ITBO20060891A1 - Lievito ricombinante lattoferrina suina, vettore di espressione del gene lattoferrina suina, lattoferrina suina ricombinante e processi di produzione degli stessi - Google Patents

Description

LIEVITO RICOMBINANTE LATTOFERRINA SUINA, VETTORE DI ESPRESSIONE DEL GENE LATTOFERRINA SUINA, LATTOFERRINA SUINA RICOMBINANTE E PROCESSI DI PRODUZIONE DEGLI STESSI

A nome: PASQUINI CESARE

residente a ZOLA PREDOSA (BO) in Via Panoramica, 23

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

In accordo con la regolamentazione della Comunità Europea, devono essere progressivamente eliminati gli antibiotici dall’alimentazione nei mangimi destinati agli animali.

La presente invenzione concerne un metodo con cui produrre una proteina che costituisca una efficace, e vantaggiosa, alternativa all’utilizzazione degli antibiotici nell’alimentazione degli animali. Tale metodo prevede inoltre l’utilizzo di un nuovo microrganismo geneticamente modificato in grado di esprimere tale proteina e di un nuovo vettore di espressione che consenta la modifica genetica. Sono altresì descritti i metodi di ottenimento dell’organismo geneticamente modificato e del vettore di espressione secondo l’invenzione. Inoltre l’invenzione fornisce alimenti e/o integratori alimentari per animali contenenti tale proteina e/o il microrganismo secondo l’invenzione.

E’ noto che le molecole che compongono gli organismi viventi sono composti organici spesso molto complessi, e per la maggior parte di natura polimerica. Per gli scopi della presente invenzione verranno trattate esclusivamente le proteine, polimeri formati da catene di amminoacidi, che svolgono all’interno dell’organismo le più svariate funzioni.

Le proteine variano tra loro sia per il tipo di amminoacidi coinvolti nella formazione della struttura, che per il numero delle unità monomeriche, oltre a presentare propriètà anche molto differenti in relazione alle diverse strutture tridimensionali che formano.

La particolarità delle proteine è che svolgono funzioni altamente specifiche (si pensi agli enzimi, capaci di far avvenire una determinata reazione chimica “scegliendo” i reagenti di partenza e consentendo la formazione di un prodotto con precise caratteristiche chimico fisiche), per cui si rendono necessarie strutture molecolari molto complesse nelle quali sia la sequenza degli amminoacidi che la conformazione tridimensionale finale devono essere perfettamente definite.

La normale sintesi proteica all’interno delle cellule viene eseguita attraverso meccanismi molto complessi, frutto dell’evoluzione naturale, in cui il DNA, portatore dell’informazione genetica, regola la formazione delle proteine con funzioni specifiche garantendo la corretta composizione amminoacidica e la giusta disposizione tridimensionale della molecola.

Da quanto sopra espresso, si può facilmente capire come la sintesi artificiale di molecole complesse di questo tipo sia difficile, dato che non solo occorre rispettare la sequenza di amminoacidi prevista, ma anche garantire la corretta disposizione spaziale della macromolecola formata.

Ciò richiede molti passaggi intermedi e molte fasi di purificazione che comportano inevitabilmente un notevole aggravio dei costi di produzione.

Sfruttare la produzione di queste molecole da parte di organismi viventi consente di ottenere i prodotti con un unico passaggio, partendo inoltre da reagenti di partenza molto semplici.

E’ noto che gli organismi unicellulari, (batteri e funghi) a dispetto delle piccole dimensioni, sono dei particolarissimi “reattori” chimici, in grado di sintetizzare molecole complesse a partire da composti semplici reperibili dall’ambiente in cui vivono.

La crescita e la proliferazione dei microrganismi, spesso indicati come “biomasse” nei processi fermentativi, è un fattore di particolare importanza quando si intendono sfruttare le loro attività metaboliche per ricavare sostanze di interesse: la quantità di sostanza prodotta dipende ovviamente dal numero di microrganismi che la producono.

Come in tutti gli ecosistemi, per permettere la vita dei microrganismi, l’ambiente deve possedere condizioni ideali, per cui non è sufficiente la disponibilità di nutrienti, ma occorre che anche altri fattori, (come il pH, la disponibilità di ossigeno per la respirazione e l’assenza di sostanze tossiche), vengano mantenuti costanti nel corso del tempo. Risulta quindi possibile sfruttare l’attività metabolica dei microrganismi allo scopo di produrre sostanze di interesse, limitatamente però a quei composti che gli organismi producono normalmente in natura per soddisfare le loro necessità.

Le nuove tecnologie di clonazione del DNA e di espressione eterologa della molecola complessa hanno permesso il superamento di questo inconveniente, consentendo di individuare il frammento di cDNA (o gene) responsabile della produzione della molecola complessa presente negli organismi superiori. L’inserimento di quest’ultimo nei microrganismi avviene tramite vettori di espressione ricombinanti.

I microrganismi così modificati sono in grado di produrre molecole complesse, come le proteine. La tipologia di microrganismi maggiormente utilizzati a questo scopo sono i lieviti.

E’ noto che con il termine fermentazione si intende un qualunque processo in cui i microrganismi si moltiplicano rapidamente provocando la trasformazione della miscela di reazione. L’attività metabolica delle cellule provoca l’arricchimento della miscela di molecole organiche complesse (tra cui la sostanza che si vuole produrre) a partire da costituenti semplici (nutrienti). Affinché detto processo abbia luogo è necessario fornire ai microrganismi un ambiente in cui essi siano in grado di prosperare: occorre quindi che siano disponibili i nutrienti, che il pH e la temperatura siano idonei e che si mantenga un corretto scambio gassoso con l’esterno per garantire la respirazione. Solitamente il processo di fermentazione può essere schematizzato come segue:

nutrienti

PREPARAZIONE

DELL’AMBIENTE DI

Coadiuvanti FERMENTAZIONE

tecnologici

Inserimento dei FASE DI INOCULO microrganismi

CRESCITA DELLA BIOMASSA

Normali attività PRODUZIONE DELLA metaboliche o SOSTANZA DI INTERESSE inserimento di un opportuno reagente stimolante

RECUPERO DELLA SOSTANZA

E DELLA BIOMASSA

Per la produzione industriale si utilizzano di solito dei processi discontinui o a “batch” (o “lotto” ) come quello descritto nello schema precedente.

Le fasi salienti sono rappresentate dalla creazione dell’opportuno ambiente per la fermentazione, dall’inserimento dei microrganismi opportunamente selezionati e dal recupero finale dei prodotti formati.

L’ambiente e le condizioni operative devono essere tali da permettere un veloce sviluppo delle colonie batteriche, affinché la successiva produzione di proteine sia efficace.

Allo scopo di avere un mezzo di crescita omogeneo è necessario che tutta la miscela sia agitata di continuo. Per assicurare una buona diffusione gassosa ed una concentrazione sufficiente di nutrienti in ogni punto bisogna impedire la formazione di schiume in superficie, che impedirebbero lo scambio gassoso. A tale scopo si impiegano spesso degli agenti antischiuma che permettono un continuo scambio gassoso senza interferire con il processo di fermentazione. In aggiunta ai nutrienti principali, si possono inserire nel processo molte altre sostanze, in minima concentrazione, che risultano indispensabili per il metabolismo cellulare, in particolare si possono utilizzare soluzioni diluite di sali. L’inserimento dei microrganismi responsabili della fermentazione, detto inoculo, viene eseguito immettendo nell’ambiente di fermentazione alcune colonie selezionate fatte crescere su un opportuno terreno: dette colonie rappresentano la biomassa iniziale.

Avvenuta la fase di crescita della biomassa, in cui i microrganismi sfruttano i nutrienti presenti nell’ambiente per crescere di dimensioni e moltiplicarsi, inizia la produzione dei composti organici complessi, quali ad es. proteine, che si accumulano nell’ambiente di fermentazione. Questa fase può essere sollecitata dall’esterno a produrre la sostanza di interesse, ad esempio attraverso variazioni dei nutrienti o l’immissione di sostanze che attivano il promotore specifico che controlla il gene della produzione della proteina.

Nella miscela di fermentazione finale saranno quindi presenti i microrganismi, la sostanza di interesse e tutti gli altri metaboliti prodotti, oltre ai nutrienti non utilizzati: occorre pertanto provvedere all’estrazione dei prodotti di interesse dalla miscela.

In considerazione di quanto sopra, la presente invenzione si inserisce nel particolare settore tecnico concernente la produzione di lattoferrina, particolarmente indicata per integrare la dieta di animali, ad esempio suinetti, nella fase di svezzamento o svezzamento precoce.

E’ noto che la lattoferrina (LF) è una glicoproteina basica, appartenente alla famiglia delle transferrine, una classe di proteine non-eme, che legano il ferro a pH neutro e alcalino e lo rilasciano a pH inferiore.

- La lattoferrina è sintetizzata nella ghiandola mammaria e in altre ghiandole esocrine ed è immagazzinante nei granuli dei leucociti polimorfonucleati;

- è coinvolta nel metabolismo del ferro;

- modula la risposta infiammatoria;

- regola la crescita e il differenziamento cellulare;

- è un peptide bioattivo del latte

I suinetti alla nascita sono immaturi dal punto di vista digestivo e immunitario; allo svezzamento risentono di numerosi fattori stressanti (allattamento dalla madre, formazione di nuovi gruppi, trattamenti sanitari, ecc.).

Appare, quindi, di notevole interesse la possibilità di integrare la dieta del suinetto precoce con molecole bioattive con valore nutraceutico e specie-specifiche, che possano supportare le deficienze immunitarie dell’animale.

Considerando le notevoli difficoltà della colonizzazione, nelle prime ore di vita, da parte della flora batterica utile, la lattoferrina assume un’importanza indispensabile nel mantenere un giusto equilibrio della flora batterica intestinale.

L’interesse per questa proteina nell’ambito dell’allevamento suinicolo risiede nella sua azione nutraceutica: un nutraceutico è una sostanza bioattiva che non possiede valore nutrizionale, ma che contribuisce al miglioramento delle performances dell’organismo.

La lattoferrina svolge un’azione inibitoria nei confronti dei patogeni e, in tal modo, l’efficienza del sistema immunitario; è noto, infatti, che il suinetto nella fase dello svezzamento è particolarmente soggetto all’insorgenza di patologie riconducibili a carenze immunitarie causate dallo stress e dalla diminuzione delle difese acquisite passivamente dalla madre con il colostro e con il latte.

La lattoferrina, inoltre, promuove l’assunzione del ferro a livello enterico, perchè interagisce in modo specifico con un recettore localizzato sull’orletto a spazzola dell’epitelio intestinale.

La produzione di lattoferrina suina mediante sintesi artificiale risulta estremamente complessa. Per tanto risulta di estremo interesse la possibilità di ottenere lattoferrina ricombinante tramite espressione eterologa.

La sequenza di cDna responsabile della produzione della lattoferrina suina è stata individuata da Alexander, L. J., et al., Animal Genetics, 23:251-256 (1992) la sequenza è lunga 2259 nucleotidi, codifica per un peptide leader lungo 19 aminoacidi e per una proteina matura di 684 residui aminoacidici del peso di 78 KDa. Il gene della lattoferrina suina presenta 257 basi nella regione in 3’ non tradotta, il segnale di poliadenilazione nella posizione nucleotidica 2273-2278 e il tratto di poliadenilazione (A15) a livello del nucleotide 2308 (Wang et al., 1997). E’ altresì noto che Pichia pastoris è un lievito metilotrofico, in grado di sfruttare il metanolo come unica fonte di carbonio e di energia, e che è impiegato come sistema di espressione per la produzione di proteine eterologhe.

I lieviti come sistema di espressione si riassumono nei seguenti vantaggi: - elevato grado di sicurezza;

- crescita rapida ;

- agevole manipolazione del patrimonio genetico.

Scopo della presente invenzione è quella di fornire un processo di fermentazione per Pichia pastoris con cui indurre, ed ottenere, la produzione di lattoferrina suina tramite espressione eterologa.

Un altro scopo dell’invenzione consiste nell’attuare il processo di fermentazione appena richiamato utilizzando composti organici semplici e poco costosi.

Un ulteriore scopo della presente invenzione consiste nel fornire un nuovo vettore di espressione che porti il gene della lattoferrina suina e un processo per produrlo. In un altro aspetto della presente invenzione il richiedente fornisce nuovo ceppo di Pichia pastoris ricombinante in grado di esprimere vantaggiosamente lattoferrina suina ed un processo per produrre detto ceppo ricombinante.

Sono altresì oggetti della presente invenzione, lattoferrina suina ricombinante ottenibile con i processi secondo l’invenzione, alimenti o integratori alimentari per animali, in particolare per suinetti, contenenti lattoferrina suina ricombinante e/o il nuovo ceppo di Pichia pastoris ottenibili secondo i metodi di produzione in accordo con la presente invenzione.

I suindicati scopi vengono ottenuti in accordo con il contenuto delle rivendicazioni. Le caratteristiche dell’invenzione sono evidenziate nel seguito, con particolare riferimento agli esempi considerati.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

In Fig.1 è riportata la mappa del vettore pPIC9

In Fig.2 è riportato il sito di clonaggio multiplo di pPIC9

In Fig.3 è riportato lo schema della sostituzione genica a livello di AOX1 in Pichia pastoris GS115.

Il processo di produzione del vettore di espressione secondo l’invenzione in cui è integrato, nel vettore di base pPIC9, il gene della lattoferrina suina comprende le seguenti fasi:

- estrarre l’RNA del gene della lattoferrina suina;

- ottenere il cDNA del gene della lattoferrina suina dall’RNA; e

- integrare il cDNA del gene della lattoferrina suina nel vettore di espressione pPIC9.

Si ottiene un secondo vettore di espressione, denominato dal richiedente pPIC9-pLF, che è quindi costituito dal vettore di base pPIC9 in cui è integrato il gene della lattoferrina suina.

Il processo di produzione del ceppo di Pichia pastoris ricombinante in grado di esprimere lattoferrina suina comprende la seguente fase :

- integrare il vettore di espressione pPIC9-pLF in di Pichia pastoris GS115, ottenendo un nuovo ceppo di Pichia pastoris, denominata dal richiedente Pichia pastoris RLF9.

Pichia pastoris RLF9 risulta quindi costituita da Pichia pastoris SG115 in cui è stato integrato il vettore di espressione pPIC9-pLF.

Il processo di produzione di lattoferrina suina secondo l’invenzione comprende la seguente fase:

- indurre l’espressione di lattoferrina suina addizionando metanolo alla coltura di Pichia pastoris RLF9.

La lattoferrina suina così prodotta è stata analizzata con tecniche SDS-PAGE e Western blotting: in quest’ultima tecnica la lattoferrina suina è stata riconosciuta da un anticorpo primario di coniglio diretto contro la lattoferrina umana. Studi condotti da Magnuson ed altri (1990) hanno, infatti, dimostrato che le lattoferrina umana e suina condividono determinanti antigenici e che presentano una notevole omologia nella struttura terziaria.

L’SDS-PAGE e il Western blotting hanno evidenziato la presenza di due bande di peso molecolare differente (80 e 50 KDa circa). La lattoferrina suina ha due siti di N-glicosilazione e tre siti potenziali di O-glicosilazione; la proteina deglicosilata pesa 77 KDa circa. La banda maggiore rappresenterebbe, quindi, la forma glicosilata della lattoferrina suina, dal momento che i residui glicosidici possono aumentare in modo significativo il peso molecolare di una proteina. La glicosilazione costituisce un processo di fondamentale importanza, in quanto l'efficacia biologica della lattoferrina, in genere, è legata alla presenza delle catene glicosidiche. E' noto, infatti, che la resistenza al trattamento con proteasi e alle variazioni di pH è influenzato dal livello di glicosilazione. La banda di peso molecolare inferiore, invece, rappresenta, probabilmente, una parte della lattoferrina processata da proteasi.

L’estrazione dell’RNA relativo alla lattoferrina suina può essere effettuata utilizzando campioni di tessuto di ghiandole esocrine di suini, vantaggiosamente di ghiandole mammarie di scrofa, utilizzando reagenti di lisi cellulare commercialmente disponibili. È preferibile omogeneizzare il campione ed effettuare l’estrazione con TRIZOL® (soluzione di lisi cellulare commercializzata dalla Invitrogen).

Il cDNA è stato ottenuto per trascrizione inversa dell’RNA corrispondente e il gene di interesse è stato amplificato tramite tecnica PCR del cDNA .

Il richiedente ha ottenuto il costrutto pPIC9-pLF che è stato utilizzato come vettore di espressione per dirigere la secrezione di proteine nel medium di coltura. Per ottenere tale vettore di espressione il richiedente ha integrato il gene della lattoferrina suina nel plasmide pPIC9, disponibile commercialmente dalla Invitrogen. Questo plasmide, la cui mappa è riportata in Fig. 1, possiede la sequenza codificante per il segnale di secrezione N-terminale (α-factor) a monte del sito di clonaggio multiplo. Il vettore possiede il promotore AOX1 dell'alcol ossidasi, che consente l'espressione di alti livelli di proteina sotto induzione del metanolo, e il gene His4, che permette la crescita in terreno privo di istidina. Il vettore di espressione pPIC9-pLF linearizzato è stato integrato nel genoma dell'ospite e promuove il mantenimento stabile del gene di interesse. Inoltre, il vettore contiene il gene per la resistenza all'ampicillina per la selezione in E.coli. Risulta vantaggioso moltiplicare il vettore d’espressione pPIC9-pLF integrandolo in un sistema biologico in grado di moltiplicarsi, quale un batterio Escherichia coli, prima di integrarlo nel ceppo di Pichia pastoris prescelto. A questo scopo si possono utilizzare vantaggiosamente ceppi di Escherichia coli del tipo XL1-Blue, DH5α e JM101, preferibilmente DH5α e JM101. L’integrazione del costrutto nel batterio può avvenire per elettroporazione o per trasformazione con metodo “HEAT SHOCK”.

Dopo aver cresciuto il ceppo ricombinante di Escherichia coli in cui è stato integrato il costrutto pPIC9-pLF e averlo selezionato su terreni di coltura contenenti ampicillina, il DNA plasmidico è stato estratto dalle colture selezionate. L’estrazione del DNA plasmidico si può effettuare con varie tecniche; tramite lisi alcalina, lisi per ebollizione, o con appositi kit disponibili commercialmente. Il DNA linearizzato è stato poi integrato nelle cellule di Pichia pastoris GS115 per elettroporazione.

Il ceppo di Pichia pastoris utilizzato è un lievito metilotrofico che in assenza di una fonte di carbonio repressiva, come il glucosio, è in grado di utilizzare il metanolo come fonte di carbonio. Il promotore dell'alcol ossidasi (AOX1) controlla l'espressione di questo enzima, che catalizza il primo step nel “pathway” metabolico del metanolo. In mancanza di metanolo non è rilevabile nessuna alcol ossidasi. Inoltre, il ceppo di Pichia pastoris GS115 è portatore di una mutazione nel gene dell'istidinol deidrogenasi (his4), che lo rende incapace di sintetizzare l'istidina. Tutti i plasmidi che recano il gene HIS4 complementano la mutazione nell'ospite e i trasformanti vengono selezionati per la possibilità di crescere in un terreno privo di istidina. Il DNA plasmidico lineare genera trasformanti stabili di Pichia pastoris tramite ricombinazione omologa con le regioni di omologia nel genoma. La linearizzazione del DNA con SacI promuove l'evento di inserzione genica nel locus AOX1; ciò determina il fenotipo His+Mut+ nel ceppo his4 GS115. ( FIG.3)

Il ceppo ricombinante ottenuto di Pichia pastoris RLF9 in cui è stato inserito il gene della lattoferrina suina è quindi selezionato da un inoculo su MGY (minimal glycerol medium, senza istidina) prima di procedere con la fermentazione e la conseguente produzione eterologa di lattoferrina suina.

CREAZIONE DELL’OPPORTUNO AMBIENTE DI FERMENTAZIONE DI PICHIA PASTORIS RLF9

Risulta vantaggioso operare la fermentazione di Pichia pastoris RLF9 utilizzando un terreno in cui è presente il glicerolo come nutriente principale, unitamente alle sostanze che rendono il mezzo idoneo alla crescita delle colonie di Pichia pastoris RLF9.

Tale terreno di coltura, denominato FBS (fermentatura basal salts) ha la composizione sottoindicata.

FBS (fermentation basal salts) 1 litro

Acido fosforico 85% 26,7 ml

Calcio solfato 0,93 g

Potassio solfato 18,2 g

Magnesio solfato .7H2O 14,9 g

Potassio idrossido 4,13 g

Glicerolo 40,0 g

Acqua 1 litro

Il terreno di coltura viene sterilizzato a 121°C per 20 minuti; viene preferibilmente portato a pH 5,0 con una soluzione di ammoniaca (NH3) al 25%; e additivato con una soluzione salina (PTM) che fornisce altre sostanze indispensabili per il metabolismo della Pichia pastoris in quantità pari a 4,35 ml/litro di terreno di coltura FBS.

Detta soluzione salina PTM, anch’ essa sterile, ha la composizione indicata nella tabella sottostante

PTM (Sali traccia) 1 litro

Rame solfato.5H2O 6,0 g

Sodio ioduro 0,08 g

Manganese solfato. H2O 3,0 g

Sodio molibdato.2H2O 0,2 g

Acido borico 0,02 g

Cobalto cloruro 0,5 g

Zinco cloruro 20,0 g

Ferro solfato.7H2O 65,0 g

Biotina 0,2 g

Acido solforico 5 ml

Acqua a un litro

Il terreno di coltura così preparato viene inserito nel reattore (fermentatore) e si impostano vantaggiosamente le condizioni definite come parametri di fermentazione:

- temperatura 30°C

- ossigeno >20%

- pH 5.0-6.0 relativamente alla prima e seconda fase

- agitazione 500-1500 rpm (rotazioni per minuto)

- aerazione 0.1-1.0 litri di ossigeno /litri di terreno di coltura /minuto.

In questo modo le cellule hanno la possibilità di crescere alla temperatura ideale, mentre la disponibilità di nutrienti e lo scambio gassoso sono garantiti dall’agitazione del mezzo. Questa condizione potrebbe portare alla formazione di schiuma, con gli inconvenienti noti all’esperto del settore, per cui si utilizza, ad esempio, polipropilenglicole (PPG) come antischiuma.

Una volta preparato l’ambiente di fermentazione si procede all’inserimento (inoculo) della Pichia pastoris RLF9.

Vantaggiosamente il pH viene continuamente controllato durante lo svolgersi della fermentazione e mantenuto a valore costante inserendo acido fosforico e ammoniaca o acido fosforico e idrossido di potassio.

INSERIMENTO DI PICHIA PASTORIS (INOCULO)

Le cellule di Pichia pastoris RLF9 adatte alla produzione eterologa di lattoferrina, vengono fatte sviluppare preventivamente su un terreno di coltura apposito e quando hanno raggiunto il grado di crescita desiderato, inserite nell’ambiente di fermentazione nel quale proseguiranno a svilupparsi e a riprodursi fino ad arrivare alla massa ideale per consentire la produzione di lattoferrina.

- Per sviluppare l’inoculo desiderato (di Pichia pastoris) si utilizza un terreno MGY (inoculato con una colonia da una piastra MGY o da uno stock in glicerolo) - Il terreno di inoculo MGY ha la composizione descritta nella tabella sottostante

MGY (Minimal Glycerol medium, senza istidina)

YNB (Yeast Nitrogen Base) 13,4 % 100 ml

Biotina 0,02% 2 ml

Glicerolo 10% 100 ml

H2O bidistillata 800 ml

PROCESSO DI FERMENTAZIONE

Si inizia con una fase di accrescimento della biomassa denominata fase di “batch con glicerolo” di durata pari a 18-24h.

In questa fase le cellule introdotte, preferibilmente in quantità pari al 5-10% del volume totale del reattore, con un processo discontinuo, consumano il nutriente (glicerolo) presente nell’ambiente di fermentazione per accrescersi e moltiplicarsi. La conclusione di questa fase viene rilevata monitorando i gas che si producono nell’ambiente di fermentazione (il valore di ossigeno aumenta del 100%).

Il processo prosegue con una seconda fase di feeding (nutrimento) con una soluzione di glicerolo al 50%, addizionata con un aliquota di 12 ml/litro di PTM, alla dose di 18 ml/ora/litro di volume iniziale per una durata di almeno 4 ore.

Durante questa fase viene consumato il glicerolo immesso nel reattore; detto consumo viene evidenziato da un incremento del valore dell’ossigeno di circa il 100%.

Alla fine della seconda fase la biomassa raggiunge il valore di circa 180-220 g/l, il controllo del valore sopra menzionato può essere eseguito tramite un prelievo di un campione di 10 ml.

Va rilevato che durante questa seconda fase può verificarsi la discesa del valore dell’ossigeno al di sotto del 20%; in questo caso viene fermato il feeding (immissione di nutrienti), si attende la ricrescita del valore dell’ossigeno senza variare altri parametri, poi si riprende il feeding eventualmente variando i parametri di agitazione o il volume d’aria immesso nella miscela.

Nella terza ed ultima fase viene indotta la produzione della lattoferrina cambiando il nutriente, più precisamente utilizzando metanolo.

In questa fase la fonte di carbonio “metanolo” attiva il promotore specifico che controlla il gene per la produzione della lattoferrina suina introdotta in Pichia pastoris.

Il richiedente ha constatato che nella terza fase il metanolo deve essere introdotto lentamente nell’ambiente di reazione: una rapida aggiunta provocherebbe la formazione di zone a concentrazione troppo elevata di nutriente che determinerebbe la morte delle cellule.

Preferibilmente tale terza fase, di feeding con metanolo al 100%, addizionato con un aliquota di 12 ml/litro di PTM, è divisa a sua volta in tre sottofasi elencate nella tabella sottostante.

sottofase Quantità di nutriente Durata

A 3,6 ml/ora/litro di volume 2-4 ore

iniziale

B 7,3 ml/ora/litro di volume 2 ore

iniziale

C 11 ml/ora/litro di volume iniziale Fino alla durata complessiva di 70 ore

Nella sottofase A il metanolo tende ad accumularsi nelle prime 2-3 ore ed i valori dell’ossigeno misurati diventano di conseguenza variabili, se discende al di sotto del 20% il feeding va interrotto e ripreso solo all’aumento dell’ossigeno; la biomassa deve adattarsi al metanolo, per una durata di adattamento di 2-4 ore (il tempo indicato in tabella).

Nella terza fase nel suo complesso si consuma una quantità di nutriente (metanolo) pari a 740 ml di metanolo per litro iniziale e la biomassa cresce fino a raggiungere un valore di circa 350-450 g/litro.

Nella terza fase il metanolo, oltre a fungere da nutriente, attiva, come già evidenziato, il promotore specifico che controlla il gene per la produzione di lattoferrina suina introdotto in Pichia pastoris RLF9. L’ambiente di fermentazione si arricchisce, quindi, durante questa fase della proteina che si intende ricavare. Risulta vantaggioso inibire l’attività delle proteasi, allo scopo di non ridurre la quantità di proteina prodotta, portando lentamente il pH del brodo di coltura a circa 3,0 alla fine della fase seconda o all’inizio della fase terza. Detta diminuzione del pH deve essere lenta (4-5 ore) per non danneggiare l’attività metabolica delle cellule.

La durata della terza fase è di circa 70 ore, in cui viene consumato il 74% del metanolo introdotto.

Il processo di fermentazione può a questo punto essere considerato concluso: si può pertanto procedere all’estrazione della lattoferrina suina ricombinante prodotta nell’ambiente di fermentazione con tecniche convenzionali ad esempio mediante l’ultrafiltrazione. Alternativamente si possono addizionare ad alimenti e/o integratori per animali cellule di Pichia pastoris RLF9.

Risultano evidenti i vantaggi dell’invenzione: partendo da composti organici semplici e poco costosi (glicerolo e metanolo) si ottiene come prodotto una proteina, la lattoferrina suina, composto la cui sintesi artificiale sarebbe estremamente complessa.

ESEMPI

Dove non espressamente indicato, i protocolli seguiti sono stati tratti da Current protocols in molecular biology (Ausbel ed altri, 1994), Molecular cloning. A laboratory manual (Sambrook ed altri, 1989) e Pichia expression kit (commercializzato dalla Invitrogen).

Le composizioni delle soluzioni o dei terreni di coltura indicati nelle procedure sono riportati di seguito alla procedura.

ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA GHIANDOLA MAMMARIA DI SCROFA

• il tessuto mammario di scrofa (da 50 a 100 mg) è posto in un tubo da 1,5 ml e si aggiunge 1 ml di TRIZOL<®>

• si omogeneizza il campione con un omogenizzatore, in modo che la soluzione si misceli opportunamente con il tessuto

• dopo un’incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente per consentire la completa dissociazione dei complessi di nucleoproteine, si aggiungono 0,2 ml di cloroformio-isoamilico (24:1), si rovescia il tubo diverse volte per 15 secondi e si incuba a temperatura ambiente per 2-3 minuti

• si centrifuga a 12000 rpm per 15 minuti a 4°C

• si preleva il supernatante e lo si trasferisce in un tubo sterile

• alla fase acquosa si aggiungono 0,5 ml di isopropanolo freddo

• si incuba il campione per 10 minuti a RT

• si centrifuga a 12000 rpm per 10 minuti a 4°C

• si rimuove il supernatante

• si aggiunge 1 ml di EtOH 70% al pellet

• si centrifuga a 7500 rpm per 5 minuti a 4°C

• si elimina il supernatante

• si centrifuga per qualche secondo e si rimuove completamente l’EtOH dalle pareti del tubo

• si lascia il tubo con il tappo aperto per 5 minuti, finchè il pellet non è asciutto

• Il pellet è risospeso in 30 µl di acqua DEPC (dietilpirocarbonato)

• Parte dell’RNA estratto è posto a –80°C, mentre un’aliquota (4 µl) è visualizzata su gel di formaldeide. Prima dell’aggiunta del sample buffer (10 µl) l’RNA è incubato per 5 minuti a 65°C; dopo l’aggiunta del sample buffer è incubato nuovamente a 65°C per 10 minuti.

Quindi, si procede al caricamento nei pozzetti del gel.

Si lascia correre 1 ora con un voltaggio di 130 V e una corrente di 200 mA e si visualizza con etidio bromuro alla luce UV. Il gel di formaldeide è stato così preparato:

1. si è sciolto 1 g di agarosio in 60 ml di acqua

2. si sono aggiunti sotto cappa 12 ml di formaldeide 40%

3. si sono aggiunti sotto cappa 8,3 ml di MOPS 10%

4. si è versato la soluzione nell’apposita vaschetta per gel

Composizione del 10X MOPS

• 0,2 M MOPS (acido 3-[N-morfolino]propansulfonico)

• 0,08 M sodio acetato pH 7

• 0,01 M EDTA

SAMPLE BUFFER (da conservare a 4°C oppure a –20°C a seconda della frequenza con il quale viene utilizzato)

• 5X MOPS 0.2 ml

• formammide 1 ml

• 40 % formaldeide 0.35 ml

• etidio bromuro 10 µl

• loading buffer 200 µl

LOADING BUFFER

• 50 % glicerolo

• 1 mM EDTA pH 8

• 0,25 % blu di bromofenolo

• 0,25 % xilene cianolo FF

TRASCRIZIONE INVERSA DELL’RNA NEL cDNA CORRISPONDENTE La miscela di reazione è schematizzata nella seguente tabella:

MISCELA DI REAZIONE

Buffer 5X 1/5 del volume finale dNTPs *

0,2 mM

(desossiribonucleotidi)

MMLV-RT 200 U

Primer* 400 nM

RNA totale** 400 ng

H2O DEPC A volume

Volume finale<25 µl>

*diluiti con H2O DEPC

**questa aliquota deriva dalla precedente precipitazione e risospensione in 5 µl di H2O DEPC dell’RNA totale estratto.

Il ciclo di trascrizione inversa utilizzato si compone delle seguenti fasi:

• fase a temperatura di 70°C per 5 minuti in questa prima fase vengono aggiunti solo il buffer, il primer e l’RNA totale

• fase a temperatura di 42°C per 65 minuti si aggiungono l’enzima e i dNTPs (desossiribonucleotidi)

• fase a temperatura di 70°C per 15 minuti

• fase a temperatura di 4°C a tempo indeterminato

Per amplificare il cDNA del gene di interesse si è impostata la seguente reazione di PCR con la seguente composizione:

MISCELA DI REAZIONE

CDNA 10 ng

Buffer 10X 1/10 del volume finale dNTPs (desossiribonucleotidi) 0,2 mM

MgCl21,5 mM

Primer 3'<400 nM>Primer 5' 400 nM

Taq polimerasi 1,5 U

H2O MQ Fino a volume Volume finale 50 µl

Le condizioni di amplificazione utilizzate sono le seguenti:

_ fase a temperatura di 94° C per 5 minuti

_ 40 cicli così composti dalle seguenti fasi:

• fase a temperatura di 94°C per 30 secondi

• fase a temperatura di 60°C per 1 minuti

• fase a temperatura di 72°C per 3 minuti e 30 secondi _ fase a temperatura di 72°C per 7 minuti

_ fase a temperatura di 4°C a tempo indeterminato MANIPOLAZIONE DEL DNA DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

Le digestioni vengono realizzate secondo lo schema seguente:

MISCELA DI REAZIONE

DNA 200 ng Buffer 10X 1/10 del volume finale BSA 1/100 del volume finale Enzima 5 U

H2O MQ A volume Volume finale 20 µl Le miscele sono state lasciate a 37°C per 2 ore circa oppure per tutta la notte, in base all'efficienza di taglio dell'enzima.

LIGATURA

La T4 DNA ligasi unisce i frammenti di restrizione di DNA che possiedono estremità sia blunt che coesive, catalizzando la formazione di ponti fosfodiestere tra il gruppo 5' fosfato e il terminale 3' idrossilico nel DNA a doppio filamento. La miscela di reazione è impostata nel modo seguente:

MISCELA DI REAZIONE

DNA pPIC9 50-100 ng

DNA pLF In rapporto 1:3 vettore/inserto

T4 ligasi<1 U>

Buffer 2X 1⁄2 del volume finale H2O MQ Fino a volume Volume finale 10-20 µl

CORSA ELETTROFORETICA SU GEL DI AGAROSIO

Il gel di agarosio è utilizzato per separare i frammenti di DNA, in funzione della dimensione e del grado di superavvolgimento. La concentrazione di agarosio impiegata è pari allo 0,8 %.

Al gel è aggiunto etidio bromuro alla concentrazione di 1 µl/50 ml di gel (stock mg/ml); questa composto è un intercalante del DNA e viene impiegato per consentire la visualizzazione del DNA, quando il gel è illuminato con raggi UV, al transilluminatore.

Prima di essere caricato, il DNA è miscelato con un tampone di caricamento che, aumentando la densità della soluzione di DNA, ne consente la discesa nei pozzetti.

Il voltaggio di corsa viene regolato a 85-90 V.

Il tampone di corsa impiegato è il TBE 0,5X, preparato a partire da TBE 10X.

TBE 10X (1000 ml)

• TRIS 108 g

• acido borico 55 g

• 0,5 M EDTA pH 8 4 ml

LOADING BUFFER

• 0,07 % blu di bromofenolo

• 50 % glicerolo

GENE CLEAN DEI FRAMMENTI EXCISI DAL GEL

Per eluire il frammento di DNA dal gel è stato impiegato il kit di estrazione QIAquick della Quiagen e si è operato nel seguente modo:

1. le bande vengono excise con un bisturi pulito, poste in un tubo da 1.5 ml e pesate.

2. si aggiungono 3 volumi di Buffer QG ogni volume di gel, considerando che 100 mg di materiale corrispondano a circa 100 µl.

3. si lascia in incubazione a 50°C per 10’, in modo che il gel si sciolga completamente. Per facilitare la dissoluzione del gel, è opportuno vortexare il tubo ogni 2-3’ durante l’incubazione. Alla fine di questa fase è necessario che il gel sia completamente sciolto ed è importante che il pH sia inferiore o uguale a 7.5, per favorire il legame del DNA alla resina 4. il contenuto del tubo è trasferito nella colonnina fornita dal kit e viene centrifugato per 1’ alla massima velocità

5. il materiale eluito dalla colonnina viene scartato e si ripete l’operazione 6. la colonnina è, quindi, lavata con 0.75 ml di Buffer PE tramite una centrifugazione di 1’ alla massima velocità

7. la colonnina è posta in un tubo da 1.5 ml pulito

8. il DNA è eluito aggiungendo 50 µl di Buffer EB (10 mM TRIS-Cl pH 8,5) e centrifugando alla massima velocità per 1’

9. il DNA è, quindi, risospeso in H2O MQ sterile.

PRECIPITAZIONE DEL DNA

La miscela di ligatura deve essere precipitata non solo per concentrare il DNA, ma anche per liberarlo dai sali, contenuti nel tampone, che potrebbero interferire con la successiva trasformazione.

• alla miscela di ligatura si aggiungono un ugual volume di isopropanolo freddo e 1/10 di volume di 3 M sodio acetato pH 5,5

• si vortexa

• si incuba 30 minuti circa a temperatura ambiente (una maggiore efficienza si ottiene incubando 30’ oppure tutta la notte a –20°C)

• si centrifuga alla massima velocità per 30 minuti (preferibilmente, in centrifuga refrigerata)

• si elimina accuratamente il surnatante

• si aggiungono 50 µl di EtOH 70% freddo, in modo da coprire il pellet • si vortexa

• si centrifuga 30 minuti alla massima velocità

• si rimuove il surnatante

• si centrifuga ancora per qualche secondo per eliminare completamente l’alcol dalle pareti del tubo

• si asciuga il peller al bunsen o all’aria per 5-10 minuti

• si risospende in H2O MQ sterile in base alla consistenza del pellet TRASFORMAZIONE DI ESCHERICHIA COLI E.coli DH5α CON METODO HEAT SHOCK

A) PREPARAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI

si cresce E.coli DH5α per tutta la notte a 37°C in agitatore (250 rpm) una singola colonia batterica di E.coli in 10 ml di LB liquido

si trasferiscono 5 ml di coltura in una beuta con 500 ml di LB liquido; si incuba a 37°C in agitatore rotante (250 rpm) finchè non si ha una OD600=0.4 (circa 3-4 ore)

si trasferisce la coltura in tubi da 250 ml e si lascia in ghiaccio per 20 minuti

si centrifuga a 4°C per 10 minuti a 3500 rpm

si risospendono le cellule in 30 ml di 0,1 M CaCl2freddo e si incuba in ghiaccio per 10 minuti

si centrifuga a 4°C per 10 minuti a 3500 rpm

si elimina il surnatante e si risospendono le cellule in 0,1 M CaCl2e 15% glicerolo freddo

si preparano aliquote da 140 µl; si passano in azoto liquido e si conservano a -80°C.

B) HEAT SHOCK

Si lasciano in ghiaccio 10 minuti le cellule competenti prelevate dal frigorifero a -80°C

Si aggiungono direttamente alle cellule 2 µl di DNA (50 ng/µl circa) Si lasciano in ghiaccio per 45 minuti

Si incuba poi per 2 minuti a 42°C

Si lascia in ghiaccio per 90 secondi

Si aggiungono 900 µl di LB liquido

Si incuba per 1 ora a 37°C

Si piastrano 150 µl di diluito e il rimanente concentrato dopo centrifugazione per 5 minuti a 12000 rpm

far crescere tutta la notte a 37°C in termostato

Composizione del LB (Luria-Bertani) Medium

Estratto di lievito 5 g

Triptone 10 g

NaCl 10 g

H2O bidistillata 1 litro

Il terreno è portato a pH 7,0 e sterilizzato in autoclave a 115°C per 15 minuti prima dell’inoculo.

La crescita e selezione del E. coli in cui è stato integrato il vettore ricombinante pPIC9-pLF è stata effettuata in LB addizionato di 50 mg/ml di ampicillina. ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO

La procedura seguita per l'estrazione di DNA da E.coli DH5α è illustrata nei punti seguenti, le composizioni delle soluzioni utilizzate sono riportate di seguito:

1) raccolta delle cellule batteriche: le cellule di E.coli vengono pellettate centrifugando alla massima velocità per 5'; il medium viene rimosso delicatamente

2) risospensione delle cellule: ai pellets vengono aggiunti 4 ml di soluzione E1;

le cellule vengono risopese vortexando, finchè la sospensione è omogenea 3) lisi cellulare: si aggiungono 4 ml di soluzione E2 e si miscela con delicatezza, ma energicamente, finchè il lisato appare uniforme

4) trattamento con RNasi: si aggiungono 10 µl di RNasi (stock 10 mg/ml) e si lascia incubare per 20 minuti a 55°C

5) neutralizzazione: si aggiungono 4 ml di soluzione E3 e si invertono i tubi 5 volte per miscelare; è importante non vortexare. Si centrifuga a 20°C a 15000 x g per 10 minuti

6) equilibratura delle colonne: l'equilibratura della colonna a resina a scambio anionico, JETSTAR commercializzata da GENOMED, si effettua facendo percolare all'interno di ciascuna colonna 10 ml di soluzione E4

7) caricamento delle colonne: il surnatante recuperato dalla precedente centrifugazione viene applicato alla colonna e lasciato percolare per gravità 8) lavaggio delle colonne: le colonne vengono lavate due volte con 10 ml di soluzione E5

9) eluizione dei plasmidi: il DNA viene eluito con 5 ml di soluzione E6

10) precipitazione dei plasmidi: il DNA viene precipitato con 0,7 volumi di isopropanolo (3,5 ml). Si centrifuga a 4°C a 15000 x g per 30 minuti. Il DNA viene lavato con EtOH 70% e centrifugato una seconda volta. Il pellet è lasciato asciugare all'aria per 10 minuti; il DNA viene risospeso in 50 µl di H2O sterile

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E1 (risospensione delle cellule)

• 50 mM Tris

• 10 mM EDTA-HCl pH 8.0

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E2 (lisi cellulare)

• 200 mM NaOH

• 1,0 % SDS (sodio dodecil solfato)

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E3 (neutralizzazione)

• 3,1 M potassio acetato-acido acetico pH 5,5

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E4 (equilibratura della colonna)

• 600mM NaCl

• 100 mM sodio acetato

• 0,15% TritonX-100-acido acetico pH 5.0

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E5 (lavaggio della colonna)

• 800 mM NaCl

• 100 mM sodio acetato-acido acetico pH 5.0

COMPOSIZIONE DELLA SOLUZIONE E6 (eluizione del DNA)

• 1250 mM NaCl

• 100 mM Tris-HCl pH 8,5

TRASFORMAZIONE DI Pichia pastoris GS115 in Pichia pastoris RLF9

(a) PREPARAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI

1. Si cresce Pichia pastoris GS115 in 5 ml di YPD in una beuta da 50 ml a 30°C tutta la notte in agitatore (250 rpm) ( preinoculo)

2. Si inoculano 500 ml di YPD fresco in una beuta da due litri con 0,5 ml di preinoculo e si cresce tutta la notte fino a una OD600di 1,3-1,5

3. Si centrifugano le cellule a 1500 x g per 5 minuti a 4°C

4. Si risospende il pellet in 500 ml di acqua sterile raffreddata in ghiaccio 5. Si centrifuga come al punto 3 e si risospende il pellet in 250 ml di acqua sterile raffreddata in ghiaccio

6. Si centrifuga come al punto 3 e si risospende il pellet in 200 ml di 1 M sorbitolo raffreddato in ghiaccio

7. Si centrifuga come al punto 3 e si risospende il pellet in 1 ml di 1 M sorbitolo per un volume finale di circa 1,5 ml

8. Si aliquotano le cellule (80 µl) e le si conservano a –80°C

(b) ELETTROPORAZIONE

1. Si miscelano alle cellule (80 µl) 5-20 µg di DNA linearizzato in un volume massimo di 10 µl di TE.

2. Si trasferiscono le cellule e il DNA in una cuvetta per elettroporatore da 0,2 cm raffreddata preventivamente in ghiaccio

3. Si lascia in ghiaccio per 5 minuti

4. Si elettroporano le cellule e si aggiunge immediatamente 1 ml di 1 M sorbitolo freddo

5. Si trasferisce il contenuto della cuvetta in un tubo sterile e si piastrano le cellule su terreno MD in aliquote di 400 µl

Composizione del YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

Estratto di lievito 10 g

Peptone 20 g

Destrosio 20% 100 ml

H2O bidistillata 900 ml

Il destrosio 20% va aggiunto dopo aver autoclavato il terreno.

Composizione del MD (Minimal Dextrose medium, senza istidina)

YNB (Yeast Nitrogen Base) 13,4% 100 ml

Biotina 0,02% 2 ml

Destrosio 20% 100 ml

H2O bidistillata 800 ml

I componenti del terreno sterili vengono aggiunti dopo aver raffreddato a 60°C l'H2O bidistillata autoclavata.

Si intende che quando sopra è stato descritto a titolo esemplificativo e non limitativo per cui eventuali varianti di natura pratico-applicativa delle fasi proposte, concernenti a definire il processo, oggetto dell’invenzione, si intendono rientranti nell’ambito protettivo dell’invenzione come sopra descritto e nel seguito rivendicato.

Claims (19)

1. RIVENDICAZIONI 1) Lievito, ricombinante lattoferrina suina, Pichia pastoris RLF9, costituito da Pichia pastoris SG115 in cui è stato integrato il vettore di espressione pPIC9-pLF.
2. 2) Vettore di espressione del gene lattoferrina suina, pPIC9-pLF, costituito dal vettore di base pPIC9 in cui è integrato il gene della lattoferrina suina.
3. 3) Processo di produzione del ceppo di Pichia pastoris RLF9 comprendente la fase di: - integrare il vettore di espressione pPIC9-pLF in Pichia pastoris GS115
4. 4) Processo di produzione di un vettore di espressione in cui è integrato il gene della lattoferrina suina, pPIC9-pLF, comprendente le seguenti fasi: - estrarre l’RNA del gene della lattoferrina suina; - ottenere il cDNA del gene della lattoferrina suina dall’RNA; e - integrare il cDNA del gene della lattoferrina suina in un vettore di espressione pPIC9.
5. 5) Processo di produzione di lattoferrina suina ricombinante comprendente la seguente fase: - Indurre l’espressione di lattoferrina suina addizionando metanolo alla coltura di Pichia pastoris RLF9.
6. 6) Processo secondo la rivendicazione 5) comprendente le fasi di: - creare un terreno di coltura sterile, ad un pH prefissato, - inoculare cellule di Pichia pastoris RLF9 nel fermentatore contenente il citato terreno di coltura; - attuare una prima fase per l’accrescimento della biomassa a seguito del consumo di glicerolo da parte delle cellule di Pichia pastoris RLF9; - attuare una seconda fase per l’ulteriore accrescimento della biomassa in conseguenza del consumo di glicerolo da parte delle cellule di Pichia pastoris RLF9; - attivare in una terza fase, mediante il metanolo, sia l’ulteriore accrescimento della biomassa, sia il promotore specifico che controlla il gene per la produzione di lattoferrina suina introdotta nelle cellule di Pichia pastoris RLF9; - estrarre la lattoferrina suina dall’ambiente di fermentazione.
7. 7) Processo secondo la rivendicazione 6 in cui in detta terza fase è alimentato metanolo al 100%, addizionato con un aliquota di soluzione salina, in una prima sottofase A) alla dose di circa 3,6 ml/ ora/litro volume iniziale, per una durata che va da due a quattro ore, in una seconda sottofase B) a circa 7,3 ml/ora/litro volume iniziale per una durata di almeno due ore, e in una terza sottofase C) a circa 11 ml/ora/litro volume iniziale per una durata tale da individuare una durata complessiva delle stessa terza fase di almeno settanta ore.
8. 8) Processo secondo le rivendicazioni da 6 a 7 in cui alla fine della seconda fase o all’inizio delle terza fase il pH dell’ambiente di fermentazione è portato a pH circa 3,0.
9. 9) Processo secondo le rivendicazioni da 6 a 8, in cui l’inoculo di cellule di Pichia pastoris RLF9 nel fermentatore, è compreso tra il 5 e il 10% del volume iniziale di quest’ultimo, in cui detta prima fase prevede l’alimentazione di glicerolo al 4% con durata compresa le 18 e 24 ore e in cui la fine di detta prima fase, conseguente al consumo completo del glicerolo, è individuata dall’incremento dell’ossigeno di circa il 100%.
10. 10) Processo secondo le rivendicazioni da 6 a 9 in cui detta seconda fase prevede l’alimentazione di glicerolo al 50%, addizionato con un aliquota di soluzione salina, per almeno quattro ore, e in cui la fine di detta seconda fase, conseguente al consumo completo del glicerolo, è individuata dall’incremento dell’ossigeno vicino al 100%.
11. 11) Processo secondo le rivendicazioni da 6 a 10, in cui il terreno di coltura è sottoposto ai seguenti parametri di fermentazione: - temperatura 30°c; - ossigeno > 20%; - pH 5,0 – 6,0 relativamente alla prima e seconda fase; - agitazione 500 – 1500 rpm; - aerazione 0,1 – 1,0 litri di ossigeno / litri terreno di coltura / minuto.
12. 12) Processo secondo le rivendicazione da 6 a 11 in cui il valore del pH 5,0 – 6,0 viene mantenuto costante durante lo svolgersi della prima e seconda fase inserendo nel fermentatore acido fosforico e ammoniaca, o acido fosforico e idrossido di potassio.
13. 13) Processo secondo le rivendicazione da 6 a 12 in cui il citato terreno di coltura ha la seguente composizione: - acido fosforico 85%, 26,7 ml; - calcio solfato 0,93 g. - potassio solfato 18,2 g. - magnesio solfato 7H2O 14,9 g. - potassio idrossido 4,13 g. - glicerolo 40 g. - acqua 1 litro - soluzione salina 4,35 ml / litro dei componenti di cui sopra.
14. 14) Processo secondo la rivendicazione 7 o 10 o 13, in cui detta soluzione salina ha la seguente composizione: - Rame solfato 5H2O 6,0 g. - Sodio ioduro 0,08 g. - manganese solfato H2O 3,0 g. - sodio molibdato 2H2O 0,2 g. - acido borico 0,02 g. - cobalto cloruro 0,5g. - zinco cloruro 20,0g. - ferro solfato 7 H2O 65,0g. - biotina 0,2g. - acido solforico 5ml. - acqua a un 1 litro
15. 15) Processo secondo la rivendicazione 7 o 10, in cui l’aliquota di detta soluzione salina è di circa 12 ml/litro.
16. 16) Processo secondo le rivendicazioni da 6 a 15 in cui alla fine della fase seconda o all’inizio della fase terza si porta il pH del brodo di coltura a circa 3,0.
17. 17) Lattoferrina suina ricombinante ottenibile con i processi secondo le rivendicazioni da 5 a 14.
18. 18) Alimento o integratore alimentare per animali contenente Pichia pastoris RLF9.
19. 19) Alimento o integratore alimentare per animali contenente lattoferrina suina secondo la rivendicazione 16. Bologna, 28/12/2006 Il Mandatario Ing. Daniele Dall’Olio (Albo Prot. 967BM)