ITRM20090073A1 - Procedimento di preparazione di scaffold polimerici preangiogenizzati. - Google Patents

Description

<Procedimento di preparazione di scaffold polimerici preangiogenizzati>

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda scaffold pre-angiogenizzati in grado di guidare correttamente la rigenerazione del tessuto, ossia di scaffold polimerici tridimensionali che incorporano in maniera integrata, da un lato, delle strutture tubolari (simili a vasi sanguigni) per garantire l’apporto di nutrienti e la rimozione dei metaboliti di scarto e, dall’altro, delle strutture atte al rilascio controllato di fattori angiogenici, in modo da guidare in maniera efficace la crescita e la differenziazione cellulare al fine di ottenere la rigenerazione del tessuto.

Stato della Tecnica

Il successo di uno scaffold dopo l’impianto in vivo dipende dalla combinazione di una serie di processi assai complessi. Inizialmente, subito dopo l’impianto, ha luogo una risposta infiammatoria acuta, seguita da processi di riparazione che determinano la guarigione della ferita. Allo stesso tempo deve aver luogo anche la crescita delle cellule all’interno dello scaffold e una rapida neo-vascolarizzazione dell’insieme biomateriale - tessuto in rigenerazione. Infatti, un tessuto ingegnerizzato complesso richiede una rete vascolare di tipo gerarchico che induca una perfusione rapida e stabile dell’impianto. Pertanto, un impianto chirurgico di scaffold privi di vascolarizzazione o con una vascolarizzazione lenta od incompleta determina un apporto insufficiente di ossigeno e di altri nutrienti al tessuto in crescita, con conseguente ipossia e morte cellulare [1]. Inoltre, molte indicazioni recenti segnalano che la penetrazione dei vasi in un tessuto consente il trasporto sia di molecole che di cellule, che concorrono a regolare la guarigione della ferita e quindi la sopravvivenza del tessuto. Tipicamente, i vasi principali possono essere costruiti usando i classici approcci dell’ingegneria tissutale, attraverso la costruzione di tubi multistrato basati su materiali sintetici e biologici. L’Heureux [2] ed altri hanno preparato dei vasi sanguigni ingegnerizzati di 4.6 mm di diametro a partire da fogli coesivi di cellule muscolari lisce. In un altro lavoro, Chrobak ed altri [3] hanno ottenuto dei vasi sanguigni a partire da cellule endoteliali cresciute sulla superficie interna di un tubo di collagene.

Nell’ultimo decennio, l’attenzione si à ̈ concentrata su un concetto alternativo chiamato “prevascolarizzazione†, che consiste nel promuovere la formazione di una rete vascolare all’interno di un tessuto ingegnerizzato, prima dell’impianto. Importanti passi in avanti sono stati ottenuti per migliorare la performance dei materiali nell’indurre la crescita vascolare (angiogenesi). Tali approcci sono basati sull’inclusione di fattori angiogenici solubili nella matrice o nell’ingegnerizzazione di matrici bioattive.

Comunque, tali tentativi sono in parte limitati dalla lenta infiltrazione delle cellule endoteliali, dal rilascio relativamente veloce e dalla instabilità biologica dei fattori angiogenici [4]. Un altro approccio à ̈ quello di combinare vari tipi cellulari (co-culture), consentendo così l’auto assemblaggio di una struttura di tipo capillare. Unger ed altri [5] hanno mostrato che le cellule endoteliali microvascolari del derma (HDMEC), quando inseminate con osteoblasti umani, sono capaci di formare in vitro delle strutture microcapillari contenenti un lume.

In letteratura non risultano esempi di dispositivi ove scaffold tubolari a porosità controllata (che consentono apporto di nutrienti e rimozione di metaboliti) sono inseriti all’interno di uno scaffold “principale†, anch’esso a porosità controllata, simile a quello normalmente proposto per la rigenerazione dei tessuti [6-8]. Il tipo di dispositivo che qui si propone consente di stimolare la formazione di vasi secondari (e capillari) mentre si promuove la rigenerazione del tessuto.

Nello stato della tecnica restava aperto il problema di apportare i nutrienti e rimuovere i metaboliti di scarto all’interno dei supporti per la rigenerazione (scaffolds).

Oggetto dell'invenzione

E' stato ora sorprendentemente trovato che l'inserimento e l'integrazione di strutture tubolari (che consentono apporto di nutrienti e rimozione di metaboliti) all’interno di una schiuma (una sorta di scaffold “principale†, simile a quello normalmente proposto per la rigenerazione dei tessuti) consentono di garantire una prevascolarizzazione in vitro dello scaffold prima del suo impianto.

Formano oggetto della presente invenzione il procedimento di produzione degli scaffold polimerici descritto nella rivendicazione 1 e nelle rivendicazioni successive e gli scaffold ottenibili da detto procedimento.

Tra i principali vantaggi dell'invenzione à ̈ da menzionare la possibilità dell'applicazione della tecnica rigenerativa mediante scaffold a tessuti fortemente vascolarizzati (ad es. derma), mentre quanto già esistente in letteratura fa riferimento a tessuti scarsamente irrorati da vasi sanguigni (cartilagine, epidermide)

Breve descrizione delle figure

Alla presente descrizione sono allegate cinque figure che mostrano:

la figura 1 una schiuma porosa biodegradabile con una rete di pori grandi (a sinistra) e piccoli (a destra);

la figura 2 una struttura tubolare ottenibile secondo la presente invenzione: basso ingrandimento (a sinistra) ed alto ingrandimento (a destra);

la figura 3 uno scaffold ottenibile secondo la presente invenzione con all’interno delle strutture tubolari ben integrate;

la figura 4 un diagramma di protocollo termico per la preparazione delle schiume in cui td à ̈ il tempo di smiscelazione; A à ̈ lo stadio di raffreddamento dalla temperatura di mantenimento (nel caso specifico 60°C) alla temperatura di miscelazione (Td); B indica il raffreddamento (quench) della soluzione dalla temperatura di miscelazione alla temperatura di congelamento (-20°C in questo caso) e

la figura 5 uno scaffold preangiogenizzato con coculture: cellule endoteliali all’interno dei tubicini e fibroblasti all’esterno: a sinistra: micrografia SEM; a destra: microscopia confocale.

Il protocollo per la preparazione degli scaffold proposto nella presente invenzione à ̈ basato sul processo di separazione di fase a partire da soluzioni ternarie solvente/non-solvente/polimero in condizioni controllate. La struttura ottenuta sotto forma di schiuma presenta pori grandi interconnessi (diametro medio > 20 µm) e pori molto più piccoli tra le pareti dei primi (diametro medio 0,5 - 3 µm).

Questi ultimi possono essere impiegati come dispositivi a rilascio controllato (cioà ̈ come una sorta di “serbatoi†) per fattori di crescita e differenziamento (vedi fig.

1). L’ottimizzazione della struttura à ̈ basata sul bilanciamento del tempo speso dalla soluzione nella regione metastabile rispetto al tempo speso nella regione instabile (spinodale). È evidente che il tempo trascorso dal sistema nella regione metastabile (prima di entrare nella regione instabile) à ̈ responsabile della generazione e crescita di un numero limitato di nuclei stabili, che successivamente tenderanno a coalescere parzialmente nello stadio successivo, quando ha luogo la decomposizione spinodale [9-11].

La temperatura alla quale fare avvenire la smiscelazione viene determinata dalla curva di “cloud-point†del sistema polimero/non-solvente/solvente e va fissata a 5±3°C al di sotto del “cloud-point†. Il tempo di smiscelazione, tipicamente compreso fra 10 minuti e 60 minuti, si determina con pochissime prove sperimentali e serve per controllare le dimensioni medie dei pori, che possono variare dipendentemente dal tessuto da rigenerare.

In secondo luogo, la presente invenzione ha come obiettivo anche quello di inserire ed integrare all’interno dello scaffold delle strutture tubolari polimeriche simili a vasi sanguigni (vedi fig.3), nelle quali cellule endoteliali opportunamente coltivate generano un tessuto endoteliale necessario ad un corretto scambio di nutrienti quando lo scaffold verrà impiantato “in vivo†e connesso, attraverso i vasi artificiali, al sistema circolatorio dell’organismo ospite (vedi fig. 5). Queste strutture che emulano i vasi sanguigni devono essere caratterizzate da pori intercomunicanti più piccoli (diametro medio minore di 5 µm, preferibilmente minore di 3 µm), attraverso i quali le cellule endoteliali non devono fuoriuscire. Tali pori devono consentire un efficiente trasferimento di nutrienti e metaboliti e quindi la struttura tubolare deve presentare un basso spessore (minore di 100 µm) ed una elevata porosità, tipicamente una porosità totale maggiore del 50%, espressa come volume di vuoto / volume totale. Inoltre la struttura tubolare deve presentare una bassa permeabilità idraulica, in modo da renderla adatta al flusso sanguigno, ed una resistenza meccanica iniziale adeguata sia per resistere alla pressione sanguigna che per rendere agevole la connessione chirurgica con i vasi dell’ospite (indicativamente lo spessore deve essere dunque maggiore di 20 µm). Quanto già esistente in letteratura fa riferimento a tessuti scarsamente irrorati da vasi sanguigni (cartilagine, epidermide).

La presente invenzione trova applicazione in campo biomedico per la rigenerazione di tessuti vascolarizzati (derma, tessuto osseo etc.)

Esempio di produzione dello scaffold

Un filo polimerico (Polietilene, Polipropilene, Poliammide etc.) di diametro 0,5 - 2,0 mm à ̈ stato estratto a velocità costante (5,0 - 25,0 mm/min), da un bagno di una soluzione binaria omogenea di PLLA e diossano (8,0 ± 3,0% peso/peso), mantenuta a temperatura controllata (fissata a 50 - 70°C). Il filo rivestito per immersione à ̈ stato poi immerso in un bagno di una soluzione binaria di acqua e diossano (0,0 - 50,0 % peso/peso) alla stessa temperatura per indurre la smiscelazione delle fasi (5,0 - 15,0 min). In seguito à ̈ stato risciacquato in acqua pura parecchie volte e finalmente essiccato all'aria (48 ore). E' stata preparata una soluzione ternaria omogenea di PLLA, diossano e acqua, con un rapporto in peso (diossano / acqua) costante e pari a 87 / 13, ricavato da precedenti studi di letteratura sullo stesso sistema (9). La concentrazione di PLLA à ̈ stata fissata al 4% peso/peso. La soluzione, inizialmente mantenuta a 60°C, à ̈ stata versata a caldo in un contenitore di campione a forma di disco realizzata in alluminio con un diametro di 60 mm ed uno spessore di 2 mm, contenente un filo rivestito di PLLA lungo 80 mm come in precedenza riportato. La temperatura (controllata continuamente per mezzo di un termocoppia inserita nel campione) à ̈ stata poi improvvisamente abbassata ad un valore all'interno della regione instabile (da 25 a 35°C) per un intervallo di tempo ben definito (da 10 a 60 min) mediante immersione del campione in un bagno termostatico ad acqua (mostrato in figura 4 con A). In seguito à ̈ stato realizzato un raffreddamento rapido mediante immersione in un bagno di alcool etilico ad una temperatura di -20°C per 5 minuti allo scopo di congelare la struttura ottenuta (vedasi B in fig. 4). L'intero protocollo sperimentale à ̈ schematizzato alla fig. 4, dove Tde tdindicano rispettivamente la temperatura e il tempo di smiscelazione.

Le schiume ottenute sono state flussate con acqua per 24 ore ed essiccate a vuoto almeno a 20°C per tutta la notte allo scopo di rimuovere completamente qualunque traccia di solvente rimanente.

Alla fine il filo à ̈ stato estratto dallo scaffold.

Esempio di introduzione e coltura di cellule

Gli scaffolds generati con al loro interno strutture tubolari, come precedentemente descritto, sono stati sterilizzati mediante trattamento con una soluzione di Et-OH al 70% in H2O, mediante disaerazione si permettere la penetrazione della soluzione alcolica in tutte le parti dello scaffold; quindi sono stati incubati per una notte a temperatura ambiente. In seguito gli scaffolds sono stati lavati con una soluzione sterile di PBS (Phostate Buffer Salt 50 mM pH 7.4) diverse volte, in modo da allontanare totalmente l’Et-OH. Le strutture tubolari dello scaffold sono perfuse con una soluzione di collagene di tipo-I in CH3COOH, 0,02 N, 50 µg/ml per almeno 2 ore a 37 °C; in modo da permettere l’interazione tra fibrille di collagene a pareti dei tubuli. Di seguito si à ̈ effettuato un trattamento con volumi cospicui di terreno di coltura contenente siero fetale bovino al 10 %, glutammica [c.f.] 200 mM, Streptavidina 100 µg/ml, Penicillina 10.0 µg/ml (5x Vol/Vol) al fine di tamponare l’ambiente acido dovuto al CH3COOH. Quindi sono state seminate le cellule endoteliali all’interno dei tubi dello scaffold mediante una siringa da insulina, che avendo un ago di diametro circa 700 µm può essere direttamente inserita senza danneggiare gli stessi; le cellule sono state inseminate ad una concentrazione di circa 1 x 10<6>/cm<3>. Fatte crescere per 15 giorni a formare un monostrato continuo a coprire tutta la superficie dei vasi (cambiando il terreno di coltura ogni 2/3 giorni). Quindi sono stati inseminati i fibroblasti all’interno dello scaffold principale con il fine di generare una matrice extracellulare che si sostituisca nel tempo allo stesso scaffold e che abbia la funzione d’indurre le cellule endoteliali a migrare e proliferare, allo scopo di formare una rete continua di “pseudovasi†necessari al trasporto di metaboliti ed alla eliminazione dei prodotti di rifiuto come pure i prodotti derivanti dal disgregarsi dello stesso scaffold; tutto ciò una volta impiantato lo scaffold nell’ospite.

Formano ulteriore oggetto dell'invenzione gli scaffold contenenti cellule in coltura e ,o nutrienti ottenibili secondo il procedimento dell'invenzione.

Bibliografia

[1] J Folkman, M Hochberg, Self-regulation of growth in three dimensions. J Exp Med (1973) 745–532.

[2] N L’Heureux, S Paquet, R Labbe ́, L Germain, FA Auger, A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J (1998) 47–56

[3] KM Chrobak, DR Potter, J Tien, Formation of perfused, functional microvascular tubes in vitro.Microvasc Res. (2006) 185-196

[4] C Borselli, O Oliviero, S Battista, L Ambrosio, PA. Netti, Induction of directional sprouting angiogenesis by matrix gradients. J biomed mat res, part A 80A (2007) 297-30

[5] RE Unger, A Sartoris, K Peters, A Motta, C Migliaresi, M Kunkel, U Bulnheim, J Rychly and CJ Kirkpatrick, Tissue-like self-assembly in cocultures of endothelial cells and osteoblasts and the formation of microcapillary-like structures on threedimensional porous biomaterials. Biomaterials 28

(2007) 3965–3976

[6] EP 1352666 A1 (2003) “Channelled biomedical foams and method for producing†, Brown Kelly R., Melican Mora C., Chun Iksoo

[7] US 2007/0009570 A1 “Method for preparing porous polymer scaffold for tissue engineering using gel spinning molding technique†, Sang Heon Kim, Soo Hyun Kim, Young Ha Kim, Jae Hyun Kwon, Min Sub Chung.

[8] WO 2005/032418 A2 “Novel porous biomaterials†, Ratner B., Marshall A.,

[9] Li S. , La Carrubba V., Piccarolo S., Sannino D., Brucato V., Polymer International, 53, 2079-2085, (2004)

[10] F. Carfì Pavia, V. La Carrubba, V. Brucato, S. Piccarolo, Journal of Biomedical Material Research, Part A, 86A, 459-466 (2008)

[11] V. La Carrubba, F. Carfì Pavia, V. Brucato, S. Piccarolo, G. Ghersi, International Journal of Material Forming (on line) ISSN: 1960-6214, (2008)

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di scaffold compositi biodegradabili in grado di alloggiare strutture tubolari microporose, detti scaffold essendo costituiti da una schiuma polimerica con macropori interconnessi le cui pareti presentano micropori di dimensioni più piccole, comprendente le seguenti operazioni: a. preparazione di una soluzione omogenea di almeno un polimero biodegradabile in uno o più solventi. b. rivestimento con detta soluzione di un’anima a sezione circolare mediante immersione in detta soluzione e successiva estrazione a velocità controllata; c. smiscelazione con separazione di fase da detta soluzione di detto rivestimento per immersione dell’anima rivestita bagnata in un non-solvente di detto polimero biodegradabile o in una soluzione di non-solventi di detto polimero biodegradabile e solventi; d. allontanamento di detti solventi/non solventi, asciugatura e ottenimento di una struttura tubolare porosa; e. preparazione di una soluzione omogenea di un sistema ternario polimero/non-solvente/solvente e determinazione del cloud-point dello stesso al variare della temperatura e della composizione; f. introduzione a caldo di detta soluzione ottenuta dall'operazione e) in un contenitore mantenuto ad una temperatura più alta del “cloud-point†della soluzione di cui all'operazione e), detto contenitore essendo in grado di alloggiare almeno una struttura tubolare ottenibile dall'operazione d); g. rapido raffreddamento di detto contenitore ad una temperatura di 3 - 8 gradi più bassa di quella di cloud-point per un periodo di circa due - tre minuti e mantenimento per un intervallo di tempo di 10 - 30 minuti h. congelamento rapido della soluzione a temperature al di sotto di quella di precipitazione del polimero, fino alla solidificazione del polimero e i. ottenimento di uno scaffold.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui da detta operazione d) si ottiene una struttura tubolare le cui pareti presentano pori di diametro medio inferiore a 5 µm, preferibilmente inferiore a 3 µm, una porosità totale maggiore del 50% e uno spessore compreso fra 20 e 100 µm.
3. 3. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui detto polimero biodegradabile in detta operazione a) à ̈ scelto dal gruppo formato da poli-DL-acido lattico (PLA), poli-acido lattico levogiro (PLLA), poli acido glicolico (PGA), poli acido lattico-co-glicolico, (PLGA), poli-diossanone (PDO), politrimetilencarbonato (TMC), poli-idrossibutirrato (PHB), poli-idrossivalerato (PHV), polifosfazene, poliesteri uretanici (PEU), polivinil pirrolindinone (PVP), poli-ε-caprolattone (PCL), polisulfone (PSU), poli-2-idrossietil metacrilato (PHEMA), poli-idrossi-etil acrilate (PHEA), loro copolimeri e miscele.
4. 4. Scaffold polimerici ottenibili dal procedimento quale rivendicato nelle rivendicazioni da 1 a 3.
5. 5. Procedimento per la coltura di cellule e,o l'introduzione di nutrienti all'interno degli scaffold polimerici quali rivendicati nella rivendicazione 4 comprendente le seguenti operazioni a. sterilizzazione di detti scaffold polimerici; b. lavaggio con una soluzione sterile di PBS (Phostate Buffer Salt 50 mM pH 7.4) in modo da allontanare totalmente la sostanza usata per la sterilizzazione; c. perfusione delle strutture tubolari dello scaffold con una soluzione di collagene di tipo-I in modo da permettere l’interazione tra fibrille di collagene e la superficie interna di dette strutture;. d. trattamento con terreno di coltura mediante inseminazione delle cellule endoteliali all’interno dei tubi dello scaffold ad una concentrazione di circa 1 x 10<6>/cm<3> e. crescita per 15 giorni fino alla formazione di un monostrato continuo a coprire tutta la superficie interna dei vasi; f. inseminazione di fibroblasti all’interno dello scaffold principale con il fine di generare una matrice extracellulare che si sostituisca nel tempo allo stesso scaffold e che abbia la funzione d’indurre le cellule endoteliali a migrare e proliferare al fine di formare una rete continua di “pseudovasi†necessari al trasporto di metaboliti ed alla eliminazione dei prodotti di rifiuto come pure i prodotti derivanti dal disgregarsi dello stesso scaffold.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui in detta operazione a), detta sterilizzazione viene realizzata con Et-OH al 70%.
7. 7. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 5 a 6, in cui in detta operazione d) detto trattamento viene realizzato con terreno di coltura supplementato con siero fetale bovino al 10 %, glutammica [c.f.] 200 mM, Streptavidina 100 µg/ml, Penicillina 10.0 µg/ml (5x Vol/Vol).
8. 8. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 5 a 7, in cui in detta operazione f) detta inseminazione avviene mediante una siringa da insulina.
9. 9. Scaffold polimerici compositi biodegradabili contenenti cellule in coltura e, o nutrienti ottenibili dal procedimento quale rivendicato nelle rivendicazioni da 5 a 8.