IT9021926A1 - Lisato di proteine di latte umano ad attivita' immunosoppressiva processo per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che lo contengono - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "LISATO DI PROTEINE DI LATTE UMANO AD ATTIVITÀ' IMMUNOSOPPRES-SIVA, PROCESSO PER LA SUA PREPARAZIONE E COMPOSIZIONI FARMA-CEUTICHE CHE LO CONTENGONO"

La presente invenzione riguarda un lisato di proteine di latte umano ad attività immunosoppressiva, un processo per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che lo contengono.

E' noto che il latte umano fornisce oltre a fattori nutritivi anche fattori di crescita, enzimi e sostanze che contribuiscono alla difesa dalle infezioni (Hanson, L.A. Ahlstedt, S., Andersson, B., Pediatrics, 75, 172 (1985)). E' altresì noto che il latte umano contiene anche ccnponenti capaci di modulare il sistema immunocompetente (J. immunol., 140, 1366 (1988)). Recentemente è stata evidenziata la presenza nel latte umano di una glicoproteina di peso molecolare > 26 kD capace di sopprimere la proliferazione di T-linfociti in colture (Clin. Exp. Immunol.79, 463 (1990)).

Si è ora travato che un lisato di proteine del latte umano a basso peso molecolare è dotato di interessanti proprietà inmunosoppressive. La disponibilità del fattore immunosoppressivo a basso peso molecolare da latte umano offre il vantaggio di una più facile identificazione della struttura e quindi di una sintesi "in vitro", che permetterebbe un più conveniente uso clinico di tale fattore come immunosoppressore.

L'esigenza di disporre di nuovi agenti capaci di sopprimere il sisterna immunitario e di potere quindi tenere sotto controllo il rigetto del trapianto di organi e tessuti e malattie autoaggressive cane il lupus eritematoso sistemico e le malattie emolitiche autoimmuni, è inoltre di estrema attualità cane mostra il crescente utilizzo in ,clinica della ciclosporina A.

Il fattore immunosoppressivo dell'invenzione è ottenibile dal latte umano attraverso un processo che comprende:

a) precipitazione delle proteine da latte umano scremato e centrifugato; b) digestione enzimatica delle proteine ottenute in a);

c) ultrafiltrazione del lisato proteico con membrane opportune o metodi di frazionamento capaci di dare pesi molecolari equivalenti.

La digestione enzimatica può essere effettuata utilizzando diversi enzimi proteolitici e diverse condizioni. E' comunque preferito l’uso di pepsina a pH compresi fra 2 e 5, preferibilmente fra 2,5 e 4, per tempi variabili fra 10 minuti e 5 ore, preferibilmente fra 0,5 e 2 ore a temperatura ambiente.

Il seguente esempio illustra più in dettaglio la metodologia preparativa e le proprietà del fattore secondo l'invenzione.

ESEMPIO

1000 mi di latte umano raccolto tra tre giorni e due mesi la comparsa della lattazione saio stati scremati per flottazione e quindi centrifugati per allontanare il contenuto in cellule. Le proteine sono state ottenute per precipitazione con 80% di armonio solfato e conseguente dialisi centro PBS, pH 7,2. Il prodotto così ottenuto (100 g) è diluito con 1000 mi di tampone fosfato 0.2 M pH 3 ed è trattato con 1 g di pepsina. Si lascia a temperatura ambiente per 1 ora.

Il U sato proteico così ottenuto è stato ultrafiltrato con membrane Amicon<® >in nodo da ottenere frazioni molecolari superiori a 10 kD, di 10-5 kD, di 5-1 kD e inferiore a 1 kD.

Gli ultrafiltrati e la sostanza madre sono stati quindi testati in colture linfocitarie stimolate con fitoemagglutinina (PHA) secondo quanto descritto in Clin. Exp. Imnunol. 79, 463 (1990). La separazione linfocitaria fu ottenuta diluendo 10 mi di sangue eparinizzato con 20 mi di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in una provetta di plastica (30 x 115). 15 mi di gradiente di Ficoll-Urovison furono stratificati al di sotto della sospensione cellulare e quindi la provetta fu centrifugata a 400 g all'interfaccia per 40 minuti. Le cellule rimosse dall'interfaccia furono lavate 3 volte con HBSS e sospese ad una concentrazione di 2,5 x 10 cellule/ml in terreno di coltura RPMI 1640 con Hepes (20 mM), penicillina (100 Ul/ml), streptomicina (100 mcg/ml) e 10% di siero AB.

La trasformazione linfocitaria fu ottenuta impiegando PHA altamente purificata alla concentrazione finale di 0,2 mcg in un sistema di microcoltura di 5 x 10 cellule in micrcpiastre a fondo rotondo.

Le cellule incubate in una atmosfera umidificata a 37°C per 72 ore, furono marcate per le ultime 16 ore con 1 μCi di [ H)-timidina, quindi recuperate e la radioattività fu misurata con un contatore a scintillazione liquida. La sostanza madre e gli ultrafiltrati sono stati aggiunti alle colture in dosi variabili, al tempo 0.

Come è riportato nella tabella solo le frazioni tra 5 e 1 kD mostrano una forte attività inibente la trasformazione linfocitaria e questa attività è dose-dipendente.

TABELLA

(*) cellule PHA

Da quanto sopra esposto, risulta evidente come il lisato dell'invenzione, avente intervallo di peso molecolare compreso tra 1 e 5 kD, possa essere vantaggiosamente utilizzato in terapia umana cane agente immunosoppressivo. In particolare, l'uso in clinica di tale prodotto può avvenire in tutte quelle forme in cui è necessario ridurre la risposta immunologica e precisamente:

1- Nel trapianto di organi e tessuti, quale nel trapianto di rene, cuore, cuore-polmone, fegato e midollo.

2. In alcune malattie infettive con aggressività immunologica, quale l'epatite cronica attiva.

3. Nelle malattie autoimmuni, quali il lupus eritematoso sistemico, la artrite reumatoide, le malattie emolitiche autoinmuni.

Per i previsti inpieghi terapeutici, il lisato dell'invenzione è convenientemente formulato in conposizioni farmaceutiche atte alla somministrazione orale, parenterale o topica, ricorrendo a tecniche ed eccipienti convenzionali, quali quelli descritti in "Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", Mack Pub. Co., N.Y., USA.

Le dosi e le modalità di somministrazione dipenderanno ovviamente dall'uso previsto e dalle condizioni del paziente: in linea di massima le dosi saranno comunque conprese tra 1 e 1000 μg/kg/dose, ma dosi inferiori o superiori non possono essere escluse a priori in considerazione della scarsa tossicità del lisato.

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Lisato di proteine di latte umano, avente peso molecolare conpreso fra 1 e 5 kD ed attività di inibizione della trasformazione linfocitaria.
2. 2. Lisato di proteine di latte umano, secondo la rivendicazione 1 ottenibile per digestione oon pepsina delle proteine totali di latte iznano.
3. 3. Processo per la preparazione di un lisato di proteine di latte umano delle rivendicazioni 1 e 2, che comprende: a) precipitazione delle proteine da latte umano scremato e centrifugato; b) digestione enzimatica delle proteine ottenute in a); c) ultrafiltrazione oon membrane opportune in modo da ottenere il desiderato intervallo di peso molecolare.
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 3, in cui la digestione enzimatica è effettuata con pepsina.
5. 5. Composizioni farmaceutiche contenenti cane principio attivo il lisato proteico delle rivendicazioni 1 e 2.
6. 6. Uso del lisato proteico delle rivendicazioni 1 e 2 per la preparazione di un medicamento ad attività imnunosoppressiva.