ITMI971825A1 - MONOCLONAL CATALYTIC ANTIBODIES FOR THE IN VIVO TRANSFORMATION OF CORTICOSTEROID PRODUCTS - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "ANTICORPI MONOCLONALI CATALITICI PER LA TRASFORMAZIONE IN VIVO DI PROFARMACI DI CORTICOSTEROIDI" Description of the industrial invention entitled: "CATALYTIC MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE IN VIVO TRANSFORMATION OF CORTICOSTEROID PROPHARMACES"
La presente invenzione si riferisce ad anticorpi monoclonali catalitici, di seguito definiti abzimi, utili per la trasformazione in vivo di profarmaci di corticosteroidi e il loro uso nella preparazione di medicamenti utili per il trattamento dell'insufficienza adrenocorticale acuta. La presente invenzione si riferisce anche a dei procedimenti per la preparazione di detti abzimi. The present invention relates to catalytic monoclonal antibodies, hereinafter defined as abzymes, useful for the in vivo transformation of corticosteroid prodrugs and their use in the preparation of drugs useful for the treatment of acute adrenocortical insufficiency. The present invention also refers to processes for the preparation of said abzymes.
Sfondo,dell'invenzione Background, of the invention
L'insufficienza adrenocorticale acuta rappresenta una condizione estremamente pericolosa, che può insorgere in caso di sepsi, crisi asmatiche acute, stati di shock e di collasso conseguenti a traumi, interventi chirurgici, ipovolemia ed ustioni, infarto del miocardio, embolia polmonare, gravi stati edematosi (edema di Quincke, edema della glottide, edema polmonare), pancreatite acuta, reazioni anafilattiche gravi in seguito ad iniezione di sieri, incidenti da trasfusioni, ipersensibilità a medicamenti, gravi reazioni allergiche, apoplessia, tossicosi acute dell'età infantile ed avvelenamenti accidentali; epatite e coma epatico; crisi tireotossiche ed addisoniane; tromboangioite obliterante ed ha spesso una prognosi funesta. Acute adrenocortical insufficiency represents an extremely dangerous condition, which can arise in the case of sepsis, acute asthma attacks, states of shock and collapse resulting from trauma, surgery, hypovolemia and burns, myocardial infarction, pulmonary embolism, severe edematous states (Quincke's edema, glottal edema, pulmonary edema), acute pancreatitis, severe anaphylactic reactions following serum injection, transfusion accidents, drug hypersensitivity, severe allergic reactions, apoplexy, acute childhood toxicosis and accidental poisoning; hepatitis and hepatic coma; thyrotoxic and addisonian crises; thrombangiitis obliterans and often has a dire prognosis.
La terapia attualmente applicata consiste nel trattamento intravenoso con elevate dosi di corticosteroidi. Tuttavia l’uso clinico dei corticosteroidi in tale applicazione terapeutica non è stato comprovato sulla base di idonei studi clinici, anzi la maggior parte dei trials non ha fornito chiari risultati di efficacia. Questo non è peraltro imputabile ad errori metodologici né ad una mancanza di attività farmacologica degli steroidi in tali indicazioni, bensì alle caratteristiche farmacocinetiche dei prodotti impiegati. Infatti i corticosteroidi, essendo insolubili in acqua devono essere coniugati a molecole (carriers) aventi carattere idrofilico per poter essere iniettati. Tuttavia la loro azione biologica può essere esplicata soltanto dopo che la porzione idrofilica viene staccata dalla molecola, rilasciando il corticosteroide che può così passare la membrana cellulare e legarsi al recettore citoplasmatico. La scissione in vivo del legame tra molecola cortisonica e porzione idrofilica è molto lenta essendo la molecola moderatamente stabile e non essendo presenti in circolo enzimi specifici ad attività esterasica. A causa di ciò la biodisponibilità del principio attivo non è immediata e la risposta terapeutica si osserva dopo diverse ore,con conseguente pericolo per la sopravvivenza del paziente. The currently applied therapy consists of intravenous treatment with high doses of corticosteroids. However, the clinical use of corticosteroids in this therapeutic application has not been proven on the basis of suitable clinical studies, indeed most of the trials have not provided clear efficacy results. However, this is not attributable to methodological errors or to a lack of pharmacological activity of the steroids in these indications, but to the pharmacokinetic characteristics of the products used. In fact, corticosteroids, being insoluble in water, must be conjugated to molecules (carriers) having a hydrophilic character in order to be injected. However, their biological action can only be carried out after the hydrophilic portion is detached from the molecule, releasing the corticosteroid which can thus pass the cell membrane and bind to the cytoplasmic receptor. The in vivo cleavage of the bond between the cortisone molecule and the hydrophilic portion is very slow as the molecule is moderately stable and no specific enzymes with esterase activity are present in the circulation. Because of this, the bioavailability of the active ingredient is not immediate and the therapeutic response is observed after several hours, with consequent danger for the patient's survival.
I corticosteroidi costituiscono tuttora il farmaco d'elezione nel trattamento di sindromi acute che richiedono interventi di emergenza, nonostante che il loro meccanismo d'azione non sia ancora stato del tutto chiarito e che non siano disponibili studi controllati, per una verifica oggettiva della loro efficacia. Situazioni quali l'insufficienza adrenocorticale acuta, lo shock anafilattico, ipovolemico e cardiogeno, l'edema della laringe ed altre patologie acute gravi,vengono generalmente trattate con dosi elevate di cortisonici (da 500 mg fino a 10 g) per via intravenosa e per somministrazioni ripetute ogni 1-2 ore durante le 24 ore, fino a che non si registra una risposta clinica da parte del paziente. La terapia può essere ulteriormente prolungata, a dosi inferiori; nelle giornate successive alla crisi, fino al raggiungimento del controllo dei sintomi e ad un completo ristabilimento dei parametri vitali. In seguito è solitamente necessario instaurare una terapia di mantenimento a dosi ridotte, anche per via orale. Inoltre i corticosteroidi, come è noto, trovano largo impiego anche nella terapia di disordini subacuti e cronici di tipo degenerativo, infiammatorio e neoplastico, quali glomerulonefrite ed altre alterazioni renali, Lupus Eritematoso Sistemico, artrite, cardite reumatica, asma bronchiale, malattie allergiche, disordini del tratto intestinale ed epatici, alterazioni dermatologiche, linfomi, morbo di Hodgking, pericardite, pemfigo, eritrodermie ed altre. Anche in questi casi, al fine di raggiungere concentrazioni adeguate del prodotto al sito di azione, si rendono necessari trattamenti prolungati e dosi consistenti,con conseguente insorgenza degli effetti collaterali tipici dei corticosteroidi. Corticosteroids are still the drug of choice in the treatment of acute syndromes requiring emergency interventions, although their mechanism of action has not yet been fully clarified and controlled studies are not available, for an objective verification of their efficacy. . Situations such as acute adrenocortical insufficiency, anaphylactic, hypovolemic and cardiogenic shock, edema of the larynx and other severe acute pathologies, are generally treated with high doses of cortisone (from 500 mg up to 10 g) intravenously and by administration repeated every 1-2 hours during the 24 hours, until there is a clinical response from the patient. Therapy can be further prolonged, at lower doses; in the days following the crisis, until symptom control is achieved and vital parameters are fully restored. Thereafter it is usually necessary to start maintenance therapy at reduced doses, including by mouth. Furthermore, corticosteroids, as is known, are also widely used in the therapy of subacute and chronic degenerative, inflammatory and neoplastic disorders, such as glomerulonephritis and other renal alterations, Systemic Lupus Erythematosus, arthritis, rheumatic carditis, bronchial asthma, allergic diseases, disorders of the intestinal and hepatic tract, dermatological alterations, lymphomas, Hodgking's disease, pericarditis, pemphigus, erythroderma and others. Also in these cases, in order to reach adequate concentrations of the product at the site of action, prolonged treatments and consistent doses are necessary, with the consequent onset of the typical side effects of corticosteroids.
Gli eventi avversi che insorgono in seguito a terapie prolungate consistono prevalentemente nella soppressione delle funzioni pituitaria e surrenale, disturbi nell'omeostasi idrica ed elettrolitica, ipertensione, iperglicemia e glicosuria, aumento della suscettibilità alle infezioni, osteoporosi e neuropatie. Evidentemente, l'attività intrinseca del farmaco è responsabile della produzione di tali reazioni avverse; tuttavia una forte responsabilità è anche ascrivibile alle caratteristiche cinetiche dei cortisonici, caratteristiche che, come spiegato più avanti, impongono simili schemi di trattamento. Adverse events that arise following prolonged therapies consist mainly of suppression of pituitary and adrenal functions, disturbances in water and electrolyte homeostasis, hypertension, hyperglycemia and glycosuria, increased susceptibility to infections, osteoporosis and neuropathies. Evidently, the intrinsic activity of the drug is responsible for producing these adverse reactions; however, a strong responsibility is also attributable to the kinetic characteristics of cortisone drugs, characteristics which, as explained below, impose similar treatment schemes.
Stato dell'arte State of the art
Al fine di superare gli aspetti svantaggiosi della terapia di emergenza con corticosteroidi, sono state tentate recentemente strategie terapeutiche diverse, ad esempio contro lo shock settico, al fine di modulare l'evento infiammatorio acuto sistemico, sono stati usati anticorpi monoclonali che bloccano mediatori dell'infiammazione del tipo citochine o che inattivano endotossine. Tali approcci tuttavia sono stati abbandonati in quanto, essendo particolarmente numerose e ridondanti le molecole implicate nel processo acuto, non è risultata terapeuticamente sufficiente l'inibizione selettiva di soltanto una od alcune di esse. I glucocorticoidi invece, come emerso da recentissimi studi farmacologici volti a chiarirne il meccanismo di azione, tramite l'interazione con il loro specifico recettore citoplasmatico, controllano l'infiammazione inibendo diversi aspetti del processo flogistico (produzione di citochine, ossido nitrico, prostaglandine, leucotrieni, espressione di molecole di adesione sulla superficie cellulare, ecc. ...), attraverso lo stimolo o la depressione della trascrizione del DNA. A seguito di queste osservazioni, si sta assistendo a una rivalutazione dell'uso di cortisonici nella terapia d'emergenza. Peraltro, questa classe di farmaci presenta alcune caratteristiche, in particolare strutturali, che li rendono non pienamente utilizzabili per quelle che sarebbero le loro effettive potenzialità terapeutiche, ed è per questo che esistono ancora dubbi sulla loro efficacia clinica. In order to overcome the disadvantageous aspects of emergency corticosteroid therapy, different therapeutic strategies have recently been tried, for example against septic shock, in order to modulate the acute systemic inflammatory event, monoclonal antibodies have been used that block mediators of inflammation of the cytokine type or which inactivate endotoxins. However, these approaches have been abandoned since, since the molecules involved in the acute process are particularly numerous and redundant, selective inhibition of only one or some of them was not therapeutically sufficient. Glucocorticoids, on the other hand, as emerged from very recent pharmacological studies aimed at clarifying their mechanism of action, by interacting with their specific cytoplasmic receptor, control inflammation by inhibiting various aspects of the inflammatory process (production of cytokines, nitric oxide, prostaglandins, leukotrienes , expression of adhesion molecules on the cell surface, etc ...), through the stimulation or depression of DNA transcription. Following these observations, there is a re-evaluation of the use of corticosteroids in emergency therapy. Moreover, this class of drugs has some characteristics, in particular structural, which make them not fully usable for what would be their effective therapeutic potential, and that is why there are still doubts about their clinical efficacy.
E' noto che, per produrre i propri effetti caratteristici, un farmaco deve raggiungere una concentrazione adeguata al proprio sito d'azione, concentrazione che dipende sia dalla quantità di prodotto somministrata, sia dal grado di assorbimento della sostanza ed altri parametri cinetici. Il processo di assorbimento, in particolare, è influenzato da fattori quali la forma e le dimensioni molecolari, il grado di ionizzazione, la solubilità in solventi lipidici. It is known that, in order to produce its characteristic effects, a drug must reach a concentration suitable for its site of action, a concentration that depends both on the quantity of product administered, and on the degree of absorption of the substance and other kinetic parameters. The absorption process, in particular, is influenced by factors such as the molecular shape and size, the degree of ionization, the solubility in lipid solvents.
Per quanto concerne i cortisonici, molecole lipofile, il maggior problema risiede nel fatto che essi, per poter esplicare la loro azione farmacologica, devono attraversare la membrana cellulare, e legarsi al loro recettore citoplasmatico. La lipofilicità di tali composti impedisce evidentemente la solubilizzazione nei solventi acquosi,nonché la diffusione nel torrente ematico, compromettendo così la loro disponibilità a livello del sito di azione. Per ovviare a tale inconveniente, le molecole di tale classe sono state coniugate,mediante legami covalenti, a particolari molecole (carriers) idrofiliche, che ne permettono la solubilizzazione. Ad esempio, nel caso del cortisolo, è stata esterificata la posizione 11, 17 o 21 con gruppi fosfato,solfato, succinato, emisuccinato od acetato, tebutato, acetonide, diacetato, esacetone. As for cortisone, lipophilic molecules, the main problem lies in the fact that, in order to carry out their pharmacological action, they must cross the cell membrane and bind to their cytoplasmic receptor. The lipophilicity of these compounds evidently prevents solubilization in aqueous solvents, as well as diffusion in the blood stream, thus compromising their availability at the site of action. To overcome this drawback, the molecules of this class have been conjugated, by means of covalent bonds, to particular hydrophilic molecules (carriers), which allow their solubilization. For example, in the case of cortisol, position 11, 17 or 21 was esterified with phosphate, sulphate, succinate, hemisuccinate or acetate, theebutate, acetonide, diacetate, hexacetone groups.
Purtroppo, se da una parte tale legame rende la sostanza solubile e ne consente la somministrabilità e la diffusione in circolo, al contempo ne impedisce il passaggio attraverso la membrana cellulare. Il prodotto quindi potrà espletare la propria attività farmacologica soltanto dopo che il legame estere del "profarmaco" sarà stato scisso ed il principio attivo lipofilo liberato. L'organismo, peraltro, non possiede enzimi ad attività esterasica capaci di scindere il legame in questione, per cui il processo idrolitico è estremamente lento, e la biodisponibilità del principio attivo è altrettanto carente. E' evidente che, nel caso di eventi patologici in cui siano richiesti interventi terapeutici di emergenza, tale caratteristica farmacocinetica determina spesso risultati negativi. Unfortunately, if on the one hand this bond makes the substance soluble and allows its administration and diffusion in the circulation, at the same time it prevents its passage through the cell membrane. The product will therefore be able to carry out its pharmacological activity only after the ester bond of the "prodrug" has been split and the lipophilic active principle released. The organism, however, does not have enzymes with esterase activity capable of breaking down the bond in question, so the hydrolytic process is extremely slow, and the bioavailability of the active principle is equally lacking. It is evident that, in the case of pathological events in which emergency therapeutic interventions are required, this pharmacokinetic characteristic often determines negative results.
Esiste perciò la necessità di disporre di una forma del principio attivo che sia solubile nelle forme farmaceutiche acquose, ad esempio quelle iniettabili,e sia prontamente disponibile, una volta in circolo, nella forma lìpofila per poter rapidamente passare la membrana cellulare e poter esercitare la propria azione farmacologica. There is therefore the need to have a form of the active ingredient that is soluble in aqueous pharmaceutical forms, for example injectable ones, and is readily available, once in circulation, in the lipophilic form in order to be able to rapidly pass the cell membrane and be able to exercise its own pharmacological action.
Sono noti anticorpi monoclonali catalitici e il loro utilizzo nell'attivazione di profarmaci in vivo, come ad esenpio descritto in Chemical Abstract (114) 610w, (119)210716q, (121)195943g e (122)28553d. La strategia generale si basa sullo sviluppo di anticorpi monoclonali catalitici (abzimi), i quali possono essere generati contro apteni che mimano la struttura molecolare dello stato di transizione del composto partecipante ad una reazione chimica. Tra gli arrangiamenti iniziale e finale delle molecole che partecipano ad una reazione chimica esiste una configurazione intermedia in cui l'energia potenziale degli atomi costituenti e delle molecole in toto raggiunge un valore massimo.Questa configurazione corrisponde allo stato di transizione e tende ad assumere l'arrangiamento finale della reazione in modo da riportare l'energia potenziale a livelli più bassi. Non sono noti abzimi contro corticosteroidi o loro derivati. Catalytic monoclonal antibodies and their use in the activation of prodrugs in vivo are known, as for example described in Chemical Abstract (114) 610w, (119) 210716q, (121) 195943g and (122) 28553d. The general strategy is based on the development of catalytic monoclonal antibodies (abzymes), which can be generated against haptens that mimic the molecular structure of the transition state of the compound participating in a chemical reaction. Between the initial and final arrangements of the molecules participating in a chemical reaction there is an intermediate configuration in which the potential energy of the constituent atoms and of the molecules as a whole reaches a maximum value. This configuration corresponds to the transition state and tends to assume the final arrangement of the reaction so as to bring the potential energy back to lower levels. There are no known abzymes against corticosteroids or their derivatives.
Un problema che si pone nella preparazione dell'abzima è l'individuazione della struttura chimica dell'aptene adatto. A problem that arises in the preparation of the abzyme is the identification of the chemical structure of the suitable hapten.
W08910754 descrive anticorpi monoclonali catalitici in grado di scindere un legame estereo,e comunque di attivare in vivo un profarmaco L'effettivo insegnamento ivi fornito è diretto a risolvere il problema di attivare o disattivare biomolecole peptidiche, da cui discende tutta una serie di particolari apteni peptidici. W08910754 describes catalytic monoclonal antibodies capable of cleaving an ester bond, and in any case of activating a prodrug in vivo The actual teaching provided therein is aimed at solving the problem of activating or deactivating peptide biomolecules, from which a whole series of particular peptide haptens derives .
W09302703 si riferisce specificamente alla terapia antitumorale, nella quale i corticosteroidi non sono previsti. W09302703 specifically refers to anticancer therapy, in which corticosteroids are not provided.
W09416734 si riferisce a un metodo di trattamento che prevede di indirizzare molecole effettrici, tra cui farmaci,su predeterminati siti cellulari tramite una complessa costruzione che prevede un primo reagente che si lega al sito cellulare, un secondo reagente che si lega a questo primo reagente in modalità amplificata, a tale secondo reagente, a sua volta, si lega la molecola effettrice, che in seguito libererà la parte attiva. I reagenti possono avere anticorpi come gruppi funzionali per la formazione dei vari legami, ma possono anche essere assimilati agli anticorpi. La molecola effettrice può essere un farmaco e può essere legata a una molecola trasportatrice, quale una proteina. Il farmaco può anche essere un profarmaco, dato che è anche previsto un agente enzimatico che liberi la parte attiva; oppure la molecola effettrice può essere un enzima che catalizza la conversione di un profarmaco. W09416734 refers to a treatment method that involves targeting effector molecules, including drugs, on predetermined cell sites through a complex construction that provides a first reagent that binds to the cell site, a second reagent that binds to this first reagent in amplified mode, to this second reagent, in turn, the effector molecule binds, which will later release the active part. The reagents can have antibodies as functional groups for the formation of the various bonds, but they can also be assimilated to antibodies. The effector molecule can be a drug and it can be bound to a carrier molecule, such as a protein. The drug can also be a prodrug, since an enzymatic agent is also provided which releases the active part; or the effector molecule can be an enzyme that catalyzes the conversion of a prodrug.
L'eventuale liberazione della parte attiva avviene al, o in prossimità del,sito recettoriale e comunque c'è un effetto di guida del farmaco attivo al sito di azione. L'insegnamento specifico è diretto alla guida di molecole efficaci nella diagnosi o cura dei tumori. Any release of the active part occurs at or near the receptor site and in any case there is a guiding effect of the active drug to the site of action. The specific teaching is aimed at guiding molecules effective in the diagnosis or treatment of tumors.
JP94220072 descrive abzimi contro antibiotici. JP94220072 discloses abzymes versus antibiotics.
E' desiderabile disporre di un criterio unico nel disegno di un adatto omologo dello stato di transizione che valga per un'intera calasse di farmaci, e non per un singolo composto. Inoltre è desiderabile disporre di tale omologo indipendentemente dalla parte idrofila che coniuga la molecola steroidea. It is desirable to have a unique criterion in designing a suitable transition state homologue that holds for an entire set of drugs, and not for a single compound. Furthermore, it is desirable to have this homologue independently of the hydrophilic part which conjugates the steroid molecule.
Lo specifico problema tecnico consiste nell'idrolizzare velocemente la funzione estere del profarmaco cortisonico, visto che non esiste nell'organismo una specifica esterasi in grado di liberare il farmaco in questione. I termini generali del problema relativo all'ottenimento di un abzima contro un profarmaco sotto forma di estere sono tutti compresi nella tecnica nota: la funzione fosfonica indicata come mimica dello stato di transizione, il gruppo di accoppiamento con la proteina vettore. Tuttavia non c'è alcuna indicazione all'esperto del settore sulla criticità di posizionamento del gruppo di accoppiamento nell'ambito della molecola steroidea e in rapporto al gruppo mimico dello stato di transizione. The specific technical problem consists in rapidly hydrolyzing the ester function of the cortisone prodrug, since there is no specific esterase in the body capable of releasing the drug in question. The general terms of the problem relating to obtaining an abzyme against a prodrug in the form of ester are all included in the known art: the phosphonic function indicated as mimic of the transition state, the coupling group with the vector protein. However, there is no indication to the skilled person on the criticality of positioning of the coupling group within the steroid molecule and in relation to the mimic group of the transition state.
E’ perciò critico il tipo di aptene da utilizzare, e ancor più critica è la posizione reciproca dei gruppi di accoppiamento e di mimesi dello stato di transizione. The type of hapten to be used is therefore critical, and the reciprocal position of the coupling and mimesis groups of the transition state is even more critical.
W08910754, a parte un rimando a generali tecniche modellistiche al calcolatore, si sofferma in particolare sulla scissione di selezionati legami peptidici di certe proteine, come rennina umana, proteina del rivestimento di HIV gpl20. W08910754, apart from a reference to general computer modeling techniques, focuses in particular on the cleavage of selected peptide bonds of certain proteins, such as human rennin, gpl20 HIV coating protein.
W09302703,che tratta lo specifico problema di profarmaci di agenti immunosoppressivi, antivirali, antitumorali e citotossici, sceglie le parti esterificanti il farmaco per proteggere un eventuale profarmaco estere dalle esterasi endogene, solo successivamente, una volta raggiunto l'opportuno livello terapeutico, libera il principio attivo. In un certo aspetto il problema tecnico è opposto a quello risolto dalla presente invenzione, dove si tratta di ottenere l'idrolisi dell'estere nel più breve tempo possibile, dovendo operare in terapia d’urgenza e non cronica. W09302703, which deals with the specific problem of prodrugs of immunosuppressive, antiviral, antitumor and cytotoxic agents, chooses the esterifying parts of the drug to protect a possible ester prodrug from endogenous esterases, only subsequently, once the appropriate therapeutic level has been reached, does it release the principle active. In a certain aspect the technical problem is opposite to that solved by the present invention, where it is a question of obtaining the hydrolysis of the ester in the shortest possible time, having to operate in emergency and not chronic therapy.
Riassunto dell' invenzione Summary of the invention
E' stato ora trovato che l'aptene adatto alla produzione di abzimi contro profarmaci idrosolubili di corticosteroidi è un conposto di struttura steroidea recante un gruppo fosfato nell'idrossile che nel corrispondente corticosteroide è coniugato con il carrier idrofilico, e un gruppo chimico adatto alla coniugazione con la macromolecola sulla posizione C-3 dello scheletro steroideo, la più lontana da detto gruppo fosfato. It has now been found that the hapten suitable for the production of abzymes against water-soluble corticosteroid prodrugs is a compound of steroid structure bearing a phosphate group in the hydroxyl which in the corresponding corticosteroid is conjugated with the hydrophilic carrier, and a chemical group suitable for conjugation with the macromolecule on position C-3 of the steroid skeleton, the furthest away from said phosphate group.
Pertanto sono un oggetto della presente invenzione composti di formula (I) Therefore, compounds of formula (I) are an object of the present invention
dove: where is it:
A rappresenta il nucleo steroideo di un ormone corticosteroide; A represents the steroid nucleus of a corticosteroid hormone;
R è un gruppo chimico legato alla posizione C-3 dell'anello A del pregnano e adatto alla coniugazione con una macromolecola immunogena; R is a chemical group linked to the C-3 position of the pregnane A ring and suitable for conjugation with an immunogenic macromolecule;
PO3X2 è un gruppo fosfato legato all'idrossile in posizione 21- o 17-(che sul corrispondente ormone corticosteroide reca una molecola idrofilica); PO3X2 is a phosphate group bound to the hydroxyl in position 21- or 17- (which carries a hydrophilic molecule on the corresponding corticosteroid hormone);
X è idrogeno o un catione farmaceuticamente. X is hydrogen or a cation pharmaceutically.
I composti di formula (I), opportunamente coniugati tramite R, con una molecola adatta a suscitare una risposta anticorpale in un animale, costituiscono gli apteni dai quali si otterranno gli anticorpi monoclonali catalitici (abzimi) specifici contro i diversi profarmaci idrosolubili di corticosteroidi. The compounds of formula (I), suitably conjugated through R, with a molecule suitable for eliciting an antibody response in an animal, constitute the haptens from which the catalytic monoclonal antibodies (abzymes) specific against the various water-soluble corticosteroid prodrugs will be obtained.
Detti abzimi sono un altro oggetto della presente invenzione. Said abzymes are another object of the present invention.
Un altro oggetto della presente invenzione è l'uso degli abzimi per la preparazione di medicamenti utili nel trattamento dell'insufficienza adrenocorticale acuta. Another object of the present invention is the use of abzymes for the preparation of medicaments useful in the treatment of acute adrenocortical insufficiency.
II vantaggio essenziale ottenuto dalla presente invenzione, conseguentemente alla maggiore biodisponibilità del principio attivo, consiste nella possibilità di ottenere un effetto terapeutico immediato, che, in situazioni di emergenza, consentirà il conseguimento di un maggior numero di successi in termini di sopravvivenza dei soggetti trattati. The essential advantage obtained by the present invention, consequently to the greater bioavailability of the active principle, consists in the possibility of obtaining an immediate therapeutic effect, which, in emergency situations, will allow the achievement of a greater number of successes in terms of survival of the treated subjects.
E' anche prevedibile che, essendo il cortisonico subito disponibile per l'azione farmacologica, sarà indispensabile utilizzarlo a dosi meno elevate. It is also foreseeable that, since the cortisone is readily available for pharmacological action, it will be essential to use it at lower doses.
Le possibilità di impiegare quantitativi più bassi e l'opportunità di diminuire i tempi di terapia, vista la maggiore biodisponibilità del principio attivo, potrebbero consentire efficaci trattamenti delle malattie croniche sopra elencate, evitando eventi indesiderabili. The possibility of using lower quantities and the opportunity to reduce therapy times, given the greater bioavailability of the active ingredient, could allow effective treatments of the chronic diseases listed above, avoiding undesirable events.
Questi ed altri oggetti della presente invenzione saranno descritti in maggior dettaglio anche per mezzo di esempi. These and other objects of the present invention will be described in greater detail also by means of examples.
Descrizione dettagliata dell'invenzione Detailed description of the invention
Nei composti di formula (I), [A] rappresenta il nucleo steroideo di un ormone corticosteroide naturale o sintetico. In the compounds of formula (I), [A] represents the steroid nucleus of a natural or synthetic corticosteroid hormone.
Esempi di ormoni adrenocorticali sono cortisolo, fluorocortisone, triamcinolone,desametasone,prednisone,cortisone,betametasone. Examples of adrenocortical hormones are cortisol, fluorocortisone, triamcinolone, dexamethasone, prednisone, cortisone, betamethasone.
Esempi di gruppi chimici R adatti alla coniugazione con una macromolecola immunogena, sono azido,p-azofenil-p-D-lattoside (Lac),pazofenil-p-D-glucoside (Giu), p-azofenil-arsonato (Ars), sodio trinitrobenzene solfonato (TNBS), sodio dinitrobenzene solfonato (DNBS), dinitrofenile (DNP) e anidride S-acetil-mercaptosuccinica. Tra questi è preferito il gruppo azido. Examples of R chemical groups suitable for conjugation with an immunogenic macromolecule are azido, p-azophenyl-p-D-lactoside (Lac), pazophenyl-p-D-glucoside (Giu), p-azophenyl-arsonate (Ars), sodium trinitrobenzene sulfonate (TNBS ), sodium dinitrobenzene sulfonate (DNBS), dinitrophenyl (DNP) and S-acetyl-mercaptosuccinic anhydride. Among these, the azido group is preferred.
Esempi di profarmaci idrosolubili di corticosteroidi sono quelli usati in formulazioni iniettabili. Esempi preferiti sono: betametasone fosfato sodico, betametasone fosfato sodico e acetato, cortisone acetato, cortisolo fosfato sodico, cortisolo succinato sodico,cortisone acetato, desametasone acetato, desametasone fosfato sodico, metilprednisolone acetato, metilprednisolone succinato sodico, prednisolone acetato, prednisolone fosfato sodico, prednisolone tebutato, triamcinoIone acetonide, triamcinolone diacetato, triaincinolone esacetonide. Esempi più preferiti sono cortisolo 21-emixuddinato, cortisolo 21-acetato, cortisolo 21-fosfato, cortisolo 17-emisuccinato,cortisolo 17-acetato,cortisolo 17-fosfato. Examples of water-soluble corticosteroid prodrugs are those used in injectable formulations. Preferred examples are: betamethasone sodium phosphate, betamethasone sodium phosphate and acetate, cortisone acetate, cortisol sodium phosphate, cortisol succinate sodium, cortisone acetate, dexamethasone acetate, dexamethasone sodium phosphate, methylprednisolone acetate, predisolone sodium predisolone, predisolone sodium thebutate, triamcinoIone acetonide, triamcinolone diacetate, triaincinolone hexacetonide. More preferred examples are cortisol 21-hemixuddinate, cortisol 21-acetate, cortisol 21-phosphate, cortisol 17-hemisuccinate, cortisol 17-acetate, cortisol 17-phosphate.
I composti di formula (I) sono preparati a partire dai rispettivi principi attivi, ossia dagli steroidi farmacologicamente attivi o derivati reperibili in commercio. Ad esempio, sono disponibili in commercio,o preparabili con metodi noti,principi attivi già recanti il gruppo estere fosfato nella posizione desiderata. Quindi viene inserito il prescelto gruppo R con metodi convenzionali e descritti in letteratura. The compounds of formula (I) are prepared starting from the respective active ingredients, ie from the pharmacologically active steroids or derivatives available on the market. For example, active ingredients already bearing the phosphate ester group in the desired position are commercially available, or can be prepared with known methods. Then the selected R group is inserted with conventional methods and described in the literature.
Una volta ottenuto il composto di formula 81) (aptene), questo viene coniugato ad una macromolecola immunogena (carrier). Esempi di tali macromolecole sono KLH, BSA, ovalbumina, tiraglobulina, IG di pollo,polisaccaridi. Once the compound of formula 81) (hapten) has been obtained, this is conjugated to an immunogenic macromolecule (carrier). Examples of such macromolecules are KLH, BSA, ovalbumin, tiraglobulin, chicken IG, polysaccharides.
II coniugato aptene-carrier viene quindi utilizzato per immunizzare l'animale dal quale, con metodiche convenzionali, si ottiene 1'anticorpo monoclonale catalitico (abzima). E'un oggetto della presente invenzione un abzima contro un profarmaco idrosolubile di un ormone corticosteroide. The hapten-carrier conjugate is then used to immunize the animal from which, with conventional methods, the catalytic monoclonal antibody (abzyme) is obtained. An object of the present invention is an abzyme against a water-soluble prodrug of a corticosteroid hormone.
Tipicamente, gli splenociti dell'animale immunizzato vengono fusi con una linea di mieloma, e dopo selezione degli ibridomi e dei cloni positivi, si procede alla purificazione dell'abzima. Typically, the splenocytes of the immunized animal are fused with a myeloma line, and after selection of the hybridomas and positive clones, the purification of the abzyme is carried out.
La procedura di ottenimento dell'abzima non è critica e non ci sono particolari limitazioni sulla scelta dell'animale, del protocollo di immunizzazione, della particolare linea di cellule di mieloma (o altre cellule immortalizzate? ). The procedure for obtaining the abzyme is not critical and there are no particular limitations on the choice of the animal, the immunization protocol, the particular myeloma cell line (or other immortalized cells?).
I metodi di purificazione dell'abzima della presente invenzione sono del tutto convenzionali e nell'ambito della normale attività dell'esperto del settore. The methods of purification of the abzyme of the present invention are entirely conventional and within the normal activity of the person skilled in the art.
Una prima realizzazione preferita della presente invenzione riguarda l'aptene del cortisolo sostituito in posizione 21. Si tratta del conposto 210,17a-21-triidrossi-4-pregnene-2O-one-3-idrazono-4'-azidobenzamide-21-fosfato, ossia il composto di formula (I) dove [A] è il residuo steroideo del cortisolo, R è il gruppo 3-idrazono-4'-azidobenzamide, X è idrogeno. A first preferred embodiment of the present invention relates to the cortisol hapten substituted in position 21. It is the compound 210,17a-21-trihydroxy-4-pregnene-2O-one-3-hydrazono-4'-azidobenzamide-21-phosphate , ie the compound of formula (I) where [A] is the steroid residue of cortisol, R is the 3-hydrazono-4'-azidobenzamide group, X is hydrogen.
Il conposto sintetizzato costituisce l'aptene. The synthesized compound constitutes the hapten.
Come si può vedere dalla struttura molecolare del conposto utilizzato come aptene, non è presente alcuna catena laterale corrispondente alla parte idrofila di qualsiasi profarmaco del cortisolo. Invece di sintetizzare l'analogo dello stato di transizione relativo ad ogni profarmaco del cortisolo esistente, la presente invenzione permette, per ogni determinato principio attivo, di fornire l'analogo dello stato di transizione della reazione di scissione di ogni profarmaco,indipendentemente dal residuo idrofilico. As can be seen from the molecular structure of the compound used as hapten, no side chain corresponding to the hydrophilic part of any prodrug of cortisol is present. Instead of synthesizing the analog of the transition state relative to each prodrug of existing cortisol, the present invention allows, for each determined active ingredient, to provide the analog of the transition state of the cleavage reaction of each prodrug, regardless of the hydrophilic residue. .
L'anticorpo quindi riconoscerà quella parte della molecola rappresentata dal punto di scissione, oltre a riconoscere una porzione della molecola steroidea, mentre è di minore importanza la diversità della porzione idrofila, che può quindi essere indifferentemente emisuccinato, fosfato,o altri carrier noti. Per questo stesso principio anche .·altri derivati del cortisolo, come ad esempio il metilprednisolone, che differisce dal cortisolo per la presenza di un gruppo metilico in posizione 6-alfa, che è disponibile in formulazione iniettabile soltanto quando legato ad una porzione emisuccinica (metilprednisolone emisuccinato, URBASONW SOLUBILE, 8, 20, 40, 250 mg) può essere utilizzato come agente terapeutico. The antibody will therefore recognize that part of the molecule represented by the cleavage point, in addition to recognizing a portion of the steroid molecule, while the diversity of the hydrophilic portion is of less importance, which can therefore be indifferently hemisuccinate, phosphate, or other known carriers. For this same principle too. hemisuccinate, URBASONW SOLUBLE, 8, 20, 40, 250 mg) can be used as a therapeutic agent.
Nella molecola dell'aptene è presente un gruppo fosfato in posizione 21 che mima lo stato di transizione dell'idrolisi del gruppo estereo,essendo analogo stericamente al carbonio tetraedrico. In the hapten molecule there is a phosphate group in position 21 which mimics the transition state of the hydrolysis of the ester group, being sterically analogous to the tetrahedral carbon.
Il gruppo deputato a stabilire il legame con la proteina di trasporto è legato alla posizione 3, che nella molecola rappresenta il carbonio più distante dalla posizione 21 o 17 su cui è presente il sostituente idrofilico. The group responsible for establishing the link with the transport protein is linked to position 3, which in the molecule represents the carbon furthest from position 21 or 17 on which the hydrophilic substituent is present.
Secondo la presente invenzione, 1'anticorpo catalitico è in grado di riconoscere una parte significativa della molecola dello steroide in prossimità del centro di reazione. Infatti il carrier macromolecolare viene attaccato all'azide in posizione C3, lasciando disponibile per il riconoscimento immunitario quella parte della molecola in cui, in effetti,deve avvenire la reazione. L'anticorpo evocato riconosce quindi sia il sito di legame in C21, sia in gran parte della molecola steroidea. According to the present invention, the catalytic antibody is able to recognize a significant part of the steroid molecule in the vicinity of the reaction center. In fact, the macromolecular carrier is attached to the azide in position C3, leaving that part of the molecule in which, in effect, the reaction must take place available for immune recognition. The evoked antibody therefore recognizes both the binding site in C21 and a large part of the steroid molecule.
L'aptene è stato ottenuto per condensazione del diidrocortisone-21-fosfato commerciale con l'idrazide dell'acido 4-azidobenzoico; quest'ultimo composto è stato preparato a partire dall'acido 4-amminobenzoico attraverso le reazioni successive di: diazotazione con acido nitroso in acqua seguita da reazione con azoturo di sodio per ottenere l'acido 4-azidobenzoico; questo è stato esterificato con metanolo cloridrico; la reazione è stata seguita da idrazinolisi in metanolo dell'estere metilico intermedio. La condensazione dell'aptene con il diidrocortisone-21-fosfato è stata effettuata per riscaldamento di guantità equimolari (2 mmol) dei reagenti in metanolo (3 mi) in una fiala chiusa riscaldata a 90*C per 3 h, fino ad ottenimento di una soluzione limpida, da cui l'aptene è stato isolato come solido per evaporazione del solvente. La presenza dell'aptene nella miscela di reazione è stata desunta dallo spostamento del segnale vinilico legato al carbonio 4 nello spettro di RMN. The hapten was obtained by condensation of commercial dihydrocortisone-21-phosphate with 4-azidobenzoic acid hydrazide; the latter compound was prepared starting from 4-aminobenzoic acid through the subsequent reactions of: diazotation with nitrous acid in water followed by reaction with sodium azide to obtain 4-azidobenzoic acid; this was esterified with hydrochloric methanol; the reaction was followed by hydrazinolysis of the intermediate methyl ester in methanol. Condensation of the hapten with dihydrocortisone-21-phosphate was carried out by heating equimolar gloves (2 mmol) of the reagents in methanol (3 ml) in a closed vial heated to 90 ° C for 3 h, until a clear solution, from which the hapten was isolated as a solid by evaporation of the solvent. The presence of the hapten in the reaction mixture was inferred from the shift of the vinyl signal bound to carbon 4 in the NMR spectrum.
In ragione del loro basso peso molecolare, le molecole sintetizzate come analoghi sono prive di capacità immunogena, che acquistano invece quando siano coniugate a "carrier" macromolecolari. Nelle consuete condizioni di sperimentazione, i carrier molecolari più frequentemente impiegati sono proteine. Si è resa necessaria quindi la coniugazione dello steroide modificato (aptene) ad una proteina, per garantire la massima esposizione del dominio molecolare di interesse (epitopo). In una realizzazione preferita, la proteina prescelta è stata la KLH. Due to their low molecular weight, the molecules synthesized as analogues lack immunogenic capacity, which they acquire instead when they are conjugated to macromolecular "carriers". Under the usual experimental conditions, the most frequently used molecular carriers are proteins. It was therefore necessary to conjugate the modified steroid (hapten) to a protein, to ensure maximum exposure of the molecular domain of interest (epitope). In a preferred embodiment, the protein of choice was KLH.
Le modalità di coniugazione a carrier macromolecolari dipendono dal tipo di gruppo funzionale disponibile sulla molecola dell'aptene. Esistono diversi metodi di modifica chimica di proteine con apteni, che possono essere utilizzati indifferentemente, selezionando poi il più efficace. Il rapporto molare di sostituzione viene stimato tramite spettrofotometria di assorbimento. The methods of conjugation to macromolecular carriers depend on the type of functional group available on the hapten molecule. There are several methods of chemical modification of proteins with haptens, which can be used indifferently, then selecting the most effective. The molar substitution ratio is estimated by absorption spectrophotometry.
Il coniugato aptene-carrier proteico è stato utilizzato per immunizzare topi Balb/c di 8-10 settimane, sia per via sottocutanea (con adiuvante di Freund completo ed incompleto) che per via intraperitoneale, secondo diversi schemi di trattamento. The hapten-protein carrier conjugate was used to immunize 8-10 week old Balb / c mice, both subcutaneously (with complete and incomplete Freund's adjuvant) and intraperitoneally, according to different treatment schemes.
Al termine del periodo di trattamento il siero degli animali è stato prelevato per verificare che questi avessero sviluppato una risposta immunitaria contro 1'antigene e che quindi producessero l'attività catalitica ricercata. At the end of the treatment period, the serum of the animals was taken to verify that they had developed an immune response against the antigen and therefore that they produced the desired catalytic activity.
Una volta selezionati gli animali che avevano sviluppato la risposta anticorpale più rilevante, si è proceduto alla preparazione di anticorpi monoclonali, secondo le metodiche usuali (fusione di splenociti con cellule di mieloma, screening delle famiglie di ibridomi mediante il saggio radiometrico sopra descritto, selezione dei cloni positivi,purificazione dell'anticorpo). Once the animals that had developed the most relevant antibody response had been selected, the preparation of monoclonal antibodies was carried out, according to the usual methods (fusion of splenocytes with myeloma cells, screening of the hybridoma families by means of the radiometric assay described above, selection of the positive clones, antibody purification).
Per massimizzare l'efficienza dell'anticorpo catalitico è possibile ricorrere a diverse strategie: To maximize the efficiency of the catalytic antibody, several strategies can be used:
modificare l'analogo dello stato di transizione change the analog of the transition state
- eseguire la selezione di anticorpi da librerie combinatorie espresse su fagi (phage display) - perform the selection of antibodies from combinatorial libraries expressed on phages (phage display)
- modificare l'anticorpo monoclonale catalitico, precedentemente ottenuto con metodi standard,mediante site directed mutagenesis. Gli abzimi secondo la presente invenzione hanno attività catalitica nei confronti di profarmaci idrosolubili di ormoni corticosteroidi, pertanto sono utili nella terapia dell'insufficienza adrenocorticale, in particolare la terapia d'urgenza, dove è necessaria un'azione del farmaco la più rapida possibile. - modify the catalytic monoclonal antibody, previously obtained with standard methods, by site directed mutagenesis. The abzymes according to the present invention have catalytic activity towards water-soluble prodrugs of corticosteroid hormones, therefore they are useful in the therapy of adrenocortical insufficiency, in particular emergency therapy, where the fastest possible action of the drug is required.
Pertanto è un oggetto della presente invenzione l'uso di abzimi contro profarmaci idrosolubili di ormoni corticosteroidei per la preparazione di un medicamento utile nel trattamento di patologie curabili con cortisonici. In particolare, l'uso secondo la presente invenzione trova applicazione nel trattamento dell'insufficienza adrenocorticale acuta, sepsi, crisi asmatiche acute, stati di shock e di collasso conseguenti a traumi, interventi chirurgici, ipovolemia ed ustioni, infarto del miocardio, embolia polmonare,gravi stati edematosi (edema di Quincke, edema della glottide, edema polmonare), pancreatite acuta, reazioni anafilattiche gravi in seguito ad iniezione di sieri, incidenti da trasfusioni, ipersensibilità a medicamenti, gravi reazioni allergiche, apoplessia, tossicosi acute dell'età infantile ed avvelenamenti accidentali; epatite e coma epatico; crisi tireotossiche ed addisoniane; tromboangioite obliterante. Therefore an object of the present invention is the use of abzymes against water-soluble prodrugs of corticosteroid hormones for the preparation of a medicament useful in the treatment of pathologies treatable with corticosteroids. In particular, the use according to the present invention finds application in the treatment of acute adrenocortical insufficiency, sepsis, acute asthma attacks, states of shock and collapse resulting from trauma, surgery, hypovolemia and burns, myocardial infarction, pulmonary embolism, severe edematous states (Quincke's edema, glottal edema, pulmonary edema), acute pancreatitis, severe anaphylactic reactions following serum injection, transfusion accidents, hypersensitivity to medications, severe allergic reactions, apoplexy, acute childhood toxicosis and accidental poisoning; hepatitis and hepatic coma; thyrotoxic and addisonian crises; thromboangiitis obliterans.
Ancora un altro oggetto della presente invenzione è l'uso di abzimi contro profarmaci idrosolubili di ormoni corticosteroidei per la preparazione di un medicamento utile nel trattamento di disordini subacuti e cronici di tipo degenerativo, infiammatorio e neoplastico, quali glomerulonefrite ed altre alterazioni renali, Lupus Eritematoso Sistemico, artrite, cardite reumatica, asma bronchiale, malattie allergiche, disordini del tratto intestinale ed epatici, alterazioni dermatologiche, linfomi, morbo di Hodgking, pericardite, pemfigo, eritrodermie ed altre. Still another object of the present invention is the use of abzymes against water-soluble prodrugs of corticosteroid hormones for the preparation of a medicament useful in the treatment of subacute and chronic degenerative, inflammatory and neoplastic disorders, such as glomerulonephritis and other renal alterations, Lupus Erythematosus Systemic, arthritis, rheumatic carditis, bronchial asthma, allergic diseases, disorders of the intestinal and hepatic tract, dermatological alterations, lymphomas, Hodgking's disease, pericarditis, pemphigus, erythroderma and others.
La somministrazione dell'abzima sarà determinata, nei tempi e nelle dosi, dal medico curante a seconda del tipo di patologie, stato del paziente e tipo di profarmaco associato. The administration of the abzyme will be determined, in time and in doses, by the treating physician according to the type of pathology, the patient's condition and the type of associated prodrug.
L'abzima secondo la presente invenzione può essere somministrato in concomitanza con il profarmaco corrispondente oppure in una certa sequenza,determinata dal medico esperto. The abzyme according to the present invention can be administered concomitantly with the corresponding prodrug or in a certain sequence, determined by the expert physician.
Convenientemente, l'abzima secondo la presente invenzione è formulato in composizioni farmaceutiche, le quali sono pure comprese nella presente invenzione. Le composizioni contengono una quantità efficace di abzima, che può essere determinata in rapporto all'attività specifica rispetto al profarmaco. Conveniently, the abzyme according to the present invention is formulated in pharmaceutical compositions, which are also included in the present invention. The compositions contain an effective amount of abzyme, which can be determined in relation to the specific activity with respect to the prodrug.
Le conposizioni secondo la presente invenzione contengono l'abzima in miscela con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili e possono essere preparate con metodi noti ad esempio come descritto in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack. Pub. , N.Y. , U.S.A. The compositions according to the present invention contain the abzyme in admixture with pharmaceutically acceptable carriers and excipients and can be prepared with known methods for example as described in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack. Pub. , N.Y. , USA.
Sono preferite le composizioni iniettabili. Injectable compositions are preferred.
La presente invenzione conprende anche una confezione (kit) contenente in forma separata, una composizione farmaceutica comprendente un'opportuna quantità di un abzima secondo la presente invenzione e una composizione farmaceutica conprendente una quantità terapeuticamente efficace (in rapporto all' abzima) di un profarmaco idrosolubile di un corticosteroide. The present invention also comprises a package (kit) containing in separate form, a pharmaceutical composition comprising an appropriate quantity of an abzyme according to the present invention and a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective quantity (in relation to the abzyme) of a water-soluble prodrug. of a corticosteroid.
Il seguente eseirpio illustra ulteriormente l'invenzione. The following example further illustrates the invention.
ESEMPIO EXAMPLE
a) Preparazione dell'aptene 21i3,17a-21-triidrossi-4-pregnene-20-one-3-idrazono-4'-azidobenzamide-21-fosfato a) Preparation of the hapten 21i3,17a-21-trihydroxy-4-pregnene-20-one-3-hydrazono-4'-azidobenzamide-21-phosphate
Il conposto del titolo è ottenuto tirando a secco 50 mg di 3-azidobenzoilidrazina e 150 mg di cortisolo 21 fosfato,non purificato. b) Coniugazione con KLH The title compound is obtained by drying 50 mg of 3-azidobenzoylhydrazine and 150 mg of cortisol 21 phosphate, not purified. b) Conjugation with KLH
20 mg di KLH (esamero,MW 450000 g/mole)vengono disciolti in 10 mM potassio bicarbonato, pH 7.4, 5 mi per una concentrazione finale di 4 mg/ml. 20 mg of KLH (hexamer, MW 450,000 g / mole) are dissolved in 10 mM potassium bicarbonate, pH 7.4, 5 ml for a final concentration of 4 mg / ml.
I prodotti di cui sopra, senza purificazione, vengono disciolti nella medesima soluzione, calcolando un eccesso 200 molare di cortisolo 21-fosfato-derivato. La quantità di prodotto da utilizzare viene calcolata assumendo arbitrariamente che tutto lo steroide si trovi nella forma azido sostituita attiva: The above products, without purification, are dissolved in the same solution, calculating a 200 molar excess of cortisol 21-phosphate-derivative. The amount of product to be used is calculated by arbitrarily assuming that all the steroid is in the active substituted azide form:
(4/3 corregge la quantità in massa tenendo conto del fatto che nel mix di reazione iniziale si trovano 1 parte di azide e 3 parti di cortisolo 21-fosfato). (4/3 corrects the quantity by mass taking into account the fact that in the initial reaction mix there are 1 part of azide and 3 parts of cortisol 21-phosphate).
La soluzione viene irradiata per 20 minuti con lampada a vapori di mercurio da 200 W, non schermata, con luce raffreddata, sotto agitazione. The solution is irradiated for 20 minutes with a 200 W mercury vapor lamp, unshielded, with cooled light, under stirring.
Il prodotto viene passato su Sephadex G 50 Zim /\ 2 cm x 5 cm equilibrato con lo stesso tampone della reazione. The product is passed on Sephadex G 50 Zim / \ 2 cm x 5 cm equilibrated with the same buffer of the reaction.
La frazione di picco (A280) viene raccolta, misurandone il volume. Si assume di aver ottenuto il rapporto di sostituzione molare massimo (200:1) per predire il contenuto di fosfati per unità di volume e si valuta la quantità di fosfati su volumi e diluizioni appropriati tramite il test di Ames. Il test di Ames è stato applicato a 10 μΐ della KLH di reazione ed ha fornito un valore di A230 = 0,981. The peak fraction (A280) is collected by measuring its volume. The maximum molar substitution ratio (200: 1) is assumed to predict the phosphate content per volume unit and the amount of phosphates on appropriate volumes and dilutions is evaluated by the Ames test. The Ames test was applied to 10 μΐ of the reaction KLH and gave a value of A230 = 0.981.
Poiché il coefficiente di estinzione del test è A28O <= >0,240/0,01 prooli di fosfati,se ne ricava: Since the extinction coefficient of the test is A28O <=> 0.240 / 0.01 prooles of phosphates, we obtain:
c) Inimmizzazione di topi con il coniugato e verifica dell’attività dell'anticorpo c) Immunization of mice with the conjugate and verification of antibody activity
il coniugato aptene-carrier proteico è stato utilizzato per immunizzare topi Balb/c di 8-10 settimane, sia per via sottocutanea (con adiuvante di Freund completo ed incompleto) che per via intraperitoneale,secondo diversi schemi di trattamento. the hapten-protein carrier conjugate was used to immunize 8-10 week old Balb / c mice, both subcutaneously (with complete and incomplete Freund's adjuvant) and intraperitoneally, according to different treatment schemes.
Al termine di questo periodo di trattamento il siero degli animali è stato prelevato per verificare che questi avessero sviluppato una risposta immunitaria contro 1' antigene e che quindi producessero l'attività catalitica ricercata. At the end of this treatment period, the serum of the animals was taken to verify that they had developed an immune response against the antigen and that they therefore produced the desired catalytic activity.
Per poter eseguire tale verifica è stato messo a punto un saggio radiometrico specifico: è stato sintetizzato il [1,2,6, 7-3⁄4] - 11β,17αdi idrossi-4-pregnene-3 , 20-dione-21 emisuccinato marcato con trizio: [3H C21-H) a partire da 37 Mbq di [l,2,6,7-3⁄4] Cortisolo (Amersham) . In order to perform this verification, a specific radiometric assay was developed: [1,2,6, 7-3⁄4] - 11β, 17α of hydroxy-4-pregnene-3, 20-dione-21 hemisuccinate was synthesized labeled with tritium: [3H C21-H) starting from 37 Mbq of [1,2,6,7-3⁄4] Cortisol (Amersham).
La concentrazione di lavoro per ottenere un segnale analitico di 50.000 cpm, con un'efficienza di conteggio b<a >60%, da un volume di 100 yl è dunque la seguente: The working concentration to obtain an analytical signal of 50,000 cpm, with a counting efficiency b <a> 60%, from a volume of 100 yl is therefore the following:
La quantità in massa di marcato disponibile permetterebbe in teoria di preparare un volume di soluzione di lavoro pari a: The mass quantity of available label would allow in theory to prepare a volume of working solution equal to:
Poiché è opportuno lavorare a concentrazioni reali di substrato pari a 10 yM (come ricavabile dalla letteratura), è dunque necessario preparare la seguente quantità totale di substrato: Since it is appropriate to work at real substrate concentrations equal to 10 yM (as obtained from the literature), it is therefore necessary to prepare the following total quantity of substrate:
Questa massa di cortisolo viene dispensata in React.Vial Pierce in cui sia stato svaporato, sotto corrente d'azoto a T (mas) 30°C, il solvente del marcato. This mass of cortisol is dispensed in React.Vial Pierce in which the solvent of the label has been evaporated under a current of nitrogen at T (max) 30 ° C.
Il cortisolo viene disciolto in 200 μΐ di pirimidina secca, per la reazione con una catalisi basica con anidride succinica in eccesso tre volte molari: Cortisol is dissolved in 200 μΐ of dry pyrimidine, due to the reaction with a basic catalysis with succinic anhydride in excess of three times molars:
La miscela di reazione viene lasciata 15 ore a TA in agitazione costante. The reaction mixture is left for 15 hours at RT under constant stirring.
Al termine dell'incubazione, la miscela è trasferita in un imbuto separatore, lavando il React.Vial.con altri 200 μL di piridina. At the end of the incubation, the mixture is transferred to a separatory funnel, washing the React.Vial. With another 200 μL of pyridine.
La piridina viene solidificata con 400 pi di HCl 37%. Dopo aver diluito con acqua,si estrae con acetato di etile (3 volte). The pyridine is solidified with 400 µl of 37% HCl. After diluting with water, it is extracted with ethyl acetate (3 times).
In questo modo, come noto da una precedente esperienza a freddo, è possibile ottenere il cortisolo marcato, svaporando cristalli del prodotto desiderato. In this way, as known from a previous cold experience, it is possible to obtain the marked cortisol by evaporating crystals of the desired product.
Dopo aver preparato il substrato marcato della reazione, si è proceduto alla messa a punto del saggio radioenzimatico, così congegnato. After having prepared the labeled substrate of the reaction, we proceeded to set up the radioenzymatic assay, thus devised.
Il metodo si basa sulla variazione di solubilità conseguente al distacco della metà succinica fredda da un nucleo di cortisolo triziato. Esso prevede pertanto, al termine di una incubazione del substrato a contatto di una matrice di reazione (soluzione tampone, sopranatante di cloni o siero umano intero), una estrazione con etere della fase acquosa, seguita da evaporazione del solvente e misura del segnale radioattivo,emesso dal 3H Cortisolo,nell'estratto. L'incubazione viene terminata al tempo desiderato attraverso una jumping dilution (16 x)con acqua distillata al suo punto di fusione. Data la dipendenza della velocità di catalisi dalla concentrazione del catalizzatore e dalla temperatura, considerando che l'incubazione avviene a 38,5 "C (corrispondente alla temperatura interna umana), questa procedura permette di ridurre 16 x 24 volte la velocità di reazione (ricordando che ogni 10"C di riduzione di T,con un AE = 20 hJ/moli, la velocità si dimezza),e può pertanto ritenersi soddisfacente. The method is based on the variation in solubility following the detachment of the cold succinic half from a core of tritiated cortisol. Therefore, at the end of an incubation of the substrate in contact with a reaction matrix (buffer solution, supernatant of clones or whole human serum), an extraction of the aqueous phase with ether, followed by evaporation of the solvent and measurement of the radioactive signal, emitted by the 3H Cortisol, in the extract. The incubation is terminated at the desired time through a jumping dilution (16 x) with distilled water at its melting point. Given the dependence of the catalysis rate on the concentration of the catalyst and on the temperature, considering that the incubation takes place at 38.5 "C (corresponding to the human internal temperature), this procedure allows to reduce the reaction rate 16 x 24 times (remembering that every 10 "C of reduction of T, with an AE = 20 hJ / moles, the speed is halved), and can therefore be considered satisfactory.
La fase di estrazione con etere viene eseguita per vortexatura per 10 secondi. Il tempo così limitato ha lo scopo di permettere alla reazione di persistere in disequilibrio nella fase acquosa durante la stessa estrazione. The ether extraction step is performed by vortexing for 10 seconds. The limited time has the purpose of allowing the reaction to persist in imbalance in the aqueous phase during the same extraction.
La definizione della procedura è stata eseguita utilizzando cinque diverse concentrazioni molari di substrato incubate in siero umano a tempi diversi. The procedure definition was performed using five different molar substrate concentrations incubated in human serum at different times.
L'attività esterasica spontanea del cortisolo-21-emisuccinato nel siero umano, in confronto a campioni di controllo, è stata rilevata soltanto a concentrazioni di substrato > 100 mM ed a tempi di incubazione superiori ad un'ora. The spontaneous esterase activity of cortisol-21-hemisuccinate in human serum compared to control samples was only detected at substrate concentrations> 100 mM and at incubation times greater than one hour.
Il metodo è stato utilizzato quindi per identificare gli animali immunizzati che avevano sviluppato una risposta umorale positiva,grazie alla produzione di anticorpi con attività esterasica nei confronti del cortisolo-21-emisuccinato. I risultati di tale saggio, eseguiti ad una concentrazione di substrato pari a 10 mM e dopo un'incubazione di un'ora, hanno fornito le seguenti indicazioni: nel siero dei topi immunizzati con il coniugato aptene-carrier è stata riscontrata una attività esterasica superiore a quella presente nel siero degli animali non trattati e nei controlli in bianco. The method was then used to identify immunized animals that had developed a positive humoral response, thanks to the production of antibodies with esterase activity against cortisol-21-hemisuccinate. The results of this assay, performed at a substrate concentration of 10 mM and after an hour incubation, provided the following indications: a higher esterase activity was found in the serum of mice immunized with the hapten-carrier conjugate to that present in the serum of untreated animals and in blank controls.
Claims (20)
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