ITFI20090141A1 - Nuovi bloccanti isoforma-selettivi dei canali hcn. - Google Patents

Description

DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:

Nuovi bloccanti isoforma-selettivi dei canali HCN

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce al campo nuovi composti chimici, loro sintesi ed uso medico o come strumenti per l’indagine farmacologica o nel processo di sviluppo di nuovi farmaci. In particolare si riferisce a composti che bloccano selettivamente le isoforme dei canali HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide gated channels).

STATO DELL’ARTE

Le malattie cardiovascolari rappresentano la prima causa di morte nel mondo occidentale. La cardiomiopatia ischemica affligge il 3-4% della popolazione adulta, tuttavia, nonostante i progressi in campo medico e chirurgico, le previsioni dell’incidenza sono in aumento a causa della crescita dell’età media della popolazione e dell’incidenza di ipertensione, obesità e diabete. L’angina pectoris è tipicamente scatenata dal disequilibrio tra perfusione miocardica e consumo d’ossigeno, accentuato dall’aumento della frequenza cardiaca, che rappresenta il principale determinante del fabbisogno d’ossigeno del cuore. È quindi intuitivo che farmaci che riducono la frequenza cardiaca abbiano la potenzialità di alleviare la sintomatologia dei pazienti.

Il discorso è tuttavia più ampio. Dati raccolti negli ultimi due decenni dimostrano in modo oggettivo che la riduzione della frequenza cardiaca è associata alla diminuzione del rischio di morte per cause cardiovascolari.

II controllo della frequenza cardiaca è da anni un obiettivo terapeutico, realizzato con varie classi di farmaci come beta-bloccanti e calcio-antagonisti, entrambi con numerosi effetti collaterali che ne limitano di fatto l’uso clinico (ipotensione arteriosa, depressione, disfunzione erettile, asma o malattie respiratorie croniche). Recentemente è comparsa nello scenario farmacologico clinico una classe di farmaci in grado di interferire in maniera diretta con il meccanismo ionico (la funny current ) che controlla la frequenza di scarica del pacemaker cardiaco, il nodo seno atriale. Questo fatto ha aperto nuove prospettive terapeutiche di imprevedibile sviluppo.

La funny current (lf) svolge un ruolo primario nella generazione di attività pacemaker e nella regolazione della frequenza cardiaca. Ifè una corrente in ingresso Na<+>/K<+>, attivata per iperpolarizzazione, direttamente modulata da cAMP, e regolata da recettori di neurotrasmettitori accoppiati a nucleotidi ciclici secondi messaggeri. Ifè mediata da canali HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide gated channels): essi consistono in 6 domini transmembrana (S1-6), con un sensore di voltaggio in S4 ed un sito di binding per un nucleotide ciclico. Nei mammiferi la famiglia dei canali HCN è formata da quattro membri o isoforme (HCN1-4) che sono differentemente distribuiti nel sistema nervoso periferico e centrale e nel cuore. I canali sono formati da quattro subunità; quando le isoforme sono espresse separatamente in cellule eterologhe, esse formano canali omomerici che mostrano le principali proprietà biofisiche della Ifnativa ma differendo gli uni gli altri per la loro diversa velocità di attivazione e il grado in cui essi sono modulati da cAMP. La varietà dei canali HCN è in vivo ulteriormente variegata perché le quattro subunità possono combinarsi in canali eteromerici, la cui stechiometria non è nota.

I canali HCN (Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide gated channels) sono di fondamentale importanza per il funzionamento di diversi tipi di cellule eccitabili: da quelle del nodo seno-atriale, che generano il battito cardiaco, a neuroni del sistema nervoso centrale e periferico, ai fotorecettori della retina. I bloccanti di questi canali trovano applicazione terapeutica per il momento solo a livello cardiaco, come bradicardizzanti nel trattamento dell’angina. Tuttavia ci sono numerose evidenze sperimentali del coinvolgimento dei canali HCN in altre importanti patologie come l’epiiessia e il dolore neuropatico, e questo aumenta l’interesse e le possibilità di impiego terapeutico di sostanze che modulano il funzionamento di queste proteine.

La specificità d’azione dei farmaci bradicardizzanti sta nel fatto che bloccano la corrente Ifo corrente pacemaker, legandosi in modo reversibile all’interno del poro del canale ionico.

Allo stato dell’arte sono noti alcuni bradicardici specifici capaci di bloccare la fra questi si ricordano zatebradina (UL-FS-49), cilobradina (DK-AH-269) e ivabradina ((+)-S 16257). L’unica molecola di questa classe attualmente disponibile clinicamente è l’ivabradina (Procoralan® o Corlentor®, Servier).

Altri composti noti strutturalmente analoghi alla zatebradina sono:

- 3-((E)-4-((3,4-dimetossifenetil)(metil)amino)but-2-enil)-7,8-dimetossi-1 H-benzo[d]azepin-2(3H)-one (EC4) descritto in Romanelli, M. N. et al. Bioorg. Med. Chem. 2005, 581 , 97;

- 3-((Z)-4-((3,4-dimetossifenetil)(metil)amino)but-2-enil)-7,8-dimetossi-1H-benzo[d]azepin-2(3H)-one (EC32) descritto in E. Cerretini, 1999 tesi di laurea in CTF, Univ. Firenze;

- Cis 3-(3-{[2-(3,4-Dimetossifenil)etil]metilamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidro-benzo[c/]azepin-2-one (EC18) descritto in E. Cerretini, 1999 tesi di laurea in CTF, Univ. Firenze.

I composti EC4 ed EC32 hanno mostrato la capacità di bloccare lfcon potenza analoga a zatebradina; anche EC18 ha mostrato una buona attività cronotropica negativa in atri isolati di cavie.

Le strutture dei composti noti allo stato dell’arte sono rappresentati in figura 1.

Zatebradina, cilobradina e ivabradina hanno differenti capacità di bloccare le correnti cationiche, ma non sono in grado di discriminare fra le diverse isoforme dei canali HCN (Sieberg, J. et al. Mol. Pharamcol. 2006, 69, 1328; Lee, T. T., et al. Eur. J. Pharmacol. 2008, 581 , 97).

Un possibile limite all’utilizzo di queste sostanze è la mancanza di selettività nei confronti delle diverse isoforme, ed in particolare della principale isoforma del nodo senoatriale (HCN4). Infatti, il blocco deH’isoforma neuronaie HCN1 può alterare la funzione visiva, causando un fenomeno detto delle visioni persistenti legato alla peculiare funzione della corrente lfnelle cellule della retina. E’ quindi importante che un farmaco interagisca il più selettivamente possibile con l’isoforma maggiormente espressa e/o funzionalmente più rilevante nel tessuto e nel tipo cellulare target del trattamento farmacologico al fine di limitare l’insorgenza di effetti collaterali. In letteratura però non sono ancora note sostanze isoforma selettive: infatti, i farmaci in commercio o in sperimentazione bloccano le varie isoforme con analoga potenza.

Le varie isoforme dei canali HCN sono proteine che presentano un alto grado di omologia, per cui non è facile trovare una sostanza che interagisca selettivamente con una di esse.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire nuove molecole che siano non solo sono in grado di ridurre la frequenza cardiaca con potenza almeno paragonabile a quella dei prodotti di riferimento (zatebradina e ivabradina), ma presentino selettività verso una specifica isoforma dei canali HCN.

DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI

Ak = alchile lineare o ramificato;

Ako-4=alchile assente o contenente da 1 a 4 atomi di carbonio;

Ak-M=alchile contenente da 1 a 4 atomi di carbonio;

Aki-3= alchile contenente da 1 a 3 atomi di carbonio;

Àk2-8=alchile contenente da 2 a 9 atomi di carbonio;

Hai = alogeno

-* = nelle formule di struttura rappresenta il punto di attacco del frammento rappresentato

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante nuovi composti di formula (I):

in cui

2 — G1 o Aki-4;

oppure G2 e G3 insieme all’azoto a cui sono legati formano una struttura ciclica del tipo:

X = CH=CH, CH2CH2;

Y = but-2-en-1 ,4-di-ile di formula

; oppure

Y è cicloalcan-di-ile del tipo

W = Ak2-g, Ak-MOAkcM, Aki-4C(=O)Ak0-4, Ak-MSAko-4, AkMN(R1)Ak0-4, a condizione che, quando Y è but-2-en-1 ,4-di-ile e G2 = Ak-M, almeno un Ak di W è ramificato e contenente almeno un centro stereogenico;

R1 ed R2 indipendentemente fra loro possono essere H, alogeno, -CN, -OH, -CF3, -Ak-i-3, -OAki-3, -SAk-i-3, -Ph-OAk-i_3;

n = 0, 1 , 2; m = 0, 1 , 2;

a condizione che G2 = Ak-M quando Y è un cicloalcan-di-ile come sopra definito escluso il composto Cis 3-(3-{[2-(3,4-Dimetossifenil)etil]metiiamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidro-benzo[c/]azepin-2-one.

I composti di cui sopra sono utili a scopo medico come principi attivi e pertanto possono essere usati per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di angina, aritmia, malattie cardiovascolari, malattie neurologiche quali ad esempio epilessia incluso le convulsioni febbrili, dolore neuropatico, disfunzioni cognitive.

Sorprendentemente è stato scoperto che i composti di formula (I), incluso il composto C/<'>s 3-(3-{[2-(3,4-Dimetossifenil)etil]metilamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidro-benzo[c/]azepin-2-one sono attivi a concentrazione ≤30 μΜ come bloccanti isoforma-selettivi del canale HCN. In particolare essi hanno mostrato diverse capacità di bloccare selettivamente le isoforme HCN1 , HCN2 e HCN4 espresse in cellule HEK.

Sono pertanto impiegabili come strumenti di indagine farmacologica per lo studio della struttura e del funzionamento dei canali HCN e i processi fisiologici e/o patologici in cui sono coinvolti, ma possono anche essere sviluppate come farmaci, o aiutare nella progettazione di farmaci più potenti e selettivi di quelli attuali, e con minori effetti collaterali.

Per un aspetto l'invenzione riguarda processi per la preparazione di composti di formula (I) a partire da composti di formula (V)

R1

R2 O

(V)

in cui R1 , R2 ed X sono come definiti sopra, detto processo come descritto in dettaglio più avanti.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1 - Rappresentazione delle strutture dei composti noti allo stato deH’arte. Figura 2 - Rappresentazione delle strutture di alcuni esempi di composti dell'invenzione.

Figura 3 - Rappresentazione delle strutture di alcuni esempi di composti dell'invenzione.

Figura 4 - Rappresentazione grafica di un esperimento tipico per lo studio dei composti dell’invenzione come bloccanti della corrente lfnelle diverse isoforme del canale. A, B: Esempio della corrente registrata in cellule HEK293 esprimenti l’isoforma HCN1 del canale in condizioni di controllo (A) e con EC32 10μΜ (B). C: Curva di attivazione della corrente lfregistrata in condizione di controllo (in nero) ed in presenza di EC32 10μΜ (in grigio). D: ampiezza della corrente lfevocate attraverso una serie di step iperpolarizzanti consecutivi a -120mV in presenza di dosi progressivamente crescenti di EC32 (1-30μΜ).

Figura 5: Rappresentazione grafica dell’effetto del composto EC4 10μΜ. A: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN1 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC4 10μΜ (in grigio). B: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN2 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC4 10μΜ (in grigio). C: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN4 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC4 10μΜ (in grigio). **p< 0.01 vs CTR.

Figura 6: Rappresentazione grafica dell’effetto del composto EC18 10μΜ. A:

Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN1 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC18 10μΜ (in grigio). B: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN2 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC18 10μΜ (in grigio). C: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN4 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC18 10μΜ (in grigio). *p< 0.05 vs CTR; §p<0.001 vs CTR.

Figura 7: Rappresentazione grafica dell’effetto del composto EC32 10μΜ. A:

Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN1 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC32 10μΜ (in grigio). B: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 l’isoforma HCN2 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC32 10μΜ (in grigio). C: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN4 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC32 10μΜ (in grigio). *p< 0.05 vs CTR; *p<0.01 vs CTR; §p<0.001 vs CTR.

Figura 8: Rappresentazione grafica dell’effetto del composto MEL57A 10μΜ. A:

Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN1 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di MEL57A 10μΜ (in grigio). B: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN2 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di MEL57A 10μΜ (in grigio). C: Curva di attivazione media della corrente lfregistrata in cellule HEK293 esprimenti HCN4 in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di MEL57A 10μΜ (in grigio). §p<0.001 vs CTR.

Figura 9: Rappresentazione grafica dei rapporti dei valori di EC50 (EC50 ratio) fra le diverse isoforme per alcuni composti rappresentativi dell’invenzione e in confronto con alcuni composti noti allo stato dell’arte.

Figura 10: Rappresentazione grafica dell’effetto di EC4, EC18 e EC32 in cellule SAN di cavia. A,B: Esempio di corrente registrata in cellule isolate dal SAN di cavia in condizioni di controllo (A) ed in presenza di EC32 10μΜ (B). C: Curva di attivazione media calcolata per la corrente lfregistrata in cellule isolate dal SAN di cavia in condizioni controllo (grafico nero) ed in presenza di EC32 10μΜ (grafico grigio). D: Densità di corrente calcolata a -120 mV in presenza di EC4, EC18 e EC32 10μΜ. *<0.05 EC4 vs CTR;<*>*<0.01 EC32vs CTR.

Figura 11: Effetto di EC4 e EC32 in cellule SAN di coniglio. A: Curva di attivazione media calcolata per la corrente lfregistrata in cellule isolate dal SAN di coniglio in condizioni controllo (grafico nero) e d in presenza di EC32 10μΜ (grafico grigio). B: Densità di corrente calcolata a -120 mV in presenza di EC4 e EC32 10μΜ.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Fra i composti di formula (I) come sopra descritti sono preferiti quei composti che hanno:

Y = but-2-en-1 ,4-di-ile;

W = Ak2-g ramificato e contenente almeno un centro stereogenico.

In maniera particolare sono preferiti i composti di formula (II):

in cui W = -CH(CH3)-CH2- oppure -CH2-CH(CH3)-.

Composti di formula (II) in cui W = -CH2-CH(CH3)- con centro stereogenico in configurazione ( R ) negli esprimenti in vitro, come dettagliatamente descritto più avanti, sono particolarmente potenti e selettivi in maniera dose-dipendente neH’inibire la corrente lfmediata da HCN1 .

Altri composti particolarmente preferiti sono quelli di formula (III):

OM

(III)

in cui W = -CH(CH3)-CH2- oppure -CH2-CH(CH3)-. Composti di formula (Ili) in cui W = -CH2-CH(CH3)- con centro stereogenico in configurazione ( R ) negli esprimenti in vitro, come dettagliatamente descritto più avanti, sono particolarmente potenti e selettivi in maniera dose-dipendente nell’inibire la corrente lfmediata da HCN2.

Fra i composti di formula (I) come sopra descritti sono preferiti quei composti che hanno:

G2 = Aki_4;

G3 =

In maniera particolare sono preferiti anche i composti di formula (IV):

in cui i sostituenti del cicloesano sono in relazione cis fra di loro. S’intendono inclusi la forma racemica e i suoi singoli enantiomeri.

Composti di formula (IV) in configurazione cis ed in tutte le loro forme enantiomeriche sono utili come inibitori selettivi del HCN4.

I composti dell’invenzione possono essere in forma anidra o idrata, possono essere in forma non-salificata o salificata per protonazione della funzione basica con un opportuno acido, ad esempio essere sotto forma di sale cloruro, bromuro, ioduro solfato, fosfato o carbossilato.

Per un aspetto quindi l’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche comprendenti composti di formula (I) come descritti sopra, e comprendenti inoltre almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile, quali ad esempio additivi o diluenti che consentano la somministrazione orale o parenterale. Additivi e/o diluenti possono essere liquidi, solidi o semisolidi.

Additivi solidi possono essere amido, cellulosa, talco, glucosio, lattosio, sucrosio, gelatina, malto, riso, farina, gel di silice, magnesio stearato, sodio stearato, glicerina monostearato, sodio cloruro, latte in polvere e simili. Eccipienti liquidi e semisolidi possono essere, senza limitazione, glicerolo, glicole propilenico, acqua, etanolo e svariati tipi di oli di origine animale o vegetale. Mezzi liquidi, particolarmente indicati nelle preparazioni iniettabili, includono acqua, soluzione salina, soluzione acquosa di destrosio e glicoli.

Un composto di formula (I) può essere somministrato con un dosaggio dipendente da numerosi fattori quali il tipo e la severità della patologia da trattare, l'età e lo stato di salute del paziente, la potenza del composto utilizzato, la via di somministrazione e la forma farmaceutica utilizzata. Vie di somministrazione preferite sono la somministrazione parenterale, per esempio infusione intravenosa o somministrazione orale, per esempio capsule, compresse, soluzioni. I dosaggi giornalieri efficaci prevedono dosi da 1 a 20 mg , anche in più somministrazioni. I composti riportati in questa invenzione sono capaci di bloccare selettivamente le isoforme dei canali HCN. Questi composti possono essere usati per ridurre la corrente lfin tessuti che mostrano un’attività ritmica esagerata o abnorme, o attività automatica non ritmica, come ad esempio cellule cardiache pacemaker primarie o sussidiarie, cardiomiociti atriali e ventricolari non-pacemaker che sviluppano una automaticità abnorme, foci neuronali epilettogeni nel sistema nervoso centrale e neuroni periferici con alta velocità di scarica. Questi meccanismi rappresentano l'eziologia di patologie con alta diffusione a livello mondiale, come tachicardia sinusale, aritmie atriali e ventricolari, morte improvvisa cardiaca, epilessia e dolore neuropatico. Anche se il ruolo della lfin queste patologie non è esclusivo, e non è ancora completamente chiarito, la disponibilità di bloccanti specifici isoforma-selettivi può aiutare nella comprensione delle basi cellulari deirautomaticità, normale e non, nelle cellule eccitabili.

Oltre che significativi come mezzi di indagine sperimentale, questi composti possono essere importanti a livello clinico, usati da soli o in combinazione con agenti (farmaci beta-bloccanti, antiepilettici e antiaritmici) attualmente impiegati nel controllo delle aritmie cardiache, nelle cardiomiopatie acquisite o congenite che beneficiano di terapie che riducono la frequenza cardiaca o che limitano la propensione allo sviluppo di automatismo anomalo nei centri pacemaker secondari, e in patologie neurologiche.

Composti di formula (I) in cui

possono essere preparati a partire da composti di formula (V)

analogamente a quanto già riportato (Bioorg. Med. Chem, 13, 1211-1216, 2005 e E. Cerretini, tesi di laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, 1999) mediante reazione con cis o trans 1 ,4-di-Cloro-but-2-ene per ottenere composti di formula (VI) cis o trans

che poi vengono fatti reagire con un opportuna ammina di formula:

Nel caso in cui detta opportuna ammina sia primaria si formano sia il prodotto di mono-alchilazione che di doppia aichilazione, che possono essere separati con metodi noti allo stato dell’arte, ad esempio separati per cromatografia. Il prodotto di mono-alchilazione può essere poi alchilato con metodologie note.

In particolare composti 4-6,10, 14, 15 di formula (II) e composti 3, 7-9, 11-13 di formula (III) come riportati negli esempi 3-14 possono essere preparati come descritto nello Schema 1 partendo dal cis o trans 3-(4-Cloro-but-2-enil)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[e/]azepin-2-one (1a e 1b, rispettivamente) preparati secondo quanto già riportato (Bioorg. Med. Chem, 13, 1211-1216, 2005 e E. Cerretini, tesi di laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, 1999). In particolare, nella fase a il clorobutenil derivato è trattato con l’opportuna ammina; quando questa è primaria si formano sia il prodotto di mono-alchilazione che di doppia aichilazione, che sono separati per cromatografia. L’ammina secondaria è poi metilata nella fase b con acido formico e formaldeide.

Schema 1

Composti di formula (I) in cui

n = 0, 1 , 2; m = 0, 1 , 2;

possono essere preparati a partire da composti di formula (V) analogamente a quanto descritto in E. Cerretini, tesi di laurea in CTF, 1999 mediante reazione con Br-cicloalchen-carbossili per ottenere miscele cis/trans di composti di formula (VII) che possono essere risolte con metodologie note

Il gruppo carbossilico dei composti di formula (VII) può essere trasformato secondo metodologie note in un gruppo NH2 per ottenere composti di formula (Vili)

in miscele cisArans che possono essere risolte con metodologie note.

Le miscele cis/trans possono essere risolte anche a livello dei composti intermedi sintetici dei composti di formula (Vili) da i composti di formula (VII); così per esempio nel caso della preparazione del composto C/s 3-(3-{[2-(3,4-dimetossifenil)etil]metilamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidrobenzo[c(]azepin-2-one di formula (IV) la risoluzione della miscela cisArans è stata effettuata sui corrispondenti precursori di formula (VII) in forma di esteri carbossilici.

I composti di formula (Vili) vengono poi fatti reagire con un opportuno aiogenuro di formula G3-Hal per ottenere composti di formula (IX)

che poi possono essere fatti reagire con un opportuno aiogenuro alchilico di formula G2-Hal o con l’opportuna aldeide per ottenere i desiderati composti di formula (I).

Per la preparazione del composto 17 di formula (IV) descritto nell’esempio 15 secondo la presente invenzione sono possibili diverse strategie di sintesi, come illustrato nel seguente schema 2

SCHEMA 2

Una miscela cis/trans dell’acido 3-(7,8-dimetossi-2-oxo-1 ,2,4,5-tetraidrobenzo[c/]azepin-3-il)-cicloesancarbossilico, preparata come descritto in letteratura [E. Cerretini, tesi di laurea in CTF, 1999], è trattata con cloruro di tionile e poi con sodio azide (fasi a e b) per ottenere l'intermedio acilazidico, che poi viene sottoposta a trasposizione termica in toluene (fase c) e ad idrolisi acida (fase d) ottenendo una miscela cis/trans di 3-(3-aminocicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidrobenzo[c/]azepin-2-one che viene separata per cromatografia, ottenendo separatamente sia l’isomero trans (16) che quello cis già descritto in letteratura [S. Betti, tesi di laurea in CTF, 1998; E. Cerretini, tesi di laurea in CTF, 1999], Il composto 16 è poi trattato con l’opportuno alogenuro alchilico (fase f) e metilato ad ammina terziaria con acido formico e formaldeide (fase g).

La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.

PARTE SPERIMENTALE

I punti di fusione sono stati determinati con un apparecchio Buchi. Gli spettri<1>H-NMR,<13>C-NMR, HSQC e COSY sono stati effettuati con uno spettrometro Bruker Avance 400. Gli spettri IR sono stati registrati con uno spettrofotometro Perkin-Elmer 681, utilizzando una pasta di Nujol per i solidi o un film di prodotto puro per i liquidi. Le cromatografie su strato sottile sono state condotte su lastre di gel di silice Kieselgel Merck F254 e su lastre di ossido di alluminio F254 neutro. Le separazioni cromatografiche sono state effettuate su colonne di gel di silice (Kieselgel 40, 0.063-0. 200 mm e 0.040-0.063 mm per cromatografia sotto pressione, Merck), utilizzando gli opportuni eluenti. Il potere ottico rotatorio è stato misurato alla concentrazione di 1 g/100 mL (c = 1 ) con un polarimetro Perkin-Elmer (accuratezza 0,002°). Le analisi GC-MS sono state eseguite su uno spettrometro Perkin-Elmer Turbomass - Autosystem XL. In alternativa, gli spettri di massa sono stati eseguiti su uno spettrometro Linear lon Trap (LTQ)-Thermo-Finnigam. I nomi chimici dei composti sono stati assegnati secondo la nomenclatura IUPAC come suggerito dal programma Beilstein-lnstitute AutoNom (versione 2.1).

Esempio 1:

sintesi di 3-[(Z)-4-(6,7-Dimetossi-3,4-diidro-1 H-isochinolin-2-il)-but-2-enil]-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (2)

In un pallone a due colli, la 6,7-dimetossi-1 ,2,3,4-tetraidroisochinolina cloridrato (prodotto commerciale; 0,65 mmol, 0,15 g) è stata aggiunta ad una soluzione di cis 3-(4-Cloro-but-2-enil)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c(]azepin-2-one 1a (0,32 mmol, 0,1 g) in trietilamina anidra (5 mL) sotto atmosfera di N2. La miscela è stata scaldata a 60°C per 5 ore, poi il solvente è stato evaporato sotto vuoto e il residuo è stato dissolto in acqua ed estratto con diclorometamo (3 x 15 mL). La fase organica è stata separata, seccata su Na2S04poi il solvente è stato evaporato, lasciando un residuo che è stato purificato per cromatografia sotto pressione, usando come eluente una miscela di diclorometano/metanolo 9/1. 2 è stato ottenuto come olio con il 53% di resa.<1>H NMR (CDCI3, δ): 2.74-2.77 (m, 2H); 2.83-2.86 (m, 2H); 3.30 (d, J=6.8 Hz, 2H); 3.45 (s, 2H); 3.60 (s, 2H); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 3.88 (s, 3H, OCH3); 4.27 (d, J=6.8 Hz, 2H); 5.52-5.58 (m, 1 H); 5.76-5.82 (m, 1H); 6.22 (d, J=9.2 Hz, 1H); 6.36 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 6.50 (s, 1 H); 6.59 (s, 1 H); 6.73 (s, 1 H); 6.78 (s, 1 H).<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 28.26 (CH2), 43.26 (CHZ), 44.75 (CH2), 50.61 (CH2), 54.45 (CH2), 55.32 (CH2), 56.00 (CH3), 56.09 (CH3), 109.56 (CH), 109.69 (CH), 111.35 (CH), 111.47 (CH), 117.48 (CH), 124.74 (C quat.), 125.56 (C quat.), 125.73 (C quat.), 126.46 (C quat.), 127.77 (CH), 128.40 (CH), 129.63 (CH), 147.47 (C quat.), 147.85 (C quat.), 148.19 (C quat.), 150.08 (C quat.), 167.62 (CO) ppm.

Esempio 2:

sintesi di 3-{(Z)-4-[(5,6-Dimetossi-indan-2-ilmetil)-metil-amino]-but-2-enil}-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (3)

Una soluzione di cis 3-(4-cloro-but-2-enil)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1a (0,24 mmol, 74 mg), 1-(5,6-dimetossi-2,3-diìdro-1 H-inden-2-il)-N-metilmetanamina (Eu.Pat. EP 0 534 859 A1) (0,36 mmol, 80 mg) e trietilamina anidra (3 mL) in cloroformio (3 mL) è stata scaldata a 60 °C per 5 ore sotto atmosfera di N2. Dopo evaporazione del solvente, il residuo è stato sciolto in acqua e estratto con diclorometano (3 χ 15 mL). La fase organica è stata separata, seccata su Na2S04, poi il solvente è stato evaporato ed il residuo è stato purificato tramite cromatografia sotto pressione usando diclorometano/metanolo 9/1 come eluente. 3 è stato ottenuto come olio chiaro con resa del 15% e trasformato nel sale con acido ossalico: p.f 88-91 °C.<1>H NMR (CDCI3, 5): 2.27 (s, 3H, NCH3); 2.39 (d, J=7.2 Hz, 2H, CH2-indano); 2.62 (dd, J=6.4 Hz, J=14.8 Hz, 2H, indano); 2.67-2.73 (m, 1 H, indano CH); 3.00 (dd, J=7.2 Hz, J=14.4 Hz, 2H, indano); 3.11 (d, J = 6 Hz, 2H, NCH2C=C); 3.45 (s, 2H, CH2CO); 3.85 (s, 6H, 2OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 3.90 (s, 3H, OCH3); 4.25 (d, J=6.8 Hz, 2H, CH2NCO); 5.43-5.49 (m, 1 H, CH butene); 5.66-5.72 (m, 1 H, CH butene); 6.18 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.33 (d, J=8.8 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.72 (s, 1 H, aromatici); 6.74 (s, 2H, aromatici); 6.79 (s, 1 H, aromatico) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 37.57 (CH), 37.65 (CH2), 42.47 (CH3), 43.15 (CH), 44.41 (CH), 54.57 (CH), 55.94 (CH3), 56.00 (CH3), 62.84 (CH2), 107.87 (CH), 109.42 (CH), 111.15 (CH), 117.21 (CH), 124.61 (C quat.), 126.32 (C quat.), 127.59 (CH), 134.37 (C quat.), 147.84 (C quat.), 147.98 (C quat.), 149.84 (C quat.), 167.47 (CO) ppm.

Esempio 3:

sintesi di (R) 3-((Z)-4-{[(Z)-4-(7,8-Dimetossi-2-oxo-1,3-diidro-benzo[d]azepin-3-il)-but-2-enil]-[2-(3,4-dimetossi-fenil)-propil]-amino}-but-2-enil)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (R-4, MEL57A) e (R) 3-((Z)-4-((2-(3,4-dimetossifenil)propil) (metil)amino)but-2-enil)-7,8-dimetossi-1H-benzo[d]azepin-2(3H)-one (R-5)

Una soluzione di 1a (1 eq) in CH3CN anidro (10 mL), trietilamina anidra (1 eq) e (R)-2-(3,4-dimetossifenil)propan-1 -amine [Riggs et al, J.Med.Chem., 1987, 30, 1914-1918] (0,82 mmol, 0,16 g) è stata tenuta sotto agitazione per una notte a T ambiente, sotto atmosfera di azoto. Dopo evaporazione del solvente sotto vuoto, il residuo è stato sciolto in diclorometano e lavato con NaOH (2M, 3 x 15 mL). La fase organica è stata separata e seccata su Na2S04, il solvente è stato evaporato ed il residuo è stato purificato per cromatografia sotto pressione usando diclorometano/metanolo/ammoniaca 95/5/0.5 come eluente. Il primo prodotto è (R)-4 (MEL57A) (12%; p.f. 97-98 °C); il secondo è (R)-5 (olio, resa 8%).

(R)-4<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.21 (d, J=6.8 Hz, 3H, CCH3); 2.45 (dd, J = 7.4, 12.6 Hz, 1 H) and 2.56 (dd, J = 7.4, 12.6 Hz, 1 H)(NCH2CAr); 2.83.2.89 (m, 1 H, CHAr); 3.1 1-3.15 (m, 4H, NCH2C=); 3.44 (s, 4H, CH2CO); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.86 (s, 6H, 2 OCH3); 3.88 (s, 6H, 2 OCH3); 4.12-4.24 (m, 4H, CH2NCO); 5.39-5.45 (m, 2H, CH butene); 5.56-5.62 (m, 2H, CH butene); 6.13 (d, J=9.2 Hz, 2H, CH azepinone); 6.31 (d, J=9.2 Hz, 2H, CH azepinone); 6.70-6.72 (m, 4H) and 6.77-6.79 (m, 3H) (aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 20.38 (CH3), 37.87 (CH), 43.14 (CH2), 44.53 (CH2), 51.00 (CH2), 55.80 (OCH3), 55.82 (OCH3), 55.92 (OCH3), 61.70 (CH2), 109.50 (CH), 110.58 (CH), 111.09 (CH), 111.17 (CH), 117.10 (CH), 119.00 (CH), 124.61 (C quat.), 126.34 (C quat.), 127.27 (CH), 127.63 (CH), 131.01 (CH), 138.71 (C quat.), 147.26 (C quat.), 147.99 (C quat.), 148.71 (C quat.), 149.84 (C quat.), 167.41 (CO) ppm. (R)-4 (hydrochloride):

[a]<25>Na-22.25° (c=0.5; CH3OH).

(R)-5<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.24 (d, J=6.8 Hz, 3H, CH3); 2.73-2.75 (m, 2H, ArCCH2); 2.86-2.89 (m, 1 H, CHAr); 3.29 (d, J=6.8 Hz, 2H, NHCH2C=); 3.42 (s, 2H, CH2CO); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 3.88 (s, 3H, OCH3); 3.89 (s, 3H, OCH3); 4.18 (d. J=6.8 Hz, 2H, NCH2C=); 5.36-5.39 (m, 1 H, CH butene); 5.58-5.61 (m, 1 H, CH butene); 6.13 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.31 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.72-6.81 (m, 5H, aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 20.29 (CH3), 39.64 (CH), 43.15 (CH2), 44.39 (CH2), 46.11 (CH2), 55.84 (OCH3), 55.89 (OCH3), 55.96 (OCH3), 56.73 (CH2), 109.48 (CH), 110.44 (CH), 111.20 (CH), 11 1.36 (CH), 117.22 (CH), 118.89 (CH), 124.63 (C quat.), 126.26 (CH), 126.32 (C qua†.), 127.54 (CH), 131.92 (CH), 137.72 (C quat.), 147.52 (C quat.), 148.01 (C quat.), 148.98 (C quat.), 149.89 (C quat.), 167.46 (CO) ppm. [a]<25>Na-1 -70° (c=1 ; CHCI3) (free amine).

Esempio 4:

sintesi di (S) 3-((Z)-4-{[(Z)-4-(7,8-Dimetossi-2-oxo-1,3-diidro-benzo[d]azepin-3-il)-but-2-enil]-[2-(3,4-dimetossifenil)propil]amino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one, (S-4) e (S) 3-{(Z)-4-[2-(3,4-Dimetossifenil)propiiamino] buten-2-iI}-7,8-dimetossi-1,3-diidrobenzo[d]azepin-2-one, (S-5)

Con la stessa procedura, partendo da (S)-2-(3,4-dimetossifenil)propan-1 -amine [(Riggs et al, J.Med.Chem., 1987, 30, 1914-1918] (0.61 mmol, 0.12 g), sono stati ottenuti (S)-4 (90 mg; resa: 20%; p.f. 98-102 °C) e (S)-5 (oil, 60 mg; resa: 21 %). Gli spettri NMR sono identici a quelli degli enantiomeri

(S)-4 (cloridrato) [ot]<25>Na+25.13° (c=0.5; CH3OH).

(S)-5 (base libera) [a]<25>Na 1.58° (c=1; CHCI3).

Esempio 5:

sintesi di 3-((Z)-4-{[(Z)-4-(7,8-Dimetossi-2-oxo-1 ,3-diidro-benzo[d]azepin-3-il)buten-2-ii]-[2-(3,4-dimetossifenil)etil]amino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one, 6

Una soluzione di 1a (0.17 g, 0.55 mmol), trietilamina anidra (1 eq), omoveratrilamina (0.28 mmol; 0.05 g) in CH3CN anidro (10 mL), è stata scaldata a riflusso per 16 h in atmosfera di N2. Il solvente è poi stato rimosso sotto vuoto, il residuo è stato sciolto in diclorometano e lavato con NaOH (2M, 3 x 15 mL). Dopo anidrificazione (Na2S04) e rimozione del solvente, il residuo è stato purificato per cromatografia sotto pressione (diclorometano/metanolo/ammoniaca 97/3/0.3) ottenendo il composto voluto come solido giailino (m.p. 60-62 °C).

<1>H NMR (CDCI3, 5): 2.69 (bs, 4H, CH2CH2); 3.22 (d, J = 6.4 Hz, 4H, =CCH2N); 3.42 (s, 4H, CH2CO); 3.81 (s, 3H, OCH3); 3.83 (s, 6H, 2 OCH3); 3.85 (s, 6H, 2 OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 4.22 (d, J = 6.8 Hz, 4H, CH2NCO); 5.42-5.48 (m, 2H, CH butene); 5.62-5.68 (m, 2H, CH butene); 6.16 (d, J=9.2 Hz, 2H, CH azepinone); 6.31 (d, J=9.2 Hz, 2H, CH azepinone); 6.68-6.78 (m, 7H, aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3lδ, APT): 33.05 (CH2), 43.08 (CH2), 44.52 (CH2), 50.55 (CH2), 55.63 (CH2), 55.79 (OCH3), 55.83 (OCH3), 55.88 (OCH3), 109.50 (CH), 111.15 (CH), 111.19 (CH), 112.04 (CH), 117.18 (CH), 120.46 (CH), 124.56 (C quat.), 126.28 (C quat.), 127.45 (CH), 127.55 (CH), 130.55 (CH), 132.79 (C quat.), 147.26 (C quat.), 147.97 (C quat.), 148.74 (C quat.), 149.84 (C quat.), 167.39 (CO) ppm.

Esempio 6;

sintesi di (S) 3-{(E)-4-[(3,4-Dimetossi-biciclo[4.2.0]octa-1(6),2,4-trien-7-ilmetil)metilamino]buten-2-il}-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (S)-7

Una soluzione di 3-((E)-4-Cloro-buten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidrobenzo[c/]azepin-2-one 1b (Romanelli M. N. et al BMC 2005) (0.49 mmol, 151 mg), trietilamina anidra (1 eq) e (S) (3,4-dimetossibiciclo[4.2.0]octa-1(6),2,4-trien-7-ilmetil)metilamine (Lerestif, J.-M., EP 1598333, 2005) (0.49 mmol; 102 mg) in acetonitrile (4 mL) è stata lasciata a T amb sotto agitazione per 48 ore in atmosfera di N2. Dopo evaporazione del solvente, il residuo è stato sciolto in etil acetato e lavato con NaHC03(soluzione satura). Dopo anidrificazione ( Na2S04) e rimozione del solvente, il residuo è stato purificato tramite cromatografia sotto pressione (eluente: diclorometano/metanolo/ammoniaca 95/5/0.5). (S)-7 è stato ottenuto come solido giallino con resa del 40% (p.f. 60-62°C), ed è stato trasformato nel cloridato (m.p 86-89 °C).<1>H NMR (CDCI3, 5): 2.27 (s, 3H, NCH3); 2.53 (dd, J=12.8 Hz, 8.8 Hz, 1 H); 2.68-2.75 (m, 2H, ciclobutano-NCHH+ CHH ciclobutano); 3.00-3.09 (m, 2H, =CCH2N); 3.25 (dd, J=12.8 Hz, J=5.2 Hz, 1 H); 3.43 (s, 2H, CH2CO); 3.51-3.58 (m, 1 H, CH ciclobutano); 3.82 (s, 3H, OCH3); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.84 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 4.14 (d, J=5.2 Hz, 2H, CH2NCO); 5.52-5.65 (m, 2H, =CH butene); 6.14 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.29 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.68 (s, 2H), 6.70 (s, 1 H, aromatico) e 6.77 (s, 1 H) (aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 35.39 (CH2), 40.77 (ArCH), 42.48 (NCH3), 43.25 (COCH2), 49.97 (CONCH2), 56.07 (OCH3), 56.34 (OCH3), 56.42 (OCH3), 59.67 (butene-CH2N), 61.35 (CH2), 106.85 (CH aromatico), 107.53 (CH aromatico), 109.55 (CH aromatico), 111.30 (CH aromatico), 117.20 (CH azepinone), 124.75 (C quat.), 126.49 (C quat.), 127.98 (CH azepinone), 128.46 (CH butene), 130.28 (CH butene), 135.06 (C quat.), 138.76 (C quat.), 148.11 (C quat.), 149.43 (C quat.), 149.96 (C quat.), 167.60 (CO) ppm. [a]<25>Na 1.96° (c=1 ; CHCI3)

Esempio 7:

sintesi di (S) 3-{(Z)-4-[(3,4-Dimetossi-biciclo[4.2.0]octa-1(6),2,4-trien-7-ilmetil)metilamino]-buten-2-il}-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (S)-8

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-7, partendo da 3-((Z)-4-clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1a (0.49 mmol, 101 mg) e (S) (3,4-dimetossi-biciclo[4.2.0]octa-1(6),2,4-trien-7-ilmetil)metilamine (Lerestif, J.-M., EP 1598333, 2005) (0.49 mmol; 150 mg), (S)-8 è stato ottenuto con resa del 26% come solido giallino (p.f. 61-63 °C) e trasformato nel cloridrato (p.f. 91-94 °C).

<1>H NMR (CDCI3, δ): 2.31 (s, 3H, NCH3); 2.58 (dd, J=12.8 Hz, 8.8 Hz, 1 H); 2.71-2.79 (m, 2H, NCHH-ciclobutano ciclobutano CHH); 3.17 (d, J = 6.4 Hz, 2H, =CCH2N); 3.27 (dd, J=12.8 Hz, J=5.2 Hz, 1 H); 3.43 (s, 2H, CH2CO); 3.55-3.62 (m, 1H, CH ciclobutano); 3.83 (s, 6H, 2 OCH3); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 4.18-4.29 (m, 2H, CH2NCO); 5.42-5.52 (m, 1 H, =CH butene); 5.65-5.75 (m, 1 H, =CH butene); 6.17 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.32 (d, J=9.2 Hz, 1H, CH azepinone); 6.67 (s, 1 H), 6.70 (s, 1 H), 6.71 (s, 1 H), 6.76 (s, 1 H) (aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 35.25 (CH2), 40.62 (ArCH), 42.49 (NCH3), 43.17 (COCH2), 44.53 (CONCH2), 54.63 (butene-CH2N), 55.98 (OCH3), 56.25 (OCH3), 56.33 (OCH3), 61.55 (CH2), 106.78 (CH aromatico), 107.46 (CH aromatico), 109.52 (CH aromatico), 111.21 (CH aromatico), 117.32 (CH azepinone), 124.63 (C quat.), 126.35 (C quat.), 127.63 (CH azepinone), 129.21 (butene CH), 130.44 (butene CH), 134.96 (C quat.), 138.63 (C quat.), 148.05 (C quat.), 149.36 (C quat.), 149.92 (C quat.), 167.51 (CO) ppm. [a]<25>Na 13.8° (c=1 ; CHCI3)

Esempio 8:

sintesi di (R) 3-((E)-4-{[2-(3,4-Dimetossifenil)propil]metilamino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (R)-9

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-7, partendo da 3-((E)-4-Clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[c(]azepin-2-one 1b (1.04 mmol; 320 mg) e (R)-2-(3,4-dimetossifenil)-N-metilpropan-1 -amine (Jullian et al Eur. J. Org. Chem 1319, 2000) (1.04 mmol; 203 mg), (R)-9 è stato ottenuto con resa del 54% ed è stato trasformato nel cloridrato (p.f. 71-73 °C).<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.14 (d, J=6.8 Hz, 3H, CCH3); 2.11 (s, 3H, NCH3); 2.28-2.40 (m, 2H, ArCCH2); 2.74-2.96 (m, 3H, CHAr and C=CCH2N); 3.39 (s, 2H, CH2CO); 3.77 (s, 3H, OCH3); 3.83 (s, 3H, OCH3); 3.81 (s, 6H, 2 OCH3); 4.02-4.15 (m, 2H, CH2NCO); 5.39-5.53 (m, 2H, CH butene); 6.12 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.30 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.65-6.75 (m, 5H, aromatici) ppm.

<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 20.28 (CH3), 37.43 (CH), 42.43 (NCH3), 43.02 (COCH2), 48.76 (CONCH2), 55.76 (OCH3), 55.81 (OCH3), 56.00 (OCH3), 59.39 (butene-CH2N), 64.43 (NCH2), 109.37 (CH aromatico), 110.50 (CH aromatico), 111.08 (CH aromatico), 111.12 (CH aromatico), 116.89 (CH azepinone), 118.70 (CH aromatico), 124.51 (C quat.), 126.29 (C quat.), 127.61 (CH azepinone), 127.68 (CH butene), 130.42 (CH butene), 138.59 (C quat.), 147.18 (C quat.), 147.87 (C quat.), 148.65 (C quat.), 149.71 (C quat.), 167.28 (CO) ppm. [a]<25>Na-11.4° (c=1 ; CHCI3)

Esempio 9:

sintesi di (S) 3-((E)-4-{[2-(3,4-Dimetossifenil)propil]metilamino}-buten-2-il)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (S)-9

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-7, partendo da 3-((E)-4-Clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c(|azepin-2-one 1b (1.04 mmol, 320 mg) e (S)-2-(3,4-dimetossifenil)-N-metilpropan-1 -amine (Vicario et al Tei Asimmetry 11 , 3779, 2000) (1.02 mmol, 198 mg), (S)-9 è stato ottenuto con resa del 9% ed è stato trasformato nel cloridrato (m.p. 72-75 °C). Gli spettri NMR sono identici a quelli del suo enantiomero. [a]<25>Na+6.4° (c=1 ; CHCI3)

Esempio 10:

sintesi di (R) 3-((Z)-4-{[(E)-4-(7,8-Dimetossi-2-oxo-1,35-diidro-benzo[d]azepin-3-il)-buten-2-il]-[2-(3,4-dimetossifenil)propil]amino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (R)-10

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-7, partendo da 3-((E)-4-Clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1b (1.45 mmol; 445 mg) e (R)-2-(3,4-dimetossifenil)-N-metilpropan-1 -amine (Jullian et al Eur. J. Org. Chem 1319, 2000) (0.72 mmol, 141 mg), (R)-10 è stato ottenuto con resa del 7% e trasformato nel cloridrato (p.f. 85-87 °C).

<1>H NMR (as hydrochloride) (CD3OD, δ): 1.13 (d, J=6.0 Hz, 3H, CCH3); 2.87-3.10 (m, 3H, NCH2CHAr); 3.19-3.49 (m, 4H, NCH2C=); 3.45 (s, 4H, CH2CO); 3.79 (s), 3.81 (s), 3.82 (s), 3.83 (s) and 3.85 (s) (18H, 6 OCH3); 4.01-4.23 (m, 4H, CH2NCO); 5.08-5.26 (m, 2H); 5.51-5.61 (m, 1 H) and 5.66-5.74 (m, 1 H) (CH butene); 6.24-6.29 (m, 2H), 6.49-6.52 (m, 1 H) and 6.65 (d, 1 H, J = 8 Hz) (CH azepinone); 6.82-6.91 (m, 7H, aromatici) ppm.

<13>C NMR (CD3OD, δ, APT): 21.38 (CH3), 36.65 (CH), 43.34 (COCH2), 49.96 (CONCH2), 54.85 (butene-CH2N), 56.57 (OCH3), 56.64 (OCH3), 56.78 (OCH3), 59.01 (NCH2CAr), 111.51 (CH aromatico), 112.29 (CH aromatico), 112.64 (CH aromatico), 113.70 (CH aromatico), 119.51 (CH azepinone), 119.59 (CH azepinone), 119.83 (CH azepinone), 120.49 (CH butene), 126.19 (C quat.), 127.86 (C quat.), 129.20 (CH<'>azepinone), 135.45 (C quat.), 138.79 (CH butene), 138.84 (CH butene), 149.81 (C quat.), 150.13 (C quat.), 151.15 (C quat.), 161.70 (C quat.), 169.48 (CO) ppm.

[cx]<25>Na -14.7° (c=1; CHCI3)

Esempio 11:

sintesi di (S) 3-((Z)-4-{[(E)-4-(7,8-Dimetossi-2-oxo-1,3-diidro-benzo[d]azepin-3-il)-buten-2-il]-[2-(3,4-dimetossifenil)propil]amino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-I ,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (S)-10

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-7, partendo da 3-((E)-4-Clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1b (1.45 mmol, 445 mg) e (S)-2-(3,4-dimetossifenil)-N-metiipropan-1 -amine (Vicario et al Tet. Asimmetry I I , 3779, 2000) (0.72 mmol, 141 mg), (R)-10 è stato ottenuto con resa del 6% e trasformato nel cloridrato (p.f. 89-93 °C). Gli spettri NMR sono identici a quelli del suo enantiomero. [a]<25>Na 11 -5° (c=1 ; CHCI3)

Esempio 12:

sintesi di (S) e (R) 3-((E)-4-((1-(3,4-dimetossifenil)propan-2-il)(metil)amino)but-2-enil)-7,8-dimetossi-1H-benzo[d]azepin-2(3H)-one (S)-11 e (R)-11

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-8, partendo da 3-((E)-4-clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1b (0.49 mmol, 150 mg) e (S)-[2-(3,4-dimetossifenil)-1-metiletil]metilammina (0.10 g, 0.49 mmol), (S)-11 è stato ottenuto dopo purificazione mediante cromatografia sotto pressione (diclorometano/metanolo/ammoniaca 95/5/0.5) con resa del 36% e trasformato nel cloridrato<1>H NMR (CDCI3, δ): 0.87 (d, J=6.4 Hz, 3H, CCH3); 2.20 (s, 3H, NCH3); 2.32 (dd, J = 13.8 Hz, 10.6 Hz, 1 H, CHHAr); 2.82-2.89 (m, 2H, CHHAr CHMe); 3.00-3.10 (m, 2H, C=CCH2N); 3.44 (s, 2H, CH2CO); 3.84 (s) e 3.87 (s) (12H, 40CH3); 4.09-4.19 (m, 2H, CH2NCO); 5.50-5.62 (m, 2H, CH butene); 6.17 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.31 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.66-6.69 (m, 3H) e 6.76-6.78 (m, 2H) (aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 13.84 (CH3), 36.73 (CH3), 39.09 (CH), 43.27 (CH2), 44.54 (CH2), 54.03 (CH2), 55.42 (OCH3), 55.97 (OCH3), 56.06 (OCH3), 56.22 (OCH3), 59.87 (CH), 109.62 (CH), I I I ,27 (CH), 111.35 (CH), 112.63 (CH), 117.11 (CH), 121.18 (CH), 124.78 (C quat.), 126.02 (C quat.), 127.27 (CH), 127.87 (CH), 131.94 (CH), 133.22 (C quat.), 147.35 (C quat.), 148.13 (C quat.), 148.83 (C quat.), 149.98 (C quat.), 167.56 (CO) ppm. [a]<25>Na+2.2° (c=0.5; CHCI3) (base libera)

Seguendo lo stesso procedimento, partendo da 1b e (R)-[2-(3,4-dimetossifenil)-1-metiletil]metilammina, (R)-11 è stato ottenuto con resa del 41% e trasformato nel cloridrato. Gli spettri NMR sono uguali a quelli dell’enantiomero. [a]<25>Na -3.5° (c=0.5; CHCI3) (base libera)

Esempio 13:

sintesi di (S) e (R) 3-((Z)-4-((1-(3,4-dimetossifenil)propan-2-il)(metil)amino)but-2-enil)-7,8-dimetossi-1H-benzo[d]azepin-2(3H)-one (S)-12 e (R)-12

Seguendo lo stesso procedimento usato per (S)-11, partendo da 3-((Z)-4-clorobuten-2-il)-7,8-dimetossi-1 ,3-diidro-benzo[c/]azepin-2-one 1b (0.49 mmol, 150 mg) e (S)-[2-(3,4-dimetossifenil)-1-metiletil]metilammina (0.10 g, 0.49 mmol), (S)-12 è stato ottenuto con resa del 56% e trasformato nel cloridrato.<1>H NMR (CDCI3, 6): 0.93 (d, J=6.8 Hz, 3H, CCH3); 2.25 (s, 3H, NCH3); 2.37 (dd, J = 12.8 Hz, 9.2 Hz, 1 H, CHHAr); 2.84-2.95 (m, 2H, CHHAr CHMe); 3.17 (d, J = 6.4 Hz, 2H, C=CCH2N); 3.45 (s, 2H, CH2CO); 3.85 (s, 3H, OCH3); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.86 (s, 3H, OCH3); 3.89 (s, 3H, OCH3) ; 4.24 (d, J = 14.0 Hz, 2H, CH2NCO); 5.41-5.47 (m, 1 H, CH butene); 5.62-5.67 (m, 1 H, CH butene); 6.19 (d, J=9.0 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.34 (d, J=9.0 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.69-6.72 (m, 3H, aromatici); 6.77-6.79 (m, 2H, aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 13.82 (CH3), 36.86 (CH3), 39.23 (CH), 43.35 (CH2), 44.64 (CH2), 50.31 (CH2), 56.02 (OCH3), 56.06 (OCH3), 56.13 (OCH3), 60.15 (CH), 109.78 (CH), 111.39 (CH), 111.45 (CH), 112.71 (CH), 117.33 (CH), 121.25 (CH), 124.87 (C quat.), 126.57 (C quat.), 126.97 (CH), 127.82 (CH), 132.07 (CH), 133.20 (C quat.), 147.46 (C quat.), 148.25 (C quat.), 148.94 (C quat.), 150.12 (C quat.), 167.65 (CO) ppm. [a]<25>Na+11.4° (c=0.5; CHCI3) (base libera)

Seguendo lo stesso procedimento, partendo da 1b e (R)-[2-(3,4-dimetossifenil)-1-metiletil]metilammina, (R)-12 è stato ottenuto con resa del 41% e trasformato nel cloridrato. Gli spettri NMR sono uguali a quelli deH’enantiomero. [a]<25>Na -11.4° (c=0.5; CHCI3) (base libera)

Esempio 14:

sintesi di 3-((Z)-4-{[2-(3,4-Dimetossifenil)propil]metilamino}buten-2-il)-7,8-dimetossi-1,3-diidro-benzo[d]azepin-2-one (R)-13 e (S)-13

Una soluzione di (R)-5 (0.06 mmol; 30 mg), acido formico (17 eq), formaldeide (37% in acqua, 5 eq) in etanolo assoluto (4 mL) è stata scaldata a riflusso per 4 ore. Dopo rimozione del solvente sotto vuoto, il residuo è stato trattato con NaHCOs (soluzione satura) e estratto con diclorometano (3<χ>15 mL). Dopo anidrificazione (Na2S04) e rimozione del solvente, il residuo è stato purificato tramite cromatografia sotto pressione, usando diclorometano/metanolo 96/4 ottenendo (R)-13 come olio chiaro (28.5 mg; resa: 92%).

<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.24 (d, J=7.2 Hz, 3H, CCH3); 2.22 (s, 3H, NCH3); 2.40 (dd, J = 12.2 Hz, 7.6 Hz, 1H) and 2.49 (dd, J = 12.2 Hz, 7.6 Hz, 1 H) (ArCCH2); 2.86-2.91 (m, 1 H, CHAr); 3.02-3.12 (m, 2H, C=CCH2N); 3.44 (s, 2H, CH2CO); 3.85 (s, 3H, OCH3); 3.87 (s, 3H, OCH3); 3.88 (s, 3H, OCH3); 3.89 (s, 3H, OCH3); 4.15-4.26 (m, 2H, CH2NCO); 5.30-5.47 (m, 1H, CH butene); 5.60-5.66 (m, 1H, CH butene); 6.15 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.31 (d, J=9.2 Hz, 1 H, CH azepinone); 6.72-6.80 (m, 5H, aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 20.41 (CH3), 37.66 (CH), 42.64 (CH), 43.16 (CH2), 44.48 (CH2), 54.64 (CH2), 55.81 (OCH3), 55.84 (OCH3), 55.95 (OCH3), 65.07 (CH2), 109.49 (CH), 110.49 (CH), 111.19 (CH), 117.08 (CH), 118.88 (CH), 124.65 (C quat.), 126.37 (C quat.), 127.18 (CH), 127.66 (CH), 131.03 (CH), 138.79 (C quat.), 147.29 (C quat.), 148.00 (C quat.), 148.79 (C quat.), 149.86 (C quat.), 167.46 (CO) ppm. [oc]<25>Na-8.84° (c=1 ; CHCI3) (base libera)

Utilizzando la stessa procedura, partendo da (S)-5 (0.13 mmol; 60 mg), è stato ottenuto (S)-13 (olio, 21 mg; resa: 34%). Gli spettri NMR sono identici a quelli deH’enantiomero.

(S)-13 (base libera): [a]<25>Na+8.00° (c=1 ; CHCI3).

Esempio 15:

sintesi di trans 3-(3-{[2-(3,4-dimetossifenil)etil]metilamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidro-benzo[c/]azepin-2-one 17

Cloruro di tionile (10 eq) è stato sgocciolato su una soluzione di acido 3-(7,8-dimetossi-2-oxo-1 ,3,4,5-tetraidrobenzo[c/]azepin-3-il)-cicloesancarbossilico [E. Cerretini, tesi in CTF, 1999] (0.8 g, 2 mmol) in miscela cis/trans 4:1 in cloroformio (50 mL); a soluzione è stata scaldata per 3 ore a 60 °C sotto atmosfera di N2, poi il solvente è stato rimosso sotto vuoto e d il residuo è stato lavato con cicloesano (2 x 30 mL, rimosso sotto vuoto). Il residuo è stato sciolto in acetone anidro (10 mL), e a questa soluzione è stata aggiunta una soluzione satura di NaN3(2 mL). La miscela è stata lasciata per 10 minuti a T ambiente, poi è stata diluita con acqua, l’acetone è stato evaporato sotto vuoto e la fase acquosa è stata estratta con diclorometano (3 χ 15 mL). La fase organica è stata separata e seccata su Na2S04, il solvente è stato evaporato sotto vuoto, ottenendo l’acil azide come solido gommoso: IR (v= 2100 cm<'1>; CON3). Questo è stato sciolto in toluene e scaldato a riflusso per una notte per permettere la trasposizione a isocianato (IR: v= 2250 cm<'1>; NCO), poi il toluene è stato evaporato ed il residuo è stato sciolto in THF (3 mL) e trattato con HCI 2N (3 mL). La miscela è stata lasciata a temperatura ambiente per una notte, poi il THF è stato evaporato, la fase acquosa è stata lavata con etere, poi alcalinizzata con NaOH 2.5M e estratta con diclorometano. La fase organica è stata separata, seccata su Na2S04poi il solvente è stato evaporato sotto vuoto. Il residuo è stato purificato per cromatografia sotto pressione (eluente: diclorometano/metanolo/ ammoniaca 90/10/0.5) ottenendo 0.05 g di trans 3-(3-aminocicloesil)-7,8-dimetossi-1, 3,4,5-tetraidrobenzo[c(]azepin-2-one 16 (8% yields) e 0.5 g di miscela tra 16 e il suo isomero cis.

<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.32-1.47 (m, 2H), 1.53-1.78 (m, 6H) (cicloesano); 2.04 (bs, 2H; NH2); 2.95-3.00 (m, 2H; 5-CH2), 3.42 (s, 1H, 3’-H); 3.63-3.67 (m, 2H; 4-CH2); 3.78 (s, 2H; 1-CH2), 3.80 (s, 3H; OCH3), 3.81 (s, 3H; OCH3), 4.75-4.85 (m, 1H; V-H), 6.50 (s, 1 H) and 6.58 (s, 1 H) (aromatici) ppm.<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 19.40 (CH2), 30.65 (CH2), 31.61 (C4), 33.84 (CH2), 37.41 (C5), 40.31 (CH2), 42.98 (C1), 46.58 (C3·), 47.12 (Cr). 55.80 (OCH3), 55.92 (OCH3), 113.08 (C6or Cg), 113.95 (C9or C6), 123.38 (C5aor C9a), 127.06 (C9aor C5a), 147.00 (C7or C8), 147.76 (C8or C7), 172.04 (C2).

Una soluzione di 16 (0.2 mmol, 0.085 g), trietilamina anidra (1 eq) e 3,4-dimetossifenetil bromuro (1 eq) in acetonitrile anidro (2 mL) è stata scaldata a 80 °C per 8 h sotto atmosfera di N2. Dopo evaporazione del solvente, al residuo è stato aggiunto HCI 2N (3 mL); la soluzione è stata prima lavata con etere (2 x 15 mL), poi basificata con Na2C03ed infine estratta con diclorometano (3 x 15 mL). Dopo anidrificazione (Na2S04) e rimozione del solvente, il residuo è stato purificato per cromatografia su colonna (eluente: diclorometano/metanolo/ammoniaca 90/10/0.5). Il trans 3-{3-[2-(3,4-dimetossifenil)etilamino]cicloesil}-7,8-dimetossi-1,3,4,5-tetraidrobenzo[cf]azepin-2-one è stato ottenuto con resa del 20 %.<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.34-1.93 (m, 9H, NH cicloesano); 2.29-3.04 (m, 6H, 5-CH2+ CH2CH2); 3.21 (bs, 1H; 3’-H); 3.69 (t, J=5.8 Hz, 2H; 4-CH2), 3.80-3.88 (m, 14H; 1-CH2+ 40CH3); 4.81 (t, J=12 Hz, 1 H; 1’-H), 6.51 (s, 1H; 6-CH), 6.64 (s, 1H; 9-CH), 6.73-6.77 (m, 3H; aromatici) ppm.

<13>C NMR (CDCI3, δ, APT): 19.73 (CH2), 28.75 (CH2), 30.41 (CH2), 33.86 (CH2), 40.57 (CH2), 43.05 (CH2), 47.65 (CH), 48.59 (CH2), 53.40 (CH), 55.86 (OCH3), 55.93 (OCH3), 56.08 (OCH3), 111.26 (CH), 112.05 (CH), 113.13 (CH), 114.08 (CH), 120.52 (CH), 123.33 (C), 127.03 (C), 147.12 (C), 147.42 (C), 172.24 (CO) ppm.

Una soluzione di questo composto (0.05 mmol; 0.025 g), acido formico (17 eq), formaldeide (37% in acqua, 5 eq) in etanolo assoluto (2 mL) è stata scaldata a riflusso per 8 ore. Il solvente è stato rimosso sotto vuoto, ed il residuo è stato trattato con una soluzione satura di NaHC03e estratto con diclorometano (3 x 15 mL). Dopo anidrificazione (Na2S04) e rimozione del solvente, il residuo è stato purificato per cromatografia (eluente: diciorometano/metanolo/ammoniaca 95/5/0.5) ottenendo 0.10 mg di 17 con resa del 65.9%.

<1>H NMR (CDCI3, δ): 1.22-1 .35 (m), 1.46-1.55 (m), 1.60-1.65 (m), 1.71-1 .80 (m) and 1.91-2.02 (m) (8H, cicloesano); 2.35 (s, 3H; NCH3); 2.60-2.64 (m, 1 H; 3'-H), 2.71 (s, 4H, CH2CH2); 3.01 (t, J=5.6 Hz, 2H; 5-CH2), 3.69 (t, J=5.8 Hz, 2H; 4-CH2), 3.84 (s, 2H; 1-CH2), 3.86 (s, 3H; OCH3), 3.87 (s, 3H; OCH3), 3.88 (s, 3H; OCH3), 3.90 (s, 3H; OCH3), 4.86 (t, J=12 Hz, 1H; 6.54 (s, 1 H; 6-CH), 6.61 (s, 1 H; 9-CH), 6.70-6.78 (m, 3H; aromatici) ppm.

Esempio 16:

Esperimenti in patch clamp in cellule HEK293 che esprimono stabilmente le isoforme HCN1, HCN2 o HCN4 del canale if.

Colture cellulari e isolamento

Cellule embrionali umani di rene (Human embryonic kidney, HEK293), transfettate con il cDNA di mHCN1, mHCN2 e hHCN4 (fornite da Prof. M. Biel), sono state coltivate in DMEM medium (Gibco, DMEM GlutaMax™-! x1) integrato del 10% di siero fetale bovino, 100 unità/ml di penicillina, 100 pg/ml di streptomicina, 200 pg/ml di geneticina G418 (Gibco) in fiasche T25 e incubate a 37 °C in presenza del 5% di C02. Al raggiungimento della confluenza (3-5 giorni dopo averle piastrate), le cellule sono state staccate usando una dissociazione enzimatica con tripsina-EDTA. La digestione è stata fermata con aggiunta del medium di coltura e le cellule sono state raccolte e centrifugate. Le cellule sedimentate sono state piastrate nuovamente o usate per le misurazioni elettrofisiologiche.

Misurazioni elettrofisiologiche

Le cellule isolate vengono incubate in soluzione Tyrode normale. La misurazione della corrente Ifè stata eseguita tramite la tecnica del patch-clamp usando la configurazione in whole-cell. Brevemente, le cellule vengono depositate sul fondo di un bagnetto alloggiato sul piano di un microscopio ottico invertito (Nikon Diaphot TMD, Japan) e perfuse con soluzioni erogate mediante un microperfusore a temperatura controllata (36±0.5 °C) comandato da valvole elettriche che permettono un cambio rapido fra le varie soluzioni (vedi Soluzioni ). Le pipette utilizzate per il patch-clamp hanno una resistenza di 2.5-3.5MOhm quando vengono riempite con la soluzione interna. La capacità di membrana (Cm) è stata misurata applicando pulse di ± 20mV da un valore di potenziale di partenza di -40mV. La corrente If è stata misurata in modalità voltage-clamp secondo il seguente protocollo: partendo da un valore di potenziale di -20mV, sono stati applicati alle cellule gradini di potenziale iperpolarizzanti di 10mV da -40 a -150 mV per le cellule HEK e da -60 a -150mV per le cellule isolate dal nodo seno atriale (SAN). Per studiare la uso-dipendenza del blocco della corrente lfsono stati evocati una serie di 30 gradini di potenziale iperpolarizzanti consecutivi a -120mV alla frequenza di 1 Hz.

L’ampiezza della corrente è stata calcolata come differenza fra il valore meno negativo e quello allo steady-state e normalizzato per Cm. Le curve dose-effetto sono state interpolate tramite l’equazione di Hill: y=Emax[x<n>/(k<n>+x<n>)] dove Emaxè l’effetto massimo; k è la EC50 (concentrazione alla quale si ottiene il 50% di Emax); x è la concentrazione della sostanza in esame; n rappresenta il coefficiente di Hill.

Soluzioni

Le composizioni delle soluzioni usate sono riportate di seguito in concentrazione mM: Soluzione A: D-(+)-glucosio 5.5, NaCI 140, KCI 5.4, MgCI21 , CaCI21.8, HEPES-NaOH 5.0, (pH 7.4). Soluzione B\ D-(+)-glucosio 5.5, NaCI 140, KCI 5.4, MgCI20.5, KH2P041.2, Taurina 50, HEPES-NaOH 5.0, (pH 6.9). Soluzione C : Taurina 20, D-(+)-glucosio 10, acido glutammico 50, HEPES-KOH 10, EGTA 0.5, KCI 40,KH2PO420, MgCI23, (pH 7.2). Soluzione Tyrode : D-(+)-glucosio 10, NaCI 140, KCI 5.4, MgCI21.2, CaCI21.8, HEPES-NaOH 5.0, (pH 7.3). Per misurare la corrente lfnelle cellule isolate del SAN, viene utilizzata una Soluzione Tyrode modificata con aggiunta di BaCI2(2), MnCI2(2), 4-amminopiridina (0.5), e incrementata di KCI fino alla concentrazione 25mM; questa soluzione permette di ridurre le interferenze delle altre correnti come la corrente al calcio di tipo L, correnti inward rectifier e la corrente lto(transient outward potassium current). Nelle cellule HEK transfettate è stata utilizzata la soluzione Tyrode con KCI 25mM per amplificare la corrente lfin quanto tali cellule esprimono solo la corrente di interesse. Soluzione delle pipette : K-aspartato 130; Na2-ATP 5, MgCI22, CaCI2 5, EGTA 11 , HEPES-KOH 10 (pH 7.2; pCa 7.0).

Le soluzioni dei composti testati sono stati ottenuti da aliquote di soluzioni in acqua precedentemente preparate a concentrazione 10<"2>M e diluite nella soluzione di registrazione in modo da raggiungere le concentrazioni finali da 0.3 a 30 μΜ.

Risultati

Tutti i composti usati sono stati testati a concentrazioni tra 0.3 e 30 μΜ.

Nella figura 4 è mostrato un esperimento esemplificativo per illustrare gli esperimenti eseguiti ai fini della presente invenzione. L’esempio riportato riguarda l'effetto del composto EC32 su di una cellula HEK293 transfettata con l’isoforma HCN1 del canale f testato alla concentrazione 10μΜ.

Le tracce della corrente lfregistrate in condizione di controllo ed in presenza del composto EC32 10μΜ sono riportate nei pannelli A e B;. Nel pannello C è riportata la curva di attivazione della corrente che rappresenta i valori di conduttanza normalizzati per la capacità di membrana calcolati dalle tracce registrate ai valori di potenziale sia in condizione di controllo (grafico in nero) che in presenza del composto in esame (grafico in grigio). Tali valori vengono calcolati come precedentemente descritto. Infine, nel pannello D, sono riportati i valori dell’ampiezza della corrente lf evocata a -120mV (valore di potenziale a cui la corrente è ampiamente espressa e fisiologicamente rilevante) incrementando la concentrazione di EC32 (1 - 30μΜ) progressivamente durante la stimolazione del canale. Vediamo che stimolando il canale in presenza di concentrazioni crescenti del composto l’ampiezza della corrente è progressivamente ridotta a dimostrazione del fatto che l’effetto è uso e concentrazione dipendente. Questo è stato dimostrato per tutti i composti esaminati.

Esperimenti simili sono stati condotti nelle cellule HEK che esprimono stabilmente le altre isoforme per tutti i composti esemplificativi della presente invenzione. Nella figura 5 sono riportate le curve di attivazione medie calcolate nelle tre isoforme per il composto EC4 a concentrazione 10μΜ. Possiamo osservare che EC4 riduce la corrente lfin tutte e 3 le isoforme ed è maggiormente significativa in HCN1 (a -120mV: CTR: 0.95±0.01 pS/pF, n=5; EC4 10μΜ: 0.29±0.1 pS/pF, n=3) e HCN4 (a -120mV: CTR: 0.89±0.03 pS/pF, n=8; EC4 10μΜ: 0.5±0.08 pS/pF, n =7) rispetto a HCN2 (a -120mV: CTR: 0.83±0.03 pS/pF, n=8; EC4 10μΜ: 0.55±0.07 pS/pF, n=8). Non presenta quindi una selettività di isoforma.

li composto EC18 riduce la densità della corrente lfin modo diverso nelle singole isoforme come illustrato in figura 6 in cui sono riportate le curve di attivazione medie. La riduzione della corrente in HCN1 è circa del 7% a -120mV (CTR 0.96±0.02 pS/pF, n=5; EC18 10μΜ: 0.89 ±0.02 pS/pF, n=4) come confermato dalla curva di attivazione (fig.6A). E’ evidente che tale composto presenta un maggior effetto nelle cellule HEK293 che esprimono risoforma HCN4 del canale dove, a -120mV, determina una riduzione di circa il 70% (CTR 0.92±0.05 pS/pF, n=4; EC18 10μΜ: 0.3±0.06 ps/pF, n=4), mentre in FICN2 la riduzione è di circa il 30%. Possiamo concludere che EC18 mostra un blocco isoforma-specifico essendo significativamente più efficace su HCN4 rispetto a HCN1 e HCN2.

In figura 7 è mostrato l’effetto di EC32. Dalle curve di attivazione medie si deduce che tale composto abbia un comportamento simile a EC4 poiché la riduzione della densità di corrente non è molto diversa fra le varie isoforme.

Il composto MEL57A rappresenta un altro esempio di bloccante isoformaspecifico del canale lfpoiché riduce in modo molto marcato e statisticamente significativo la corrente lfespressa nella isoforma HCN1 del canale (fig. 8A). La sua azione di bloccante diminuisce drasticamente passando alle altre isoforme. In FICN1 la riduzione a -120mV è circa dell’80% (CTR 0.94±0.02 pS/pF, n=5; MEL57A 10μΜ 0.2±0.1 pS/pF, n=3) mentre in HCN2 è del 40% (CTR 0.82±0.05 pS/pF, n=4; MEL57A 10μΜ 0.6±0.1 pS/pF, n=4) e di appena il 7% in HCN4 (CTR 0.92±0.09 pS/pF, n=6; MEL57A 10μΜ 0.86±0.1 pS/pF, n=5).

La tabella sotto riportata (Tabella 1 ) riassume i valori di EC50 (μΜ), calcolati attraverso l’equazione di Hill (vedi Metodi), per le tre isoforme del canale HCN per i composti rappresentativi; ivabradina e cilobradina (DK-AH-269) sono stati usati come termini di paragone essendo noti bloccanti lfma non isoforma selettivi.

Tabella 1 : Valori delle EC5o calcolate nelle diverse isoforme per i vari composti rappresentativi

Per rendere più facilmente confrontabili le attività dei composti nelle diverse isoforme, abbiamo riportato in un grafico (figure 9) i valori dei rapporti fra le EC50di una isoforma rispetto ad un’altra per i diversi composti.

Abbiamo poi scelto il valore 5 come soglia di selettività, considerando cioè un composto selettivo verso una ìsoforma piuttosto che verso un’altra se il rapporto supera questa soglia. Per EC18 i valori calcolati per HCN4 verso HCN2 e HCN4 verso HCN1 superano la soglia prestabilita, questo vuol dire che l’attività di EC18 nel bloccare la corrente in HCN4 è maggiore di almeno 5 volte (essendo 5 il valore limite) rispetto all’attività su HCN1 e HCN2. In dettaglio, l'attività di EC18 in HCN4 è circa 16 volte maggiore a quella in HCN2 e di 6 volte maggiore rispetto a HCN1. EC4 non presenta una sostanziale differenza di attività fra HCN4 e le altre due isoforme ma solo fra HCN2 e HCN1 che ha poco interesse. EC32 non è selettivo mentre MEL57A presenta un’attività di circa 170 volte maggiore in HCN1 rispetto a HCN4 e di circa 30 volte maggiore rispetto a HCN2 risultando essere altamente selettivo per l’isoforma HCN1 del canale. I composti utilizzati come confronto, Ivabradina e DKAH269, non presentano selettività di isoforma. I nostri composti di partenza, EC4 e EC32, pur non essendo isoforma selettivi nel blocco della corrente Iflhanno permesso di arrivare alla sintesi di una serie di nuove sostanze i cui capostipiti sono rappresentati da EC18 e MEL57A che risultano essere isofoma-selettivi nel blocco della corrente lf.

Esempio 17:

Effetto sulla corrente lfnativa: esperimenti in cellule isolati dal nodo seno atriale (SAN)

In osservanza del 3Rs (replacing, refining and reducing thè use of animals in research), ci siamo limitati all’uso di animali (conigli e cavie) per confermare il blocco dei canali lfe l’effetto cronotropo negativo dei composti più importanti. Questa indagine è conforme alle linee guida per la Cura e Uso di Animali da Laboratorio (Directive U.E. n#86/609/EC , European Community Regulations on thè Care and Use of Laboratory Animals). I composti sono stati testate sulla corrente lf(registrata da single cellule isolate dal SAN) per verificare la loro azione sulla corrente lfnativa, come descritto sotto.

Isolamento di singoli miociti dalla regione del SAN

La sperimentazione si attiene alle norme per la tutela e l'utilizzazione degli animali da laboratorio, imposte dalla Comunità Europea (86/609/CEE). Per questo studio sono state utilizzate cavie albine maschi (Azienda Pampaioni, Italia). Gli animali sono stati sacrificati anestesia con etere per dislocazione cervicale. Il cuore è stato rapidamente rimosso dopo toracotomia, posto nella soluzione A e la regione del SAN chirurgicamente isolata e tagliata in 5-6 piccoli frammenti. Le cellule sono state isolate mediante digestione enzimatica utilizzando una soluzione B contenente collagenasi, elastasi e proteasi per degradare la matrice intercellulare e perdere l’adesione fra cellule in modo da facilitare la procedura di dispersione meccanica (vedi Soluzioni). Le singole cellule isolate sono mantenute nella soluzione C e dopo un’ora poste in soluzione Tyrode aggiungendo calcio da 0.2 a 0.8 mM, e così mantenute per l’intero giorno dell'esperimento. Le registrazioni elettrofisiologiche e le soluzioni per gli esperimenti di patch-clamp sono simili a quelli descritti nel precedente esperimento (vedi Metodi e Soluzioni).

Effetti sulla corrente h registrata in cellule isolate dal SAN

La figura 10 mostra un esperimento esemplificativo condotto in cellule isolate dal SAN di cavia. Nel pannello A è riportata la traccia tipica della corrente lf registrata in condizioni di controllo (in nero) ed in presenza di EC32 10 μΜ (in grigio). Le corrispondenti curve di attivazione calcolate nel modo descritto precedentemente (vedi Metodi ), sono mostrate nel pannello B. In C è riportato il grafico che riassume la riduzione dell’ampiezza della corrente in tali cellule da parte dei tre composti testati. EC4 riduce la corrente lf a -120 mV del 63% (CTR 0.9±0.03 pS/pF, n=9; EC4 10μΜ: 0.32±0.05 pS/pF, n=3), EC18 di circa 88% (CTR 0.9±0.03 pS/pF n=9; EC18 10μΜ: 0.1 ±0.01, n=3) e EC32del 46% (CTR 0.9±0.03 pS/pF, n=9; EC32 10μΜ: 0.49±0.07 pS/pF, n=6). Gli effetti dei composti EC4 ed EC32 in miociti isolati dal SAN di coniglio sono mostrate in figura 11. Nel pannello A, è riportata la curva di attivazione della corrente lf calcolata in assenza (grafico nero) ed in presenza di EC32 (grafico grigio) 10μΜ. EC4 riduce la densità di corrente del 51% (CTR 0.74±0.07 pS/pF, n=7; EC4 10μΜ: 0.4±0.03 pS/pF, n=3) e EC32 del 70 % (CTR 0.74±0.07 pS/pF, n=7; EC32 10μΜ: 0.2±0.11 pS/pF, n=4) a -120mV come riportato nel panello B.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula (I):

   oppure G2 e G3 insieme all’azoto a cui sono legati formano una struttura ciclica del tipo:

   ed in cui X = CH=CH, CH2CH2; Y = but-2-en-1,4-di-ile di formula

   ; oppure Y è un cicloalcan-di-ile del tipo:

   W = Ak2-9, Ak1-4OAko-4, Ak1-4C(=0)Ako-4, Ak^SAko^, Ak-MN(R1 )Ak0-4, a condizione che, quando Y è but-2-en-1 ,4-di-ile e G2 = Ak1-4, almeno un Ak di W è ramificato e contenente almeno un centro stereogenico; R1 ed R2 indipendentemente fra loro possono essere H, alogeno, -CN, -OH, -CF3, -Ak-i-3, -OAki-3, -SAki-3, -Ph-OAki-3; n = 0, 1 , 2; m = 0, 1 , 2; a condizione che G2 = Aki-4quando Y è un cicloalcan-di-ile come sopra definito; escluso il composto C/s 3-(3-{[2-(3,4-Dimetossifenil)etil]metilamino}cicloesil)-7,8-dimetossi-1 ,3,4,5-tetraidro-benzo[c/]azepin-2-one.
2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui Y = but-2-en-1 ,4-di-ile; G3 =

   W = Ak2-gramificato e contenente almeno un centro stereogenico.
3. 3. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui Y =

   G2 — Aki-4; G3 =
4. 4. Composti secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 per l’uso come medicamenti.
5. 5. Composizioni farmaceutiche comprendenti un composto di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
6. 6. Uso di composti di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di angina, aritmia, malattie cardiovascolari, malattie neurologiche quali ad esempio epilessia incluso le convulsioni febbrili, dolore neuropatico, disfunzioni cognitive.
7. 7. Uso di composti di formula (I):

   oppure G2 e G3 insieme all’azoto a cui sono legati formano una struttura ciclica del tipo:

   X = CH=CH, CH2CH2; Y = but-2-en-1 ,4-di-ile di formula

   ; oppure Y è un cicloalcan-di-ile del tipo

   W — Ak2-9, Aki-40Ako-4, Aki-4C(— 0)Ako-4, Aki-4SAko-4, Aki_4N(R1 )Ako-4, a condizione che, quando Y è but-2-en-1 ,4-di-ile e G2 = Ak-M, almeno un Ak dì W è ramificato e contenente almeno un centro stereogenico; R1 ed R2 indipendentemente fra loro possono essere H, alogeno, -CN, -OH, -CF3, -Ak-i-3, -OAki-3, -SAki-3, -Ph-OAk-i-3; n = 0, 1 , 2; m = 0, 1, 2; a condizione che G2 = Aki-4quando Y = cicloalcan-di-ile; per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di patologie che possano essere migliorate 0 prevenute dalla inibizione selettiva di una delle isoforme dei canali HCN.
8. 8. Uso secondo la rivendicazione 7 in cui i composti di formula (I) sono come definiti in una qualunque delle rivendicazioni 2-3.
9. 9. Uso di composti di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 7-8 per la preparazione di kit per l’indagine farmacologica per lo studio della struttura e del funzionamento dei canali HCN e i processi fisiologici e/o patologici in cui sono coinvolti.

   Processo per la preparazione di un composto di formula (I) secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-3 detto processo comprendente come intermedio un composto di formula (V)

   in cui R1 ed R2 indipendentemente fra loro possono essere H, alogeno, -CN, -OH, -CF3, -Aki-3, -OAk-i-3, -SAk-i-3, -Ph-OAk-i-3; X = CH=CH, CH2CH2.