Tat potrebbe giocare un ruolo essenziale nello sviluppo della malattia da HIV-1, e così rappresentare un potenziale bersaglio per un nuovo intervento terapeutico. La Tat extracellulare promuove la produzione di citochine e recettori di citochine; modula la sopravvivenza, proliferazione e migrazione di differenti tipi cellulari; esercita attività angiogenica in vitro e in vivo; inibisce la proliferazione dei linfociti specifici per l’antigene (recensito in: Fittipaldi, UN, e al. 2003. J. Biol. Chem. 278, 34141; Giacca, M 2004. Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 4, 277). È probabile che alcuni dei summenzionati effetti della Tat extracellulare possano avere importanti implicazioni nella patogenesi della malattia da HIV-1, con particolare riguardo al neuropatogenico ruolo dell’infezione da HIV-1 nel sistema nervoso centrale (Kolson, DL, e al.1993. AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 677; Philippon, V, e al.1994. Virology 205, 519; Sabatier, JM, e al. 1991. J. Virol.

65, 961; Weeks, BS, e al. 1995. J.. Neurosci. Res. 42, 34). Dal momento che l’involucro dei virioni di HIV-1 à ̈ formato previa germogliazione dalla membrana cellulare, un’altra possibilità intrigante à ̈ che la Tat extracellulare legata alla membrana possa conferire proprietà ancora sconosciute ai virioni di HIV. Durante gli eventi fisiologici che si inquadrano nell’infezione da HIV-1, tra le notevoli proprietà del virus vi à ̈ la sua abilità di attraversare le barriere mucosali e quella emato-cerebrale. Il primo evento ha luogo durante l’infezione primaria; l’infezione del cervello à ̈ uno dei marchi della malattia ancora inspiegati, che si verificano un livello clinico o subclinico nella maggior parte dei pazienti (Resnick, L, e al.1988. Neurology 38, 9). Infatti, HIV-1 à ̈ in grado di passare attraverso le cellule microvascolari del cervello usando la stessa via della tossina del colera, che dipende dall’integrità della zattera lipidica, senza distruzione delle giunzioni occludenti e in assenza dell’infezione produttiva delle cellule endoteliali (Liu, NQ, e al. 2002. J. Virol. 76, 6689). Va osservato che questo processo assomiglia alla transcitosi, la caratteristica via vescicolare transcellulare epiteliale che avviene attraverso l’endocitosi caveolare (Bomsel, M 1997. Nat. Med.3, 42).

Per tutte le summenzionate ragioni, l’inibizione della funzione di Tat, sia dentro sia fuori dalla cellula, à ̈ stata vista come un potenziale bersaglio terapeutico per il trattamento di infezioni da HIV-1 e malattie correlate. L’inibizione della proteina Tat à ̈ una possibile via per fermare la replicazione virale, controllare o sopprimere l’infezione o bloccare i meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo della malattia da HIV-1 di organi o tipi cellulari specifici, quali quelli del sistema nervoso centrale.

Sono state proposte molte strategie per l’inibizione di Tat.

EP0386563, della Bayer, descrive nucleotidi antisenso che inibiscono Tat.

CA2074188, degli Stati Uniti d’America, descrive un costrutto di DNA utile nella terapia genica per inibire la replicazione di HIV-1.

WO90/08780, degli Stati Uniti d’America, fornisce una composizione di TAR RNA e proteina Tat.

WO91/15224, della Smith Kline Beecham, fornisce un agente di natura peptidomimetica che inibisce l’adesione cellulare di Tat mediata da RGD.

WO 92/02228, del Medical Research Council, descrive un oligonucleotide comprendente tre residui disaccoppiati che comprendono un residuo di uridina corrispondente un U23nella sequenza di TAR RNA di HIV e come coppie di basi affiancate corrispondenti a G26-C39nella sequenza di TAR RNA di HIV.

US 5.597.895, dell’Università del Texas, come pure US 5.889.175, della Transgene S.A., descrivono mutanti transdominanti di Tat in grado di inibire la replicazione di HIV-1.

WO 96/40759, della Ciba-Geigy descrive peptoidi che inibiscono l’interazione Tat/TAR.

US 5.821.046, della RiboTargets Holdings, PLC fornisce oligonucleotidi di RNA che legano la proteina Tat di HIV.

US 5.686.264, dell’Università del Texas, descrive sostituzione transdominante della Tat di HIV e geni mutanti troncati, in grado di inibire in vitro l’espressione del virus HIV-1 alla presenza di una concentrazione equimolare della proteina Tat selvatica.

WO 98/47913, dell’Università del New Jersey insegna l’inibizione della replicazione attraverso il peptide R-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-X-(biotin)-NH2analogo del dominio di legame Tat RNA.

Ancora, l’Università del New Jersey descrive in WO 99/02488 derivati di oligocarbammati come agenti che inibiscono Tat. Si veda anche WO 00/43332 per composti di oligourea derivati della Tat.

Un altro metodo per inibire la replicazione di HIV-1 à ̈ fornito da questa Università in WO 03/72709 con varianti della proteina Tat.

WO 99/42441 del CNRS descrive composti aromatici che hanno almeno una funzione donatore o accettore di protoni in grado di inibizione allosterica della proteina Tat.

WO 99/46991 dell’Università del Maryland insegna il trattamento di demenza associata all'HIV-1 attraverso la somministrazione di inibitori di Tat.

Rana e Huq descrivono in US 6.468.969 polipeptidi con D-amminoacidi come inibitori di Tat.

Analoghi di peptidi con catena ciclica che mimano in modo funzionale il segnale di localizzazione nucleare sono forniti in US 6.664.368, dell’Università Ebraica di Gerusalemme.

Una differente strategia à ̈ descritta da Malfroy-Camine, in US 6.703.019, per mezzo di anticorpi cationizzati contro Tat.

Hur e Chong, US 2004/0123877, descrivono una proteina di fusione che reprime la trascrizione di HIV, comprendente un) un polipeptide o composto inibitore della sua trascrizione scelto dal gruppo che consiste di un polipeptide che reprime fortemente l’attività del fattore di trascrizione di Sp1 o NF-kB, un polipeptide che reprime l’attività di trascrizione attraverso la cromatina di condensazione, e un polipeptide che ha un’attività di legame al promotore; e b) proteina Tat.

WO 2004/084805, del J. David Gladstone Institutes, fornisce un metodo per indurre una risposta immunitaria alla proteina Tat di HIV-1 mediante somministrazione di una proteina Tat acetilata.

Mathews e al. descrivono in US 2005/221288 una variante di proteina Tat selvatica di HIV-1 recante una mutazione 23Thr/Asn e in grado di inibire la trascrizione virale.

Aguilar-Cordova e al., US 2005/260717, insegnano un metodo per inibire la propagazione di HIV trasfettando una cellula con un doppio gene di fusione transdominante, che à ̈ costruito legando mutanti trans dominanti di Tat e Rev.

Una strategia siRNA Ã ̈ descritta in US 2007/082864 da Haren Bellan e al.

Nonostante molti tentativi, la ricerca di un agente efficace dotato della desiderata attività inibitrice à ̈ ancora in corso.

La Na<+>,K<+>-ATPasi à ̈ un complesso enzimatico costruito dentro la membrana plasmatica che catalizza L’idrolisi dell’ATP accoppiata con il trasferimento di Na<+>e K<+>attraverso la membrana contro il gradiente elettrochimico. Il complesso à ̈ composto di due subunità essenziali: la subunità alfa idrolizza ATP accoppiato con il trasporto di Na<+>e K<+>, mentre la subunità beta à ̈ richiesta per il ripiegamento della proteina e modula l’affinità del substrato; una subunità ausiliaria modula l’affinità del substrato ma non à ̈ richiesta per l’attività enzimatica. In tutte le cellule animali, la Na<+>,K<+>-ATPasi partecipa alla creazione del potenziale di membrana un riposo e al mantenimento e regolazione del volume cellulare, in aggiunta a funzioni più specializzate nei tessuti dell’epitelio renale, muscolo e neuroni (recensito in: Kabakov, UN 1994. J. Theor. Biol. 169, 51). La funzione enzimatica della Na<+>,K<+>-ATPasi à ̈ specificamente inibita da glicosidi cardiaci di origine vegetale, quali digoxina e ouabaina, che furono per prime usate per il trattamento dello scompenso cardiaco più di 200 anni fa. A una concentrazione bassa, non tossica, l’inibizione della Na<+>,K<+>-ATPasi da queste molecole esercita un positivo effetto inotropico sulla contrattilità cardiaca. Il sito di legame del glicoside cardiaco à ̈ localizzato sulla parte extracellulare della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi (Lingrel, JB, e al. 1994. Kidney Int. Suppl. 44, S32). Da notare, la sensibilità cellulare a questi inibitori differisce a seconda delle specie animali; la sensibilità minima à ̈ caratteristica per l’enzima di ratto (Emanuel, JR, e al. 1988. J. Biol. Chem. 263, 7726; Pista, LK, e al.1993. J. Biol. Chem.268, 17930).

Nell’esplorare i meccanismi responsabili per il traffico intercellulare della Tat, i presenti inventori hanno scoperto che la proteina lega specificamente la subunità catalitica della Na<+>,K<+>-ATPasi e che questa interazione à ̈ essenziale per mediare il rilascio extracellulare di Tat. I presenti inventori hanno anche trovato che l’ouabaina blocca l’interazione tra le due proteine, un riscontro che à ̈ consistente con precedenti osservazioni che questo farmaco impedisce la secrezione di Tat (Chang, HC, e al.1997. Aids 11, 1421), in aggiunta un quella di FGF-2 (Dahl, JP, e al. 2000. Biochemistry 39, 14877; Florkiewicz, RZ, e al. 1998. J. Biol. Chem.

273, 544).

WO 98/37881, della Ciblex Corporation descrive piccole molecole che inibiscono l’azione di esportazione su proteine “leaderless†. Sono descritte numerose proteine leaderless, tra cui Tat di HIV. Gli inibitori interferiscono tra la proteina leaderless e la molecola di trasporto, per esempio la Na<+>/K<+>ATPasi. Questo riferimento, tuttavia, non suggerisce specificamente il meccanismo di inibizione, non fornisce specifica comprensione sulla rilevanza dell’inibizione per l’esportazione della Tat di HIV-1, non esplora l’efficacia dell’inibizione dell’esportazione di Tat sulla funzione di Tat e la replicazione di HIV-1, e, infine, non prevede alcuna rilevanza dell’esportazione di Tat sullo sviluppo della malattia da HIV-1. Inoltre, questo riferimento postula che esista un diretto legame tra il trattamento con il farmaco, l’inibizione della Na<+>/K<+>ATPasi e l’esportazione della proteina leaderless, che non à ̈ il caso per Tat di HIV-1, dal momento che, per esempio, mutanti di Na<+>/K<+>ATPasi che sono inattivi come enzimi sono ancora efficienti nel mediare l’esportazione di Tat.

Nel loro lavoro, i presenti inventori hanno scoperto che l’esportazione di Tat di HIV-1 dipende specificamente dall’interazione fisica di Tat con la Na<+>/K<+>ATPasi. È stato trovato che il legame tra le due proteine richiede integrità del dominio basico di Tat e della regione C-terminale della alfa sub unità della Na<+>,K<+>-ATPasi. In particolare, quest’ultima regione contiene tre tratti peptidici intracitoplasmatici corti che sono giustapposti nella struttura tridimensionale della proteina, e che sono tutti richiesti per legare Tat.

Come conseguenza della presente scoperta, i presenti inventori forniscono, ed à ̈ un oggetto della presente invenzione, agenti attivi dotati di attività inibitrice della proteina Tat di HIV-1, pertanto rendendo disponibile un metodo per l’inibizione di tutte le funzioni esercitate da Tat, o nella cellula che esprime questa proteina (in particolare, inibizione della trascrizione e la replicazione di HIV-1) o dopo il suo rilascio extracellulare, quindi un metodo per il trattamento dell’infezione da HIV-1 e malattie correlate all’HIV-1.

Sommario dell’invenzione

È un oggetto della presente invenzione un peptide corrispondente a uno dei tre tratti peptidici del dominio intracitoplasmatico C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, o di loro combinazioni, detti tratti peptidici essendo richiesti per il legame della proteina Tat di HIV-1. In particolare, detti peptidi corrispondono rispettivamente alla regione 824-843, regione 939-951 e regione 1007-1023 del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi.

È un altro oggetto della presente invenzione à ̈ uno dei peptidi di cui sopra, o una loro miscela, per uso nell’inibizione della replicazione del virus HIV-1, nel trattamento dell’infezione da virus HIV-1 e nel trattamento di malattie indotte da HIV-1.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ una proteina comprendente uno o una combinazione dei tre tratti peptidici del dominio intracitoplasmatico C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi sopra descritti, che sono tutti richiesti per il legame della proteina Tat di HIV-1. Detta proteina à ̈ ottenuta come una proteina ricombinante o à ̈ espressa nella cellula dopo trasferimento della relativa sequenza codificante di DNA.

La presente invenzione fornisce anche la proteina e/o peptidi sopra citati per uso come medicamento.

È ancora un altro oggetto della presente invenzione à ̈ una composizione farmaceutica comprendente la proteina e/o peptidi sopra citati come principi attivi per l’inibizione della replicazione del virus HIV-1 e nel trattamento dell’infezione da virus HIV-1 o malattia indotta da HIV-1.

Questi e altri oggetti dell’invenzione saranno descritti in dettaglio nella seguente descrizione anche per mezzo di figure ed esempi.

Figura 1 A. Rappresentazione schematica della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi alla membrana cellulare. Le porzioni transmembrana della proteina sono mostrate da aste nere; le anse extracellulari e intracellulari da linee grigie. La numerazione si riferisce al Riferimento della Sequenza con numero di accesso NCBI NM_000701.7 (isoforma subunità alfa 1 della Na<+>/K<+>-ATPasi). B. Domini della Na<+>,K<+>-ATPasi. Le frecce indicano le regioni corrispondenti ai peptidi P1, P2 e P3. C. Sequenza amminoacidica dei peptidi P1, P2 e P3 di uomo, maiale e ratto. La numerazione corrisponde rispettivamente alle Riferimento della Sequenza con numero di accesso: NM_000701.7, NM_214249.1 e NM_012504.1. D. Sequenza amminoacidica della proteina di fusione P1-P3-P3. X indica qualsiasi amminoacido nel regione ponte tra i peptidi. E. Sequenza DNA codificante per la proteina di fusione P1-P2-P3. Y corrisponde a qualsiasi sequenza nucleotidica codificante per il ponte amminoacidico tra le sequenze peptidiche P1, P2 e P3. F.

Rappresentazione schematica di una cassetta trascrizionale per l’espressione intracellulare della proteina di fusione P1-P2-P3. Pr: qualsiasi promotore. Pa: qualsiasi segnale di poliadenilazione.

Figura 2A. Tat lega i tre peptidi citoplasmatici nel C-terminale della proteina Na<+>,K<+>-ATPasi alfa1. Peptidi biotininilati furono legati a sfere di streptavidina, incubati con [S<35>]-Tat86, lavati abbondantemente, e poi risolti con SDS-PAGE. Il riquadro mostra gel esposto a un “phosphoimager†. Il grafico mostra la quantità di proteine espresse legate come percentuali di conteggio di radiomarcato. B. Espressione delle anse citoplasmatiche del C-terminale di Na<+>,K<+>-ATPasi impedisce la transattivazione. Cellule HeLa che stabilmente esprimono un gene della luciferasi guidato da LTR furono trasfettate con diverse quantità di sia Tat sia FLAG-P1-P2-P3, al fine di stabilire il possibile effetto di un’interazione tra le due proteine nell’attività di transattivazione di Tat. Cellule HeLa furono trasfettate usando un costrutto contenente le sequenze U3 e R del LTR di HIV-1 (o un promotore CMV nei controlli negativi) a monte del gene della luciferasi di lucciola come reporter, e pcDNA3-Tat86 come un effettore, alla presenza di diverse quantità del costrutto FLAG-P1-P2-P3; Un plasmide (pCI-Neo, Promega) esprime il gene della luciferasi di Renilla sotto il controllo di un promotore CMV fu cotrasfettato nella cellula per standardizzare ciascun esperimento. Le attività misurate furono standardizzate dall’attività di Renilla; gli istogrammi rappresentano i valori medi di tre esperimenti indipendenti, assieme all’errore standard. C. Il trattamento di cellule con peptidi P1, P2, P3 blocca rilascio di Tat86-TK. Le cellule furono trasfettate con Tat86-TK e, dopo 36 h, lavate con eparina e poi trattate con 2-15 µg/ml di una miscela equimolare dei tre peptidi (Pmix); la presenza di Tat86-TK nel surnatante della coltura cellulare fu analizzata da western blotting dopo 4 h di incubazione. La pista 2 mostra i risultati di un esperimento simile nel quale la proteina di fusione P1-P2-P3 fu espressa in modo intracellulare. I livelli di espressione di proteina intracellulare furono stabiliti con western blotting sui lisati di cellule intere (whole cell lysates WCL). D. Il trattamento con peptidi P1, P2 e P3 impedisce l’infezione da HIV-1 in un saggio di infezione cellulare a singolo ciclo. Cellule HOS CCR5+ furono infettate con un HIV-1 pNL4-3-luciferasi pseudotipizzato BAL che, prima dell’infezione, furono incubate con una miscela equimolare di peptidi P1, P2 e P3 (Pmix) alla concentrazione di 15 µg/ml, a 37°C per 1 h; le cellule furono incubate con il virus per 4 h, lavate, e fu aggiunto mezzo fresco contenente 15 mg/ml Pmix; dopo 24 ore, le cellule furono raccolte e fu provato il livello di espressione di luciferasi. E. Inibizione della replicazione di HIV-1 dopo trattamento delle cellule con peptidi P1, P2 e P3. Cellule CEM T furono infettate con HIV-1BRUper 4 h alla presenza di una miscela dei tre peptidi (Pmix) o di un controllo peptide FLAG. Dopo l’infezione, il mezzo contenente il virus fu lavato e sostituito con mezzo fresco, contenente la corrispondente preparazione di peptidi. Al t=0 e successivamente, ogni 3 giorni fino al giorno12, i surnatanti furono provati per l’attività RT, mentre le cellule furono diluite 1:2 e peptidi freschi furono aggiunti ai mezzi di coltura.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

È un primo oggetto della presente invenzione una proteina comprendente un singolo o una combinazione di tre tratti peptidici del dominio intracitoplasmatico C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, detti tratti peptidici tutti leganti la proteina Tat di HIV-1.

È un secondo oggetto della presente invenzione un peptide, anche sintetico, corrispondente a uno dei tre tratti peptidici del dominio intracitoplasmatico C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, detti tratti peptidici tutti leganti la proteina Tat di HIV-1. Secondo questo oggetto, un peptide preferito à ̈ uno scelto dal gruppo che consiste del peptide corrispondente alla regione 824-843 del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi umana; il peptide corrispondente alla regione 939-951 del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi umana e il peptide corrispondente alla regione 1007-1023 del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi umana.

In modo del tutto vantaggioso, tutti i peptidi o loro derivati della presente invenzione corrispondenti a uno dei tre tratti peptidici del dominio C-terminale intracitoplasmatico della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, attraversano la membrana cellulare ed entrano nella cellula dopo rilascio extracellulare. Questa proprietà, imprevedibile a priori, rende i peptidi e i loro derivati vantaggiosi per la somministrazione, senza bisogno di ulteriori modifiche o speciali formulazioni farmaceutiche per il rilascio intracellulare.

La presente invenzione si riferisce anche a tutte le possibili modifiche previste dalla chimica farmaceutica dei summenzionati peptidi, introdotti per superare gli ostacoli dei peptidi naturali in termini breve durata di azione e mancanza di biodisponibilità orale. Queste modifiche includono, ma non sono limitate a, acilazione, PEGilazione, introduzione di aminoacidi non naturali, introduzione di restrizioni conformazionali e simili. In particolare la presente invenzione prevede anche la trasformazione dei peptidi summenzionati in sali farmaceuticamente accettabili. Detti sali sono noti all’esperto del settore non abbisognano di particolari descrizioni. Come riferimento esemplificativo, si veda il riferimento citato di seguito Remington’s Pahrmaceutical Sciences Handbook. Tutte queste modifiche vanno intese nel termine “derivati†o “derivato†quando riferito ai peptidi della presente invenzione.

È un terzo oggetto della presente invenzione la proteina e/o i peptidi summenzionati, sia da soli o in miscela tra loro per uso nell’inibizione della transattivazione della proteina Tat di HIV-1. Anche, la presente invenzione fornisce la proteina e/o i peptidi sopra citati per uso nell’inibizione della replicazione di HIV-1, e di conseguenza per uso nel trattamento dell’infezione da HIV-1. le medesime sostanze sono per uso nel trattamento di malattie associate all’HIV-1.

È un quarto oggetto della presente invenzione un vettore di espressione di mammifero, quale ad esempio un plasmide, virus o altro vettore che esprime la proteina o i singoli peptidi di cui sopra.

In generale, come ulteriore oggetto della presente invenzione, la proteina e/o il vettore e/o il peptide(i) sono per uso come medicamento.

È anche un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente la proteina e/o vettore e/o peptide(i) qui descritti.

L’espressione intracellulare della proteina di fusione della presente invenzione blocca la transattivazione della Tat.

In modo molto interessante, il trattamento delle cellule T- CD4<+>con una miscela di peptidi solubili, anche sintetici, dell’invenzione impedisce sial rilascio extracellulare di sia la replicazione di HIV-1.

Diverse realizzazioni dell’invenzione

Una realizzazione preferita della presente invenzione à ̈ la proteina avente la sequenza

NH2-YEQAESDIMKRQPRNPKTDK-(X)n-TRRNSVFQQGMKN-(X)n-LIIRRRPGGWVEKETYY-COOH,

dove (X)nà ̈ un tratto peptidico di qualsiasi lunghezza (n) composto da qualsiasi amminoacido (X), con n che varia da 0 a 1.000.

Un’altra realizzazione preferita della presente invenzione à ̈ una sequenza di DNA codificante per la proteina di cui sopra, in particolare la sequenza:

5'-TATGAGCAGGCTGAGAGTGACATCATGAAGAGACAGCCCAGAAATCCCAAAACAGACAAA-(Y)m-ACCAGGAGGAATTCGGTCTTCCAGCAGGGGATGAAGAAC-(Y)m-CTCATCATCAGGCGACGCCCTGGCGGCTGGGTGGAGAAGGAAACCTACTAT-3',

dove (Y)mà ̈ una sequenza DNA di qualsiasi lunghezza (m) composta da qualsiasi tripletta nucleotidica codificante per un amminoacido (Y), con n che varia da 0 a 3.000.

e le loro sequenze nucleotidiche che ibridizzano, anche sotto ibridazione stringente. In questo contesto i termini “ibridazione†e “stringente†si riferiscono alle tecniche di ibridazione convenzionali ben note all’esperto del settore (Buzdin A and Lukyanov S (eds) Nucleic Acids Hybridization Kluwer Academic Publishers Netherlands 2007).

Questa sequenza à ̈ un altro oggetto della presente invenzione, assieme ad altre sequenze di DNA equivalenti che codificano per le summenzionate sequenze amminoacidiche secondo il codice genetico (due al degeneration del genetic code).[sentire Elisa]

Un altra realizzazione preferita della presente invenzione à ̈ un peptide scelto dal gruppo che consiste di:

NH2-YEQAESDIMKRQPRNPKTDK-COOH (SEQ ID: 1)

NH2-TRRNSVFQQGMKN-COOH (SEQ ID: 2)

NH2-LIIRRRPGGWVEKETYY-COOH (SEQ ID: 3)

La proteina della presente invenzione à ̈ preparata secondo tecniche convenzionali, che sono parte della conoscenza generale dell’esperto dell’arte. Si può fare riferimento a testi generali, si veda per esempio Sambrook, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, NY, 2001. La proteina à ̈ prodotta e purificata da un microrganismo trasformato, per esempio il batterio BL21. Il microrganismo viene trasformato con il corrispondente vettore. Per ulteriori dettagli si veda la sezione Metodi negli Esempi. Le culture batteriche vengono fatte crescere in mezzi appropriati e la produzione proteina à ̈ indotta, per esempio con isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) o un altro induttore. I batteri sono poi lisati, per esempio in un tipico tampone di lisi (come 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 5% glicerolo, 2 mM ditiotreitolo), con mezzi usuali, per esempio sonicazione. La purificazione della proteina à ̈ realizzata usando procedure convenzionali (si veda Sambrook di cui sopra). Un esempio di tecnica di purificazione à ̈ il ben noto metodo con sfere di agarosio reticolate con glutatione per proteine di fusione con GST.

Si possono usare altre tecniche per la preparazione della proteina di fusione.

I peptidi sintetici della presente invenzione possono essere ottenuti con un qualsiasi metodo convenzionale, come per esempio la sintesi in fase solida, ad esempio quello basato sulla chimica Fmoc/t-Bu.

Il complesso peptide-resina à ̈ scisso/deprotetto usando un tipico reagente. In una realizzazione dell’invenzione, viene usata la miscela modificata del reagente H (acido trifluoroacetico 80%, fenolo 3%, tioanisolo 3%, 3,6-diossa-1,8-ottaneditiolo 8%, acqua 2,5%, metiletilsolfuro 2%, acido iodidrico 1,5% p/p). I peptidi sono isolati, per esempio con precipitazione con mezzi adatti, per esempio dietil etere, lavati e liofilizzati. I peptidi grezzi sono purificati da RP-HPLC preparativa o altre tecniche convenzionali. Le frazioni purificate possono essere raccolte e liofilizzate.

La presente invenzione fornisce proteine e peptidi come agenti attivi per uso nel trattamento di infezioni HIV. Il trattamento condotto grazie all’inibizione della proteina Tat di HIV-1 e dalla transattivazione da parte della proteina e/o dei peptidi della presente invenzione. Come risultato, la proteina e/o il peptide di cui sopra inibiscono la replicazione di HIV-1. La sequenza di DNA codificante per la proteina può anche essere usata nel trattamento di cui sopra.

Di conseguenza, la presente invenzione fornisce anche un metodo per trattare un soggetto che soffre di infezione da HIV, comprendente la somministrazione a detto soggetto di un’efficace quantità della proteina e/o del peptide e/o della sequenza di DNA .

I metodi della presente invenzione sono adatti per i trattamenti di individui affetti dal virus dell’immunodeficienza umana. Tali individui includono coloro ai quali à ̈ stata diagnosticata un’infezione HIV.

In qualche caso, l’individuo à ̈ CD4<+>deficiente, o ha una bassa conta di CD4<+>. I termini "CD4<+>- deficiente" e " bassa conta di CD4<+>" sono usati di seguito in modo intercambiabile, e, come di seguito riportato, si riferiscono ad uno stato di un individuo nel quale il numero di linfociti T CD4<+>à ̈ ridotto al confronto con un individuo in buona salute con un sistema immunitario intatto. La deficienza CD4<+>include uno stato in cui il numero di linfociti funzionali T CD4<+>à ̈ minore di circa 600 cellule T CD4<+>/mm<3>di sangue; uno stato in cui il numero di cellule funzionali T CD4<+>à ̈ ridotto al confronto di uno stato normale per un individuo in buona salute; e uno stato in cui le cellule funzionali T CD4<+>sono completamente assenti.

Come riportato di seguito, un "individuo CD4<+>deficiente" à ̈ un individuo che ha un numero ridotto di cellule funzionali T CD4<+>, indipendentemente dalla ragione, quando confrontato con un individuo che ha un sistema immunitario normale ed intatto. In generale, il numero di cellule funzionali T CD4+ che à ̈ compreso in un intervallo normale à ̈ conosciuto per diverse specie di mammiferi.

Anche adatti per il trattamento secondo la presente invenzione sono gli individui a rischio di contrarre l’infezione da virus dell’immunodeficienza. Tali individui includono, ma non sono limitati a, individui con sistema immunitario sano ed intatto, ma che sono a rischio di infezione HIV (individui "a rischio"). Gli individui a rischio includono, ma non sono limitati a, individui che hanno una maggiore probabilità di essere infettati da HIV rispetto alla popolazione generale.

Individui a rischio di infezione HIV includono, ma non sono limitati a, individui a rischio per infezione HIV dovuto ad attività sessuale con individui infettati da HIV; utilizzatori di farmaci endovena; individui che possono essere stati esposti a sangue infetto da HIV, prodotti di sangue, o altri fluidi corporei contaminati da HIV; bambini nati da madri infette da HIV.

Anche adatti per trattamento con questo metodo sono individui che furono trattati per infezione da virus dell’immunodeficienza, ma che hanno avuto una ricaduta, esempio, coloro che hanno avuto un aumento del numero di cellule T CD4<+>in risposta alla terapia anti-virale per HIV, ma che successivamente tali valori T CD4<+>sono crollati.

Il metodo della presente invenzione à ̈ adatto per il trattamento di individui che hanno fallito il trattamento della terapia antivirale per un’infezione HIV ("fallimento del trattamento dei pazienti"). Tale fallimento del trattamento dei pazienti include individui che hanno subito precedenti regimi di trattamento HAART o STI.

Il metodo della presente invenzione à ̈ anche adatto per il trattamento di individui che, a causa di un’infezione da HIV-1, soffrono di HIV-1 o di altre malattie concorrenti, comprese ma non limitate a, neuropatie indotte da HIV-1 e sarcoma di Kaposi.

Sono anche adatti individui che furono precedentemente trattati con terapia antiretrovirale per il trattamento di un’infezione da HIV, e nei quali à ̈ emersa una resistenza ai farmaci HIV.

Il medicamento oggetto della presente invenzione à ̈ noto agli esperti nel settore e non richiede una qualsiasi particolare descrizione. In via esemplificativa, si rinvia il lettore alla letteratura qui citata.

Convenientemente, detto medicamento à ̈ nella forma di una preparazione per somministrazione parenterale, ma vi sono altre forme ugualmente adatte per mettere in pratica la presente invenzione. La persona esperta nell’arte deciderà il tempo di somministrazione più efficace, in dipendenza delle condizioni del paziente, grado di severità della malattia, risposta del paziente e qualsiasi altro parametro clinico relativo alla conoscenza generale di questa materia.

Le composizioni farmaceutiche conterranno almeno una proteina, DNA codificante per la proteina, peptide, o il vettore di espressione descritto sopra come ingrediente attivo, in una quantità tale da produrre un significativo effetto terapeutico. Le composizioni della presente invenzione sono del tutto convenzionali e sono ottenute con metodi di comune prassi nell’industria farmaceutica, come ad esempio, quelle illustrate nel Remington's Pharmaceutical Science Handbook, Mack Pub. N.Y. – ultima edizione, si veda anche la letteratura brevettale citata in questa descrizione. Secondo la via di somministrazione scelta, la composizione sarà in forma solida o liquida, adatta per somministrazione orale, parenterale o endovenosa. Un’altra realizzazione à ̈ anche la terapia genica. Le composizioni secondo la presente invenzione contengono, con l’ingrediente attivo, almeno un veicolo od eccipiente farmaceutico accettabile. Questi possono essere coadiuvanti di formulazione particolarmente utili, ad esempio agenti solubilizzanti, agenti disperdenti, agenti sospendenti e agenti emulsionanti.

Gli agenti attivi per l’uso nella presente invenzione possono essere somministrati come medicamento, ad esempio una composizione farmaceutica. La composizione della presente invenzione contiene almeno un agente attivo con un veicolo adatto. Si possono utilizzare varie tecniche di somministrazione, tra le quali vi sono tecniche parenterali come sottocutanee, endovena ed iniezioni intraperitoneali, cateterizzazioni e simili. Le quantità medie dell’agente attivo possono variare ed in particolare, possono essere basate su raccomandazioni e prescrizioni di un medico qualificato.

Le composizioni farmaceutiche usate nei metodi di questa invenzione per somministrazione ad animali ed esseri umani comprendono il composto attivo in combinazione con un veicolo o eccipiente farmaceutico.

Il medicamento può essere nella forma di compresse (comprese losanghe e granuli), dragee, capsule, pillole, fiale, spray intranasali, o supposte comprendenti il composto dell’invenzione.

"Medicamento" ha di seguito il significato di porzioni fisicamente discrete coerenti adatte per somministrazione medica. "Medicamento nella forma di dosaggio unitario" ha di seguito il significato di unità fisicamente discrete coerenti adatte per somministrazione medica, ciascuna contenente una dose giornaliera o un multiplo o un sottomultiplo di una dose giornaliera del composto attivo dell’invenzione in associazione con un veicolo e/o racchiuso in un involucro. Quando il medicamento contiene una dose giornaliera, o, per esempio, la metà, un terzo o un quarto di una dose giornaliera dipenderà da come il medicamento à ̈ somministrato se una o, per esempio, due, tre o quattro volte al giorno, rispettivamente.

Vantaggiosamente, le composizioni sono formulate come unità di dosaggio, ciascuna unità adattata a fornire una dose fissa di principio attivo. Compresse, compresse rivestite, capsule, pillole, fiale, spray intranasali, o supposte sono esempi di forme di dosaggio preferito secondo l’invenzione. E’ necessario che l’ingrediente attivo costituisca un’efficace quantità, ad esempio in modo tale che un dosaggio efficace sarà consistente con la forma di dosaggio impiegata in una dose singola o multipla. Il dosaggio esatto per l’individuo, come il dosaggio giornaliero, sarà sicuramente determinato secondo i principi standard medici e sotto la direzione di un medico.

Il composto attivo può anche essere somministrato come sospensione, soluzione ed emulsione del composto attivo in diluenti acquosi o non acquosi, sciroppi, granulati o polveri.

Diluenti che possono essere usati nelle composizioni farmaceutiche (es., granulati) contenenti il composto attivo adattato per le forme nelle compresse, dragee, capsule e pillole comprendono: riempitivi e diluenti, ad esempio amido, zuccheri, mannitolo e acido silicico; agenti di legame, ad esempio carbossimetil cellulosa e altri derivati di cellulosa, alginati, gelatine e polivinil pirrolidone; agenti umettanti, ad esempio glicerolo; agenti disintegranti, ad esempio, agar-agar, calcio carbonato e sodio bicarbonato: agenti per ritardare la dissoluzione, ad esempio, paraffina; acceleratori di assorbimento, ad esempio, composti di ammonio quaternario; tensioattivi, ad esempio, cetil alcool, glicerolo monostearato; veicoli assorbenti, ad esempio, caolino e bentonite; lubrificanti, ad esempio, talco, calcio e magnesio stearato e polietilene glicoli solidi. L’esperto dell’arte può portare varianti alle realizzazioni esemplificative.

Le compresse, dragee, capsule e pillole comprendenti il composto attivo possono avere un rivestimento convenzionale, ricoperture e matrici protettive, che possono contenere opacizzanti.

Questi possono essere realizzate in modo tale che rilascino l’ingrediente attivo solo o preferibilmente in una zona particolare del tratto intestinale possibilmente in determinato periodo di tempo. Per esempio il rivestimento, copertura e matrice protettiva possono essere fatti da sostanze polimeriche o cere.

L’ingrediente attivo può essere anche microincapsulato assieme a uno o più dei diluenti sopra citati.

Il diluente da usare nelle composizioni farmaceutiche adatte alla forma di supposte possono, per esempio, essere i soliti diluenti idrosolubili, come i polietilene glicoli e grassi (ad esempio, olio di cocco ed esteri superiori (ad esempio, alcool C4 con acido grasso C6) o loro miscele.

Le composizioni farmaceutiche che sono soluzioni ed emulsioni possono, per esempio, contenere i soliti diluenti, come solventi, agenti di dissoluzione ed emulsionanti. Esempi specifici e non limitanti di tali diluenti sono acqua, alcol etilico, alcol isopropilico, carbonato etilico, acetato etilico, alcool benzilico, benzoato di benzile, propilene glicole, 1,3-butilene glicole, dimetilformammide, oli (per esempio, olio di nocciole, glicerolo, tetraidrofurfuril alcool, polietilene glicoli ed esteri di acidi grassi con sorbitolo) o loro miscele.

Soluzioni e sospensioni per somministrazione parenterale e intranasale, devono essere sterili, ad esempio acqua od olio di arachide contenuto in fiale e, se appropriato, isotoniche con il sangue.

Le composizioni farmaceutiche che sono sospensioni possono contenere diluenti comuni, come diluenti liquidi, ad esempio, acqua, alcol etilico, propilene glicole, tensioattivi (ad esempio, isostearil alcool etossilati, poliossietilene sorbitolo e esteri di sorbitano), cellulosa microcristallina, alluminio metaidrossido, bentonite, agaragar e tragacante, o loro miscele.

Le composizioni farmaceutiche possono anche contenere agenti coloranti e conservanti, così come profumi e aromatizzanti (ad esempio, oli di menta piperita o eucalipto e agenti dolcificanti (ad esempio, saccarina e aspartame).

Le composizioni farmaceutiche conterranno generalmente da 0,5 a 90% dell’ingrediente attivo del peso totale della composizione.

In aggiunta il composto attivo, può contenere nella composizione e medicamento farmaceutico anche altri composti farmaceuticamente attivi.

Ogni diluente nel medicamento della presente invenzione può essere uno qualsiasi di quelli sopra menzionati in relazione alle composizioni farmaceutiche.

E’ previsto che questo composto attivo sarà somministrato in modalità perorale, intranasale, parenterale (per esempio, intramuscolare, intratecale, intraperitoneale, sottocutanea, transdermica o endovenosa), rettale o locale, preferibilmente intranasale o parenterale, specialmente perlinguale, o endovenosa. Il peptide di o un suo sale analogo, à ̈ somministrato molto preferibilmente per via intranasale o endovenosa.

Il dosaggio, à ̈ preferibilmente nell’intervallo da 0,01 a 20 mg/kg di peso corporeo, e più preferibilmente nell’intervallo di 0,05 a 5 mg/kg di peso corporeo, e sarà in funzione della natura e del peso corporeo del soggetto da trattare, la reazione dell’individuo a questo trattamento, il tipo di formulazione con cui viene somministrato l’ingrediente attivo, il modo in cui la somministrazione à ̈ condotta e il punto di progressione della malattia o l’intervallo con cui viene somministrata. Così, in qualche caso può essere sufficiente un uso inferiore a un dosaggio minimo mentre in altri casi un limite superiore può essere superato per raggiungere i risultati desiderati. Dove vengono somministrate grandi quantità, si suggerisce di dividere queste somministrazioni all’individuo più volte al giorno. In questo caso la somministrazione intranasale può utilizzare dispositivi dosatori noti nell’esperto dell’arte.

I seguenti esempi illustrano ulteriormente l’invenzione.

ESEMPIO 1

Tat di HIV-1 lega la subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi cellulare.

Precedenti esperimenti hanno indicato che il rilascio extracellulare di alcune delle proteine che non seguono la canonica via di secrezione, mediato da ER-Golgi, quale il FGF2 (Dahl, JP, e al.2000. Biochemistry 39, 14877; Florkiewicz, RZ, e al.

1998. J. Biol. Chem. 273, 544) e Tat di HIV-1 (Chang, HC, e al. 1997. Aids 11, 1421) à ̈ inibito dal glicoside cardiaco ouabaina. Dal momento che lo specifico bersaglio cellulare dell’ouabaina à ̈ la subunità alfa di Na<+>,K<+>-ATPasi, i presenti inventori hanno voluto investigare se la Tat possa direttamente interagire con questa proteina e se questa interazione possa essere coinvolta nel rilascio extracellulare della Tat.

Per provare questa ipotesi, i presenti inventori hanno eseguito esperimenti di coimmunoprecipitazione tra una proteina di fusione corrispondente alla forma a 86 amminoacidi della Tat fusa all’enzima timidina chinasi (Tat86-TK) e la subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi endogena, espressa in modo ubiquitario, in cellule HEK293T che esprimono Tat86-TK. I presenti inventori hanno trovato che alfa1 era presente nell’immunoprecipitato anti-Tat86-TK e, in modo molto rimarchevole, che il trattamento delle cellule con 25 µM di ouabaina per 4 h prima della loro raccolta, aboliva completamente l’interazione tra le due proteine.

Dal momento che la Na<+>,K<+>-ATPasi di ratto à ̈ nota per essere insensibile al trattamento con ouabaina, dovuto alla presenza di variazioni amminoacidiche naturali nella sua subunità alfa1 (Emanuel, JR, e al. 1988. J. Biol. Chem. 263, 7726), i presenti inventori si sono chiesti se questa proteina ancora interagiva con Tat. Cellule HEK293T umane furono trasfettate con vettori esprimenti alfa1 di ratto assieme a vettori esprimenti o Tat86-TK o una proteina reporter TK fusa a 11 amminoacidi nel dominio basico di Tat (aa 48-58; Tat11-TK). Quando alfa1 fu immunoprecipitata con uno specifico anticorpo, anche la proteina di fusione con Tat era presente negli immunoprecipitati. Da notare, tuttavia, e per contro con la alfa1 umana, che l’aggiunta di ouabaina non modificava l’interazione tra l’alfa1 di ratto e la proteina Tat. Inoltre, Tat anche il mutante inattivo 716N della subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi legato per via catalitica, che reca una mutazione da Asp a Asn nel sito di legame con ATP impedisce l’attività catalitica dell’enzima.

Nell’insieme, questi risultati indicano che Tat lega le subunità di Na<+>,K<+>-ATPasi di uomo e ratto indipendentemente dall’attività enzimatica delle proteine.

METODI

Costrutti che esprimono TK, Tat11-TK e Tat86-TK (Tasciotti, E, e al.2003. Cancer Gene Ther.10, 64), Tat86, Tat11-GFP (Fittipaldi, A, e al. 2003. J. Biol. Chem.278, 34141), Tat86(R5A) (Demarchi, F, e al. 1996. J. Virol.70, 4427) sono già descritti. L’alfa1 di ratto mutante puntiforme recante una mutazione puntiforme missenso (da G ad A) al nucleotide 2447 (che porta alla sostituzione di Asp alla posizione 716 con Asn, nella terza, grande ansa citoplasmatica della proteina) fu introdotta mutagenesi mediata con PCR a due stadi, usando PCR inneschi recanti la sostituzione voluta; il secondo stadio fu eseguito usando gli stessi inneschi descritti per i mutanti di delezione. L’amplicone fu poi digerito con HindIII e NotI, e clonato nella pcDNA3 (Invitrogen Co). L’epitopo FLAG fu inserito come segue: oligonucleotidi complementari codificanti la sequenza FLAG mancante dell’ATG furono progettati, appaiati (annuale), e il dsDNA risultante fu clonato nei vettori del mutante dell’alfa1 (come pure il vettore pcDNA3 codificante l’alfa1 selvatica) tra i siti NotI e Bam HI, risultante in vettori che esprimono il mutante selvatico, catalitico o il mutante di delezione delle proteine alfa1 marcate con l’epitopo FLAG al C-terminale.

I costrutti, che esprimono le maggiori regioni citoplasmatiche della subunità alfa1 di Na<+>,K<+>-ATPasi di ratto come proteina di fusione con glutatione-S-trasferasi (GST) nel vettore procariota pGEX1T sono un dono da P. Devarajan (Devarajan, P, e al.1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2965). Il costrutto codificante una Ig a singola catena marcata con peptide SV5 (Sc-VHD16-SV5), nel vettore eucariota pcDNA3, fu un gentile dono da O. Burrone (Sepulveda, J., e al. 2003. J. Mol. Biol.

333, 355).

Anticorpo policlonale contro HSV-TK fu acquistato da William C. Summers Laboratory (Università di Yale, USA); l’anticorpo monoclonale contro tubulina proviene da Sigma; l’anticorpo monoclonale contro il peptide SV5 fu un gentile dono dal Prof. Oscar Burrone (ICGEB, Trieste, Italia); l’anticorpo monoclonale contro Tat di HIV-1 (5A5.3) fu ottenuto attraverso l’AIDS Research e Reference Reagent Program (Divisione di AIDS, NIAID, NIH dal Dr. Jon Karn); l’anticorpo monoclonale contro la subunità Na<+>,K<+>-ATPasi fu ottenuto da Upstate (Lake Placid, NY); l’anticorpo monoclonale contro GM-130 fu ottenuto da Transduction Laboratories (Lexington, KY); l’anticorpo monoclonale anti-FLAG e anti-FLAG coniugato con agarosio furono ottenuti da Sigma; anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) per western blotting ottenuti furono da Santa Cruz Biotechnology e anticorpi secondari accoppiati con Alexa 488 usati per microscopia confocale furono acquistati da Molecular Probes Inc. (Eugene, O). Il cocktail di inibitori di proteasi fu ottenuto da Roche (Strasburgo, France). Tutti gli altri reagenti furono ottenuti da Sigma tranne specificato altrove.

Per immunoprecipitazione, i bottoni cellulari furono lisati in tampone NHEN contenente inibitori della proteasi (Roche). La concentrazione della proteina negli estratti fu determinata con il saggio di Bradford (BioRad). Anticorpi anti-TK e antialfa1 furono incubati per una notte a 4°C con estratti cellulari (2-3 mg). Dopo l’incubazione, sfere proteina-A Trisacryl (Pierce Technologies Inc., Rockfors, IL) furono usate per legare gli immunocomplessi, secondo le istruzioni del fabbricante. Dopo incubazione, le sfere furono lavate 5 volte con tampone NHEN, poi preparate per l’SDS-PAGE e western blotting usando gli opportuni anticorpi.

Sfere anti-FLAG M2-Agarosio (Sigma) furono incubate per una notte a 4°C con estratti cellulari (2,5–4,5 mg). Dopo incubazione, gli immunocomplessi furono analizzati con western blotting usando opportuni anticorpi.

ESEMPIO 2

Interazione di Tat con la subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi cellulare à ̈ cruciale per la secrezione di Tat e transattivazione trans cellulare di Tat

Dal momento che alfa1 di ratto lega Tat in una maniera insensibile all’ouabaina, i presenti inventori si sono chiesti se la sua sovraespressione possa recuperare l’inibizione che l’ouabaina impone sulla secrezione delle proteine di fusione con Tat nelle cellule umane. Per accertare questa possibilità, cellule HEK293T furono trasfettate con Tat86-TK o Tat11-TK, assieme alla subunità alfa1 di ratto. Infatti, la sovraespressione di questa proteina ripristinava rilascio cellulare delle proteine Tat in cellule trattate con ouabaina. Di nota, il mutante alfa1 716N fu ugualmente efficace come la proteina selvatica nel recuperare l’inibizione da parte della ouabaina, indicando ancora che l’effetto di alfa1 sul rilascio di Tat à ̈ indipendente dalla sua attività enzimatica. La secrezione dello ScVH16-SV5 rimase incondizionata da qualsiasi alto trattamento. Risultati sovrapponibili furono anche ottenuti quando nello studiare il rilascio di Tat86-TK esattamente nelle stesse condizioni sperimentali.

I presenti inventori vollero anche verificare se la marcata inibizione che l’ouabaina esercita sul rilascio delle proteine di fusione con Tat impedisce anche le proprietà di transattivazione transcellulare della Tat selvatica. Per questo scopo, i presenti inventori hanno trasfettato in modo transiente cellule HEK293T con un vettore di espressione per la forma di Tat a 86 aa (Tat86); 24 h dopo trasfezione, le cellule furono lasciate non trattate o trattate con ouabaina 25 mM per 4 h, e le cellule risultanti condizionate con i mezzi furono raccolte e aggiunte a cellule HL3T1 umane, una linea cellulare derivata da cellule HeLa recanti un costrutto silente LTR-CAT di HIV-1. Mezzo condizionato da cellule esprimenti trascrizione LTR attivata con Tat86 nella linea cellulare reporter, come stabilito dalla quantificazione CAT, mentre il trattamento con ouabaina abrogava completamente tale effetto; non fu osservata alcuna diminuzione dell’attività CAT nella linea cellulare reporter dopo trattamento con ouabaina quando le cellule esprimenti Tat86 furono cotrasfettate con un vettore codificante alfa1 di ratto, o di tipo selvatico cataliticamente inattivo.

Collettivamente, i risultati finora descritti sono consistenti con le conclusioni che il dominio basico di Tat specificamente riconosce la subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi e che questa interazione, piuttosto che l’attività catalitica dell’enzima, à ̈ essenziale a mediare il rilascio di attivo Tat o delle proteine di fusione con Tat nell’ambiente extracellulare.

METODI

Cellule HEK 293T o CHO UN-745 furono inseminate su piastre 6 cm (1x10<6>) un giorno prima della trasfezione; le cellule furono trasfettate in modo transiente o con Tat11-TK, Tat86-TK o costrutti TK e con il costrutto Sc-VHD16-SV5 come controllo positivo di secrezione classica. I complessi calcio-fosfato-DNA furono incubati per 12 ore, poi il mezzo fu rimpiazzato con DMEM fresco, e le cellule furono incubate per altre 24 ore. I saggi di secrezione furono eseguiti lavando le cellule (3 lavaggi di 10 min ciascuno) con Optimem contenente 20 µg/ml di eparina per prevenire il legame della proteina Tat secreta ai proteoglicani eparan solfato extracellulari dopo trasfezione (Tyagi, M, e al. 2001. J. Biol. Chem. 276, 3254), e incubando le cellule con 2 ml di Optimem più eparina per le volte indicate. Dopo l’incubazione, i surnatanti delle cellulari colture furono raccolti e concentrati usando un concentratore Amicon Ultra 10 (Millipore) secondo le istruzioni del fabbricante; la frazione concentrata fu poi preparata per il western blotting. Come controllo della proteina di espressione, la frazione cellulare fu raccolta, lisati in tampone NHEN (20 mM Hepes pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5% NP-40, 20% glicerolo, 1 mM EDTA) contenente inibitori della proteasi (Roche). La concentrazione totale della proteina fu stabilita con il saggio di Bradford (BioRad), e 30 µg di ciascun campione fu preparato per Western Blotting.

CHO K1 e PsgA-745 (Rostand, KS, e al. 1997. Infect. Immun. 65, 1) furono ottenute dall’American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) e mantenuto in mezzo di Ham F12 modificato da Kaighn. Cellule HEK 293T e U2OS (ottenute dall’ATCC) e HL3T1 (derivate da Cellule HeLa stabilmente trasfettate con una cassetta LTR-CAT silente), un gentile dono di B. Felber (Felber, BK, e al.

1988. Science 239, 184), furono mantenute in DMEM. Tutti i mezzi di coltura furono supplementati con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, e 50 µg/ml gentamicina.

Cellule U2OS (5×10<4>) furono inseminate su vetrini a camera di vetro a quattro pozzetti (LabTek II-Nalge Nunc) e trasfettate con il kit di trasfezione Polyfect (Qiagen) per 24 h; in tutte le trasfezioni, un’adeguata quantità di vettore pcDNA3 vuoto fu aggiunta per raggiungere una simile quantità di DNA. Cellule HEK 293T furono trasfettate usando precipitazione standard con calcio fosfato (Sambrook, J., e al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual/II Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), incubate per 36 h, e poi preparate per gli esperimenti di secrezione o coimmunoprecipitazione.

Per provare l’attività biologica della proteina Tat secreta, cellule HEK 293T furono trasfettato con un costrutto pcDNA3 che esprime Tat86 e un pcDNA3 che esprime o alfa1 selvatica o uno dei mutanti deleti; dopo 24 h di incubazione, le cellule furono lavate e il mezzo sostituito con mezzo fresco più eparina 20 µg/ml e, per gli esperimenti di inibizione di secrezione, aggiunto di 25 µM ouabaina. Dopo 4 h, il surnatante fu raccolto e aggiunto a cellule HL3T1, contenenti un gene batterico integrato cloramfenicolo-acetiltrasferasi (CAT) sotto il controllo dell’LTR di HIV-1, alla presenza di 100 µM clorochina. Dopo 24 h di incubazione, l’espressione CAT Tat-guidata fu saggiata quantificando i livelli di proteina CAT usando un kit CAT ELISA (Roche Diagnostics, Meylan, France).

Altri reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi dell’Esempio 1.

ESEMPIO 3

La regione basica di Tat lega le anse citoplasmatiche C-terminali della subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi.

I presenti inventori hanno voluto definire le regioni di Tat e della subunità alfa1 di Na<+>,K<+>-ATPasi coinvolte nell’interazione tra le due proteine. Alfa1 à ̈ una grande proteina di membrana integrale con 10 domini di transmembrana più le regioni citoplasmatiche N- e C-terminali (Lingrel, JB, e al. 1994. Kidney Int. Suppl. 44, S32; Morth, JP, e al. 2007. Nature 450, 1043). I presenti inventori hanno focalizzarono l’attenzione sui domini citoplasmatici della proteina che erano i candidati più probabili per il legame con Tat, come il resto della proteina à ̈ o incorporato nel doppio strato fosfolipidico o protrude nello spazio extracellulare.

Frammenti alfa1 fusi con GST corrispondenti alle tre principali regioni citoplasmatiche (Devarajan, P, e al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U S UN 91, 2965), come pure una fusione dei tre domini citoplasmatici C-terminali corti della subunità alfa1 di ratto, denominati P1-P2-P3, furono usati in esperimenti “GST-pull down†usando in vitro Tat tradotta marcata [35S], o un mutante [35S]- Tat - mutato Tat86(R5A, in cui il residuo di arginina del peptide Tat11 era stato rimpiazzato da alanine (Demarchi, F, e al.1996. J. Virol..70, 4427). La Tat marcata non si legava a nessuna delle grandi anse citoplasmatiche della alfa1 di Na<+>,K<+>-ATPasi; per contro, mostrava un forte legame con la proteina P1-P2-P3, corrispondente alla fusione delle tre anse corte, C-terminali. Il mutante Tat86(R5A) non riusciva a interagire con qualsiasi delle regioni di alfa1.

A ulteriore caratterizzazione della regione di legame tra Tat e il C-terminale della subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi, i presenti inventori hanno analizzato in vitro il legame di Tat con tre peptidi sintetici della presente invenzione, corrispondenti alle tre sequenze citoplasmatiche corte (residui 824-843, 939-951 e 1007-1023, denominati rispettivamente P1, P2 e P3) nel dominio C-terminale della proteina alfa1. Per verificare il legame, i peptidi sintetici biotinilati furono accoppiati a sfere di streptavidina, e successivi saggi “pull down†furono eseguiti impiegando Tat radiomarcata, tradotta in vitro.

Dopo incubazione e abbondanti lavaggi, la proteina Tat mostrava un marcato legame alle sfere rivestito con uno qualsiasi dei tre peptidi, in particolare con il peptide P2, tuttavia non legava con sfere non accoppiate o sfere rivestite con uno scarso peptide biotinilato (Figura 2A). Il mutante Tat86(R5A) non mostrava legame con nessuno dei tre peptidi.

Da notare, la sequenza amminoacidica delle tre anse intracitoplasmatiche C-terminali della subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi sembra molto conservata, con una perfetta omologia tra le sequenze alfa1 di ratto, uomo e maiale, la cui struttura cristallina fu risolta di recente (Morth, JP, e al. 2007. Nature 450, 1043).

METODI

Il ΔCTERM di alfa1 manca del frammento che si estende tra gli amminoacidi 784-3040 (comprendente gli ultimi due frammenti citoplasmatici C-terminali come pure una regione transmembrana tra loro); l’innesco inferiore fu progettate per contenere una mutazione nonsenso (ad esempio un codone di stop) alla posizione amminoacidica 784 (corrispondente al nucleotide 2352) e il sito di restrizione per NotI. Il cds troncato di alfa1 di ratto fu amplifcato dal vettore pcDNA3-alfa1 con questi inneschi e un innesco superiore, contenente un sito HindIII. Il mutante di delezione di alfa1 fu clonato in vettore pcDNA3 tra i siti HindIII e NotI.

Il segmento di DNA codificante per la fusione dei tre tratti citoplasmatici C-terminali della subunità alfa1, legati da un residuo di glicina (P1-P2-P3), fu ottenuto dall’accoppiamento di due lunghi oligodeossinucleotidi:

5'-TATGAGCAGGCTGAGAGTGACATCATGAAGAGACAGCCCAGAAATCCCAA AACAGACAAAGGTACCAGGAGGAATTCGGTCTTCCAGCA-3' e

5'-ATAGTAGGTTTCCTTCTCCACCCAGCCGCCAGGGCGTCGCCTGATGATGA

GACCGTTCTTCATCCCCTGCTGGAAGACCGAATTCCTCC-3'

codificanti le sequenze amminoacidiche 824-843, 939-951 e 1007-1023 della subunità alfa1, seguite da PCR amplificazione dei frammenti usando inneschi esterni contenenti opportuni siti di restrizione per il clonaggio. In particolare, il segmento di DNA codificante per P1-P2-P3 fu poi clonato nel vettore pFLAG-CMV2, tra i siti NotI e EcoRI, ottenendo il costrutto PFLAG-P1-P2-P3, e nel vettore pGEX-2T, tra i siti HindIII e Eco RI, ottenendo il costrutto pGEX-P1-P2-P3.

Le proteine di fusione ricombinante corrispondenti a GST-Tat, GST, le porzioni citoplasmatiche 1, 2 e 3 di alfa1 (rispettivamente GST-P1, -P2, -P3), e la proteina di fusione GST-P1-P2-P3 furono prodotte e purificate da batteri BL21 trasformati con i corrispondenti vettori. Le colture batteriche furono cresciute in “terrific broth†più ampicillina e la produzione della proteina fu indotta con IPTG 0,5 mM per 3 h at 30°C fino a un OD600tra 0,6 e 0,8. I batteri furono poi risospesi in tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 5% glicerolo, 2 mM ditiotreitolo) e sonicati con 4 impulsi di 30 secondi ciascuno. I lisati batterici furono mescolati con una sospensione al 50% (vol/vol) di sfere di agarosio reticolato con glutatione e le proteine di fusione- GST furono lasciate legare le sfere at 4°C su una ruota ruotante per 1 h. La sospensione fu caricata su una colonna di plastica vuota (BioRad, Richmond, CA), lasciando percolare le proteine non legate, e le sfere furono lavate con 400 volumi di letto di tampone di lisi. Le proteine di fusione legate alle sfere GST agarosio furono poi risospese in un’adeguata quantità di tampone di lisi e tenute a -80°C prima dell’uso. L’integrità e purezza delle proteine furono stabilite con elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) seguita da colorazione Coomassie.

Il pcDNA3-Tat86 e il pcDNA3-Tat86(R5A) (Tat86 mutante nella regione basica) furono usati come stampi per produrre le proteine<35>S-marcata Tat86 e Tat86(R5A) per il legame in vitro usando il TNT Reticulocyte Lysate System (Promega, Madison, WI).

Il legame dei frammenti di alfa1 fusa a GST a<35>S-Tat86 e<35>S-Tat86(R5A) fu eseguito come segue. Brevemente, 1 µg di proteine ricombinanti, dopo pretrattamento in una soluzione contenente DNasi I 0,25 U/µl e RNasi 0,2 µg/µl per rimuovere gli acidi nucleici batterici contaminanti, fu incubati con 600 c.p.m. di Tat tradotta in vitro in una soluzione contenente 0,2 mg/ml di etidio bromuro. Dopo abbondanti lavaggi, la miscela di reazione fu risolta con elettroforesi SDS–PAGE e analizzata con PhosphoImager.

I peptidi sintetici corrispondenti ai residui 824-843, 939-951 e 1007-1023 di alfa1 C-terminale (rispettivamente P1, P2 e P3) furono ottenuti dalla Peptide Synthesis Facility all’ICGEB di Trieste. I peptidi furono sintetizzati su fase solida (NovaSyn TGT precaricata, Novabiochem) con chimica Fmoc/t-Bu usando un sintetizzatore automatico autocostruito basato su un sistema Gilson Aspec XL SPE. Le peptideresine furono scisse/deprotette usando una miscela Reagent H modificata (acido trifluoroacetico 80%, fenolo 3%, tioanisolo 3%, 3,6-diossa-1,8-ottaneditiolo 8%, acqua 2,5%, metiletilsolfuro 2%, acido iodidrico 1,5% p/p) per 3 h. I peptidi furono poi precipitati da dietil etere, lavati e liofilizzati. I peptidi grezzi furono purificati con RP-HPLC preparativa su una colonna 25x300 mm (Load&Lock system, Varian) impaccata con resina VariTide RPC (Polymer Laboratories - Varian) usando un gradiente da 0,1% TFA in acqua a 0,1% TFA in acetonitrile. Le frazioni purificate furono controllate con ESI-MS, raccolte e liofilizzate.

Per tutti i tre peptidi, le forme N-biotinilata, N-fluoresceinata e non-coniugata furono sintetizzate.

I peptidi sintetici biotinilati, corrispondenti a P1, P2 e P3, furono usati per saggi di legame come segue: 25 µl di resina streptavidina (sfere di streptavidina UltraLink Plus, Pierce), furono pretrattati con 3 mg di BSA per 10 min a temperatura ambiente, e successivamente incubati con 50 µg di peptide a 22°C per 1 h; dopo 3 lavaggi, le sfere furono rivestite di peptide furono incubate con 600 c.p.m. di Tat tradotta in vitro come precedentemente descritto, o con 250 ng di GST-Tat ricombinante, per 2 h at 4°C. Dopo abbondanti lavaggi, la miscela di reazione fu risolta con elettroforesi SDS–PAGE e analizzata con PhosphoImager, o blotted e analizzata con analisi western usando un anticorpo anti-GST.

Altri reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi negli Esempi 1 e 2.

ESEMPIO 4

Una proteina di fusione corrispondente alle anse C-terminali di alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi (proteina P1-P2-P3) lega Tat e impedisce la transattivazione

A prova del legame in vivo di Tat alle tre anse citoplasmatiche C-terminali corte della subunità alfa1 di Na<+>,K<+>-ATPasi, fu ottenuto un plasmide con vettore di espressione, codificante per la proteina di fusione P1-P2-P3, corrispondente alle anse C-terminali di alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi legato da un residuo di glicina, sotto il controllo del promotore CMV costitutivo. Il plasmide codificante per P1-P2-P3 fu coespresso in cellule HEK293T assieme a o Tat86-TK o Tat11-TK, e i lisati furono usati in esperimenti di coimmunoprecipitazione. Il Western blot usando un anticorpo anti-TK ha mostrato l’interazione tra la proteina di fusione tripartita e le versioni di Tat 86- e 11-aa, ma non con il controllo TK.

Dal momento che questi esperimenti di coimmunoprecipitazione hanno indicato che la proteina di fusione P1-P2-P3, una volta espressa in modo intracellulare, era in grado di legare la regione basica di Tat, i presenti inventori si sono chiesti se la sovraespressione di questa proteina poteva anche influenzare la trans attivazione di Tat. A prova di questa possibilità, cellule HeLa esprimenti un gene della luciferasi guidato da LTR furono trasfettate con diverse quantità sia di un plasmide che esprime Tat (1, 5 e 25 ng) sia di un plasmide che esprime la proteina P1-P2-P3 (300, 600 ng). Questi risultati hanno rivelato che, a qualsiasi delle tre concentrazioni del plasmide Tat, la coespressione della dose maggiore del plasmide P1-P2-P3 inibiva significativamente l’attivazione trascrizionale del costrutto LTR-reporter. La vitalità cellulare non fu influenzata dalla trasfezione di P1-P2-P3 alla concentrazione più elevata.

Questi risultati supportano la conclusione generale che il legame tra Tat e la P1-P2-P3 proteina tripartita avviene dentro la cellula, ed à ̈ consistente con la possibilità che la sovraespressione della proteina di fusione devi Tat dalla sua funzione di transattivazione al promotore LTR di HIV-1, agendo così come un inibitore competitivo.

METODI

Saggi della luciferasi furono eseguiti usando un costrutto contenente le sequenze U3 e R dell’LTR di HIV-1 (o un promotore CMV nei controlli negativi) a monte del gene della luciferasi di lucciola come reporter, e pcDNA3-Tat86 come un effettore, alla presenza di diverse quantità del costrutto P1-P2-P3 marcato FLAG (vedi sopra). Il plasmide pCI-Neo-Renilla (Promega) esprimente il gene della luciferasi di renilla sotto il controllo del promotore CMV fu co-trasfettato nella cellula per standardizzare l’efficienza di trasfezione in ciascun punto sperimentale.

Cellule HeLa furono trasfettate usando Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen, secondo il protocollo del fabbricante), con 150 ng di pLTR-luciferasi o CMV-luciferasi, 10 ng di pCI-Neo-Renilla, 1, 5 o 25 ng di pcDNA3-Tat86 e 300 o 600 ng di plasmide codificante P1-P2-P3. La quantità totale di DNA trasfettato fu normalizzata secondo un plasmide pcDNA3.

Le cellule furono lisate e raccolte 48 h post-trasfezione. I reagenti per i saggi dual luciferase furono acquistati da PJK GmbH, Germania; la luminescenza fu misurata usando un Perkin Elmer EnVision 2104 Multilabel Reader, con un tempo di integrazione di 10 sec.

Le attività misurate furono standardizzate con i livelli di renilla; come controllo dell’attività basale di LTR-luciferasi, con o senza FLAG-P1-P2-P3, esperimenti simulati furono inclusi dove l’effettore non fu trasfettato.

Altri reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi degli Esempi 1-3.

ESEMPIO 5

I peptidi sintetici corrispondente alle anse C-terminali della alfa1 di Na<+>,K<+>-ATPasi bloccano l’esportazione di Tat

L’osservazione che la proteina di fusione P1-P2-P3 era in grado di diminuire la trans attivazione di Tat, sebbene a un elevato rapporto molare verso Tat, ha spinto i presenti inventori a chiedersi quale potesse essere l’effetto dei peptidi corti corrispondenti alle anse C-terminale di alfa1 sul rilascio extracellulare di Tat. A differenza della proteina P1-P2-P3 espressa per via endogena, i peptidi possono essere somministrati per via esogena ad elevate concentrazioni e il loro legame a Tat nonn dovrebbe essere sottoposto a possibili restrizioni strutturali imposte dalla loro fusione nel costrutto P1-P2-P3. In aggiunta, i nostri dati di legame in vitro mostrano che qualsiasi delle tre anse intracitoplasmatiche C-terminali della subunità alfa1 potevano indipendentemente legare Tat.

I presenti inventori hanno provato gli effetti del trattamento di cellule con i singoli peptidi o con Pmix sul rilascio di Tat. Le cellule furono trasfettate con Tat11-TK assieme all’anticorpo a catena singola ScVH16-SV5 e trattate con 5 o 10 µg/ml dei Peptidi P1, P2 e P3. Il trattamento delle cellule con qualsiasi dei tre peptidi, alla concentrazione maggiore, ha mostrato una marcata inibizione del rilascio extracellulare della proteina di fusione con Tat, mentre lasciava la secrezione dell’anticorpo di controllo scFv indisturbata; fu osservato un blocco quasi completo quando fu usata Pmix alla concentrazione inferiore. Sulla base di questi risultati, i presenti inventori hanno provato gli effetti di una Pmix con un più ampio intervallo di concentrazione (da 2 a 15 µg/ml) sulla secrezione di Tat86-TK. Il trattamento di cellule con Pmix inibiva il rilascio extracellulare di Tat in una maniera dipendente dalla dose, mentre la secrezione canonica di ScVH16-SV5 rimaneva inalterata. Da notare che la trasfezione della proteina di fusione tripartita P1-P2-P3 era inefficace in questo saggio, il che à ̈ coerente con la possibilità che l’affinità di questa proteina per il dominio basico di Tat possa essere inferiore di quella dei singoli peptidi.

METODI

Tutti i reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi degli Esempi 1-4.

ESEMPIO 6

Peptidi sintetici corrispondenti alle anse C-terminali di alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi bloccano la replicazione di HIV-1

In seguito, i presenti inventori si sono chiesti se la somministrazione esogena dei peptidi Pmix potesse influenzare l’infezione da HIV-1. Una prima serie di esperimenti fu eseguita con un saggio di infezione a singolo ciclo in cellule HOS CCR5 usando un virus HIV-1-NL4-Luc recante l’involucro M-tropic Bal. Quando le cellule furono preincubate con Pmix, tuttavia non con un peptide FLAG di controllo (10 µg/ml ciascuno), prima dell’infezione virale fu osservata una significativa diminuzione dell’attività luciferasi, misurata 24 h post-infezione.

In un successivo esperimento, i presenti inventori vollero analizzare l’effetto dei peptidi Pmix e FLAG (controllo) sull’infezione di cellule CEM T CD4+ con HIV-1BRUselvatico. Nel corso di 12 giorni dopo infezione, metà del mezzo cellulare fu rimpiazzata ogni secondo giorno con mezzo fresco contenente uno dei due peptidi a una concentrazione di 10 µg/ml. L’infezione Virale fu monitorata misurando l’attività di trascrittasi inversa nel surnatante della coltura cellulare. Fu trovato che i peptidi Pmix davano una marcata soppressione dell’infezione virale, mentre il peptide di controllo FLAG non aveva alcun effetto rilevante.

Questi risultati collettivamente indicano che la soppressione del rilascio extracellulare di Tat e della funzione di Tat da parte di peptidi derivati dal dominio C-terminale della subunità alfa1 della Na<+>,K<+>-ATPasi impedisce in modo marcato l’infezione da HIV-1.

METODI

Stock del vettore HIV-1BAL-luciferasi furono preparati con il metodo di trasfezione standard calcio-fosfato in cellule HEK293T usando il plasmide pNL4.3-luciferasi (He, J., e al.1995. J. Virol. 69, 4587; Connor, RI, e al.1996. J. Virol.70, 5306) e il plasmide codificante l’involucro M-tropic Bal in un rapporto 3:1. Il surnatante contenente virioni fu raccolto 48 H dopo trasfezione, centrifugato 5 min at 1.500 gpm e filtrato con filtro Millipore da 45 mm. Le cellule furono infettate per 4 h.

Stock dei cloni virali HIV-1BRU(Petit, C, e al. 1999. J. Virol. 73, 5079) furono preparati con il metodo di trasfezione standard calcio-fosfato in cellule HEK293T. Il surnatante contenente i virioni fu raccolto 48 h dopo trasfezione, centrifugato 5 min at 1.500 gpm e filtrato con filtro Millipore da 45 mm. Prima dell’infezione virale gli stock furono trattati con Dnasi I (Invitrogen) 40U/ml per 1 ora a temperatura ambiente. Le cellule furono infettate per 4 h.

Per le infezioni a singolo ciclo, cellule HOS CCR5<+>furono infettate con pNL4.3-luciferasi pseudotipizzato con l’involucro M-tropic Bal. Prima dell’infezione, il virus fu preincubato con una miscela equimolare di peptidi P1, P2 e P3 (Pmix) alla concentrazione di 15 µg/ml, a 37°C per 1 h; le cellule furono incubate son il virus per 4 h, lavate, e fu aggiunto mezzo fresco contenente 15 mg/ml Pmix; dopo 24 ore, le cellule furono raccolte e il livello di espressione di luciferasi fu provato con il kit per il saggio DualGlo Luciferasi (Promega, Madison, WI) secondo le istruzioni del fabbricante. L’attività della luciferasi fu calcolata dopo normalizzazione contro l’attività della luciferasi del cotrasfettato Renella. Per le infezioni con virus selvatico, cellule CEM (0,5x10<6>/ml) furono infettate con HIV-1BRUa un MOI di 0,05, per 4 h; dove indicato, l’infezione fu eseguita alla presenza di 10 µg/ml di Pmix, o di peptide FLAG, come controllo negativo. Dopo infezione, il mezzo contenente il virus fu lavato e sostituito con mezzo fresco, contenente la corrispondente preparazione di peptidi. A t=0 e successivamente ogni 3 giorni fino al 12<°>giorno, i surnatanti furono raccolti e provati, mentre le cellule furono contate, diluite a 0,5x10<6>/ml e furono aggiunti peptidi freschi ai mezzi di coltura. La quantità di virus fu valutata misurando l’attività RT nei surnatanti seguendo protocolli standard, e normalizzando i valori RT sul numero di cellule.

Altri reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi degli Esempi 1-5.

ESEMPIO 7

Peptidi sintetici derivati dalla regione C-terminale della Na<+>K<+>-ATPasi sono internalizzati dalla cellula quando somministrati per via esogena

Per provare l’efficacia dell’internalizzazione intracellulare dei singoli peptidi P1, P2 e P3, questi furono sintetizzati come coniugati a fluoresceina e somministrati a cellule HEK293T alle concentrazioni di 2, 5 o 10 µg/ml. Dopo 4 h, le cellule furono sottoposte a tripsinizzazione prolungata e lavate abbondantemente per rimuovere la fluorescenza extracellulare, e poi analizzate con citometria a flusso. Tutti e tre i peptidi hanno mostrato una notevole capacità, dipendente dalla dose, di internalizzazione cellulare. Da notare che i profili di citometria a flusso mostrano un aumento di fluorescenza nella gran parte delle cellule, indicando che l’internalizzazione di Pmix à ̈ una proprietà generale delle cellule.

METODI

Per l’esperimento di cattura del peptide fluorescente, peptidi sintetici biotinilati, marcati con fluoresceina P1, P2 e P3, o una miscela equimolare dei tre peptidi. denominata Pmix, furono diluiti in Optimem e incubati con cellule per 4 h at 37°C. Le cellule furono poi tripsinizzate, lavate una volta con DMEM e due volte con PBS, e analizzate con citometria a flusso. Per visualizzare la fluorescenza intracellulare, cellule HEK293T furono inseminate su vetrini a camera (chamber slides) trattati con polilisina; dopo 4 h di incubazione con i peptidi fluorescenti, le cellule furono brevemente tripsinizzate, lavate due volte con PBS, fissate con PFA 2%. I vetrini furono analizzati dopo montaggio con mezzo Vectashield. Le immagini fluorescenti furono acquisite usando un microscopio confocale TCS-SL Leica.

Altri reagenti e procedure sono gli stessi come descritto nei Metodi degli Esempi 1-5.

SEQUENCE LISTING

<110> International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology - ICGEB

Scuola Normale Superiore di Pisa

<120> Peptides and their derivatives inhibiting extracellular release of HIV-1 Tat protein and HIV-1 replication

<130> 09143MS

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptide corresponding to region 824-843 of C-terminal domain of the Na+,K+-ATPase alpha sub-unit

<400> 1

Tyr Glu Gln Ala Glu Ser Asp Ile Met Lys Arg Gln Pro Arg Asn Pro 1 5 10 15

Lys Thr Asp Lys

20

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptide corresponding to region 939-951 of C-terminal domain of the Na+,K+-ATPase alpha sub-unit

<400> 2

Thr Arg Arg Asn Ser Val Phe Gln Gln Gly Met Lys Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptide corresponding to region 1007-1023 of C-terminal domain of the Na+,K+-ATPase alpha sub-unit

<400> 3

Leu Ile Ile Arg Arg Arg Pro Gly Gly Trp Val Glu Lys Glu Thr Tyr 1 5 10 15

Tyr

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Proteina comprendente un singolo o una combinazione di tre tratti peptidici intracitoplasmatici del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, detti tratti peptidici tutti leganti la proteina Tat di HIV-1.
2. 2. Proteina secondo la rivendicazione 1, avente la sequenza NH2-YEQAESDIMKRQPRNPKTDK-(X)n-TRRNSVFQQGMKN-(X)n-LIIRRRPGGWVEKETYY-COOH, dove (X)nà ̈ un tratto peptidico di qualsiasi lunghezza (n) composto di qualsiasi amminoacido (X), con n che varia da 0 a 1.000.
3. 3. DNA codificante per proteina della rivendicazione 2, in particolare un DNA avente la sequenza 5'-TATGAGCAGGCTGAGAGTGACATCATGAAGAGACAGCCCAGAAATCCCAAAACAGACAAA-(Y)m-ACCAGGAGGAATTCGGTCTTCCAGCAGGGGATGAAGAAC-(Y)m- CTCATCATCAGGCGACGCCCTGGCGGCTGGGTGGAGAAGGAAACCTACTAT-3', dove (Y)mà ̈ una sequenza DNA di qualsiasi lunghezza (m) composto da qualsiasi codificante per una tripletta nucleotidica (Y) di amminoacido con n che varia da 0 a 3.000.
4. 4. Peptide, o un suo derivato, corrispondente ad uno dei tre tratti peptidici intracitoplasmatici del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi, detti tratti peptidici tutti leganti la proteina Tat di HIV-1.
5. 5. Peptide o un suo derivato secondo la rivendicazione 4, corrispondente a una regione del dominio C-terminale della subunità alfa della Na<+>,K<+>-ATPasi umana, detta regione scelta dal gruppo che consiste di: regione 824-843, regione 939-951 e regione 1007-1023.
6. 6. Peptide o un suo derivato secondo la rivendicazione 5, scelto dal gruppo che consiste di: NH2-YEQAESDIMKRQPRNPKTDK-COOH (SEQ ID: 1) NH2-TRRNSVFQQGMKN-COOH (SEQ ID: 2) NH2-LIIRRRPGGWVEKETYY-COOH (SEQ ID: 3)
7. 7. Vettore di espressione di mammifero che esprime la proteina delle rivendicazioni 1 o 2.
8. 8. Proteina della rivendicazione 1 o 2 per uso nell’inibizione della transattivazione della proteina Tat di HIV-1.
9. 9. Proteina della rivendicazione 1 o 2 e/o DNA della rivendicazione 3 e/o peptide o un suo derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 e/o vettore della rivendicazione 7 per uso nell’inibizione della replicazione di HIV-1.
10. 10. Proteina della rivendicazione 1 o 2 e/o DNA della rivendicazione 3 e/o peptide o un suo derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 e/o vettore della rivendicazione 7 per uso nel trattamento di infezione da HIV-1.
11. 11. Proteina della rivendicazione 1 o 2 e/o DNA della rivendicazione 3 e/o peptide o un suo derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 e/o vettore della rivendicazione 7 per uso nel trattamento di malattie associate a HIV-1.
12. 12. Proteina della rivendicazione 1 o 2 e/o DNA della rivendicazione 3 e/o peptide o un suo derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 e/o vettore della rivendicazione 7 per uso come medicamento.
13. 13. Composizione farmaceutica comprendente la proteina della rivendicazione 1 o 2 e/o il DNA della rivendicazione 3 e/o un peptide o un suo derivato di una qualsiasi delle rivendicazioni 4-6 e/o il vettore della rivendicazione 7.