ITMI20110678A1 - COMPOSITION AND METHOD FOR THE CRIOCONSERVATION OF CELLS - Google Patents
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Description
Titolo: “Composizione e metodo per la crioconservazione di cellule†Title: â € œComposition and method for cryopreservation of cellsâ €
Descrizione Description
La presente invenzione ha per oggetto una composizione adatta alla crio-conservazione a breve e a lungo termine di cellule di mammifero per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa. The present invention relates to a composition suitable for the short and long term cryopreservation of mammalian cells for research purposes and for applications in regenerative medicine.
Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per la crio-conservazione di cellule che comprende i) l’internalizzazione di uno zucchero; ii) l’esposizione delle cellule alla composizione di crio-conservazione; iii) il congelamento delle cellule in detta composizione di crio-conservazione. La composizione di crio-conservazione e la metodica oggetto della presente invenzione sono applicabili su cellule conservate in sospensione così come su cellule congelate in adesione. A further object of the present invention is a method for the cryopreservation of cells which comprises i) the internalization of a sugar; ii) the exposure of the cells to the cryopreservation composition; iii) freezing of the cells in said cryopreservation composition. The cryopreservation composition and the method object of the present invention are applicable on cells preserved in suspension as well as on cells frozen in adhesion.
Stato dell’arte State of the art
La medicina rigenerativa rappresenta un approccio terapeutico finalizzato alla rigenerazione biologica del tessuto/organo deteriorato, anziché alla sua sostituzione con una protesi o un trapianto. Regenerative medicine represents a therapeutic approach aimed at the biological regeneration of the deteriorated tissue / organ, rather than replacing it with a prosthesis or transplant.
Le terapie cellulari rientrano in questo ambito. Inizialmente dirette verso situazioni per le quali non erano presenti alternative terapeutiche, le terapie cellulari si sono in seguito sviluppate in maniera tale da prevedere un loro impiego esteso al trattamento di patologie degenerative largamente diffuse. Cellular therapies fall into this area. Initially directed towards situations for which there were no therapeutic alternatives, cellular therapies later developed in such a way as to provide for their extensive use in the treatment of widespread degenerative diseases.
Le capacità di proliferazione e differenziamento che caratterizzano le cellule staminali ha certamente contribuito a questo sviluppo. Infatti, la possibilità di disporre di popolazioni di cellule staminali totipotenti, in grado cioà ̈ di dare origine a qualsiasi tipo di cellula matura, amplia in maniera considerevole le possibili ricadute della terapia cellulare nella medicina rigenerativa. The proliferation and differentiation capabilities that characterize stem cells have certainly contributed to this development. In fact, the possibility of having populations of totipotent stem cells, capable of giving rise to any type of mature cell, considerably expands the possible effects of cell therapy in regenerative medicine.
E’ pertanto fortemente avvertita la necessità di poter conservare per utilizzi futuri cellule di mammifero, comprese cellule umane, non solo per applicazioni nell’ambito della ricerca ma anche per applicazioni di medicina rigenerativa. A titolo di esempio, ad oggi sono state impiegate con successo cellule staminali nella medicina rigenerativa veterinaria, in particolare in patologie cutanee, osteocondrali e tendinee del cavallo. Il vantaggio di poter disporre di cellule staminali crio-conservate adatte a tali applicazioni à ̈ evidente. Un altro ambito dove vi à ̈ necessità di disporre di metodiche di conservazione adatte riguarda le cellule del cordone ombelicale, cellule dalle enormi potenzialità che vengono conservate per possibili utilizzi futuri in trapianti autologhi e/o eterologhi. The need is therefore strongly felt to be able to preserve mammalian cells for future use, including human cells, not only for research applications but also for regenerative medicine applications. As an example, stem cells have been successfully used in veterinary regenerative medicine, in particular in skin, osteochondral and tendon pathologies of the horse. The advantage of having cryopreserved stem cells suitable for such applications is evident. Another area where it is necessary to have suitable conservation methods concerns the cells of the umbilical cord, cells with enormous potential that are preserved for possible future use in autologous and / or heterologous transplants.
Dallo stato dell’arte sono noti metodi di conservazione di cellule di mammifero che prevedono il congelamento delle stesse in presenza di proteine come stabilizzanti e di un agente in grado di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio che andrebbero a distruggere in maniera irreversibile la struttura della cellula stessa. E’ consolidato l’utilizzo per il congelamento di una composizione che comprende siero fetale bovino che apporta le proteine necessarie e dimetilsolfossido (DMSO) in concentrazioni generalmente pari al 10% quale crioprotettore. Il DMSO viene utilizzato in quanto à ̈ un solvente particolarmente igroscopico in grado di attraversare la membrana cellulare. Laddove à ̈ necessario conservare le cellule per applicazioni nell’ambito della medicina rigenerativa, la conservazione deve avvenire secondo criteri ben definiti che implicano il superamento di alcuni limiti intrinseci alla metodica di congelamento oggi in uso. In particolare, va escluso il contatto delle cellule con proteine di specie diversa da quella del soggetto ricevente, di conseguenza non à ̈ ammesso l’utilizzo del siero fetale bovino. Va anche escluso il contatto con sostanze dotate di tossicità , tra le quali figura appunto il DMSO. Inoltre il DMSO, per meccanismi ancora non del tutto chiariti, agisce da induttore del differenziamento cellulare, pertanto il suo utilizzo nella conservazione di cellule totipotenti da mantenere nello stato indifferenziato à ̈ fortemente sconsigliato. From the state of the art, mammalian cell preservation methods are known which involve freezing them in the presence of proteins as stabilizers and an agent capable of avoiding the formation of ice crystals that would irreversibly destroy the structure. of the cell itself. The use for freezing of a composition that includes fetal bovine serum which provides the necessary proteins and dimethylsulfoxide (DMSO) in concentrations generally equal to 10% as cryoprotectant is consolidated. DMSO is used as it is a particularly hygroscopic solvent capable of crossing the cell membrane. Where it is necessary to preserve cells for applications in the field of regenerative medicine, conservation must take place according to well-defined criteria that imply the overcoming of some intrinsic limits of the freezing method in use today. In particular, the contact of the cells with proteins of a species other than that of the recipient must be excluded, consequently the use of fetal bovine serum is not allowed. Contact with toxic substances, including DMSO, should also be excluded. Furthermore, DMSO, for mechanisms not yet fully understood, acts as an inducer of cell differentiation, therefore its use in the conservation of totipotent cells to be kept in the undifferentiated state is strongly discouraged.
Con l’obiettivo di individuare sostanze alternative a quelle di norma utilizzate per il congelamento di cellule, l’attenzione si à ̈ rivolta verso gli zuccheri. E’ infatti noto che zuccheri, tra i quali il trealosio, esercitano un’attività stabilizzante sulle cellule. L’alta concentrazione di trealosio nei tessuti di alcuni organismi detti criptobionti consente loro di sopravvivere in condizioni di mancanza di acqua ed a temperature molto elevate. Questi organismi, una volta reidratati, riprendono il loro normale ciclo vitale, senza presentare alcun danno. Grazie a tali proprietà stabilizzanti, soluzioni contenenti trealosio vengono utilizzate per prolungare la conservazione di tessuti e di organi. Ai fini di poter utilizzare le proprietà del trealosio per la conservazione di cellule, à ̈ necessario internalizzarlo nelle stesse cellule. Infatti la membrana cellulare non à ̈ permeabile agli zuccheri. Diverse metodiche sono state sviluppate per favorire l’internalizzazione cellulare di sostanze esogene, tra le quali l’uso di proteine batteriche (α- emolisina) per la formazione di pori transienti, la lipofezione, l’elettroporazione e la stimolazione dei recettori P2x7 mediante l’impiego dei rispettivi agonisti Adenosina 5-trifosfato (ATP) e/o suoi analoghi come 2’-3'-O-(4-Benzoilbenzoil)adenosina-5'-trifosfato (BzATP). Tuttavia queste metodiche, efficaci e largamente utilizzate in molteplici ambiti, risultano essere troppo invasive e non applicabili in maniera propedeutica alla conservazione delle cellule. With the aim of identifying alternative substances to those normally used for freezing cells, attention has turned to sugars. It is in fact known that sugars, including trehalose, exert a stabilizing activity on cells. The high concentration of trehalose in the tissues of some organisms called cryptobionts allows them to survive in conditions of lack of water and at very high temperatures. Once rehydrated, these organisms resume their normal life cycle, without presenting any damage. Thanks to these stabilizing properties, solutions containing trehalose are used to prolong the preservation of tissues and organs. In order to be able to use the properties of trehalose for cell preservation, it is necessary to internalize it in the same cells. In fact, the cell membrane is not permeable to sugars. Various methods have been developed to favor the cellular internalization of exogenous substances, including the use of bacterial proteins (Î ± - haemolysin) for the formation of transient pores, lipofection, electroporation and stimulation of P2x7 receptors through the use of the respective agonists Adenosine 5-triphosphate (ATP) and / or its analogues such as 2â € ™ -3'-O- (4-Benzoylbenzoyl) adenosine-5'-triphosphate (BzATP). However, these methods, effective and widely used in many areas, are too invasive and not applicable in a preparatory way to the conservation of cells.
US 7,314,755 descrive l’utilizzo di ATP per la permeabilizzazione della membrana cellulare, permeabilizzazione ottenuta mediante l’azione esercitata dall’ATP sui recettori P2X7. I recettori P2X7 appartengono alla famiglia dei purinocettori per l’ATP e funzionano da canali-ionici ligando operati, responsabili della formazione di pori di membrana permeabili a molecole anche di grandi dimensioni. US 7,314,755 descrive un metodo che prevede l’ingresso ATP-mediato di trealosio nella cellula, suggerendo che cellule così trattate sono adatte alla conservazione come cellule disidratate o congelate. Non viene però suggerita alcuna formulazione di crioconservazione, ed é noto che pellet di cellule, indipendentemente da eventuali trattamenti ai quali le cellule stesse siano state preventivamente esposte, non sono adatti alla crio-conservazione se non risospesi in un solvente opportuno. US 7,314,755 describes the use of ATP for the permeabilization of the cell membrane, permeabilization obtained through the action exerted by ATP on P2X7 receptors. P2X7 receptors belong to the family of purinoreceptors for ATP and function as ligand-operated ion-channels, responsible for the formation of membrane pores permeable to even large molecules. US 7,314,755 describes a method involving the ATP-mediated entry of trehalose into the cell, suggesting that cells thus treated are suitable for storage as dehydrated or frozen cells. However, no cryopreservation formulation is suggested, and it is known that cell pellets, regardless of any treatments to which the cells themselves have been previously exposed, are not suitable for cryopreservation if not resuspended in a suitable solvent.
E’ scopo della presente invenzione quello di mettere a disposizione una composizione e un metodo adatti alla crio-conservazione a lungo termine di cellule di mammifero per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa. It is an object of the present invention to provide a composition and a method suitable for the long-term cryopreservation of mammalian cells for research purposes and for applications in regenerative medicine.
Descrizione dell’invenzione Description of the invention
La presente invenzione descrive una composizione adatta alla crio-conservazione a breve e a lungo termine di cellule di mammifero preventivamente trattate con zuccheri, preferibilmente con trealosio, per scopi di ricerca e per applicazioni nella medicina rigenerativa. E’ inoltre descritto un metodo per la crio-conservazione che comprende i) l’internalizzazione di uno zucchero, preferibilmente di trealosio, mediata da esposizione a shock osmotici e/o a shock termici; ii) l’esposizione di dette cellule alla composizione di crio-conservazione; iii) il congelamento di dette cellule in detta composizione di crio-conservazione. La composizione di crio-conservazione e la metodica oggetto della presente invenzione sono applicabili su cellule da conservarsi in sospensione così come su cellule da conservarsi in adesione. The present invention describes a composition suitable for the short and long-term cryopreservation of mammalian cells previously treated with sugars, preferably with trehalose, for research purposes and for applications in regenerative medicine. A method for cryopreservation is also described which includes i) the internalization of a sugar, preferably trehalose, mediated by exposure to osmotic and / or thermal shocks; ii) the exposure of said cells to the cryopreservation composition; iii) freezing said cells in said cryopreservation composition. The cryopreservation composition and the method object of the present invention can be applied to cells to be preserved in suspension as well as to cells to be preserved in adhesion.
La descrizione à ̈ integrata dagli esempi che seguono e che formano parte integrante della stessa. The description is supplemented by the following examples which form an integral part of it.
Descrizione delle figure Description of the figures
Figura 1: rappresentazione grafica del congelamento programmato tramite Rate Freezer. Figure 1: graphic representation of the freezing programmed using Rate Freezer.
Figura 2: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule neurali staminali fetali umane derivate dal midollo spinale, linea CB660sp. In A e B sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, ottenuti congelando con una metodica che non comprende, in A, o comprende, in B, l’utilizzo di ATP. In C à ̈ riportata un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento. Figure 2: cell viability analysis performed on human fetal neural stem cells derived from the spinal cord, CB660sp line. In A and B are reported the cell viability data before freezing, at the time of thawing (t = 0h), and 24h after thawing, obtained by freezing with a method that does not include, in A, or includes, in B, the € ™ use of ATP. C shows a representative image of the crop 24 hours after thawing.
Figura 3: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule staminali neurali murine di origine embrionale . In A sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, in B un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento. Figure 3: cell viability analysis performed on mouse neural stem cells of embryonic origin. In A the cell viability data are shown before freezing, at the time of thawing (t = 0h), and 24h after thawing, in B a representative image of the culture 24h after thawing.
Figura 4: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule di glioma umano, G179. In A e B sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, ottenuti congelando con una metodica che non comprende, in A, o comprende, in B, l’utilizzo di ATP. Figure 4: cell viability analysis performed on human glioma cells, G179. In A and B are reported the cell viability data before freezing, at the time of thawing (t = 0h), and 24h after thawing, obtained by freezing with a method that does not include, in A, or includes, in B, the € ™ use of ATP.
Figura 5: analisi di vitalità cellulare effettuata su cellule staminali neurali umane AF22. In A sono riportati i dati di vitalità cellulare prima del congelamento, al momento dello scongelamento (t=0h), e 24h dopo lo scongelamento, in B un’immagine rappresentativa della coltura a 24h dallo scongelamento. Figure 5: cell viability analysis performed on human AF22 neural stem cells. In A the cell viability data are shown before freezing, at the time of thawing (t = 0h), and 24h after thawing, in B a representative image of the culture 24h after thawing.
Descrizione dettagliata dell’invenzione: Detailed description of the invention:
E’ oggetto della presente invenzione una composizione adatta alla crio-conservazione di cellule di mammifero, comprese cellule umane, somatiche o germinali. Detta composizione di crioconservazione comprende uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule di mammifero e opzionalmente DMSO in quantità minore o uguale al 2% v/v. Detta soluzione di crio-conservazione non contiene proteine di origine animale. Detta composizione di crio-conservazione comprende: NaCl da 50 a 150 mM, preferibilmente circa 145 mM; KCl 1-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; gluconato sale sodico 0.5-6 mM, preferibilmente circa 3 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 25 mM; mioinositolo 100-1000 µM, preferibilmente circa 500 µM, un inibitore delle caspasi, preferibilmente Z-VAD-FMK 100-1000 nM, preferibilmente circa 500 nm, GIBCO MEM Amino Acids 100X, GIBCO MEM Vitamin Solution 100X; uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule 100-1000 mM, preferibilmente trealosio circa 500 mM. Opzionalmente, detta composizione di crioconservazione potrà contenere DMSO in quantità minore o uguale al 2% v/v. Detta composizione di crio-conservazione avrà un’osmolarità compresa tra 1100 e 1400 mOsm, preferibilmente detta osmolarità sarà di circa 1278 mOsm The object of the present invention is a composition suitable for the cryopreservation of mammalian cells, including human, somatic or germ cells. Said cryopreservation composition comprises a sugar not physiologically present in mammalian cells and optionally DMSO in a quantity lower than or equal to 2% v / v. Said cryopreservation solution does not contain proteins of animal origin. Said cryopreservation composition comprises: NaCl from 50 to 150 mM, preferably about 145 mM; KCl 1-20 mM, preferably about 5 mM; glucose 2-20 mM, preferably about 5 mM; gluconate sodium salt 0.5-6 mM, preferably about 3 mM; Hepes 5-50 mM, preferably about 25 mM; myoinositol 100-1000 µM, preferably about 500 µM, a caspase inhibitor, preferably Z-VAD-FMK 100-1000 nM, preferably about 500 nm, GIBCO MEM Amino Acids 100X, GIBCO MEM Vitamin Solution 100X; a sugar not physiologically present in 100-1000 mM cells, preferably about 500 mM trehalose. Optionally, said cryopreservation composition may contain DMSO in quantities less than or equal to 2% v / v. Said cryo-conservation composition will have an osmolarity between 1100 and 1400 mOsm, preferably said osmolarity will be about 1278 mOsm
Il metodo di crio-conservazione comprende l’esposizione di cellule che abbiano preventivamente internalizzato uno zucchero a detta composizione di crio-conservazione. In una forma di realizzazione, detta composizione di crio-conservazione viene mantenuta in ghiaccio prima dell’utilizzo. The cryopreservation method includes the exposure of cells that have previously internalized a sugar to said cryopreservation composition. In one embodiment, said cryopreservation composition is kept on ice before use.
I migliori risultati in termini di efficacia della procedura di crio-conservazione sono stati ottenuti utilizzando detta composizione di crioconservazione secondo la metodica che viene qui di seguito descritta e che à ̈ parte integrante della presente invenzione. The best results in terms of efficacy of the cryopreservation procedure have been obtained using said cryopreservation composition according to the method described below and which is an integral part of the present invention.
Il metodo di crio-conservazione comprende: The cryopreservation method includes:
1) l’internalizzazione nelle cellule di uno zucchero non presente fisiologicamente in dette cellule, laddove l’internalizzazione à ̈ mediata da esposizione a shock osmotico e/o shock termico ed, opzionalmente, ad esposizione ad ATP o analoghi dell’ATP; 1) the internalization in the cells of a sugar not physiologically present in these cells, where the internalization is mediated by exposure to osmotic shock and / or thermal shock and, optionally, to exposure to ATP or ATP analogues ;
2) l’esposizione di dette cellule alla composizione di crio-conservazione; 2) the exposure of said cells to the cryopreservation composition;
3) il congelamento di dette cellule. 3) freezing of said cells.
Detto processo 1) di internalizzazione dello zucchero comprende due fasi: a) modifica delle conduttanze ioniche di membrana con conseguente aumento della fluidità e trasporto passivo delle molecole presenti nell’ambiente extracellulare; b) ingresso dello zucchero. Said process 1) of internalization of the sugar comprises two phases: a) modification of the ionic conductances of the membrane with consequent increase in the fluidity and passive transport of the molecules present in the extracellular environment; b) entry of sugar.
In detta fase a) le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii)opzionalmente, lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, preferibilmente ad una T compresa tra 0°C e 4°C; iii)opzionalmente, rapido lavaggio con soluzione di distacco, preferibilmente comprendente tripsina EDTA o Accutase<TM>; iv)opzionalmente, aggiunta di una soluzione salina, detta soluzione B che, in una forma di realizzazione, può contenere un agente porante, preferibilmente ATP o suoi analoghi. Detta soluzione B verrà mantenuta sulle cellule per un tempo compreso tra i 5 e i 30 minuti, preferibilmente per 15 minuti, ad una T compresa tra i 4 e i 50°C, preferibilmente a circa 37°C. In said step a) the cells are deprived of the culture medium and exposed to a washing cycle which comprises: i) washing with PBS (saline phosphate solution); ii) optionally, rapid washing with saline solution, said solution A, which comprises EDTA, preferably at a T between 0 ° C and 4 ° C; iii) optionally, rapid washing with release solution, preferably comprising trypsin EDTA or Accutase <TM>; iv) optionally, addition of a saline solution, called solution B which, in one embodiment, can contain a poring agent, preferably ATP or its analogues. Said solution B will be kept on the cells for a time comprised between 5 and 30 minutes, preferably for 15 minutes, at a T comprised between 4 and 50 ° C, preferably at about 37 ° C.
Laddove le cellule vengono conservate in adesione, detta fase a) comprende detti passaggi i), ii) e, in detto passaggio iv) si aggiunge detta soluzione B che, in una forma di realizzazione, può contenere un agente porante, preferibilmente ATP o suoi analoghi. Where the cells are preserved in adhesion, said step a) comprises said steps i), ii) and, in said step iv) said solution B is added which, in one embodiment, can contain a poring agent, preferably ATP or its analogues.
Si passa quindi a detta fase b), dove dette cellule vengono esposte a una soluzione di internalizzazione, detta soluzione C, che comprende uno zucchero non presente fisiologicamente nelle cellule di mammifero, preferibilmente trealosio. Detta soluzione C viene preferibilmente mantenuta a T compresa tra 0°C e 4°C e dette cellule vengono incubate in detta soluzione di internalizzazione per un tempo compreso tra 5 e 60 minuti, preferibilmente per circa 15 minuti a una T compresa tra i 4 e i 50°C, preferibilmente a circa 37°C. Per favorire l’internalizzazione dello zucchero si interviene meccanicamente, ad esempio con leggeri urti sulle pareti della piastra o della flask nella quale le cellule sono adese. One then passes to said step b), where said cells are exposed to an internalization solution, called solution C, which comprises a sugar not physiologically present in mammalian cells, preferably trehalose. Said solution C is preferably kept at a T comprised between 0 ° C and 4 ° C and said cells are incubated in said internalization solution for a time comprised between 5 and 60 minutes, preferably for about 15 minutes at a T comprised between 4 and 1. 50 ° C, preferably at about 37 ° C. To favor the internalization of the sugar, mechanical action is taken, for example with light impacts on the walls of the plate or of the flask in which the cells are adhered.
Laddove le cellule vengono conservate in adesione, in detta fase b), mantenendo dette cellule in detta soluzione B, viene aggiunta detta soluzione di internalizzazione C; il volume di soluzione C sarà superiore a quello di soluzione B, preferibilmente detta soluzione C e detta soluzione B saranno in rapporto 2:1. Where the cells are preserved in adhesion, in said step b), by keeping said cells in said solution B, said internalization solution C is added; the volume of solution C will be higher than that of solution B, preferably said solution C and said solution B will be in a 2: 1 ratio.
Nella successiva fase 2), laddove le cellule vengono congelate in sospensione, dette cellule vengono risospese nella composizione di crioconservazione dopo aver ottenuto per sedimentazione un pellet cellulare, anche mediante l’utilizzo di una centrifuga, centrifugando circa 5 minuti a circa 1500 rpm a circa 25°C. Detto pellet cellulare à ̈ preferibilmente costituito da un numero di cellule compreso tra 3*10^6 e 5*10^6, preferibilmente circa 4*10^6. laddove le cellule vengono congelate in adesione, la composizione di crio-conservazione viene aggiunta direttamente sulle cellule, private della soluzione B e della soluzione di internalizzazione. In the subsequent phase 2), where the cells are frozen in suspension, said cells are resuspended in the cryopreservation composition after obtaining a cell pellet by sedimentation, also by using a centrifuge, centrifuging about 5 minutes at about 1500 rpm to about 25 ° C. Said cellular pellet is preferably constituted by a number of cells comprised between 3 * 10 ^ 6 and 5 * 10 ^ 6, preferably about 4 * 10 ^ 6. where the cells are frozen in adhesion, the cryopreservation composition is added directly to the cells, deprived of solution B and of the internalization solution.
Nella fase 3), dette cellule in composizione di crio-conservazione vengono congelate, preferibilmente mediante Rate Freezer, ovvero in un sistema di abbassamento controllato della temperatura. In una forma preferita di realizzazione, la temperature viene abbassata di ~1ËšC/min. Per controllare la nucleazione ed il rilascio del calore latente durante il congelamento il Rate Freezer viene preferibilmente programmato con la rampa rappresentata in Figura 1 e che comprende: (1) mantenimento della temperatura per 3 min a 4.0ËšC, (2) -1.0ËšC/min a -4.0ËšC, (3) -35.0ËšC/min a -35.0°C, (4) 25.0ËšC/min a -16.0ËšC, (5) 2.0ËšC/min a -12.0ËšC, (6)-1.0ËšC/min a -40.0ËšC, (7) -5.0ËšC/min a -60.0ËšC, (8) -10.0Ëš/min a -90.0ËšC. In step 3), said cells in cryopreservation composition are frozen, preferably by Rate Freezer, or in a controlled temperature lowering system. In a preferred embodiment, the temperature is lowered by ~ 1ËC / min. To control the nucleation and release of latent heat during freezing, the Rate Freezer is preferably programmed with the ramp shown in Figure 1 and which includes: (1) maintaining the temperature for 3 min at 4.0ËšC, (2) -1.0ËšC / min at -4.0ËšC, (3) -35.0ËšC / min at -35.0ËšC, (4) 25.0ËšC / min at -16.0ËšC, (5) 2.0ËšC / min at -12.0ËšC, (6) -1.0ËšC / min at -40.0ËšC, (7) -5.0ËšC / min at -60.0ËšC, (8) -10.0Ëš / min at -90.0ËšC.
Le cellule vengono quindi mantenute in azoto liquido, in vapori di azoto o a – 80°C. The cells are then kept in liquid nitrogen, in nitrogen vapors or at â € “80 ° C.
Detta soluzione A à ̈ preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, e comprende: NaCl da 50 a 200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-20 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; EDTA 5-30 mM, preferibilmente circa 10 mM. Detta soluzione A ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327 mOsm. Said solution A is preferably prepared in deionized water, preferably in water of MilliQ Millipore grade, and comprises: NaCl from 50 to 200 mM, preferably about 120 mM; KCl 5-20 mM, preferably about 10 mM; glucose 2-20 mM, preferably about 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferably about 20 mM; EDTA 5-30 mM, preferably about 10 mM. Said solution A has an osmolarity between 300 and 350 mOsm, preferably about 327 mOsm.
Detta soluzione B à ̈ preferibilmente preparata in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore, e comprende: NaCl da 5 a 20 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM, opzionalmente potrà essere impiegato ATP 1-15 mM, preferibilmente circa 5 mM. In alternativa all’ATP, la soluzione B potrà contenere analoghi dell’ATP, quali il BzATP [2’, 3’-O-(benzoil-4-benzoil) ATP] in concentrazioni ricomprese tra 5 e 30 µM, preferibilmente circa 15 µM. In un’ulteriore forma di realizzazione, ATP e BzATP potranno essere co-presenti in detta soluzione B. Detta soluzione B ha un’osmolarità compresa tra 300 e 350 mOsm, preferibilmente circa 327mOsm. Said solution B is preferably prepared in deionized water, preferably in water of MilliQ Millipore grade, and comprises: NaCl from 5 to 20 mM, preferably about 10 mM; KCl 50-200 mM, preferably about 120 mM; glucose 2-20 mM, preferably about 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferably about 20 mM, optionally ATP 1-15 mM, preferably about 5 mM, can be used. As an alternative to ATP, solution B may contain ATP analogues, such as BzATP [2â € ™, 3â € ™ -O- (benzoyl-4-benzoyl) ATP] in concentrations between 5 and 30 µM, preferably about 15 µM. In a further embodiment, ATP and BzATP may be co-present in said solution B. Said solution B has an osmolarity comprised between 300 and 350 mOsm, preferably about 327mOsm.
Detta soluzione di internalizzazione C comprende: NaCl da 5 a 20 mM, preferibilmente circa 10 mM; KCl 50-200 mM, preferibilmente circa 120 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Detta soluzione C ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.219 mOsm. Said internalization solution C comprises: NaCl from 5 to 20 mM, preferably about 10 mM; KCl 50-200 mM, preferably about 120 mM; glucose 2-20 mM, preferably about 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferably about 20 mM; trehalose 100-1000 M, preferably about 500 mM. These components are dissolved in PBS. Said solution C has an osmolarity between 1,100 and 1,350 mOsm, preferably about 1,219 mOsm.
In una forma di realizzazione, laddove si proceda con detta fase iv) e con l’esposizione a detta soluzione B, nella successiva fase b) la soluzione di internalizzazione C usata comprenderà NaCl da 50 a 200 mM, preferibilmente circa 120 mM; KCl 5-20 mM, preferibilmente circa 10 mM; glucosio 2-20 mM, preferibilmente circa 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferibilmente circa 20 mM; trealosio 100-1000 M, preferibilmente circa 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Detta soluzione C ha un’osmolarità compresa tra 1.100 e 1.350 mOsm, preferibilmente circa 1.219 mOsm. In one embodiment, where one proceeds with said step iv) and with the exposure to said solution B, in the subsequent step b) the internalization solution C used will comprise NaCl from 50 to 200 mM, preferably about 120 mM; KCl 5-20 mM, preferably about 10 mM; glucose 2-20 mM, preferably about 5 mM; Hepes 5-50 mM, preferably about 20 mM; trehalose 100-1000 M, preferably about 500 mM. These components are dissolved in PBS. Said solution C has an osmolarity between 1,100 and 1,350 mOsm, preferably about 1,219 mOsm.
In una forma di realizzazione, la temperatura di utilizzo delle soluzioni A, B, C e della composizione di crio-conservazione à ̈ pari alla temperatura di incubazione delle cellule, preferibilmente circa 37°C. In un’ulteriore forma di realizzazione, laddove si volesse aggiungere allo shock osmotico anche uno shock termico, dette soluzioni vengono utilizzate fredde. In one embodiment, the temperature of use of the solutions A, B, C and of the cryopreservation composition is equal to the incubation temperature of the cells, preferably about 37 ° C. In a further embodiment, where a thermal shock is also to be added to the osmotic shock, said solutions are used cold.
La composizione di crio-conservazione e la metodica qui rivendicate trovano applicazione per la crio-conservazione di linee cellulari immortalizzate, così come di cellule staminali totipotenti o pluripotenti, anche umane. In particolare, detta composizione di crio-conservazione e detta metodica trovano impiego con successo nella crio-conservazione di cellule staminali neurali murine, ad esempio le NS46C. Un impiego di successo si à ̈ anche osservato nella crio-conservazione di cellule staminali neurali umane, ad esempio nella crio-conservazione di cellule staminali neurali umane derivate dal midollo spinale fetale, quali le CB660sp oppure delle cellule staminali neurali umane AF22, ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS). The cryopreservation composition and the methodology claimed herein find application for the cryopreservation of immortalized cell lines, as well as totipotent or pluripotent stem cells, including human ones. In particular, said cryopreservation composition and said method are successfully used in the cryopreservation of murine neural stem cells, for example NS46C. A successful use has also been observed in the cryopreservation of human neural stem cells, for example in the cryopreservation of human neural stem cells derived from the fetal spinal cord, such as CB660sp, or of human neural stem cells AF22, obtained from human neural stem cells. induced pluripotent stem (iPS).
Cellule crio-conservate nella composizione di crio-conservazione e secondo la metodica della presente invenzione potranno trovare impiego nella ricerca e nella medicina rigenerativa. Dette cellule, non essendo entrate in contatto con siero fetale bovino, non contengono antigeni eventualmente responsabili di una risposta immunitaria non desiderata. Inoltre, l’assenza di DMSO fa sì che le stesse non vadano incontro ad un differenziamento indesiderato, ma sia possibile indirizzarne il differenziamento quando scongelate. Infine, utilizzando la composizione e la metodica qui rivendicate, le cellule risultano stabilizzate e non vanno incontro alle alterazioni cromosomiche che tipicamente si riscontrano seguendo metodiche di crio-conservazione tradizionali. Cryo-conserved cells in the cryopreservation composition and according to the method of the present invention will be able to find use in research and regenerative medicine. Since these cells did not come into contact with fetal bovine serum, they do not contain antigens possibly responsible for an unwanted immune response. Furthermore, the absence of DMSO means that they do not undergo undesired differentiation, but it is possible to direct their differentiation when thawed. Finally, using the composition and method claimed here, the cells are stabilized and do not undergo the chromosomal alterations that are typically found following traditional cryopreservation methods.
ESEMPI: EXAMPLES:
Esempio 1: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule staminali neurali umane. Example 1: Vitality after cryopreservation of human neural stem cells.
Cellule staminali neurali umane derivate dal midollo spinale fetale CB660sp la cui derivazione à ̈ descritta in WO2005/121318 vengono congelate utilizzando una composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, MEM Vitamin 100X, MEM Aminoacid 100X, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM. Vengono utilizzate due diverse metodiche. La metodica a comprende: CB660sp fetal spinal cord derived human neural stem cells whose derivation is described in WO2005 / 121318 are frozen using a cryopreservation composition comprising: 145 mM NaCl; KCl 5 mM; 5 mM glucose; gluconate sodium salt 3 mM; Hepes 25 mM; myoinositol 500 µM, MEM Vitamin 100X, MEM Aminoacid 100X, Z-VAD-FMK 500 nM; trehalose 500 mM. Two different methods are used. Method a includes:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente Tripsina EDTA e/o Accutase<TM>; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione precedentemente mantenuta a 4°C, incubando per circa 15 minuti a 37°C; 1) internalization of sugar, where the cells are deprived of the culture medium and exposed to a washing cycle a) which includes: i) washing with PBS (saline phosphate); ii) rapid washing with saline solution, called solution A, which includes EDTA, at 4 ° C; iii) rapid washing with release solution, comprising Trypsin EDTA and / or Accutase <TM>; b) exposure to the internalization solution C previously maintained at 4 ° C, incubating for about 15 minutes at 37 ° C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione sopra descritta; 2) resuspension of the cells in the cryopreservation composition described above;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido. 3) freezing with Rate Freezer and storage in liquid nitrogen.
La metodica b comprende gli stessi passaggi descritti in a, ma detto passaggio 1) comprende in aggiunta uno step iv) dove viene aggiunta una soluzione B per 15’ a 37°C che opzionalmente comprende ATP. Method b includes the same steps described in a, but said step 1) additionally includes step iv) where a solution B is added for 15â € ™ at 37 ° C which optionally includes ATP.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore. Said solution A comprises: 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM. These components are dissolved in deionized water, preferably in MilliQ Millipore grade water.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata, preferibilmente in acqua di grado MilliQ Millipore. Said solution B comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. These components are dissolved in deionized water, preferably in MilliQ Millipore grade water.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Said solution C comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Quando viene seguito il metodo b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. When method b is followed, said solution C comprises 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica. Upon thawing, the tubes containing the cells are removed from the liquid nitrogen and immersed in a 37 ° C water bath for approximately 2 minutes and kept under constant agitation. The cells are then recovered in culture medium, centrifuged for about 5 minutes at 1,250 rpm at about 25 ° C and then resuspended in fresh culture medium. Cells are plated and cell viability assays are conducted by Trypan blue <TM> exclusion count and by cytometric analysis.
La figura 2 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento (t=0h) e 24 ore dopo lo scongelamento (t=24h). Con entrambe le metodiche di conta cellulare, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 50% ed una vitalità pari a 40% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti. Figure 2 reports the cell viability measured at the time of freezing, at thawing (t = 0h) and 24 hours after thawing (t = 24h). With both cell counting methods, the cells at the time of thawing have a viability equal to 50% and a viability equal to 40% 24h after thawing. The percentages reported refer to the number of live cells compared to the total number of cells present.
Esempio 2: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule neurali staminali fetali murine. Example 2: Vitality after cryopreservation of murine fetal neural stem cells.
Cellule staminali neurali murine NS46C, derivate secondo la procedura descritta in WO2005/121318, vengono congelate utilizzando la composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM, DMSO 2% seguendo una metodica che comprende: NS46C murine neural stem cells, derived according to the procedure described in WO2005 / 121318, are frozen using the cryopreservation composition which includes: 145 mM NaCl; KCl 5 mM; 5 mM glucose; gluconate sodium salt 3 mM; Hepes 25 mM; myinositol 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trehalose 500 mM, DMSO 2% following a method that includes:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente Accutase<TM>; iv) aggiunta di una soluzione B che comprende ATP; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C; 1) internalization of sugar, where the cells are deprived of the culture medium and exposed to a washing cycle a) which includes: i) washing with PBS (saline phosphate); ii) rapid washing with saline solution, called solution A, which includes EDTA, at 4 ° C; iii) rapid washing with release solution, comprising Accutase <TM>; iv) addition of a solution B comprising ATP; b) exposure to the internalization solution C maintained at 4 ° C by incubating for about 15 minutes at 37 ° C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione; 2) resuspension of the cells in the cryopreservation composition;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido. 3) freezing with Rate Freezer and storage in liquid nitrogen.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata preferibilmente MilliQ. Said solution A comprises: 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM These components are dissolved in deionized water preferably MilliQ.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Tali componenti sono disciolti in acqua deionizzata preferibilmente MilliQ. Said solution B comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. These components are dissolved in deionized water preferably MilliQ.
Detta soluzione C comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Said solution C comprises: 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica. Upon thawing, the tubes containing the cells are removed from the liquid nitrogen and immersed in a 37 ° C water bath for approximately 2 minutes and kept under constant agitation. The cells are then recovered in culture medium, centrifuged for about 5 minutes at 1,250 rpm at about 25 ° C and then resuspended in fresh culture medium. Cells are plated and cell viability assays are conducted by Trypan blue <TM> exclusion count and by cytometric analysis.
La figura 3 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento. Figure 3 reports the cell viability measured at the time of freezing, at thawing t = 0h and 24 hours after thawing.
Con entrambi i metodi, utilizzando la composizione di crio-conservazione qui descritta, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 47% ed una vitalità pari a 41% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti. With both methods, using the cryopreservation composition described here, the cells at the time of thawing show a viability equal to 47% and a viability equal to 41% 24h after thawing. The percentages reported refer to the number of live cells compared to the total number of cells present.
Esempio 3: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule di glioma umano. Example 3: Vitality after cryopreservation of human glioma cells.
Cellule di glioma umano G179 vengono congelate utilizzando una composizione di crio-conservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trealosio 500 mM. Le cellule vengono conservate in azoto liquido. Si utilizzano due metodiche di conservazione. la metodica a comprende: Human glioma G179 cells are frozen using a cryopreservation composition which includes: 145 mM NaCl; KCl 5 mM; 5 mM glucose; gluconate sodium salt 3 mM; Hepes 25 mM; myinositol 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM; trehalose 500 mM. The cells are stored in liquid nitrogen. Two conservation methods are used. method a includes:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente accutase; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C; 2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione; 1) internalization of sugar, where the cells are deprived of the culture medium and exposed to a washing cycle a) which includes: i) washing with PBS (saline phosphate); ii) rapid washing with saline solution, called solution A, which includes EDTA, at 4 ° C; iii) rapid washing with release solution, comprising accutase; b) exposure to the internalization solution C maintained at 4 ° C by incubating for about 15 minutes at 37 ° C; 2) resuspension of the cells in the cryopreservation composition;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido. 3) freezing with Rate Freezer and storage in liquid nitrogen.
La metodica b comprende gli stessi passaggi descritti in a, ma detto passaggio 1 comprende uno step iv) di aggiunta di una soluzione B che comprende ATP. Method b comprises the same steps described in a, but said step 1 comprises a step iv) for adding a solution B which comprises ATP.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM. Said solution A comprises: 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Said solution B comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM, ATP 5 mM.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Said solution C comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Seguendo la metodica b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Following method b, said solution C comprises 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.250 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypab blue e mediante analisi citometrica. Upon thawing, the tubes containing the cells are removed from the liquid nitrogen and immersed in a 37 ° C water bath for approximately 2 minutes and kept under constant agitation. The cells are then recovered in culture medium, centrifuged for about 5 minutes at 1,250 rpm at about 25 ° C and then resuspended in fresh culture medium. The cells are plated and cell viability assays are conducted, by means of exclusion count at Trypab blue and by cytometric analysis.
La figura 4 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento. Con entrambi i metodi, utilizzando la composizione di crio-conservazione qui descritta, le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 40% ed una vitalità pari a 30% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti. Figure 4 reports the cell viability measured at the time of freezing, at thawing t = 0h and 24 hours after thawing. With both methods, using the cryopreservation composition described here, the cells at the time of thawing show a viability equal to 40% and a viability equal to 30% 24h after thawing. The percentages reported refer to the number of live cells compared to the total number of cells present.
Esempio 4: Vitalità dopo crio-conservazione di cellule staminali neurali umane. Example 4: Vitality after cryopreservation of human neural stem cells.
Cellule staminali neurali umane AF22, ottenute da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), sono congelate utilizzando una composizione di crioconservazione che comprende: NaCl 145 mM; KCl 5 mM; glucosio 5 mM; gluconato sale sodico 3 mM; Hepes 25 mM; mioinositolo 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM, MEM Amino Acids 100X, MEM Vitamin Solution 100X; trealosio 500 mM secondo una metodica che comprende: AF22 human neural stem cells, obtained from induced pluripotent stem (iPS) cells, are frozen using a cryopreservation composition comprising: 145 mM NaCl; KCl 5 mM; 5 mM glucose; gluconate sodium salt 3 mM; Hepes 25 mM; myoinositol 500 µM, Z-VAD-FMK 500 nM, MEM Amino Acids 100X, MEM Vitamin Solution 100X; trehalose 500 mM according to a method that includes:
1) internalizzazione dello zucchero, laddove le cellule vengono private del terreno di coltura ed esposte ad un ciclo di lavaggi a) che comprende: i)lavaggio con PBS (soluzione salina fosfato); ii) lavaggio rapido con soluzione salina, detta soluzione A, che comprende EDTA, a 4°C; iii) rapido lavaggio con soluzione di distacco, comprendente accutase; b) esposizione alla soluzione C di internalizzazione mantenuta a 4°C incubando per circa 15 minuti a 37°C; 1) internalization of sugar, where the cells are deprived of the culture medium and exposed to a washing cycle a) which includes: i) washing with PBS (saline phosphate); ii) rapid washing with saline solution, called solution A, which includes EDTA, at 4 ° C; iii) rapid washing with release solution, comprising accutase; b) exposure to the internalization solution C maintained at 4 ° C by incubating for about 15 minutes at 37 ° C;
2) risospensione delle cellule nella composizione di crio-conservazione; 2) resuspension of the cells in the cryopreservation composition;
3) congelamento mediante Rate Freezer e conservazione in azoto liquido. 3) freezing with Rate Freezer and storage in liquid nitrogen.
Detta soluzione A comprende: NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM. Said solution A comprises: 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; EDTA 10 mM.
Detta soluzione B comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM, ATP 5 mM. Said solution B comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM, ATP 5 mM.
Detta soluzione C comprende: NaCl 10 mM; KCl 120 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Seguendo la metodica b, detta soluzione C comprende NaCl 120 mM; KCl 10 mM; glucosio 5 mM; Hepes 20 mM; trealosio 500 mM. Tali componenti sono disciolte in PBS. Said solution C comprises: 10 mM NaCl; KCl 120 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS. Following method b, said solution C comprises 120 mM NaCl; KCl 10 mM; 5 mM glucose; Hepes 20 mM; trehalose 500 mM. These components are dissolved in PBS.
Al momento dello scongelamento, i tubi contenenti le cellule vengono rimossi dall’azoto liquido e immersi in un bagno d’acqua a 37°C per un tempo pari a circa 2 minuti e mantenuti in costante agitazione. Le cellule vengono quindi recuperate in terreno di coltura, centrifugate per circa 5 minuti a 1.500 rpm a circa 25°C e quindi risospese in terreno di coltura fresco. Le cellule vengono piastrate e vengono condotti saggi di vitalità cellulare, mediante conta di esclusione al Trypan blue<TM>e mediante analisi citometrica. Upon thawing, the tubes containing the cells are removed from the liquid nitrogen and immersed in a 37 ° C water bath for approximately 2 minutes and kept under constant agitation. The cells are then recovered in culture medium, centrifuged for about 5 minutes at 1,500 rpm at about 25 ° C and then resuspended in fresh culture medium. Cells are plated and cell viability assays are conducted by Trypan blue <TM> exclusion count and by cytometric analysis.
La figura 5 riporta la vitalità cellulare misurata al momento del congelamento, allo scongelamento t=0h e 24 ore dopo lo scongelamento. Le cellule al momento dello scongelamento presentano una vitalità pari al 58% ed una vitalità pari a 91% 24h dopo lo scongelamento. Le percentuali riportate fanno riferimento al numero di cellule vive rispetto al totale di cellule presenti. Figure 5 reports the cell viability measured at the time of freezing, at thawing t = 0h and 24 hours after thawing. The cells at the time of thawing show a vitality equal to 58% and a vitality equal to 91% 24h after thawing. The percentages reported refer to the number of live cells compared to the total number of cells present.
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