ITRM20000293A1 - Metodo di estrazione di prodotti ad attivita' farmaceutica da piante spermafite, prodotti cosi' ottenuti e loro impiego in medicina, in part - Google Patents

Description

Descrizione

della domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:

“Metodo di estrazione di prodotti ad attività farmaceutica da piante spermatofite, prodotti così ottenuti e loro impiego in medicina, in particolare come sostanze ad attività antitumorale"

Campo dell’invenzione

La presente invenzione è relativa a un metodo di estrazione di prodotti ad attività farmaceutica da piante spermatofite, ai prodotti così ottenuti e al loro impiego in medicina, in particolare come sostanze ad attività antitumorale.

In particolare l'invenzione è relativa all'utilizzazione in campo farmaceutico con attività anti-tumorale del Cis-resveratrolo (anche detto nel seguito C-Res) e degli Stilbeni idrossilati, Oligostilbeni e Stilbenoidi sia nelle loro forme libere che glucosidate.

Arte nota

Gli stilbeni idrossilati, sia monomeri che oligomeri, rappresentano una classe di composti chimici presenti in un limitato numero di piante spermatofite ed in particolare nella vite, di cui sono componenti essenziali a livello delle radici, del fusto, delle foglie e, principalmente, del frutto (Vrhovsek U, Mattivi F, 1998, Proceedings of thè 29th J.PIecnik, Cardiovascular Diseases, 449-463; Mattivi F et al., 1995, J Agric Food Chem, 42, 1820-1823). Poiché il loro ruolo nella fisiologia delle piante sembra essere principalmente l'inibizione della progressione delle infezioni fungine, questo gruppo di sostanze è stato incluso fra le fitoalexine, una classe di antibiotici di origine vegetale (Hain R et al, 1990, Plant Mol Biol, 15, 325-335).

I risultati di una serie di studi suggeriscono che uno dei composti appartenente alla classe degli stilbeni, il trans-resveratrolo, possa svolgere, nell'uomo, attività farmacologiche. Recenti studi hanno infatti dimostrato che il trans-resveratrolo possiede attività antiossidanti (Fauconneau B et al, 1997, Life Sci, 61, 2103-2110), è capace di inibire l'aggregazione piastrinica (Bertelli A et al, 1996, Drugs Exp Clin Res, 22, 61-63) e l'attività cicloossigenasica (Jang M et al, 1997, Science, 275, 218-220). Inoltre, per tale composto è stata dimostrata la capacità di inibire in vitro la crescita di cellule appartenenti alta linea MCF-7 derivata da adenocarcinoma mammario (Mgbonyebi O P et al, 1998, Int J Oncology, 12, 865-869), ed in cellule appartenenti alla linea cellulare HL60 (leucemia acuta promielocitica umana), di indurre l'arresto del ciclo cellulare nella transizione fra la fase S e la fase G2 (Della Ragione F et al, 1998, Biochem Biophys Res Com, 250, 53-58), indurre apoptosi ad alte dosi e regolare l'espressione di CD95L (Clement MV et al, 1998, Blood, 92, 996-1002). Infine, in vivo il trans-resveratrolo si è dimostrato capace di inibire la tumorigenesi in un modello murino di cancro della pelle indotto da sostanze carcinogenìche (Jang M et al, 1997, Science, 275, 218-220).

Nessuno di tali studi riportava l’attività farmacologica, e i corrispondenti meccanismi d’azione di tale attività, del cis-resveratrolo, dei glucosidi del cis- e trans-resveratrolo e degli oligostilbeni e stilbenoidi, dagli autori ritenuti potenzialmente impiegabili quali presidi terapeutici nella prevenzione e nella cura dei tumori.

Come è noto, attualmente la terapia farmacologica dei tumori si avvale principalmente dell'uso di farmaci che agiscono esplicando la loro attività citotossica con vari meccanismi biochimici e siti d'azione direttamente sulla cellula tumorale, provocandone l'arresto della replicazione e la morte, e farmaci immunoterapici che agiscono indirettamente provocando, ad esempio, l'aumento della risposta immunitaria dell'individuo nei confronti delle cellule neopiastiche. Recenti ricerche suggeriscono che sostanze capaci di indurre l'apoptosi di cellule neopiastiche possano avere un ruolo importante nella terapia combinata dei tumori. L'apoptosi, o morte cellulare programmata, è un processo naturale di 'suicidio cellulare' geneticamente regolato, utilizzato dagli organismi multicellulari per l'eliminazione di cellule superflue, vecchie o che siano state danneggiate da stimoli patogenici. La morte cellulare per apoptosi avviene attraverso una serie successiva di eventi biochimici che si manifestano in cambiamenti morfologici (quali, ad esempio, il ’blebbing' della membrana piasmatica, la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA) e funzionali della cellula stessa. Evidenze sperimentali hanno dimostrato che l'assenza di risposta a stimoli apoptotici può rappresentare l'evento primario nella tumorigenesi e che una serie di difetti nel meccanismo apoptotico riscontrati in cellule tumorali risultano capaci di conferire a tali cellule resistenza sia alla chemio che alla radioterapia. Al momento, comunque, le strategie utilizzate per l'identificazione di fattori capaci di svolgere una, o più, delle attività sopra riportate non hanno prodotto risultati definitivi e la loro ricerca rappresenta uno dei campi di studio, nell'ambito della lotta alle malattie neoplastiche, in più attivo sviluppo.

Sommario dell’invenzione

Costituisce oggetto della presente invenzione un metodo per estrarre da piante spermatofite prodotti aventi attività farmacologica, in particolare attività antitumorale, più in particolare attività apoptotica.

Altro oggetto sono i prodotti del processo di estrazione, utilizzati in campo farmacologico, detti prodotti essendo costituiti da miscele complesse comprendenti composti aventi nella loro molecola uno o più gruppi stilbenici, variamente idrossilati e/o glucosidati e composti da essi derivati per via biosintetica enzimatica naturale (definendo oligostilbeni quegli oligomeri che possiedono nella molecola almeno un doppio legame stilbenico riconoscibile, e stilbenoidi quegli oligomeri che nel processo di condensazione hanno coinvolto tutti i doppi legami stilbenici). Preferiti sono i composti denominati: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati.

Altro oggetto dell'invenzione è l’impiego come farmaci dei composti ottenuti attraverso l'estrazione, in particolare farmaci ad attività antitumorale, più in particolare ad attività apoptotica.

Altri oggetti risulteranno evidenti dalla descrizione dell’invenzione.

Breve descrizione delle figure

Fig. 1 mostra l’effetto del C-Res sulla replicazione di cellule M 14.

Fig. 2 mostra l'effetto del C-Res suli'apoptosi di cellule M 14.

Fig. 3 mostra l'effetto del C-Res sulla mortalità di cellule M 14.

Fig. 4A mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule M 14 a 24h. Fig. 4B mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule M 14 a 48h. Fig. 4C mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule M 14 a 72h. Fig. 5 mostra l’effetto del C-Res sulla replicazione di cellule PAR-MEL. Fig. 6 mostra l’effetto del C-Res suli'apoptosi di cellule PAR-MEL.

Fig. 7 mostra l’effetto del C-Res sulla mortalità di cellule PAR-MEL.

Fig. 8A mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule PAR-MEL a 24h.

Fig. 8B mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule PAR-MEL a 48h.

Fig. 8C mostra l'effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule PAR-MEL a 72h.

Fig. 9 mostra l’effetto del C-Res sulla replicazione di cellule HT-29.

Fig 10 mostra l'effetto del C-Res suli'apoptosi di cellule HT-29.

Fig. 11 mostra l’effetto del C-Res sulla mortalità di cellule HT-29.

Fig. 12A mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule HT-29 a 24h.

Fig. 12B mostra l’effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule HT-29 a 48h.

Fig. 12C mostra l'effetto del C-Res sul ciclo cellulare di cellule HT-29 a 72h.

Fig. 13 mostra il confronto tra l'attività antitumorale del Cis-resveratrolo (C-Res) e del trans-resveratrolo (T-Res)

Fig. 14 mostra il tracciato cromatografico HPLC in fase inversa della miscela complessa di stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi estratti dalle radici di Vitis: i trans-stilbeni e trans-oligostilbeni sono monitorati a 320 nm, i cis-stilbeni e gli stilbenoidi a 282 nm.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

I composti di interesse della presente invenzione si possono suddividere in due grossolane famiglie: la prima, quella degli stilbeni ed oligostilbeni, la seconda, quella degli stilbenoidi. La prima abbraccia molecole caratterizzate dalla presenza di uno o più gruppi dello stilbene [(C6H5)-CH=CH-(CeHs)] variamente idrossilati e/o glucosidati. A titolo di esempio non limitativo, fanno parte di questa prima famiglia i seguenti composti:

T-Res monoglucosidato C-Res monoglucosidato

(il legame glucosidico, in alternativa alla posizione 3, può anche essere presente nella posizione 4' e dare differenti T-Res e C-Res differentemente monoglucosidati o T-Res e C-Res recanti più di un gruppo glucosidico).

Dimoro del T-Res (ε-vìniferina) Trimero del T-Res (gnetina H)

Tetrameri del T-Res (r-2-viniferina ed r-viniferina)

La seconda famiglia, quella degli stilbenoidi, abbraccia composti che, come i precedenti, sono classificabili come oligomeri stilbenici, ma nei quali l'originaria struttura stilbenica non è più riconoscibile, in quanto tutti i doppi legami stilbenici sono stati modificati per via biosintetica enzima·* tica naturale all’interno dei prodotti vegetali da cui vengono estratti. A titolo di esempio non limitativo si possono indicare i composti:

Ampelopsina A Hopeaphenol

L’Ampelopsina A è considerato un dimero ossidativo del T-Res. L’Hopeaphenol è il tetramero corrispondente, ossia un dimero di dimeri legati attraverso le due posizioni C8.

i composti appartenenti alle due classi possono essere ottenuti attraverso trattamenti di estrazione e purificazione dai prodotti naturali che li contengono, che possono essere frutti (es. uva), parti aeree (tronco, tralci, foglie) oppure parti sotterranee di piante spermatofite, in particolare quelle appartenenti alla famiglia delle Vitaceae oppure delle Poligonaceae. Particolarmente preferite sono le parti sotterranee di tali piante. I processi di estrazione e purificazione seguono le metodologie appresso riportate. Si deve tenere in conto che le miscele ottenute con i processi della presente invenzione sono miscele complesse all'interno delle quali sono stati identificati solo i componenti principali (gli stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi indicati in precedenza) tuttavia questi prodotti sono da ritenersi solo indicativi in quanto rappresentativi di altri componenti similari, presenti in minore quantità, che non sono stati isolati e caratterizzati, ma che hanno la medesima natura e caratteristiche applicative analoghe; anch’essi fanno parte della presente invenzione, ancorché non isolati e caratterizzati, in quanto presenti negli estratti naturali.

La presente invenzione concerne l'attività antitumorale esplicata da questi composti, da soli o in miscela, mediante la capacità di inibire la replicazione cellulare, indurre l'apoptosi, indurre la mortalità ed indurre a vari livelli il blocco del ciclo cellulare di cellule appartenenti a differenti linee tumorali, ed in particolare, di cellule di melanoma maligno resistenti ai chemioterapici.

Il processo di estrazione secondo la presente invenzione è applicato a piante spermatofìte. Il materiale di partenza può essere costituito dal frutto, dalle parti aeree oppure dalle parti sotterranee delle piante. La materia di partenza può essere, a seconda dei casi, fresca o congelata oppure liofilizzata e ridotta in polvere. Le matrici più significative sono considerate le radici di Polygonum cuspidatum e di Polygonum multiflorum e la corteccia delle radici lignificate del genere Vitis.

Si preferisce lavorare con materiale il più possibile secco, per cui è vantaggioso sottoporre detto materiale da estrarre ad un pre-trattamento di sostanziale eliminazione a freddo dell'acqua, ad es. per liofilizzazione. L’estrazione viene effettuata in ambiente neutro con un alcol alifatico, preferibilmente metanolo o etanolo e relative miscele, utilizzando preferibilmente quantità di solvente che variano da 10 a 20 volte in volume rispetto al peso della matrice da estrarre. Si miscelano il materiale da estrarre e il solvente, si pone sotto agitazione e si estrae in atmosfera esente da ossigeno, ad es. saturata di azoto, e schermata dalla luce, a temperatura ambiente, con durata dell’estrazione variabile in funzione della matrice, indicativamente dell'ordine di 2-12 ore per matrici tal quali, e di 5-120 minuti per matrici preventivamente liofilizzate e ridotte in polvere attraverso preventiva macinazione del liofilizzato. L'estratto finale viene centrifugato e si recupera il sumatante, che viene concentrato sotto vuoto a temperature ridotte (inferiori ai 45 °C) e ripreso con acetato di etile o altro solvente di analoghe caratteristiche quale ad esempio acetato di metile e/o tetraidrofurano (estratto grezzo in solvente) o con acqua (estratto grezzo aquoso) (in particolare per radici di polygonum, per ottenere un grado di purezza più spinto).

L'estratto grezzo può essere trattato secondo due metodologie a seconda che si voglia recuperare una miscela contenente sostanzialmente tutti i prodotti dell’invenzione oppure solo il trans-resveratrolo e i transresveratroli glucosidati.

Il primo tipo di trattamento (Trattamento A) è preferito nel caso che l'estrazione venga condotta su piante del tipo del genere Vitis , il secondo tipo di trattamento (Trattamento B) è preferito per la matrice più semplice relativa alle piante del genere delle Poligonaceae.

Trattamento (A) L'estratto grezzo in solvente quale etile acetato viene lavato con acqua saturata con sale inorganico (ad es. NaCI), la frazione in etile acetato viene caricata su una colonna preparata con una resina di un polimero a struttura aromatica (sono particolarmente adatti a questo i copolimeri stirene-divinilbenzene, preferibilmente con granulometria compresa tra 0,1 e 0,25 mm).

Effettuato il caricamento, si eluisce con acqua, preferibilmente in volume circa doppio a quello dell’etile acetato, poi con pentano-metilene cloruro 2:1 (in volume circa eguale a quello dell'etile acetato). Si eluiscono gli stilbeni con etile acetato o con idonee miscele di solventi organici di polarità intermedia, aventi forza eluente corrispondente rispetto ad XAD-2, sigla nota all’esperto del ramo. XAD-2 è un tipo particolare di resina copolimero stirene-divinilbenzene rispetto alla quale sono tabulati in letteratura i fattori di forza relativa eluente (vedi ad es. Robinson J.L. et al., J. Chromatogr., 1980, 185, 145), quali ad esempio tetraidrofurano o metilene cloruro. Il volume di etile acetato viene scelto in modo da assicurare il recupero quantitativo di tutta la classe (come in fìg. 14), ed è variabile in funzione della forma e del volume morto della colonna. Il prodotto di questa eluizione selettiva è costituito da una frazione purificata contenente tutta la classe delle viniferìne, contenenti sia gli oligostilbeni che gli stilbenoidi.

I costituenti base che conferiscono interesse farmacologico a questa frazione sono gli oligomeri del resveratrolo, con particolare attenzione ai dimeri, trimeri e tetrameri, sia quelli contenenti ancora un doppio legame stilbenico in forma trans- o cis- (oligostilbeni) che quelli che hanno perso la struttura stilbenica nella polimerizzazione naturale (stilbenoidi). Nella stessa frazione si recupera anche il monomero trans-resveratrolo glucosidato.

Se si vogliono ottenere i composti puri seguenti: epsilon-viniferina, alfaviniferina, gnetina-H (isolabile anche da legno di Welwitschia mirabilis), rviniferina, ampelopsina A (isolabile anche da radici di Ampelopsis brevipedunculata) e hopeaphenol si effettua una cromatografia liquida ad alta prestazione su colonne di fase inversa. Si possono utilizzare le fasi a base di silice funzionai izzata con C18 oppure C8 (terminologia comune nota all'esperto) oppure polimeri stirenici, questi ultimi solo in bassa pressione. Un esempio pratico (ottimale per separare epsilon-viniferina, gnetina H e r-viniferina) è l'uso di colonna impaccata con fase fissa RP-18, aad esempio del tipo LiChrospher 100 o altra similare, 10 micron di diametro particelle, eluendo con un gradiente lineare di acqua ed acetonitrile, quest'ultimo dal 30 al 50%. La messa a punto delle condizioni di separazione per questo tipo di miscele è alla portata del tecnico del ramo.

Un’analisi quantitativa della miscela degli stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi ottenuta con l’estrazione secondo l’invenzione, può in generale essere ottenuta per cromatografìa liquida ad alta prestazione in fase inversa (o, in subordine, con altre tecniche separative in fase liquida quali elettroforesi, cromatografia su strato sottile (TLC) con rilevazione UV, MS (Spettrometria di Massa) o con detector a fluorescenza. Le prime due tecniche sono preferibili in quanto permettono una affidabile conferma identificativa. Un esempio di condizioni ottimizzate è dato nell’esempio 8.

Trattamento B

Il trattamento 6 consta delle seguenti alternative:

- se dall’estratto finale si vogliono eliminare sia i composti lipofili che quelli idrofili l'estratto grezzo acquoso viene lavato con metilene cloruro o altro solvente con polarità similare quale ad esempio cloroformio, per rimuovere i prodotti lipofili ma non gli stilbeni, e successivamente viene riestratto in etile acetato, (ad esempio per cinque volte con volume estratto/estraente 1/1, riducibili nel caso di volumi di estraenti maggiori o di modifica delia forza ionica dell’estratto), per recuperare gli stilbeni, mentre i composti idrofili restano nella parte acquosa, che viene scartata. - se dall’estratto finale si vogliono ottenere i soli derivati glucosidati, è possibile precipitarli selettivamente a freddo dall’estratto grezzo in solvente quale acetato di etile con solvente apolare (ottimale, esano, in rapporto 3/1 rispetto all’acetato di etile), e recuperarli per filtrazione. Alternativamente, si può usare l'intera frazione e recuperare anche il transresveratrolo.

- se si vuole ottenere una separazione abbastanza accurata della miscela, si può partire dall'estratto grezzo in solvente quale etile acetato, che deve essere perfettamente anidro. Esso, preferìbilmente ridotto al minimo volume, viene caricato in testa ad una colonna preparativa di silice per cromatografia (ad es. Kieselgel 0,05-0,20 mm), impaccata in solvente apolare (ad esempio, esano). Sopra la colonna si lascia un volume adeguato di cloroformio. La lavorazione prevede due sequenze di lavaggio ed eluzione in serie, con miscele a forza eluente crescenti, cloroformio-metanolo, rispettivamente I (20:1); il (10:1); III (5:1); IV (2.5:1). Più in generale, con opportune miscele binarie o ternarie di solventi di moderata polarità (ad es., solventi clorurati, etere dietilico, tetraidrofurano) e solventi forti (ad es., alcoli alitatici, acetonitrile), sono ottenibili separazioni similari utilizzando miscele con posizionamento nella serie eluotropa analogo a quelle sopraesposte, secondo quanto noto all’esperto de) ramo. Questa separazione permette un recupero integrale dei principi attivi stilbenici, separati da tutti i maggiori interferenti, ottenendo due preparati a purezza molto spinta: la frazione IV contiene due diversi derivati monoglucosidati del trans-resveratrolo, raccolti nella stessa frazione, la frazione II contiene il trans-resveratrolo libero. Le condizioni qui esposte sono riferite in particolare all'estratto di radici di Polygonum cuspidatum, e possono essere adattate con procedura similare al Polygonum multiflorum che è noto contenere anche altri tipi di stilbeni glucosidi (2,3,5,4’-tetraidrossistilbene-2-glucoside, Yong et al., 2,2-diphenyl-1-picriylhydrazyl radical-scavenging active components from Polygonum multiflorum Thunb., J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 226-2228). Se è necessario arrivare a livello molecolare, sono applicabili le tecniche di purificazione per cromatografia preparativa, nelle condizioni descrìtte in Mattivi et al., Isolation, characterization, and evolution in red wine vinification of resveratrol monomers. J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820-1823).

Un’analisi quantitava dei resveratroli può essere condotta secondo l'esempio 8

Le tecniche di analisi quantitativa descrìtte sono particolarmente indicate ad esempio per valutare la presenza del principio attivo desiderato nei terreni di coltura, e quindi per supportare i modelli sperimentali in vitro. Isomerizzazione trans-cis.

Un'indicazione delle tecniche di isomerizzazione secondol'invenzione si trova nell’esempio 7.

Attività terapeutica

In terapia possono essere usati gli estratti tal quali ovvero i singoli composti sia in forma naturale (come isolati dalle matrici di origine vegetale) sia come ottenuti da sintesi chimica. L’agente attivo può essere somministrato sotto forma di sale, estere, ammide, prodrug o analogo farmacologicamente accettabili o da loro combinazioni. I sali, esteri, ammidi, prodrug o analoghi degli agenti attivi possono essere preparati seguendo le procedure standard della chimica sintetica organica.

Sulla base della via di somministrazione che si intende utilizzare la formulazione farmaceutica può essere in forma di compresse, supposte, pillole, capsule, polveri, liquidi, sopensioni, creme, unguenti, lozioni o simili. Le composizioni includeranno una quantità efficace dell'agente in combinazione con un eccipiente farmacologicamente accettabile e possono inoltre includere altri agenti farmacologici, adiuvanti, diluenti, tamponi etc. I composti potranno così essere somministrati per via orale, parenterale (iniezione subcutanea, intravenosa, intramuscolare), transdermica, rettale, nasale, boccate, topica o mediante impianto a rilascio controllato.

La quantità del composto attivo da somministrare dipenderà dalla particolare patologia (o patologie) di cui soffre il soggetto da trattare, dal peso e dall'età del soggetto, dalla via di somministrazione prescelta e dal giudizio del medico curante. Nel metodo dell'invenzione, attività antitumorale, lo schema di trattamento prevederà la somministrazione del farmaco a dosi comprese fra 0,0001 e 20 mg/kg/die.

E' stato verificato che i composti, singoli e in miscela, secondo la presente invenzione, in particolare il C-Res, sono induttori di apoptosi cellulare, inoltre, nell'intervallo di dosi 5 e 10 mcg/ml il C-Res svolge una significativa attività citostatica mentre alla dose di 20 e 40 mcg/ml il composto svolge attività citotossica.

E' stato altresì trovato che i composti, singoli e in miscela, secondo la presente invenzione, in particolare il C-Res, sono capaci di svolgere attività antitumorale in generale e in particolare attività per il melanoma maligno resistente ai chemioterapici, per l'adenocarcinoma colo-rettale. Inoltre l'attività antitumorale specifica del C-Res è risultata essere almeno 12 volte più elevata di quella del T-Res.

Di seguito vengono fomiti, a scopo illustrativo e non limitativo, esempi secondo la presente invenzione.

Esempio 1

Estrazione dei resveratroli (trans-resveratrolo, cis-resveratrolo e loro glucosidi) da matrici vegetali (frutti, ad es. uva da vite)

La matrice viene congelata quindi omogeneizzata in presenza di sodio metabisolfito e di acido ascorbico in ragione dell'1% in peso ciascuno, l'omogeneizzato viene sottoposto ad estrazione liquido-liquido per 3 volte con acetato di etile (150% in volume rispetto al peso della matrice), ai riparo dalla luce. Gii estratti vengono lavati una volta con soluzione acquosa di sodio carbonato acido al 3 % e due volte con acqua distillata, con volume di ciascun lavaggio pari al 10% di quello dell’estratto. L'estratto lavato viene anidrificato con del sodio solfato anidro o mediante congelamento e concentrato fino a secco sotto pressione ridotta ed a bassa temperatura. L'estratto secco viene ripreso con acetato di etile anidro.

Esempio 2

Estrazione dei resveratroli (trans-resveratrolo, cis-resveratrolo e loro giucosidi) da radice di Polygonum cuspidatum.

La radice della pianta svasata viene lavata, asciugata, tagliata in grossi pezzi, liofilizzata e macinata. Si estrae con metanolo (oppure etanolo), sotto agitazione, al riparo dalla luce e dall’ossigeno. Si centrìfuga e si recupera il surnatante, che viene concentrato sotto pressione e temperatura ridotte, e ripreso con acetato di etile.

Esempio 3

Estrazione delle viniferine (stilbeni oligomeri e stilbenoidi) da matrici vegetali.

L'estrazione delle viniferine dalle parti aeree (tronco, tralci, foglie) oppure dalle parti sotterranee di piante della famiglia delle Vitaceae oppure delle Poligonaceae può essere fatta sia sulla matrice fresca o congelata, oppure sulla parte liofilizzata e ridotta in polvere. Se l’estrazione si effettua operando sulle radici, queste vengono lavate, asciugate, tagliate in grossi pezzi, liofilizzate e macinate. La matrice considerata più significativa è costituita dalla corteccia delle radici lignificate del genere Vitis.

L'estrazione viene ottenuta con metanolo (o in alternativa con etanolo), in volume da 10 a 20 volte superiore al peso della matrice da estrarre, in atmosfera solitamente esente da ossigeno, ad es. saturata di azoto, e schermata dalla luce, a temperatura ambiente, con durata variabile in funzione della matrice. L'estratto finale viene concentrato sotto pressione ridotta ed a bassa temperatura, e ripreso con etile acetato.

Esempio 4.

Purificazione delle viniferine, preparazione dell'estratto purificato contenente tutta la classe di questi composti.

L'estratto concentrato ottenuto viene lavato con acqua saturata con sale inorganico (NaCI), la frazione in etile acetato viene caricata su una colonna preparata con resina di polimero a base stirene-divinilbenzene, con granulometria compresa tra 0,1 e 0,25 mm, prepurificata attraverso lavaggi consecutivi con metanolo, metilene cloruro, acetone, metanolo, acqua. Sopra la testa della colonna si lascia un volume di acqua pari a 10 volte circa il volume dell'estratto da caricare. Effettuato il caricamento, si inizia l'assorbimento in testa alla colonna, seguito da lavaggi con acqua, poi con pentano-metilene cloruro 2:1. Si eluiscono gli stilbeni con etile acetato. Il prodotto di questa eluizione selettiva è costituito da una frazione purificata contenente tutta la classe delle viniferine, contenenti sia gli oligostiibeni che gli stilbenoidi. Gli altri polifenoli, fortemente adsorbiti, vengono eluiti con metanolo e/o metanolo acidificato con acido minerale forte.

In particolare, i costituenti fondamentali che conferiscono interesse farmacologico a questa frazione sono gli oligomeri del resveratrolo, con particolare attenzione verso i dimeri, trimeri e tetrameri, sia quelli contenenti ancora un doppio legame stilbenico in forma trans- o cis- (oligostiibeni) che quelli che hanno perso la struttura stilbenica nella polimerizzazione (stilbenoidi). Nella stessa frazione si recupera anche il monomero trans-resveratrolo glucoside.

Esempio 5

Purificazione dei resveratroli, preparazione dell'estratto purificato, con eventuale separazione delle forme libere da quelle glucosidi.

L'estratto grezzo ottenuto come descritto sopra, ottenuto da radici di Polygonum cuspidatum, viene trattato nel modo seguente. Se è necessario purificare i soli glucosidi, è possibile precipitarli selettivamente con solvente apolare (ottimale, esano). Alternativamente, si può usare l'intera frazione e recuperare anche il trans-resveratrolo. L’estratto in etile acetato, che deve essere perfettamente anidro, viene ridotto al minimo volume e caricato in testa ad una colonna preparativa di silice per cromatografìa (Kieselgel 0,05-0,20 mm), impaccata in esano. Sopra la colonna si lascia un volume adeguato di cloroformio. La lavorazione prevede due sequenze di lavaggio ed eluzione in serie, con diverse miscele cloroformio-metanolo, rispettivamente I (20:1); Il (10:1); III (5:1); IV (2,5:1). Questa separazione permette un recupero integrale dei principi attivi, separati da tutti i maggiori interferenti, ottenendo due preparati a purezza molto spinta: uno contiene due diversi monoglucosidi del transresveratrolo, raccolti nella stessa frazione, l'altro il trans-resveratrolo libero. Se necessario arrivare a livello molecolare, sono applicabili le tecniche di purificazione per cromatografia preparativa, nelle condizioni descritte in Mattivi et al., Isolation, characterization, and evolution in red wine vinifìcation of resveratra) monomers. J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820-1823.

Esempio 6

Preparazione dei composti puri della famiglia delle viniferine.

Se il prodotto di partenza è costituito dalle radici di Vitis, si possono ottenere tramite purificazione i composti seguenti: epsilon-viniferina, alfaviniferina, gnetina-H (isolabile anche da legno di Welwitschia mirabilis), rviniferina, ampelopsina A (isolabile anche da radici di Ampelopsis brevipedunculata) e hopeaphenol.

L'isolamento finale di questi composti puri è ottenibile attraverso cromatografia liquida ad alta prestazione su colonne di fase inversa. Sono applicabili con successo le fasi costituite da silice funzionalizzata con C18 oppure C8 oppure polimeri stirenici, questi ultimi solo in bassa pressione. Un esempio pratico (ottimale per separazione di epsilon-viniferina, gnetina H e r-viniferina) è l'uso di colonna impaccata con LiChrospher 100 RP-18, 10 micron di diametro particelle, eluendo con un gradiente lineare di acqua ed acetonitrile, quest'ultimo dal 30 al 50%.

Esempio7

Isomerizzazione trans-cis.

Questa reazione può essere impiegata sia per ottenere i prodotti non disponibili commercialmente (esempio: cis-resveratrolo), sia per spostare l'equilibrio di miscele di estratti naturali contenenti entrambi le forme, se farmacologicamente opportuno.

Gli isomeri cìs possono essere preparati per fotoisomerizzazione a partire dai corrispondenti isomeri trans. La resa di conversione migliore si ottiene per blando irraggiamento nel vicino ultravioletto o nei visibile, che può essere condotta in recipienti di vetro trasparente. Ad esempio, l'isomerizzazione di una soluzione contenente 0,5 mg/ml di T-Res commerciale in etanolo, protetta dall'ossigeno tramite degasaggio in bagno a ultrasuoni, insufflata con azoto, e quindi sigillata ed irraggiata a 366 nm, permette di ottenere rese di conversione intorno al 90% con tempi di 600 minuti. Il controllo della conversione può essere fatto con le tecniche di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) descritte sopra, per iniezione diretta, fermando la reazione al raggiungimento della resa desiderata. Ovviamente, tempi e modalità vanno adattati secondo buona prassi generale: è possibile utilizzare irraggiamenti più spinti, a patto di mettere in essere controlli di processo più rapidi noti all’esperto del ramo (UV diretto, HPLC (socratico), il che risulta comunque agevole nel caso di composti singoli. La soluzione alcolica, nel nostro caso con etanolo, permette una stabilità ottimale del preparato, che deve essere conservato in soluzione, presentando forti problemi di stabilità allo stato solido.

Esempio 8

Metodiche di analisi quantitativa.

Per quanto riguarda la quantificazione delle viniferine, in miscela dall’esempio 4 oppure dall'esempio 6, si inietta un volume tra 1 e 6 microlitri di estratto in etile acetato, anidrificato e filtrato a 0,22 micron, su un sistema HPLC con colonna in fase inversa Hypersil ODS C18, 5 micron, 200x2,1 mm. Le condizioni strumentali prevedono come eluenti A=H3P04 1 mM in acqua, B= acetonitrile, gradiente lineare da 100% A, 2%B/min, flusso di 0,6 ml/min, 40°C. La rilevazione viene ottenuta con detector a fotodiodi, rilevazione a 325 nm per gli oligostilbeni ed a 282 nm per gli stilbenoidi. Quantificazione con il metodo dello standard esterno, rispetto a rette di calibrazione con composti di riferimento puri. Per quanto riguarda i resveratroli, essi sono ottenibili con due tecniche alternative, HPLC oppure GC. Per entrambe le tecniche la quantificazione si effettua con il metodo dello standard interno. Il composto da noi individuato come ottimale è il trans-4-idrossi-stilbene, reperibile commercialmente.

Per l'analisi GC si utilizzano le tecniche riportate in Mattivi et al. Isolation, characterization, and evolution in red wine vinification of resveratrol monomers. J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820-1823. E' indispensabile un derivatizzante diverso da quelli riportati nella letteratura, costituito da trimetilclorosilano ed esametildisilazano in piridina anidra. Queste condizioni specifiche sono determinanti per superare i problemi della silanizzazione con bis(trimetilsilil)trifluoroacetamide (BSTFA).

Per HPLC si può applicare il metodo di riferimento con colonna in fase inversa, con rilevazione a 310 nm per gli isomeri trans ed a 282 per il cis (Mattivi F. Solid phase extraction of trans-resveratrol tram wines for HPLC analysis. Zeitschrrft fuer Lebensmittel- Untersuchung und Forschung, 1993, 196, 522-525). Le condizioni strumentali sono le stesse sopra descrìtte per le viniferìne. Il coefficiente di estinzione molare dei due glucosidi è quasi identico a quello dei corrispondenti agliconi, per cui essi possono essere dosati come tali, previa correzione per i pesi molecolari (Mattivi et al., Isolation, characterization, and evolution in red wine vinification of resveratrol monomers. J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820-1823).

Se è necessaria preparazione per matrici acquose od idroalcoliche, si preceda l'iniezione con uno step di pre-purificazione su cartucce di fase inversa secondo Mattivi F. Solid phase extraction of trans-resveratrol from wines for HPLC analysis. Zeitschrift fuer Lebensmittel- Untersuchung und Forschung, 1993, 196, 522-525). In aggiunta a quanto riportato nel citato lavoro, si è verificato che il metodo è idoneo per tutti gli stilbeni monomeri, sia liberi che glucosidi, e che la frazione eluita con etile acetato può essere portata a secco sotto leggero flusso dì azoto, nel caso sia necessario scambiare in altro solvente e/o abbassare ulteriormente i limiti di quantificazione.

Tali tecniche sono utilizzabili ad esempio per controllare la stabilità del principio attivo nei terreni di coltura, e quindi per supportare i modelli sperimentali in vitro di cui ai successivi esempi. Ad esempio, per il mezzo di coltura di cui al punto 10, si possono riscontrare dei tempi di dimezzamento di 38 h per il cis-resveratrolo, ancora presente intorno al 25% al termine della prova (72h), mentre il tempo di dimezzamento è ancora elevato, di 28 h per il trans-resveratrolo, non più presente come tale a 72h.

Esempio 9

Metodiche di analisi qualitativa

I principali esperimenti necessari per caratterizzazioni univoche a livello molecolare sono richiamati per tecnica:

Spetroscopia ultravioleto: in spetrofotometro UV con cella statica, si effetua la doppia misurazione in etanolo assoluto senza e con l'aggiunta di sodio etilato (Hillis W.E., Ishikura N. 1968 J. Chromatog., 32, 323)). In detector a fotodiodi accoppiato ad HPLC, secondo Mattivi F., Reniero F. Relationship between UV spectra and molecular structure of resveratrol oligomers. Polypnenols Communications 96, 1996, 125-126). Dato y=A230/A326, si otiene il numero di unità stilbeniche neli'oligomero, x, con l'equazione y=0,657x - 0,065.

Risonanza magnetica nucleare: 1 H in spettrometro NMR a 400 MHz o superiore, 13C a 100 MHz o superiore, in acetone esadeuterato con TMS come riferimento. Alternativamente, le risonanze del gruppo metile dell'acetone esadeuterato possono essere utilizzate come riferimento (deltaH=2,04 deltaC=29,8) Per gli specifici composti, sono applicabili a seconda delle necessita vari esperimenti di misura homonuclear DEPT, 1H COSY, 1H COSY long range, doublé quantum filtered COSY, heteronuclear HECTOR e heteronuclear long range 1H-13C(13C)-GARP decoupling experiments, HMQC, HMBC, NOE difference spectra. Concentrazioni otimali per la misura in probe da 5 mm sono 15 mg in 0,5 mi per gli esperimenti al protone, e 80 mg in 0,5 mi per gli esperimenti al carbonio.

Spettrometria di massa, in particolare FAB-MS registrati in modalità negativa, in matrice di glicerolo.

Spettrometria infrarosso: registrata in pastiglie di KBr.

Acetilazione deoli idrossili liberi, nelle condizioni riportate da Koenig et al. (1987, Phytochemistry, 26, 2, 423-427)

Esempio 10

Modelli Sperimentali per lo studio dell'attività antitumorale

Linee cellulari e trattamenti

Nel corso degli esperimenti sono state utilizzate una serie di linee cellulari originate da differenti tipi di tumore. Tutte le linee cellulari sono state fatte crescere e mantenute in terreno RPMI-1640 supplementato con siero fetale di vitello (FCS) al 10% e penicillina-streptomicina aH’1%. Le sostanze dell1 invenzione sono state disciolte in dimetil-suifossido (DMSO) alla concentrazione iniziale di 100mM ed aggiunte alle colture cellulari alle concentrazioni indicate. Alle colture di controllo é stato aggiunto il solo DMSO.

Determinazione della replicazione cellulare.

Le cellule poste in micropiastra alla concentrazione di 1x10s/ml sono state incubate con varie dosi di ciascuna sostanza e per differenti perìodi di tempo. Alla fine del trattamento la replicazione cellulare é stata valutata mediante conta cellulare effettuata con l'ausilio di un Coulter Counter.

Determinazione della mortalità cellulare.

Le cellule poste in micropiastra alla concentrazione di 1x105/ml sono state incubate con varie dosi di ciascuna sostanza e per differenti periodi di tempo. Alla fine del trattamento la mortalità cellulare é stata valutata mediante conta cellulare in trypan blue e/o mediante citometria a flusso con l'ausilio di un citometro FACscan (Becton-Dickinson) determinando la vitalità di cellule non fissate marcate con ioduro di propidio (PI).

Determinazione dell'apoptosi mediante citofluorimetrìa a flusso

Le cellule sono state risospese alia concentrazione di 1 x106/ mi ed incubate per differenti periodi di tempo con varie dosi di ciascuna sostanza. Alla fine del periodo di incubazione le cellule sono state fissate in acetone/metanolo 1:4, trattate con 100 KU/ml di RNasi e marcate con ioduro di propidio (50 mcg/mi). Le cellule sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso con l'ausilio di un citometro FACscan.

Determinazione dell'apoptosi mediante microscopia confocale

Le cellule sono state risospese alla concentrazione di 1x106/ mi ed incubate per differenti periodi di tempo con varie dosi di ciascuna sostanza. Alla fine del periodo di incubazione le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% trattate con 100 KU/ml di RNasi e marcate con ioduro di propidio. Le cellule sono state quindi analizzate mediante osservazione al microscopio confocale (LEIKATCS 4D).

Analisi del ciclo cellulare

Le cellule sono state risospese alla concentrazione di 1x106/ mi ed incubate per differenti periodi di tempo con varie dosi di ciascuna sostanza. Alla fine del periodo di incubazione le cellule sono state fissate in acetone/metanolo 1:4, trattate con 100 KU/ml di RNasi e marcate con ioduro di propidio (50 mcg/ml). Le diverse fasi del ciclo cellulare sono state quindi analizzate mediante emometria a flusso con l'ausilio di un citometro FACscan utilizzando un apposito programma statistico.

Esempio11

Effetti antitumorali del Cis-Resveratrolo su cellule M14 ( melanoma malignol

Le cellule appartenenti alla linea tumorale (melanoma maligno) M14 sono state incubate per vari periodi di tempo con 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 e 80 mcg/ml di Cis-Resveratrolo (C-Res), o solo DMSO per quanto riguarda i controlli. I risultati degli esperimenti dimostrano che a tutte le dosi saggiate il C-res è capace di inibire crescita cellulare. In particolare, i dati mostrano (fìg 1) che nell'intervallo di dosi 5 - 20 mcg/ml il C-Res svolge una significativa attività citostatica mentre alla dose di 40 mcg/ml il composto svolge attività citotossica.

L'analisi citofluorimetrica del contenuto di DNA delle cellule marcate con PI mostra (fig 2) che il C-Res induce un incremento del numero di cellule apoptotiche dipendente dalla dose e dal tempo di esposizione al farmaco. Tale effetto risulta infatti particolarmente significativo a partire dalla dose di 20 mcg/ml ed il picco di attività si ha a 48h. Un'attività simile, per andamento, viene svolta dal C-res sulla mortalità cellulare (fig 3), anche se per tale parametro le percentuali di cellule sensibili all'azione del farmaco sono molto più elevate.

Il C-Res, infine.si è rivelato particolarmente attivo nell'indurre variazioni del ciclo cellulare nelle cellule M14 fig 4). Infatti, già dopo 24h di incubazione delle cellule con C-Res ed a partire dalla dose di 1,25 mcg/ml, si osserva un blocco significativo del ciclo cellulare a livello S/G2M con conseguente aumento del percento di cellule in fase S. Tale blocco rimane, alle dosi più alte, costante per le ore successive.

Questi risultati indicano chiaramente che il C-Res è capace di svolgere attività antitumorale nei confronti di cellule appartenenti alla linea di melanoma maligno M14. Tale attività si esplica in tali cellule attraverso i) l'inibizione dose e tempo di incubazione dipendente della crescita, ii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente dell'apoptosi iii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente della mortalità iiii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente di variazioni nel ciclo cellulare, In particolare l'induzione di un blocco del ciclo cellulare a livello S/G2M.

Esempio 12

Effetti antitumorali del Cis-Resveratrolo su cellule PAR-MEL (melanoma maligno resistente ai chemioterapici)

Le cellule appartenenti alla linea tumorale PAR-MEL (melanoma maligno resistente ai chemioterapici) sono state incubate per vari periodi di tempo con 5, 10, 20 e 40 mcg/ml di C-Res. I risultati degli esperimenti dimostrano che il C-res è capace di inibire la crescita di tali cellule. In particolare, i dati mostrano (fig 5) che nell'intervallo di dosi 5 e 10 mcg/ml il C-Res svolge una significativa attività citostatica mentre alla dose di 20 e 40 mcg/ml il composto svolge attività citotossica.

Analogamente a quanto evidenziato per le cellule M14, i risultati dell'analisi citofluorimetrica del contenuto di DNA delle cellule marcate con PI mostrano che il C-Res induce un incremento del numero di cellule apoptotiche dipendente dalla dose e dal tempo di esposizione al farmaco (fig 6). I risultati, comunque, indicano una maggiore sensibilità di tali cellule, rispetto alla linea M14, all'effetto apoptotico dei C-Res. infatti la sostanza alla dose di 40 mcg/ml si è dimostrata capace, dopo 72h di incubazione, di indurre l'apoptosi nel 50% delle cellule.

Per quanto concerne l’attività svolta dal C-Res sulla mortalità cellulare (fig 7), i risultati dimostrano che tale attività è correlata al tempo ed alla dose. Esclusivamente per la dose di 40 mcg/ml il plateau viene raggiunto dopo solo 24h di incubazione.

Per quanto riguarda gli effetti sul ciclo cellulare (fig 8), già dopo 24h di incubazione delle cellule PAR-MEL con C-Res ed a partire dalla dose di 5 mcg/ml, si osserva un blocco significativo dei ciclo cellulare a livello G1-S/G2M con conseguente aumento del percento di cellule in fase S ed a dosi più alte in fase G1. Tale blocco rimane costante per le ore successive.

Questi risultati indicano chiaramente che il C-Res è capace di svolgere attività antitumorale nei confronti di cellule appartenenti alla linea di melanoma maligno PAR-MEL resistente ai chemioterapici. Tale attività si esplica in tali cellule attraverso i) l'inibizione dose e tempo di incubazione dipendente della crescita, ii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente dell'apoptosi iii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente della mortalità iiii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente di variazioni nel ciclo cellulare, in particolare l'induzione di un blocco del ciclo cellulare a livello G1 -S/G2M.

Esempio 13

Effetti antitumorali del Cis-Resveratrolo su cellule HT-29 (adenocarcinoma colo-rettale )

Le cellule appartenenti alla linea tumorale (adenocarcinoma colo-rettale) HT-29 sono state incubate per 24, 48 e 72h con 5, 10, 20 e 40 mcg/ml di C-Res. Le curve di crescita della linea cellulare osservate fino a 72 ore dimostrano (fig 9) che il C-Res alle dosi di 20 e 40 mcg/ml induce una inibizione, rispettivamente parziale o completa, delia crescita tumorale, mentre alle dosi di 5 e 10 mcg/ml il C-Res non induce effetti significativi. I risultati dell'analisi citofluorimetrica del contenuto di DNA delle cellule marcate con PI mostrano (fig 10) un'assenza di picchi misurabili di ipodiploidia, e quindi di apoptosi, alla dose di 5 mcg/ml per tutti i tempi di incubazione. Per tutte le altre dosi si registra un incremento dell'effetto correlato al tempo di incubazione.

Per quanto concerne l'attività svolta dal C-Res sulla mortalità cellulare (fig 11 ), i risultati dimostrano che tale attività è correlata al tempo ed alla dose. Per tutte le dosi il picco di attività viene rilevato dopo 48 ore di incubazione.

Per queste cellule gli effetti del C-Res sul ciclo cellulare (fig 12), appaiono solamente dopo 48h di incubazione a partire dalla dose di 10 mcg/ml e consistono in un blocco del ciclo cellulare a livello G1-S/G2M.

Questi risultati indicano chiaramente che il C-Res è capace di svolgere attività antitumorale nei confronti di cellule appartenenti alla linea di adenocarcinoma colo-rettale HT-29. Tale attività si esplica in tali cellule attraverso i) l'inibizione dose e tempo di incubazione dipendente della crescita, ii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente deH'apoptosi iii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente della mortalità iiii) l'induzione dose e tempo di incubazione dipendente di variazioni nel ciclo cellulare, in particolare l'induzione di un blocco dei ciclo cellulare a livello G1-S/G2M.

Esempio 14

Confronto tra l'attività antitumorale del Cis-resveratrolo ( C-Res ) e del trans-rasveratrolo (T-Res)

Le cellule appartenenti alla linea tumorale M14 (melanoma maligno) sono state incubate per 72h con 2,5, 5, 10, 20, e 40 mcg/ml di C-Res o T-Res. I risultati degli esperimenti hanno dimostrato che la concentrazione inibente il 50% della replicazione cellulare (Clso) corrispondeva a 2,7 e 31,6 mcg/ml rispettivamente per il C-Res ed il T-Res (fig 13). L'analisi del ciclo cellulare confermava che già alla dose più bassa il C-Res, ma non il T-Res, era capace di indurre l'accumulo delle cellule nella fase del ciclo G1/S. Questi dati indicano che l'attività specifica del C-Res è circa 12 volte più elevata di quella del T-Res.

Claims (38)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per estrarre da piante spermatofìte prodotti aventi attività farmacologica, in particolare attività antitumorale e proapoptotica, detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che il materiale di partenza, scelto fra frutti, parti aeree, parti sotterranee di dette piante, e relative miscele, viene sottoposto a estrazione in ambiente neutro con un alcool alifatico come solvente, l’estrazione essendo condotta sulla miscela del materiale da estrarre e del solvente, miscela posta sotto agitazione, in atmosfera esente da ossigeno e schermata dalla luce, a temperatura ambiente, con durata dell’estrazione dell'ordine di circa 2-12 ore; l'estratto finale essendo quindi centrifugato, separato dal solido, concentrato sotto vuoto a temperature inferiori ai 45 °C e ripreso con acqua, ottenendosi così un estratto grezzo aquoso, oppure con un solvente scelto fra acetato di etile, acetato di metile, tetraidrofurano e relative miscele, ottenendosi cosi un estratto grezzo in solvente.
2. 2. Metodo secondo la riv. 1 in cui l’estrazione viene condotta con un alcool scelto fra metanolo, etanolo e relative miscele.
3. 3. Metodo secondo la riv. 1 in cui le quantità di alcool variano da 10 a 20 volte in volume rispetto al peso del materiale di partenza.
4. 4. Metodo secondo la riv. 1 in cui l'estrazione è condotta per un tempo dell’ordine di circa 5-120 minuti per materiali di partenza preventivamente liofilizzati e ridotti in polvere.
5. 5. Metodo secondo la riv. 1 in cui il materiale di partenza viene scelto tra materiale fresco, congelato oppure liofilizzato ed eventualmente ridotto in polvere.
6. 6. Metodo secondo )a riv. 1 in cui iì materiale di partenza viene preventivamente sottoposto ad un pre-trattamento di sostanziale eliminazione a freddo dell'acqua per liofilizzazione.
7. 7. Metodo secondo la riv. 1 in cui il materiale di partenza è scelto fra le radici di Polygonum cuspidatum e di Polygonum multiflorum e la corteccia delle radici lignificate del genere Vitis.
8. 8. Procedimento di estrazione secondo le riv. 1-7 condotto su piante del tipo del genere Vitis caratterizzato dal fatto che l'estratto grezzo in solvente viene lavato con acqua saturata con sale inorganico, la corrispondente frazione in solvente viene caricata su una colonna contenente una resina di un polimero a struttura aromatica, si eluisce prima con acqua, poi con una miscela di pentano-metilene cloruro 2:1, infine con un solvente o una miscela di solventi organici di polarità intermedia, aventi forza eluente corrispondente rispetto ad XAD-2, il volume utilizzato di detto solvente a polarità intermedia essendo tale assicurare il recupero quantitativo dalla colonna di una miscela di stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi.
9. 9. Procedimento secondo la riv. 8 in cui il sale inorganico è NaCi.
10. 10. Procedimento secondo la riv. 8 in cui il polimero a struttura aromatica è un copolimero stirene-divinilbenzene, preferibilmente con granulometria compresa tra 0,1 e 0,25 mm.
11. 11. Procedimento secondo la riv. 8 in cui la prima eluizione è effettuata con una quantità d'acqua in volume circa doppio rispetto al volume della frazione in solvente e l’eluizione successiva è effettuata con una miscela di pentano-metilene cloruro 2:1 in volume circa eguale a quello della frazione in solvente.
12. 12. Procedimento secondo la riv. 8 in cui l’eluizione finale con solventi organici di polarità intermedia è condotta con un solvente scelto fra tetraidrofurano, metilene cloruro, etilene cloruro, e relative miscele.
13. 13. Procedimento secondo la riv. 8 in cui i vari componenti della miscela di stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi vengono separati mediante eromatografia liquida ad alta prestazione su colonne di fase inversa con fase fissa a base di silice funzionalizzata con C18 oppure C8 o di polimeri stirenici.
14. 14. Procedimento secondo la riv. 8 in cui i vari componenti della miscela di stilbeni, oligostilbeni e stilbenoidi vengono separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione su colonne di fase inversa con fase fissa RP-18, 10 micron di diametro particelle, eluendo con un gradiente lineare di acqua ed acetonitrile, quest'ultimo dal 30 al 50%.
15. 15. Procedimento di estrazione secondo le riv. 1-7 condotto su piante del genere delle Poligonaceae caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti alternative: - nei caso si vogliano eliminare dall'estratto finale sia i composti II-pofili che quelli idrofili, l'estratto grezzo acquoso viene lavato con un solvente scelto fra metilene cloruro e cloroformio e successivamente viene riestratto in etile acetato e la parte acquosa viene scartata; - nel caso che dall’estratto finale si vogliano ottenere i soli derivati glucosidati, essi vengono ottenuti per precipitazione selettiva a freddo a partire dall'estratto grezzo in solvente utilizzando un solvente apolare, e recuperati per filtrazione; - nel caso che si voglia ottenere una separazione accurata della miscela, si parte dall’estratto grezzo in solvente anidrificato che viene caricato in testa ad una colonna preparativa di silice per cromatografia, impaccata in solvente apolare e in testa alla quale è stato lasciato un volume adeguato di cloroformio, quindi si effettuano due sequenze di lavaggio ed eluzione in serie, con miscele binarie o ternarie di solventi di moderata polarità e solventi forti a forza eluente crescente, per ottenere l’ultima frazione arricchita in derivati stilbenici glucosidati e una frazione intermedia contenente trans-resveratrolo.
16. 16. Procedimento secondo la riv. 15 in cui la colonna preparativa di silice per cromatografia è la Kieselgel 0,05-0,20 mm, impaccata in esano.
17. 17. Procedimento secondo la riv. 15 in cui due le sequenze di lavaggio ed eluzione in serie vengono effettuate con miscele cloroformiometanolo, rispettivamente I (20:1); Il (10:1); III (5:1); IV (2,5:1).
18. 18. Procedimento secondo la riv. 15 in cui i solventi a moderata polarità sono scelti fra solventi clorurati, etere dietilico, tetraidrofurano e relative miscele e i solventi forti sono scelti fra alcoli alitatici, acetonitrile e relative miscele.
19. 19. Processo di isomerizzazione per ottenere isomeri cis- o trans a partire dai corrispondenti isomeri trans- o cis- dei composti ottenuti dal processo secondo le riv. 8 e 15 in cui le miscele comprendenti detti isomeri vengono sottoposte a blando irraggiamento in un intervallo di radiazione dal vicino ultravioletto al visibile.
20. 20. Prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 da utilizzare in campo farmaceutico, detti prodotti essendo costituiti da miscele complesse comprendenti composti aventi nella loro molecola uno o più gruppi stilbenici, variamente idrossilati e/o glucosidati e composti da essi derivati per via biosintetica enzimatica naturale detti stilbenoidi.
21. 21. Prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsìna A e T-Res glucosidati e relative miscele da impiegare in campo farmaceutico.
22. 22. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 in combinazione con adatti eccipienti.
23. 23. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 somministrabili sotto forma di sale, estere, ammide, prodrug o analogo farmacologicamente accettabili o loro combinazioni
24. 24. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 in forma di compresse, supposte, pillole, capsule, polveri, liquidi, sospensioni, creme, unguenti o lozioni.
25. 25. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 somministrabili per via orale, parenterale (iniezione subcutanea, intravenosa, intramuscolare), transdermica, rettale, nasale, boccale, topica o mediante impianto a rilascio controllato.
26. 26. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 per attività antitumorale somministrabili a dosi comprese fra 0,0001 e 20 mg/kg/die del principio attivo.
27. 27. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 ad attività citostatica.
28. 28. Composizioni farmaceutiche comprendenti come principio attivo i composti secondo le riv. 20 e 21 ad attività citotossica.
29. 29. Impiego dei prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività antitumorale.
30. 30. Impiego dei prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività apoptotica.
31. 31. Impiego dei prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 per realizzare composizioni farmaceutiche per l’induzione della mortalità e del blocco del ciclo cellulare di cellule appartenenti a differenti linee tumorali.
32. 32. Impiego dei prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 per realizzare composizioni farmaceutiche per l’induzione della mortalità e del blocco del ciclo cellulare di cellule di melanoma maligno resistenti ai chemioterapici.
33. 33. Impiego dei prodotti ottenuti con il processo secondo le riv. 8 e 15 per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività antitumorale contro l'adenocarinoma colo-rettale.
34. 34. Impiego dei prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati e relative miscele per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività antitumorale.
35. 35. Impiego dei prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati e relative miscele per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività proapoptotica.
36. 36. Impiego dei prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati e relative miscele per realizzare composizioni farmaceutiche per l’induzione della mortalità e del blocco del ciclo cellulare di cellule appartenenti a differenti linee tumorali.
37. 37. Impiego dei prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati e relative miscele per realizzare composizioni farmaceutiche per l’induzione della mortalità e del blocco del ciclo cellulare di cellule di melanoma maligno resistenti ai chemioterapici.
38. 38. Impiego dei prodotti scelti tra: C-Res, C-Res glucosidato, ε-viniferina, gnetina H, r-2-viniferina, r-viniferina, hopeaphenol, Ampelopsina A e T-Res glucosidati e relative miscele per realizzare composizioni farmaceutiche ad attività antitumorale contro l’adenocarinoma colorettale.