ITFI20120025A1 - Formulazione costituita da snalp contenente pre-mir 34a utile per il trattamento del mieloma multiplo. - Google Patents

Description

Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:

Formulazione costituita da SNALP contenente pre-miR 34a utile per il trattamento del mieloma multiplo.

Campo dell'invenzione

L'invenzione si riferisce al campo dei prodotti ad attività farmacologica in particolare Stato dell'arte

Come è noto il mieloma multiplo (MM) è la seconda malattia ematologica più comune nei Paesi occidentali. Nonostante numerosi progressi nella conoscenza dei meccanismi patobiologici della malattia e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, i trattamenti oggi disponibili falliscono nell’obiettivo di ottenere una risposta duratura e la maggior parte dei pazienti sperimentano recidiva e esito letale. Numerose anomalie genetiche ed epigenetiche caratterizzano il processo di trasformazione multistep del MM nel midollo osseo dove il microambiente gioca un importante ruolo di supporto alla crescita cellulare e alla resistenza ai terapeutici convenzionali. Tutte le alterazioni acquisite dalle cellule di MM possono deregolare la crescita delle plasmacellule e il network di interazioni molecolari all’interno del microambiente.

E' altrettanto noto che i microRNA (miRs) sono piccole molecole di RNA non codificanti di circa 20 basi che giocano un ruolo critico nella regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica. I miRs sono importanti modulatori di pathways cellulari con ruolo chiave nei processi di proliferazione e sopravvivenza cellulare. I miRs deregolati (down- o upregolati) possono agire come oncogeni (onco-miRs) o soppressori tumorali (TS-miRs) ed hanno perciò suscitato interesse per potenziali strategie terapeutiche.

Tra i miRs che risultano frequentemente downregolati in differenti tumori umani, il miR-34a risulta di particolare interesse per le sue potenziali applicazioni terapeutiche. Inoltre, l’attività antitumorale sembra non limitata alle cellule con ridotta espressione endogena di miR34a ma risulta anche efficace in cellule con apparente espressione normale di miR 34a.

Tuttavia l’utilizzo di miR, macromolecole polianioniche, presenta non poche difficoltà, tra cui degradazione ed inattivazione da parte delle nucleasi presenti nel plasma e nelle cellule (Akhtar et al., 1991), una scarsa penetrazione nelle cellule stesse (Hope et al., 1998; Rojanasakul et al., 1996), una rapida eliminazione piasmatica (Agrawal e Zhang, 1997) nonché una tossicità renale ed emodinamica (Henry et al., 1997). Tutto ciò ne limita fortemente l’impiego pre-clinico e clinico.

Da ciò risulta evidente che l’impiego di miR in terapia, non può prescindere dallo sviluppo di una formulazione che sia in grado di proteggere la molecola dalla degradazione enzimatica, ne consenta l’accumulo preferenzialmente nel sito d’azione e ne promuova la penetrazione all’interno delle cellule bersaglio e le permetta di svolgere la sua azione. E' evidente da quanto detto sopra l'interesse a poter utilizzare un miR quale prodotto farmacologico nel trattamento del mieloma multiplo.

Breve descrizione delle figure

La Figura 1 mostra i risultati di test in vivo utilizzando i composti secondo l’invenzione su Descrizione dettagliata dell'invenzione

E' stato ora sorprendentemente trovato che un particolare miR, miR 34a, wild type o presentante un gruppo -0-CH3in posizione C2’ (miR 34a O-Met ), di sequenza

5’-UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U-3’ [SEQ ID n°1]

e un pre-miR34a, avente sequenza

5’-(GGC CAG CUG UGA GUG UUU CUU UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG UUG UGA GCA AUA GUA AG G AAG CAA UCA GCA AGU AUA CUG CCC UAG AAG UGC UGC ACG UUG UGG GGC CC)-3’ [SEQ ID n°2]

possono essere efficacemente utilizzati contro cellule di mieloma multiplo grazie a particolari nanovettori a base lipidica che permettono di superare i problemi suddetti proteggendo il miR 34a o il pre-miR in essi incapsulato dalla degradazione in ambiente biologico, cambiandone la biodistribuzione e favorendo l’interazione di quest’ultimo con cellule bersaglio.

Va sottolineato che i pre-miR sono molecole diverse dai miR 34a, sia perché seguono un diverso pathway biochimico, sia per la loro lunghezza; un miR ha una lunghezza di 21 nucleotidi, mentre un pre-miR arriva a 71 nucleotidi.

In particolare secondo l'invenzione per nanovettori a base lipidica si intendono nanoparticelle, polimeriche o lipidiche, quali nanoparticelle, micelle, liposomi o particelle lipidiche stabilizzate contenenti acidi nucleici (queste ultime anche note come SNALPs) (negli esempi specifici qui di seguito riportati si sono utilizzati questi ultimi come nano vettori).

E' pertanto un oggetto della presente invenzione una formulazione costituita da nanovettori a base lipidica contenente miR 34a o miR 34a O-Met o pre-miR 34a (o loro miscele) utile per il trattamento del mieloma multiplo.

L'invenzione potrà essere meglio compresa alla luce degli esempi qui di seguito riportati. Esempio 1

Preparazione degli SNALPs caricati con miR 34a o miR 34a O-Met o pre-miR 34a

Gli SNALPs utilizzati sono costituiti da una miscela di lipidi (1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine/colesterolo/N-palmitoyl-sphingosine-1 -{succi nyl[methoxy(polyethylene glycol) 2000]}/1 ,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane (DSPC/CHOL/Cer-PEG/DODAP) (25/45/20/10, mol/mol/mol/mol) o DSPC/DSPE-PEG-Maleinimide(Mal)/CHOL/Cer-PEG/DODAP) e sono preparati mediante la tecnica dell'iniezione di etanolo (Sample et al., 2001 ) modificata.

Quindi una soluzione etanolica (100%) contenente 1 mg di lipidi totali (0,4 mi del volume totale) sono posti in una vial ambrata.

In un’altra vial, 0,2 mg di miR 34a o miR 34a O-Met o pre-miR 34a (qui di seguito indicati come ON) sono stati solubilizzati in 0,6 mi di acido citrico 20 mM a pH 4,0.

Le due soluzioni sono state riscaldate a 65Ό per 2-3 minuti e successivamente la soluzione etanolica, contenente i lipidi, è stata aggiunta alla soluzione acquosa contente ΓΟΝ, il tutto sotto agitazione. Successivamente le preparazioni sono state tenute a 65° C per circa 1 ora e sottoposte a un processo di estrusione, mediante l’utilizzo di un estrusore termostatato (Northern Lipidi Ine., Canada), a 65Ό. La sos pensione è stata fatta passare 5 volte su membrane di policarbonato con porosità di 0,2 μιτι e 20 volte su membrane con porosità 0,1 μιτι. La sospensione è stata, quindi, dializzata (3,5 kDa cut off) in tampone citrato 20 mM a pH 4,0 per 1 ora circa, per rimuovere l’eccesso di etanolo ed in tampone HBS (20mM HEPES, 145 mM NaCI, pH 7,4) per 18-20 ore per rimuovere il tampone citrato e neutralizzare il DODAP. La sospensione è stata purificata tramite cromatografia a scambio ionico DEAE-Sepharose CL-6B.

Il diametro medio degli SNALP è stato determinato mediante photon correlation spectroscopy (PCS). Ciascun campione è stato diluito con acqua deionizzata e filtrata ed analizzato a 20Ό. Per ciascun campione, il diametro medio e la distribuzione dimensionale sono stati ottenuti dalla media di tre misure. Per ogni formulazione, il diametro medio e ΙΊ.Ρ. sono stati calcolati dalla media di tre differenti lotti. Le formulazioni SNALP incapsulanti miR34a, miR34a O-Met o pre-miR34a, presentano rispettivamente un diametro medio di circa 157, 128 e 208 nm.

Il dosaggio dei diversi miRs contenuti all’interno degli SNALPs è stato ottenuto mediante spettroscopia UV (Shimadzu, Giappone): 10 pi di sospensione SNALPs sono stati disciolti in 990 μΙ di metanolo ed analizzati a 260 nm. Il tasso d’incapsulazione dell’ON è stato calcolato come mg di ON/ml di sospensione diviso i mg di lipidi totali. La quantità di DSPC è stata calcolata mediante il saggio di Stewart (vedi Stewart JC. Anal Biochem. 1980). In breve, 10 μΙ di sospensione SNALP sono stati diluiti con 2 mi di acqua contenente ferrotiocianato di ammonio (0,1 N); la soluzione è stata poi addizionata a 2 mi di cloroformio. La concentrazione di DSPC è stata determinata dalla misura dell’assorbanza della fase organica a 485 nm. L’efficienza d’incapsulazione, invece, è stata calcolata come rapporto tra il tasso d’incapsulazione reale e quello teorico per 100.

Da tali analisi risulta che l’efficienza d’incapsulazione, per le formulazioni SNALP incapsulanti miR34a risulta essere pari al 82%, mentre per la formulazione miR34a O-Met o pre-miR 34a, risulta essere per entrambe del 100% circa.

Esempio 2

Esperimenti in vivo.

Gli esperimenti in vitro sono stati condotti utilizzando colture di linee cellulari di MM trattate con varie formulazioni preparate secondo l’esempio 1 e sottoposte ad analisi di proliferazione cellulare. Per gli esperimenti in vivo sono stati utilizzati modelli murini xenograft e precisamente topi immunodeficienti (SCID) inoculati sottocute con 5X106 cellule di MM. Quando i tumori raggiungevano una dimensione misurabile venivano trattati per 4 volte a distanza di tre giorni con le diverse formulazioni a base di SNALP. L’attività anti MM del formulato è stata valutata mediante misura della massa tumorale e valutazione della survival degli animali trattati. Gli animali sono stati sacrificati quando i tumori raggiungevano 2 cm di diametro o quando insorgevano eventi che ne compromettevano la qualità della vita.

In Figura 1 , è stata riportata l’inibizione della proliferazione cellulare (asse delle ascisse) rispetto ai giorni di trattamento (asse delle ordinate). In particolare, è possibile osservare che l’attività antitumorale di pre-miRNA 34a nel MM è superiore a quella ottenuta con miR34a e miR34 OMe, entrambi veicolati mediante SNALP. In assenza di nano vettore i miR non mostrano in vivo attività antitumorale nel MM.

Sempre dalla figura 1 si nota come, contrariamente alle attese, la presenza di transferrina sulla superficie degli SNALP non è in grado di aumentare l’efficacia degli SNALP contenenti pre-miR 34 mentre esercita l’effetto atteso sugli SNALP contenenti miR34a.

Claims (4)

1. RIVENDICAZIONI 1. Formulazioni comprendenti miR 34a di sequenza 5’-UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U-3’ [SEQ ID n°1], o Il corrispondente derivato MiR 34 a O-Met, presentante un gruppo -0-CH3in posizione C2’ o un pre-miR34a, avente sequenza 5’-(GGC CAG CUG UGA GUG UUU CUU UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG UUG UGA GCA AUA GUA AG G AAG CAA UCA GCA AGU AUA CUG CCC UAG AAG UGC UGC ACG UUG UGG GGC CC)-3’ [SEQ ID n°2] o loro miscele. Incapsulati in un opportuno nanovettore a base lipidica.
2. 2. Formulazioni secondo la rivendicazione 1 in cui detto nano vettore a base lipidica è scelto fra: nanoparticelle, liposomi, particelle lipidiche stabilizzate contenenti acidi nucleici noti come SNALPs.
3. 3. Formulazione secondo la rivendicazione 2 in cu detto nano vettore a base lipidica è uno SNALP.
4. 4. Uso di una formulazione secondo le rivendicazioni 1 - 3 per ili trattamento del mieloma multiplo.