IT202100011576A1 - Nuova sequenza promotore per terapia genica - Google Patents
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Description
NUOVA SEQUENZA PROMOTORE PER TERAPIA GENICA
Campo tecnico
La presente invenzione riguarda una sequenza promotore per l'espressione efficiente e sufficiente di transgeni, nonch? vettori di trasferimento genico comprendenti detta sequenza promotore da usare nella terapia genica. In particolare, la presente invenzione riguarda i vettori lentivirali che forniscono la terapia genica per condizioni patologiche del sistema nervoso centrale.
Stato della tecnica
La neuroinfiammazione ? caratterizzata, oltre che da altri fenomeni, dall'attivazione delle cellule microgliali che gioca un ruolo importante nella patogenesi e nella progressione di diverse malattie neurodegenerative ereditarie e acquisite, comprese le malattie da accumulo lisosomiale (LSD). L'effetto benefico della terapia genica ex vivo (GT) basata sull'uso di cellule staminali ematopoietiche (HSC) geneticamente modificate per queste condizioni si basa su cellule funzionalmente equivalenti alla microglia derivate dalle HSC geneticamente modificate trapiantate nel sistema nervoso centrale (SNC) del ricevente dove esercitano funzioni omeostatiche e di scavenging, normalizzano l'omeostasi delle cellule della microglia e riducono la neuroinfiammazione dopo il trattamento. Inoltre, nelle HSC GT per le LSD, le cellule simili alla microglia derivate dal trapianto, enzimaticamente capaci, geneticamente corrette, rilasciano il fattore terapeutico (l'enzima lisosomiale difettoso di interesse per ogni LSD) per essere disponibile per tutte le cellule residenti del SNC. Allo stesso modo, la consegna mediata dalla microglia di fattori immunomodulatori o altri fattori antiossidanti potrebbe essere esplorata per mitigare la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione.
Un vettore lentivirale (LV) ideale per questa strategia GT per le malattie neurodegenerative dovrebbe portare ad un'espressione regolata del transgene terapeutico nelle cellule simili alla microglia derivate dalle HSPC: sovraregolata in presenza di neuroinfiammazione e sottoregolata in condizioni omeostatiche del SNC. Tale modello trascrizionale ? tipico del gene umano HLA-DRA, che codifica per il dominio immunoglobulinico della catena a del complesso maggiore di istocompatibilit? (MHC-II) di classe II dell'antigene leucocitario di istocompatibilit?. Le molecole di classe II sono costitutivamente espresse ad un basso livello basale dalle cellule professionali che presentano l'antigene, come le cellule della microglia, e la loro espressione ? fortemente sovraregolata durante l'infiammazione (Jenny Pan-Yun Ting et al. Celi 2002).
Tuttavia, rimane la necessit? di sviluppare sequenze promotori, vettori di trasferimento genico, retrovirali, in particolare lentivirali, che permettano un'espressione efficiente e sufficiente dei transgeni.
Sommario dell?invenzione
Il problema tecnico posto e risolto dalla presente invenzione ? di fornire una sequenza promotore che permetta un controllo efficiente dell'espressione dei transgeni, in particolare nei tipi di cellule immunitarie, come ad esempio rilevanti cellule mieloidi/microglia associate al SNC derivate dal trapianto di HSC. Tale problema ? risolto da una sequenza promotore secondo la rivendicazione 1 della presente invenzione.
A seguito di un'analisi approfondita della regione regolatoria putativa del gene endogeno HLA-DRA umano, gli autori della presente invenzione hanno progettato in particolare un promotore sintetico che mira ad avere un'attivit? trascrizionale basale minima ed ad essere altamente inducibile all'attivazione delle cellule della microglia. Per divulgare gli elementi regolatori che controllano questo modello trascrizionale, gli inventori hanno analizzato la presunta regione regolatrice del gene HLA-DRA umano integrando i dati trascrizionali ed epigenetici pubblicamente disponibili prodotti dal Broad Institute-Encode Project in linee cellulari umane ematopoietiche (cellule K562) e non ematopoietiche. Con una profonda analisi in silico della regione genomica a monte e a valle del sito di inizio trascrizione HLA-DRA umano, hanno identificato regioni epigeneticamente marcate come promotori attivi ed enhancers attivi, legati da fattori di trascrizione ematopoietici specifici come indicato dalle mappe genomiche Chip-seq. La regione del promotore epigeneticamente identificata ? stata confermata dai dati RNA-seq.
Una volta identificata una presunta regione promotrice ampia, gli inventori l'hanno raffinata cercando motivi di DNA generali (TATA box) e specifici (Beresford G. W, Nat Immunol 2001), noti per regolare l'espressione del gene della Classe II, come: i) una W/S- e X1-box, che servono come sito di legame per il fattore di trascrizione multicomponente RFX che recluta il principale regolatore MHC II, cio? l'attivatore trascrizionale di Classe II (CIITA); ii) una X2- e Y-box, che agiscono come siti di legame per i fattori di trascrizione X2BP e NF-Y.
Questa analisi in silico ? stata eseguita con un software di analisi delle sequenze basato su motivi (The MEME Suite, Bailey TL et al., Nucleic Acids Res. 2015), utilizzando come riferimento le sequenze S-, X- e Y-box pubblicate in Beresford et al (Beresford G.W, Nat Immunol 2001). Una presunta regione promotore HLA-DRA core ? stato cos? identificato e adattato al sistema lentivirale per generare un promotore sintetico finale HLA-DRA (d'ora in poi, hHLA). Il promotore basato su HLA-DRA dell'invenzione ? quindi progettato con una dimensione compatta, adatta a un sistema lentivirale.
Come chiaramente dimostrato dai risultati riportati nella sezione sperimentale della presente descrizione dettagliata, il nuovo promotore hHLA progettato e sviluppato dagli autori della presente invenzione, quando inserito in un vettore lentivirale per controllare l'espressione di un dato transgene in tipi di cellule immunitarie, ? in grado di indurre l'espressione genica, a livello di mRNA e proteine, in vitro e in vivo, anche in rilevanti cellule mieloidi/microglia associate al SNC, derivate dal trapianto di HSC.
Secondo una forma di realizzazione, la sequenza promotore dell'invenzione ? sintetizzata e clonata in un backbone LV standard per controllare l'espressione di un gene reporter biologicamente inattivo, la proteina fluorescente verde (GFP), per creare un LV reporter. Tale vettore ? attualmente in fase preclinica e ha dimostrato la capacit? di essere prodotto a titolo infettivo molto elevato, di trasdurre in modo efficiente e sicuro linee cellulari umane e cellule staminali primarie ematopoiertiche/cellule progenitrici ematopoietiche (HSPC) in vitro, e di trasdurre e guidare un alto livello di espressione del transgene in vivo in HSC ripopolate a lungo termine in un saggio di trapianto eseguito su topi wildtype.
La capacit? della sequenza promotore dell'invenzione di rispondere all'attivazione delle cellule immunitarie aumentando il suo livello trascrizionale ? attualmente oggetto di studio nelle cellule umane della microglia. In particolare, il nuovo promotore hHLA dell'invenzione pu? indurre un'elevata espressione del transgene in vivo, in cellule mieloidi/della microglia derivate da HSPC trapiantate, suggerendo la sua capacit? di mantenere il corretto profilo regolatorio durante la differenziazione delle cellule pluripotenti in cellule di microglia, non essendo soggetto a silenziamento epigenetico o altre forme di regolazione indesiderate.
Questo tipo di promotore pu? essere fortemente vantaggioso per approcci di terapia cellulare e genica che richiedano un livello basale di espressione di proteine terapeutiche che aumentano in presenza di neuroinfiammazione, uno stato patologico tipico di molteplici malattie neurodegenerative gravi, ereditate o acquisite, dell'infanzia e dell'et? adulta.
I risultati ottenuti dagli autori della presente invenzione quindi sostengono fortemente l'uso di questo nuovo promotore hHLA per scopi terapeutici, per determinare un'espressione regolata di molecole terapeutiche o immuno-modulatorie in approcci di terapia genica e cellulare per trattare condizioni patologiche del SNC, in particolare per quelle caratterizzate da neuroinfiammazione.
?, quindi, foma della presente invenzione:
- Una sequenza promotore comprendente o costituita da una sequenza polinucleotidica avente SEQ ID NO:1 o che condivide pi? del 90%, preferibilmente pi? del 95%, ancora pi? preferibilmente pi? del 99% di identit? con la sequenza di SEQ ID NO: 1 ;
- Un vettore di trasferimento genico, in particolare un vettore lentivirale, comprendente la sequenza promotore secondo una delle forme di realizzazione come definite nella presente descrizione dettagliata e nella rivendicazione 1 ;
- Una particella di vettore virale comprendente la sequenza promotore o il vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione come definite nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni;
- Una cellula ospite isolata comprendente la sequenza promotore, o il vettore, o la particella del vettore virale secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione come definito nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni;
- Una cellula ospite isolata infettata o trasdotta con il vettore di trasferimento genico o una particella secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione come definite nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni;
- Una composizione farmaceutica che comprende il vettore di trasferimento genico, o una particella, o la cellula secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione come definite nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni, e uno o pi? eccipienti o diluenti o vettori;
- Un vettore di trasferimento genico, una particella, una composizione farmaceutica, una cellula secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione definite nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni per l'uso come medicamento o vaccino, per l'uso in una terapia genica, per l'uso nella terapia staminale ematopoietica, e/o per trattare una condizione patologica del SNC, in particolare una condizione patologica del SNC caratterizzata da neuroinfiammazione;
- Uso in vitro di un vettore di trasferimento genico, o di una particella secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte nella presente descrizione dettagliata e nelle rivendicazioni, per regolare l'espressione di un transgene in una cellula ospite, in particolare in una cellula staminale ematopoietica o una cellula progenitrice ematopoietica.
Le caratteristiche preferite della presente invenzione sono oggetto delle rivendicazioni dipendenti. Ulteriori caratteristiche e vantaggi dei vari aspetti della presente invenzione diventeranno evidenti con seguente descrizione dettagliata delle sue forme di realizzazioni preferite, insieme alle figure di accompagnamento. Le forme di realizzazione preferite hanno lo scopo di spiegare ed esemplificare alcuni aspetti della presente invenzione, ma non devono essere interpretate come limitanti l'ambito di protezione.
Breve descrizione dei disegni
La presente invenzione e la seguente descrizione dettagliata delle forme di realizzazione preferite possono essere meglio comprese con riferimento alle figure seguenti:
- Figura 1: Identificazione dei presunti elementi di regolazione trascrizionale di HLA-DRA. Dall'alto, le barre blu indicano il corpo del gene HLA-DRA, le barre arancioni e rosse indicano le regioni con segno distintivo, tipo enhancer e promotore, dall'analisi ENCODE cCREs, in rosa sono i picchi delle modifiche degli istoni o del legame con la RNA polimerasi II, e le barre grigie in basso indicano i siti di legame di specifici fattori di trascrizione.
- Figura 2: Elementi regolatori nella regione prossimale del promotore HLA-DRA. A) vista schematica del regoloma che opera a livello del promotore HLA-DRA; B) l'output dell'analisi MEME, in cui la presunta cassetta S-X-Y ? indicata come elemento arancione-blu-rosso. Il motivo di consenso del DNA corrispondente ? indicato in basso a sinistra.
- Figura 3: cellule umane HEK293T trasdotte con quantit? crescenti di hHLA-GFP. Nella parte superiore di ogni dot plot ? mostrata la quantit? di preparazione virale usata per trasdurre le cellule bersaglio, espressa in mi. Sull'asse X ? tracciato il segnale GFP (FITC).
- Figura 4: espressione GFP in vivo guidata dal promotore hlHLA. A) vista schematica della strategia di gating utilizzata per determinare la frazione di cellule CD11b , CD45.1 e GFP nelle cellule derivate nei topi trapiantati; b) chimerismo del donatore della cellula (a sinistra), percentuale di CD1 1 b CD45 / GFP cellule mieloidi / microgliali (centro), e media dell'intensit? di fluorescenza (MFI, a destra) in tutta la serie di tre topi trapiantati per gruppo di vettori.
Descrizione dettagliata delle forme di realizzazione preferite
In seguito, saranno descritte diverse forme di realizzazione dell'invenzione. ? inteso che le caratteristiche delle varie forme di realizzazione possono essere combinate, se compatibili. In generale, le forme di realizzazione successive saranno divulgate solo rispetto alle differenze con quelle descritte in precedenza.
Se non diversamente definito, tutti i termini tecnici e scientifici qui utilizzati hanno lo stesso significato di quello comunemente inteso da coloro che hanno un'abilit? ordinaria nel campo tecnico a cui appartiene l'invenzione.
Sequenza promotore
"Promotore" e "sequenza promotore" sono usati in modo intercambiabile e si riferiscono a una sequenza di DNA in grado di controllare l'espressione di una sequenza codificante o di un RNA funzionale. In generale, una sequenza codificante si trova in 3' rispetto ad una sequenza promotore. Un promotore pu? essere derivato nella sua interezza da un gene nativo, pu? essere composto da diversi fattori derivati da diversi promotori trovati in natura, o pu? contenere segmenti di DNA sintetici.
Secondo un aspetto della presente invenzione viene fornita una sequenza promotore comprendente o costituita da una sequenza polinucleotidica avente SEQ ID NO:1.
Secondo un aspetto della presente invenzione viene fornita una sequenza promotore che condivide pi? del 90%, preferibilmente pi? del 95%, ancora pi? preferibilmente pi? del 98% e ancora pi? preferibilmente pi? del 99% di identit? con la sequenza di SEQ ID NO:1. Resta inteso che diverse mutazioni nella sequenza promotore possono essere introdotte a condizione che non compromettano la capacit? del promotore di svolgere le funzioni qui descritte.
"Percentuale (%) di identit? di sequenza" come usato qui rispetto a una sequenza polinucleotidica di riferimento ? definita come la percentuale di acidi nucleici in una sequenza candidata che sono identici agli acidi nucleici nella sequenza polinucleotidica di riferimento, dopo l'allineamento delle sequenze e l'introduzione di spazi, se necessario, per raggiungere la massima identit? di sequenza percentuale. L'allineamento ai fini della determinazione dell'identit? di sequenza percentuale dell'acido nucleico o dell'aminoacido pu? essere realizzato in vari modi che sono atra le capacit? di una persona esperta del settore, per esempio, usando un software pubblicamente disponibile come BLAST, BLAST-2, o il Megalign software. Le persone esperte del settore possono determinare i parametri adatti per allineare le sequenze, compresi tutti gli algoritmi necessari per ottenere l'allineamento massimo che comprendano la lunghezza totale delle sequenze che sono confrontate. Per esempio, i valori di identit? di sequenza percentuale possono essere generati usando il programma informatico di confronto di sequenza BLAST.
Secondo una forma di realizzazione la sequenza promotore ? una sequenza sintetica.
L'invenzione comprende inoltre una sequenza di mRNA comprendente o costituita da SEQ ID NO:2 o una sequenza di mRNA con pi? del 98%, pi? preferibilmente pi? del 99% di identit? con la sequenza di SEQ ID NO:2.
Vettore di trasferimento genico/vettore lentivirale
Secondo un aspetto della presente invenzione ? fornito un vettore di trasferimento genico per l'uso nella terapia genica comprendente la sequenza promotore dell'invenzione.
Secondo una forma di realizzazione il vettore di trasferimento genico comprende anche la sequenza nucleonica, che ? un transgene, in particolare comprendente una sequenza del transgene, sotto il controllo trascrizionale di detta sequenza promotore.
I vettori di espressione qui descritti comprendono regioni di acido nucleico contenenti sequenze in grado di essere trascritte. Pertanto, sequenze che codificano mRNA, tRNA e rRNA sono incluse in questa definizione.
Un vettore ? uno strumento che permette o facilita il trasferimento di un'entit? da un ambiente a un altro. A titolo esemplificativo, alcuni vettori usati nelle tecniche di DNA ricombinante permettono ad entit?, come un segmento di DNA (come un segmento di DNA eterologo, come un segmento di cDNA eterologo), di essere trasferiti in una cellula bersaglio. Opzionalmente, una volta all'interno della cellula bersaglio, il vettore pu? poi servire a mantenere il DNA eterologo all'interno della cellula o pu? agire come unit? di replicazione del DNA. Esempi di vettori usati nelle tecniche di DNA ricombinante includono plasmidi, cromosomi, cromosomi artificiali o virus.
In particolare, il termine "plasmide", come qui usato, si riferisce a una molecola di DNA a doppio filamento circolare extracromosomico in cui possono essere legati ulteriori segmenti di DNA. Un plasmide ? un tipo di vettore, una molecola di acido nucleico capace di trasportare un altro acido nucleico al quale ? stato legato. Alcuni plasmidi sono in grado di replicarsi autonomamente in una cellula ospite in cui sono introdotti (ad esempio, plasmidi batterici che hanno un'origine batterica di replicazione e plasmidi episomali di mammiferi). Altri vettori (ad esempio, vettori non episomali di mammiferi) possono essere integrati nel genoma di una cellula ospite al momento dell'introduzione nella cellula ospite, e quindi vengono replicati insieme al genoma ospite. Alcuni plasmidi sono in grado di dirigere l'espressione dei geni a cui sono operativamente legati.
I sistemi di consegna non virali includono ma non sono limitati ai metodi di trasfezione del DNA. Qui, la trasfezione include un processo che utilizza un vettore non virale per consegnare un gene a una cellula di mammifero bersaglio.
Secondo una forma di realizzazione il vettore di trasferimento genico ? un vettore virale, come un vettore lentivirale o virale adeno-associato, o ? un vettore non virale.
Esempi adatti di vettori non virali di trasferimento genico che potrebbero essere impiegati secondo la presente invenzione includono tutti i vettori non virali di trasferimento genico basati su elementi trasponibili, come il sistema di trasposoni sleeping beauty o il sistema di trasposoni PiggyBac.
Secondo una forma di realizzazione preferita il vettore di trasferimento genico ? derivabile da un lentivirus, in particolare ? un vettore lentivirale.
Nel contesto di questa invenzione, per "vettore lentivirale" si intende anche un vettore non replicante per la trasduzione di una cellula ospite con un transgene comprendente sequenze di RNA o DNA lentivirali ad azione cis e che richiede proteine lentivirali che sono fomite in trans. Il vettore lentivirale pu? essere presente nella forma di una molecola di RNA o di DNA, a seconda della fase di produzione o di sviluppo di detti vettori retrovirali.
Il vettore lentivirale pu? essere nella forma di una molecola di DNA ricombinante, come un plasmide. Il vettore lentivirale pu? essere nella forma di vettore di particella lentivirale, come una molecola di RNA all'interno di un complesso di proteine lentivirali e altre proteine. Tipicamente, i vettori di particelle lentivirali, che corrispondono a particelle di lentivirus modificate o ricombinanti, comprendono un genoma che ? composto da due copie di RNA a singolo filamento. Queste sequenze di RNA possono essere ottenute per trascrizione da una sequenza di DNA a doppio filamento inserita nel genoma di una cellula ospite (vettore provirale a DNA ) o possono essere ottenute dall'espressione transitoria di DNA plasmidico (vettore plasmidico a DNA) in una cellula ospite trasformata.
I vettori lentivirali derivano da lentivirus, in particolare dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1 o HIV-2), dal virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV), dal virus dell'encefalite infettiva equina (EIAV), dal virus dell'artrite encefalite caprina (CAEV), dal virus dell'immunodeficienza bovina (BIV) e dal virus dell'immunodeficienza felina (FN), che sono modificati per rimuovere determinanti genetici coinvolti nella patogenicit? e per introdurre nuovi determinanti utili per ottenere effetti terapeutici.
Deve essere compreso che molte fonti diverse di vettori lentivirali possono essere utilizzate, e numerose sostituzioni e alterazioni in alcuni dei vettori lentivirali possono essere accomodate a condizione che non compromettano la capacit? del vettore di eseguire le funzioni qui descritte.
In varie forme di realizzazione, il vettore lentivirale comprende la sequenza promotore dell'invenzione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Secondo una forma di realizzazione, il vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte comprende una o pi? sequenze di geni reporter. Come qui usato, una "sequenza di gene reporter" ? qualsiasi sequenza genica che, quando espressa, risulta nella produzione di una proteina la cui presenza o attivit? pu? essere monitorata. Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, la sequenza del gene reporter codificher? un enzima o un'altra proteina che ? normalmente assente nella cellula bersaglio e la cui presenza pu?, quindi, stabilire definitivamente la presenza del vettore in tale cellula.
L'invenzione comprende inoltre metodi per produrre una particella di vettore lentivirale. Tali metodi possono comprendere gli step della trasfezione di una cellula ospite adatta con il vettore lentivirale; la trasfezione della cellula ospite con un vettore plasmidico di imballaggio contenente sequenze di DNA virale che codificano almeno le proteine strutturali e integrasi di un retrovirus; la coltura di detta cellula ospite trasfettata per ottenere l'espressione e l'imballaggio di detto vettore lentivirale in particelle di vettore lentivirale; e la raccolta delle particelle di vettore lentivirale risultanti dall'espressione e dall'imballaggio in dette colture di cellule ospiti.
L'invenzione comprende inoltre particelle di vettore lentivirale comprendenti il vettore lentivirale dell'invenzione. La particella del vettore lentivirale pu? comprendere una sequenza di transgene sotto il controllo del promotore dell'invenzione. Preferibilmente, la sequenza promotore comprende una sequenza polinucleotidica che condivide pi? del 90%, preferibilmente pi? del 95%, ancora pi? preferibilmente pi? del 99% di identit? con la sequenza promotore di SEQ ID NO:1.
L'invenzione comprende ulteriormente un metodo per la produzione di un vettore lentivirale comprendente l'introduzione del set dei costrutti di DNA qui trattati in una cellula ospite, e l'ottenimento della particella virale del vettore, secondo una forma di realizzazione tale metodo comprende gli step di:
a) trasfezione di una cellula ospite adatta con il vettore lentivirale secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte;
b) coltura di detta cellula ospite trasfettata per ottenere l'espressione e il confezionamento di detto vettore lentivirale in particelle di vettore lentivirale; e
d) raccolta delle particelle di vettori lentivirali risultanti dall'espressione e dal confezionamento dello step c) in dette cellule ospiti in coltura.
I vettori lentivirali secondo l'invenzione possono essere direttamente somministrati a un paziente attraverso le vie di somministrazione note, comprese quelle sistemiche, locali, o cutanee, intradermiche, per esempio quella intratumorale. Nel presente documento, i termini "somministrare", "amministrazione" e simili si riferiscono alla somministrazione diretta al paziente di un agente terapeutico (ad esempio, un vettore lentivirale o una popolazione di cellule ospiti modificate oggetto dell'invenzione) attraverso una qualsiasi via efficace.
Anche la somministrazione ex vivo, per esempio la trasduzione ex vivo di cellule bersaglio seguita dalla somministrazione delle cellule trattate al paziente da trattare, ? compresa nell'invenzione.
Transgene
Nel contesto della presente invenzione, un "transgene" pu? essere una sequenza di acido nucleico all'interno di un vettore di trasferimento genico, in particolare un vettore lentivirale che non ? normalmente presente o non ? correttamente espresso in una cellula da trasdurre con il vettore di trasferimento genico, in particolare un vettore lentivirale. Il vettore lentivirale serve a introdurre questa sequenza nella cellula trasdotta. Il termine "transgene" non comprende quelle sequenze del vettore che facilitano la trasduzione del transgene. Il transgene pu? essere una molecola di acido nucleico senso o antisenso. Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione, il transgene ? una sequenza di acido nucleico esogeno. Come usato qui, il termine "esogeno" descrive la sequenza dell'acido nucleico che non si trova naturalmente in un organismo particolare (per esempio, un umano) o in una posizione particolare all'interno di un organismo (per esempio, un organo, un tessuto o una cellula, come una cellula umana) o uno che ? stato aggiunto a una cellula, quindi nel contesto della presente invenzione, il transgene esogeno ? quello che ? stato introdotto nella cellula o in una cellula madre precursore da cui la cellula ha origine (ad esempio cellula della microglia da una HSPC modificata).
Secondo una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, la sequenza transgenica codifica un polipeptide, in particolare un polipeptide terapeutico o un enzima, in cui detto enzima ? selezionato ad esempio dal gruppo degli enzimi lisosomiali o catalitici, molecole coinvolte nella modulazione dell'infiammazione o della risposta immunitaria, un fattore di crescita/trofico, una loro combinazione o altri.
Secondo alcune forme di realizzazione, detto transgene codifica un polipeptide che fornisce benefici curativi, preventivi o migliorativi a un soggetto diagnosticato o sospetto di soffrire di una condizione patologica del sistema nervoso centrale (SNC), pi? in particolare una condizione patologica del SNC caratterizzata da neuroinfiammazione.
Secondo una forma di realizzazione, la sequenza promotore qui descritta ? "operativamente collegata" al transgene. Il termine "operativamente collegato" significa che i componenti descritti sono in un rapporto che permette loro di funzionare nel modo previsto.
Cellula ospite
L'invenzione comprende inoltre una cellula ospite isolata comprendente la sequenza promotore o il vettore di trasferimento genico, in particolare un vettore lentivirale dell'invenzione.
Secondo un altro aspetto dell'invenzione, viene fornita una cellula infettata o trasdotta con il vettore di trasferimento genico o la particella secondo la presente invenzione. La cellula pu? essere trasdotta o infettata in vivo o in vitro, utilizzando qualsiasi approccio gi? noto dallo stato dell'arte.
Se trasdotto o infettato in vitro, per esempio, le cellule destinatane desiderate potrebbero essere rimosse da un soggetto bisognoso di terapia, trasdotte o infettate con il vettore di trasferimento genico o la particella secondo la presente invenzione, e reintrodotte nel soggetto. Le cellule trasdotte in vitro possono essere esaminate per quelle cellule che ospitano i geni di interesse usando tecniche convenzionali come Southern blot e/o PCR, o usando marcatori selezionabili. Le cellule trasdotte o infettate con successo dovrebbero quindi essere in grado di esprimere il gene o un altro polinucleotide introdotto e/o l'acido nucleico del vettore virale o parte di esso nella cellula.
Le cellule trasdotte o infettate possono poi essere formulate in composizioni farmaceutiche, e le composizioni introdotte nel soggetto con varie tecniche come descritto pi? avanti, in una o pi? dosi.
La cellula pu? derivare da o far parte di un animale, preferibilmente un mammifero, pi? preferibilmente un essere umano. Le cellule ospiti secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte possono particolarmente derivare da un individuo sano o da un individuo con una malattia da trattare, come un individuo con una malattia o un disturbo diagnosticato.
Le cellule adatte alla trasduzione/trasfezione e alla somministrazione nei metodi di terapia genica dell'invenzione includono, ma non sono limitate, alle cellule staminali, alle cellule progenitrici e alle cellule differenziate.
Secondo una forma di realizzazione la cellula ? una cellula staminale ematopoietica o una cellula progenitrice ematopoietica. Il termine "cellula staminale ematopoietica" o "HSC" si riferisce a cellule staminali multipotenti che hanno la capacit? di autorinnovarsi e di differenziarsi in cellule mature del sangue di diversi lignaggi, inclusi ma non limitati a granulociti (ad esempio, promielociti, neutroni, eosinofili, basofili), eritrociti (ad esempio reticolociti, eritrociti), trombociti (per esempio, megacarioblasti, megacariociti produttori di piastrine, piastrine), monociti (per esempio, monociti, macrofagi), cellule dendritiche, microglia, osteoclasti e linfociti (per esempio, cellule NK, cellule B e cellule T). In forme di realizzazione preferite, le cellule sono cellule staminali ematopoietiche e/o progenitrici isolate dal midollo osseo, dal sangue del cordone ombelicale, dalla circolazione periferica (compreso il sangue periferico mobilizzato), dal sangue placentare, dal fegato fetale e dai tessuti molli linfoidi. Inoltre, le HSC si riferiscono anche alle HSC ripopolanti a lungo termine (LT-HSC) e alle HSC ripopolanti a breve termine (ST-HSC). LT-HSC e ST-HSC sono differenziate, in base al potenziale funzionale e all'espressione dei marcatori di superficie cellulare. Ognuna di queste HSC pu? essere utilizzata in uno qualsiasi dei metodi qui descritti.
Le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) sono discendenti delle HSC in grado di differenziarsi ulteriormente per diventare cellule specializzate. Le cellule staminali che si autorinnovano producono altre cellule staminali, quelle che iniziano il percorso di differenziazione producono cellule progenitrici. Una popolazione comprendente HSCs e/o HPCs ? qui definita come HSPCs.
La cellula ospite potrebbe anche essere una cellula della microglia (cio? trasdotta direttamente dal trasferimento genico in vivo) o un monocita/macrofago, anche per applicazioni extra-SNC. Con il termine "microglia", come qui usato, si intende una cellula immunitaria del sistema nervoso centrale.
Il promotore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione della presente invenzione dovrebbe essere altamente espresso anche nei monociti circolanti e nei macrofagi.
In particolari forme di realizzazione, le cellule trasdotte o trasfettate possono essere somministrate a un soggetto che ne ha bisogno secondo la presente invenzione per mezzo di un trapianto, ad esempio, come parte di un trapianto di midollo osseo.
Secondo una forma di realizzazione preferita, l'invenzione fornisce cellule trasdotte o trasfettate che hanno il potenziale per svilupparsi in cellule della microglia del cervello. Secondo una forma di realizzazione, la cellula ? una cellula mieloide o della microglia derivata da cellule staminali/progenitrici ematopoietiche trapiantate.
Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione, viene fornito anche un metodo per produrre una popolazione di cellule ospiti, in particolare cellule staminali ematopoietiche, modificate per esprimere un transgene, in particolare un transgene condificante un polipeptide o un enzima terapeutico, il metodo comprendente il contatto di un campione di cellule ospiti con un vettore di trasferimento genico, una particella virale o una composizione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, in condizioni che permettano detto vettore, particella virale o composizione di trasdurre le cellule ospiti. In genere, il metodo viene eseguito ex vivo.
Secondo una forma di realizzazione, il metodo sopra descritto comprende ulteriormente una fase di determinazione per mezzo di analisi qualitativa e/o quantitativa dei livelli di espressione di detto transgene nella cellula ospite trasdotta. I termini "analisi qualitativa e/o quantitativa" sono intesi a comprendere qualsiasi tecnica standard o saggi disponibili nell'arte nota, che sarebbero adatti per la determinazione e/o quantificazione dei livelli di espressione del transgene di interesse. Esempi non limitativi di saggi adatti a determinare e/o quantificare i livelli di espressione di uno qualsiasi dei suddetti marcatori includono un saggio immunologia), un saggio basato su aptameri, un saggio istologico o citologico, un saggio dei livelli di espressione di RNA o una loro combinazione. Tutti i test sopra indicati sono noti a una persona esperta nel settore che, conoscendo il transgene la cui espressione deve essere determinata e/o quantificata e il tipo di cellule utilizzate, sar? in grado di selezionare il protocollo pi? adatto.
Secondo una forma di realizzazione preferita, i livelli di espressione del transgene possono essere determinati misurando la concentrazione o l'abbondanza relativa di un prodotto polipeptidico e/o enzimatico corrispondente codificato dal gene di interesse. I saggi di espressione proteica adatti all'uso con le composizioni e i metodi qui descritti includono approcci proteomici, analisi di immunoistochimica e/o western blot, immunoprecipitazione, saggi di legame molecolare, ELISA, saggio di immunofiltrazione legato aN'enzima (ELIFA), spettrometria di massa, saggio immunologico di spettrometria di massa e saggi biochimici di attivit? enzimatica.
Composizioni
Secondo un altro aspetto dell'invenzione viene fornita una composizione farmaceutica comprendente il vettore di trasferimento genico o la particella o la cellula ospite secondo la presente invenzione insieme a un diluente, un eccipiente o un vettore accettabile in campo farmaceutico. L'invenzione inoltre comprende tali composizioni per uso come medicamento, in particolare nella terapia genica, pi? in particolare nella terapia genica ex vivo e/o in vivo.
La presente invenzione inoltre fornisce una composizione farmaceutica per il trattamento di un individuo tramite terapia genica, in cui la composizione comprende una quantit? terapeuticamente efficace del vettore della presente invenzione comprendente uno o pi? transgeni terapeutici e/o diagnostici da somministrare o una particella virale prodotta o ottenuta dallo stesso. La composizione farmaceutica pu? essere preferibilmente per uso umano. La composizione pu? facoltativamente comprendere un trasportatore, un diluente, un eccipiente o un adiuvante accettabile in campo farmaceutico.
Come usato qui, un "vettore accettabile in campo farmaceutico" include qualsiasi e tutti i solventi, mezzi di dispersione, rivestimenti, agenti antibatterici e antimicotici, agenti isotonici e ritardanti dell'assorbimento, purch? siano fisiologicamente compatibili, compresi i mezzi di coltura cellulare accettabili in campo farmaceutico. La scelta del vettore farmaceutico, dell'eccipiente o del diluente pu? essere in relazione alla via di somministrazione prevista e alla pratica farmaceutica standard. Possono essere iniettati pervia parenterale, ad esempio pervia intra-cavemosa, endovenosa, intraparenchimale nel SNC, nel liquido cerebrospinale (intra-cerebrale ventricolare o intratecale), intramuscolare o sottocutanea. Per la somministrazione parenterale, le composizioni possono essere meglio utilizzate sotto forma di una soluzione acquosa sterile che pu? contenere altre sostanze, per esempio abbastanza sali o monosaccaridi per rendere la soluzione isotonica con il sangue.
Le soluzioni iniettabili sterili possono essere preparate incorporando i composti attivi dell'invenzione nella quantit? richiesta del solvente appropriato con i vari altri ingredienti enumerati sopra, come richiesto, seguiti da sterilizzazione per filtrazione.
La persona esperta pu? facilmente determinare le quantit? di vettori genici, particelle virali o cellule e additivi opzionali, veicoli e/o vettori nelle composizioni da somministrare. In particolare, la quantit? di cellule secondo la presente invenzione da somministrare a un soggetto bisognoso di terapia e la via di somministrazione possono dipendere da una serie di fattori come, per esempio, dal livello di espressione della proteina o delle proteine desiderate nelle cellule, dalla percentuale di cellule trasdotte con successo, dal numero di copie del vettore (VCN), dall'et? del paziente, dal peso corporeo, dal sesso, dai metodi di formulazione farmaceutica, nonch? dalla gravit? della malattia da trattare.
Le composizioni devono essere stabili nelle condizioni di produzione e di conservazione e devono essere preservate dall'azione contaminante di microrganismi, come batteri e funghi. Le composizioni possono essere presentate in contenitori sigillati monodose o multidose, come fiale e flaconi.
Se lo si desidera, le composizioni dell'invenzione possono essere somministrate anche in combinazione con altri agenti, come, ad esempio, altre proteine, polipeptidi, piccole molecole o vari agenti farmacologicamente attivi. Non c'? praticamente alcun limite ad altri componenti che possono anche essere inclusi nelle composizioni, a condizione che gli agenti aggiuntivi non influenzino negativamente la capacit? della composizione di fornire la terapia genica prevista.
Terapia
L'invenzione ulteriormente comprende il vettore di trasferimento genico, la particella virale, la composizione farmaceutica, la cellula ospite secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte per l'uso come medicamento, in particolare per l'uso in una terapia genica, preferibilmente per l'uso nella terapia genica ex vivo e/o in vivo, pi? preferibilmente per l'uso nella terapia cellulare ematopoietica con cellule staminali/progenitrici. In particolare, per il trattamento di una condizione patologica del sistema nervoso centrale (SNC), pi? in particolare una condizione patologica del SNC caratterizzata da neuroinfiammazione. Secondo una particolare forma di realizzazione, il vettore di trasferimento genico, la particella virale o le composizioni farmaceutiche secondo una qualsiasi delle forme di realizzazioni qui descritte potrebbero essere utilizzate per la trasduzione in vivo delle cellule della microglia per mezzo di trasferimento genico intra-parenchimale o intra-cerebrale ventricolare o intratecale.
La presente invenzione contempla che i vettori di trasferimento genico, le particelle virali, le composizioni farmaceutiche, le cellule ospiti secondo qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte possono anche essere usati per prevenire e/o migliorare una condizione patologica del SNC. L'espressione "migliorare una condizione patologica", come usato qui, significa che l'estensione e/o le manifestazioni cliniche indesiderate della malattia, del disturbo o della condizione sono diminuite e/o il corso del tempo della progressione ? rallentato o allungato, rispetto all'estensione o al corso del tempo in assenza di trattamento.
L'invenzione comprende inoltre il vettore di trasferimento genico, la particella virale, la composizione farmaceutica, la cellula ospite secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte per il trattamento di una malattia scelta tra malattie neurodegenerative ereditarie o acquisite (ad esempio, disturbi di stoccaggio lisosomiale come la leucodistrofia metacromatica (MLD), leucodistrofia a cellule globoidi (GLD), gangliosidosi GM1, gangliosidosi GM2, mucopolisaccaridosi (MPSs) eco, disturbi perossisomici come l'adrenoleucodistrofia legata al X (X-ALD), l'adrenomieloneuropatia (AMN) eco., condizioni neurodegenerative acquisite ad insorgenza adulta come il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Parkinson (PD), la demenza frontotemporale (FTD), la sclerosi multipla (MS) eco.)
L'invenzione comprende anche un metodo di trattamento di un soggetto comprendente la fase di somministrazione in detto soggetto del vettore di trasferimento genico, della particella virale, della composizione farmaceutica o della cellula ospite secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
? anche qui esposto un metodo di trattamento di un soggetto che comprende le seguenti fasi:
- determinare se un soggetto soffre di una condizione patologica del sistema nervoso centrale; e
- se il soggetto ? affetto da tale condizione, somministrare a tale soggetto il vettore di trasferimento genico, la particella virale, la composizione farmaceutica o la cellula ospite secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
In alcune forme di realizzazione, il soggetto sottoposto a trattamento ? il donatore che fornisce le cellule (ad esempio, cellule staminali ematopoietiche e/o cellule progenitrici) che vengono successivamente modificate secondo uno dei metodi precedentemente descritti, prima di essere risomministrate al soggetto. In questi casi, le cellule prelevate (ad esempio, HSPC) possono essere re-infuse nel soggetto dopo, ad esempio, l'incorporazione di un transgene che codifica un polipeptide o un enzima terapeutico secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione discusse nella presente descrizione dettagliata. Nei casi in cui il soggetto sottoposto a trattamento serve anche come donatore di cellule, le cellule trapiantate hanno meno probabilit? di subire il rigetto dell'innesto.
In alternativa, il soggetto sottoposto a detto trattamento e il donatore di cellule possono essere diversi.
Fa anche parte della presente invenzione l'uso in vitro di un vettore di trasferimento genico o di una particella secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte nella presente descrizione dettagliata, per regolare l'espressione di un transgene in una cellula ospite, in particolare in una cellula staminale ematopoietica o in una cellula progenitrice ematopoietica. Secondo una forma di realizzazione preferita, detto vettore di trasferimento genico o particella sono usati per sovraregolare specificamente l'espressione di detto transgene in presenza di neuroinfiammazione e sottoregolarlo in condizioni omeostatiche del SNC in detta cellula ospite. I termini "sovraregolato", come usati qui, si riferiscono a un livello di trascrizione dell'mRNA aumentato rispetto alla stessa espressione generalmente determinata in uno stato sano e/o rispetto allo standard.
Avendo cos? descritto diverse forme di realizzazione della presente invenzione, dovrebbe essere notato da coloro che sono esperti nel settore che le descrizioni sono solo esempi e che varie altre alternative, adattamenti e modifiche possono essere fatte nell'ambito della portata della presente invenzione. Di conseguenza, la presente invenzione non ? limitata alle forme di realizzazione specifiche come qui descritte.
Di seguito sono riportati degli esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio le forme di realizzazione descritte nella presente descrizione, tali esempi non sono in alcun modo da considerarsi una limitazione della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.
Esempi
Esempio 1 - Progettazione di un nuovo promotore basato sulla presunta regione di regolazione di HLA_DRA umana
Diversi cluster di presunti elementi regolatori trascrizionali sono stati identificati nella regione genomica intorno al Transcriptional Start Site (TSS) di HLA-DRA umano sul cromosoma 6, integrando i dati trascrizionali ed epigenetici pubblicamente disponibili prodotti dal Broad Institute-Encode Project in cellule umane. Sono stati identificati quattro enhancer attivi come regioni arricchite in modifiche istoniche H3K4me1 e H3K27ac e legate da fattori di trascrizione ematopoietici specifici, come indicato dalle mappe genomiche Chip-seq (Figura 1), e una regione epigeneticamente contrassegnata come promotore attivo da picchi di H3K4me3, H3K27ac e legata alla polimerasi-II, accoppiata a evidenze di trascrizione attiva di dati RNA-seq. Queste regioni genomiche sono state ulteriormente definite come Enhancer- e Promoter- Like Signature (arancione e rosso barra orizzontale in Figura 1), dall'analisi del candidato ENCODE Cis-Regulatory Elements (cCREs).
Una volta identificata una vasta regione come presunto promotore HLA-DRA, la regione genomica corrispondente da "The UCSC Genome Browser" (https://genome.ucsc.edu/) ? stato ottenuto e analizzato in dettaglio per identificare i motivi chiave dei motivi di DNA regolatori W/S-, X- e Y-box (Figura 2A). Sono state definite due sequenze da analizzare, una breve costituita dalla regione pi? prossimale al TSS di HLA-DRA (Figura 2B, HLA-DRA-SHORT), o una versione estesa, comprendente i picchi di segni epigenetici (Figura 2B, HLA-DRA-LONG). Queste sequenze genomiche sono state analizzate con MEME Suite per identificare le caselle S, X e Y basali, utilizzando le sequenze pubblicate in Beresford et al. (Figura 2B). Dall'analisi, la sequenza HLA-DRA-SHORT conteneva l'intera cassetta W/S-X-Y, ed ? stata scelta per un'ulteriore ottimizzazione della sequenza per generare un promotore sintetico basato su HLA-DRA da usare in un sistema lentivirale per riprodurre la corretta regolazione trascrizionale di HLA-DRA. Gli inventori hanno lavorato a lungo sulla sequenza HLA-DRA-SHORT per eliminare tutti i segnali canonici e criptici di poliadenilazione, che potrebbero portare al blocco prematuro della produzione del genoma lentivirale nelle cellule packaging, e i segnali di splicing che potrebbero indurre alterazioni trascrizionali nelle cellule trasdotte da eventi di trans-splicing che si verificano tra il provirus integrato e il genoma ospite. Dopo le ottimizzazioni della sequenza, il promotore sintetico finale basato su HLA-DRA (hHLA) ? risultato lungo 361 pb.
Esempio 2 - Produzione di vettori lentivirali che che portano il nuovo promotore hHLA per guidare l'espressione di GFP
Il promotore hHLA ? stato sintetizzato da Genewiz (Lispia, Germania), e clonato in un backbone lentivirale standard autoattivante per guidare l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) per generare il LV.hHLA.GFP (hHLA-GFP). Come vettore di controllo, ? stato usato un costrutto identico che porta un promotore forte e costitutivo di fosfato glicerato chinasi umana (PGK) per guidare l'espressione della GFP (hPGK-GFP). Le particelle lentivirali sono state prodotte dal sistema lentivirale di terza generazione mediante trasfezione transitoria di cellule HEK293T seguendo le procedure operative standard. I LV sono stati poi concentrati per ultracentrifugazione, risospesi in tampone fosfato salino (PBS) e conservati a -80?C fino all'utilizzo. I titoli infettivi del LV sono stati determinati come unit? di trasduzione per mi (TU/ml) di stock virale valutando il numero di copie del vettore risultante (VCN) in cellule HEK293T trasdotte con diluizioni seriali di ogni stock di LV, dopo due settimane in coltura. Il VCN ? stato determinato mediante digital droplet PCR (ddPCR). In diverse produzioni, tutti i LV potrebbero essere prodotti con un titolo infettivo generalmente superiore a 109 TU/ml.
Come mostrato nella Figura 3, il LV hHLA-GFP pu? trasdurre efficientemente i fibroblasti umani HEK293T determinando un aumento dell'espressione del transgene alfaumentare della quantit? di preparazione virale.
Esempio 3 - Valutazione dell'espressione di GFP guidata dal promotore hHLA in vivo
La capacit? del promotore hHLA di nuova concezione di regolare l'espressione di un transgene in vivo nel tipo di cellula e nell'organo clinicamente rilevante, rappresentato dalle cellule della microglia nel sistema nervoso centrale (SNC), ? stata studiata mediante un test di trapianto di HSPC in topi wild-type C57BL/6J. Dopo il trapianto di HSPC in topi riceventi completamente mieloablati, queste cellule sono in grado di ripopolare il SNC ricevente, sostituendo il compartimento originale di cellule mieloidi con cellule mieloidi/della microglia simili a quelle del donatore.
Il lignaggio negativo di HSPC (Lin-) ? stato raccolto dal midollo osseo (BM) di topi donatori CD45.1 e prima trasdotte con il vettore hHLA-GFP o hPGK-GFP, per 16 ore ad un MOI di 100. Dopo la trasduzione, le cellule sono state lavate e trapiantate in topi C57BL/6J riceventi completamente mieloablati CD45.2 (N=3 per LV) mediante somministrazione intracerebroventricolare (ICV). Parte delle cellule sono state mantenute in coltura due settimane per la determinazione VCN, che ? risultata comparabile per i due LV, ad un valore medio superiore di 10. Cinque giorni dopo la somministrazione ICV di cellule , i topi trapiantati hanno ricevuto per via endovenosa cellule BM totali per sostenere la ricostituzione ematopoietica sistemica.
Quarantacinque giorni dopo il trapianto, i topi che hanno ricevuto HSPC trasdotte con il LV hHLA-GFP (N=3) e i topi che hanno ricevuto HSPC trasdotte con il LV hPGK-GFP (N=3) sono stati sacrificati. I cervelli sono stati perfusi, raccolti ed elaborati in un omogenato di una singola cellula per essere analizzati per il chimerismo delle cellule del donatore e l'espressione di GFP mediante citofluorimetria. Le cellule mieloidi / della microglia sono state identificate dall'espressione di CD45 e CD11b (Figura 4A, a sinistra). Il chimerico del donatore di cellule ? stato determinato come la frazione di cellule CD45.1 rispetto CD45.2 nella popolazione totale delle cellule CD11b (Figura 4A, centro). Infine, la percentuale di LV cellule mieloidi /della microglia ? stato determinato quantificando l'espressione di GFP nella popolazione di cellule CD11bCD45.1 (Figura 4A, a destra).
Un livello comparabile di chimerico del donatore della cellula ? stato osservato nel cervello dei topi trapiantati con i due gruppi di cellule Lin-, sia trasdotto con il hHLA-GFP che il LV di controllo. Allo stesso modo, il vettore hHLA-GFP ha raggiunto un'efficienza di trasduzione comparabile al LV di controllo nelle cellule della microglia derivate da HSC (Figura 4B, centro). Infine, il promotore hHLA ha dimostrato di determinare un'alta espressione di GFP (Figura 4B, a sinistra), quantificata come MFI, nelle cellule della microglia in vivo, leggermente inferiore al promotore hPGK forte e costitutivo.
Conclusioni:
Qui ? stato dimostrato che il nuovo promotore hHLA che ? stato progettato e sviluppato, quando inserito in un vettore lentivirale per controllare l'espressione di un dato transgene in tipi di cellule immunitarie, ? in grado di indurre l'espressione genica, a livello di mRNA e proteine, in vitro e in vivo, anche in rilevanti cellule mieloidi/ della microglia associate al SNC derivate dal trapianto di HSC. Infatti, questo nuovo promotore hHLA pu? indurre un'elevata espressione transgenica in vivo, in cellule mieloidi/della microglia derivate da HSPC trapiantate, suggerendo la sua capacit? di mantenere il corretto profilo regolatorio durante la differenziazione da cellule pluripotenti in cellule della microglia, non essendo soggetto a silenziamento epigenetico o ad altre forme di regolazione indesiderata.
Questi risultati supportano fortemente l'uso di questo nuovo promotore hHLA per scopi terapeutici, per determinare un'espressione regolata di molecole terapeutiche o immunomodulanti in approcci di terapia genica e cellulare per trattare condizioni patologiche del SNC caratterizzate da neuroinfiammazione.
Lista delle sequenze parte della descrizione
SEQ ID No:1 - sequenza promotore hHLA
tcgatttccgaattccactatccctgtctagaagtcagattggggttaaagagtctgtccgtgattgactaacagtcttaaatacttgatttgttgtt gttgttgtcctgtttgtttaagaactttacttctttatccaatgaacggagtatcttgtgtcctggaccctttgcaagaacccttcccctagcaacag atgcgtcatctcaaaatatttttctgattggccaaagagtaattgatttgcattttaatggtcagactctattacaccccacattctcttttcttttattct tgtctgttctgcctcactcccgagctctactgactcccaacagagcgcccaagaagaaaacgc
SEQ ID No:2 - sequenza mRNA corrispondente al promotore hHLA
ucgauuuccgaauuccacuaucccugucuagaagucagauugggguuaaagagucuguccgugauugacuaacagucuua aauacuugauuuguuguuguuguuguccuguuuguuuaagaacuuuacuucuuuauccaaugaacggaguaucuugugu ccuggacccuuugcaagaacccuuccccuagcaacagaugcgucaucucaaaauauuuuucugauuggccaaagaguaau ugauuugcauuuuaauggucagacucuauuacaccccacauucucuuuucuuuuauucuugucuguucugccucacucccg agcucuacugacucccaacagagcgcccaagaagaaaacgc
Claims (17)
1. Sequenza promotore comprendente o costituita da una sequenza polinucleotidica avente sequenza SEQ ID: 1 o che condivida pi? del 90%, preferibilmente pi? del 95%, ancora pi? preferibilmente pi? del 99% di identit? con la SEQ ID:1.
2. Un vettore di trasferimento genico comprendente la sequenza promotore secondo la rivendicazione 1 .
3. Il vettore di trasferimento genico secondo la rivendicazione 2 in cui il vettore ? un vettore di trasferimento genico virale o non virale.
4. Il vettore di trasferimento secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detto vettore ? un vettore lentivirale o derivabile dal lentivirus.
5. Il vettore di trasferimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 comprendente una sequenza transgene, in cui detta sequenza transgene ? sotto il controllo trascrizionale di detta sequenza promotore.
6. Il vettore di trasferimento genico secondo la rivendicazione 5, in cui detto transgene codifica per un enzima, in particolare in cui detto enzima ? selezionato dal gruppo di enzimi lisosomiali o catalitici, molecole coinvolte nella modulazione dell'infiammazione o della risposta immunitaria, fattore di crescita/trofico o combinazioni di questi
7. Una particella di vettore virale comprendente la sequenza promotore secondo la rivendicazione 1 o il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6.
8. Cellula ospite isolata comprendete la sequenza promotore secondo la rivendicazione 1 o il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6 o la particella di vettore virale secondo la rivendicazione 7.
9. Una cellula ospite isolata infettata o trasdotta con il vettore di trasferimento genico o una particella vettore virale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6 o 7.
10. La cellula secondo la rivendicazione 8 o 9, la quale ? una cellula staminale ematopoietica o una cellula progenitrice ematopoietica.
11. Composizione farmaceutica comprendente il vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6 o la particella secondo la rivendicazione 7 o la cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10 e uno o pi? eccipienti o diluenti o vettori.
12. Un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, una particella secondo la rivendicazione 7, una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1 1. una cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 per l'uso come medicamento o vaccino.
13. Un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, una particella secondo la rivendicazione 7, una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 , una cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 per l?uso in una terapia genica, in particolare per l?uso nella terapia genica ex vivo e/o in vivo.
14. Un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, una particella secondo la rivendicazione 7, una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 , una cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 per l?uso nella terapia staminale ematopoietica.
15. Un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, una particella secondo la rivendicazione 7, una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, una cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 per il trattamento di una condizione patologica del SNC, in particolare una condizione patologica del SNC caratterizzata da neuroinfiammazione.
16. Un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, una particella secondo la rivendicazione 7, una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 , una cellula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 per il trattamento di una malattia scelta tra disordini di stoccaggio lisosomiale (LSDs), come la leucodistrofia metacromatica (MLD), la leucodistrofia a cellule globoidi (GLD), gangliosidosi GM1, gangliosidosi GM2, mucopolisaccaridosi (MPS) e altre LSD, disturbi perossisomici, come l?adrenoleicodistrofia legata all?X (X-ALD), adrenomieloneuropatia (AMN), e/o condizioni neurodegenerative acquisite ad insorgenza adulta, come il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi multipla (MS).
17. Uso in vitro di un vettore di trasferimento genico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6 o una particella secondo la rivendicazione 7 per regolare l?espressione di un trasgene in una cellula ospite, in particolare in una cellula staminale ematopoietica o una cellula progenitrice ematopoietica.
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