ITNA20090047A1 - Agenti antitumorali con attività inibitoria di proteine di prenilazione, processo di preparazione e impieghi in campo medico - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione avente per TITOLO: “Inibitori di proteine di premiazione come agenti antitumorali: processo di preparazione ed impieghi in campo medico”,

composti della presente invenzione, non limitati a quelli indicati negli esempi, sono utili per il trattamento del cancro causato o aggravato dalla sovraespressione di Ras e di altre proteine di famesilazione. Approssimativamente il 25% di tutti i tumori umani è dovuto a geni mutanti che codificano forme mutanti (H-/Ras, K -Ras, N -Ras) di una proteina nota come Ras. Questa proteina è sovraespressa nello sviluppo di numerosi tumori maligni, [a) Rodenhuis, ras and human tumore, Semin Cancer Biol 3 (1992), pp. 241-247. b) J.L. Bos, ras oncogenes in human cancer: a review, Cancer Res 49 (1989), pp. 4682-4689.] Casistiche riguardanti adenocarcinomi del colon, del pancreas e del polmone riportano alterazioni di K-ras fino al 90%, con implicazioni fondamentali nei processi di tumorigenesi. Il concetto fondamentale è che le oncoproteine Ras attivate sono in grado di eludere il controllo inibitorio delle guanosintrifosfatasi (GTPasi). Le cellule tumorali rimangono così in un perenne stato proliferativo. Per indurre la divisione cellulare, Ras deve essere localizzata sulla superficie interna della membrana delle cellule cancerose. Questa allocazione di Ras sulla membrana è dovuta al legame di un gruppo idrofobico, principalmente il famesolo, ma anche il geranilgeranile. In entrambi i casi, il gruppo idrofobico si lega a Ras per via enzimatica in un processo noto come prenilazione. Pertanto, interferire con la prenilazione di Ras può prevenire la allocazione di Ras sulla superfìcie interna della membrana cellulare tumorale con conseguente blocco della divisione cellulare incontrollata e/o ritorno della cellula cancerosa al fenotipo normale [a) M.S. Boguski et al. Proteine regulating Ras and its relatives, Nature 366 (1993), pp. 643-654. b) R. Khosravi-Far et al. Protein prenylation: key to ras function and cancer intervention?, Celi Growth Differ 3 (1992), pp. 461-469.]. L’enzima che lega il gruppo prenile a Ras, RhoB ed altre proteine per facilitarne l’adatta allocazione nella cellula è la proteina famesil transferasi (riferita qui come FTasi). Il gruppo prenile si lega a Ras, RhoB e ad altre proteine per reazione con il famesildifosfato, anche noto come famesil pirofosfato (qui riferito come FPP). In altre parole, la FTasi catalizza la reazione illustrata sotto per la proteina Ras, nella quale la proteina si lega al gruppo famesile [a) End D.W. et al. Famesyl protein transferase inhibitors: molecular mechanisms and progress in thè clinic. Top Med Chem (2007) 1: 133-168. b) D.W. End et al. Famesyl protein transferase inhibitors and other therapies targeting thè Ras signal transduction pathway, Invest New Drugs 17 (1999), pp. 241-258. c) E.K. Rowinsky et al. Ras protein famesyltransferase: A strategie target for anticancer therapeutic development, J Clin Oncol 17 (1999), pp. 3631— 3652.] per spostamento del gruppo pirofosfato (P207<4'>, riferito qui come PP,):

FTasi

Ras FPP ...→ ... farnesi PP,

Ciò detto, l’enzima FTasi è un bersaglio chiave nella strategia che tende a ritardare la proliferazione cellulare. Mediante la regolazione dell’attività della FTasi, la famesilazione di Ras, la famesilazione e geranilgeranilazione di RhoB e la premiazione di altre proteine possono essere controllate. Questo può anche alterare la distribuzione intracellulare di queste proteine e, a sua volta, prevenire la proliferazione delle cellule cancerose.

Molte sostanze sono note per bloccare l’attività della FTasi e prevenire la famesilazione di proteine cellulari. Queste includono inibitori della i) FTasi (FTI), che generalmente agiscono bloccando il legame delle proteine che devono essere premiate, ii) FPP o iii) entrambi, nel sito attivo della FTasi. Senza la capacità dei normali substrati (ad es. Ras ed FPP) di legarsi alla FTasi, questo enzima non può provvedere al trasferimento del gruppo famesile da FPP a Ras. In generale, gli inibitori strutturalmente mimano uno o entrambi i substrati naturali dell’enzima, in questo caso Ras e/o FPP.

Poiché il processo di famesilazione risulta fondamentale nell'attività delle oncoproteine Ras, l'inibizione specifica della FTasi è una strategia terapeutica potenzialmente efficace. Inoltre permetterebbe di agire con le funzioni delle cellule tumorali senza influenzare le cellule normali. Attualmente esistono anche convincenti evidenze che mostrano che l’inibizione della premiazione di Ras può non essere necessaria per ottenere gli effetti antineoplastici da parte degli FTI. Infatti, altre proteine famesilate coinvolte nella trasformazione neoplastica, come la proteina RhoB, le fosfatasi PRL-1, 2, 3, rap 2, laminina A e B e le proteine centromeriche CENP-E/CENP-F, possono essere anche importanti target per gli effetti antitumorali degli FTI [a) Pan J, et al. Recent advances in understanding thè antineoplastic mechanisms of famesyltransferase inhibitors. Cancer Res.

2005; 65: 9109-12. b) Jiang K et al. The phosphoinositide 3-OH-kinase/AKT2 pathway as a criticai target for amesyltransferase inhibitor-induced apoptosis. Mal Celi Biol 2000; 20: 139-148.]. Infatti, è stato osservato che nelle cellule trattate con FTI ha luogo l’accumulo di RhoB geranilgeranilato, il quale induce l’apoptosi delle cellule. [Prendergast, G. C. et al. Famesyltransferase inhibitors: antineoplastic properties, mechanisms of action, and clinical prospects. Semin Cancer Biol, 10: 443-452., 2000]. In altri modelli cellulari, gli FTI inibiscono il pathway della chinasi PI-3. [Pio, I., et al. The phosphoinositide 3-kinase/Alct pathway is activated by daunorubicin in human acute myeloid leukemia celi lines. FEBS Leti, 452 : 150-154., 1999]. Recentemente, abbiamo indagato gli effetti citotossici di vari inibitori della FTasi, incluso Lonafamib (SCH66336), nelle cellule di leucemia mieloide acuta (AML) e cronica (CML). Gli effetti citotossici osservati furono correlati all’aumento dell’apoptosi Inoltre FTI attivarono la caspasi 3 lasciando inalterate le caspasi 1 ed 8 e contribuirono ad innalzare l’espressione dell’mRNA dell’inducibile sintasi dell’ossido nitrico (iNOS) con conseguente innalzamento della produzione di ossido nitrico (NO). Pertanto, concludemmo che gli FTI potevano indurre apoptosi selettiva nelle cellule CML ed AML attraverso l’attivazione di iNOS e caspasi-3 [a) Sederi C. et al. Involvement of nitric oxide in faesyltransferase inhibitor-mediated apoptosis in chronic myeloid leukemia cells. Blood. 2003; 102: 1490-8. b) Sederi C. et al. Famesyltransferase inhibitors induce apoptosis in acute myeloid leukemia cells via activation of inducible nitric oxide synthase and caspase-3 without Fas, BCL-2 and P53 modulation. Haematologica. 2003; 88 (Suppl n.15), 177.]. In conclusione, su 4 molecole inizialmente sviluppate da diverse aziende farmaceutiche (Johnson & Johnson e Schering Ploughs) con l'obiettivo di inibire tra cui Tipifamib (Zamestra®, RI 15777) [a) D.W. End et al., Characterization of thè Ìtitumor effects of thè selective famesyl protein transferase inhibitor RI 15777 in vivo and in vitro, Cancer Res 61 (2001), pp. 131-137. b) A.D. Cox et al. Famesyltransferase inhibitors: promises and realities, Curr Opin Pharmacol 2 (2002), pp. 388-393.] e Lonafamib (Sarasar®, SCH 6336) [a) E.J. Feldman, Famesyltransferase inhibitors in myelodysplastic syndrome, Curr Hematol Rep 4 (2005), pp. 186-190. b)_A.K. Ganguly et al. Famesyl protein transferase inhibition: a novel approach to anti-tumor therapy. thè discovery and development of SCH 66336, Curr Med Chem 8 (2001), pp. 1419-1436.], nessuna ha superato la sperimentazione clinica a causa dei loro effetti avversi e del meccanismo d’azione non chiarito. Pertanto, resta aperto uno spazio di indagine in questo campo nel quale si colloca lo sviluppo dei prodotti di questa invenzione.

La presente invenzione ha per oggetto i composti di formule generali (I) e (II) e tutti i loro possibili derivati (vedi Tavola 1 allegata), che inibiscono la prenilazione di Ras. Ri è selezionato dal gruppo che consiste di alchili saturi lineari, ramificati, ciclici e policiclici, insaturi lineari, ramificati, ciclici e policiclici, ed alchilarilici; R2è selezionato dal gruppo che consiste di esteri alchilcarbonilossi, dimetilaminoalchili, arili, alchilarili, arileterocicli, arilarili, ed amminoarili; X è selezionato dal gruppo che consiste di O, S ed NH.

Come è riportato nei casi specifici, i seguenti termini hanno i significati indicati:

Il termine “alchile” identifica essenzialmente un gruppo monovalente derivato da una catena idrocarburica satura lineare o ramificata per rimozione di un singolo atomo di idrogeno.

Il termine “cicloalchilalchile”, usato qui, si riferisce ad un sistema ciclico a sei termini non-aromatico legato a ponte con un ulteriore ciclo sostituito da alchili.

termine “alchenile”, usato qui, si riferisce ad un gruppo alchilico, come definito sopra, cntenente uno o più doppi legami carbonio-carbonio.

termine “carbonilossi”, usato qui, si riferisce ad un estere, dove il gruppo alcanoile è legato al raggruppamento molecolare parente mediante un atomo di ossigeno di un gruppo alchilossi.

Il termine “amino sostituito”, usato qui, si riferisce sia a mono che a di-sostituiti gruppi amminici. Questi termini, da soli o in combinazione, illustrano un radicale di formula -NR’R”, dove nel caso della monosostituzione uno dei due R è idrogeno e l’altro può essere selezionato fra gli alchili, cicloalchili, arili eterocicli, (aril)alchili, (eterociclo)alchili, eteroarili ed etero(aril)alchili; nel caso della di-sostituzione, R’ ed R” sono indipendentemente selezionati fra alchili, cicloalchili, arili, eterocicli ed, eteroarili.

Il termine “arilico”, usato qui, si riferisce ad un sistema monociclico aromatico, fenilico o piridinico, un sistema biciclico o triciclico condensato. Il gruppo arilico di questa invenzione può essere opzionalmente sostituito con uno o più sostituenti selezionati tra gruppi alchilici, alogeni, trifluorometile, nitro, ciano, metossi e un addizionale gruppo fenilico o piridinico.

Il termine “alogeno”, usato qui, rappresenta fluoro, clóro, bromo e iodio.

Il termine “(aril)alchilico”, usato qui, si riferisce ad un gruppo arilico legato al raggruppamento molecolare parente attraverso un gruppo alchilico, come definito sopra. Il termine “eterociclo”, usato qui, si riferisce ad un anello a cinque ed a sei termini contenente uno, due o tre eteroatomi (azoto, ossigeno e zolfo). Esempi rappresentativi di eterocicli includono morfolina, piperidina, piperazina e metilpiperazina. I gruppi eterociclici della presente invenzione possono sostituire un idrogeno su un atomo di carbonio del gruppo fenilico legato al raggruppamento molecolare parente.

Il termine “fenilaminico”, usato qui, si riferisce ad un gruppo fenilico legato al raggruppamento molecolare parente attraverso un gruppo amminico secondario (idrazina). Il gruppo fenilico di questa invenzione può essere opzionalmente sostituito con uno o più sostituenti selezionati tra gruppi alchilici, alogeni, trifluorometile, nitro, ciano e metossi. Come inibitori della prenilazione di Ras, questi composti sono utili nel trattamento di tumori solidi primari e metastatici come carcinoma della mammella, colon, retto, polmone; orofaringe; ipofaringe, esofago, stomaco, pancreas, fegato, cistifellea, dotti biliari; piccolo intestino; del tratto urinario (reni, vescica, e uretere); genitale femminile (cervice uterina, utero e ovaie); tratto genitale maschile (prostata, vescicole seminali, e testicoli); ghiandole endocrine (tiroide, surrene, e ghiandola pituitaria); pelle (emangiomi, melanomi e sarcomi), tumori del cervello, nervi, ed occhi; meningi (astrocitomi, gliomi, glioblastomi, retinoblastomi, neuromi, neuroblastomi, meningiomi); tumori solidi derivanti da neoplasie ematopoietiche (leucemie e cloromi); plasmacitomi; placche; tumori di micosi fungoidi; linfomi/leucemie cutanee di cellule T, linfomi di Hodgkin, compresi i linfomi non-Hodgkin; profilassi di malattie autoimmuni (artrite reumatoide, artrite degenerativa e immunitaria); malattie oculari (retinopatia diabetica, retinopatia di prematurità, rigetto del trapianto di cornea, fìbroplasia retrolentale, glaucoma neovascolare, rubeosi, neovascolarizzazione della retina a causa di degenerazione maculare, ed ipossia), malattie della pelle (psoriasi, emagiomi e proliferazione capillare nelle placche aterosclerotiche). In base ai metodi di trattamento, i composti della presente invenzione possono essere utili anche per la prevenzione di metastasi tumorali, se usati da soli o in combinazione con radioterapia e/o altri trattamenti chemioterapici convenzionali somministrati ai pazienti per il trattamento del cancro. Quando si utilizzano i composti della presente invenzione per la chemioterapia, la dose efficace terapeutica specifica per ogni paziente dipenderà da fattori quali la malattia in trattamento e la gravità della malattia; l'attività del particolare composto lato ; la composizione specifica usata; l'età, il peso corporeo, la salute in generale, il sesso, e la dieta del paziente, il tempo di somministrazione, la via di somministrazione; la velocità di escrezione del composto usato; la durata del trattamento; e i farmaci utilizzati in combinazione con o contemporaneamente con i composti utilizzati. Ad esempio, quando un composto della presente invenzione viene utilizzato nel trattamento di tumori solidi, esso può essere somministrato con agenti chemioterapici, quali alfa inteferon, COMP (ciclofosfamide, vincristina, metotressato, e prednisone), etoposide, mBACOD (metortressato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamide, vincristina e desametasone), PRO-MACE/MOPP (prednisone, metotressato, doxorubicina, ciclofosfamide, taxolo, etoposide/mecloretamina, vincristina, prednisone e procarbazina), vincristina, vinblastina, angioinibine, TNP-470, pentosan polisolfato, fattore piastrinico 4, angiostatina, LM-609, SU-101, CM-101, Tecgalan, talidomide, SP-PG, e simili. Ad esempio, un tumore può essere trattato convenzionalmente mediante chirurgia, radiazioni o chemioterapia ed, in aggiunta, con un composto della presente invenzione per estendere la dormienza delle micrometastasi, stabilizzare ed inibire la crescita di qualsiasi residuo del tumore primario. I composti della presente invenzione possono essere somministrati per via orale, parenterale, osmotica (spray nasale), rettale, vaginale, o topica per formulazioni contenenti camers, coadiuvanti, diluenti, veicoli, o una loro combinazione. Il termine "parenterale" comprende l'infusione e l’iniezione sottocutanea, endovenosa, intramuscolare, ed intrastemale.

Sospensioni acquose o oleose dei composti della presente invenzione somministrate per via parenterale possono essere formulate con agenti di dispersione, bagnanti o di sospensione. La preparazione iniettabile può essere anche una soluzione iniettabile o sospensione in un diluente o solvente. Tra diluenti o solventi accettabili utilizzati vi sono acqua, soluzione fisiologica, soluzione di Ringer, tamponi, acidi diluiti e basi, soluzioni diluite di aminoacidi, monogliceridi, digliceridi, acidi grassi come l’acido oleico, e oli fissi c monogliceridi o digliceridi.

L'effetto chemioterapeutico di composti somministrati per via parenterale può essere prolungato rallentando il loro assorbimento. Un modo per rallentare l'assorbimento di un particolare composto è la somministrazione forme depot iniettabili comprendenti sospensioni di forme del composto cristallino, amorfo, o insolubile in acqua. Il tasso di assorbimento del composto dipende dalla sua velocità di dissoluzione, che è, a sua volta, dipendente dal suo stato fisico. Un altro modo per rallentare l'assorbimento di un particolare composto è la somministrazione di forme depot iniettabili comprendenti il composto come soluzione oleosa o in sospensione. Ancora un altro modo per rallentare l'assorbimento di un particolare composto è la somministrazione di forme depot iniettabili comprendenti matrici di microcapsule del composto intrappolato all'interno di liposomi, microemulsioni, o polimeri biodegradabili come polilattide-poliglicolide, poliortoesteri o polianidridi. A seconda del rapporto del farmaco con il polimero e la composizione del polimero, il tasso di rilascio di farmaco può essere controllato.

Anche i cerotti transdermici consentono la distribuzione controllata dei composti. Il tasso di assorbimento può essere rallentato usando membrane che controllano la velocità o catturando il composto in una matrice polimerica o gel. Al contrario, possono essere utilizzati promotori dell’assorbimento, i cosiddetti enhancers, per aumentare l'assorbimento.

Le forme solide per la somministrazione orale comprendono capsule, compresse, pillole, polveri e granuli. In queste forme solide, il composto attivo può opzionalmente comprendere diluenti come saccarosio, lattosio, amido, talco, acido silicico, idrossido di alluminio, silicati di calcio, polvere di poliammide, lubrificanti ed eccipienti come magnesio stearato o cellulosa microcristallina. Capsule, compresse e pillole possono comprendere anche agenti alcalini e compresse e pillole possono essere preparati con rivestimenti enterici o altri rivestimenti che controllano il rilascio. Polveri e spray possono anche contenere eccipienti come talco, acido silicico, idrossido di alluminio, silicato di co, poliammide in polvere, o loro miscele. Gli sprays possono inoltre contenere propellenti come clorofluoroidrocarboni o succedanei.

Forme liquide di dosaggio per la somministrazione orale includono emulsioni, microemulsioni, soluzioni, sospensioni, sciroppi, elisir comprendenti diluenti inerti come l'acqua. Queste composizioni possono comprendere anche coadiuvanti come bagnanti, emulsionanti, sospensioni, dolcificanti ed aromi.

Forme di dosaggio topiche comprendono unguenti, paste, creme, lozioni, gel, polveri, soluzioni, spray, inalanti, e cerotti transdermici. Il composto viene miscelato in ambiente sterile con un vettore e gli eventuali tamponi e conservanti necessari. Queste forme di dosaggio possono includere anche eccipienti, come grassi animali e vegetali, oli, cere, paraffine, amido, tragacanth, derivati della cellulosa, polietilene glicoli, siliconi, bentoniti, idrotalciti, acido silicico, talco e ossido di zinco, o loro miscele. Supposte per somministrazione rettale o vaginale possono essere preparate mescolando i composti della presente invenzione con un opportuno eccipiente non irritante come burro di cacao o polietilene glicole, ciascuno dei quali è solido a temperatura ordinaria, ma fluido in vagina o nel retto. Formulazioni oftalmiche comprendenti colliri, pomate oftalmiche, polveri, e soluzioni sono anche contemplate nello scopo della presente invenzione.

La dose giornaliera totale dei composti della presente invenzione somministrata ad un paziente in dose singola o dosi suddivise può essere in quantità compresa tra circa 0,1 e circa 200 mg/kg di peso corporeo o, preferibilmente, tra circa 0,25 e circa 100 mg/kg di peso corporeo.

I composti riportati in questa invenzione sono stati testati per l’attività antiproliferativa su due linee cellulari leucemiche, K562 ( human erythroid leukemia celi line ) e KGla (human myeloid celi line), secondo il Celi Titer Aqueous One Solution Proliferation Assay Promega, Madison, WI), un metodo colorimetrico che consente di determinare il numero di cellule vitali in saggi di proliferazione. Il metodo prevede l’uso di [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolo] (MTS) e di fenazina etosolfato (PES), un reagente ad accoppiamento elettronico. L’MTS viene ridotto dalle cellule in un prodotto colorato, solubile nel mezzo di coltura cellulare. Tale riduzione è mediata da NADPH o NADH prodotti dagli enzimi deidrogenasi in cellule metabolicamente attive. Il saggio è eseguito aggiungendo una piccola quantità di Celi Titer Aqueous One Solution Reagent direttamente alle piastre cellulari, incubando per 2 ore (37 °C, 5% C02) e poi leggendo l’assorbanza a 490 nm ad un lettore ELISA. Il valore di densità ottica (O.D.) letto è direttamente proporzionale al numero di cellule vive presenti sulla piastra. Il valore di O.D. del campione non trattato (campione a cui non è stato aggiunto nessun IFT) rappresenta il 100% di proliferazione. Quindi, si calcola il rapporto tra il valore di O.D. dei vari campioni ed il valore di O.D. del 100% di proliferazione per ottenere la misura della riduzione della proliferazione di ogni campione rispetto al 100% di proliferazione.

L'ffetto di alcuni composti rappresentativi della presente invenzione, misurato come percentuale di inibizione della vitalità cellulare, è riportato in Tabella 1 (vedi Tavola 1 allegata).

L’effetto antiproliferativo degli esempi 1 e 2 sulle linee cellulari K562 e KG la potrebbe essere dovuto all’induzione di apoptosi. L’analisi di DNA a basso peso molecolare estratto dalle cellule KGla e K562 fatte crescere in presenza degli esempi 1 e 2 ha mostrato una degradazione del DNA nucleosomale rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio carat dell’apoptosi. La citometria a flusso sul DNA proveniente dalle cellule KG la esposte a 1 e 2, eseguita mediante colorazione con ioduro di propidio (PI) ed essina V (AnnV), ha confermato che questi composti innalzano fortemente l’apoptosi delle cellule KGla e K562, come illustrato in Tabella 2 (vedi Tavola 1 allegata).

La traslocazione dell’antigene lipidico fosfatidilserìna sul lato esterno della membrana plasmatica rappresenta un evento precoce dell'apoptosi e si manifesta quando la cellula conserva ancora la sua integrità cellulare. L’annexina V (AnnV) è una proteina che presenta un'alta affinità per la fosfatidilserìna e viene quindi utilizzata come probe per iconoscere queste cellule. L’uso di questa proteina ci permette di riconoscere Tapoptosi ad uno stadio più precoce. Altri metodi sono basati su variazioni più tardive della cellula, ad esempio a livello nucleare, con la frammentazione di DNA. L'esposizione all'esterno della fosfatidilserìna non è un evento esclusivo dell'apoptosi, ma anche di un' altra forma di morte cellulare, la necrosi, dove le cellule hanno perso la loro integrità cellulare e sono diventate permeabili a coloranti vitali come lo ioduro di propidio (PI). L'uso combinato di annexina V coniugata al fluorocromo FITC (fluoresceinisotiocianato) e ioduro di propidio ci permette, in citofluorimetria, di discriminare tra cellule in apoptosi allo stadio iniziale (AnnV+/PI-), cellule in necrosi o apoptosi allo stadio finale (AnnV+/PI+) e cellule vive (AnnV-/PI-). Le percentuali indicate in Tabella 2 (vedi Tavola 1 allegata) si riferiscono alla prima popolazione calcolata sul totale degli eventi cellulari acquisiti.

Gli esempi 1 e 2 sono stati testati con la metodologia sopra riportata anche su cellule mononucleari del midollo osseo (BMMNC) di sei leucemie mieloidi acute oltre che su quelle di un donatore sano. Come illustrato nella Figura 1 (vedi Tavola 1 allegata), gli esempi 1 e 2 mostrano di non inibire la proliferazione delle cellule normali, ad una concentrazione inferiore a 10<-4>, mentre inibiscono fortemente la proliferazione delle cellule cancerose.

Sulla base dei risultati ottenuti dai riportati esperimenti, sono stati selezionati i tempi e le concentrazioni opportune degli esempi 1 e 2 ai quali effettuare i saggi di determinazione ell’attività di Ras. A tale scopo è stato utilizzato il Ras activation assay (Upstate), che utilizza il metodo Pull-Down, una tecnica che consente di verificare l'interazione fra due proteine. Si utilizza una proteina con un tag (ad es. GST, His6, biotina, etc.) detta bait (esca) per legare e “tirare giù” (“pull-down”) una proteina partner (prey = preda), che è uella di cui si vuole verificare l’interazione con la proteina esca. In questo caso la proteina utilizzata come esca è il dominio di Raf-1 in grado di legare Ras. La proteina Raf-1 presenta un tag di GST (glutatione S-transferasi) ed è legata ad una resina (glutatione agarosio). Le cellule K562 sono state incubate con gli esempi selezionati (1 e 2) alle concentrazioni che avevano dato i migliori risultati nel saggio di proliferazione. A 48 ore le cellule sono state raccolte e Usate. Il Usato cellulare è stato quindi incubato con la proteina esca (Raf-1) per 45 minuti in agitazione lenta, per consentire alla proteina preda (Ras) di legarsi alla proteina esca. I complessi “proteina esca-proteina preda” che si sono formati sono stati recuperati e analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) . Dopo la corsa elettroforetica le proteine sono state trasferite su una membrana di polivinildenfluoruro (PVDF), incubata successivamente con un anticorpo primario AntiRas (over night). Il giorno successivo, la membrana è stata incubata con un anticorpo secondario, diretto contro l’anticorpo primario e coniugato ad una perossidasi. La membrana è stata quindi bagnata con un reagente contenente luminolo che consente la detection. La perossidasi (legata al complesso anticorpo primario-anticorpo secondario) causa l’ossidazione del luminolo con conseguente emissione di luce, che va ad impressionare una lastra autoradiografica, formando delle bande. Le 2 bande indicate sulla lastra in Figura 2 (vedi Tavola 1 allegata) rappresentano Ras attivata, mentre NT è il campione non trattato. I campioni con gli esempi 1 (ΚΓ<6>M) e 2 (IO<'12>M) mostrano una forte inibizione dell’attività di Ras.

I composti della presente invenzione possono essere di fonte commerciale o preparati Attraverso metodi riportati in letteratura e ben noti all’esperto del ramo. Un metodo alternativo di sintesi dei composti di formula generale (I) e (II) (vedi Tavola 1 allegata) è stato realizzato nella presente invenzione allo scopo di facilitare la procedura sintetica e migliorare le rese di reazione (vedi schema 1 e 2 nella Tavola 2 allegata). Lo Schema 1 mostra la sintesi alternativa dei composti di formula (I). II composto di formula (1) è trattato con il furano (4), in soluzione organica per fornire il composto di formula (5) attraversounareazione di Dies-Alder. Esempi di solventi usati in questa reazione includono Acetone, Benzene, Toluene ed Etere etilico. La reazione è condotta a temperatura variabile tra 50 e 25 °C per un tempo che va da 6 ore a tre giorni. Il composto di formula (5) viene fatto reagire con opportune animine, composti di formula (2), per fornire i composti di formula (8). Esempi di solventi usati in questa reazione includono Benzene, Toluene, Etere etilico ed acetone. La reazione è condotta a temperatura variabile tra 50 e 25 °C per un tempo che va da 6 ore a tre giorni. I composti di formula (8) possono essere convertiti ai composti di formula (9) per disidratazione con anidride acetica e neutralizzazione con acetato di sodio. La reazione è di solito condotta a circa 50 °C per 2 ore. I composti di formula (9) possono essere convertiti nei composti di formula (I) per riscaldamento in Toluene a riflusso attraverso una reazione di retro Dies-Alder. Lo Schema 2 mostra una sintesi alternativa per alcuni dei composti di formula (II). I composti di formula (10) possono essere trattati con opportuni eterocicli, composti di formula (4) (dove X = O, NH, S), in soluzione organica per fornire i composti di formula (11) attraverso una reazione di Dies-Alder. Esempi di solventi usati in questa reazione includono Benzene, Toluene ed Etere etilico. La reazione è condotta a temperatura variabile tra 80 e 25 °C per un tempo che va da 6 ore a tre giorni. I composti di formula (11) possono essere fatti reagire con opportuni alchilcloruri, composti di formula (12), in presenza di basi, per i composti di formula (II). Esempi di solventi usati in questa reazione includono e, Toluene, Etere etilico ed acetone. La reazione è condotta a temperatura variabile 25 °C per un tempo che va da 6 ore a tre giorni,

presente invenzione verrà ora descritta insieme con alcune realizzazioni che non ne limitano lo scopo. Invece, la presente invenzione copre tutte le alternative, le modifiche e somiglianze che possono essere comprese nella finalità di queste rivendicazioni. Così, i seguenti Esempi, che includono le migliori realizzazioni, illustreranno la migliore pratica della presente invenzione, tenendo presente che gli Esempi hanno lo scopo di illustrare certe particolari realizzazioni e di fornire ciò che si pensa sia la più utile e facilmente coensibile descrizione delle procedure e degli aspetti concettuali. I composti dell’invenzione sono stati nominati utilizzando ChemBioDraw Ultra versione 11.0 (sviluppato da CambridgeSoft, Cambridge CB5 8LA UK). Gli spettri 1H-NMR sono stati registrati con un Bruker-500 spectrometer, mentre gli spettri di massa sono stati ottenuti usando un EI a 70 eV su un ZAB 2F spectrometer, e sono qui sotto riportati per illustrare ulteriormente gli Esempi dell’invenzione.

ESEMPIO 1

1 -(( 1 R,2S,3 S,5 S)-2,6,6-trimetilbiciclo[3.1.1 ]eptan-3 -il)- 1 H-pirrolo-2,5-dione Ad una soluzione di anidride maleica (1 mmol) in benzene (10 mi) si aggiunge goccia a goccia una soluzione di furano (1 mmol) in benzene (10 mi) a temperatura ambiente sotto agitazione per tre giorni. La miscela viene portata a secco, a 25 °C e a pressione ridotta, e il residuo lavato con etere etilico. Il solido bianco separato per filtrazione viene dissolto in acetone e addizionato goccia a goccia di una soluzione di (lR,2S,3S,5S)-2,6,6-trimetilbiciclo[3.1.1]eptan-3-ammina (Immole in 5 mi di acetone) sotto agitazione. Dopo 24 ore, la soluzione viene portata a secco sotto vuoto a pressione ridotta ed il solido grezzo dissolto in 10 mi di anidride acetica. La soluzione agitata per 2 ore, diluita con acqua, estratta con toluene e riscaldata a riflusso per 2 ore, fornisce il composto grezzo L<,>Esempio 1 che viene purificato per cromatografia su gel di silice (TLC o colonna eluee cloroformio-metanolo 80:20 w). Resa 75 %. MS (EI) m/z 233; ’H NMR (CDCI3) 2H, s), 3.58 (IH, dd), 2.24 (IH, m), 1,67-1,53 (2H, m), 1.49 (IH, m), 1,24 (IH, m), ,43 (2H, m), 1,02 (6H, s). Anal. Cale. Ci4H19N02, C, 72.07; H, 8.21; N, 6.00; Trovato C, 72.12; H, 8.19; N, 6.04.

ESEMPIO 2

2-(4-morpholin-4-ylphenyl)-3a,4,7,7a-tetrahydro-l/7-4,7-epoxyisoindole-l,3-dione Ad una soluzione di maleimmide (1 mmol) in benzene (10 mi) si aggiunge goccia a goccia una soluzione di furano (1 mmol) in benzene (10 mi) a temperatura ambiente sotto agitazione per tre giorni. La miscela viene portata a secco, a 25°C e a pressione ridotta, e il residuo lavato con etere etilico. Il solido bianco separato per filtrazione viene dissolto in acetone e addizionato goccia a goccia di una soluzione di 4-(4-clorofenil)morfolina (Immole in 5 mi di acetone e due gocce di trietilammina) sotto agitazione. Dopo 24 ore, la soluzione viene portata a secco sotto vuoto a pressione ridotta ed il solido grezzo, dissolto in cloroformio, è lavato con acqua. La fase organica, portata a secco, fornisce il composto grezzo dell’Esempio 2 che viene purificato per cromatografia su gel di silice (TLC o colonna eluente cloroformio-metanolo 70:30 w). Resa 65 %. MS (EI) m/z 326; 1H NMR (CDCI3) 7,10 (2H, d), 7,03 (2H, d), 5,78 (2H, d), 4.62 (2H, dd), 3,65 (4H, m), 3,18 (4H, m), 3, 07 (2H, d). Anal. Cale. CI8HI8N204, C, 66.25; H, 5.56; N, 8.58; Trovato C, 66.40; H, 5.52; N, 8.61.

ESEMPIO 3

1 -butil- 1 H-pirrolo-2,5-dione

Il prodotto desiderato è stato preparato a partire da anidride maleica e butan-l-ammina.

80%. MS (EI) m/z 153; 1H NMR (CDCI3) 6.98 (2H, s), 4.45 (2H, dd), 1.52 (2H, p), 1, 33 (2H, m), 1.02 (3H, t). Anal. Cale. C8HnN02C, 62.73; H, 7.24; N, 9.14; Trovato C, 62.75; H, 7.21; N, 9.16.

ESEMPIO 4

1 -dodecil- 1 H-pirrolo-2,5 -dione

Il prodotto desiderato è stato preparato a partire da anidride maleica e dodecan-1-ammina. Resa: 78%. MS (EI) m/z 265; 1H NMR (CDC13) 6.98 (2H, s), 4.39 (2H, t), 1.63 (2H, m), 1, 31 (16H, m), 0.91 (3H, t). Anal. Cale. Ci6H27N02C, 72.41; H, 10.25; N, 5.28; Trovato C, 72.50; H, 10.23; N, 5.26.

ESEMPIO 5

(£)-l-(eptadec-8-enil)-lH-pirrolo-2,5-dione

Il prodotto desiderato è stato preparato a partire da anidride maleica e (£)-eptadec-8-en-1 -ammina. Resa: 69%. MS (EI) m/z 333; *H NMR (CDC13) 6.98 (2H, s), 5,45 (2H, s), 4.41 (2H, t), 2,20 (4H, dt), 1.63 (2H, m), 1, 31 (18H, m), 0.91 (3H, t). Anal. Cale. C2iH35N02C, 75 63; H 10 58; N 420; Trovato C 7567; H 1061; N, 4.18.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI dell’invenzione avente per TITOLO: “Agenti antitumorali con attività inibitoria di proteine di prenilazione, processo di preparazione e impieghi in campo medico”, Si rivendica: 1. L’applicazione dei composti di formula generale (I) (vedi Tavola 1 allegata) come nuovi agenti antitumorali.
2. 2. L’applicazione dei composti di formula generale (II) (vedi Tavola 1 allegata) come nuovi genti antitumorali.
3. 3. I composti come definiti nella rivendicazione 1 come inibitori della prenilazione di Ras e di altre proteine.
4. 4. I composti come definiti nella rivendicazione 2 come inibitori della prenilazione di Ras e di altre proteine.
5. I composti definiti nelle rivendicazioni 1 e 2 come inibitori della proliferazione delle cellule tumorali e non delle cellule normali, alla concentrazione citotossica.
6. 6, Un processo per sintetizzare i composti di formula (I), secondo lo Schema 1 (vedi Tavola 2 allegata) illustrato nell’Esempio 1.
7. 7. Un processo per sintetizzare i composti di formula (II), secondo lo Schema 2 (vedi Tavola 2 allegata) illustrato nell’Esempio 2.
8. 8. Uso dei composti come definiti nelle rivendicazioni 1 e 2 come agenti terapeuticamente attivi.
9. 9. Uso dei composti come definiti nelle rivendicazioni 1 e 2 nella preparazione di un medicamento utile nella terapia antitumorale.
10. 10. Una composizione farmaceutica utile per combattere il tumore e le sue metastasi, che contiene una quantità terapeuticamente efficace di almeno uno dei composti come definiti nelle rivendicazioni 1 e 2, in unione con almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.