ITBO980425A1 - Metodo per la preparazione di glucofarina . - Google Patents

Description

METODO PER LA PREPARAZIONE DI GLUCORAFANINA.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si inquadra nel settore concernente i metodi per l’isolamento e la preparazione di glucosinolati. In particolare l’invenzione si riferisce ad un metodo per la preparazione di glucorafanina a partire da glucoerucina.

E’ noto che i glucosinolati (GLs) comprendono più di cento metaboliti secondari della famiglia delle brassicaceae (o crucifere) e presentano una struttura molecolare comune con una catena laterale R di tipo alchilico, arilico od indolico. La glucorafanina fa parte della famiglia dei glucosinolati (CAS-num. ) e presenta la seguente formula di struttura:

Quindi la glucorafanina è dotata di un gruppo R di tipo alchilico tiofunzionalizzato e cioè: -(CH2)4-SO-CH3.

Quando i glucosinolati vengono a contatto con l enzima mirosinasi, anch’esso presente nelle brassicaceae, si trasformano velocemente in un gruppo di composti ad elevata attività biologica, quali ad esempio gli isotiocianati (ITC), presentanti la formula di struttura: R-N=C=S.

Negli ultimi anni sono stati eseguiti numerosi studi, sia in vitro che in vivo, tesi a dimostrare che alcuni isotiocianati a catena laterale alchilica o alchilica tiofimzionalizzata, sintetici oppure ottenuti dall’idrolisi enzimatica dei corrispondenti glucosinolati contenuti nelle brassicaceae, rappresentano sostanze ad azione potenzialmente antitumorale “chemiopreventiva” in quanto capaci di modulare il livello degli enzimi della cosiddetta Fase II, preposti alla detossificazione delle sostanze cancerogene introdotte nell’organismo umano mediante la dieta [Verhoeven et al., Chemico-Biological Interaction 103, 79-129, (1997) e Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, voi. 89 pp. 2399-2403 (1997)].

Inoltre, gli isotiocianatl· aromatici ed indolici sono stati classificati come agenti antitumorali “bloccanti” in quanto si sono dimostrati attivi quando somministrati a delle cavie prima e durante il trattamento con sostanze cancerogene.

Nel brevetto US 5,411,986 viene divulgato l’impiego farmacologico del sulforafane (CAS-num. 4478-93-7), come principale e più attivo agente che induce gli enzimi (Fase II). Tale sulforafane è un isotiocianato ed è prodotto mediante l’azione dell’enzima mirosinasi (MYR) sulla glucorafanina, che è il principale glucosinolato presente nei broccoli, secondo, la seguente reazione:

Il sulforafane naturale (isomero R), ma anche il composto ottenuto per sintesi chimica costituito dalla miscela racemica dei due isomeri R ed S, è risultato il più potente agente induttore degli enzimi della Fase II, giustificandone quindi l’impiego farmacologico.

Recentemente è stato inoltre dimostrato che anche una miscela di glucosinolati intatti, in cui la glucorafanina è il principale componente, sebbene ad un basso grado di purezza essendo un estratto liofilizzato dei broccoli, esercita un’azione protettiva riducendo l’incidenza del tumore mammario in cavie trattate con la sostanza cancerogena DMBA [Fahaey et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, voi. 94 pp. 10367-10372, (1997)].

Da questi recenti risultati emerge il forte interesse per lo studio degli effetti antitumorali dei glucosinolati intatti puri, precursori degli isotiocianati già ampiamente studiati nel settore.

Di solito nelle brassicaceae sono presenti contemporaneamente diversi glucosinolati. Ad esempio l’analisi HPLC dei semi o dei germogli di broccoli, condotta seguendo la metodica ufficiale adottata dall’Unione Europea (ISO 9167-1), ha consentito di stimare il contenuto di glucorafanina nell’ordine dell’ 1-2% sul peso secco.

Tale glucosinolato, però, è associato ad altri glucosinolati, che rappresentano insieme circa il 40-50% del totale, come ad esempio la gluocoiberina, la glucoerucina, la 4-idrossiglucobrassicina, la progoitrina, la glucoibervirina e la glucobrassicina.

La separazione della glucorafanina dagli altri glucosinolati presenti nei semi o germogli di broccolo risulta possibile dal punto di vista analitico impiegando tecniche cromatografiche ad alta pressione (HPLC) ed in presenza di sostanze agenti quali contro-ione.

Lo svantaggio principale presentato da tale metodo di separazione è che esso non è utilizzabile per la produzione su vasta scala del composto in quanto risulta costoso e di difficile realizzazione.

A differenza della glucorafanina, la glucoerucina è presente nei semi di rucola come glucosinolato esclusivo, in quantità dell’ordine del 3-4% in peso, e può essere estratta e purificata da tali semi seguendo una metodica nota [Visentin et al., J. of Agric.

and Food Chem., 40, 1687-1691 (1992)].

Scopo della presente invenzione è dunque quello di proporre un metodo per la preparazione di glucorafanina pura a partire glucoerucina, che sia realizzabile in modo economico e quindi applicabile per la produzione su vasta scala.

Il metodo oggetto dell’invenzione utilizza la reazione dei tioeteri, i quali, trattati con una sostanza ossidante, si trasformano nel corrispondente sulfossido, secondo la seguente reazione:

Infatti la glucorafanina presenta una catena laterale R che è ascrivibile nel gruppo dei sulfossidi per cui è possibile produrre la stessa glucorafanina per blanda ossidazione del corrispondente glucosinolato di tipo “tio”, come ad esempio la glucoerucina (CAS-num. ), avente catena laterale del tipo: [CH3-S-(CH2)4-], ricorrendo alla sopra riportata reazione dei tioeteri che in questo caso è così specificata:

Il metodo oggetto dell’invenzione, di seguito descritto in maggiore dettaglio, comprende quindi la trasformazione della glucoerucina pura, ottenuta per estrazione dai semi e dalle parti verdi di brassicaceae ed in particolare di semi di rucola quali ad esempio quelli appartenenti alla specie Eruca e Diplotaxis, per ossidazione e successivo isolamento della glucorafanina pura così ottenuta.

La trasformazione della glucoerucina viene effettuata utilizzando un agente ossidante, preferibilmente in una quantità molare pari o superiore al numero di moli di glucoerucina impiegata. Un esempio particolare prevede l’impiego di una quantità pari a 2-3 volte il numero di moli di sostanza da ossidare.

Preferibilmente viene utilizzato, come agente ossidante acqua ossigenata o qualsiasi composto contenente il gruppo perossido nella molecola.

La reazione di ossidazione viene generalmente effettuata per riscaldamento, preferibilmente ad una temperatura tra 1° C e 100° C, con valore preferenziale di circa 60° C, e per un intervallo di tempo compreso tra 1 minuto e 24 ore, con valore preferenziale di 1 ora. L’isolamento della glucorafanina viene quindi effettuato secondo tecniche convenzionali di purificazione.

Preferibilmente l’isolamento viene effettuato cromatografando la glucorafanina attraverso una resina a scambio anionico, eliminando per estrazione eventuali residui inorganici ed infine insolubi lizzando ed essiccando la glucorafanina pura.

Allo scopo di meglio illustrare la presente invenzione, senza tuttavia limitarla, vengono descritti i seguenti due esempi di preparazione, puramente indicativi e non limitativi.

ESEMPIO 1

Semi macinati di rucola sono stati trattati in acqua bollente in un rapporto peso/volume di 1:10 p/v e omogeneizzando con U-Turrax Modello TP 18/2N per circa 10 minuti.

Dopo filtrazione il residuo solido è stato riestratto con un uguale volume di acqua. Gli estratti limpidi ottenuti sono stati riuniti e trattati con una soluzione di acetato di zinco 1M per la deproteinizzazione.

L’estratto limpido deproteinizzato è stato introdotto, mediante una pompa peristaltica, in una colonna cromatografica contenente una resina a scambio anionico DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), condizionata con un tampone imidazolo-formiato 50 mM a pH 4,5.

Successivamente si è proceduto al lavaggio della colonna dapprima con acqua, poi con una soluzione costituita da acido formico, 2-propanolo ed acqua, in proporzioni volumetrica di (3:2:5), e infine di nuovo con acqua.

La eluizione della glucoerucina è stata eseguita impiegando una soluzione satura di solfato di potassio (K2SO4) contenente 5% di 2-propanolo.

L’eluato è stato concentrato per mezzo di un evaporatore rotante (Buchi Modello RE121) sotto vuoto alla temperatura di circa 60°C.

Il residuo solido è stato estratto dall’evaporatore, mediante aliquote di circa 100 mi. di metanolo bollente per 3 successive estrazioni.

Dopo filtrazione, l’estratto metanolico complessivo così ottenuto è stato concentrato in un evaporatore rotante alla temperatura di circa 60°C fino ad un volume di alcune decine di millilitri.

La soluzione concentrata calda è stata gocciolata in etanolo assoluto preraffreddato ad una temperatura di circa -20°C, ottenendo la formazione di un precipitato solido bianco costituito da glucoerucina pura.

Il precipitato solido è stato separato per centrifugazione ed essiccato in un apposito essiccatore sottovuoto in presenza di anidride fosforica (P2O5), con conseguente ottenimento della glucoerucina.

Il controllo analitico del campione è stato eseguito sia con analisi HPLC seguendo il metodo ISO 9167-1, sia determinando il glucosio liberato per idrolisi enzimatica.

La resa di produzione della glucoerucina così ottenuta è risultata dell’ordine del 13% in peso riferito al seme di partenza ed il grado di purezza è risultato dell’ordine del 70-85% riferito al peso del composto, ma di oltre il 95% se riferito alla composizione dei glucosinolati.

E’ opportuno notare che i semi macinati di rucola possono essere tratati con altri liquidi estraenti, riscaldati quali miscele isoalcoliche (ad esempio metanolo-acqua 70:30).

ESEMPIO 2

Un campione di 3 grammi di glucoerucina (con peso molecolare di 459,6 D), otenuto come descrito nell’esempio 1, è stato sciolto in circa 80 mi. di acqua e sono stati aggiunti 3 mi. di acqua ossigenata 35 volumi (reagente Merck. Cod. 108600), corrispondenti a circa 2-3 volte il numero di moli del composto da ossidare.

La miscela così ottenuta, è stata riscaldata ad una temperatura di 60°C per circa 30 minuti.

La miscela è stata introdota, mediante una pompa peristaltica, in una colonna cromatografica contenente una resina a scambio anionico DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), condizionata con un tampone imidazolo-formiato 50 mM a pH 4,5.

Successivamente si è proceduto al lavaggio della colonna dapprima con acqua, poi con una soluzione costituita da acido formico, 2-propanolo ed acqua, in proporzioni volumetriche di (3:2:5), e infine di nuovo con acqua.

La eluizione della glucorafanina è stata eseguita impiegando una soluzione satura di solfato di potassio (K2S04) contenente 5% di 2-propanolo.

L’eluato è stato concentrato a secchezza per mezzo di un evaporatore rotante (Buchi Modello RE121) sotto vuoto alla temperatura di circa 60°C.

Il residuo solido è stato estratto più volte con aliquote di circa 100 mi di metanolo bollente.

Dopo filtrazione l’estratto metanolico così ottenuto è stato nuovamente concentrato in un evaporatore rotante ad una temperatura di circa 60°C, fino ad un volume di alcune decine di millilitri.

La soluzione concentrata calda è stata gocciolata in etanolo assoluto preraffreddato a circa -20°C, ottenendo la formazione di un precipitato solido bianco costituito da glucorafanina pura.

Il precipitato solido è stato separato per centrifugazione ed essiccato in un apposito essiccatore sottovuoto in presenza di anidride fosforica (P2O5), con conseguente ottenimento della glucorafanina ad elevato grado di purezza con una resa circa dell’ 80% rispetto alla quantità di glucoerucina trattata ed un titolo HPLC maggiore del 95%.

La caratterizzazione molecolare della sostanza prodotta è stata eseguita sia mediante un’analisi spettroscopica NMR della glucorafanina intatta sia mediante un’analisi GC/MS dell’isotiocianato (sulforafane) prodotto dall’idrolisi enzimatica con mirosinasi pura.

Quest’ultima analisi ha fornito uno spettro di massa identico a quello divulgato nella pubblicazione Chiang et al., J. Agric. Food Chem. 46, 1018-1021, confermando così la natura della sostanza ottenuta per blanda ossidazione della glucoerucina e cioè la glucorafanina.

II principale vantaggio della presente invenzione è dunque quello di fornire un metodo per la preparazione di glucorafanina pura, utilizzabile ad esempio in campo farmacologico, a partire da glucoerucina, che sia realizzabile in modo economico e quindi applicabile per la produzione su vasta scala.

Ulteriore vantaggio della presente invenzione è quello di fornire un metodo che sia di semplice ed affidabile realizzazione.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di glucorafanina a partire da glucoerucina, caratterizzato dal fatto di comprendere la trasformazione della glucoerucina pura, ottenuta per estrazione dai semi e parti verdi di vegetali della famiglia delle brassicaceae, in particolare da semi di rucola, per ossidazione ed il successivo isolamento della glucorafanina pura così ottenuta 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la trasformazione della glucoerucina per ossidazione viene effettuata utilizzando un agente ossidante in quantità molare pari o superiore al numero di moli di glucoerucina. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto agente ossidante è costituito da acqua ossigenata o da composti aventi almeno un gruppo perossido. 4. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che la trasformazione della glucoerucina per ossidazione viene effettuata per riscaldamento. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto riscaldamento viene effettuato ad una temperatura compresa fra 1° C e 100° C. 6. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto riscaldamento viene effettuato in un intervallo di tempo compreso fra 1 minuto e 24 ore.