ITMI20090388A1

ITMI20090388A1 - BIOREACTOR FOR CULTURE OR BIOLOGICAL FABRIC CELLS, RELATIVE METHOD AND SIS THEME

Info

Publication number: ITMI20090388A1
Application number: IT000388A
Authority: IT
Inventors: Pietro Cecini; Matteo Moretti; Manuela Teresa Raimondi; Giuseppe Talo'
Original assignee: Istituto Ortopedico Galeazzi S P A; Milano Politecnico
Priority date: 2009-03-13
Filing date: 2009-03-13
Publication date: 2010-09-14

Description

BIOREATTORE PER LA COLTURA DI CELLULE O TESSUTI BIOLOGICI, RELATIVO METODO E SISTEMA MULTISTAZIONE BIOREACTOR FOR THE CULTURE OF BIOLOGICAL CELLS OR TISSUES, RELATIVE METHOD AND MULTISTATION SYSTEM

La presente invenzione si riferisce a un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici, al relativo metodo e ad un sistema multistazione. The present invention refers to a bioreactor for the culture of biological cells or tissues, to the relative method and to a multistation system.

Un bioreattore è un dispositivo per sviluppare tessuti bioingegnerizzati partendo da cellule, in principio di tipo qualunque, ma in particolare per cellule di tutti i tessuti del sistema muscoloscheletrico, del sangue, della cartilagine (condrociti), e in genere cellule che risentono della stimolazione meccanica. A bioreactor is a device for developing bioengineered tissues starting from cells, in principle of any type, but in particular for cells of all tissues of the musculoskeletal system, blood, cartilage (chondrocytes), and generally cells that are affected by mechanical stimulation .

In particolare per i condrociti è importante che lo stimolo meccanico a cui sono sottoposti durante la coltura riproduca la stimolazione fisiologica, caratterizzata da un flusso interstiziale che perfonde i tessuti e da una pressione ciclica isotropica. In particular, for chondrocytes it is important that the mechanical stimulus to which they are subjected during culture reproduces the physiological stimulation, characterized by an interstitial flow that perfuses the tissues and by an isotropic cyclic pressure.

Per simulare le condizioni fisiologiche, nel bioreattore, il medium liquido di coltura deve passare attraverso il tessuto per esercitare uno sforzo idrodinamico di taglio in grado di trasportare la massa nutriente ed eliminare la massa tossica. Inoltre, la camera di coltura viene messa in pressione da un cilindro. To simulate the physiological conditions, in the bioreactor, the liquid culture medium must pass through the tissue to exert a hydrodynamic shear effort capable of transporting the nutrient mass and eliminating the toxic mass. Furthermore, the culture chamber is pressurized by a cylinder.

E’ noto, ad esempio realizzare un bioreattore comprendente un attuatore pneumatico per mettere in pressione la camera, nonché una pompa roller che realizza la perfusione del medium. I tubi da e per la pompa roller sono dotati di valvole, che devono essere in grado di tenere le elevate pressioni della fase di pressurizzazione. It is known, for example, to create a bioreactor comprising a pneumatic actuator to put the chamber under pressure, as well as a roller pump that performs the perfusion of the medium. The pipes to and from the roller pump are equipped with valves, which must be able to hold the high pressures of the pressurization phase.

Uno degli inconvenienti di tale dispositivo consiste proprio nella criticità delle valvole, che devono garantire la tenuta a pressioni fino a 15 MPa quando è messa in pressione la camera di coltura. One of the drawbacks of this device consists precisely in the criticality of the valves, which must guarantee tightness at pressures up to 15 MPa when the culture chamber is pressurized.

Inoltre, la pompa roller comprende più stadi, alcuni dei quali devono essere posti all’esterno dell’incubatore per tutta la durata dell’esperimento. Questo comporta un passaggio di tuberia nell’intercapedine dello stesso. In addition, the roller pump includes several stages, some of which must be placed outside the incubator for the duration of the experiment. This involves a passage of piping in the cavity of the same.

Altri bioreattori noti, effettuano il passaggio interstiziale, ma non permettono il ricambio del fluido. Other known bioreactors carry out the interstitial passage, but do not allow the replacement of the fluid.

Scopo della presente invenzione è quello di realizzare un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici che risolva gli inconvenienti tecnico sopra citati. The object of the present invention is to provide a bioreactor for the culture of biological cells or tissues which solves the technical drawbacks mentioned above.

Altro scopo della presente invenzione è quello di realizzare un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici a ridotto ingombro e ridotto numero di componenti adatto ad essere assemblato a gruppi di più bioreattori controllati da una unica centralina elettronica in modo tra loro indipendente e formanti un relativo sistema multistazione. Another object of the present invention is to provide a bioreactor for the culture of biological cells or tissues with a reduced size and reduced number of components suitable for being assembled in groups of several bioreactors controlled by a single electronic control unit independently of each other and forming a related multi-station system.

Ulteriore scopo è quello di realizzare un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici facilmente sterilizzabile, facile da chiudere e con un ridotto volume di priming. A further object is to provide a bioreactor for the culture of biological cells or tissues that is easily sterilizable, easy to close and with a reduced priming volume.

Un altro scopo della presente invenzione è quello di realizzare un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici, un relativo metodo ed un sistema multistazione particolarmente semplice e funzionale, con costi contenuti. Another object of the present invention is to provide a bioreactor for the culture of biological cells or tissues, a relative method and a particularly simple and functional multistation system, with low costs.

Questi scopi secondo la presente invenzione sono raggiunti realizzando un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici come esposto nella rivendicazione 1. These purposes according to the present invention are achieved by making a bioreactor for the culture of biological cells or tissues as set forth in claim 1.

Ulteriori caratteristiche sono previste nelle rivendicazioni dipendenti. Further characteristics are provided in the dependent claims.

Le caratteristiche ed i vantaggi di un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici, di un relativo metodo e di un sistema multistazione secondo la presente invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione seguente, esemplificativa e non limitativa, riferita ai disegni schematici allegati nei quali: The characteristics and advantages of a bioreactor for the culture of biological cells or tissues, of a relative method and of a multistation system according to the present invention will become more evident from the following description, which is exemplary and not limiting, referring to the attached schematic drawings in which:

la figura 1 è una vista prospettica, parzialmente spaccata, di una realizzazione preferita di un bioreattore per la coltura di cellule secondo l’invenzione; Figure 1 is a partially broken perspective view of a preferred embodiment of a bioreactor for cell culture according to the invention;

la figura 2 mostra schematicamente in sezione il bioreattore di figura 1 nella la fase di pressurizzazione; Figure 2 schematically shows in section the bioreactor of Figure 1 in the pressurization step;

la figura 3 mostra schematicamente in sezione il bioreattore di figura 1 nella fase di perfusione; figure 3 schematically shows in section the bioreactor of figure 1 in the perfusion phase;

le figure 4 e 5 mostrano schematicamente in sezione una seconda realizzazione del bioreattore secondo l’invenzione rispettivamente nella fase di pressurizzazione e di perfusione; Figures 4 and 5 schematically show in section a second embodiment of the bioreactor according to the invention respectively in the pressurization and perfusion phase;

le figure 6-9 mostrano viste schematiche di ulteriori realizzazioni semplificate del bioreattore per la coltura di cellule secondo l’invenzione; Figures 6-9 show schematic views of further simplified embodiments of the bioreactor for cell culture according to the invention;

la figura 10 mostra un sistema multistazione comprendente quattro bioreattori secondo l’invenzione. Figure 10 shows a multi-station system comprising four bioreactors according to the invention.

Con riferimento alle figure, viene mostrato un bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici complessivamente indicato con 10 ed un sistema multistazione 100 comprendente una pluralità di bioreattori 10 collegati ad una medesima centralina di controllo elettronica 50. With reference to the figures, there is shown a bioreactor for the culture of biological cells or tissues indicated as a whole with 10 and a multistation system 100 comprising a plurality of bioreactors 10 connected to the same electronic control unit 50.

Il bioreattore 10, secondo la realizzazione preferita mostrata in figure 1-3 comprende un corpo 12 dotato di una camera di coltura 13 di cellule o tessuti biologici, di un primo canale di afflusso 20 nonché di un secondo canale di afflusso 30 di un medium liquido di coltura alla camera di coltura, disposti ad estremità opposte della camera di coltura 13. The bioreactor 10, according to the preferred embodiment shown in figures 1-3, comprises a body 12 equipped with a culture chamber 13 for biological cells or tissues, with a first inflow channel 20 as well as with a second inflow channel 30 for a liquid medium to the culture chamber, arranged at opposite ends of the culture chamber 13.

Secondo una ulteriore realizzazione non mostrata, i canali di afflusso potrebbero essere anche in numero maggiore. According to a further embodiment not shown, the inflow channels could be even in greater number.

L’accesso alla camera di coltura 13 avviene da un lato, che è richiudibile mediante un piattello serrato da una vite 15. Access to the culture chamber 13 takes place on one side, which can be closed by means of a plate tightened by a screw 15.

Il bioreattore prevede inoltre, un sistema di attuazione per la perfusione e la pressurizzazione della camera di coltura 13 che comprende un solo attuatore lineare 40 posto in comunicazione con la camera di coltura 13 che, al variare della corsa, attua fasi di pressurizzazione e fasi di perfusione della camera di coltura 13. The bioreactor also provides an actuation system for the perfusion and pressurization of the culture chamber 13 which comprises a single linear actuator 40 placed in communication with the culture chamber 13 which, as the stroke varies, carries out pressurization phases and phases of culture chamber perfusion 13.

Ognuno dei due canali di afflusso 20, 30 è provvisto di una valvola 23, 33 comandabile a occludere alternativamente, in funzione della corsa dell’attuatore lineare 40, i relativi canali di afflusso 20, 30 durante la fase di perfusione unidirezionale o bidirezionale. Each of the two inflow channels 20, 30 is equipped with a valve 23, 33 that can be controlled to alternately occlude, depending on the stroke of the linear actuator 40, the relative inflow channels 20, 30 during the unidirectional or bidirectional perfusion phase.

L’attuatore lineare 40, al variare della corsa, attua alternativamente e in momenti temporali distinti, fasi di pressurizzazione e fasi di perfusione della camera di coltura 13. The linear actuator 40, as the stroke varies, implements alternatively and in distinct temporal moments, phases of pressurization and perfusion phases of the culture chamber 13.

L’attuatore lineare 40 comprende un pistone 41, mobile in una camera di scorrimento 16 del corpo 12 in comunicazione con la camera di coltura 13. The linear actuator 40 includes a piston 41, movable in a sliding chamber 16 of the body 12 in communication with the culture chamber 13.

Secondo quanto mostrato a titolo esemplificativo in figure 1 e 10, un motore elettrico 42, ad esempio associato ad un meccanismo vite – madrevite, è comandato dalla centralina di controllo elettronica 50 per impartire un movimento lineare al pistone 41. As shown by way of example in Figures 1 and 10, an electric motor 42, for example associated with a screw-nut mechanism, is controlled by the electronic control unit 50 to impart a linear movement to the piston 41.

Secondo la realizzazione preferita del bioreattore oggetto dell’invenzione, mostrata nelle figure da 1 a 3, il primo ed il secondo canale di afflusso 20, 30 sono entrambi immessi nella camera di scorrimento 16 del pistone 41, ed in particolare il secondo canale di afflusso 30 si trova in posizione più lontana dalla camera di coltura 13 rispetto al primo canale di afflusso 20. According to the preferred embodiment of the bioreactor object of the invention, shown in Figures 1 to 3, the first and second inflow channels 20, 30 are both introduced into the sliding chamber 16 of the piston 41, and in particular the second inflow channel 30 is located further away from the culture chamber 13 than the first inflow channel 20.

La corsa del pistone 41 ha un punto morto inferiore variabile ed impostabile mediante la centralina di controllo 50. Infatti, in relazione della corsa di discesa del pistone 41, il punto morto inferiore si trova a valle rispetto al primo canale di afflusso 20, per la fase di pressurizzazione (figura 2), ed a monte del primo canale di afflusso 20, per la fase di perfusione (figura 3). The stroke of the piston 41 has a variable lower dead center that can be set by means of the control unit 50. In fact, in relation to the downward stroke of the piston 41, the lower dead center is located downstream with respect to the first inflow channel 20, for the pressurization phase (Figure 2), and upstream of the first inflow channel 20, for the perfusion phase (Figure 3).

Il pistone 41 comprende una porzione 43 esterna al corpo 12 del bioreattore 10 ed uno stelo 44, mobile nella camera di scorrimento 16, provvisto ad ogni estremità di una coppia di guarnizioni 45. In una posizione compresa tra la coppia di guarnizioni 45, tra il pistone 41 e la camera di scorrimento 16 è generata una camera secondaria 46 per il medium posta in comunicazione con la camera di coltura 13. Nell’esempio di figure 2 e 3, la camera secondaria 46 è realizzata sotto forma di una sede, o fresatura, sullo stelo 44 del pistone 41. La camera secondaria 46 è posta in corrispondenza di un condotto di collegamento 17 disposto nel corpo 12 del bioreattore tra la camera coltura 13 e la camera di scorrimento 16 del pistone 41. The piston 41 comprises a portion 43 external to the body 12 of the bioreactor 10 and a stem 44, movable in the sliding chamber 16, provided at each end with a pair of seals 45. In a position comprised between the pair of seals 45, between the piston 41 and the sliding chamber 16 a secondary chamber 46 is generated for the medium placed in communication with the culture chamber 13. In the example of Figures 2 and 3, the secondary chamber 46 is made in the form of a seat, or milling , on the rod 44 of the piston 41. The secondary chamber 46 is located in correspondence with a connection duct 17 arranged in the body 12 of the bioreactor between the culture chamber 13 and the sliding chamber 16 of the piston 41.

Le guarnizioni 45, preferibilmente reallizzate come guarnizioni composte in teflon, polietilene o silicone, possono essere mantenute in posizione da distanziatori 47. The gaskets 45, preferably made as gaskets composed of Teflon, polyethylene or silicone, can be held in position by spacers 47.

La distanza tra le guarnizioni appartenenti ad ogni coppia 45 è la medesima e deve essere maggiore della corsa di pressurizzazione del pistone 41. The distance between the gaskets belonging to each pair 45 is the same and must be greater than the pressurization stroke of the piston 41.

Secondo una realizzazione semplificata, potrebbe essere omessa, di ogni coppia di guarnizioni 45, quella posta in posizione superiore. In tale configurazione, mostrata ad esempio in figura 4, nella fase di pressurizzazione, le guarnizioni 45 devono trovarsi in corrispondenza dei canali di afflusso 20, 30 per isolare la camera di coltura 13 e la camera secondaria 46. According to a simplified embodiment, the one placed in the upper position of each pair of gaskets 45 could be omitted. In this configuration, shown for example in Figure 4, in the pressurization phase, the gaskets 45 must be located in correspondence with the inflow channels 20, 30 to isolate the culture chamber 13 and the secondary chamber 46.

La distanza tra le guarnizioni inferiori di ogni coppia di guarnizioni 45 deve essere invece sostanzialmente uguale alla distanza tra i due canali di afflusso 20, 30. Infatti, al punto morto inferiore del pistone 41 - nella fase di pressurizzazione - le guarnizioni inferiori di ogni coppia 45 si devono trovare a valle dei rispettivi canali di afflusso 20, 30 (figura 3). E’ così realizzata una valvola meccanica ad occlusione e durante la pressurizzazione, la camera di coltura 13 e la camera secondaria 46 sono isolate dai canali di afflusso 20, 30. I canali di afflusso 20, 30 si trovano in questa condizione a pressione ambiente. Durante la fase di perfusione, invece, i canali di afflusso 20, 30 restano costantemente in collegamento con la camera di coltura 13, con il condotto di collegamento 17 e con la camera secondaria 46. The distance between the lower gaskets of each pair of gaskets 45 must instead be substantially equal to the distance between the two inflow channels 20, 30. In fact, at the lower dead center of the piston 41 - in the pressurization phase - the lower gaskets of each pair 45 must be located downstream of the respective inflow channels 20, 30 (Figure 3). A mechanical occlusion valve is thus created and during pressurization, the culture chamber 13 and the secondary chamber 46 are isolated from the inflow channels 20, 30. The inflow channels 20, 30 are in this condition at ambient pressure. During the perfusion phase, on the other hand, the inflow channels 20, 30 remain constantly in connection with the culture chamber 13, with the connection duct 17 and with the secondary chamber 46.

Nell’esempio mostrato in figura 1, ognuno dei due canali di afflusso 20, 30 è collegato mediante un connettore 21, 31 ad un relativo tubo 22, 32 di un circuito idraulico del medium ed alla relativa valvola 23, 33. In the example shown in Figure 1, each of the two inflow channels 20, 30 is connected by means of a connector 21, 31 to a relative pipe 22, 32 of a hydraulic circuit of the medium and to the relative valve 23, 33.

Le valvole 23, 33 sono preferibilmente valvole elettromagnetiche comandabili con la medesima centralina di controllo elettronica 50 che gestisce il motore 42, che comanda in funzione della corsa del pistone l’occlusione alternativa dei tubi 22, 32 durante la fase di perfusione (figura 3). The valves 23, 33 are preferably electromagnetic valves which can be controlled with the same electronic control unit 50 which manages the motor 42, which controls the alternative occlusion of the tubes 22, 32 during the perfusion phase as a function of the stroke of the piston (Figure 3). .

Secondo la realizzazione preferita del bioreattore 10 mostrata nelle figure 1-3, il pistone 41 è disposto in posizione verticale e la camera di coltura 13 si trova in posizione inferiore rispetto al pistone 41 per aiutare il debollamento attraverso i tubi 22, 23. Infatti, le eventuali bolle d’aria presenti nel bioreattore in fase di montaggio viaggiano verso l’alto e grazie alla disposizione verticale del pistone, risalgono fino all’ingresso dei due canali di afflusso del medium. According to the preferred embodiment of the bioreactor 10 shown in Figures 1-3, the piston 41 is arranged in a vertical position and the culture chamber 13 is located in a lower position with respect to the piston 41 to help the debuffing through the tubes 22, 23. In fact, any air bubbles present in the bioreactor during assembly travel upwards and, thanks to the vertical arrangement of the piston, rise up to the entrance of the two medium inflow channels.

La prima fase del debollamento comporta l’afflusso di medium dal lato di sinistra e l’uscita da quella di destra, in questo modo l’aria presente sotto la testa del pistone viene spinta fuori dal bioreattore 10. Una volta debollata la parte di destra del bioreattore 10, si inverte il flusso e si procede in modo analogo al debollamento della parte di sinistra. Tale procedura non presenta alcuna differenza dalla fase di perfusione, eccetto che non viene spinto del medium, ma si elimina aria. The first phase of the debuffing involves the inflow of medium from the left side and the exit from the right one, in this way the air present under the piston head is pushed out of the bioreactor 10. Once the right side has debuffed of the bioreactor 10, the flow is reversed and proceeding in a similar way to the weakening of the left side. This procedure has no difference from the perfusion phase, except that the medium is not pushed, but air is eliminated.

In figure 4 e 5 è mostrata schematicamente una seconda realizzazione del bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici 10, comprendente sostanzialmente i medesimi componenti del bioreattore di figure 1-3, alla descrizione delle quali si rimanda. La differenza consiste invece nel posizionamento orizzontale del pistone 41. La camera secondaria 46, che è generata tra il pistone 41 e la camera di scorrimento 16, in una posizione compresa tra le due guarnizioni 45, è in questo caso un incavo anulare ricavato sullo stelo 44 del pistone 41. La camera secondaria 46, in questa seconda realizzazione del bioreattore 10 secondo l’invenzione, è posta in comunicazione con la camera di coltura 13 attraverso una apertura 17’ della camera di scorrimento 16. Figures 4 and 5 schematically show a second embodiment of the bioreactor for the culture of biological cells or tissues 10, substantially comprising the same components as the bioreactor of Figures 1-3, to the description of which reference should be made. The difference consists instead in the horizontal positioning of the piston 41. The secondary chamber 46, which is generated between the piston 41 and the sliding chamber 16, in a position included between the two seals 45, is in this case an annular recess obtained on the rod 44 of the piston 41. The secondary chamber 46, in this second embodiment of the bioreactor 10 according to the invention, is placed in communication with the culture chamber 13 through an opening 17 'of the flow chamber 16.

Per le applicazioni a colture di cellule per le quali sono necessarie elevate pressioni, nell’ordine dei 15 MPa, il corpo 12 del bioreattore 10 è preferibilmente realizzato in un pezzo unico in materiale metallico provvisto di una pluralità di fori ad asse lineare collegati con l’esterno, che identificano rispettivamente la camera di scorrimento 16 del pistone 41, il primo 20 e secondo 30 canale di afflusso, il condotto di collegamento 17 tra la camera di coltura 13 e la camera secondaria 46 e la stessa camera di coltura 13. For applications to cell cultures for which high pressures are required, in the order of 15 MPa, the body 12 of the bioreactor 10 is preferably made in a single piece of metal material provided with a plurality of linear axis holes connected to the 'external, which respectively identify the sliding chamber 16 of the piston 41, the first 20 and second 30 inflow channel, the connection duct 17 between the culture chamber 13 and the secondary chamber 46 and the culture chamber 13 itself.

Per le applicazioni a colture di cellule per le quali sono sufficienti pressioni di esercizio ridotte, il corpo 12 del bioreattore 10 potrebbe essere realizzato in materiale plastico a basso costo ed essere pertanto impiegabile come prodotto monouso. For applications to cell cultures for which low operating pressures are sufficient, the body 12 of the bioreactor 10 could be made of low-cost plastic material and therefore be usable as a disposable product.

La coltura di cellule o tessuti biologici nel bioreattore 10 secondo l’invenzione, può essere fatta posizionando il costrutto di cellule libero nella camera di coltura 13, oppure posizionando un supporto, non mostrato, in posizione verticale nella camera di coltura 13 per migliorare il debollamento. The culture of biological cells or tissues in the bioreactor 10 according to the invention can be done by placing the free cell construct in the culture chamber 13, or by placing a support, not shown, in a vertical position in the culture chamber 13 to improve the debuffing. .

Il bioreattore 10 secondo l’invenzione, grazie alle sue ridotte dimensioni ed al numero ridotto di componenti può essere integrato in un sistema multistazione 100, mostrato in figura 10, comprendente una pluralità di bioreattori 10 collegati ad una unica centralina di controllo elettronica 50, in modo che ad un predeterminato canale della centralina 50 corrisponda un predeterminato bioreattore 10 del sistema multistazione 100. Ogni bioreattore 10 del sistema multistazione 100 ha invece un circuito idraulico indipendente per mantenere distinte tra loro le colture. Come schematizzato in figura 10 mediante tratteggio, per creare un sistema multistazione 100 è sufficiente collegare alla centralina elettronica 50 di un primo bioreattore 10 gli ulteriori bioreattori 10. L’unico limite al numero di bioreattori 10 formanti il sistema multistazione 100 è dato dal numero di canali della centralina 50 e dallo spazio a disposizione. The bioreactor 10 according to the invention, thanks to its small size and the reduced number of components, can be integrated into a multi-station system 100, shown in figure 10, comprising a plurality of bioreactors 10 connected to a single electronic control unit 50, in so that a predetermined channel of the control unit 50 corresponds to a predetermined bioreactor 10 of the multistation system 100. Each bioreactor 10 of the multistation system 100 instead has an independent hydraulic circuit to keep the crops distinct from each other. As schematized in figure 10 by hatching, to create a multistation system 100 it is sufficient to connect the additional bioreactors 10 to the electronic control unit 50 of a first bioreactor 10. The only limit to the number of bioreactors 10 forming the multistation system 100 is given by the number of channels of the control unit 50 and the space available.

La semina di cellule, e la conseguente coltura in incubatore per portare alla formazione di costrutti definiti ed efficienti, è un processo lungo e costoso. Esso richiede tecniche di isolamento e semina cellulare accurate per ridurre al minimo la mortalità cellulare incrementando l’efficienza dell’esperimento. Inoltre, la fase di coltura in incubatore richiede fino a quattro settimane, tempo durante il quale l’incubatore rimane occupato e non utilizzabile per altri esperimenti. Non potendo intervenire sui tempi di semina e isolamento, comunque minori rispetto al tempo di coltura, si cerca di intervenire appunto sulla fase di incubazione. The seeding of cells, and the consequent culture in an incubator to lead to the formation of defined and efficient constructs, is a long and expensive process. It requires accurate cell isolation and seeding techniques to minimize cell mortality by increasing the efficiency of the experiment. In addition, the culture phase in the incubator takes up to four weeks, a time during which the incubator remains occupied and cannot be used for other experiments. Not being able to intervene on the sowing and isolation times, however shorter than the cultivation time, we try to intervene precisely on the incubation phase.

Per fare ciò, l’obiettivo è ottenere, in un tempo limitato, un gran numero di campioni perfettamente coltivati (cosiddetto High-Throughput). Tuttavia, spesso, come nel caso della creazione di un costrutto di cartilagine, non esiste al momento una lista delle migliori condizioni di carico e perfusione applicabili. Tutto ciò allunga molto i tempi della ricerca, in quanto è necessario progettare diversi esperimenti a diverse condizioni di carico e perfusione per poi confrontare e stabilire quale sia il metodo di coltura migliore. To do this, the goal is to obtain, in a limited time, a large number of perfectly grown samples (so-called High-Throughput). However, often, as in the case of creating a cartilage construct, there is currently no list of the best applicable loading and perfusion conditions. All this greatly lengthens the research time, as it is necessary to design different experiments under different loading and perfusion conditions to then compare and establish which is the best culture method.

Nel caso esemplificativo di un sistema multistazione comprendente quattro bioreattori 10 identici indipendenti, raffigurati in figura 10, che applichino ognuno condizioni di carico e perfusione differenti e che coltivino simultaneamente per due settimane 18 supporti l’uno, al termine delle due settimane si avranno a disposizione 72 campioni coltivati a 4 condizioni di carico diverse. In the exemplary case of a multi-station system comprising four independent identical bioreactors 10, shown in figure 10, which each apply different loading and perfusion conditions and which simultaneously cultivate 18 supports each for two weeks, at the end of the two weeks 72 samples grown under 4 different load conditions.

Il funzionamento con diverse condizioni di carico permette, soprattutto in fase di sperimentazione, di verificare quale sia la condizione di coltura migliore, riducendo il tempo complessivo necessario per gli esperimenti. The operation with different load conditions allows, especially in the experimentation phase, to verify which is the best culture condition, reducing the overall time needed for the experiments.

Il funzionamento del bioreattore 10 secondo l’invenzione, può essere distinto in fasi di pressurizzazione e fasi di perfusione, comandabili una in alternativa all’altra per mezzo della centralina di controllo elettronica 50. Nel sistema multistazione 100, ogni bioreattore 10 è soggetto a condizioni di stimolazione programmabili e controllabili in modo indipendente. The operation of the bioreactor 10 according to the invention can be divided into pressurization and perfusion phases, which can be controlled alternatively by means of the electronic control unit 50. In the multistation system 100, each bioreactor 10 is subject to conditions stimulation programmable and controllable independently.

Nella fase di pressurizzazione, mostrata in figura 2, le guarnizioni 45 chiudono entrambi i canali 20, 30 e la discesa del pistone 41 provoca la pressurizzazione della camera di coltura 13, come pure della camera secondaria 46 e del condotto di collegamento 17. L’entità della pressurizzazione è determinabile con la corsa del pistone 41. In the pressurization phase, shown in Figure 2, the gaskets 45 close both channels 20, 30 and the descent of the piston 41 causes the pressurization of the culture chamber 13, as well as of the secondary chamber 46 and of the connection duct 17. The amount of pressurization can be determined with the stroke of the piston 41.

Secondo la realizzazione preferita del bioreattore 10 oggetto dell’invenzione, il pistone 41 possiede una corsa di 5 mm, per raggiungere la pressione desiderata nella fase di pressurizzazione. Considerando il circuito come completamente isolato e il medium di coltura come un fluido incomprimibile, teoricamente sarebbe sufficiente una corsa infinitesima per mandare in pressione il circuito. Tuttavia, il debollamento del dispositivo, seppure efficace e continuo durante l’arco dell’esperimento, può risultare non ideale e può verificarsi la presenza di bolle all’interno del bioreattore. Una presenza massiccia di bolle implica che la forza esercitata dal motore 42 viene utilizzata per comprimere le bolle, ma non il fluido. According to the preferred embodiment of the bioreactor 10 object of the invention, the piston 41 has a stroke of 5 mm, to reach the desired pressure in the pressurization phase. Considering the circuit as completely isolated and the culture medium as an incompressible fluid, theoretically an infinitesimal stroke would be sufficient to pressurize the circuit. However, the debuffing of the device, although effective and continuous during the period of the experiment, may not be ideal and the presence of bubbles may occur inside the bioreactor. A massive presence of bubbles implies that the force exerted by the motor 42 is used to compress the bubbles, but not the fluid.

Questo comporterebbe l’impossibilità di raggiungere la pressione desiderata. Tuttavia il pistone 41 ha una corsa sufficiente per spazzare il 12% del volume totale del bioreattore. In tale modo il pistone, oltre a comprimere le bolle fino a farle collassare, possiede ancora corsa utile per comprimere il liquido mandandolo in pressione. This would make it impossible to reach the desired pressure. However, the piston 41 has sufficient stroke to sweep 12% of the total volume of the bioreactor. In this way the piston, in addition to compressing the bubbles until they collapse, still has a useful stroke to compress the liquid by sending it under pressure.

Nella perfusione, mostrata in figura 3, le guarnizione inferiore 45 del pistone 41 risultano sempre a monte dei canali di afflusso 20, 30 del medium. In the perfusion, shown in Figure 3, the lower gaskets 45 of the piston 41 are always upstream of the medium inflow channels 20, 30.

In particolare, per ottenere una perfusione sinistra dei supporti, la valvola 33 del secondo canale di afflusso 30 si chiude e la valvola 23 del primo canale di afflusso 20 si apre. Il pistone 41 sale e avviene l’aspirazione che permette l’entrata di medium dal primo canale di afflusso 20. Quando il pistone 41 finisce l’aspirazione e inverte il suo moto, la valvola 33 del secondo canale di afflusso 30 passa da posizione aperta a chiusa e la valvola 23 del primo canale di afflusso 20 passa da posizione chiusa a aperta. Questo permette al medium di uscire dalla parte opposta a dove è entrato, vale a dire dal secondo canale 30, perfondendo quindi in un verso, in particolare da destra a sinistra, i supporti coltivati. Il pistone 41 ricomincia l’aspirazione sopra descritta e le valvole 23, 33 invertono nuovamente la loro condizione di apertura/chiusura. In particular, to obtain a left perfusion of the supports, the valve 33 of the second inflow channel 30 closes and the valve 23 of the first inflow channel 20 opens. The piston 41 rises and the suction takes place which allows the entry of medium from the first inflow channel 20. When the piston 41 finishes the suction and reverses its motion, the valve 33 of the second inflow channel 30 passes from the open position a closed and the valve 23 of the first inflow channel 20 passes from closed to open position. This allows the medium to exit from the side opposite to where it entered, that is to say from the second channel 30, thus perfusing the cultivated supports in one direction, in particular from right to left. The piston 41 restarts the suction described above and the valves 23, 33 reverse their opening / closing conditions again.

In tal modo, i supporti sono perfusi solo in un senso. Per ottenere una fase di perfusione destra dei supporti, s’inverte la sequenza di apertura/chiusura delle valvole 23, 33. La valvola 33 del secondo canale di afflusso 30 si apre e l’altra si chiude prima della risalita del pistone 41 che effettua una aspirazione dal secondo canale 20 e i supporti vengono perfusi nel senso opposto al precedente. Prima della corsa di discesa del pistone 41, le valvole 23, 33 invertono la loro condizione di chiusura/apertura e il medium è forzato ad uscire dal primo canale di afflusso 20. In this way, the supports are perfused only in one direction. To obtain a right-hand perfusion phase of the supports, the sequence of opening / closing of the valves 23, 33 is reversed. The valve 33 of the second inflow channel 30 opens and the other closes before the piston 41 rises. a suction from the second channel 20 and the supports are perfused in the opposite direction to the previous one. Before the descent stroke of the piston 41, the valves 23, 33 reverse their closed / open condition and the medium is forced out of the first inflow channel 20.

La perfusione destra e sinistra non sono effettuate in successione perché così non vi sarebbe nessun ricambio di medium. The left and right perfusions are not carried out in succession as there would be no change of medium.

In genere, ognuna è effettuata per metà del tempo dedicato alla perfusione, in modo tale da ottenere, al termine della perfusione, dei costrutti coltivati uniformemente e nei due sensi. Generally, each is carried out for half the time dedicated to perfusion, in such a way as to obtain, at the end of perfusion, constructs cultured uniformly and in both directions.

Inoltre, la pressurizzazione e la perfusione non sono generalmente contemporanee, ma intermittenti. E’ possibile utilizzare il bioreattore 10 oggetto dell’invenzione alternando diverse ore di perfusione a diverse ore di pressurizzazione oppure, incrementando la corsa del pistone 41, con un metodo intermittente. In tale modo il pistone 41 vede in un suo ciclo sia la fase di perfusione sia la fase di pressurizzazione permettendogli una corsa più lunga. Furthermore, pressurization and perfusion are generally not simultaneous, but intermittent. It is possible to use the bioreactor 10 object of the invention by alternating several hours of perfusion with several hours of pressurization or, by increasing the stroke of the piston 41, with an intermittent method. In this way the piston 41 sees both the perfusion phase and the pressurization phase in one of its cycles, allowing it a longer stroke.

Come si può intuire, è importante limitare il volume di medium spinto dal pistone 41 e la relativa portata in modo tale che la sua velocità rimanga intorno ai 100 μm/s, velocità benefica per le cellule. As you can guess, it is important to limit the volume of medium pushed by the piston 41 and its flow rate in such a way that its speed remains around 100 μm / s, which is beneficial for the cells.

E’ tuttavia necessaria un’accorta regolazione della corsa del pistone 41, in quanto il motore 42 è chiamato a soddisfare due richieste antitetiche: esso deve garantire una coppia e velocità tale per riuscire a raggiungere la pressione di 15 MPa in 0.5 secondi. D’altro canto, in fase di perfusione, il motore 42 deve saper muovere il pistone 41 così lentamente per non far superare i 100 μm/s all’interno dei supporti. However, a careful adjustment of the stroke of the piston 41 is necessary, as the engine 42 is required to satisfy two antithetical requests: it must guarantee such a torque and speed to be able to reach the pressure of 15 MPa in 0.5 seconds. On the other hand, during the perfusion phase, the motor 42 must be able to move the piston 41 so slowly so as not to exceed 100 μm / s inside the supports.

Secondo ulteriori realizzazioni semplificate, mostrate in figure 6-9, il bioreattore 10 secondo l’invenzione può comprendere anche un solo canale di afflusso 20 alla camera di coltura 13 (figure 6 e 7) collegato al relativo tubo 22 provvisto di valvola 23. Tale canale 20 può essere direttamente immesso nella camera di coltura 13, oppure può vantaggiosamente essere immesso nella camera di scorrimento 16 spazzata dalla corsa del pistone 41. In tal caso la valvola 23 comunque non sarà sollecitata durante la fase di pressurizzazione e potrà avere inferiori caratteristiche meccaniche. According to further simplified embodiments, shown in Figures 6-9, the bioreactor 10 according to the invention can also comprise a single inflow channel 20 to the culture chamber 13 (Figures 6 and 7) connected to the relative tube 22 provided with valve 23. Such channel 20 can be directly introduced into the culture chamber 13, or it can advantageously be introduced into the sliding chamber 16 swept by the stroke of the piston 41. In this case the valve 23 will in any case not be stressed during the pressurization phase and may have lower mechanical characteristics .

Le ulteriori realizzazioni del bioreattore 10, mostrate in figure 8 e 9 comprendono due canali di afflusso 20, 30 alla camera di coltura 13,posti ad estremità opposte della camera 13 stessa, in cui almeno uno 30 dei canali è immesso nella camera di coltura 13 piuttosto che nella camera di scorrimento 16 spazzata dalla corsa del pistone 41. Analogamente a quanto sopra descritto, le valvole 20, 30 applicate ai tubi direttamente immessi nella camera di coltura dovranno essere in grado di tenere le alte pressioni della fase di pressurizzazione. The further embodiments of the bioreactor 10, shown in figures 8 and 9 comprise two inflow channels 20, 30 to the culture chamber 13, located at opposite ends of the chamber 13 itself, in which at least one 30 of the channels is introduced into the culture chamber 13 rather than in the sliding chamber 16 swept by the stroke of the piston 41. Similarly to what has been described above, the valves 20, 30 applied to the pipes directly introduced into the culture chamber must be able to hold the high pressures of the pressurization phase.

Anche per le realizzazioni semplificate del bioreattore secondo l’invenzione, mostrate in figure 6-9, al variare della corsa dell’unico attuatore lineare posto in comunicazione con la camera di coltura 13 è possibile realizzare alternativamente e in momenti temporali distinti fase di pressurizzazione della camera di coltura 13 e fasi di perfusione della stessa. Also for the simplified embodiments of the bioreactor according to the invention, shown in Figures 6-9, as the stroke of the only linear actuator placed in communication with the culture chamber 13 varies, it is possible to alternatively realize the pressurization phase of the culture chamber 13 and its perfusion phases.

Il bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici, oggetto della presente invenzione, ha il vantaggio di presentare un numero limitato di componenti che facilita oltremodo il lavoro dell’operatore che lo utilizza. Il bioreattore risulta compatto e relativamente maneggevole sotto cappa. La facile chiusura semplifica la fase di montaggio svincolandosi dall’utilizzo di viti. Infatti, la presenza di una sola vite sovradimensionata e serrabile a mano riduce i tempi di montaggio sotto cappa e facilita l’operatore durante l’esperimento, oltre a limitare l’ingombro. The bioreactor for the culture of biological cells or tissues, object of the present invention, has the advantage of having a limited number of components which greatly facilitates the work of the operator who uses it. The bioreactor is compact and relatively easy to handle under the hood. The easy closure simplifies the assembly phase, freeing itself from the use of screws. In fact, the presence of a single oversized screw that can be tightened by hand reduces assembly times under the hood and facilitates the operator during the experiment, as well as limiting the overall dimensions.

In particolare, l’eliminazione della pompa roller rispetto ai dispositivi noti, comporta un rilevante vantaggio in termini di semplicità e ingombro. In particular, the elimination of the roller pump with respect to known devices entails a significant advantage in terms of simplicity and bulk.

Inoltre, nonostante la particolare geometria del bioreattore, tutto il complesso risulta facilmente sterilizzabile in autoclave. Si ricordi che le parti che entrano in contatto con il bioreattore e che necessitano una sterilizzazione sono: il corpo del bioreattore, il piattello, il pistone e la guarnizioni. Furthermore, despite the particular geometry of the bioreactor, the whole complex can be easily sterilized in an autoclave. Remember that the parts that come into contact with the bioreactor and that require sterilization are: the bioreactor body, the plate, the piston and the gaskets.

Un ridotto numero di parti che necessitano sterilizzazione implica una minore difficoltà in fase di montaggio. Infatti, le parti che non entrano in contatto con i fluidi biologici possono essere assemblati in ambiente non sterile e quindi fuori dalla cappa: ciò implica una maggiore libertà di movimento da parte dell’operatore che facilita e velocizza la fase di assemblaggio. Quando invece il circuito viene riempito di medium, è necessario procedere sotto cappa per evitare la contaminazione dei costrutti e il fallimento in partenza dell’esperimento. A reduced number of parts that need sterilization means less difficulty during assembly. In fact, the parts that do not come into contact with biological fluids can be assembled in a non-sterile environment and therefore outside the hood: this implies greater freedom of movement by the operator which facilitates and speeds up the assembly phase. On the other hand, when the circuit is filled with medium, it is necessary to proceed under a hood to avoid contamination of the constructs and failure at the start of the experiment.

Vantaggiosamente, grazie alla configurazione del bioreattore secondo l’invenzione e al metodo di perfusione mediante pistone, il debollamento risulta continuo ed efficiente. Il debollamento avviene alla fine della fase di montaggio, prima di posizionare il bioreattore in incubatore ed avviare la coltura dei campioni. Inoltre, anche durante la fase di coltura, è facile intuire come il debollamento avvenga in continuazione, in quanto la procedura di perfusione procede in modo del tutto analogo alla fase di debollamento. Il risultato è l’ottenimento di un circuito sempre debollato anche durante le n settimane di esperimento, durante le quali può verificarsi la generazione di bolle a causa del metabolismo cellulare. Advantageously, thanks to the configuration of the bioreactor according to the invention and to the perfusion method by piston, the boiling is continuous and efficient. The debuffing occurs at the end of the assembly phase, before placing the bioreactor in the incubator and starting the culture of the samples. Furthermore, even during the cultivation phase, it is easy to understand how the debuffing occurs continuously, as the perfusion procedure proceeds in a completely similar way to the debuffing phase. The result is to obtain a circuit that is always weakened even during the n weeks of the experiment, during which the generation of bubbles can occur due to cellular metabolism.

Ulteriore vantaggio è rappresentato dall’utilizzo di valvole esterne poco costose per il ricircolo bidirezionale del mezzo di coltura. Infatti, l’attuatore svolge la funzione di pressurizzazione tramite valvole meccaniche ad occlusione, costituite dal pistone e dalle guarnizioni. Per la perfusione sono sufficienti invece valvole elettromagnetiche a basso costo e durevoli nel tempo che devono semplicemente occludere alternativamente, in funzione della corsa del pistone, i tubi in silicone di afflusso del medium. Tali valvole non complicano il bioreattore in quanto richiedono solo una centralina di controllo elettronica, che comunque è già prevista per il comando dell’attuatore. Another advantage is represented by the use of inexpensive external valves for the bidirectional recirculation of the culture medium. In fact, the actuator performs the function of pressurization through mechanical occlusion valves, consisting of the piston and seals. For perfusion, on the other hand, low-cost and long-lasting electromagnetic valves are sufficient, which simply have to alternatively occlude, depending on the stroke of the piston, the silicone tubes for inflow of the medium. These valves do not complicate the bioreactor as they only require an electronic control unit, which in any case is already provided for the actuator control.

Il bioreattore secondo l’invenzione ha inoltre vantaggiosamente un basso volume di priming, vale a dire un volume di spazio vuoto nell’interno del bioreattore, che incide sul volume di medium presente nel circuito e quindi sui costi degli esperimenti. E’ necessario aggiungere che il bioreattore può essere utilizzato per compiere diversi tipi di esperimenti, anche variando la composizione del mezzo di coltura. Nello specifico, se si volesse sperimentare l’azione di fattori di crescita, risulterebbe oltremodo oneroso avere un alto volume di riempimento in quanto i fattori di crescita possiedono dei prezzi molto elevati. The bioreactor according to the invention also advantageously has a low priming volume, i.e. a volume of empty space inside the bioreactor, which affects the volume of medium present in the circuit and therefore the costs of the experiments. It is necessary to add that the bioreactor can be used to perform different types of experiments, even by varying the composition of the culture medium. Specifically, if you wanted to experiment with the action of growth factors, it would be extremely onerous to have a high filling volume as the growth factors have very high prices.

Un ulteriore vantaggio del bioreattore secondo l’invenzione è rappresentato dalle condizioni di stimolazione programmabili, controllabili e personalizzabili in maniera semplice. A further advantage of the bioreactor according to the invention is represented by the programmable, controllable and customizable stimulation conditions in a simple way.

Vantaggiosamente, il bioreattore secondo l’invenzione consente di alloggiare nella camera di coltura supporti per cellule personalizzati in termini di numero e dimensione di campioni da coltivare. Advantageously, the bioreactor according to the invention allows to house in the culture chamber supports for cells customized in terms of number and size of samples to be cultivated.

Inoltre, vantaggiosamente, il costo ridotto e la compattezza del bioreattore, che occupa un volume di circa 10 cm di diametro e 30 cm di altezza, motore compreso, consentono di ospitarne più esemplari nell’incubatore, oltretutto collegabili ad una medesima centralina a formare un sistema multistazione. Furthermore, advantageously, the reduced cost and compactness of the bioreactor, which occupies a volume of about 10 cm in diameter and 30 cm in height, including the engine, allow multiple specimens to be housed in the incubator, which can also be connected to the same control unit to form a multistation system.

Il sistema multistazione consente vantaggiosamente di trattare contemporaneamente un alto numero di campioni in differenti condizioni di carico. The multi-station system advantageously allows to simultaneously treat a high number of samples under different load conditions.

Il bioreattore per la coltura di cellule o tessuti biologici e il relativo sistema multistazione così concepiti sono suscettibili di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell’invenzione; inoltre tutti i dettagli sono sostituibili da elementi tecnicamente equivalenti. In pratica i materiali utilizzati, nonché le dimensioni, potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze tecniche. The bioreactor for the culture of biological cells or tissues and the related multistation system thus conceived are susceptible to numerous modifications and variations, all of which are covered by the invention; furthermore, all the details can be replaced by technically equivalent elements. In practice, the materials used, as well as the dimensions, may be any according to the technical requirements.

Claims

CLAIMS 1) Bioreactor for the culture of biological cells or tissues comprising a body (12) equipped with a culture chamber (13) for cells or tissues and at least a first inflow channel (20) for a liquid culture medium, as well as comprising an actuation system for the perfusion and pressurization of the culture chamber (13), characterized in that said actuation system for the perfusion and pressurization of the culture chamber comprises a single linear actuator (40) placed in communication with said chamber culture (13) which, as the stroke varies, carries out pressurization and perfusion phases of said culture chamber (13).

2) Bioreactor according to claim 1, characterized in that said linear actuator (40) comprises a piston (41), movable in a sliding chamber (16) placed in communication with the culture chamber (13) 3) Bioreactor according to claim 2, characterized by the fact that said at least one first inflow channel (20) is introduced into said flow chamber (16) and by the fact that the stroke of the piston (41) has a variable lower dead center, which is located downstream of said at least one first inflow channel (20), for the pressurization phase, and upstream of said at least one first inflow channel (20), for the perfusion phase, in which said piston (41 ) is provided at one end with at least a first gasket (45) which, at the lower dead center of the piston in the pressurization phase, is located in correspondence with or downstream of said at least first inflow channel (20). 4) Bioreactor according to any one of the preceding claims, characterized in that it comprises at least a second inflow channel (30) of the liquid medium in communication with said culture chamber (13). 5) Bioreactor according to claim 4, when dependent on claim 3, characterized by the fact that also said at least second inflow channel (30) is introduced into said flow chamber (16) and that said piston (41) is provided at the end opposite of at least a second gasket (45) at a distance from the first gasket (45) substantially equal to the distance between said inflow channels (20, 30), in which a secondary chamber (46) generated between said piston (41) and said sliding chamber (16) in a position between said two gaskets (45) is in communication with said culture chamber (13), during the pressurization phase said culture chamber (13) and said secondary chamber (46) being isolated from to the inflow channels (20, 30) due to the effect of the gaskets (45) and during the perfusion phase being in connection with the inflow channels (20, 30). 6) Bioreactor according to claim 5, characterized in that at each end of the piston (41) there is a pair of gaskets (45), in which the gaskets of each pair (45) are respectively upstream and downstream of the corresponding channel inflow (20, 30). 7) Bioreactor according to claim 5, characterized by the fact that said linear actuator (40), as the stroke varies, carries out alternatively and in distinct temporal moments, phases of pressurization and perfusion phases of said culture chamber (13), said channels of inflow (20, 30) being provided with controllable valves (23, 33) to alternatively occlude, according to the stroke of the piston (41), said inflow channels (20, 30) during the unidirectional or bidirectional perfusion phase. 8) Bioreactor according to any one of the preceding claims, characterized in that it comprises an electric motor (42) controlled by an electronic control unit (50). 9) Bioreactor according to claim 5, characterized by the fact that said body (12) is made in a single piece of metal material and is provided with a plurality of linear axis holes which identify said sliding chamber (16) of the piston, said first and second inflow channel (20, 30), a connecting duct (17) between said culture chamber (13) and said secondary chamber (46), as well as said culture chamber (13), open on one side and reclosable with a screw (15), or it is made of plastic material suitable for single use. 10) Bioreactor according to any one of the preceding claims, characterized by the fact that said piston (41) is arranged in a vertical position and that the culture chamber (13) is located in a lower position with respect to said piston (41) to help the boiling through the pipes. 11) Multi-station system comprising a plurality of bioreactors (10) according to any one of the preceding claims in which said bioreactors (10) are connected to a single electronic control unit (50), so that to a predetermined channel of the control unit (50) corresponds to a predetermined bioreactor of the multistation system, and in which each bioreactor of the multistation system has an independent hydraulic circuit. 12) Method for applying a hydrostatic pressure to a culture chamber (13) of a bioreactor according to claim 1, characterized by the fact of carrying out the pressurization or perfusion as the stroke of said single linear actuator (40) varies.