ITMI950383A1 - Procedimento enzimatico migliorato per la produzione di penicilline e cefalosporine - Google Patents

Abstract

Un procedimento per produrre penicilline o cefalosporine per reazione tra acido 6-amino-penicillanico o acido 7-amino-cefalosporanico e una amide, in mezzo acquoso, in presenza di un enzima penicillina acilasi immilizzato su di un azlattone polimerico.

Description

Descrizione di un'invenzione industriale avente titolo:

"PROCEDIMENTO ENZIMATICO MIGLIORATO PER LA PRODUZIONE DI PENICILLINE E CEFALOSPORINE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per l'ottenimento di penicilline e cefalosporine di formula (I) e(II)

in cui X è S o CH2, R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed R1 è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a mezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto.

L'US-A-3816253 descrive un procedimento per l'ottenimento di penicilline o cefalosporine per reazione di un α-aminoacido α-sostituito con un composto derivante dall'acido 7-aminocefalosporanico o 7-aminodesacetossicefalosporanico in presenza di un microrganismo attivo o enzima, in soluzione acquosa, ad una temperatura compresa tra 5°C e 50°C, preferibilmente tra 20°C e 40°C. E' stato trovato che, operando come descritto nell'USP precedentemente citato, la resa del prodotto finale desiderato viene fortemente diminuita a causa di reazioni concomitanti parallele con formazione di sottoprodotti che sono difficilmente separabili dalla miscela di reazione.

Per eliminare o perlomeno ridurre gli inconvenienti sovracitati, le 'P-A-0473008 propone un metodo per produrre penicilline e cefalosporine di formula (I) o (II). Secondo detto metodo l'acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico viene fatto reagire con un α-aminoacido αsostituito di formula R-CH2 (NH2 )-COOH o con un derivato reattivo degli stessi, in presenza di una acilasi penicillina immobilizzata, effettuando la reazione in mezzo acquoso ad una temperatura compresa tra -5°C e 20°C, preferibilmente a circa 4°C .

Le condizioni di reazione sono fornite chiaramente nell ΈΡ-Α-0473008 che riporta anche, in dettaglio, 25 esempi di realizzazione con rese molto buone (90% e più) del prodotto finale desiderato .

A questo proposito è necessario notare che un procedimento è industrialmente realizzabile solo quando le rese sono sufficientemente elevate (circa 90%) ed il prodotto finale è facilmente purificabile.

L 'EP-A-0473008 menziona in termini generici gli α-aminoacidi α-sostituiti di formula R-CH(NH2)-COOH o i loro derivati reattivi che possono essere usati come sostanze di partenza. Pur tuttavia l'unico aminoacido specificatamente esemplificato è solo il metil estere della D-fenilglicina.

I presenti richiedenti hanno effettuato molte ed accurate prove sperimentali seguendo il procedimento descritto negli esempi riportati nell ΈΡ-Α-0473008 : i risultati ottenuti sono stati però tutti scoraggianti.

E' stato infatti verificato che qualora nel mezzo di reazione il rapporto molare del citato aminoacido è inferiore a 4 moli per 1 mole di acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico usato, la resa del prodotto finale desiderato è molto bassa (inferiori a circa il 60%) e, come tale, non è industrialmente accettabile.

Buone rese, industrialmente accettabili sono invece ottenute solo se il numero di moli della D-fenilglicina metilestere in reazione è in un rapporto compreso tra 4 e 6 rispetto ad 1 mole di acido 6-amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico usato.

In questo caso, tuttavia, si verifica non solo un aumento non accettabile dei costi (il prezzo della D-fenilglicina metilestere è molto elevato), ma si formano anche dei sottoprodotti difficilmente o del tutto ineliminabili dalle desiderate penicilline o cefalosporine finali della reazione.

Tentativi sono stati effettuati usando diversi esteri della D-feniglicina o di differenti aminoacidi: tutti questi tentativi sono stati infruttuosi .

Uguali risultati negativi sono stati ottenuti usando numerosi derivati reattivi degli aminoacidi.

La domanda tedesca di brevetto DOS 2214444 riporta una sintesi enzimatica di cefalosporine (in particolare della cefalexina) per reazione del 7-ADCA con fenilglicina amide in presenza dell'enzima penicillina acilasi: le rese ottenute sono molto basse .

PCT/DK91/00188 (W092/01061) e PCT/DK92/00388 (WO93/12250) riportano metodi per la preparazione di antibiotici β-lattamici a mezzo di acilazione enzimatica, secondi i quali una amide di formula (III)

viene fatta reagire con acido 6-amino-penicillanico o 7-amino-cefalosporanico in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato.

Tali metodi si dimostrano attuabili : è stato però trovato che un apprezzabile quantitativo di amide (III) viene idrolizzato dall'enzima medesimo, aumentando in tal modo le impurezze dei prodotti finali desiderati: anche una discreta quantità del prodotto finale viene idrolizzata dallo stesso enzima.

I richiedenti hanno effettuato numerosi esperimenti seguendo le indicazioni delle predette domande PCT, usando come agenti acilanti amidi diverse, differenti enzimi come sorgente batterica e differenti matrici solide per immobilizzare gli enzimi .

I risultati ottenuti, tra di loro comparabili, hanno sempre mostrato tuttavia un apprezzabile idrolisi sia delle amidi impiegate che dei desiderati prodotti finali.

I richiedenti hanno invece sorprendentemente trovato che pur seguendo gli stessi procedimenti descritti nei sopra citati W092/01061 e WO93/12250, ma usando per l'immobilizzazione degli enzimi un particolare supporto che è un azlattone polimerico, già conosciuto e comunemente usato come mezzo di biosupporto. per cromatografia e venduto della Minnesota Mining and Manufactoring Co con il marchio EMPHAZE, l'idrolisi delle amidi (III) e dei prodotti finali viene sostanzialmente diminuita.

Tale diminuzione può essere quantificata nell'ordine di circa il 30% e, ciò è importante, non solo dal punto di vista dell'economia del processo ma in special modo perchè i prodotti finali possono essere ottenuti con alto grado di purezza.

Viene inoltre evitata la cristallizzazione del prodotto idrolizzato (feniglicina e suoi derivati): a questo riguardo è necessario mettere in risalto che la cristallizzazione può facilmente aver luogo qualora vengono usate matrici immobilizzanti differenti che sono state testate.

E' stato anche trovato che l'idrolisi può essere ulteriormente ridotta per aggiunta al mezzo di realizzazione di inibitori selettivi di idrolisi quali gli acidi fenil e fenossiacetici, l'etil acetato, alcol isobutilico o l'acido L-fenilmandelico, tutti a concentrazione molto bassa.

Come conseguenza, la presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per produrre penicilline e cefalosporine di formula (I) e (II) come sopra specificato, in cui un acido 6-amino-penicillanico o 7-amino-cefalosporanico di formula (IV) o (V)

in cui X e hanno il significato detto sopra viene fatto reagire ad una temperatura compresa tra -5°C e 35°C, in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato, con una amide di formula (III)

dove R è come sopra specificato, R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio o i loro sali, in un rapporto molare da 1 a 3 moli di detta amide (III) per 1 mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che detto enzima è immobilizzato sull 'azlattone polimerico .

In particolare detta amide (III) è la D-feniglicina o un suo sale con un acido organico o inorganico.

L'invenzione si riferisce anche a composizioni farmaceutiche comprendenti penicilline o cefalosporine preparate a mezzo del procedimento descritto nella presente invenzione, come pure a diluenti o veicolanti farmaceuticamente accettabili .

Le composizioni farmaceutiche contenenti le penicilline o cefalosporine vengono comunemente preparate secondo metodi convenzionali e sono somministrate in adatta forma farmaceutica.

Con riferimento alle formula (I) e (II), R può essere ad esempio un gruppo fenile, cicloesadienile , cicloesenile non sostituito o sostituito con un ossidrile, alogeno, alchile, alcossi, carbossile, nitro o animino.

R1 può essere un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile o metilenico legato ad un gruppo organico ed in particolare ad un gruppo alcossi, alcossicarbonile o un gruppo eterociclico a cinque o sei termini contenente da 1 a 4 eteroatomi scelti fra O, S ed N legati al gruppo metilenico a mezzo di un atomo di O, S, N e opzionalmente sostituiti con uno o più gruppi scelti tra un idrossile, alogeno, alchile, alcossi, carbonile, carbossi, ciano, amino e simili.

I termini alchile ed alcossi qui usati si riferiscono a gruppi aventi da 1 a 6 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 4 atomi di carbonio .

Con riferimento agli oc-aminoacidi le cui amidi hanno formula (III), si possono citare come esempio la D-fenilglicina, D-p-idrossifenilglicina e la D-1,4-cicloesadien-1-il-glicina.

Sali adatti dell 'amide sono quelli con acido inorganico quali l'acido cloridrico, fluoridrico, bromidrico, solforico o nitrico, oppure con un acido organico, ad esempio l'acido acetico, formico o maleico.

I seguenti acidi sono di particolare interesse tra i composti di formula (IV) e (V):

l'acido 6-aminopenicillanico, 7-amino-cef alosporanico, 7-amino-desacetossicef alosporanico , 7-amino-3-cloro-cef alosporanico .

L'enzima usato nel presente procedimento può essere una acilasi penicillinica o una amidasi penicillinica.

L'acilasi penicillinica o l'enzima amidasi può derivare da qualsiasi sorgente microbica nota.

In particolare da microrganismi del genere Xanthomonas, Pseudomonas, Acromonas, Escherichia, Arthrobacter, Acetobacter, Mycoplasma protaminobacter, Kluyvera, Corynbactirium e Baciilus.

Particolarmente preferiti sono gli enzimi derivanti dall'E. coli: questi infatti sono facilmente disponibili in commercio ed a buon mercato sia liberi che in orma immobilizzata. Possono essere particolarmente usati la penicillina acilasi o amidasi classificati come EC 3.5.1.11.

I seguenti esempi illustrano l'invenzione ESEMPIO 1

immobilizzazione della Penicillina G acilasi su di un supporto funzionale di azlattone polimerico.

138,8 mg di penicillina acilasi in 2 ml di una soluzione di fosfato 0.1M a pH 7.5, vengono miscelati con 28 ml di tampone legante 1.1 M di sodio solfato e 0.1 M sodio fosfato a pH 7.4. 1 g di supporto funzionale di azlattone (EMPHASE™ ) fu portato in una provetta per centrifuga da 50 mi. L'enzima, in soluzione tampone legante, fu aggiunto a perline anidre e mescolato su di un piatto rotante, poco a poco, e per 3 ore a temperatura ambiente. L'eccesso di soluzione tampone legante fu eliminato e le perline vennero lavate per cinque volte con 10 mi per volta di PBS (20 mM fosfato, 0,9% sodio cloruro a pH 7.4).

Dopo l'immobilizzazione su questo supporto l'attività dell'enzima risultò >90%.

ESEMPIO 2

Cefaclor con β-naftolo presente nel reattore enzimatico.

11.69 g (49.82 mmoli) di acido 3-cloro-7-amino-desacetossi-cefalosporanico (3Cl/Nu) e 15.22 g (101-47 mmoli) di D-fenilglicina amide (FGA) vennero disciolti in 196 ml di acqua.

A detta soluzione vennero aggiunti nello stesso reattore 8 g (55.44 mmoli) di β-naftolo finemente macinato. L'acilazione venne effettuata con 21.2 g (3700 I.U.) di penicillina G amidasi (PGA* ), preparata come nell'esempio 1, nelle condizioni seguenti: il pH fu mantenuto stabile a 6.8 mediante acido solforico 4N ad una temperatura di 10°C.

Dopo 2 ore, il 98% di 3Cl/Nu si era trasformato in cefaclor [acido 7-(D-2-amino-2-fenilacetamido-3-cloro-3-cefem-4-carbossilico] complessato con il β-naftolo. Dopo il 98% di conversione del 3Cl/Nu, il rapporto molare in selettività per la,produzione sintetica di cefaclor rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 4.12 rispetto a 3.56 ottenuto con PGA supportato su perline di oxirano poliacrilico.

ESEMPIO 3

Cefaclor complessato in continuo con β-naftolo in un reattore separato di cristallizzazione.

47.11 g (203.37 mmoli) di 3Cl/Nu e 87.38 (582.53 mmoli) di FGA vennero disciolti in un volume totale di 1070 ml di acqua. Quindi nel reattore di cristallizzazione si aggiunsero 30 g (207.90 mmoli) di β-naftolo finemente macinato. La soluzione fu portata nel reattore di enzimazione in cui l'acilazione venne effettuata per aggiunta di 25 g ( 4500 IU ) di PGA.

Il prodotto complessato venne filtrato e le acque madri riportate nel reattore di enzimazione per completare la conversione. Il processo fu efettuato nelle seguenti condizioni: il pH venne mantenuto stabile a 6.8 con acido solforico 4N ad una temperature di 10°C. Dopo 3 ore di riciclaggio, il 94% di 3Cl/Nu era stato trasformato in cefaclor conplessato con il β-naftolo nel reattore di cristallizzazione..

Dopo detta conversion del 94% del 3Cl/NU, la selettività molare della produzione sintetica di ccefaclor rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era pari a 3.05 comparata a 2.37 ottenuta con PGA supportata su perline di ossirano poliacrilico.

ESEMPIO 4

Cefaclor diidrato cristallizzato in continuo in un reattore separato.

Si adopera la stessa soluzione iniziale dell'esempio 3.

La soluzione venne riciclata dal reattore enzimatico, in cui l'acilazione venne effettuata con 25 g (4500 I.U.) di PGA nel reattore di cristallizzazione in cui il pH fu abbassato a 6.4 per promuovere la precipitazione del cefaclor.2H2O. Il prodotto cristallizzato fu separato per filtrazione e l'acqua madre fu riportata nel reattore enzimatico per completare la conversione.

Il processo fu eseguito nelle seguenti condizioni: il pH fu mantenuto costante a 6.4 mediante acido solforico 4N nel reattore di cristallizzazione ad una temperatura di 2°C per ambedue i reattori.

Dopo 3 ore di riciclaggio, il 93% di 3Cl/Nu si era trasformato in cefaclor .2H2O nel reattore di cristallizzazione. Dopo il 93% di conversione del 3Cl/Nu, il rapporto molare di selettività della produzione sintetica di cefaclor rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2.61 rispetto a 2.02 ottenuto con PGA supportato su perline di ossirano poliacrilico.

ESEMPIO 5

Acilazione del 7-ADCA a cefalexina mediante FGA con una enzimazione a doppio stadio e successiva cristallizzazione-25.05 g (117.05 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA) e 30.05 g (198.99 moli) di FGA vennero disciolti in un volume totale di 498 mi di acqua.

L'acilazione fu efettuata a mezzo di 21.0 g (3750 I.U.) di PGA nelle condizioni seguenti: pH iniziale del primo stadio 6.57 ad una temperatura di 3°C. Dopo circa 1 ora il 61.9% di 7-ACA si era trasformato in cefalexina [acido 7-(D-2 amino-2-fenilacetamido) 3-metil-3-cefem-4-carbossilico].

La maggior parte della cefalexina venne separata dalle acque madri complessandola con 11.50 g (79.50 g (79.70 mmoli) di β-naftolo. Il secondo stadio della reazione venne quindi completato trattando le acque madri con lo stesso PGA come sopra. Dopo circa 2 ore, il 94.5% di 7-ACA era stato trasformato in cefalexina,, in totale dopo i due stadi. La maggior parte della cefalexina venne isolata dalle acque madri ricche del secondo stadio complessandola con 7.50 g (51.98 mmoli) di βnaftolo. Dopo il 94.5% di conversione del 7-ADCA, il rapporto molare in selettività della produzione sintetica di cefalexina rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2.27 rispetto a 1.53 ottenuto con PGA supportato su perline di ossirano poliacrilico.

ESEMPIO 6

Acilazione dell'acido 7-amino-3-cloro-carbacef em a Loracarbef con FGA.

3.32 g (15.31 moli) di acido 3-cloro-7-aminocarbacefem (3Cl/CNU) e 8.65 g (57.70 mmoli) di FGA furono disciolti in un volume totale di 190 ml di acqua .

L'acilazione venne effettuata con 5g (895 I.U.) di PGA nelle seguenti condizioni: il pH fu mantenuto stabile a 6.2 con acido cloridrico IN ad una temperatura di 3°C. Dopo 2 ore, l'89.5% di 3Cl/CNu si era trasformato in loracarbef [acido 7-(D-2-amino-2-f enilacetantido)-3-cloro-3-carbacefem-4-carbossilico ].

Dopo l'89.5% di conversione di 3Cl/CNU, il rapporto molare di selettività della produzione sintetica di loracarbef rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2.76 rispetto a 2.15 ottenuto con PGA supportato su perline di ossirano poliacrilico.

ESEMPIO 7

Inibizione di idrolisi del PGA con acido fenilacetico durante l'acilazione del 7-ADCA a cefalexina.

13 g (60.75 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA), 46.5 g (230.84 mmoli) di D-fenilglicina metilestere cloridrato (FGME) e 140 mg (1.03 mmoli) di acido fenilacetico vennero disciolti in un volume totale di 1000 ml di acqua. L'acilazione venne effettuata con 17.5 g (3000 I.u.) di PGA nelle seguenti condizioni: pH iniziale di 7.25 ad una temperatura di 3°C. Dopo circa 3 ore, il 93% di 7-ADCA si era trasformata in cefalexina. Dopo il 93% di conversione del 7-ADCA, il rapporto molare di produzione sintetica di cefalexina rispetto alla produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2-15 rispetto a 1.44 di quello ottenuto senza inibitore.

ESEMPIO 8

Inibizione di idrolisi del PGA mediante etile acetato durante l'acilazione di 3Cl/Mu a cefaclor.

11.40 g (48.6 mmoli) di 3Cl/NU e 13.67 (91.13 mmoli) di FGA vennero disciolti in un volume totale di 200 ml di acqua. Quindi alla soluzione vennero aggiunti 1.8 g (20.43 mmoli) di acetato di etile.

L'acilazione venne efettuata con 6.8 g (1220 I.U.) di PGA nelle condizioni seguenti: pH iniziale di 6.8 ad una temperatura di 20°C.

Dopo 2 ore, il 92.5% di 3Cl/Nu si era trasformato in cefaclor. Dopo il 92.5 di conversione del 3Cl/Nu, il rapporto molare di produzione sintetica del cefaclor rispetto a quello di produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2.03 rispetto quello ottenuto di 1.49 in assenza di inibitore .

ESEMPIO 9

Inibizione di idrolisi del PGA mediante isobutano lo durante l'acilazione di 3Cl/Nu a cefaclor.

6.80 g (29.37 mmoli) di 3Cl/Nu e 17.42 (116.13 mmoli) di FGA vennero disciolti in un volume totale di 205 ml di acqua.

Si aggiunsero quindi alla soluzione 1.6 g (21.59 mmoli) di isobutanolo. L'acilazione venne effettuata con 10.3 g (1800 I.U.) di PGA nelle condizioni seguenti: il pH fu mantenuto stabile a 6.8 con acido cloridrico IN ad una temperatura di 10°C. Dopo 5 ore, il 92.2% di 3Cl/Nu era stato trasformato in cefaclor. Dopo il 92.2% di conversione di 3Cl/Nu, il rapporto molare della produzione sintetica di cefaclor rispetto a quello di produzione idrolitica di D-fenilglicina era di 2.49 rispetto a quello ottenuto di 1.557 in assenza di inibitore

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per produrre una penicillina o cefalosporina di formula (I) o (II) in cui X è S o CH2, R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a mezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto, in cui: un acido 6-amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico di formula (IV) o (V) in cui X ed R1 sono come sopra definiti, viene fatto reagire in mezzo acquoso ad una temperatura tra -5°C e 35°C in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato, con una amide di formula (III) in cui R è come sopra definito, R2 ed R3 sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare o ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio o i loro sali, in rapporto molare da 1.5 a 3 moli di detta amide (III) per 1 mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che detto enzima è immobilizzato su di un azlattone polimerico .
2. 2. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta amide (III) è la D-fenilglicina amide o un suo sale con un acido organico o inorganico.
3. 3. Una composizione farmaceutica che comprende penicillina o cefalosporine preparate con un procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 con un accettabile diluente o veicolante.
4. 4. Un enzima penicillina acilasi immobilizzato su di un azlattone polimerico