[go: up one dir, main page]

HUT77876A - A method for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity and vaccines containing them - Google Patents

A method for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity and vaccines containing them Download PDF

Info

Publication number
HUT77876A
HUT77876A HU9702303A HU9702303A HUT77876A HU T77876 A HUT77876 A HU T77876A HU 9702303 A HU9702303 A HU 9702303A HU 9702303 A HU9702303 A HU 9702303A HU T77876 A HUT77876 A HU T77876A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
bacterium
intestinal
shigella
intestinal bacterium
bacteria
Prior art date
Application number
HU9702303A
Other languages
Hungarian (hu)
Inventor
Steven M. Frey
John L. Pace
Richard I. Walker
Original Assignee
Antex Biologics Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/538,543 external-priority patent/US5681736A/en
Application filed by Antex Biologics Inc., filed Critical Antex Biologics Inc.,
Publication of HUT77876A publication Critical patent/HUT77876A/en

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/105Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/025Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/09Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/107Vibrio
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18Testing for antimicrobial activity of a material
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55555Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány olyan in vitro módszerekkel foglalkozik, melyekkel a bélbaktériumok antigénjeinek és/vagy virulenciafaktorainak a kifejeződését indukálhatjuk vagy fokozhatjuk, miáltal fokozott antigenitású bélbaktériumokat termelhetünk. Foglalkozik továbbá a találmány a fokozott antigenitású bélbaktériumok felhasználási eljárásaival és fokozott antigenaktivitású bélbaktériumokat tartalmazó vakcinákkal.The present invention relates to in vitro methods for inducing or enhancing the expression of antigens and / or virulence factors of intestinal bacteria, thereby producing intestinal bacteria with increased antigenicity. The invention further relates to methods of using intestinal bacteria with increased antigenicity and vaccines containing intestinal bacteria with increased antigenicity.

Általánosan ismert, hogy a szokásos táptalajon és körülmények között in vitro tenyésztett baktériumok tulajdonságai különböznek a természetes környezetükben növekvő - ideértve a normál mikroflóra vagy a kórokozók gazdaszervezetben in vivő történő - baktériumokétól. Ezért az in vitro tenyésztett kórokozó baktérimok alkalmatlanok lehetnek arra, hogy oltóanyagkomponens- ként alkalmazzuk őket. Ha azonban lehetővé válna, hogy meghatározzuk azokat a környezeti tényezőket, melyek a virulen-ciafaktorok vagy antigének - beleértve a külső felületi antigéneket - kifejeződését elindítják vagy fokozzák és megfelelő fiziológiai állapotot hoznak létre, akkor fontos termékek és terápiák (például a vakcinákhoz felhasználható új antigének, anti-biotikumok új célpontjai, a diagnosztikában felhasználható új bakteriális tulajdonságok) gyors felismerése történhetnek meg.It is generally known that bacteria grown in conventional culture media and conditions in vitro have properties that are different from those growing in their natural environment, including those of normal microflora or pathogens in vivo. Therefore, in vitro cultured pathogenic bacteria may be unsuitable for use as a vaccine component. However, if it would be possible to determine the environmental factors that trigger or enhance the expression of virulence factors or antigens, including external surface antigens, and produce an appropriate physiological state, important products and therapies (such as new antigens for use in vaccines, new targets of anti-biotics, new bacterial properties used in diagnostics) can be rapidly recognized.

Már azonosítottak néhány olyan környezeti tényezőt, amely hatással van a baktériumvirulencia meghatározóinak kifejeződésére [ Mekalanos, J. J., J. Bacteriol., 174:1-7 (1992)] . Például régóta kutatják már a baktériumok virulenciájának a vassal való összefüggését, különösen a Shigella [ Payne, Mól. Microbiol., 3:1301-1306 (1989), a Neisseria [Payne és Finkelstein, J. Clin.Some environmental factors that influence the expression of bacterial virulence determinants have already been identified (Mekalanos, J. J., J. Bacteriol., 174: 1-7 (1992)). For example, the association of bacterial virulence with iron has long been studied, particularly in Shigella [Payne, Mole. Microbiol., 3: 1301-1306 (1989), in Neisseria (Payne and Finkelstein, J. Clin.

• · · · • · • . · · ♦··.··· · .· ♦ _ 2 _ ......... :····»··• · · · • · •. · · ♦ ··. ··· ·. · ♦ _ 2 _ .........: ···· »··

Microbiol., 6:293-297 (1977)] és a Pasteurella [ Gilmour és munkatársai, Vaccine, 9:137-140 (1991)] esetében.Microbiol., 6: 293-297 (1977)] and Pasteurella (Gilmour et al., Vaccine, 9: 137-140 (1991)).

A növényekben és az állatokban élő baktériumok széles körénél kimutattak olyan más környezeti tényezőket is, amelyek befolyásolják a koordinativen szabályozott virulencia determinánsok kifejeződését. Ilyen tényezők a fenolos vegyületek, monoszaccharidok, aminosavak, a hőmérséklet, az ozmotikus körülmények és más ionok [ Mekalanos, J. Bacterial., 174:1-7 (1992)] .Other environmental factors that influence the expression of co-ordinately regulated virulence determinants have also been identified in a wide range of bacteria in plants and animals. Such factors include phenolic compounds, monosaccharides, amino acids, temperature, osmotic conditions, and other ions (Mekalanos, J. Bacterial., 174: 1-7 (1992)).

A gyomron át (azaz szájon keresztül) a gazdaszervezetbe bejutó kórokozó baktérium a szervezetben őt körülvevő környezetben számos olyan komponenssel és állapottal találkozik, melyek befolyásolhatják a fiziológiáját és a virulenciafaktorok kifejeződését. Ezekhez a komponensekhez és állapotokhoz tartozik az epe, epesavak vagy sóik, a gyomor kémhatása (pH értéke), a mikroaerofill állapotok (a gyomorban magas a szén-dioxid- alacsony az oxigénkoncentráció), az ozmotikus körülmények és sok más, még nem meghatározott tényező. A behatoló (invazív) bélbaktériumoknak de novo fehérjeszintézisre van szükségük, hogy végrehajtsák a behatolást (internalizációt) [Headley és Payne, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:4179-4187 (1990)] . A baktériumok ezért csak bizonyos környezeti szignálokra reagálva képesek optimálisan termelni ezeket az invazív faktorokat. Ezekkel a szignálokkal in vitro rendszerint nem találkoznak. Ezt a hipotézist támasztja alá egy mostani beszámoló, mely szerint a szokásos módon nőtt C.jejunival szembeni antiszérum csak csekély hatással van az in vitro behatolás blokkolására [Kőnkéi és munkatársai,The pathogenic bacterium that enters the host through the stomach (orally) encounters a number of components and conditions in the surrounding environment that may influence its physiology and expression of virulence factors. These components and conditions include bile, bile acids or their salts, gastric pH (pH), microaerophilic states (high carbon dioxide in the stomach, low oxygen concentration), osmotic conditions, and many other undefined factors. Invasive intestinal bacteria require de novo protein synthesis to effect internalization [Headley and Payne, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4179-4187 (1990). Therefore, bacteria are only able to produce these invasive factors optimally in response to certain environmental signals. These signals are not normally encountered in vitro. This hypothesis is supported by a recent report that antiserum to C. jejuni, which is normally grown, has little effect on blocking in vitro penetration [Kőnkéi et al.

J. Infect. Dis., 168:948-954 (1993)] . Ha azonban a Campylobacter sejteket egyrétegű epithelsejtek jelenlétében növesztjük, vagyis • · • ν·*· * Ζ·β· ··/··* olyan körülmények között, melyek fokozzák a behatolóképességet, a nyulak ilyen Campylobacter kivonatával szembeni immunizálásával olyan antiszérumot nyerünk, mely kifejezetten gátolja a baktérium behatolását.J. Infect. Dis., 168: 948-954 (1993)]. However, if the Campylobacter cells were grown to a monolayer epithelial cells in the presence of, or • · • ν · * · * Ζ · β · ·· / ·· * under conditions that increase the invasiveness, by immunizing rabbits against such Campylobacter extract of the obtained antiserum is specifically inhibits bacterial invasion.

A kutatók vizsgálták a baktériumok intesztinális körülmények közötti növekedését, hogy felismerjék a virulenciafaktorokat. így például a nyúl csípőbélkacsában növekvő Campylobacter 81-176 törzs olyan fehérjéket expresszál, melyeket a szokásos laboratóriumi in vitro körülmények kötött nem termel [ Panigrahi és munkatársai, ínfect. Immun., 60:4938-4944 (1992)] . Új vagy megnövekedett fehérjeszintézis figyelhető meg az egyrétegű INT 407 sejtekkel együtt tenyésztett Campylobacternél, összehasonlítva olyan tenyészetével, amit nem hámsejtek jelenlétében növesztettek [Kőnkéi és munkatársai, J. ínfect. Dis., 168:948-954 (1993)] . Továbbá, ezek a változások időben összeestek a C.jejuni megnövekedett behatolóképességével. Egy avirulens C.jejuni törzset intravénásán és chorioallantoisba adva, csirkeembriókon keresztül passzáltak, és ekkor más változások is megfigyelhetők voltak, nevezetesen megváltozott a sejt morfológiája, eltűntek a flagellák, új külső membránfehérje expresszálódott és módosultak a sejtfelszíni szénhidrátok [Fíeld és munkatársai, J. Med.The researchers examined the growth of bacteria under intestinal conditions to recognize virulence factors. For example, the strain Campylobacter 81-176 growing in the rabbit duodenum expresses proteins which are not produced by standard laboratory in vitro conditions [Panigrahi et al., Infect. Immun., 60: 4938-4944 (1992)]. Novel or increased protein synthesis was observed in Campylobacter co-cultured with monolayer INT 407 cells as compared to cultures grown in the presence of non-epithelial cells [Kőnkéi et al., J. Infect. Dis., 168: 948-954 (1993)]. Furthermore, these changes coincided with the increased penetration of C.jejuni over time. An avirulent strain of C.jejuni passed through intravenous and chorioallantoic passages through chicken embryos, and other changes were observed, namely cell morphology, flagella disappearance, expression of new outer membrane protein and modification of cell surface carbohydrate, .

Microbiol, 38:293-300 (1993)] .Microbiol, 38: 293-300 (1993)].

Más intesztinális komponensekről, például az epesavakról vagy sóikról ismert, hogy bizonyos baktériumokat gátolnak, de az epesavaknak más szerepük is lehet a baktériumok virulenciájának befolyásolásán keresztül.Other intestinal components, such as bile acids or their salts, are known to inhibit certain bacteria, but bile acids may also have other roles in influencing bacterial virulence.

Popé és Payne [ 93rd Am. Soc. Microbiol., B-147 (1993)] leírták, hogy a nátrium-kenodeoxikolátot tartalmazó közegben te4 nyésztett Shigella flexneri esetében az egyrétegű HeLa sejtek fertőzöttsége 3-5-szűrösére nőtt. Arról is beszámolnak, hogy más epesavas sók és detergensek, ideértve a kolátot, glikolátot, taurodeoxiklolátot, CHAPS sorozatot, digitonint és a Triton XlOO-at, valamint ezek nátriumsóját, viszont nem voltak hatással az S.flexneri behatolóképességére. Sőt a kenodeoxikolát tápközegben való jelenléte sem volt hatással az E.coli és más avirulens Shigella törzs behatolóképességére.Popé and Payne (93rd Am. Soc. Microbiol., B-147 (1993)) reported that Shigella flexneri cultured in medium containing sodium canodeoxycholate had a 3-5 fold infiltration of monolayer HeLa cells. However, other bile acid salts and detergents, including cholate, glycolate, taurodeoxycholate, CHAPS series, digitonin, and Triton X100, and their sodium salts, have been reported to have no effect on S.flexneri penetration. In fact, the presence of kenodeoxycholate in the medium did not affect the penetration capacity of E.coli and other avirulent Shigella strains.

Az S.flexneri új proteineket szintetizáló tevékenysége a pH érték, a hőmérséklet és a tenyészközeg ionösszetételeinek megváltoztatásával is kiváltható [ Mekalanos, J. Bacterioi., 174:1-7 (1992)] .The activity of S.flexneri to synthesize new proteins can also be induced by altering pH, temperature and ionic composition of the culture medium (Mekalanos, J. Bacteriol., 174: 1-7 (1992)).

A WO 93/22423 közzétételi számú (PCT) szabadalom (1993. november 11.) eljárásokkal szolgál baktériumok lipideken - például foszfatidil-szerin - vagy nyálkaanyagon történő tenyésztésére és a foszfatidil-szerin jelenlétében fokozottan expresszálódó fehérjék kinyerésére. Az említett szabadalom azonban nem tartalmaz vagy javasol fokozott virulenciájú vagy antigén tulajdonságú bélbaktériumok előállítására szolgáló, jelen találmány szerinti módszereket.WO 93/22423 (PCT), issued November 11, 1993, provides methods for culturing bacteria on lipids such as phosphatidylserine or mucosa and recovering proteins that are highly expressed in the presence of phosphatidylserine. However, the said patent does not include or suggest methods for the production of intestinal bacteria with enhanced virulence or antigenic properties according to the present invention.

Sok bélpatogén - például a Campylobacter és a Shigella - ellen nincs még oltóanyag, és a járványtannak fontos célja e betegségek elleni vakcina kidolgozása. A shigellózis az egész földre kiterjedő endémiás betegség, és a fejlődő államokban az évente 5 millió gyermekhalál 10 %-át a hasmenés okozza. A Campylobacterről ismert - noha csak mostanában azonosították, mint bélpatogént -, hogy úgy a fejlett, mint a fejletlen államokban a hasmenéses betegségek fő oka. Évente 400-500 millióMany intestinal pathogens, such as Campylobacter and Shigella, are not yet vaccinated, and the development of a vaccine against these diseases is an important goal of epidemiology. Shigellosis is a worldwide endemic disease and diarrhea is responsible for 10% of the 5 million deaths a year in developing countries. Campylobacter, although only recently identified as an enteric pathogen, is known to be the leading cause of diarrheal disease in both developed and underdeveloped states. 400-500 million a year

Campylobacter által okozott hasmenéses megbetegedés fordul elő, az Egyesült Államokban 2 millió felett van az esetek száma.Diarrhea caused by Campylobacter occurs, with over 2 million cases in the United States.

A shigellózis annak következménye, hogy a baktérium behatol a vastagbél nyálkahártyájába. A behatolás egy plazmid jelenlétével kapcsolatos, ami megtalálható valamennyi invazív izolátumban [ Sansonetti és munkatársai, Infect. Immun., 35:852-860 (1982)] . A plazmid egy fragmense tartalmazza az inváziós plazmid antigén (Ipa) géneket, az Ipa A, B, C és D géneket. Az Ipa A, C és D fehérjék alapvető szerepet játszanak a behatolási folyamatokban [ Baudry és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 133:3403-3413 (1987)] .Shigellosis is the result of the bacterium penetrating the colon mucosa. Penetration is related to the presence of a plasmid found in all invasive isolates [Sansonetti et al., Infect. Immun., 35: 852-860 (1982)]. A fragment of the plasmid contains the invasive plasmid antigen (Ipa) genes, the Ipa A, B, C and D genes. Ipa A, C, and D proteins play a fundamental role in the penetration process [Baudry et al., J. Gene. Microbiol., 133: 3403-3413 (1987)].

Az Ipa fehérjék logikusan vakcina jelölteknek számíthatnak, bár védőhatásuk még tökéletesen nem megállapított. Az Ipa B és Ipa C fehérjék immundomináns proteinek [Halé és munkatársai,Ipa proteins may logically count as vaccine candidates, although their protective effects have not yet been fully established. Ipa B and Ipa C proteins are immunodominant proteins [Halé et al.

Infect. Immun., 50:620-629 (1985)] . A 62 kDa nagyságú Ipa B fehérje (az invazin, ami megkezdi a sejtbe való belépést, és közreműködik a membránhoz kötött fagocita vakuolom lízisében) [ High és munkatársai, EMBO J., 11:1991-1999 (1992)] nagyon konzervatív fehérje a Shigella fajokban. Az alultáplált gyermekeknél - akiknél nincs lényeges mennyiségű antitest a nyálkahártyában a Shigella Ipa-val szemben - megfigyelt elhúzódó megbetegedés arra utal, hogy az Ipa-val szembeni nyálkahártya antitest megakadályozhatja a fertőzés elterjedését és súlyosbodását.Infect. Immun., 50: 620-629 (1985)]. The 62 kDa Ipa B protein (the invasin that initiates cell entry and contributes to lysis of membrane-bound phagocyte vacuole) [High et al., EMBO J., 11: 1991-1999 (1992)] is a highly conserved protein in the Shigella species. The prolonged morbidity observed in malnourished children who do not have a significant amount of mucosal antibody to Shigella Ipa suggests that the mucus antibody to Ipa may prevent the spread and worsening of the infection.

Noha számos vakcinajelöltet kipróbáltak már a Shigellaval szemben emberben és állatban, sikereset még nem találtak. Az Ipa fehérjék virulenciában játszott potenciális jelentőségük ellenére, a shigellózis ellen kifejlesztett legtöbb eddigi vakcinajelölt a lipopoliszacharid antigénen alapult, mely a szérumtí• · · · pus-specifikus determinánsokat hordozza. Ugyancsak kifejlesztettek egy parenterálisan beadott poliszacharid-fehérje konjugált vakcinát, de állatoknál ez még nem mutatott lényeges védelmet [ Robbins és munkatársai, Rév. Inf. Dis., 13:S362-365 (1191)] . Egy hasonló módon bevitt riboszómális vakcina nyálkahártya immunitást idéz elő, de védőhatása még bizonyításra vár [ Levenson és munkatársai, Arch. Allergy Appl. Immunoi., 87:25-31 (1983)] .Although many vaccine candidates have been tested against Shigella in humans and animals, they have not yet been found successful. Despite their potential importance in virulence, most of the vaccine candidates developed to date for shigellosis have been based on lipopolysaccharide antigen, which carries serum-type · · · · type-specific determinants. A parenteral polysaccharide protein conjugate vaccine has also been developed, but has not yet shown significant protection in animals [Robbins et al., Rev. Inf. Dis., 13: S362-365 (1191)]. A ribosomal vaccine administered in a similar manner induces mucosal immunity but its protective effect remains to be demonstrated [Levenson et al., Arch. Allergy Appl. Immunol., 87: 25-31 (1983)].

A Campylobacter fertőzés patogenezise nem annyira jólismert, mint Shigella fertőzéseké in vitro vizsgált sejtbehatolási kísérletek [Kőnkéi és munkatársai, J. Infect. Dis., 168:948-954 (1993)] , és a hisztopatológiai vizsgálatok [ Russel és munkatársai, J. Infect. Dis., 168:210-215 (1993)] arra vallanak, hogy a vastagbélben történő behatolás szintén jelentős. Ez a megállapítás összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a Campylobacter okozta hasmenés lehet súlyos, és kapcsolatban lehet a székletben megjelenő vérrel. Ezek az aktivitások kapcsolatban lehetnek az immundomináns 62 kDa nagyságú flagellin fehérjével. Egy jelenlegi beszámoló azt jelzi, hogy a flagellumok jelenléte lényeges a Campylobacter számára, hogy átjusson a polarizált epithelsejtek egysejtes rétegek [ Grant és munkatársai, Infect. Immun., 61 : 1764-1771 (1993)] .The pathogenesis of Campylobacter infection is not as well known as in vitro cell penetration assays for Shigella infections [Kőnkéi et al., J. Infect. Dis., 168: 948-954 (1993)] and histopathological examinations [Russel et al., J. Infect. Dis., 168: 210-215 (1993)] suggest that colon penetration is also significant. This finding is consistent with the observation that Campylobacter diarrhea can be severe and may be related to blood in the stool. These activities may be related to the immunodominant 62 kDa flagellin protein. A recent report indicates that the presence of flagella is essential for Campylobacter to pass through polarized epithelial cells in single cell layers [Grant et al., Infect. Immun., 61: 1764-1771 (1993)].

A védettségben szereplő specifikus Campylobacter antigéneket még nem határozták meg, azonban alacsony molekulasúlyú (28-31 kDa) fehérjékről vagy PEB fehérjékről és az immundomináns flagellum-fehérjérői feltételezik, hogy ilyen vonatkozásban reménykeltőek lehetnek [ Pavlovskis és munkatársai, Infect. Immun., 59:2259-2264 (1992); Blaser és Gotschilch, J. Bioi. Chem., 265:14529-14535 (1990)] . A flagellum-fehérje fontosságát jelzi a • »· ·Specific Campylobacter antigens in protection have not yet been identified, but low molecular weight (28-31 kDa) or PEB proteins and immunodominant flagellum proteins are thought to be promising in this regard [Pavlovskis et al., Infect. Immun., 59: 2259-2264 (1992); Blaser and Gotschilch, J. Bioi. Chem., 265: 14529-14535 (1990)]. The importance of flagellum protein is indicated by • »· ·

- 8 bélben történő megtelepedésnél és a Lior alcsoportoknál tapasztalt törzsek közötti keresztvédelemben játszott szerepe [ Pavlovskis és munkatársai, Infect. Immun., 59:2259-2264 (1992)] . Azonban a flagellum-fehérjén alapuló Campylobacter elleni oltóanyagnak lehet, hogy 8-10 klinikailag legfontosabb Lior szérumcsoportból· származó flagellum-fehérje antigént kellene tartalmaznia.Its role in cross-protection between strains found in 8 colonies and Lior subgroups [Pavlovskis et al., Infect. Immun., 59: 2259-2264 (1992)]. However, a flagellum protein based vaccine against Campylobacter may need to contain 8-10 flagellum protein antigens from the clinically most important Lior serum group.

A jelen találmány tárgya tehát, 1) olyan in vitro tenyésztési körülmények bélbaktériumok tenyésztésére vagy kezelésére, melyek optimálisan indukálják vagy fokozzák a behatolási aktivitást és/vagy a sejtfelszínre vonatkozó bizonyos jellegzetességek kialakulását; 2) a behatolóképesség és a sejtfelszínre vonatkozó jellegzetességek megváltoztatása, összefüggésben az antigén profilban bekövetkező változásokkal; 3) a nevezett mikroorganizmusok fokozott virulenciája kisállat modellekben; és 4) a fokozott behatolóképességű vagy megváltozott sejtfelszíni jellegzetességekkel rendelkező mikroorganizmusokkal szembeni vakcina, ami sokkal hatásosabb az élő mikroorganizmusok in vitro és in vivő semlegesítésében, mint a szokásosan növesztett baktériumokkal szemben létrejövő antiszérum. A találmány eleget tesz ezeknek és más céloknak.The present invention thus relates to: (1) in vitro culture conditions for culturing or treating intestinal bacteria which optimally induce or enhance penetration activity and / or the development of certain cell surface characteristics; 2) alteration of penetration and cell surface characteristics in association with changes in antigen profile; 3) increased virulence of said microorganisms in pet models; and 4) a vaccine against microorganisms with enhanced penetration or altered cell surface properties, which is more effective in in vitro and in vivo neutralization of living microorganisms than antiserum against conventionally grown bacteria. The invention fulfills these and other objects.

A fenti referenciák egyike sem tartalmaz kitanítást vagy ajánlást a jelen találmány in vitro módszereire, sem a jelen találmány szerinti, fokozott antigénaktivitású bélbaktériumokat tartalmazó vakcinákra.None of the above references teach or recommend the in vitro methods of the present invention, nor the vaccines of the present invention containing intestinal bacteria with enhanced antigenic activity.

A találmány meghatározott tenyésztési körülményeket és a bélbaktériumok tápközegéhez adandó komponenseket nyújt azzal a céllal, hogy indukálja vagy fokozza a virulenciafaktorok és más • ·The invention provides specific culture conditions and components to be added to the culture medium of intestinal bacteria for the purpose of inducing or enhancing virulence factors and other.

antigének megjelenését. Előnyösen az ilyen antigének immunizálok. Még előnyösebben az ilyen immunizáló antigének korrelációban vannak a virulencia mutatókkal.the appearance of antigens. Preferably, such antigens are immunized. More preferably, such immunizing antigens are correlated with virulence indices.

A bélbaktériumokat olyan körülmények között és olyan komponensek jelenlétében tenyésztjük, melyek szimulálnak bizonyos in vivő állapotokat, melyeknek a mikroorganizmusok a természetes viszonyok között ki vannak téve. A jelen találmány módszereivel fokozott antigénaktivitású bélbaktériumok állíthatók elő, melyek az alábbi fenotipusos változásokat mutatják: megnövekedett sejtenkénti összfehérje, új vagy megnövekedett mennyiségű egyedi fehérjék, megnövekedett mennyiségű vagy megváltozott felületi szénhidrátok, megváltozott felületi lipopoliszacharidok, megnövekedett adhéziv képesség, megnövekett behatolási képesség és/vagy megnövekedett sejten belüli szaporodás. Emellett a jelen találmány szerinti módszerek alkalmasak ipari célt szolgáló, megnövelt méretű fermentációk elvégzésére.Intestinal bacteria are cultured under conditions and in the presence of components that simulate certain in vivo conditions to which the microorganisms are naturally exposed. The methods of the present invention can produce intestinal bacteria with enhanced antigenic activity which exhibit the following phenotypic changes: increased total cellular protein, new or increased amount of individual proteins, increased or altered surface carbohydrates, altered surface lipopolysaccharides, intracellular growth. In addition, the methods of the present invention are suitable for industrial scale fermentations.

A fokozott antigenicitású nevezett bélbaktériumokat felhasználhatjuk inaktivált teljes sejteket vagy töredékeket tartalmazó védő vakcinák előállítására, alkalmazhatjuk diagnosztikai célra, például antitest-termelődés vizsgálatára vagy kórokozó bélbaktériumok kimutatására vagy felhasználhatjuk antibiotikumok termelésére. Továbbá a jelen találmány szerinti fokozott aktivitású baktériumokkal indukált antitestek felhasználhatók, mint passzív vakcinák.Said intestinal bacteria with increased antigenicity can be used to produce protective vaccines containing inactivated whole cells or fragments, used for diagnostic purposes, for example, to test antibody production or for the detection of pathogenic intestinal bacteria, or used to produce antibiotics. Further, antibodies raised by the highly active bacteria of the present invention can be used as passive vaccines.

Ezek szerint a jelen találmány egyik tárgya eljárás fokozott antigénaktivitású Campylobacter sp., Yersinia sp. , Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , ι·· ·Accordingly, one aspect of the present invention is a method of increasing antigenic activity of Campylobacter sp., Yersinia sp. , Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , ι ·· ·

- 10 Vibrio sp. , Clostridium sp. , Enterococcus sp. vagy Escherichia coli bélbaktérium előállítására, ami abból áll, hogy a bélbaktériumot in vitro az alábbi körülmények között növesztjük: (a) 0,05-3 % epe vagy 0,025-0,6 % egy vagy több epesav vagy sója jelenlétében 30°C vagy 42°C közötti hőmérsékleten növesztünk, amíg a növekedési fázis eléri a korai lóg fázist, a korai lóg fázis és a stacioner fázis közötti fázist vagy a stacioner fázist, levegőn vagy mikroaerofill körülmények között, ami lehet például 5-20 % szén-dioxid és 80-95 % levegő; 5-20 % szén-dioxid és 80-95 % nitrogéngáz vagy 5-10 % oxigéngáz, 10-20 % széndioxid és 70-85 % nitrogéngáz összetételű gázelegy; adott esetben kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, ami lehet például bár nemcsak ezekre korlátozva - 0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ- 10 Vibrio sp. , Clostridium sp. , Enterococcus sp. or Escherichia coli intestinal bacteria, which comprises growing the intestinal bacterium in vitro under the following conditions: (a) 0.05-3% bile or 0.025-0.6% in the presence of one or more bile acids or salts thereof at 30 ° C or 42 ° C; And the growth phase reaches the early-hanging phase, the early-hanging-phase to the stationary phase or the stationary phase, in air or under microaerophilic conditions such as 5-20% carbon dioxide and 80- 95% air; A mixture of 5-20% carbon dioxide and 80-95% nitrogen gas or 5-10% oxygen gas, 10-20% carbon dioxide and 70-85% nitrogen gas; optionally in the presence of a divalent cationic chelating agent which may be, but is not limited to, 0-100 μΜ, preferably 25 μΜ

BAPTA/AM, 0-10 μΜ EGTA vagy 0-100 μΜ EGTA/AM; vagy (b) azonos az (a) pontban ismertetett körülményekkel, eltekintve a jelenlevő kétértékű kation-kelátképzőtől, ami ez esetben 1,0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 mM EGTA vagy 1-100 μΜ EGTA/AM, és nincs a közegben epe, epesav vagy sója.BAPTA / AM, 0-10 μΜ EGTA, or 0-100 μΜ EGTA / AM; or (b) the same conditions as in (a), except for the presence of a divalent cationic chelator, which in this case is 1.0-100 μΜ, preferably 25 μΜ BAPTA / AM, 0.5-10 mM EGTA or 1-100 μΜ EGTA / AM and there is no bile, bile acid or salt in the medium.

A találmány szerinti bármelyik egyedi epesavnak vagy sójának a koncentrációja 0,025-0,6 %, előnyösen 0,05-0,5 %, még előnyösebben 0,05-0,2 %, de legelőnyösebb, ha 0,05-0,1 %. Előnyös, ha a nevezett epesav vagy sója a deoxikolát vagy a glükokolát.The concentration of any individual bile acid or salt of the present invention is 0.025-0.6%, preferably 0.05-0.5%, more preferably 0.05-0.2%, but most preferably 0.05-0.1% . Preferably said bile acid or salt thereof is deoxycholate or glycolate.

A találmány további tárgya a Campylobacter sp. , Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Clostridium sp. , Enterococcus sp. és Escherichia coli bélbaktérium, mely nevezett bélbaktériumokat in •·· * vitro olyan körülmények között növesztjük, melyek fokozzák az antigenecitási tulajdonságaikat; a nevezett körülmények: (a)Another object of the present invention is to provide Campylobacter sp. , Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Clostridium sp. , Enterococcus sp. and Escherichia coli enteric bacteria, said enteric bacteria being grown in vitro under conditions that enhance their antigenic properties; the said circumstances: (a)

0,05-3 % epe vagy 0,025-0,6 % egy vagy több epesav vagy sója jelenlétében 32-42°C hőmérsékleten növesztünk, amíg a növekedési fázis el nem éri a korai lóg fázist, a korai lóg fázis és a stacioner fázis közötti fázist vagy a stacioner fázist, levegőn vagy mikroaerofill körülmények között, ami lehet 5-20 % szén-dioxid és 80-95 % levegő vagy 5-20 % szén-dioxid és 80-85 % nitrogén vagy 5-10 oxigén, 10-20 % szén-dixoid és 70-85 % nitrogén összetételű gázelegy, adott esetben kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, ami lehet - noha nemcsak az említettekre korlátozva - 0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ BAPTA/AM, 0-10 mM EGTA vagy 0-100 μΜ EGTA/AM; vagy (b) azonos az (a) pontban ismertetett körülményekkel, eltekintve a jelenlevő kétértékű kation-kelátképzőtől, ami ez esetben 1,0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 mM0.05-3% bile or 0.025-0.6% in the presence of one or more bile acids or salts thereof is grown at 32-42 ° C until the growth phase reaches the early log phase, between the early log phase and the stationary phase. phase or stationary phase, in air or under microaerophilic conditions, which may be 5-20% carbon dioxide and 80-95% air or 5-20% carbon dioxide and 80-85% nitrogen or 5-10 oxygen, a gas mixture of% carbon dixoid and 70-85% nitrogen, optionally in the presence of a divalent cationic chelating agent, which may be, but is not limited to, 0-100 μΜ, preferably 25 μΜ BAPTA / AM, 0-10 mM EGTA or 0- 100 μΜ EGTA / AM; or (b) the same conditions as in (a), except for the presence of a divalent cationic chelator, which in this case is 1.0-100 μΜ, preferably 25 μΜ BAPTA / AM, 0.5-10 mM

EGTA vagy 1,0-100 μΜ EGTA/AM, és nincs a közegben epe, epesav vagy sója.EGTA or 1.0-100 μΜ EGTA / AM and no medium, bile acid or salt.

A találmány egy további tárgya vakcina, ami Campylobacter sp. , Yersínia sp. , Helicobacter sp. , Gastrospirillum sp. ,Another object of the invention is a vaccine which is a Campylobacter sp. , Yersínia sp. , Helicobacter sp. , Gastrospirillum sp. .

Bacteroides sp. , Klebsiella sp. , Enterobacter sp. , Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Clostridium sp. ,Bacteroides sp. , Klebsiella sp. , Enterobacter sp. , Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Clostridium sp. .

Enterococcus sp. vagy Escherichia coli teljes bélbaktériumot vagy komponensét vagy fokozott antigénaktivitású immunizáló fragmensét vagy származékát tartalmazza, adott esetben gyógyászati szempontból alkalmazható vívőanyag vagy hígító kíséretében .Enterococcus sp. or an entire intestinal bacterium or component of Escherichia coli or an immunizing fragment or derivative having enhanced antigenic activity, optionally accompanied by a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Előnyös az a vakcina, mely inaktivált, fokozott antigén- 12 aktivitású, teljes bélbaktériumokat tartalmaz. A találmány egy további tárgyát képezi az a vakcina, amely hatásfokozó anyagot is tartalmaz.A vaccine containing whole intestinal bacteria having inactivated, enhanced antigenic activity is preferred. It is a further object of the present invention to provide a vaccine comprising a booster.

A találmány egy további tárgyát képezik azok az antitestek (ideértve - bár nem korlátozva csak ezekre - az antiszérumot, a tisztított IgG vagy IgA antitesteket, a Fab fragmenst, stb.), melyek képesek specifikusan kötődni a jelen találmányban felsorolt bélbaktériumok legalább egy antigén-determinánsához. Az ilyen poliklonális vagy monoklonális antitestek felhasználhatók immunvizsgálati reagensekként a bélbaktériumok élőlényből vagy az élőlényből nyert biológiai mintából történő kimutatásánál. A jelen találmány szerinti poliklonális vagy monoklonális antitestek bélbaktériumok okozta fertőzések vagy betegségek ellen is alkalmazhatók, mint passzív vakcinák.It is a further object of the invention to provide antibodies (including, but not limited to, antiserum, purified IgG or IgA antibodies, Fab fragments, etc.) that are capable of specifically binding to at least one antigenic determinant of the gut bacteria of the present invention. . Such polyclonal or monoclonal antibodies can be used as immunoassay reagents for the detection of intestinal bacteria in a living organism or in a biological sample. The polyclonal or monoclonal antibodies of the present invention can also be used as passive vaccines against infections or diseases caused by intestinal bacteria.

A találmány egy további tárgya in vitro eljárás potenciális antimikrobiális hatóanyagok vizsgálatára, ami abból áll, hogy a fokozott antigénaktivitású Campylobacter sp., Yersinia sp.,Another object of the present invention is to provide an in vitro method for assaying potential antimicrobial agents comprising the use of Campylobacter sp., Yersinia sp.

Heliobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. vagy Escherichia coli bélbaktériumot érintkezésbe hozunk a kérdéses vizsgálandó anyaggal és meghatározzuk a baktericid vagy bakteriosztatikus hatását.Heliobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. or Escherichia coli intestinal bacterium is contacted with the test substance of interest and the bactericidal or bacteriostatic effect is determined.

A találmány egy további tárgya in vitro módszer gazdaszervezet antitest termelésének detektálására vagy a gazdaszervezetben vagy belőle származó mintákban lévő bélbaktériumok kimutatására, ami abból áll, hogy a gazdából nyert biológiai mintát érintkezésbe hozzuk a találmány szerinti, fokozott antigénaktivitásúA further object of the present invention is to provide an in vitro method for detecting the production of a host antibody or detecting intestinal bacteria in a host or in a sample thereof, comprising contacting a biological sample obtained from a host with the antigenic activity of the invention.

Campylocbater sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp. , Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp. , Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Closcridium sp. , Enterococcus sp. vagy Escherichia coli bélbaktériummal, ezek antigénjeivel vagy azokkal szembeni antitestekkel és vizsgáljuk az antitest/antigén kölcsönhatást.Campylocbater sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp. , Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp. , Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Closcridium sp. , Enterococcus sp. or Escherichia coli, their antigens, or antibodies thereto, and assaying for the antibody / antigen interaction.

A találmány tárgya egy diagnosztikai készlet gazdaszervezetek bélbaktériumok elleni antitest termelésének vagy bélbaktériumoknak kimutatására, ahol a készlet fokozott antigéngaktivitású Campylobacter sp., Yersinia sp., Heliobacter sp.,Gastrospirillum sp. , Bacteroides sp. , Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. vagy Escherichia coli baktériumot vagy adott baktériummal szembeni antitestet és minden más lényeges alkotórészt tartalmaz.The present invention relates to a diagnostic kit for detecting the production of antibodies against intestinal bacteria in a host organism, wherein the kit is a Campylobacter sp., Yersinia sp., Heliobacter sp., Gastrospirillum sp. , Bacteroides sp. , Klebsiella sp., Enterobacter sp., Salmonella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. or Escherichia coli or an antibody to that bacterium and all other relevant ingredients.

A találmány különböző szempontjaiból előnyös bélbaktérium aPreferred intestinal bacteria from various aspects of the invention are a

Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenterie, Shigella boydii, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Gastrospirillum hominus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Bactetroides fragilis,Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenterie, Shigella boydii, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Vodrospirillus, Gastrospirillus .

Clostridium difficile, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi,Clostridium difficile, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi,

Salmonella pullorum, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, ésSalmonella pullorum, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, and

Enterococcus faecalis.Enterococcus faecalis.

Az Escherichia coli törzsek közül előnyösek - de nem kizárólagosan az enterotoxikus, entero-haemorrhagiás, entero14Escherichia coli strains are preferred, but not limited to enterotoxic, entero-haemorrhagic, entero14

-invazív, entero-pathogen vagy más törzsek.-invasive, entero-pathogen or other strains.

A jelen találmány részben azon a meglepő felfedezésen alapszik, hogy a találmány szerinti fokozott antigénaktivitású bélbaktérium olyan immunválaszt vált ki, mely az immunválaszt kiváltó baktérium törzseivel vagy szerotípusaival szemben szélesebb spektrumú immunológiai keresztvédelmet nyújt, mint a szokásos körülmények között tenyésztett ugyanazon bélbaktériummal történő indukció. Legalább egy esetben, a találmány szerinti fokozott antigén aktivitású bélbaktérium által kiváltott immunválasz keresztvédelme eltérő fajú bélbaktériummal szemben is megnyilvánul .The present invention is based, in part, on the surprising discovery that an intestinal bacterium with enhanced antigen activity according to the invention elicits an immune response that provides a broader spectrum of immunological cross-protection against strains or serotypes of the immune response-inducing bacterium. In at least one case, the cross-protection of the immune response elicited by the intestinal bacterium with enhanced antigen activity according to the invention is also expressed against different types of intestinal bacteria.

Az ábrák rövid leírásaBrief Description of the Drawings

ΙΑ, 1B és IC ábra: a C.jejuni 81-76 törzs felületi extraktum hidrolizátumában lévő monoszacharidok HPLC kromatogramjai. 1A ábra - standardok: fukóz „Fue, N-acetil-galaktózamin „GalNac, N-acetil-glükózamin „GlcNac, galaktóz „Gál, glükóz „Glc, mannóz „Mán. 1B ábra - a szokásosan növesztett baktérium („BHI) felületi extraktumának kromatogramja. IC ábra - a jelen találmány szerint növesztett baktérium („DOC) felületi extraktumának kromatogramja.Figure 1B and IC: HPLC chromatograms of monosaccharides in the surface extract hydrolyzate of C.jejuni strain 81-76. Figure 1A - Standards: Fucose "Fue, N-acetyl-galactosamine" GalNac, N-acetylglucosamine "GlcNac, galactose" Gal, glucose "Glc, mannose" Man. Figure 1B is a chromatogram of a surface extract of a conventionally grown bacterium ("BHI"). Figure IC is a chromatogram of a surface extract of a bacterium ("DOC") grown in accordance with the present invention.

2. ábra: a szokásos módon növesztett („BHI), illetve a jelen találmány szerint növesztett (0,8 % Oxgall epesavak, „OX , vagy 0,1 % deoxikolát jelenlétében, „DOC) C. jejuni 81-176 törzs teljes sejtjeinek (1., 2. és 3. oszlop) és felületi extraktumának (5. és 6. oszlop) nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) szétválasztott fehérjeinek • · · · képe .Figure 2: Total cells of C. jejuni strains 81-176 grown in the usual manner ("BHI") or grown according to the present invention (0.8% Oxgall bile acids, "OX" or 0.1% deoxycholate, "DOC"). (Columns 1, 2 and 3) and surface extract (columns 5 and 6) of sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel separated protein (SDS-PAGE) image.

3. ábra: „ 1 - a szokásos módon tenyésztett C.jejuni 81-176 teljes sejtjében; „2 - a jelen találmány szerint 0,8 % Oxgall epesavak vagy „3 - 0,1 % deoxikolát jelenlétében tenyésztett C. jejuni 81-176 teljes sejtjében; „4 - a hagyományos módon tenyésztett C.jejuni 81-176 felületi extraktumában; és „5 - a jelen találmány szerint 0,1 % deoxikolát jelenlétében tenyésztett C.jejuni 81-176 felületi extraktumában lévő, a C.jejuni 81-176 teljes sejttel fertőzött vadászmenyeit IgA-t tartalmazó nyálkájának komponenseihez kötődő fehérjék összehasonlító Western Biot analízise .Figure 3: "1 - in whole cells of C.jejuni 81-176 grown in conventional manner; "2 - in whole cells of C. jejuni 81-176 grown in the presence of 0.8% Oxgall bile acids or" 3 to 0.1% deoxycholate according to the present invention; "4 - surface extract of C.jejuni 81-176 grown in conventional manner; and "5 - Comparative Western Biot analysis of proteins in the surface extract of C.jejuni 81-176 cultured in the presence of 0.1% deoxycholate in the presence of 0.1% deoxycholate and containing IgA-containing mucosa components of whole cell-infected hunts.

4. ábra: „3 - a jelen találmány szerint tenyésztett C.jejuni 81-176 teljes sejtjéből; „2 - a szokásos módon tenyészett C.jejuni 81-176 teljes sejtjéből; és „3 - a jelen találmány szerint fermentorban növesztett C.jejuni 81-176 teljes sejtjéből származó, a flagellire specifikus monoklonális 72c antitesthez kötődő fehérjék összehasonlító Western Biot analízise.Figure 4: "3 - from whole cells of C.jejuni 81-176 grown in accordance with the present invention; "2 - 81-176 whole cells of C.jejuni grown in the usual manner; and "3 - Comparative Western Biot analysis of flagella specific monoclonal antibody 72c binding protein derived from whole cells of C.jejuni grown in a fermenter according to the present invention.

5. ábra: S.flexneri 2457T teljes sejt lipopoliszacharidjainak SDS-PAGE képe. „1 - S.flexneri 2457T a szokásos módon, illetve „2 - a jelen találmány szerint 0,1 deoxikolát jelenlétében növesztve.Figure 5: SDS-PAGE image of S.flexneri 2457T whole cell lipopolysaccharides. "1 - S.flexneri 2457T grown in the usual manner, and" 2 - grown according to the present invention in the presence of 0.1 deoxycholate.

6. ábra: a jelen találmány szerint növesztett C.jejuni megnövekedett immunológiai keresztaktivitása. Az antitestek indukálására a szokásos módon növesztett vagy a találmány szerint például az 5. példában leírt körülmények között - növesztett C.jejuni 81-176 sejteket használtuk. Az antitestek két típusának (például BHI növesztett C.jejuni 81-176 anti-C és DOC növesztett C.jejuni 81-176 anti-C) agglutinációs aktivitását különféle • · ·· ·Figure 6: Increased immunological cross-activity of C. jejuni grown in accordance with the present invention. C.jejuni 81-176 cells grown in the usual manner or grown according to the invention, for example under the conditions described in Example 5, were used to induce antibodies. The agglutination activity of two types of antibodies (for example, BHI-grown C.jejuni 81-176 anti-C and DOC-grown C.jejuni 81-176 anti-C) is variable.

- 16 C.jejuni típusokkal szemben mutatjuk be (részletesebben lásd a- 16 against C.jejuni types (for more details see

32. példában).Example 32).

7A, 7B és 7C ábra: inaktivált C.jejuni 81-176 teljes sejteket tartalmazó vakcina hatásossága élő C.jejuni 81-176 sejtekkel szemben orron keresztül megfertőzött egereknél. Az egereket az alábbi készítményekkel oltottuk be: foszfátpufferes sóoldat (PBS, folytonos vonal); LT adjuvánst tartalmazó PBS (Adjuvans, szaggatott vonal); az 5. példában leírtak szerint növesztett és összegyűjtött, formalinnal inaktivált C.jejuni 81-176 teljes sejtek adjuváns nélkül (CWC, folytonos vonal üres körrel); és CWC LT adjuvánssal CWC + adjuváns, folytonos vonal telt körrel). A vakcina hatékonyságát intesztinális megtelepedés módszerével állapítottuk meg. 7A - a védettség mértéke azoknál az állatoknál, melyeknél a vakcinálás szájon át történt három dózissal, dózisonként 105 inaktivált baktériummal (felső ábra); 7B - a védettség mértéke azoknál az állatoknál, melyeknél a vakcinálás szájon át történt három dózissal, dózisonként 107 inaktivált baktériummal (középső ábra); 7C - a védettség mértéke azoknál az állatoknál, melyeknél a vakcinálás szájon át történt három dózissal, dózisonként 10 inaktivalt baktériummal (alsó ábra) (részletesebben lásd a 34. példában leírtakat).Figures 7A, 7B and 7C: Efficacy of an inactivated C.jejuni 81-176 whole cell vaccine against live C.jejuni 81-176 cells in nasally infected mice. Mice were inoculated with the following formulations: phosphate buffered saline (PBS, solid line); LT adjuvanted PBS (Adjuvans, dashed line); formalin-inactivated C.jejuni 81-176 whole cells grown and harvested as described in Example 5 without adjuvant (CWC, solid line with blank); and CWC LT adjuvant (CWC + adjuvant, solid line with full circle). The efficacy of the vaccine was determined by the method of intestinal colonization. 7A - the degree of protection in animals, where the oral vaccination in three doses, 10 per dose of inactivated bacteria 5 (top); 7B - the degree of protection in animals, where the vaccination dose orally in three doses at 10 7 inactivated bacteria (Figure middle); 7C - Degree of protection in animals given three doses of oral vaccine with 10 inactivated bacteria per dose (lower figure) (see Example 34 for details).

8A, 8B és 8C ábra: inaktivált C.jejuni 81-176 teljes sejteket tartalmazó vakcina hatásossága élő C.jejuni 81-176 baktériummal szemben szájon át megfertőzött egereknél. Az egereket aFigures 8A, 8B and 8C: Efficacy of an inactivated C.jejuni 81-176 whole cell vaccine against live C.jejuni 81-176 in orally infected mice. The mice are a

7A, 7B és 7C ábránál leírt módon vakcináltuk. A vakcina hatásosságát az intesztinális megtelepedés módszerével állapítottuk meg; 8A - a védettség mértéke dózisonként 105 inaktivált baktériumot tartalmazó, három orális dózis esetében (felső ábra); 8B7A, 7B and 7C were vaccinated. The efficacy of the vaccine was determined by the method of intestinal colonization; 8A - Degree of protection at three oral doses of 10 5 inactivated bacteria per dose (upper figure); 8B

- a védettség mértéke dózisonként 10? inaktivált baktériumot tartalmazó, három orális dózis esetében (középső ábra); 8C - a védettség mértéke dózisonként 109 inaktivált baktériumot tartalmazó, három orális dózis esetében (alsó ábra) (részletesebben lásd a 34. példában).- the degree of protection is 10 per dose ? for three oral doses containing inactivated bacteria (middle figure); 8C - Degree of protection for three oral doses of 10 9 inactivated bacteria per dose (bottom figure) (see Example 34 for details).

9. ábra: a tenyészet növekedési fázisának hatása a Shigella flexneri 2457T sejtek behatolási képességére. A Shigella flexneri 2457T sejteket a szokásos módon (BHI) vagy a jelen találmány szerinti, például a 9. példában leírt módon növesztettük, és a sejteket a korai lóg fázisban gyűjtöttük össze (DOC-EL), vagy a növesztés a 9. példában leírtak szerint történt, de az összegyűjtés előtt hagytuk, hogy a tenyészet érje el a késői lóg fázist (DOC-LL). Az ábrán ezeknek a különböző sejtpreparátumoknak a behatolóképességét mutatjuk be (részletesebben lásd a 35. példát).Figure 9: Effect of culture growth phase on penetration ability of Shigella flexneri 2457T cells. Shigella flexneri 2457T cells were grown in the usual manner (BHI) or according to the present invention, for example as described in Example 9, and harvested in the early log phase (DOC-EL), or as described in Example 9. but were allowed to reach the late hanging phase (DOC-LL) prior to collection. The figure shows the penetration capacity of these different cellular preparations (see Example 35 for details).

10. ábra: a jelen találmány eljárása szerint tenyésztett Shigella sejtek megnövekedett behatolóképességének a bemutatása.Figure 10 is an illustration of the increased penetration capacity of Shigella cells cultured according to the method of the present invention.

A Shigella sonnei és az S.dysenteriae 3818 sejteket a szokásos módon (BHI) vagy a jelen találmány szerint, a 9. példában bemutatott módon növesztettük. A Shigella sejtek ezen különböző preparátumainak behatolóképességét INT-407 sejtekkel szemben mutatjuk be (részletesebben lásd a 35. példát).Shigella sonnei and S.dysenteriae 3818 cells were grown as usual (BHI) or according to the present invention as shown in Example 9. The intrinsic potency of these various preparations of Shigella cells against INT-407 cells is shown (see Example 35 for details).

11. ábra: a jelen találmány szerint növesztett Shigella megnövekedett immunológiai keresztreaktivitásának bemutatása. Az antitestek indukálására a jelen találmány szerinti, a 9. példában bemutatott módon növesztett S.flexneri 2457T sejteket használtuk. Bemutatjuk az indukált antitestek agglutinációs aktivitását a szokásos módon (BHI) és a jelen példa szerint (9. példa) növesztett S.flexneri, S.sonnei, S.dysenteriae és az S.bodydii baktériumokkal szemben (részletesebben lásd a 36. példát).Figure 11 is an illustration of the increased immunological cross-reactivity of Shigella grown in accordance with the present invention. S.flexneri 2457T cells of the present invention grown as described in Example 9 were used to induce antibodies. The agglutination activity of induced antibodies against S.flexneri, S.sonnei, S.dysenteriae and S.bodydii bacteria grown in the usual way (BHI) and the present example (Example 9) is shown (see Example 36 for details).

12. ábra: az epekoncentráció és a növekedési fázis hatása a Helicobacter pylori NB3-2 sejtek megtapadási képességére. A H.Pylori NB3-2 sejteket 0 %, 0,025 %, 0,05 % vagy 0,1 % epét tartalmazó tápközegben tenyésztettük, és a sejteket a beoltás utáni 8., 10., 12. és 18. órában gyűjtöttük össze. Bemutatjuk ezen különböző H.pylori NB3-2 preparátumok INT-407 sejtekkel szembeni behatolóképességét (részletesebben lásd a 38. példát).Figure 12: Effect of bile concentration and growth phase on adhesion of Helicobacter pylori NB3-2 cells. H.Pylori NB3-2 cells were cultured in 0%, 0.025%, 0.05% or 0.1% bile medium and harvested at 8, 10, 12 and 18 hours post-inoculation. The intrinsic potency of these various H.pylori NB3-2 preparations against INT-407 cells is shown (see Example 38 for details).

13. ábra: az epekoncentráció és a növekedési fázis hatása a Helicobacter pylori Gl-4 sejtek megtapadási képességére. A H.pylori Gl-4 sejteket 0 %, 0,1 % vagy 0,2 % epét tartalmazó tápközegben növesztettük és a sejteket a beoltás utáni 6., 8., 10., 12., 14. és 16. napon gyűjtöttük össze. Bemutatjuk ezen különböző H.pylori Gl-4 sejtek INT-407 sejtekkel szembeni behatolóképességét (részletesebben lásd a 38. ábrát).Figure 13: Effect of bile concentration and growth phase on adhesion of Helicobacter pylori Gl-4 cells. H.pylori Gl-4 cells were grown in 0%, 0.1%, or 0.2% bile medium and harvested on days 6, 8, 10, 12, 14, and 16 after inoculation. . The intrinsic potency of these various H.pylori Gl-4 cells against INT-407 cells is shown (see Figure 38 for details).

A jelen találmány a bélbaktériumok in vitro tenyésztésének olyan módjával foglalkozik, ahol a bizonyos körülményeket bizonyos komponensekkel úgy kombinálunk össze, hogy ezzel indukáljuk vagy fokozzuk az antigének és/vagy a virulenciá faktorok expresszálását.The present invention relates to a method of culturing intestinal bacteria in vitro, wherein certain conditions are combined with certain components to induce or enhance the expression of antigens and / or virulence factors.

Az itt és az igénypontokban használt „bélbaktérium („enterális) kifejezésen értjük azokat a baktériumokat, melyek normális körülmények között egy élőlény gasztrointesztinális rendszerének bármelyik részében találhatók vagy bármelyik olyan baktériumot, mely egy élőlény gasztrointesztinális rendszerének bármelyik részében fertőzést okoz. A bélbaktériumok közé gram pozitív és gram negatív baktériumok is tartoznak.As used herein and in the claims, the term "enteric" refers to bacteria that are normally found in any part of an organism's gastrointestinal tract or any bacterium that causes infection in any part of an organism's gastrointestinal tract. Intestinal bacteria include gram positive and gram negative bacteria.

Az itt és az igénypontokban használt „komponensek és „körülmények kifejezésen értjük azt a számos tényezőt, mellyel természetes in vivő körülmények között a bélbaktérium kapcsolatba kerül és további faktorokat. Ilyen komponensek és körülmények - bár nemcsak ezekre korlátozva az epe, epesavak és sóik, biológiai előanyagaik, például koleszterin, pH, mikroaerophill körülmények ozmotikus körülmények és a baktériumok kívánt növekedési fázisában történő összegyűjtése.As used herein and in the claims, the term "components and" conditions refers to a number of factors with which intestinal bacteria come into contact under natural in vivo conditions and additional factors. Such components and conditions include, but are not limited to, the collection of bile, bile acids and their salts, their biological precursors, such as cholesterol, pH, microaerophilic conditions, osmotic conditions, and bacterial growth.

Az itt és az igénypontokban használt „antigén és a vele kapcsolatos „antigeniális kifejezés olyan antigéneket és antigeniális jellegzetességet jelent, mint a sejtek morgológiá]ában vagy mozgásában résztvevő makromolekulák, a fehérjék; közelebbről a felületi fehérjék, lipopoliszacharidok és szénhidrátok - noha a kifejezés nemcsak a felsoroltakra vonatkozik. A nevezett antigének előnyösen immunizálhatok (immunogének) .As used herein and in the claims, the term "antigen and related antigenic" refers to antigens and antigenic characteristics such as macromolecules involved in the morphology or movement of cells, proteins; more specifically, surface proteins, lipopolysaccharides, and carbohydrates, although the term is not limited to those listed. These antigens are preferably immunized (immunogens).

Az itt és az igénypontokban használt „immunizáló („immunogén) kifejezés olyan képességre utal, mely egy élőlényben antitest termelődést indukál, miután a nevezett élőlényt a jelen találmány szerint növesztett teljes baktériumot vagy a teljes baktérium fragmensét tartalmazó készítmény hatásának tesszük ki.The term "immunizing" as used herein and in the claims refers to the ability to induce antibody production in a living entity after exposure to said composition comprising a whole bacterium or a fragment of a whole bacterium grown in accordance with the present invention.

Az itt és az igénypontokban használt „fokozott antigenitású, „fokozott antigenicitású kifejezés a jelen találmány szerint növesztett bélbaktérium antigenitási állapotára utal.The term "enhanced antigenicity" as used herein and in the claims refers to the antigenicity status of the intestinal bacterium grown in accordance with the present invention.

Ezek a baktériumok bizonyos immunogén antigének magasabb szintjével vagy új immunogén antigénekkel rendelkeznek a szokásos körülmények között növesztett baktériumokhoz képest.These bacteria have higher levels of certain immunogenic antigens or new immunogenic antigens compared to bacteria grown under normal conditions.

Az itt és az igénypontokban használt „szokásos kifejezés olyasmire utal, ami a technika mai állása szerint ismert.As used herein and in the claims, the "conventional term" refers to what is known in the art.

Az itt és az igénypontokban használt „mikroaerofill körülmények kifejezés anaerob körülményeket vagy megemelt szén-dioxid koncentrációt jelent, például 5-20 % CO2 és 80-85 % levegő; 5-20 % CO2 és 80-95 % N2; vagy 5-10 % 02, 10-20 % CO2 és 75-85 % N2 összetételű légteret.As used herein and in the claims, the term "microaerophilic conditions" means anaerobic conditions or elevated carbon dioxide concentrations, for example, 5-20% CO 2 and 80-85% air; 5-20% CO 2 and 80-95% N 2 ; or 5-10% O 2 , 10-20% CO 2 and 75-85% N 2 .

Az itt és az igénypontokban használt „virulencia kifejezés a bélbaktérium azon tényezőire vonatkozik, melyek a megtapadási képességgel és/vagy a behatolással és/vagy a gazdaszervezetekben való túléléssel és/vagy a patogén állapot kiváltásával kapcsolatosak.As used herein and in the claims, the term "virulence" refers to those factors of the intestinal bacterium that are related to adhesion and / or penetration and / or survival in host organisms and / or induction of a pathogenic condition.

Az itt és az igénypontokban használt „immunológiai keresztvédelem kifejezés egy baktérium törzs vagy szérumtípus - legyen az teljes sejt vagy más - olyan immunválaszt kiváltó képességre utal, ami ugyanazt a gazdaszervezetet részben vagy teljesen megvédi ugyanezen baktérium genus más törzseivel, szérumtípusával vagy speciesével szemben is.As used herein and in the claims, the term "immunological cross-protection" refers to the ability of a bacterial strain or serum type, whole or otherwise, to elicit an immune response that partially or completely protects the same host against other strains, serum types or species of the same bacterial genus.

Az itt és az igénypontokban használt „immunológiai keresztreaktivitás kifejezés egy baktérium törzs vagy szérumtípus legyen az teljes sejt vagy más - olyan humorális immunválaszt (például antitestek) kiváltó képességét jelenti, mely immunválasz keresztreakcióba lép (például antitest megkötés) ugyanezen baktérium genus más törzsével, szérumtípusával vagy speciesével szemben is. Az immunológiai keresztreaktivitás indikatív a baktérium immunológiai keresztvédelmére vonatkozóan és fordítva.As used herein and in the claims, the term "immunological cross-reactivity" refers to the ability of a bacterial strain or serum type to elicit a whole cell or other humoral immune response (e.g., antibodies) that cross-react (e.g., antibody binding) with another strain, serum or species. Immunological cross-reactivity is indicative of bacterial immunological cross-protection and vice versa.

Az itt és az igénypontokban használt „gazda kifejezés in vivő esetben egy élőlényt, in vitro esetben egy élőlény sejtte* <The term "host" as used herein and in the claims was in vivo derived from an animal, in vitro by an organism * <

- 21 nyészetét jelenti. Az itt és az igénypontokban szereplő „élőlény kifejezésbe beletartozik valamennyi melegvérű teremtmény, mint amilyenek az emlősök és a madarak (például csirke, pulyka, kacsa, stb.), noha nem korlátozódik a kifejezés csak az említettekre.- 21 things. The term "living being" as used herein and in the claims includes, but is not limited to, all warm-blooded creatures such as mammals and birds (e.g., chicken, turkey, duck, etc.).

A találmány szerint a vakcina fokozott antigén aktivitású bélbaktériumot vagy annak immunogén fragmensét vagy származékát tartalmazza. A bélbaktérium lehet élő vagy inaktivált. A vakcina továbbá adjuvánsokat is tartalmazhat, például - bár nemcsak ezekre korlátozva - timsót, olaj/víz emulziót, entero-toxigén E.coliból származó hőlabilis toxint (LT), ennek nem toxigén formáit (például mLT) és/vagy alegységeit, Bacille Calmette-Guerin (BCG) vagy Freund-féle adjuvánst tartalmazhat, továbbá az oltóanyag gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagot, ideértve - de nemcsak ezekre korlátozva - a sóoldatot, dextróz vagy más komponens vizes oldatát. A gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagokat a Remingtons' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company) írja le. Az itt és az igénypontokban használt „vakcina („oltóanyag) - beleértve a „passzív vakcinákat is - kifejezés olyan antitesteket tartalmazó készítményt jelent, amelyek specifikusan kötődnek azokhoz a kórokozókhoz, melyek fertőzések és általuk okozott betegségek ellen védelmet kívánunk nyúj tani.According to the invention, the vaccine comprises an intestinal bacterium with enhanced antigen activity or an immunogenic fragment or derivative thereof. The gut bacteria may be live or inactivated. The vaccine may also contain adjuvants such as, but not limited to, alum, oil / water emulsion, heat-stable toxin (LT) derived from E. coli enterotoxigen, non-toxic forms thereof (e.g., mLT) and / or subunits thereof, Bacille Calmette- Guerin (BCG) or Freund's adjuvant may be included, and the vaccine may be a pharmaceutically acceptable carrier, including, but not limited to, saline, dextrose, or other aqueous solutions. Pharmaceutically acceptable carriers are described in Remingtons' Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company). As used herein and in the claims, the term "vaccine," including "passive vaccines," refers to a composition comprising antibodies that specifically bind to pathogens that are intended to protect against infections and diseases caused by them.

Az itt és az igénypontokban használt „inaktivált baktérium kifejezés olyan bélbaktériumokra utal, melyek képtelenek a fertőzésre és/vagy a megtelepedésre, a fogalomba beletartoznak a legyengített vagy elölt baktériumok. A legyengített baktériumok szaporodhatnak, de fertőzést vagy betegséget nem tudnak okozni.As used herein and in the claims, the term "inactivated bacterium" refers to intestinal bacteria that are incapable of infection and / or colonization, and includes inactivated or killed bacteria. Weakened bacteria can multiply but cannot cause infection or disease.

A nevezett baktériumok inaktiválására bármelyik, a szakterületen ismert módszert felhasználhatjuk, inaktiválhatjuk a baktériumot kémiailag, például formalinos fixálással vagy fizikai úton, például hővel, ultrahanggal vagy besugárzással, mely kezelések a baktériumokat képtelenné teszik a szaporodásra és/vagy fertőzésre és/vagy betegségek előidézésére.Any of the methods known in the art for inactivating said bacteria may be chemically inactivated, for example by formalin fixation or by physical means such as heat, ultrasound or irradiation, which render the bacteria incapable of proliferation and / or infection.

A vakcinák hatásos mennyiségét kell a szervezetbe juttatni, a „hatásos mennyiség a bélbaktériumoknak vagy immunogén fragmenseinek vagy származékainak olyan mennyiségét jelentik, mely a szervezetben immunválaszt képes létrehozni. Az ehhez szükséges mennyiség változóan függ az alkalmazott baktérium, fragmens vagy származék antigénaktivitásától, a védendő lény fajától és tömegétől, de mindez ismert módon megállapítható. Előnyös - bár ez nem jelenti a találmány korlátozását -, ha a vakcina hatásos mennyiségét úgy választjuk meg, hogy az antibakteriális antitest tittere a vakcinálás előtt értéknek legalább kétszeresére nőjön. Továbbá sem korlátozva a talál7 11 manyt, előnyös a gazdaszervezetbe 10 -10 , meg előnyösebben 1O8-1O10 baktériumot bejuttatni. Előnyösek azok a vakcinák, melyek inaktivált teljes baktériumokat tartalmaznak.An effective amount of vaccine is to be delivered to the body, "an effective amount is the amount of intestinal bacteria or immunogenic fragments or derivatives that can produce an immune response in the body. The amount required for this will vary depending upon the antigenic activity of the bacterium, fragment or derivative used, the species and weight of the subject being protected, but can be determined in a known manner. While not limiting the invention, it is preferred that the effective amount of the vaccine be selected such that the titre of the antibacterial antibody is increased to at least twice the value prior to vaccination. Further, but not limited to 10 to 10, more preferably 10 to 8 to 10, bacteria are found to be introduced into the host. Vaccines containing whole inactivated bacteria are preferred.

A passzív vakcinákkal kapcsolatban a „hatásos mennyiség kifejezés az antitesteknek azt a mennyiségét jelenti, ami képes enyhíteni egy bakteriális fertőzést vagy betegséget vagy megelőzni azt.In the context of passive vaccines, the term "effective amount" refers to the amount of antibodies that can ameliorate or prevent a bacterial infection or disease.

A szükséges mennyiség változóan függ az antitest típusától, az antitest tittertől, a védendő szervezet fajától és tömegétől. A mennyiséget ismert módszerekkel meg tudjuk állapítani.The amount required will vary depending on the type of antibody, the antibody titer, the species and weight of the organism to be protected. The amount can be determined by known methods.

A találmány szerinti vakcinát ismert módszerekkel alkalmaz23 hatjuk lokálisan és/vagy az egész szervezetre kiterjedően, például beadhatjuk intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intravaginálisan, intraperitoneálisan, orron vagy szájon keresztül vagy más nyálkahártyán át, stb.The vaccine of the invention may be administered by known methods locally and / or throughout the body, for example, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intravaginally, intraperitoneally, nasally or orally, or other mucous membranes, etc.

A vakcinát bevihetjük megfelelő, nem-toxikus, gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagokkal, mikrokapszulákban és/vagy elnyújtott felszabadulást biztosító eszközzel.The vaccine may be administered with suitable non-toxic pharmaceutically acceptable carriers, microcapsules and / or sustained-release devices.

Kívánatos lehet a vakcinát időközökre elosztva beadni, hogy fenntartsuk a kívánt antitest-szintet.It may be desirable to administer the vaccine at intervals to maintain the desired antibody level.

A találmány szerinti vakcinát alkalmazhatjuk más baktericid vagy bakteriosztatikus módszerrel együtt.The vaccine of the invention may be used in combination with other bactericidal or bacteriostatic methods.

A találmány szerinti antitesteket bármelyik, a szakterületn jól ismert módszerrel megkaphatjuk, ilyen módszereket ismertet például az „Antibodies-A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane,The antibodies of the invention may be obtained by any of the methods well known in the art, such as those described in the "Antibodies-A Laboratory Manual" (E. Harlow, D. Lane,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) kézikönyv. Ez általában úgy történik, hogy egy állatot (sok gerinces felhasználható erre, leginkább egeret, patkányt, tengerimalacot, hörcsögöt és nyulat alkalmaznak) a jelen találmány szerinti fokozott antigénaktivitású bélbaktérium teljes sejtjeivel, fragmensével vagy származékával immunizálunk egy adjuváns vagy bármilyen ágens jelenlétében vagy távollétében, mely ágens fokozza az immunizáló hatékonyságot és szabályos intervallumokban erősítést ad. Az állat szérumában a szokásos módon megvizsgáljuk a kívánt antitest jelenlétét. A nevezett állat szérumát vagy vérét felhasználhatjuk a poliklonális antitestek forrásaként.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). This is usually done by immunizing an animal (many vertebrates may be used, most preferably mice, rats, guinea pigs, hamsters and rabbits) with whole cells, fragments or derivatives of the high antigenic activity of the present invention in the presence or absence of an adjuvant or any agent enhances the immunizing efficacy and provides regular enhancement. The animal serum is assayed for the presence of the desired antibody in the usual manner. The serum or blood of said animal may be used as a source of polyclonal antibodies.

Monoklonális antitestek előállításánál az állatokat a fentiek szerint kezeljük. Amikor elfogadható antitest-tittert észlelünk, az állatot kíméletesen elöljük és a lépet aszeptikus kö24 rülmények között eltávolítjuk. A lépsejteket specifikusan kiválasztott, immortális mieloma sejtvonallal keverjük össze, a sejtkeveréket egy olyan ágensnek, általában polietilén-glikolnak vagy hasonlónak tesszük ki, ami elősegíti a sejtek fúzióját. Ezek között a körülmények között a sejtek összeolvadása véletlenszerű kiválasztással történik, és a keletkezett termék a fuzionált és a nem-fuzionált sejtek keverékéből áll. A fuzionáláshoz használ mieloma sejtvonalat specifikusan úgy választjuk meg - a szelekciós közeg felhasználásával, mint amilyen például a hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmazó „HAT -, hogy a fúziós keverék tenyészetéből csak azok a sejtek maradnak meg, melyek az immunizált donorból származó sejtek és a mieloma sejtek hibridjei. A fúzió után a sejteket kihígítjuk és a szelektív táptalajon tenyésztjük. A tenyészközeget szűrővizsgálatnak vetjük alá abból a szempontból, hogy tartalmazza-e a kiválasztott antigénre specifikus antitestet. A kívánt antitestet tartalmazó tenyészeteket hígításos módszerrel klónozzuk, amíg egysejttenyészethez nem jutunk. A jelen találmány szerinti antitestek passzív vakcinaként alkalmazhatók bélbaktériumok okozta fertőzések és betegségek ellen.In preparing monoclonal antibodies, the animals are treated as described above. When an acceptable antibody titer is detected, the animal is gently killed and the spleen removed under aseptic conditions. The spleen cells are mixed with a specifically selected immortal myeloma cell line, and the cell mixture is exposed to an agent, usually polyethylene glycol or the like, which promotes cell fusion. Under these conditions, cell fusion occurs by random selection and the resulting product consists of a mixture of fused and non-fused cells. The myeloma cell line used for fusion is specifically selected - using a selection medium such as HAT containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine - that only cells remaining in the culture of the fusion mixture are those of the immunized donor and the myeloma. cell hybrids. After fusion, cells are diluted and cultured on selective medium. The culture medium is screened for the presence of antibody specific for the selected antigen. Cultures containing the desired antibody are cloned by dilution until a single cell culture is obtained. The antibodies of the present invention can be used as a passive vaccine against infections and diseases caused by intestinal bacteria.

A gazdában lévő antitesek vagy nevezett baktériumok kimutatására használt módszerek közé tartoznak az immunológiai kimutatáson alapuló eljárások, melyek ismertek a szakterületen,. Ilyen eljárás lehet a radioimmunológiai vizsgálat (RIA), az enzimkötött immunszorbens vizsgálat (ELISA), a fluoreszcens immunológiai vizsgálat és a fluoreszcenciás polarizációs immunológiai vizsgálat (FPIA), bár a módszerek nem korlátozódnak csak a felsoroltakra .Methods for detecting antibodies or named bacteria in the host include immunoassay detection techniques known in the art. Such procedures include, but are not limited to, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent immunoassay, and fluorescent polarization immunoassay (FPIA).

• « · ·• «· ·

A találmány egy másik kivitelezési módját jelentik a diagnosztikai készletek, melyek a jelen találmány szerinti kívánt immunológiai vizsgálat elvégzéséhez szükséges valamennyi lényeges reagenst tartalmazzák. A diagnosztikai készlet kereskedelmi csomagolásban lehet, ami a szükséges reagenseket tartalmazó egy vagy több tartóedényt jelent. Az ilyen készlet a jelen találmány szerinti bélbaktériumot és/vagy a jelen találmány szerinti monoklonális vagy poliklonális antitestet tartalmazza néhány szokásos komponenssel együtt. A szokásos komponensek nyilvánvalóak a szakemberek előtt, és számos közleményben szerepelnek, például az Antibodies A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane; Cold. Spring Harbor Laboratory Press, 1989) kézikönyvben. A készletek a szokásos módon tartalmazhatnak például: mikrotitter lemezeket, a vizsgálati elegy kémhatását beállító puffereket (Tris, HEPES, stb), konjugált másod antitesteket, például peroxidáz konjugált egér anti-IgG-t (vagy bármilyen más anti-IgG-t abból az állatból, melyből az első antitest származik), stb. és más standard reagenseket.Another embodiment of the present invention is the diagnostic kits, which contain all the essential reagents necessary to perform the desired immunoassay of the present invention. The diagnostic kit may be in commercial packaging, which means one or more containers containing the required reagents. Such a kit contains the gut bacterium of the present invention and / or the monoclonal or polyclonal antibody of the present invention together with some common components. Conventional components will be readily apparent to those skilled in the art and are included in numerous publications, such as the Antibodies A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane; Cold. Spring Harbor Laboratory Press, 1989). The kits may contain, for example, microtiter plates, assay mixing buffers (Tris, HEPES, etc.), conjugated second antibodies, such as peroxidase-conjugated mouse anti-IgG (or any other anti-IgG from that animal) in the usual manner. , from which the first antibody comes), etc. and other standard reagents.

A jelen találmány szerinti eljárás szerint a bélbaktériumokat megfelelő alap-táptalajon tenyésztjük, melyek tartalmazzák a nélkülözhetetlen alkotórészeket. Ilyen táptalaj például a kereskedelmi forgalomban lévő agy/szív kivonat (BHI), a Luria táptalaj (LB) , birkavéres agar (SBA), a Brucella táptalaj, a Meuller-Hinton táptalaj, a marhahús kivonat, stb. Az alkalmazott körülmények - bár nem korlátozva csak ezekre -: 0,05-3 % epe, vagy 0,025-0,6 % egy vagy több epesav vagy sója vagy előanyaga, például koleszterin jelenlétében 30-42°C hőmérsékleten addig növesztjük a tenyészetet, amíg a növekedési fázis el nem éri a ko26 rai lóg fázist, a korai lóg és a stacioner fázis közötti állapotot vagy a stacioner fázist. A tenyésztést levegőn vagy mikroaerofill körülmények között végezzük, ami például 5-20 % CO2 és 80-95 % levegő; 5-20 % CO2 és 80-95 % N2; vagy 5-10 % O2,According to the method of the present invention, the intestinal bacteria are cultured on a suitable basic medium containing the essential ingredients. Such media include commercially available brain / heart extract (BHI), Luria medium (LB), sheep blood agar (SBA), Brucella medium, Meuller-Hinton medium, beef extract, and the like. The conditions used include, but are not limited to, 0.05 to 3% bile, or 0.025 to 0.6% one or more bile acids, or salts or precursors, such as cholesterol, at 30 to 42 ° C until growth is achieved. the growth phase does not reach the coagulation phase, the state between the early phase and the stationary phase, or the stationary phase. The culture is carried out in air or under microaerophilic conditions such as 5-20% CO 2 and 80-95% air; 5-20% CO 2 and 80-95% N 2 ; or 5-10% O 2 ,

10-20 % CO2 és 70-85 % N2 összetételű gázelegy. A tenyésztést adott esetben kétértékű kation-kelátképző jelenlétében végezzük, ami lehet - bár nemcsak a felsoroltakra korlátozva 0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ BAPTA/AM [ 2' -(etilén-dioxi)-dianilin-N,N,Ν' , Ν' -tetraecetsav/acetoxi-metil-észter; Molecular Probes, Eugene,It is a gas mixture of 10-20% CO 2 and 70-85% N 2 . The cultivation is optionally carried out in the presence of a divalent cationic chelating agent, which may be, but is not limited to, 0-100 μΜ, preferably 25 μΜ BAPTA / AM [2 '- (ethylenedioxy) dianiline-N, N, Ν', Ν '-tetraacetic acid / acetoxymethyl ester; Molecular Probes, Eugene,

OR, USA) 0-10 μΜ EGTA (etilén-bisz(oxi-etilén-nitrilo)-tetraecetsav; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 0-100 μΜOR, USA) 0-10 μΜ EGTA (ethylene bis (oxyethylene nitrile) tetraacetic acid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 0-100 μΜ

EGTA/AM etilén-bisz(oxi-etilén-nitrilo)-tetraecetsav/acetoxi-metil-észter; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). A fenti tenyésztési körülmények és komponensek megválasztásával fokozott antigénaktivitású bélbaktériumokat állítunk elő.EGTA / AM ethylene bis (oxyethylene nitrile) tetraacetic acid / acetoxymethyl ester; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). By selecting the above culture conditions and components, intestinal bacteria with enhanced antigenic activity are prepared.

A találmány egy további megvalósítási módjánál a bélbaktériumokat az előzőekben ismertetett körülmények között növesztjük kétértékű kation-kelátképző jelenlétében - ami lehet például 1,0-100 μΜ, előnyösen 25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 mM EGTA vagy 1,0-100 μΜ EGTA/AM - nem korlátozva csak a felsoroltakra -, de epe, epesav vagy sója nincs a tenyészközegben.In a further embodiment of the invention, the intestinal bacteria are grown under the conditions described above in the presence of a divalent cationic chelating agent, for example 1.0-100 μΜ, preferably 25 μΜ BAPTA / AM, 0.5-10 mM EGTA or 1.0-100 μΜ μΜ EGTA / AM - but not limited to - but no bile, bile acid or salt in culture medium.

A jelen találmány által használt epe vagy epesav, illetve só, lehet bármilyen, a máj által kiválasztott és az epehólyagban természetes körülmények között összegyűjtött természetes epekomponens, illetve a szakterületen ismert szintetikus epesav, mint amilyen például az „Oxgall (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), szarvasmarha epe (Sigma Chemicals, St. Louis,The bile or bile acid or salt used in the present invention may be any of the natural bile components selected by the liver and collected naturally in the gallbladder, or synthetic bile acids known in the art, such as Oxgall (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). , bovine bile (Sigma Chemicals, St. Louis,

Missuori) vagy más, a kereskedelmi forgalomból beszerezhető készítmény, kolsav, deoxikolsav, taurokolsav vagy glikokolsav. Előnyös a deoxikolát (DOC), az in vivő a disztális vékonybélben és vastagbélben lévő, egy kevés bélbaktériumot tartalmazó kereskedelmi forgalomból beszerezhető epe. Ugyancsak előnyös a glikokolát (GC).Missuori) or other commercially available formulations, colic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid or glycolic acid. Preferred is deoxycholate (DOC), a bile commercially available in the distal small intestine and colon, containing a small amount of intestinal bacteria. Glycocholate (GC) is also preferred.

A találmány szerinti bélbaktérium tenyészetek, nevezetesen a Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Shigella sp. , Clostridium sp., Enterococcus sp. és Escherichia coli tenyészet fagyasztott állománya, a szokásos módon elkészíthető és a felhasználásig -80°C hőmérsékleten tárolható. Például a Campylobacter jejuni tárolt törzsanyag elkészíthető oly módon, hogy a mikroorganizmust 5 % fibrinmentes birka eritrocitákat (SBA) tartalmazó triptikáz-szója-agar táptalajon 20 órán át növesztjük 37°C hőmérsékleten és 5 % O2, 10 % CO2 és 85 % N2 összetételű gáztérben (mikroaerofill körülmények, „MC). Az Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori és Shigella flexneri tárolt törzsanyagának elkészítéséhez mikroorganizmusokat agy/szív kivonaton („BHI) tenyésztjük. A baktériumokat a lefagyasztáshoz bármelyik ismert módszerrel összegyűjthetjük, például a letörölt tenyészet 30 % glicerint tartalmazó BHI-ben való szuszpendálásával. Az analitikai vizsgálatokhoz vagy a termelő fermentálásokhoz a tenyészeteket bármelyik általánosan ismert módszerrel előállíthatjuk, például a mikroorganizmust 1,5 % agart tartalmazó BHI táptalajon növesztjük 37°C hőmérsékleten és MC vagy légköri körülmények között, majd egy különálló telepet átviszünk a tápközegbe és a jelen találmányban leírtak szerint tenyésztjük. A baktériumsejteket bármelyik ismert módszerrel, például centrifugálással, összegyűjthetjük.Intestinal bacterial cultures of the invention, namely Campylobacter sp., Yersinia sp., Helicobacter sp., Gastrospirillum sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp., Aeromonas sp. , Vibrio sp. , Shigella sp. , Clostridium sp., Enterococcus sp. and Escherichia coli cultures, frozen and stored at -80 ° C until use. For example, a stock stock of Campylobacter jejuni can be prepared by growing the microorganism on tryptase soy agar medium containing 5% fibrin-free sheep erythrocytes (SBA) for 20 hours at 37 ° C and 5% O 2 , 10% CO 2 and 85% N 2 gas composition (microaerophilic conditions, "MC"). Microorganisms are cultured in brain / heart extract ("BHI") to prepare stored stock of Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori and Shigella flexneri. The bacteria can be harvested for freezing by any known method, for example by suspending the wiped culture in BHI containing 30% glycerol. For analytical assays or productive fermentations, cultures can be prepared by any method known in the art, for example, by culturing the microorganism on BHI medium containing 1.5% agar at 37 ° C and MC or atmospheric conditions, then transferring a separate colony into the medium and as described in the present invention. we breed. The bacterial cells may be harvested by any known method, such as centrifugation.

Előnyös kivitelezési módnál a fokozott antigénaktivitású Campylobacter sp-t, előnyösen a jejuni vagy coli fajokat, legelőnyösebben a jejuni 81-176 törzset 0,1 % DOC-t vagy 0,8 % epét tartalmazó alaptáptalajon, előnyösen BHI tápközegben tenyésztjük 37°C hőmérsékleten, 10-20 % CO-t és 80-90 % levegőt tartalmazó gáztérben. Amikor a növekedési faktor eléri a késői lóg fázis és a stacioner fázis közötti állapotot, általában 20 órával a beoltás után, a baktériumsejteket összegyűjtjük.In a preferred embodiment, the highly antigenic activity of Campylobacter sp, preferably jejuni or coli species, most preferably jejuni strain 81-176, is cultured in a basic medium containing 0.1% DOC or 0.8% bile, preferably BHI medium at 37 ° C, In a gas space containing 10-20% CO and 80-90% air. When the growth factor reaches the state between the late log phase and the stationary phase, usually 20 hours after inoculation, the bacterial cells are harvested.

Egy másik előnyös eljárásnál a fokozott antigénaktivitású Shigella sp.-t előnyösen flexneri vagy dysentrieae fajokat, legelőnyösebben a flexneri 3457T törzset alaptáptalajon, előnyösen BHI táptalajon, melyet 0,1 % DOC-cal vagy 0,8 % epével kiegészítettünk, növesztjük 37°C hőmérsékleten. A sejteket a tenyészet korai lóg fázisában, általában a 30 perccel a beoltás után összegyűjtjük. Az említett beoltás korai és közép lóg fázis közötti állapotban lévő tenyészettel történik.In another preferred method, Shigella sp. With increased antigenic activity is preferably grown in flexneri or dysentrieae species, most preferably flexneri strain 3457T, in basic medium, preferably BHI medium supplemented with 0.1% DOC or 0.8% bile at 37 ° C. . Cells are harvested in the early hanging phase of the culture, usually 30 minutes after inoculation. Said inoculation is carried out with culture between the early and mid-log phase.

Egy másik előnyös eljárásnál a fokozott antigénaktivitású Helicobacter pylorit, előnyösen az ATCC 495003, NB3-2 vagy Gl-4 törzset alaptáptalajon, előnyösen BHI tápközegben tenyésztjük 0,05-0,2 % epe vagy 0,05 % glikolát (GC) jelenlétében 37°C hőmérsékleten, 5-20 % C02 és 80-95 % levegő vagy 10 % CO2, 5 % O2 és 85 % N2 összetételű gáztérben. Amikor a tenyészet eléri a lóg fázist vagy a stacioner fázist, a sejteket összegyűjtjük. Előnyösebb, ha a tenyészet a lóg fázisban van.In another preferred method, Helicobacter pylori with enhanced antigen activity, preferably ATCC 495003, NB3-2 or Gl-4, is cultured in a basic medium, preferably BHI medium, in the presence of 0.05-0.2% bile or 0.05% glycolate (GC) at 37 ° C. C, 5-20% CO 2 and 80-95% air or 10% CO 2 , 5% O 2 and 85% N 2 . When the culture reaches the hanging phase or the stationary phase, the cells are harvested. More preferably, the culture is in the hanging phase.

A kizárólag csak az alaptáptalajon növekvő sejtekhez képest, a találmány szerint tenyésztett bélbaktériumoknak megváltozik a morfológiája, és/vagy sejtmozgékonysága és/vagy bizonyos új fehérjéket, lipopoliszacharidokat és/vagy szénhidrogéneket termelnek és/vagy az említett makromolekulák koncentrációja nő. Optimális az a tenyésztési körülmény, ahol nő a sejthozam és a patogenocitási index. Ezeket a tenyésztési körülményeket használva, kimutatható a virulenciával kapcsolatos antigének kiváltása vagy mennyiségük növekedése.The intestinal bacteria cultured according to the invention change their morphology and / or cell motility and / or produce certain novel proteins, lipopolysaccharides and / or hydrocarbons and / or the concentration of said macromolecules increases in comparison with cells growing only on the basic medium. The culture conditions with increased cell yield and pathogenicity index are optimal. Using these culture conditions, virulence-related antigens can be induced or increased.

A mobilitási vagy a feltűnő morfológiai változásokat a kezeletlen vagy a festett baktériumok mikroszkópiái vizsgálatával figyelhetjük meg. A jelen találmány szerinti eljárások más morfológiai változásokat is okozhatnak, melyek elektronmikroszkóppal vagy fluoreszcencia-mikroszkóppal láthatók.Mobility or striking morphological changes can be observed by microscopic examination of untreated or stained bacteria. The methods of the present invention may also cause other morphological changes as seen with an electron microscope or a fluorescence microscope.

A jelen találmány szerint tenyésztett bélbaktériumok morfológiája és a nyálkaszerű jellegzetessége arra utal, hogy tok és/vagy felületi réteg expressziója indukálódhatott. A tok kialakításának vizsgálatához elkészíthető a felületi komponensek fehérjék, szénhidrátok és lipopoliszacharidok - fenolos extraktuma. A HPLC vizsgálatok arra utalnak, hogy megnőtt a szénhidrátok mennyisége.The morphology and mucosal character of the gut bacteria cultured in accordance with the present invention suggest that expression of the capsule and / or surface layer may have been induced. The phenolic extract of proteins, carbohydrates and lipopolysaccharides of surface components can be prepared to investigate the design of the capsule. HPLC studies indicate an increase in carbohydrates.

A jelen találmány virulenciát fokozó körülményei között tenyésztett baktériumok külső membránjainak fehérjeösszetételét nátrium-dodecil-s zulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) vizsgálhatjuk, és az eredményeket összehasonlítjuk a szokásos táptalajon növesztett baktériumok gélelektroforetikus képével. Az SDS-PAGE analízis arra utal, hogy az antigénaktivitást fokozó vagy megváltoztató körülmények következményeként változások történnek a baktériumsejt extrahált fehérjéiben. Ezek az • * adatok mennyiségi és minőségi adatokat szolgáltatnak a megnövekedett behatolóképességgel és a megváltozott antigenicitással összefüggő felületi változásokról.The protein composition of the outer membranes of the bacteria grown under the virulence enhancing conditions of the present invention can be analyzed by sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the results are compared with the bacterial gel electrophoresis of conventional media. SDS-PAGE analysis indicates that conditions that increase or alter antigenic activity result in changes in the extracted protein of the bacterial cell. These data * provide quantitative and qualitative data on surface changes associated with increased penetration and altered antigenicity.

Az indukált vagy megváltozott fehérje antigének immunizáló képességét Western Blotting analízissel állapíthatjuk meg. Az indukált vagy megváltoztatott és az SDS-PAGE módszerrel azonosított baktérium fehérjék immunogenicitását a Western Blotting eljárás alábbiakban leírásra kerülő, általánosan alkalmazott technikáival értékelhetjük. A bakteriális antigének vizsgálatához az antitesteknek bármilyen forrását használhatjuk, ez lehet például reconvaleseens nyúl- vagy vadászmenyét-savó (az antitest forrása olyan állat, amit orálisan megfertőztünk a szokásos körülmények vagy a találmány szerinti körülmények között tenyésztett élő mikroorganizmusokkal), bélnyálka (IgA antitest forrása), poliklonális antiszérum vagy monoklonális antitest, például olyan, ami kereszt-reaktív a C.jejuni flagellinjével.Immunization ability of induced or altered protein antigens can be determined by Western Blotting analysis. Immunogenicity of the bacterial proteins induced or altered and identified by SDS-PAGE can be assessed by the commonly used techniques of Western Blotting as described below. Any source of antibodies can be used to test for bacterial antigens, such as reconvalescent rabbit or hunting whey (the source of the antibody is an animal orally infected with live microorganisms cultured under normal conditions or the conditions of the invention), intestinal mucus (source of IgA antibody). , a polyclonal antiserum or a monoclonal antibody, for example, which is cross-reactive with C.jejuni flagellin.

A bakteriális antigének némelyikének megnövekedett termelése együtt jár a virulenciával kapcsolatos tulajdonságok erősödésével. Ezek közé a tulajdonságok közé tartozik a tenyésztett humán bélhámsejteken való megtapadási és behatolóképesség és Congo-vörössel való festődés. A virulencia megállapításának egy általánosan elfogadott módja a Congo-vörös festék megkötésének vizsgálata. A módszert Andrews és munkatársai [Infect. Immun.,Increased production of some bacterial antigens is associated with enhanced virulence-related properties. These properties include adhesion and penetration of cultured human intestinal epithelial cells and staining with Congo red. A commonly accepted way to determine virulence is by examining the setting of Congo-red dye. The method was described by Andrews et al., Infect. Immun.,

60:3287-3295, (1992)] valamint Yoder [ Avian Dis., 33:502-505 (1989)] írják le, és az eljárást az alábbiakban ismertetjük. A baktérium Congo-vöröset megkötő képessége összhangban van a hemint megkötő képességével, ez pedig a baktérium virulenciájával. A Congo-vöröst megkötő képesség a baktériumoknak a hámsej31 tekbe való behatolóképességével is korrelációban van.60: 3287-3295 (1992)] and Yoder (Avian Dis., 33: 502-505 (1989)) and the process is described below. The bacterium's ability to bind Congo-red is consistent with its ability to bind hemin, which is the virulence of the bacterium. The ability to bind Congo red is also correlated with the ability of bacteria to penetrate epithelial cells.

Korábban bizonyítást nyert már, hogy a legtöbb szokásos módon növesztett C.jejuni Lior szérumtípus nem ad immunológiai keresztreakciót egymással. Ezért, hogy a Campylobacterral szemben általános védelmet nyújthassunk, számos eltérő Lior szérumtípusú törzs vakcináját kellett elkészíteni és beadni, vagy egy kombinált készítményt kellett összeállítani. A találmány szerint előállított, fokozott antigenecitású Campylobacter immunológiai keresztreaktivitása a Lior szérumtípusok szélesebb spektrumára terjed ki, mint a szokásos módon tenyésztett Campylobacteré. Hasonló a helyzet a Shigella fajoknál is. Ezek az immunológiai keresztreaktivitások és keresztvédelmek az alábbiakban leírásra kerülő agglutinációs vizsgálatokkal és oltóanyag kísérletekkel bizonyítottak.Previously, it has been proven that most of the conventionally grown C.jejuni Lior serum types do not cross-react with each other. Therefore, in order to provide general protection against Campylobacter, vaccines for many different strains of Lior serum types had to be prepared and administered, or a combination product had to be formulated. The immunological cross-reactivity of the highly antigenic Campylobacter produced according to the invention extends to a broader spectrum of Lior serum types than the conventionally cultured Campylobacter. The situation is similar for Shigella species. These immunological cross-reactivity and cross-protection were demonstrated by the agglutination assays and vaccine experiments described below.

A jelen találmánynak a fokozott antigénaktivitású bélbaktériumok előállítására vonatkozó eljárásai kapcsolatban vannak a kisállat modelleken tapasztalt fokozott virulenciával. Néhány háziállat felhasználható az ember Campylobacter okozta megbetegedésének modellezésénél. Az immunizáló képesség szempontjából a legtöbbet vizsgált a reverzibilis béllekötés, a felnőtt nyúl hasmenése [ KITÁRD Modell; Coldwell és munkatársai, Infect. Immun., 42:1176-1182 (1983)] . Ez a modell a Lior szérumtípusoknak a törzsek közötti keresztvédelemmel való kapcsolatát is demonstrálja. A modellel azonban inkább a kolonizációval, mint a betegséggel szembeni ellenállóképességet mérhetjük. Bell és munkatársainak vadászgörény-modellje [Infect. Immun., 58:1848-1852 (1990)] alkalmasabb lehet, minthogy ezen az állaton hasonló tünetek jelentkeznek, mint az ember Campylobacter okozta megbete32 gedésénél. Újabb, a Bagar-féle [ Intención and Immunity, 63:3731-3735 (1995)] egér kolozizációs modell. Immunizált egeret orron vagy szájon át élő Campylobacterrel fertőznek meg, és vizsgálják a bélben való megtelepedést, nyomon követve a fekáliában a Campylobacter jelenlétét.The methods of the present invention for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity are related to the increased virulence observed in pet models. Some pets can be used to model human Campylobacter disease. Reversible bowel ligation, adult rabbit diarrhea, has been the most studied for immunization ability [ANSWER Model; Coldwell et al., Infect. Immun., 42: 1176-1182 (1983)]. This model also demonstrates the relationship between Lior serum types in cross-strain protection. However, the model can be used to measure resistance to colonization rather than disease. Ferret model of Bell et al., Infect. Immun., 58: 1848-1852 (1990)] may be more suitable for this animal to exhibit similar symptoms to human disease caused by Campylobacter. A more recent mouse colonization model of Bagar (Intención and Immunity, 63: 3731-3735 (1995)). Immunized mice are infected with nasal or oral Campylobacter and examined for colonization in the intestine, monitoring for the presence of Campylobacter in the faeces.

Egerek Shigellával orron keresztüli fertőzését Malett és munkatársai (lásd 37. példa) írják le. Ezzel a módszerrel állítják meg a fertőzőképességet és az oltóanyag védőképességét. A találmány szerinti eljárással előállított Helicobacter pylori vakcina hatékonyságát Chen és munkatársai [ Láncét, 339:1120-1121 (1992)] módszerével állapítjuk meg. A módszer a Helicobacter telis gyomorban történő megtelepedésének modelljét használja.Nasal infection of mice with Shigella is described by Malett et al. (See Example 37). This method is used to stop the infectivity and the protective capacity of the vaccine. The efficacy of the Helicobacter pylori vaccine produced by the method of the present invention is determined by the method of Chen et al., (1992), Chain 339: 1120-1121. The method uses a model of colonization of Helicobacter telis in the stomach.

A bélbaktériumok inváziójára és fertőzésére más állatmodellek is vannak, melyek felhasználhatók a jelen találmány szerint előállított, fokozott aktivitású bélbaktériumokkal készített vakcinák hatékonyságának vizsgálatára.There are other animal models for intestinal bacterial invasion and infection that can be used to test the efficacy of the highly active intestinal bacteria vaccines of the present invention.

A jelen találmány szerint előállított fokozott antigénaktivitású bélbaktériumok felhasználhatók az elölt teljes sejtet vagy alegységet tartalmazó vakcina prototípusának elkészítésére. Ezeket az oltóanyagokat állatokba juttatva, kimutatható az antitestek keletkezésének indukálása és a vakcina védőhatása. A baktérium antigének indukálása vagy fokozása olyan baktériumot eredményez, melyek a vakcinát még hatásosabbá teszik.Intestinal bacteria with enhanced antigen activity produced according to the present invention can be used to prepare a prototype vaccine containing a whole cell or subunit killed. By administering these vaccines to animals, the induction of antibody production and the protective effect of the vaccine can be demonstrated. Induction or enhancement of bacterial antigens results in bacteria that make the vaccine more effective.

A találmány szerint előállított vakcinajelölt készítményeket különféle, a nyálkahártyán át immunizáló módszerrel felhasználhatjuk az intesztinális immunválasz kiváltására. A sikeres immunizációs eljárás felhasználható aztán az élőlényeknek a fokozott vagy nem-fokozott antigenecitású kórokozókkal szembeni védelmé33 re. Az oltóanyagot elkészíthetjük és vizsgálhatjuk összetett vakcina alakjában is, például egyetlen vakcina tartalmazhatja a Shigella és a Campylobacter sejteket vagy sejtalkotó részeket.The vaccine candidate compositions of the present invention can be used to induce an intestinal immune response by a variety of mucosal immunization techniques. A successful immunization procedure can then be used to protect organisms against pathogens with increased or non-enhanced antigenicity. The vaccine may also be prepared and tested as a complex vaccine, for example, a single vaccine may contain Shigella and Campylobacter cells or cellular constituents.

Az ismertetésre kerülő kísérleti megközelítések alkalmasak arra, hogy kimutassuk a felületi antigénekben vagy más, a fokozott behatolóképességgel kapcsolatos tulajdonságokban bekövetkező változásokat. Ezek a változások lehetnek mennyiségi vagy minőségi jellegűek. A legfontosabb, hogy ezek a kísérletek bizonyítják, hogy a jelen találmány szerinti eljárások fokozzák a behatolóképességet és immunológiailag fontos antigéneket indukálnak. Az ilyen fokozott antigénaktivitású bélbaktérium immunizáló választ vált ki, mely védelmet nyújt a baktérium törzsek, szérumtípusok és/vagy fajok széles tartományával szemben, és ezért hatékonyabb oltóanyagként alkalmazható, mint a szokásosan növesztett baktérium.The experimental approaches described are useful for detecting changes in surface antigens or other intrinsic properties. These changes can be quantitative or qualitative. Most importantly, these experiments demonstrate that the methods of the present invention enhance penetration and induce immunologically important antigens. Such a highly antigenic gut bacterium elicits an immunizing response that provides protection against a broad range of bacterial strains, serum types and / or species, and is therefore more effective as a vaccine than conventionally grown bacteria.

Néhány, jól meghatározott modell általánosan ismert a szakterületen, és amint a későbbiekben leírjuk, alkalmasak a baktériumok fokozott antigénaktivitási tulajdonságainak, fertőzőképességének megállapítására.Some well-defined models are generally known in the art and, as described below, are useful in determining the enhanced antigenic activity and infectivity of bacteria.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.The following are examples to illustrate what has been said. The examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

PéldákExamples

Eljárások fokozott antigénaktivitású baktériumok előállításáraMethods for producing bacteria with increased antigenic activity

1. példaExample 1

Campylobacter jejuni 81-176 törzset kenünk fel véres agar lemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és mikroaerofill GasPak edényben (BBL, Cockeysville, MD, USA) inkubáljuk 37°C hőmérsékleten 20 órán át. A baktériumréteget letörölve összegyűjtjük, és 1 liter BHI tápközeget oltunk be vele, ami 0,8 % OXGALL-t (Difco, Detroit,Campylobacter jejuni strains 81-176 were spread on a blood agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocytes) and incubated in a microaerophilic GasPak dish (BBL, Cockeysville, MD, USA) for 20 hours. The bacterial layer was harvested and harvested and inoculated with 1 liter of BHI medium, 0.8% OXGALL (Difco, Detroit,

MI,USA) rartalmaz. A táptalajt előzőleg ekvilibráljuk 10 % CO2 és 90 % levegő összetételű gázeleggyel. A lezárt edényt 10 % C02 és 80 % levegő összetételű légtérben 20 órán át rázatjuk 37°C hőmérsékleten, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűj tjük.MI, USA). The medium was previously equilibrated with a gas mixture of 10% CO 2 and 90% air. The sealed vessel was shaken in an atmosphere of 10% CO 2 and 80% air for 20 hours at 37 ° C, and the cells were harvested as described above.

2. példaExample 2

Campylobacter jejuni 81-176 törzset kenünk fel véres agar lemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és 20 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten egy mikroaerofill GasPak edényben (BBL, Cockeysville, MD, USA) . A baktériumréteget letöröljük, és ezzel oltunk be 1 liter BHI tápközeget, ami 0,01-0,1 % nátrium-deoxikolátot (DOC) tartalmaz. A tápközeget előzőleg 10 % CO2 és 90 % levegő összetételű gázeleggyel ekvilibráljuk. (Fontos, hogy a DOC-ot a BHI tápközegtől külön, mint törzsoldatot készítsük el és autoklávozzuk, majd közvetlenül a baktériummal való beoltás előtt adjuk aszeptikus körülmények között a BHI táptalajhoz). A tenyészetet különböző ideig, leghosszabban 20 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten 5 % O2, 10 % CO2 és 85 % N2 összetételű gáztérben, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Campylobacter jejuni strains 81-176 were spread on a blood agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocyte) and incubated for 20 hours at 37 ° C in a microaerophilic GasPak dish (BBL, Cockeysville, MD, USA). The bacterial layer was wiped and inoculated with 1 L of BHI medium containing 0.01-0.1% sodium deoxycholate (DOC). The medium was previously equilibrated with a gas mixture of 10% CO 2 and 90% air. (It is important that DOC is prepared and autoclaved separately from the BHI medium as a stock solution and added aseptically to the BHI medium immediately before inoculation with the bacterium). The culture was incubated at 37 ° C in 5% O 2 , 10% CO 2 and 85% N 2 for various periods of time, up to 20 hours, and cells were harvested as described above.

3. példaExample 3

Campylobacter jejuni 81-176 törzset felkenünk véres agar lemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és 20 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten egy mikroaerofill GasPak edényben (BBL, Cockeysville, MD, USA) . A baktériumréteget letöröljük, és ezzel oltunk be 1 liter Brucella tápközeget, ami 0,01-0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tápközeget előzőleg 10 % CO2-t tartalmazó gázeleggyel ekvilibráljuk. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten rázatjuk 20 órán át 5 % O2, 10 % CO2 és 85 % N2 összetételű gázelegyben, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Campylobacter jejuni strains 81-176 were spread on a blood agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocyte) and incubated for 20 hours at 37 ° C in a microaerophilic GasPak dish (BBL, Cockeysville, MD, USA). The bacterial layer was wiped and inoculated with 1 liter Brucella medium containing 0.01-0.1% sodium deoxycholate. The medium was pre-equilibrated with a gas mixture containing 10% CO 2 . The culture was shaken at 37 ° C for 20 hours in a gas mixture of 5% O 2 , 10% CO 2 and 85% N 2 , and the cells were harvested as described above.

4. példaExample 4

Campylobacter jejuni 81-176 törzset felkenünk véres agar lemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és egy mikroaerofill GasPak edényben (BBL, Cockeysville, MD, USA) inkubáljuk 20 órán át 37°C hőmérsékleten. A baktériumréteget lemossuk, és ezzel oltunk be 1 liter Mueller-Hinton táptalajt, ami 0,01-0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tápközeget előzetesen 10 % CO2-t tartalmazó gázeleggyel ekvilibráltuk. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten rázatjuk 20 órán • · · · • · · · • ·« « · · · át 5 % 02, 10 % CO2 és 85 % N2 összetételű gázelegyben, majd a fentiekben leírt módon a sejteket összegyűjtjük.Campylobacter jejuni strains 81-176 were spread on a blood agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocyte) and incubated in a microaerophilic GasPak dish (BBL, Cockeysville, MD, USA) for 20 hours at 37 ° C. The bacterial layer was washed and inoculated with 1 liter of Mueller-Hinton medium containing 0.01-0.1% sodium deoxycholate. The medium was pre-equilibrated with a 10% CO 2 gas mixture. The culture was shaken at 37 ° C for 20 hours in a gas mixture containing 5% 0 2 , 10% CO 2 and 85% N 2 , and the cells were harvested as described above. .

5. példaExample 5

Campylobacter jejuni 81-176 törzset felkenünk véres agar lemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és egy mikroaerofill GasPak edényben (BBL, Cockeysville, MD, USA) 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 20 órán át. A baktériumréteget lemossuk és ezzel oltunk be 1 liter BHI tápközeget, ami 0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tápközeget előzőleg 10 % CO2-t tartalmazó gázeleggyel ekvilibráljuk. A tenyészetet lassan kevertetve 20 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten, 10 % CO2, 90 % levegő összetételű légtérben, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Campylobacter jejuni strains 81-176 were spread on a blood agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocyte) and incubated in a microaerophilic GasPak dish (BBL, Cockeysville, MD, USA) at 37 ° C for 20 hours. The bacterial layer was washed and inoculated with 1 L of BHI medium containing 0.1% sodium deoxycholate. The medium was pre-equilibrated with a gas mixture containing 10% CO 2 . The culture is slowly incubated for 20 hours at 37 ° C, 10% CO 2 , 90% air, and cells are harvested as described above.

6. példaExample 6

Vibrio cholerae baktériumot kenünk fel BHI agarlemezre (triptikáz-szója-agar, ami 5 % fibrinmentes birka vörösvértestet tartalmaz), és 37°C hőmérsékleten levegőn inkubáljuk 20 órán át. A baktériumréteget lemossuk, és ezzel oltunk be 1 liter BHI tápközeget, ami 0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten, levegő alatt rázatjuk 20 órán át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Vibrio cholerae was spread on BHI agar plate (tryptase soy agar containing 5% fibrin-free sheep erythrocyte) and incubated at 37 ° C in air for 20 hours. The bacterial layer was washed and inoculated with 1 liter of BHI medium containing 0.1% sodium deoxycholate. The culture was shaken at 37 ° C under air for 20 hours and the cells were harvested as described above.

7. példaExample 7

Salmonella cholerasius baktériumot kenünk fel BHI agarlemezekre, és 37°C hőmérsékleten inkubálunk 20 órán át. A • · • · · • · ··«··· · ·· · ·· baktériumréteget lemossuk, és ezzel oltunk be 1 liter BHI tápközeget, ami 0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tenyészeteket 37°C hőmérsékleten, levegő alatt rázatjuk 20 órán át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Salmonella cholerasius was plated on BHI agar plates and incubated at 37 ° C for 20 hours. The bacterial layer was washed and inoculated with 1 liter of BHI medium containing 0.1% sodium deoxycholate. The cultures were shaken in air at 37 ° C for 20 hours and the cells were harvested as described above.

8. példaExample 8

Salmonella typhimurium baktériumot kenünk fel Luria tápagarlemezekre és a lemezeket 37°C hőméréskleten, levegőn inkubáljuk 20 órán át. A baktériumréteggel 1 liter BHI tápközeget oltunk be, mely tápközeg 0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmaz. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten, 10 % CO2, 90 % levegő öszszetételű gáztérben rázatjuk 20 órán át. Egy telepet átviszünk 0,1 % DOC-ot tartalmazó 1 liter LB tápközegbe, és egy lezárt edényben inkubáljuk 37°C hőmérsékleten lassú kevertetés mellett. 12 óra múlva 60 ml tenyészetet átviszünk 1 liter friss, előmelegített, ugyanilyen tápközegbe, és további 30 percen át inkubálunk, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűj tjük.Salmonella typhimurium was spread on Luria medium plates and incubated in air at 37 ° C for 20 hours. The bacterial layer was inoculated with 1 liter of BHI medium containing 0.1% sodium deoxycholate. The culture was shaken at 37 ° C, 10% CO 2 , 90% air for 20 hours. One colony is transferred to 1 L of LB medium containing 0.1% DOC and incubated in a sealed vessel at 37 ° C with slow agitation. After 12 hours, 60 ml of the culture is transferred to 1 liter of fresh preheated medium and incubated for another 30 minutes, and the cells are harvested as described above.

9. példaExample 9

Shigella flexneri 2457T törzset felkenünk Congo-vöröset tartalmazó agarlemezre és a lemezt 37°C hőmérsékleten, levegőn inkubáljuk. Egyetlen vörös teleppel beoltunk 1 liter BHI tápközeget, és 12 órán át rázatjuk a tenyészetet. 50 ml nyert tenyészettel beoltunk 250 ml előmelegített, 0,1 % nátrium-deoxikolátot tartalmazó BHI tápközeget. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten, levegőn rázatjuk 4 órán át. Ezt a tenyészetet 0,17 OD600 • · értékre hígítjuk előmelegített BHI táptalajjal, ami 0,1 % DOC-ot tartalmaz, és 30 percen át rázatjuk a tenyészetet 37°C hőmérsékleten és levegőn, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűj tjük.Shigella flexneri strain 2457T was spread on a Congo-red agar plate and incubated at 37 ° C in air. One liter of colony was inoculated with 1 liter of BHI medium and shaken for 12 hours. 50 ml of the resulting culture was inoculated with 250 ml of preheated BHI medium containing 0.1% sodium deoxycholate. The culture was shaken in air at 37 ° C for 4 hours. This culture was then diluted to 0.17 OD600 • · to prewarmed BHI broth containing 0.1% DOC was, and shaken culture was at 37 ° C in air for 30 minutes, and the cells collect place ongoing manner described above.

10. példaExample 10

Campylobacter jejuni 81-176, 81-116 vagy HC törzsek preparátumát (BHI közegben 30 % glicerinnel) gyorsan felolvasztjuk és birkavéres agarra (SBA) lemezeljük (0,1 ml lemezenként). A beoltott lemezeket GasPak edényben 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk CampyPak Plus mikroaerofill környezeti generátor (BBL, Cockeysville, MD, USA) segítségével 20 órán át. A baktériumréteget letöröljük a lemezről és 10 ml BHI közegben szuszpendáljuk. A baktérium-szuszpenzióval beoltunk egy kétliteres edényben lévő 1 liter BHI tápközeget vagy 0,1 % DOC-ot tartalmazó BHI tápközeget. A tápközeget előzetesen 10 % CO2, 90 % levegő összetételű gázeleggyel ekvilibráljuk. Az inokulumot addig adjuk az előekvilibrált tápközeghez, amíg el nem érjük a 0,05 OD600 értéket. A beoltott edényt visszahelyezzük a 10 % CO2, 90 % levegő összetételű gáztérbe, és 37°C hőmérsékleten lassan kevertetjük 20 órán át. Ekkor a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűj tjük.Preparation of Campylobacter jejuni strains 81-176, 81-116 or HC (30% glycerol in BHI medium) was rapidly thawed and plated on sheep blood agar (SBA) (0.1 mL per plate). The inoculated plates were incubated in a GasPak vessel at 37 ° C for 20 hours using a CampyPak Plus microaerophil environment generator (BBL, Cockeysville, MD, USA). The bacterial layer was wiped from the plate and resuspended in 10 ml of BHI medium. The bacterial suspension was inoculated with 1 L of BHI medium or BHI medium containing 0.1% DOC in a 2 liter dish. The medium was pre-equilibrated with a gas mixture of 10% CO 2 , 90% air. The inoculum was added until the előekvilibrált medium until it reaches an OD 600 value of 0.05. The inoculated vessel is returned to the gas chamber containing 10% CO 2 , 90% air and stirred slowly at 37 ° C for 20 hours. The cells are then harvested as described above.

11. példaExample 11

Helicobacter pylori baktériumot adunk 4 % borjúszérummal kiegészített BHI tápközegbe. Beoltás után az edényeket 5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2 összetételű gázeleggyel öblítjük át, és 37°C hőmér• ·Helicobacter pylori is added to BHI medium supplemented with 4% bovine serum. After inoculation, the vessels are flushed with 5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 , and a temperature of 37 ° C.

sékleten rázatjuk 22 órán át. Az inkubálás után 2,5 ml tenyészetet átviszünk 4 % borjúszérumot tartalmazó BHI tápközegbe, illetve ugyanilyen tápközegbe, ami 0,05 % nátrium-glikolátot is tartalmaz. Ezeket a tenyészeteket ismét átöblítjük a mikroaerofill gázeleggyel. (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2) , lezárjuk és 12 órán át 37 °C hőmérsékleten rázatjuk. A baktériumtenyészetet ezután ugyanilyen tápközeggel hígítjuk 0,17 OD600 értékre, majd ugyanolyan körülmények között inkubálunk, amíg a tenyészet el nem éri a korai lóg fázist. Ez általában a hígítás utáni 30.shake for 22 hours. After incubation, 2.5 ml of the culture is transferred to BHI medium containing 4% bovine serum and to the same medium containing 0.05% sodium glycolate. These cultures are again rinsed with the microaerophilic gas mixture. (5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 ), seal and shake for 12 hours at 37 ° C. The bacterial culture is then diluted to 0.17 OD 600 with the same medium and incubated under the same conditions until the culture reaches the early log phase. This is usually 30 after dilution.

percben érhető in minutes el. A sej teket a. The cell does a fentiekben leírt as described above módon way összegyűj tjük. collect it. 13. példa Example 13 Salmonella Salmonella typhimurium typhimurium baktériumot kenünk fel LB bacterial application LB agarlemezre, és on an agar plate, and a tenyésztést breeding 37°C 37C hőmérsékleten, levegőn temperature, air végez- végez- zük 18-20 órán stir for 18-20 hours át. Felveszünk over. taken up egy one telepet és átvisszük 1 and transfer 1 liter liter

LB tápközegbe vagy 0,1 % DOC-ot tartalmazó LB tápközegbe, ésLB medium or LB medium containing 0.1% DOC, and

37°C hőmérsékleten levegőn tartjuk 12 órán át. A tenyészetet ugyanolyan friss tápközeggel meghígítjuk (1/5), és a fenti körülmények között inkubáljuk 4 órán át. A tenyészetet ezután ugyanolyan friss tápközeggel hígítjuk 0,17 OD600 értékre és a fentiekkel azonos körülmények között növesztjük, amíg el nem éri a lóg fázist. Ehhez általában a hígítás után 30 percre van szükség. A sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Air at 37 ° C for 12 hours. The culture was diluted (1/5) with the same fresh medium and incubated for 4 hours under the same conditions. The culture is then diluted to 0.17 OD 600 with the same fresh medium and grown under the same conditions until it reaches the hanging phase. This usually requires 30 minutes after dilution. Cells were harvested as described above.

14. példaExample 14

Klebsiella pneumoniae baktériumot kenünk fel BHI agar lemez·· ···» ·· · ···♦ • · · · · · · ····· ··· · • ·· ······ · ······· ·· · · ·Klebsiella pneumoniae was spread on BHI agar plate ······ ··· ···· ·· · · ·

- 40 re, és a lemezt 37°C hőmérsékleten, levegőn tartjuk 18-20 órán át. Felveszünk egy telepet és beoltunk vele 1 liter BHI tápközeget vagy 0,1 % DOC-ot tartalmazó BHI tápközeget. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten, levegőn rázatjuk 12 órán át. A tenyészetet ugyanolyan friss tápközeggel hígítjuk 0,17 OD600 értékre, és tovább növesztjük 30 percen át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.- 40 and the plate is kept in air at 37 ° C for 18-20 hours. A battery is picked up and inoculated with 1 liter of BHI medium or BHI medium containing 0.1% DOC. The culture was shaken in air at 37 ° C for 12 hours. The culture was diluted with the same fresh medium to 0.17 OD 600 and further grown for 30 minutes and the cells were harvested as described above.

15. példaExample 15

Enterobacter cloacae baktériumot kenünk fel BHI agarlemezre, és a lemezt 18-20 órán át 37°C hőmérsékleten, levegőn tartjuk. Egy teleppel beoltunk 1 liter BHI tápközeget vagy 0,1 % DOC-ot tartalmazó BHI tápközeget, és a tenyészetet 37 °C hőmérsékleten rázatjuk 12 órán át. A baktériumokat ugyanolyan friss tápközeggel hígítjuk 0,17 OD600 értékre, 30 percen át tovább növesztjük, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Enterobacter cloacae was plated on a BHI agar plate and the plate was exposed to air at 37 ° C for 18-20 hours. One colony was inoculated with 1 L of BHI medium or BHI medium containing 0.1% DOC and the culture was shaken for 12 hours at 37 ° C. The bacteria were diluted with the same fresh medium to 0.17 OD 600 , grown for 30 minutes, and the cells were harvested as described above.

16. példaExample 16

Escherichia coli 0157:H7 törzset kenünk fel birkavéres agarlemezre, és a lemezt 37°C hőmérsékleten, levegőn tartjuk 17-20 órán át. Egy teleppel beoltunk 1 liter BHI tápközeget vagy 0,1-0,2 % DOC-ot tartalmazó BHI tápközeget, és a tenyészetetEscherichia coli 0157: H7 strain was spread on sheep blood agar plate and the plate was kept in air at 37 ° C for 17-20 hours. One colony was inoculated with 1 liter of BHI medium or BHI medium containing 0.1-0.2% DOC and the culture was

37°C hőmérsékleten rázatjuk 12 órán át. A tenyészetet 0,17 OD600 értékre hígítjuk és tovább növesztünk 30 percen át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Shake at 37 ° C for 12 hours. The culture was diluted to 0.17 OD 600 and further grown for 30 minutes and the cells harvested as described above.

17. példaExample 17

Enterococcus faecalis baktériumot kenünk fel birkavéres ··· ·Enterococcus faecalis bacterium is applied on sheep blood ··· ·

- 41 agarlemezre, és a lemezt 37 °C hőmérsékleten, levegőn tartjuk 18-20 órán át. Egy teleppel beoltunk 1 liter BHI tápközeget vagy 0,1 % DOC-ot tartalmazó BHI tápközeget, és a tenyészetet 37°C hőmérsékleten rázatjuk 12 órán át. A baktériumokat 0,17 OD600 értékre hígítjuk, és tovább növesztünk 30 percen át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.- 41 agar plates and kept in air at 37 ° C for 18-20 hours. One colony was inoculated with 1 L of BHI medium or BHI medium containing 0.1% DOC and the culture was shaken for 12 hours at 37 ° C. The bacteria were diluted to 0.17 OD 600 and further grown for 30 minutes, and the cells were harvested as described above.

18. példaExample 18

Clostridium difficile baktériumot (darabolt hús módosított kivonatában 30 % glicerinnel) kenünk fel az anaerob vizsgálatokhoz használt szarvasmarha máj kivonatot és 1,5 % agart tartalmazó lemezre, és a lemezeket 37°C hőmérsékleten tartjuk mikroaerofill körülmények között (5 % CO2 és 95 % N2). Egy teleppel beoltunk 1 liter darabolt hús módosított kivonatát tartalmazó táptalajt vagy ugyanilyen táptalajt, mely 0,1 % DOC-ot tartalmaz. A baktériumot mikroaerofill körülmények között tenyésztjük 37°C hőmér-Clostridium difficile bacterium (modified in minced meat extract with 30% glycerol) was spread on a plate containing bovine liver extract and 1.5% agar used for anaerobic assays and maintained at 37 ° C under microaerophilic conditions (5% CO 2 and 95% N). 2 ). The colonies were inoculated with medium containing 1 liter of modified meat extract or the same medium containing 0.1% DOC. The bacterium was cultured under microaerophilic conditions at 37 ° C.

sékleten 12 órán összegyűj tjük. stool for 12 hours collect it. át, majd a over, then fentiekben above leírt módon as described a sejteket cells 19. példa Example 19 Bacteroides Bacteroides fragilis baktériumot (darabolt hús fragilis (cut meat) módosított modified kivonatában 30 % in extract 30% glicerinnel) glycerol) kenünk fel lubricate darabolt hús cut meat módosított modified

kivonatot tartalmazó agarlemezre, és a lemezeket 37°C hőmérsékleten tartjuk mikroaerofill körülmények között (5 % CO2 és 95 % N2)- Egy teleppel beoltunk 1 liter darabolt hús módosított kivonatát tartalmazó táptalajt vagy ugyanilyen táptalajt, mely 0,1 %extract and agar plate at 37 ° C under microaerophilic conditions (5% CO 2 and 95% N 2 ) - Inoculate with 1 liter medium containing the modified extract of cut meat or the same medium containing 0.1%

DOC-ot tartalmaz, és mikroaerofill körülmények között tenyészt42 jük 37°C hőmérsékleten 12 órán át, majd a fentiekben leírt módon a sejteket összegyűjtjük.It contains DOC and is cultured under microaerophilic conditions at 37 ° C for 12 hours, and cells are harvested as described above.

20. példaExample 20

Yersinia pseudotuberculosis baktériumot (30 % glicerint tartalmazó Luria tápközegben) kenünk fel Luria táptalajt tartalmazó agarlemezre, és a lemezt 30°C hőmérsékleten tartjuk. Egy teleppel beoltunk 1 liter LB tápközeget, és a tenyészetet 30°C hőmérsékleten tartjuk 12 órán át. Ezt a tenyészetet LB vagy 0,1 %Yersinia pseudotuberculosis bacterium (30% glycerol in Luria medium) was plated on a Luria medium agar plate and maintained at 30 ° C. One colon was inoculated with 1 L of LB medium and kept at 30 ° C for 12 hours. This culture was either LB or 0.1%

DOC-ot tartalmazó LB tápközeggel hígítjuk meg (1/5) és 4 órán át inkubáljuk 37°C hőméréskleten. A tenyészetet ugyanolyan tápközeggel 0,17 OD600 értékre hígítjuk, tovább növesztünk 30 percen át, majd a sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.It is diluted (1/5) with DB containing DOC and incubated for 4 hours at 37 ° C. The culture was diluted to 0.17 OD 600 with the same medium, further grown for 30 minutes, and cells were harvested as described above.

21. példaExample 21

Helicobacter pylori baktériummal oltunk be 4 % borjúszérumot tartalmazó BHI tápközeget. A beoltás után az edényeket átöblítjük 5 % O2, 10 % CO2 és 85 % N2 összetételű gázeleggyel, majd a tenyészetet 37°C hőmérsékleten rázatjuk 22 órán át. 2,5 ml ilyen tenyészettel beoltunk 4 % borjúszérumot tartalmazó BHI tápközeget vagy ugyanilyen tápközeget, ami 0,1-0,2 % szarvasmarha-epét tartalmaz. Az edényeket ismét átöblítjük a mikroaerofill gázeleggyel (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2) , és a tenyészeteket 37°C hőmérsékleten tartjuk 20-24 órán át. A sejteket a fentiekben leírt módon összegyűjtjük.Helicobacter pylori was inoculated with BHI medium containing 4% bovine serum. After inoculation, the vessels were rinsed with 5% O 2 , 10% CO 2 and 85% N 2 and shaken at 37 ° C for 22 hours. 2.5 ml of this culture was inoculated with BHI medium containing 4% bovine serum or the same medium containing 0.1-0.2% bovine bile. Flasks were rinsed again with the microaerophilic gas mixture (5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 ) and the cultures maintained at 37 ° C for 20-24 hours. Cells were harvested as described above.

Az alábbi példák a fokozott antigénaktivitású baktériumokkal foglalkozik.The following examples deal with bacteria with increased antigenic activity.

• · ♦ · · • ·· · ·• · ♦ · · · · · · ·

22. példaExample 22

A natív (nedvesen kiemelt) baktériumok mikroszkópiái vizsgálatát használjuk a baktériumok mozgékonyságának és szemmel látható morfológiájának megfigyelésére. A felületi rétegek tanulmányozásához a tokot tusban festjük. Levegőn való szárítás után a sejteken kristály-ibolyával ellenfestést végzünk. Valamennyi megfigyeléshez 1000-szeres nagyítást használunk.Microscopic examination of native (wet-raised) bacteria is used to observe the bacterial motility and apparent morphology. To study the surface layers, the case is painted in ink. After air drying, the cells are counterstained with crystal violet. A 1000x magnification is used for each observation.

A jelen találmány szerint tenyésztett baktériumok (a továbbiakban „fokozott aktivitású baktériumok) morfológiája eltérő a csak alaptáptalajon nőtt (a szokásos körülmények között nőtt) baktériumok morfológiájától. Például a fokozott aktivitású C. jejuni aggregálódik és nagy sejtcsomókat képez, míg a szokásos körülmények között növök jobbára magányosak. A tok festésének adataiból (az adatok nem bemutatottak) nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti tenyészkörülmények hatással vannak a baktérium felületére. A felület változása azt eredményezi, hogy a fokozott aktivitású sejtek felülete jobban megköti a nigrozin festékszemcséket. A fokozott aktivitású baktérium megőrzi nagyfokú mozgékonyságát.The morphology of the bacteria cultured in accordance with the present invention (hereinafter referred to as "high activity bacteria") is different from the morphology of bacteria grown only on the basic medium (grown under normal conditions). For example, high-activity C. jejuni aggregates and forms large cell clusters, whereas under normal conditions the plants are mostly solitary. From the staining data of the capsule (data not shown), it is evident that the culture conditions of the present invention affect the surface of the bacterium. The change in surface area results in enhanced surface activity of the nigrosin dye particles on the surface of high activity cells. The highly active bacterium retains a high degree of motility.

23. példaExample 23

A C.jejuni felületi alkotórészeit fenolos extrahálással analizáljuk. Az extraktumot a szokásos, illetve a 2. példában leírt módon tenyésztett C.jejuni 81-176 törzsből készítjük. A C.jejuni sejteket centrifugálással gyűjtjük össze és a fermentléből, amint azt a fentiekben leírtuk. A sejtüledéket szobahőmérsékle• «· · · · ten 2 órán át extraháljuk 1 %-os fenollal. Az inakt sejteket 45 perces centriguálással választjuk el az extrahált anyagtól. A baktérium felületi komponenseit tartalmazó felülúszót egy éjszakán át dializáljuk desztillált vízzel szemben. A visszamaradt folyadékot 4°C hőmérsékleten és 105.000 g értéken centrifugáljuk 3 órán keresztül. Az extraktum üledékét 10 % nátrium-klorid oldatban ismét feloldjuk, és kétszeres térfogatú 95 %-os etanollal lecsapjuk. A lecsapást megismételjük, és a mintát fagyasztva szárítjuk. További analízishez a mintát 1 mg/ml koncentrációban oldjuk vízzel.Surface constituents of C.jejuni were analyzed by phenol extraction. The extract was prepared from C.jejuni strains 81-176, conventionally grown or cultured as described in Example 2. C.jejuni cells are harvested by centrifugation and from the fermentation broth as described above. The cell pellet was extracted with 1% phenol for 2 hours at room temperature. Inactivated cells are separated from the extracted material by centrifugation for 45 minutes. The supernatant containing the bacterial surface components was dialyzed overnight against distilled water. The remaining liquid was centrifuged at 4 ° C and 105,000 g for 3 hours. The pellet of the extract was redissolved in 10% sodium chloride solution and precipitated with two volumes of 95% ethanol. The precipitation was repeated and the sample was freeze-dried. For further analysis, the sample is dissolved in water at a concentration of 1 mg / ml.

A kivonat szénhidrát tartalmát az általánosan használt fenolos/kénsavas módszerrel vizsgáljuk, standardként glükózt használva. A kivonat uronsav tartalmát Dische-féle módszerrel mérjük, karbazol reagenst használva. A fenolos kivonat összfehérje-tartalmár készlettel (Pierce Chem. Co. , Rockford, IL, USA) határozzuk meg.The carbohydrate content of the extract is assayed using the commonly used phenolic / sulfuric acid method using glucose as the standard. The uronic acid content of the extract was measured by the Dische method using a carbazole reagent. The phenolic extract was determined using a total protein assay kit (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, USA).

Érdemes megjegyezni, hogy az uronsav hiányzott a kivonatból. Sok baktérium tokjának tipikus összetevői az uronsavpolimerek. Meglepő módon a C.jejuni 81-176 felületi kivonata elsősorban fehérjét tartalmaz. A fokozott aktivitású sejtek kivonata viszont több össz-szénhidrát-tartalommal rendelkezik, mint a szokásos módon növesztetté.It is worth noting that uric acid was missing from the extract. Typical components of many bacterial shells are uronic acid polymers. Surprisingly, the surface extract of C.jejuni 81-176 contains mainly protein. Extracted cells, on the other hand, have a higher total carbohydrate content than is normally grown.

A kivonat szénhidrát:fehérje arányát az I. táblázat mutatja.The carbohydrate: protein ratio of the extract is shown in Table I.

··« ··· «·

- 45 I. TÁBLÁZAT- 45 TABLE I

A szokásos módon (BHI) és a 2. példa szerint („fokozott) növesztett C.jejuni sej tfelület kivonatának szénhidrát:fehérje arányaCarbohydrate: protein ratio of C.jejuni cell surface extract grown in the usual way (BHI) and exemplified ("enhanced")

beoltás utáni after vaccination BHI BHI „ fokozott' 'Enhanced' idő (óra) time (hours) 1 1 0, 02 0, 02 0,02 0.02 2 2 0, 02 0, 02 0,10 0.10 4 4 0, 02 0, 02 0,15 0.15 6 6 0, 03 0, 03 0,29 0.29

Közvetlen összefüggés van a tenyészközeg DOC tartalma és a baktérium felületi kivonatának szénhidrát-tartalma között (I.There is a direct relationship between the DOC content of the culture medium and the carbohydrate content of the bacterial surface extract (I.

táblázat). A találmány szerint tenyésztett baktériumok felületi kivonatában több, mint nyolcszorosára nő a szénhidráttartalom; a szokásos módon tenyésztett baktériumnál növekedés nem tapasztalható. Rehidratációnál a kivonat vízben erősen gélesedő kapacitást mutat, egy sűrűnfolyós, nyálkaszerű oldatot eredményezve, ami hasonlít az aggregálódott baktériumot állagához. A kivonat funkcionálissága hasonlít a nyálkaszerű glikoproteinekre.spreadsheet). The surface extract of the bacteria cultivated according to the invention increases the carbohydrate content by more than eightfold; no growth was seen with the bacteria cultured normally. When rehydrated, the extract shows a highly gelling capacity in water, resulting in a dense, mucus-like solution that resembles that of aggregated bacteria. The extract is similar in functionality to mucus-like glycoproteins.

Az egyes szénhidrogének analizálásához a kivonatot lezárt edényben 1 normál trifluor-ecetsavval hidrolizáljuk. A mintát 2 órán át szárítjuk nitrogéngáz alatt, majd ismételten szuszpendáljuk vízben. A cukrozott HPLC módszerrel választjuk szét Dionex Corp kromatográfiás mátrixon, az eluens összetétele: 3 % 0,5 normál nátrium-hidroxid oldat, 97 % víz. Az elválasztott monoszacharidok mérésénél amperometrikus detektálást alkalma• ··♦· * zunk. Összehasonlító anyagként fukózból, galaktózaminból, glükózaminból, galaktózból, glükózból és mannózból álló standard elegyet használunk.For analysis of each hydrocarbon, the extract is hydrolyzed in a sealed vessel with 1 N trifluoroacetic acid. The sample was dried under nitrogen for 2 hours and then resuspended in water. Separate by the HPLC method on a Dionex Corp. chromatographic matrix, eluting with 3% 0.5 N sodium hydroxide solution, 97% water. Ammonometric detection is used to measure the separated monosaccharides. The reference mixture is a standard mixture of fucose, galactosamine, glucosamine, galactose, glucose and mannose.

A felületi kivonat HPLC analízise néhány monoszacharid jelenlétére utal (1. ábra). Nics minőségi különbség a szénhidrátösszetétel tekintetében a szokásos módon és a 2. példában leírtak szerint tenyésztett baktériumok extraktuma között, de kis mennyiségi különbözőség megfigyelhető.HPLC analysis of the surface extract indicates the presence of some monosaccharides (Figure 1). There is no difference in quality of carbohydrate composition between the bacterial extract cultivated in the usual manner and as described in Example 2, but a slight difference is observed.

24. példaExample 24

A baktériumok fehérjéit SDS-PAGE és Western Blotting módszerrel analizáljuk. Az elektroforézishez Lugtenberg és munkatársai gélrendszerét használjuk [ FEBS Letters, 58:254-258 (1975)] . A folytonos gélrendszer alacsony akrilamid tartalmú (általában 4 %) gélből, pH - 6,8 és magasabb akrilamid tartalmú elválasztó gélből, pH = 8,8, áll. Mindkét gél tartalmazBacterial proteins were analyzed by SDS-PAGE and Western Blotting. The gel system of Lugtenberg et al. (FEBS Letters, 58: 254-258 (1975)) was used for electrophoresis. The continuous gel system consists of a low acrylamide (usually 4%) gel, a separation gel of pH 6.8 and higher acrylamide pH 8.8. Both gels contain

SDS-t (0,1 %) és puffért. A fehérjék elválasztása a molekula mérete alapján történik, az elválasztáshoz 8 % vagy 12 % akrilamidot tartalmazó gélt használunk. A fehérjéket a fixált gélen ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. A molekulaméret meghatározását standardként szolgáló ismert fehérjék Mr értékeinek alapján végezzük.SDS (0.1%) and buffer. Separation of proteins is based on the size of the molecule, using a gel containing 8% or 12% acrylamide. Proteins are visualized on the fixed gel by silver staining. The molecular size is determined from the M r values of known proteins that serve as standard.

A C.jejuni sejt fehérjéit SDS-PAGE módszerrel választjuk el, és ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. A DOC jelenlétében tenyésztett baktériumokban négy protein, beleértve a 62 kDa nagyságot, indukálódott vagy ezek mennyisége nőtt (2. ábra).C.jejuni cell proteins are separated by SDS-PAGE and visualized by silver staining. In bacteria cultured in the presence of DOC, four proteins, including 62 kDa, were induced or increased (Figure 2).

«· »··» ··** « ·»« « · ♦ * · • · » · «··* * ♦ ·(.·«·«· · * · ·♦«·» ·· »·· **« · »« «· ♦ * · •» · «·· * * ♦ · (. ·« · «· · * · · ♦

- 47 25. példa- 47 Example 25

Az S.flexneri baktérium LPS összetételét fenolos extrahálással analizáljuk. Az S.flexneri sejteket a szokásos módon vagy a 9. példában leírtak szerint tenyésztjük és a fentiekben leírt módon, centrifugálással gyűjtjük össze. A lipopoliszacharidokat (LPS) Westphal és Jann [ R. Whistler szerk., Methods inThe LPS composition of S.flexneri was analyzed by phenol extraction. S.flexneri cells are cultured in the usual manner or as described in Example 9 and harvested by centrifugation as described above. Lipopolysaccharides (LPS) are described by Westphal and Jann (R. Whistler, Eds., Methods in

Carbohydrate Chemistry, 5. kötet, 83. oldal (1965)] módszerével extraháljuk. Röviden: a BHI tápközegben vagy a 9. példában leírtak szerint tenyésztett baktériumot centrifugálással összegyűjtjük és egyszer mossuk PBS-sel. A sejteket 68°C hőmérsékleten extraháljuk 45 % fenolt tartalmazó vizes oldattal 15 percen át. A kivonatot 10°C hőmérsékletűre hűtjük és centrifugáljuk. Az LPS-t tartalmazó felső vizes fázist leszívjuk és desztillált vízzel szemben dializáljuk. A visszamaradt folyadékot 7 órán át centrifugáljuk 4°C hőmérséklete 80.000 g értéknél, majd háromszor centriguáljuk 105.000 g értéken, minden centrifugálást 3 órán át végezve. A végső üledéket fagyasztva szárítjuk. Analízis előtt az LPS-t vízben szuszpendáljuk (1 mg/ml). A tisztított LPS szénhidrát tartalmát a fentiekben leírt módon, az LPS összetételt a fentiekben ismertetett SDS-PAGE módszerrel analizáljuk (5. ábra).Carbohydrate Chemistry, Vol. 5, p. 83 (1965)]. Briefly, the bacterium grown in BHI medium or as described in Example 9 was harvested by centrifugation and washed once with PBS. The cells were extracted with an aqueous solution of 45% phenol at 68 ° C for 15 minutes. The extract was cooled to 10 ° C and centrifuged. The upper aqueous phase containing LPS is aspirated and dialyzed against distilled water. The remaining liquid was centrifuged for 7 hours at 80,000 g at 4 ° C and centrifuged three times at 105,000 g for 3 hours each centrifugation. The final pellet is freeze-dried. Prior to analysis, LPS was suspended in water (1 mg / ml). The carbohydrate content of the purified LPS was analyzed as described above, and the LPS composition was analyzed by SDS-PAGE as described above (Figure 5).

Az adott SDS-PAGE rendszerben nincs nagy különbség a szokásos módon növesztett és a fokozott aktivitású S.flexneri sejtek fehérjeösszetétele között. Az LPS száraz-tömegéhez viszonyított szénhidrátarány a fokozott aktivitású sejteknél kisebb, mint a BHI tápközegben nőtt sejtek extraktumában. Az S.flexneri LPS oxidálását és ezüstfestést követő SDS-PAGE kép azonban nagy el··· ·In the given SDS-PAGE system, there is no significant difference between the protein composition of conventionally grown and highly active S.flexneri cells. The ratio of carbohydrate to dry weight of LPS is less in high activity cells than in the extract of cells grown in BHI medium. However, the SDS-PAGE image after S.flexneri LPS oxidation and silver staining is large · ·· ·

- 48 térést mutat az LPS összetételben (5. ábra). Amint a „2 sávban látható, a fokozott aktivitású S.flexneriből származó LPS 0-antigén frakciójánál a hosszúság csökken. Ez az eredmény összhangban van azzal a megállapítással, hogy a fokozott aktivitású baktériumból származó LPS-nél csökken a szénhidrát/LPS száraz tömeg arány.- shows 48 deviations in the LPS composition (Figure 5). As shown in lane 2, the length of the LPS 0 antigen fraction from the highly active S.flexneri decreases. This result is consistent with the finding that LPS from high activity bacteria decreases the carbohydrate / LPS dry weight ratio.

Ezek az eredmények a „fokozott aktivitású sejteken rövidebb O-antigén oldallánc jelenlétére utalnak, ami a baktériumot potencionálisan hidrofóbbá teheti. A hidrofóbbá vált baktérium és a bél hidrofób felülete között szorosabb kölcsönhatás alakulhat ki .These results suggest the presence of a shorter O-antigen side chain on the cells with increased activity, which could potentially make the bacterium more hydrophobic. A closer interaction between the hydrophobic bacterium and the hydrophobic surface of the intestine may occur.

26. példaExample 26

A fehérjék immunogén aktivitását Western Biot eljárással állapítjuk meg. A hagyományos módon vagy a jelen találmány szerint, a fenti 1. vagy 5. példában leírtak alapján tenyésztett baktériumokból nyert fehérjéket SDS-PAGE módszerrel választjuk szét, majd elektrof oretikus úton nitrocellulóz vagy PVDF membránra visszük át, és a szokásos blokkoló ágenssel [ 3 % BSA, 50 mM Trisz (pH = 8,5 ), 50 mM NaCl, 0,2 % Tween 20] rögzítjük a fehérjéket. Primer antitestet alkalmazunk blokkoló pufferben, a „blot-ot kimossuk és a membránt egy jelző szekunder antitesttel reagáltatjuk. Mosás után a foltokat színt vagy kromofort képező reagenssel tesszük láthatóvá. Jelző ágensként torma peroxidázt vagy bázikus foszfatázt alkalmazunk.The immunogenic activity of the proteins was determined by Western Biot. Proteins obtained from bacteria cultured in conventional manner or according to the present invention as described in Examples 1 or 5 above are separated by SDS-PAGE and electrophoretically transferred to a nitrocellulose or PVDF membrane and the usual blocking agent [3% BSA , 50 mM Tris pH 8.5, 50 mM NaCl, 0.2% Tween 20]. Priming antibody was used in blocking buffer, the blot was washed, and the membrane was reacted with a labeled secondary antibody. After washing, the spots are visualized with a color or chromophore-forming reagent. The labeling agent used is horseradish peroxidase or basic phosphatase.

A 3. ábra a fehérjéknek az immunizált nyúl IgA-t tartalmazó nyálkájával végzett Western Biot analízisének eredményét mutat··· · « · · 9· · • C « • ··» • * ···· ··· ja. Amint látható, a 60 kDa nagyságú fehérje az immundomináns antigén. A 62 kDa nagyságú fehérje antigenicitása erősen megnövekszik a DOC vagy az epe jelenlétében tenyésztett sejteknél. Ez a fehérje a DOC jelenlétében tenyésztett sejtek felületi kivonatában is a túlsúlyban lévő antigén.Figure 3 shows the result of Western Biot analysis of proteins with immunized rabbit IgA-containing mucus · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · As can be seen, the 60 kDa protein is the immunodominant antigen. The antigenicity of the 62 kDa protein is greatly increased in cells cultured in the presence of DOC or bile. This protein is also the predominant antigen in the surface extract of cells cultured in the presence of DOC.

A Campylobacter flagellinjével keresztreaktív egér monoklonális antitest felhasználásával kimutatható, hogy a megnövekedett mennyiségű fehérje a C.jejuni flagellinje (4. ábra). Ez lényeges felfedezés volt, mert több kutató kimutatta, hogy a C.jejuni flagellinje szerepet játszik a patogenezisben és kapcsolatban van a baktérium behatolóképességével.Using a murine monoclonal antibody cross-reactive with Campylobacter flagellin, it can be shown that the increased amount of protein is C.jejuni flagellin (Figure 4). This was an important discovery because several researchers have shown that C.jejuni's flagellin plays a role in pathogenesis and has been linked to bacterial invasion.

27. példaExample 27

A fertőzőképesség mérését a Congo-vörös festék megkötésével végezzük. A bélbaktériumot a szokásos körülmények között (BHI) vagy a találmány szerinti körülmények között („fokozott aktivitású) növesztjük 0,025 % Congo-vörös festéket tartalmazó BHI agarlemezen. A baktériumokat desztillált vízben szuszpendáljuk és 10 percen át extraháljuk acetonnal. A sejttörmeléket centrifugálással ülepítjük, és a festék OD468 értékét 40 % acetont és 60 % vizet tartalmazó vakkal szemben mérjük. A festék fényelnyelését a sejtek 660 nm-en mért fényelnyeléséhez viszonyítjuk, és megállapítjuk az OD488/OD600 arányt. Az adatokat a II. táblázatban foglaltuk össze.Infectivity is measured by curing Congo-red dye. The intestinal bacterium is grown under normal conditions (BHI) or under the conditions of the invention ("enhanced activity") on a BHI agar plate containing 0.025% Congo red dye. The bacteria were suspended in distilled water and extracted with acetone for 10 minutes. Cell debris was pelleted by centrifugation and the dye OD 468 measured against a blank containing 40% acetone and 60% water. The light absorption of the dye was compared to the light absorbance of the cells at 660 nm and the OD 488 / OD 600 ratio was determined. The data are shown in Annex II. are summarized in Table.

········

II. TÁBLÁZATII. SPREADSHEET

A szokásos módon (BHI) és a jelen találmány szerint („fokozott aktivitású) növesztett kórokozó bélbaktériumok Congo-vörös festékmegkötése a festék abszorbanciája törzs_BHI_„fokozott aktivitású)Congo-red dye binding of pathogenic intestinal bacteria grown in the usual manner (BHI) and in accordance with the present invention (strain_BHI_ "increased activity)

jejuni 81-176 jejuni 81-176 0, 07 0, 07 0,49 0.49 jejuni 81-116 jejuni 81-116 0, 06 0, 06 0,49 0.49 typhimurium SR11 typhimurium SR11 0,05 0.05 0,30 0.30 flexneri 2457T flexneri 2457T 0, 02 0, 02 0,13 0.13 cholera 569b cholera 569b 0, 70 0, 70 2,00 2.00

Amint a II. táblázat adatai mutatják, a jelen találmány szerint tenyésztett néhány bélbaktérium Congo-vörös festéket megkötő képessége fokozódott. Ez arra vall, hogy a jelen találmány szerinti in vitro módszerek alkalmasak a virulencia és egyéb olyan tulajdonságok indukálására, melyekről ismert más baktériumoknál, hogy az in vivő patogenezissel kapcsolatban vannak.As shown in FIG. Table 3 shows that some intestinal bacteria cultivated according to the present invention have enhanced Congo red dye binding capacity. This suggests that the in vitro methods of the present invention are capable of inducing virulence and other traits known to other bacteria to be involved in in vivo pathogenesis.

28. példaExample 28

A baktériumok tenyésztett hámsejtekhez való hozzákötődésétBacteria attachment to cultured epithelial cells

Gálán és Curtiss [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6383-6387 (1989)] módszerével vizsgáljuk. A szöveti sejteket [ INT-407 vagy Henle sejtek (ATCC-CCL6) és CaCo-2 (ATCC-HTB37) humán bélsejtvonal] 24-lyukú szövettenyésztő lemezen növesztjük (37°C, 5 % CO2) , amíg a tenyészer be nem növi a felület 60-68 %-át. A közeg az alkalmazott sejtvonaltól függ. A Henle sejtekhez Dulbecco által módosított Eagle közeget használunk, amit 10 % szarvasmarhaembrió-szérummmal·, 50 mg/ml penicillin G-vel és 50 mg/ml sztreptomicinnel egészítünk ki. A CaCo-2 sejteket RPMI 1640 tápközegben tenyésztjük, melyet 10 % szarvamarhaembrió-szérummal, 50 mg/ml penicillin G-vel és 50 mg/ml sztreptomicinnel egészítünk ki. Legalább három órával a vizsgálat előtt, eltávolítjuk a tenyészközeget, a sejteket magnézium- és kalciumionokat tartalmazó Hank-féle kiegyensúlyozó sóoldattal (HBSS) kétszer mossuk. Az egyrétegű sejttenyészetet antibiotikumot nem tartalmazó növesztő közeggel fedjük le.Galán and Curtiss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6383-6387 (1989)]. Tissue cells (INT-407 or Henle cells (ATCC-CCL6) and CaCo-2 (ATCC-HTB37) human intestinal cell line) were grown in 24-well tissue culture plate (37 ° C, 5% CO 2 ) until the culture grew. 60-68% of the surface. The medium depends on the cell line used. Henle cells were supplemented with Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% bovine embryo serum, 50 mg / ml penicillin G and 50 mg / ml streptomycin. CaCo-2 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% horn embryo serum, 50 mg / ml penicillin G and 50 mg / ml streptomycin. At least three hours before the assay, the culture medium is removed and the cells are washed twice with Hank's Balancing Saline (HBSS) containing magnesium and calcium ions. The monolayer cell culture is overlaid with growth medium containing no antibiotic.

Az adhéziós vizsgálatokhoz a sejtpreparátumot az alábbiak szerint készítjük el. A lassan növekvő bélbaktériumoknál, mint amilyen a Campylobacter és a Helicobacter, a tenyészetet friss, előekvilibrált közeggel 0,1 OD625 értékre hígítjuk és ezután használjuk a vizsgálathoz. A Shigella és más gyorsan növekvő bélbaktériumnál a tenyészetet friss, előekvilibrált tápközeggel 0,17 OD625 értékre hígítjuk és így használjuk a vizsgálatokhoz. A baktériumtenyészetet hozzáadjuk a hámsejtekhez, hogy elkerüljük a telítettséget 10 baktériumot számítva egy sejtre. A szövettenyészetbe beoltott baktériumok számát lemezen történő számlálással állapítjuk meg. 5 % CO2-t tartalmazó légtérben a Campylobacter esetében a fertőzés után 2 órával, a Shigella esetében 30 perccel HBSS oldattal kimossuk a nem megkötött baktériumokat, majd a sejtréteget 0,1 % deoxikoláttal lizáljuk, és a lizátumot lemezeijük az adhézió megállapításához.For the adhesion assays, the cell preparation is prepared as follows. For slow growing intestinal bacteria such as Campylobacter and Helicobacter, the culture is diluted to 0.1 OD 625 with fresh pre-equilibrated medium and then used for assay. For Shigella and other fast growing intestinal bacteria, the culture is diluted to 0.17 OD 625 with fresh pre-equilibrated medium and used for assays. The bacterial culture is added to the epithelial cells to avoid saturation per 10 bacteria per cell. The number of bacteria inoculated into tissue culture is determined by counting on a plate. At 5% CO 2 in the air, 2 hours after infection in Campylobacter and 30 minutes in Shigella, the non-bound bacteria were washed with HBSS, and the cell layer was lysed with 0.1% deoxycholate and the lysate was plated for adhesion.

A szokásos módon vagy a jelen találmány szerinti körülmények között, például az 5. példában leírtak alapján tenyésztett C.jejuni 81-176 baktériumnak az INT-407 törzsekhez való kötődését a hőmérséklet a III. táblázatban bemutatott mértékben befolyásolta .The binding of C.jejuni 81-176 to the INT-407 strains, cultured in the usual manner or under the conditions of the present invention, for example as described in Example 5, is shown by the temperature shown in Figure III. .

A szokásos módon és a jelen találmány szerint tenyésztett néhány C.jejuni törzs eltérő kötődését a IV. táblázatban mutatjuk be.The differential binding of some C.jejuni strains cultured in the conventional manner and in accordance with the present invention is shown in Figure IV. is shown in Table.

A kötődés százalékos értékének kifejezéséhez a sejtrétegről eltávolított közegben lévő telepképző egység (CFU) számát elosztjuk a rétegre vitt ínokulum CFU értékével és szorozzuk százzal (adhézió %).To express the percentage of binding, the number of colony forming units (CFU) in the media removed from the cell layer is divided by the CFU value of the inoculum applied to the layer and multiplied by 100 (% adhesion).

III. TÁBLÁZATIII. SPREADSHEET

A hőmérséklet hatása a szokásos módon (BHI), illetve a találmányEffect of temperature in the usual way (BHI) and the invention

szerint tenyésztett („fokozott bred ("increased aktivi tású) active) C.jejuni baktériu- C.jejuni bacterial moknak az INT-407 sejtekhez való They are intended for INT-407 cells kötődésére binding hőmérséklet BH temperature BH fokozott aktivitású increased activity (adhézió, %) (adhesion,%) (adhézió, (Adhesion, Q. O Q. SHE 37°C 5,5 37 ° C 5.5 62,3 62.3 42°C 5,5 42 ° C 5.5 11,2 11.2 IV. T Á B ARC. T Á B LÁZAT loose A szokásos módon (BHI), illetve As usual (BHI), respectively a találmány the invention szerint tenyésztett cultivated („fokozott aktivitású) C.jejuni törzsek kötődése az INT-407 ("High activity") C.jejuni strains bind to INT-407

sejtekhez (BHI-hoz viszonyított növekedés)cells (growth relative to BHI)

törzs tribe BHI BHI fokozott aktivitású increased activity 81-176 81-176 1,0 1.0 8, 4 8, 4 81-116 81-116 1,0 1.0 12,5 12.5 HC HC 1,0 1.0 28,2 28.2

A behatolási vizsgálatnál a hámsejteket az adhéziós vizsgálatok53 nál fent ismertetett módon tenyésztjük és készítjük elő. A szokásos módon vagy a találmány szerint növesztett baktériumokat a telítettséget elkerülendő, olyan mennyiségben adjuk a hámsejtekhez, hogy 10 baktérium jusson egy hámsejtre. A sejttenyészethez adott baktériumtenyészetben a baktériumok számát kilemezeléssel állapítjuk meg. A Campylobacter baktériumokat 2 órán át, a Shigella baktériumokat 30 percen keresztül tartjuk az 5 % CO2-t tartalmazó légtérben tartott hámsejteken, majd a baktériumos közeget leszívjuk, és az egyrétegű tenyészetet növekedési tápközeggel borítjuk le, ami gentamicint tartalmaz, hogy a sejten kívüli baktériumokat elpusztítsuk. Ezek után csak a hámsejteken belül marad tenyészthető baktérium. A szén-dioxidos légtérben történő mkubálást tovább folytatjuk, C.jejuni baktériummal fertőzött sejtek esetében 3 órán át, a Shigella baktérium esetében 1,5 órán keresztül. Az egyrétegű tenyészetből HBSS-sel kimossuk a gentamicint, és a sejteket 0,1 %-os deoxikoláttal lizáljuk. A lizátumban lévő baktériumok számát lemezen meghatározzuk, és a glutamicines kezelést túlélt baktériumok és a fertőzéshez használt baktérium szuszpenzióban lévő baktériumok számának ismeretében kiszámoljuk a behatolási százalékot. A gentamicines kezelés után az egyrétegű tenyészetről visszanyert telepképző egységek számát (CFU) elosztjuk a telepre vitt fertőző anyag CFU számával, és a kapott értéket megszorozzuk százzal.In the penetration assay, epithelial cells are cultured and prepared as described above for adhesion assays53. Bacteria grown in the usual manner or according to the invention are added to the epithelial cells in an amount such that 10 bacteria can reach one epithelial cell to avoid saturation. In the bacterial culture added to the cell culture, the number of bacteria is determined by plating. Campylobacter bacteria are maintained for 2 hours, Shigella bacteria for 30 minutes in epithelial cells kept in 5% CO 2 , and the bacterial medium is aspirated and the monolayer culture is covered with growth medium containing gentamycin for extracellular bacteria. destroy. After that, only cultivable bacteria remain inside the epithelial cells. The incubation in carbon dioxide air was continued for 3 hours for cells infected with C.jejuni and 1.5 hours for Shigella. Gentamicin was washed out of the monolayer culture with HBSS and cells were lysed with 0.1% deoxycholate. The number of bacteria in the lysate is determined on a plate and the penetration percentage is calculated by knowing the number of bacteria surviving the glutamycin treatment and the number of bacteria present in the bacterial suspension used for infection. After gentamicin treatment, the number of colony forming units (CFU) recovered from the monolayer culture was divided by the CFU number of the infectious material transferred to the colony and multiplied by 100.

A hőmérsékletnek a hagyományos módon vagy a jelen találmány szerint, például a 5. példában leírtak alapján tenyésztett C.jejuni 81-176 INT-407 sejtekbe történő behatolására gyakorolt hatását az V. táblázatban mutatjuk be.The effect of temperature on the penetration of C.jejuni 81-176 INT-407 cells cultured in a conventional manner or according to the present invention, for example as described in Example 5, is shown in Table V.

A hagyományosan, illetve a találmány szerint tenyésztett né54 hány C.jejuni törzs INT-407 sejtekbe való eltérő behatolását a VI. táblázatban mutatjuk be.Differences in intracellular invasion of approximately 54 strains of C.jejuni, traditionally cultured and cultured according to the invention, are shown in Figure VI. is shown in Table.

A DOC hatását az INT-407 sejteken való megtapadásra és a sejtekbe való behatolásra a VII. táblázatban mutatjuk be a szokásosan és a jelen találmány 5. példája szerint növesztett C.jejuni 81-176 baktériumos összehasonlításával.The effect of DOC on adherence and penetration of INT-407 cells is shown in Figure VII. Table II shows a comparison of C.jejuni 81-176 bacteria grown normally and according to Example 5 of the present invention.

A DOC hatását az INT-407 sejteken való megtapadásra és a sejtekbe való behatolásra a VIII. táblázatban mutatjuk be a szokásosan és az 5. példa szerint növesztett Shigella baktériumok összehasonlításával.The effect of DOC on adherence to and penetration of INT-407 cells is shown in Table VIII. Table 5 shows a comparison of Shigella bacteria grown conventionally and Example 5.

V. TÁBLÁZATTABLE V

A hőmérséklet hatása a szokásosan (BHI), illetve a találmány szerint tenyésztett C.jejuni 81-176 („fokozott aktivitású) baktériumok INT-407 sejtekbe való behatolására hőmérséklet BHI (behatolási %) fokozott aktivitású (behatolási %)Effect of temperature on penetration of normal (BHI) or C.jejuni 81-176 ("high activity") cultured according to the invention into INT-407 cells at temperature BHI (% penetration) increased activity (% penetration)

37°C37C

2,52.5

49, 549, 5

42°C42 ° C

4,04.0

7,1 • · · · • · · · · · · • ··· · ··· · • · · ··«··· · ······· ·· · · ·7.1 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ···

VI. TÁBLÁZATVI. SPREADSHEET

A szokásosan (BHI), illetve a jelen találmány szerint tenyész-As usual (BHI) or according to the present invention,

tett („fokozott ("increased aktivi tású) active) C. jejuni törzsek C. jejuni strains behatolása az penetration of the INT-407 törzs INT-407 tribe sejtekbe cells BHI BHI fokozott aktivitású* increased activity * 81-176 81-176 1,0 1.0 9,2 9.2 81-116 81-116 1,0 1.0 10,0 10.0 HC HC 1,0 1.0 26, 7 26, 7 A BHI The BHI értékekhez values viszonyított relative érték value VII. T Á VII. T Á B L Á Z A T B L A L A T A DOC koncentrációjának hatása Effect of DOC concentration a C.jejuni 81-176 a C.jejuni 81-176 baktériumnak az bacteria INT-407 INT-407 sej teken shit valómegtapadására és a sejtekbe adhesion and into cells való behatoló- intruder

sára, összehasonlítva a szokásosan (BHI) és a jelen találmány szerint tenyészett („fokozott aktivitású) baktériumokat tenyésztés megtapadás (%) behatolás (%)compared to conventional (BHI) and cultured ("high activity") bacteria according to the present invention cultivation adherence (%) penetration (%)

BHI BHI 9,3 9.3 6, 3 6, 3 fokozott aktivitású, 0,025 % DOC high activity, 0.025% DOC 18,3 18.3 17,4 17.4 fokozott aktivitású, 0,1 % DOC enhanced activity, 0.1% DOC 52, 6 52, 6 37,0 37.0

• · • · · · • · · · · · · • ··· · ··· · • · · ··«··· · —_ ········· ···• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ··· ·

- 5 6 VIII. TÁBLÁZAT- 5 6 VIII. SPREADSHEET

Ά DOC hatása az S.flexneri baktériumnak az INT-407 sejten való megtapadására és a sejtekbe való behatolásra, összehasonlítva a szokásosan (BHI) és a jelen találmány szerint („fokozott aktivitású) tenyésztett baktériumokat tulajdonság HBI fokozott aktivitású megtapadás (%) 1,0 140,0 behatolás (%) 1,0 94,4Ά Effect of DOC on S.flexneri bacterial adhesion to and intracellularity of INT-407 cells, comparing bacteria cultivated conventionally (BHI) with bacteria of the present invention ("high activity") HBI high activity adherence (%) 1.0 140.0 penetration (%) 1.0 94.4

Több, mint az eredetileg a sejtekhez adott baktérium, mert a vizsgálat alatt a baktériumok szaporodtak.It is more than the bacterium originally added to the cells because the bacteria multiplied during the test.

Az emberből izolált néhány C.jejuni törzs (például 81-116, 81-176 és HC) INT-407 sejteken való adhéziója és a sejtekbe való behatolása erősen fokozható azáltal, hogy a baktérium tenyészközegében epét vagy deoxikolátot adunk (IV. és VI. táblázat). AAdhesion and cellular uptake of some C. jejuni strains (e.g., 81-116, 81-176 and HC) isolated from human can be greatly enhanced by the addition of bile or deoxycholate in the culture medium of the bacterium (Tables IV and VI). ). THE

DOC leghatékonyabb koncentrációja a 0,1 % volt (VII. táblázat). A legerősebb reakciót 37°C hőmérsékleten és nem 42°C-nál kapjuk (a Campylobactert szokás szerint ezen a hőmérsékleten tenyésztik) (III. és V. táblázat).The most effective concentration of DOC was 0.1% (Table VII). The strongest reaction is obtained at 37 ° C and not at 42 ° C (Campylobacter is cultured at this temperature as usual) (Tables III and V).

Hasonló eredményeket kapunk a Shigella flexneri esetében is (VIII. táblázat). A jelen találmány szerinti módszerrel tenyésztett Shigella baktériumnak erősen megnőtt a megtapadó és behatoló képessége.Similar results are obtained for Shigella flexneri (Table VIII). The Shigella bacterium cultured by the method of the present invention has greatly increased adhesion and penetration.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti eljárások fokozzák a bélbaktériumok behatolását és megtapadását.These data indicate that the methods of the present invention enhance intestinal bacterial penetration and adhesion.

• · • · · · · · • *·· · · · · · • · · ······ ,- -, ········· ···• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

- 3 / 29. példa- Example 3/29

Az immunológiai keresztaktivitás kimutatására a tárgylemezen végzett gyors agglutinációs eljárást használjuk. A szokásos módon, illetve a találmány például az 5. példában leírt módszere szerint növesztett C.jejuni törzseket olyan állatokból származó szérum IgG-nek tesszük ki, melyeket a szokásos módon vagy a jelen találmány szerint (például 5. példa) tenyésztett C.jejuni 81-176 (Lior 5) baktériummal immunizáltunk. Az IgG antitesteket protein A-val bevont latexgyöngyökön rögzítettük. Ha a vizsgálati szérumtípus és a Lior 5 szérumtípussal· szemben termelődő antitestek között vannak keresztreaktív epitopok, akkor a sejtek csaknem azonnali összecsapódása (agglutináció) figyelhető meg. Az összecsapódás mértékét egy 0-3 értékű skálán adjuk meg, miután egy rövid ideig hagytuk, hogy a reakció megtörténjen. A 0 értéknél nincs látható összecsapódás, a 3 értéknél a legnagyobb fokú az agglutináció. Négy törzzsel kapott adatokat a IX. táblázatban foglaltuk össze.Rapid agglutination on a slide is used to detect immunological cross-activity. C.jejuni strains grown in the usual manner or according to the method of the invention, for example, described in Example 5, are exposed to serum IgG from animals that have been cultured in the usual manner or according to the present invention (e.g., Example 5). -176 (Lior 5). IgG antibodies were fixed on protein A coated latex beads. If cross-reactive epitopes are present between the test serum type and the antibodies raised against the Lior 5 serum type, an almost immediate confluence (agglutination) of the cells can be observed. The degree of clash is given on a 0-3 scale after allowing the reaction to occur for a short time. At 0, there is no visible collision, at 3, agglutination is the highest. Data obtained with four strains are shown in Table IX. are summarized in Table.

• · · · • · · · · · · • ··· · ··· · • · · ······ ·• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·–––––––––––

IX. TÁBLÁZATIX. SPREADSHEET

A hagyományosan (BHI) és a jelen találmány eljárása szerintConventionally (BHI) and according to the process of the present invention

(„fokozott ( "Increased aktivitású) tenyésztett Lior cultured Lior szérumtípusok serum types kereszt reaktivitása cross reactivity tenyészet culture tenyésztési breeding a gyöngyön lévő on the pearl reaktivitás reactivity körülmények conditions antitest antibody mértéke degree 81-176 81-176 (L5) (L5) BHI BHI anti-BHIa anti-BHI a 1 1 81-176 81-176 (L5) (L5) BHI BHI anti-ENHb anti-ENH b 2 2 81-176 81-176 (L5) (L5) fokozott aktivitású increased activity anti-BHI Anti-BHI 2 2 81-176 81-176 (L5) (L5) fokozott aktivitású increased activity anti-ENH Anti-ENH 2,5 2.5 L2 L2 BHI BHI anti-BHI Anti-BHI 1 1 L2 L2 BHI BHI anti-ENH Anti-ENH 1,5 1.5 L2 L2 fokozott aktivitású increased activity anti-BHI Anti-BHI 0 0 L2 L2 fokozott aktivitású increased activity anti-ENH Anti-ENH 1,5 1.5 L8 L8 BHI BHI anti-BHI Anti-BHI 2 2 L8 L8 BHI BHI anti-ENH Anti-ENH 1 1 L8 L8 fokozott aktivitású increased activity anti-BHI Anti-BHI 1 1 L8 L8 fokozott aktivitású increased activity anti-ENH Anti-ENH 2,5 2.5 L21 L21 BHI BHI anti-HBI anti-HBI 0 0 L21 L21 BHI BHI anti-ENH Anti-ENH 2 2 L21 L21 DOC DOC anti-BHI Anti-BHI 0 0 L21 L21 DOC DOC anti-ENH Anti-ENH 2 2 média media BHI BHI anti-BHI Anti-BHI 0 0 BHI BHI anti-ENH Anti-ENH 0 0

a szokásos módon tenyésztett 81-176 törzs indukálta antitestek a jelen találmány, például az 5. példában leírtak szerint tenyésztett 81-176 törzs indukálta antitestekconventionally cultured strain 81-176 induced antibodies of the present invention such as strain 81-176 cultured as described in Example 5

A IX. táblázat bemutatja, hogy mind a 4 vizsgált Lior szé·· ···· «· · ···· • · · · · · · • ··· · ··· · • · · ···«·· · ········· ··· — 5 9 — rumtípus (L5, L2, L8, L21) keresztreakciót adott a fokozott aktivitású C.jejuni 81-176 L5 szérumtípusú törzzsel immunizált állatokban termelődő antitestekkel szemben. A C.jejuni 81-176 törzzsel fertőzött nyulak beléből kiöblített, IgA-t tartalmazó nyálka a jelen találmány szerint tenyésztett C.jejuni 10 fő klinikai szérumtípusából (a humán kórokozók) nyolccal reagált (lásd XVI. táblázat). Az eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány szerinti eljárás lényegesen kibővíti azoknak a Lior szérumtípusoknak a számát, melyek keresztreakciót mutatnak a Lior 5 szérumtípusú C.jejunival immunizált állatokból származó antiszérummal.IX. Table 4 shows that each of the four Lior studied · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ········ ··· - 5 9 - rumine type (L5, L2, L8, L21) cross-reacted with antibodies raised in animals immunized with highly active C.jejuni strain 81-176 L5 strain. IgA-containing mucus rinsed from the gut of rabbits infected with C.jejuni strain 81-176 reacted with eight of the 10 major clinical serum types of C.jejuni (human pathogens) cultured according to the present invention (see Table XVI). The results show that the method of the present invention significantly expands the number of Lior serum types that cross-react with antiserum from animals immunized with Lior 5 serum type C.junun.

A jelen találmány szerint növesztett néhány Shigella faj ugyancsak keresztreakciót mutat a DOC jelenlétében növesztett Shigella flexneri 2457T törzssel immunizált állatokból származó IgG antitestekkel, de ez a keresztreakció nem jelentkezik a hagyományos módon növesztett Shigella fajoknál.Some Shigella species raised according to the present invention also cross-react with IgG antibodies from animals immunized with Shigella flexneri 2457T raised in the presence of DOC, but this cross-reaction does not occur with conventionally grown Shigella species.

A következő példákkal a vakcina hatékonyságát szemléltetjük.The following examples illustrate the efficacy of the vaccine.

30. példaExample 30

A Campylobacter baktérium esetében a vakcinának a baktérium megtelepedésével és/vagy kórokozásával szembeni védőhatását vadászmenyéten tanulmányozhatjuk, minthogy a vadászmenyét megfertőzésével a baktérium okozta három humán megbetegedés közül kettő ezeken az állatokon is reprodukálhatóan kiváltható.In the case of Campylobacter bacteria, the protective effect of the vaccine against colonization and / or pathogenesis of the bacterium can be studied in hunting animals, since two of the three human diseases caused by the bacterium can be reproducibly induced in these animals.

7-9 hetes hím vadászmenyétet PBS-sel (kontroll) vagy a szokásosan (BHI), illetve az 5. példában leírt módon („fokozott aktivitású) tenyésztett és formaiinnal fixált C.jejuni 81-176 ··· · ·· törzssel orálisan immunizálunk. Szérumot veszünk az IgG alaptitter meghatározásához. Valamennyi vakcinát és a PBS-t LT adjuváns jelenlétében adjuk be két alkalommal, a 0. és 7. napon („vakcinálás) . Egy héttel az utolsó kezelés után (14. nap) („vakcinálás utáni állapot) szérumot gyűjtünk az IgG antitest titterének meghatározásához. 4 hetes vakcinálás utáni állapot elteltével az állatokat ACE promazin-Ketamine-nal érzéstelenítjük, és 10 ml élő C.jejuni 81-176 baktériumot tartalmazó (lxlO10 CFU) PBS oldattal megfertőzzük (fertőzés). Ezt követően naponta vizsgáljuk az állatokat, mucoid diarrheat, bacteeraemiat, Campylobacteres bélsárürítést, testsúlyváltozást, fejtett vérzést és a bélsárban lévő fehérvérsejteket figyelve. A bacteraemia kimutatásához az érzéstelenített vadászmenyét nyaki vénájából 1-2 ml vért veszünk, és a mintát levegőztetett tiptikáz-szójás tápközegben inkubáljuk. 2, 5 és 7 nappal a beoltás után másodlagos tenyészeteket készítünk véres agarlemezeken. Az IgG titter meghatározásához szérummintákat az immunizálás előtt (alapérték), a második immunizációs kezelés után egy héttel, a fertőzés idején és a fertőzés után egy héttel gyűjtjük.7- to 9-week-old male hunts were immunized orally with PBS (control) or C.jejuni 81-176 ··· · ·········································································· d circumstancesology ads dissemin . Serum was taken to determine the baseline IgG titer. Each vaccine and PBS are administered twice in the presence of LT adjuvant on days 0 and 7 ("vaccination"). One week after the last treatment (day 14) ("post-vaccination status"), serum was collected to determine the IgG antibody titer. At 4 weeks post-vaccination, the animals were anesthetized with ACE promazine-Ketamine and infected with 10 ml of live C.jejuni bacterium 81-176 (1x10 10 CFU) in PBS (infection). Thereafter, the animals are examined daily for mucoid diarrhea, bacteraemia, Campylobacter fecal excretion, weight change, squamous blood, and white blood cells in the feces. For detection of bacteremia, 1-2 ml of blood from an anesthetized hunter's neck is taken from the cervical vein and the sample is incubated in aerated tiptase soy medium. At 2, 5 and 7 days after inoculation, secondary cultures are prepared on blood agar plates. For IgG titre, serum samples are collected prior to immunization (baseline), one week after the second immunization, at the time of infection, and one week after the infection.

A rejtett vérzés kimutatásához a bélsarat Hemacult kártyán vizsgáljuk. A bélsarat lemezre kenjük, és metilén-kék festéssel detektáljuk a fehérvérsejteket. A Campylobacter bélsárból való kimutatásához a végbélből vett kenetet Campylobacter baktériumra specifikus tápközegű lemezre visszük (tiptikáz-szójás agar, 5 % birkavér, trimetoprim, vankomicin, polimixin B, cefalotin és amfotericin B; Remei, Lenaxa, KS, USA) . A vizsgálatokkal kapott eredményeket a X. és a XI. táblázatban foglaljuk össze.The intestine is examined on a Hemacult card for hidden bleeding. The intestinal slurry is spread on a plate and white blood cells are detected by methylene blue staining. For the detection of Campylobacter in fecal matter, the rectal smear is plated on a plate containing medium specific for Campylobacter bacteria (tiptase soy agar, 5% sheep blood, trimethoprim, vancomycin, polymyxin B, cephalotine and amphotericin B), Remei, Lena. The results of the tests are shown in Tables X and XI. are summarized in Table.

··» ··· »·

X. TÁBLÁZATTABLE X.

Vadánymenyétek vakcinálással való védelme C.jejuni 81-176 baktériummal szemben vakcina pozitív megtelepedés a fertőzés után 5. napon3 betegségVaccination protection of wild boar vaccines against C.jejuni 81-176 vaccine positive colonization on day 5 after infection 3 diseases

PBS 6/6 1/6PBS 6/6 1/6

BHI 0/6 2/6 „fokozott aktivitású 0/5c 0/6 3 pozitív megtelepedés száma/vizsgált esetek száma b megjelenése: zöld, nyálkás/formátlan/vizenyős széklet c a csoport egyik állata elpusztult, amikor a betegséget már megállapítottuk, de a megtelepedés még nem volt kiértékelveBHI 0/6 2/6 'increased activity 0/5 c 0/6 3 number of positive colonies / number of cases tested b appearance: green, mucus / formless / watery stool c one animal in the group died when disease was confirmed but the settlement has not yet been evaluated

XI. TÁBLÁZATXI. SPREADSHEET

A vadászmenyét szérumának IgG tittere (geometriai átlag) csoport alapérték egy héttel a fertőzéskor egy héttel a vakcinálás után fertőzés utánIgG titer (geometric mean) serum of hunting mite serum baseline one week after infection one week after vaccination after infection

PBS PBS 6,4 6.4 4,9 4.9 6,4 6.4 1380, 1380, 4 4 BHI BHI 6,4 6.4 94,0 94.0 94,0 94.0 26505, 26505, 3 3 „fokozott "increased aktivitású activity 6,8 6.8 234,4 234.4 1621,8 1621.8 56234, 56 234, la l a

a öt túlélő állatnál kapott átlagos titteraverage titre obtained from the five surviving animals

A X. táblázat adatai mutatják, hogy a jelen találmány szerinti vakcina megóvta az állatokat az élő baktériumokkal való • · · Wfc · · · · ·»»· • · » · « « · • ··· · · » · · » «· ···««· · «·*···· ·« * ·» fertőzéstől, a megtelepedéstől és a betegség kialakulásától. A XI. táblázat adatai azt mutatják, mennyivel nagyobb IgG antitest titter érhető el a jelen találmány szerinti vakcinával („fokozott aktivitású), mint a hagyományosan növesztett bélbaktériumból készítettel (HBI).The data in Table X show that the vaccine of the present invention protected the animals with live bacteria. · Infection, colonization and disease development. The XI. The data in Table 1A show how much higher IgG antibody titers can be achieved with the vaccine of the present invention ("enhanced activity") than with conventionally grown intestinal bacteria (HBI).

Ezek az eredmények szemléltetik a jelen találmány szerinti vakcinával elért immunitást (XI. táblázat) és a fertőzés elleni védettséget (X. táblázat), melyek hatékonyabbak, mint a szokásos módon tenyésztett baktériumokkal vakcináit állatok esetében.These results illustrate the immunity obtained with the vaccine of the present invention (Table XI) and protection against infection (Table X), which are more effective than animals vaccinated with conventionally cultured bacteria.

31. példaExample 31

Ellentétben a vadászmenyéttel, az egereknél természetes körülmények között nem alakul ki Campylobacter vagy Shigella fertőzöttség, de a vizsgálatoknál felhasználják őket szájon át fertőzött immunizált állatok intesztinális megtelepedéssel szembeni ellenállásának és a tüdőn át megfertőzött immunizált állatok betegséggel szembeni rezisztenciájának kimutatására. Az orron keresztül megfertőzött egerek modellje felhasználható más állatok vagy az ember esetében is a vakcinálás várható hatékonyságának megállapítására. A vizsgálati módszert Mailét és munkatársai írták le [ Vaccine, 11:190-196 (1993)] .Unlike hunts, mice do not naturally develop Campylobacter or Shigella infections, but are used in studies to detect intestinal resistance in orally infected immunized animals and disease resistance in immunized animals lung-infected. A model of nasally infected mice can be used to determine the expected efficacy of vaccination in other animals or humans. The assay is described by Maile et al., Vaccine, 11: 190-196 (1993).

A vizsgálatokhoz 16 hetes nőstény Balb/c egereket használunk; egy csoportban 10 állat van. Az állatokat szájon át immunizáljuk foszfátpufférés sóoldattal (PBS), a szokásos módon növesztett C.jejunival (BHI) vagy az 5. példában leírt módon tenyésztett C.jejunival („fokozott aktivitású). A baktériumokból 107 CFU vagy 109 CFU dózist használunk. Immunizálás után provo• ·* · ·« «»·· S. . » • » * * » * 9 « «·» · · · · · • ·· «···« * <··«·«> ·* « a* káljuk a megbetegedést. A bélnyálka IgA titterét ELISA módszerrel állapítjuk meg. A kapott eredményeket a XII. táblázatban foglaltuk össze.16-week-old female Balb / c mice were used for the studies; there are 10 animals per group. The animals were immunized orally with phosphate buffered saline (PBS), conventionally grown C.jejuni (BHI) or cultured with C.jejuni ("high activity") as described in Example 5. A dose of 10 7 CFU or 10 9 CFU of bacteria is used. After immunization provo • · * · · «« »·· S.. »•» * * »* 9« «·» · · · · · · ············································································································································································································································heted. The IgA titer of the intestinal mucosa is determined by ELISA. The results obtained are shown in Table XII. are summarized in Table.

XII. TÁBLÁZATXII. SPREADSHEET

99

Campylobacter teljes sejtekkel (10 vagy 10 ) szájon át immunizált egerek IgA titterválasza immunizálás bélfürdő IgA reagálók %-ab tittereb Campylobacter oral whole cell (10 or 10) of mice immunized with IgA titterválasza immunization intestinal lavage IgA% of responders b tittere b

PBS PBS 23 23 14 14 fokozott aktivitású increased activity (107)(10 7 ) 114 114 75 75 (109)(10 9 ) 78 78 75 75 BHI (107) BHI (10 7) 40 40 25 25 (109)(10 9 ) 32 32 12 12

a az egyes vizsgálati csoportoknál kapott anti-C.jejuni IgA titter átlaga b reagálónak tekintjük azokat az állatokat, melyek végponttittere a csak PBS-sel kezelt állatok átlagát 2 standard deviációs értékkel meghaladja. the mean of the anti-C.junun IgA titre obtained in each test group is considered to be b -reactive animals with an end-point titer greater than 2 standard deviations in the mean of PBS-treated animals only.

A XII. táblázat adatai mutatják, hogy a szokásos módon tenyésztett baktériumokkal immunizált állatokhoz képest a találmány szerint tenyésztett baktériumokkal immunizált állatoknál magasabb az intésztinális IgA antitest titter.XII. The data in Table II show that animals immunized with bacteria cultured in accordance with the invention have a higher intestinal IgA antibody titer compared to animals immunized with conventionally cultured bacteria.

Az alábbi példában az antigénaktivitás deoxikoláttal történő • -. *· * > · » *· -J ·«*· ·· ·♦** megváltoztatásának vagy fokozásának a mechanizmusát szemléltetj ük.In the example below, the antigenic activity is with deoxycholate. The mechanism of changing or enhancing ** * * * - * * - * - ** is illustrated.

32. példaExample 32

Noha nincs szándékunkban a jelen találmányt egyik adott akciómechanizmusra sem korlátozni, úgy találtuk, hogy a deoxikolát (DOC) a bélbaktériumok immunizáló hatását mintegy kétszeres mértékben megváltoztatja vagy fokozza. Bizonyítékok jelzik, hogy a DOC hatásának egyik összetevője kalciumfüggő, minthogy a DOC megköti a kalciumot, és ezáltal csökkenti a közeg kalciumkoncentrációját. Ennek bizonyítékát az alábbiakban ismertetjük. Ha a C.jejuni 81-176 baktériumot a membránon átjutni képes BAPTA/AM kalcium-kelátképző jelenlétében, de DOC távollétében tenyésztjük, az INT-407 sejtekbe való behatolóképességük kb. tízszeresére fokozódik (XIII. táblázat). A csak BAPTA/AM kezelés azonban nem szélesíti a C.jejuni 81-176 baktérium immunológiai keres ztreaktivitását.Although not intended to limit the present invention to any particular mechanism of action, it has been found that deoxycholate (DOC) alters or enhances the immunizing effect of intestinal bacteria by approximately twice. Evidence indicates that one component of the effect of DOC is calcium-dependent, since DOC binds calcium and thereby reduces the calcium concentration in the medium. The proof of this is described below. When cultured in the presence of BAPTA / AM calcium chelator capable of crossing the membrane but in the absence of DOC, C.jejuni 81-176 has an intrinsic ability to invade INT-407 cells. increases tenfold (Table XIII). However, BAPTA / AM treatment alone does not increase the immunological cross-reactivity of C.jejuni 81-176.

A XIII. táblázat adatait olyan C.jejuni 81-176 baktériumokkal kaptuk, melyeket az 5. példában leírtak szerint növesztettünk azzal a különbséggel, hogy a 0,1 % DOC-t 25 μΜ BAPTA/AM-mel helyettesítettük. A behatolási vizsgálatokat és értékelésüket aXIII. The data in Table III were obtained with C.jejuni 81-176, grown as described in Example 5, except that 0.1% DOC was replaced with 25 μΜ BAPTA / AM. Penetration tests and their evaluation a

28. példában leírtak szerint hajtottuk végre.This was carried out as described in Example 28.

··· · • · • · « · • · · · · · · • ··· · ··· · • · · ······ · ······· ·· · · ···· ······················································· ·

XIII. TÁBLÁZATXIII. SPREADSHEET

A szokásos módon (BHI) vagy BAPTA/AM jelenlétében növesztettGrown as usual (BHI) or in the presence of BAPTA / AM

C.jejuni INT-407 sejtekbe való behatolása tenyésztési körülmények törzs_ BHI BAPTA/AMInvasion of C.jejuni INT-407 cells under culture conditions strain_ BHI BAPTA / AM

C . jejuni 81-176_3, 0_36, 9C. jejuni 81-176_3, 0_36, 9

Noha olyan baktérium genus, melynek antigénaktivitása epével vagy epesavsókkal, mint amilyen a DOC, fokozható vagy megváltoztatható (például Campylobaceter, Shigella, Heliobacter) génhomológiát mutat a Yersinia alacsony kalcium reaktivitási (low calcium response, lcr) génjeivel. Ismert, hogy az lcr lókusz szabályozza a Yersinia fertőzőképességét az alacsony kalciumkoncentrációnál. A Campylobacter flagellin expresszálásában és elkészítésében résztvevő két gént, melyek a behatoláshoz szükségesek (flaA és flbA) részben a lcr terméke szabályoz. A szokásos módon a találmány szerinti, a virulenciát fokozó körülmények között növesztett Campylobacter flaA és flbA mutánsok viselkedésének analízise azt mutatja, hogy a behatolóképesség kalciumfüggő, de a Congo-vörös festék megkötése vagy a keresztreakció növekedése nem.Although a bacterial gene with antigenic activity in bile or bile acid salts such as DOC, it can be enhanced or altered (e.g., Campylobaceter, Shigella, Heliobacter) by gene homology with Yersinia's low calcium response (lcr) genes. The lcr locus is known to control the infectivity of Yersinia at low calcium concentrations. The two genes involved in the expression and production of Campylobacter flagellin, which are required for penetration (flaA and flbA), are partially regulated by the lcr product. As usual, analysis of the behavior of the Campylobacter flaA and flbA mutants grown in virulence enhancing conditions of the invention shows that the penetration is calcium dependent but not the increase in Congo-red dye or increase in cross-reaction.

• ·· · • · · · · · · • ··· · ··· · • ·· ······ · __ θ θ _ ······· · · · ··• · · · · · · · · · · ·································································································································· ·

XIV. TÁBLÁZATXIV. SPREADSHEET

A szokásos körülmények kötött (BHI), illetve a jelen találmányNormal conditions are bound (BHI) or the present invention

szerint tenyésztett („fokozott aktivitású) C.jejuni mutánsok C.jejuni mutants ('enhanced activity') INT-407 sejtekbe való INT-407 cells behatolása ingress tenyésztési körülmények breeding conditions törzs tribe BHI BHI fokozott aktivitású increased activity C.j ej uni 81-17 6 C.j ej uni 81-17 6 3,5 3.5 40,8 40.8 C.jejuni flaA C.jejuni flaA 0,05 0.05 0, 05 0, 05 C.jejuni flbA C.jejuni flbA 0,01 0.01 0,04 0.04

A C.jejuni flaA és flbA mutánsok szignifikáns növekedést mutattak a Congo-vörös festék megkötését és az immunológiai keresztreakciókat illetően, ha DOC jelenlétében tenyésztjük őket (XV. táblázat, 6. ábra) . A XV. táblázat és a 6. ábra adatait a szokásos módon, illetőleg az 5. példában leírtak szerint tenyésztett C.jejuni baktériummal kaptuk. A Congo-vörös festék megkötését (XV. táblázat) a 26. példában leírtak szerint vizsgáltuk. A 6. ábrán bemutatott immunológiai keresztreakciók vizsgálatát a 29. példában leírtak szerint végeztük.C.jejuni flaA and flbA mutants showed significant increases in Congo-red dye binding and immunological cross-reactions when cultured in the presence of DOC (Table XV, Figure 6). In the XV. Table 6 and Figure 6 were obtained using C.jejuni cultured in the usual manner or as described in Example 5. Congo-red dye binding (Table XV) was assayed as described in Example 26. The immunological cross-reactions shown in Figure 6 were performed as described in Example 29.

··· ···· ·

XV. TÁBLÁZATXV. SPREADSHEET

A szokásos módon (BHI), illetve a találmány szerint („fokozott aktivitású) tenyésztett C.jejuni mutánsok Congo-vörös festékmegkötése tenyésztési körülmények törzs_BHI_fokozott aktivitásúCongo-red dye binding of C.jejuni mutants cultured in conventional manner (BHI) or according to the invention ("enhanced activity") under culture conditions strain_BHI_high activity

jejuni 81-176 jejuni 81-176 0,07 0.07 1,68 1.68 jejuni flaA jejuni flaA 0,10 0.10 1,60 1.60 jejuni flbA jejuni flbA 0,12 0.12 0,80 0.80

Az flaA mutáns nem képes flagellint expresszálni. Az flaA mutáns és az flaA-flaB kettős mutáns (C.Grantól, NIH) még deoxikoláttal való kezelés után sem képes a behatolásra, jelezvén, hogy a flagellin szükséges a behatoláshoz. Érdekes módon az említett fia mutánsok izogén szülőtörzsei és bizonyos más Lior szérumtípusú C.jejuni törzsek között a normális körülmények között (azaz nem DOC kezelt) meglepő immunológiai keresztreakció a mutánsoknál hiányzik. A DOC kezeléssel azonban a flagellin hiányos mutánsokat indukálhatjuk, hogy fokozott immunológiai keres ztreakciót és Congo-vörös festékmegkötést mutassanak.The flaA mutant is unable to express flagellin. The flaA mutant and the flaA-flaB double mutant (from C.Grant, NIH) are unable to penetrate even after treatment with deoxycholate, indicating that flagellin is required for penetration. Interestingly, there is no surprising immunological cross-reaction between the isogenic parent strains of said son mutants and certain other strains of C. ljununi serum type Lior under normal conditions (i.e., not DOC treated). However, DOC treatment can induce flagellin-deficient mutants to exhibit enhanced immunoassay and Congo-red dye binding.

Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy a bélbaktériumok virulenciáját a DOC kalciumfüggő (például behatolóképességet) és kalciumtól nem függő (például Congo-vörös megkötést) mechanizmusokon keresztül szabályozza. Az eredmények továbbá arra utalnak, hogy a DOC által indukált fokozott immunológiai keresztreaktivitás és a Congo-vörös megkötése legalábbis részben a flagellintől független.These observations indicate that intestinal bacterial virulence is regulated by DOC through calcium-dependent (e.g., penetration) and non-calcium-dependent (e.g., Congo-red binding) mechanisms. The results further suggest that DOC-induced enhanced immunological cross-reactivity and Congo-red binding are at least partially independent of flagellin.

• ·· · • · · ·• ·· · • · · ·

Az alábbi példában a Campylobacter jejuni DOC által indukált fokozott immunológiai keresztreaktivitását szemléltetjük.The following example illustrates the increased immunological cross-reactivity of Campylobacter jejuni induced by DOC.

32. példaExample 32

A jelen találmány szerint növesztett Campylobacter jejuni szérumtípusokra vonatkozó immunológiai keresztreakcióit a lemezen végzett gyors agglutinációs vizsgálattal állapítjuk meg. A vizsgálatokhoz az immunizált és nem-immunizált nyulakból származó bélnyálkát használjuk, hogy meghatározzuk a tenyésztési körülmények miként befolyásolják a Campylobacter heterolog törzseinek keresztreaktivitását. A nyulakat a szokásos módon tenyésztett C.jejuni 81-176 élő sejtjeivel immunizáljuk. A nyálkában lévő antitestek agglutinációs aktivitását 24 Campylobacter törzzsel szemben vizsgáltuk, melyek 18 szérumtípusba sorolhatók. A tenyésztésük a szokásos módon, illetve az 5. példában leírtak szerint történik.Immunological cross-reactions of Campylobacter jejuni serum types grown in accordance with the present invention are determined by rapid agglutination assay on the plate. For the assays, intestinal mucosa from immunized and non-immunized rabbits is used to determine how culture conditions affect cross-reactivity of strains of Campylobacter heterolog. Rabbits are immunized with live cells of C.jejuni 81-176 cultured in conventional manner. The agglutination activity of the mucus antibodies was tested against 24 Campylobacter strains, which are classified into 18 serum types. They were cultured in the usual manner or as described in Example 5.

Az agglutinációs vizsgálatok azt mutatják, hogy a heterológ Campylobacter törzsek kereszt-agglutinációja szélesebb körű és sok esetben erősebb, ha a törzseket a találmány szerint tenyésztjük. A heterológ agglutinációs reaktivitás több, mint kétszeresére nőtt: a szokásos módon növesztett 24 heterológ törzs közül 6 mutatott az anti-81-176 nyálkával szemben (+) szintű vagy ennél magasabb agglutinációt, míg ha ugyanazt a 24 törzset DOC jelenlétében tenyésztettük, 14 agglutinált ( + ) szinten vagy ennél erősebben. Továbbá, ha a szokásos módon tenyésztettünk, 18 heterológ törzs negatív vagy csak gyenge (+) agglutinációs aktivitást mutatott, ha viszont a jelen találmány szerinti körülmények között (például DOC-t tartalmazó közegben) nö·· ···· ·· · ···· • · · · · · · • ··· · ··· · • ·· ······ ·Agglutination studies show that the cross-agglutination of heterologous Campylobacter strains is more extensive and in many cases stronger when the strains are cultivated according to the invention. Heterologous agglutination reactivity more than doubled: 6 of the 24 heterologous strains grown in conventional manner showed agglutination (+) level or higher against anti-81-176 mucus, whereas 14 of the same 24 strains were cultured in the presence of DOC (14). +) level or higher. Furthermore, when cultured in the usual manner, 18 heterologous strains showed negative or only weak (+) agglutination activity, but in the conditions of the present invention (e.g., DOC-containing medium), ··· · · · · · · · · · · · · · · · · ···

- 69 - ............- 69 - ............

vesztettük őket, ugyanezen törzsek közül 11 mutatott fokozott agglutinációs reakciót a szokásos módon növesztettekhez viszonyítva .we lost them, 11 of the same strains showed increased agglutination reaction compared to the conventionally grown strains.

A XVI. táblázat 19 heterológ Lior szérumtípusba tartozó 22 törzs keresztreakcióját mutatja anti-81-176 immun nyúlnyálkával szemben. A törzseket a szokásos módon (BHI-YE), illetve az 5.XVI. Table 22 shows the cross-reaction of 22 strains of 19 heterologous Lior serum types against anti-81-176 immune rabbit mucosa. The strains were as usual (BHI-YE) or as shown in Figure 5.

példában leírtak szerint tenyésztettük („fokozott aktivitású). Noha ezek a vizsgálatok az ismert Lior szérumtípusoknak csak egy hányadára terjedtek ki, az eredmények bizonyítják, hogy a találmány szerinti eljárás lényeges immunológiai keresztreaktivitást indukál a Lior szérumtípusok között. Az eredmények továbbá azt is mutatják, hogy a DOC fokozza vagy indukálja a Campylobacter azon antigénjét, melyek - úgy tűnik - fontos szerepet játszanak a rezisztenciával és a Campylobacter fertőzéses betegség gyógyulásával kapcsolatos IgA szekréciós válaszban.("high activity"). Although these assays covered only a fraction of known Lior serum types, the results demonstrate that the method of the invention induces significant immunological cross-reactivity between Lior serum types. The results further indicate that DOC enhances or induces a Campylobacter antigen that appears to play an important role in the IgA secretory response to resistance and cure for Campylobacter infectious disease.

Meg kell továbbá jegyezni, hogy a 8 Lior szérumtípus törzs egy másik fajt, a Campylobacter coli-t képviseli. Ezen szérumtípusba tartozó 2 törzs egyike (VC-167) erősen agglutinálódott (3+) az anti-81-176 immun nyúlnyálkában. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a C.jejuni törzsből (például Lior 5) származó vakcina nemcsak ugyanazon faj heterológ szérumtípusaival szemben nyújthat keresztvédelmet, hanem más Campylobacter fajokkal (például Campylobacter coli) szemben is. Ugyancsak érdemes megjegyezni, hogy az 1, 2, 4, 9 és 11 Lior szérumtípusok betegséggel kapcsolatos leggyakoribb szérumtípusok közé tartoznak világszerte. A vizsgálatokban valamennyien kimutatható keresztreakciót adtak.It should also be noted that the strain of the 8 Lior serum type represents another species, Campylobacter coli. One of the 2 strains of this serum type (VC-167) was highly agglutinated (3+) in the anti-81-176 immune rabbit mucosa. These results indicate that the vaccine from C.jejuni strain (e.g., Lior 5) can provide cross-protection not only against heterologous serum types of the same species, but also against other Campylobacter species (e.g., Campylobacter coli). It is also worth noting that Lior serum types 1, 2, 4, 9 and 11 are among the most common serum types associated with the disease worldwide. All of the tests gave a detectable cross-reaction.

• ·• ·

99 999999 999 999999 9

9999999 99 9 999999999 99 9 99

XVI . TÁBLÁZATXVI. SPREADSHEET

Szokásos módon (BHI-YE), illetve a találmány szerint tenyésztett („fokozott aktivitású) 20 Campylobacter szérumtípus agglutinációs válasza a nem-immunizáltb vagy az immunizált nyúl (anti-81-176b nyálkájával szemben agglutinációs válasz nem indukált nyálka immunizált nyálkaUsual way (BHI-YE) and cultured according to the invention ( "increased activity) 20 serum type Campylobacter agglutination response to the non-immunized or immunized rabbit b (as opposed to anti-81-176 mucus b agglutination response did not induce mucosal immune mucus

törzs tribe Lior szérumtípus Lior serum type BHI-YE BHI-YE fokozott aktivitású intensified activity BHI-YE BHI-YE fokozott aktivitá intensified Aktiviti 134 134 1 1 - - - - - - + + ++ 195 195 2 2 - - - - - - 1 1 4 4 - - - - - - +++ +++ 170 170 5 5 - - - - +++ +++ ++++ ++++ 81-176 81-176 5 5 - - - - + +++ + +++ ++++ ++++ 6 6 6 6 - - - - ++++ ++++ +++ +++ 81-116 81-116 6 6 - - - - + + + + ++ 35 35 7 7 - - - - - - + + 52 52 8 8 - - + + + + ++ ++ VC-167 VC-167 8 8 - - - - + + +++ +++ VC-159 VC-159 8 8 - - - - + + - - 88 88 9 9 - - - - - - + + 244 244 11 11 - - - - + + + + + +++ 556 556 17 17 - - - - + + - - 563 563 18 18 - - - - - - - - 544 544 19 19 - - ++ ++ - - ++ ++ 6 9 9 6 9 9 21 21 - - - - + + ++ ++ 1180 1180 28 28 - - - - + + + + + +++ 1182 1182 29 29 - - - - - - - - 910 910 32 32 - - + + ++ - - + + ++ 2074 2074 36 36 - - - - - - - - HC HC 36 36 - - + + - - + + 2984 2984 46 46 - - - - - - - - 7981 7981 72 72 - - - - - -

az anti-81-176 nyálkát a szokásos módon tenyésztett C.jejuni 81-176 élő sejtjeivel fertőzött nyúlból nyertük • ·· · ····· ··· · • ·· ··«··· · _ 71 _ ............81-176 anti-slime as usual C.jejuni 81-176 cultured living cells of infected rabbits were obtained ·· • · · · · · • ·· ·· ····· "· · · · _ 71 _ .. ..........

b a nem-immunizált nyálkát nem-fertőzött nyálból nyertük c az agglutinációs válasz értékelése: (-) negatív ( + ) nagyon gyenge (++++) nagyon erős b non-immunized mucus was obtained from non-infected saliva c evaluation of agglutination response: (-) negative (+) very weak (++++) very strong

Az alábbi példában további kísérleti eredményeket adunk meg a Campylobacter vakcina hatékonyságára.In the following example, further experimental results are provided for the efficacy of the Campylobacter vaccine.

34. példaExample 34

A jelen találmány szerint tenyésztett Campylobacter jejuni formalinnal rögzített teljes sejtjeinek védőhatását egéren vizsgált megtelepedéssel határozzuk meg, ahogyan azt Baqar leírta [ Infect. & Immun., 63:3731-3735 (1995)] .The protective activity of whole cells fixed by Campylobacter jejuni cultured in accordance with the present invention was determined in a mouse assay as described by Baqar, Infect. &Amp; Immun., 63: 3731-3735 (1995)].

A C.jejuni 81-176 baktériumot az 5. példában leírtak szerint növesztjük és gyűjtjük össze. A sejteket 0,075 %-os formaiinnal inaktiváljuk a fentiekben ismertetett módon. 6-8 hetes, nőstény Balb/c egerekből öttagú csoportokat képezünk, és az állatoknak szájon át három dózist (térfogata 0,25 ml/dózis endotoxin-mentes PBS-ben) adunk be. Az egyes dózisok 10 , 10 vagy 10 inaktivált baktériumot tartalmaznak 25 pg hőlabilis E.coli enterotoxinnal (LT) vagy anélkül. A dózisokat 48 órás időközökkel adjuk be, és közvetlenül utána két 0,5 ml 5 %-os nátrium-hidrogén-karbonát oldatot (pH = 8,5) is beadunk 15 perces időközökkel, hogy semlegesítsük a gyomorsavat. A kontroll állatok csak PBS-t kapnak önmagában vagy LT adjuvánssal. Körülbelül 28 nappal a harmadik dózis beadása után, a vakcináit állatokat orron vagy szájon át megfertőztük 108 telepképző egységnyi (CFU), a szokásos módon te élő C.jejuni 81-176 baktériummal. Az intesztinális megtelepedés • · időtartamát a széklettel való ürítés naponkénti vizsgálatával követjük nyomon 9 napon át. A székletet steril PBS-ben emulgeáljuk és a kivett mintát Campylobacter tenyésztéséhez használt véres agaron lemezeljük. A lemezeket 35°C hőmérsékleten, mikroaerofill körülmények között tartjuk (Campylobacter GasPak,C.jejuni 81-176 was grown and harvested as described in Example 5. Cells are inactivated with 0.075% formalin as described above. Six-to eight-week-old female Balb / c mice were grouped into five members and given three doses (0.25 ml / dose in endotoxin-free PBS) orally. Each dose contains 10, 10 or 10 inactivated bacteria with or without 25 µg of heat-labile E.coli enterotoxin (LT). Doses were administered at 48 hour intervals and immediately followed by two 0.5 ml 5% sodium bicarbonate solutions (pH 8.5) at 15 minute intervals to neutralize gastric acid. Control animals receive PBS alone or with LT adjuvant. Approximately 28 days after the third dose, the vaccinated animals were infected with 10 8 colony forming units (CFU), either nasal or oral, in the usual manner of C.jejuni 81-176. The duration of intestinal establishment is monitored by daily examination of faecal excretion for 9 days. The stool is emulsified in sterile PBS and the harvested sample is plated on blood agar used for culturing Campylobacter. Plates were maintained at 35 ° C under microaerophilic conditions (Campylobacter GasPak,

BBL) 3-5 napon át. A megbetegedés eredményességét az adott mintavételi napon a Campylobactert ürítő állatok százalékában fejezzük ki .BBL) for 3-5 days. Disease efficacy is expressed as a percentage of the animals excreting Campylobacter on a given sampling day.

Amint a 7. ábra mutatja, valamennyi orron keresztül megfertőzött állat - az immunizáltak és a kontroll állatok egyaránt mikroorganizmus ürítenek közvetlenül a fertőzés után (1. nap). A kontroll állatok 80- 100 %-ában a mikroorganizmus megtelepedett marad a fertőzést követő 9 napon át. Ezzel szemben a vakcináit csoportban szignifikánsan kevesebb állat ürít mikroorganizmust a 9 napos vizsgálati periódus alatt. A fertőzött állatok kitisztulásának mértéke és ideje a beadott vakcina mennyiségétől függ. Az alacsony (10 baktérium/dózis) és a közepes (10 baktérium/dózis) vakcinadózis fokozatos és tökéletlen kitisztítást eredményez. Az adjuváns jelenléte fokozza e dózisok védőhatását. Meglepő módon a magas dózisnál (109 baktérium/dózis) az adjuvánst nem tartalmazó vakcina azonos vagy kissé erősebb védelmet nyújt, mint az ugyanilyen dózis LT adjuvánssal.As shown in Figure 7, all nasally infected animals - both immunized and control animals - are excreted immediately after infection (Day 1). In 80-100% of control animals, the microorganism remains established for 9 days after infection. In contrast, significantly fewer animals in the vaccinated group excreted the microorganism during the 9-day study period. The extent and timing of clearance of infected animals depends on the amount of vaccine administered. Low (10 bacteria / dose) and medium (10 bacteria / dose) vaccine doses result in gradual and incomplete clearance. The presence of the adjuvant enhances the protective effect of these doses. Surprisingly, at a high dose (10 9 bacteria / dose), the non-adjuvanted vaccine offers the same or slightly stronger protection than the same dose of LT adjuvant.

Hasonló eredményeket kapunk az orálisan vakcináit állatok fertőzésénél (8. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a jelen találmány szerint tenyésztett és inaktivált Campylobacterrel történő immunizálás védelmet nyújt az utána bekövetkező élő Campylobacterrel végzett fertőzéssel szemben, és az immunizáció még akkor is hatásos, ha szájon át végezzük és adjuvánst sem alkalmazunk.Similar results were obtained for the infection of orally vaccinated animals (Figure 8). These results demonstrate that immunization with Campylobacter cultured and inactivated according to the present invention provides protection against subsequent infection with live Campylobacter, and that immunization is effective even when administered orally and without the use of an adjuvant.

Ugyancsak vizsgáltuk a jelen találmány szerint (például 5. példa) tenyésztett, formalinnal rögzített teljes sejt Campylobacter jejuni intraperitoneálisan (IP) beadott dózisainak védőhatását is. A kísérleteknél egy csoportba 20 nőstény Balb/c egeret kezelünk egyszeri dózissal, mely 0,5 ml endotoxin-mentes PBS-ben 1,3χ1Ο10, 2,5xl09, 5,0xl08, Ι,ΟχΙΟ8, illetve 2,0xl07 inaktivált C.jejuni sejtet tartalmaz adjuváns nélkül. 14 nappal később az állatokat élő C.jejuni 81-176 egyszeri letális dózisával (kb. Ι,ΟχΙΟ10 CFU endotoxin-mentes PBS-ben) fertőzzük meg, a dózist intraperitoneálisan bejuttatva. 4 napon át figyeljük az állatok napi mortalitását.The protective effect of intravenously administered (IP) doses of Campylobacter jejuni formally fixed whole cell cultured in accordance with the present invention (e.g., Example 5) was also investigated. For each experiment a group of 20 female Balb / c mice were treated with a single dose containing 0.5 ml of endotoxin-free PBS 1,3χ1Ο 10 2,5xl0 9 5,0xl0 8, Ι, ΟχΙΟ 8 or 7 2,0xl0 contains inactivated C.jejuni cells without adjuvant. Fourteen days later, animals were challenged with a single lethal dose of live C.jejuni 81-176 (approximately Ι, ΟχΙΟ 10 CFU in endotoxin-free PBS), administered intraperitoneally. Daily mortality of the animals is monitored for 4 days.

gg

Amint a 17. táblázat mutatja 5,0x10 inaktivált C.jejuni egyszeri intraperitoneális dózisa indukál olyan immunválaszt, mely az élő C.jejuni fertőzéssel szembeni védelemhez szükséges.As shown in Table 17, a single intraperitoneal dose of 5.0x10 inactivated C.jejuni induces the immune response required to protect against live C.jejuni infection.

XVII. TÁBLÁZATXVII. SPREADSHEET

A találmány szerint tenyésztett és inaktivált, IP bejuttatottThe invention is cultured and inactivated, IP-delivered

C.jejuni védőhatása dózis mortalitás túlélésThe protective effect of C.jejuni is dose mortality survival

1234 nap l,3xlO10 0 4 2,5x10° 0 0 5,0xl08 0 0 Ι,ΟχΙΟ8 11 7 5,0xl07 10 6 BPS kontroll 4 31234 nap l, 3xlO 10 0 4 2.5x10 ° 0 0 5.0xl0 8 0 0 Ι, ΟχΙΟ 8 11 7 5.0xl0 7 10 6 BPS control 4 3

00

00

00

00

00

0 • · β * t (0 • · β * t (

Az alábbi példákban szemléltetjük hogy a DOC fokozza Shigella behatolóképességét, Congo-vörös megkötését és az immunológiai keresztreaktivitást.The following examples illustrate that DOC enhances Shigella penetration, Congo-red binding and immunological cross-reactivity.

35. példaExample 35

Az in vitro növesztett Shigella behatolóképességét a tenyészet növekedési fázisa befolyásolja. A Shigella flexneri 2457T behatolóképességét a 28. példában leírtak szerint vizsgáljuk a következő tenyészeteknél: hagyományosan növesztett (BHI); a találmány szerint, például a 9. példában leírtak alapján növesztett (DOC-EL) (a sejtek korai lóg fázisú tenyészetből származnak); a 9. példa szerint növesztett, de a sejtek késői lóg fázisban lévő tenyészetből származnak (DOC-LL). Az eredmények azt mutatják, hogy a DOC jelenlétében történő tenyésztésnél fokozódik a behatolóképesség és a maximum a korai lóg fázisban érhető el (9. ábra).The penetration capacity of Shigella grown in vitro is affected by the growth phase of the culture. The penetration potency of Shigella flexneri 2457T was tested as described in Example 28 for the following cultures: conventionally grown (BHI); grown (DOC-EL) according to the invention, for example as described in Example 9 (the cells are derived from early-phase culture); grown according to Example 9 but cells from late-hanging culture (DOC-LL). The results show that the cultivation in the presence of DOC increases the penetration capacity and reaches the maximum in the early log phase (Figure 9).

A találmány szerinti, DOC jelenlétében történő tenyésztés ugyancsak fokozza más Shigella fajok, például a S.sonnei, S.Dysentariae behatolóképességét is (10. ábra). Polarizált hámsejteknél a Shigella fokozott behatolóképessége csak akkor figyelhető meg, ha a hámsejteket bazolaterálisan fertőzzük a baktériummal. Ez a megfigyelés megfelel az in vivő megfigyelt behatolási folyamatnak.Cultivation of the present invention in the presence of DOC also enhances the penetration capacity of other Shigella species, such as S.sonnei, S.Dysentariae (Figure 10). In polarized epithelial cells, Shigella's enhanced penetration can be observed only when the epithelial cells are basolaterally infected with the bacterium. This observation corresponds to the intruder intrusion observed.

Az összehasonlító vizsgálatok mutatják, hogy a jelen találmány szerint növesztett Shigella közel tízszer olyan fertőzőképes, mint a Popé és munkatársai [ Infect. & Immun., 63:3642-3648 (1995)] szerint tenyésztett Shigella.Comparative studies show that Shigella grown in accordance with the present invention is about ten times as infectious as Popé et al., Infect. & Immun., 63: 3642-3648 (1995)].

36. példaExample 36

A jelen találmány szerint tenyésztett Shigella fokozott Congo-vöröst megkötő képességet is mutat. A 26. példában leírt, a festéket megkötő képesség vizsgálatához a Shigella flexneri 2457T és S.sonnei baktériumokat a szokásos módon, (BHI), illetőleg a jelen találmány szerint (például 9. példa) tenyésztjük. Az eredmények azt mutatják, hogy a DOC jelenlétében növekvő Shigella fajok Congo-vörös festéket megkötő képessége 10-20-szorosára növekszik (XVIII. táblázat).Shigella cultivated in accordance with the present invention also exhibits enhanced ability to bind Congo red. To test the dye-binding ability described in Example 26, Shigella flexneri 2457T and S.sonnei were cultured in the conventional manner (BHI) or in accordance with the present invention (e.g., Example 9). The results show that the ability of Shigella species growing in the presence of DOC to increase Congo-red dye binding by 10-20 fold (Table XVIII).

XVIII. TÁBLÁZATXVIII. SPREADSHEET

A szokásos módon (BHI), illetve a találmány szerint növesztett („fokozott aktivitású) S. flexneri és S.sonnei Congo-vörös festéket megkötő képessége tenyésztési körülmények törzs_BHI_fokozott aktivitásúAbility to bind S. flexneri and S.sonnei Congo red stains (BHI) grown according to the invention ("high activity") or cultured according to the invention under culture conditions strain_BHI_high activity

S.flexneri 2457T 0,04 0,44S.flexneri 2457T 0.04 0.44

S.sonnei 0,02 0,40S.sonnei 0.02 0.40

A Shigella 4 fajra és különféle szérumtípusokra oszlik. A jelen találmány szerint növesztett Shigella flexneri immunológiai keresztreaktvitiását a 28. példában leírt agglutinációs módszerrel vizsgáljuk. A vizsgálatokhoz immunizált nyulak antiszérumát használjuk, hogy megállapítsuk a tenyésztési körülmények hatását az eltérő Shigella fajok immunológiai keresztreaktivitása. A nyulakat formalinnal rögzített Shigella flexneriShigella is divided into 4 species and various serum types. The immunological cross-reactivity of Shigella flexneri grown according to the present invention was tested by the agglutination method described in Example 28. Antisera from immunized rabbits were used in the assays to determine the effect of culture conditions on the immunological cross-reactivity of different Shigella species. Rabbits were formalin-fixed with Shigella flexneri

2457T baktériummal immunizáljuk a 9. példában leírt módon. Az • · ··· · • · • * » ··· · • · · · • · · Η · • ···*· · ·· · ·· immunizált állatokból nyert IgG antitestek agglutinációs aktivitását a hagyományos és a találmány szerint (például 9. példa) tenyésztett, mind a 4 Shigella fajjal szemben vizsgáljuk. Az agglutinációs vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a DOC jelenléte lényegesen növeli a homológ Shigella flexneri és a három heterológ Shigella faj anti-S.flexneri antitestekkel szembeni agglutinációs aktivitását (11. ábra).Immunized with 2457T as described in Example 9. The agglutination activity of IgG antibodies obtained from immunized animals in accordance with the conventional and the present invention was demonstrated by the use of IgG antibodies obtained from immunized animals. (e.g., Example 9) cultured against all 4 Shigella species. The results of the agglutination assays show that the presence of DOC significantly increases the agglutination activity of homologous Shigella flexneri and three heterologous Shigella species against anti-S.flexneri antibodies (Fig. 11).

Az alábbi példában a Shigella vakcina hatékonyságát szemléltetjük .The following example illustrates the efficacy of the Shigella vaccine.

37, példaExample 37

A jelen találmány szerint növesztett, formaiinnal rögzített teljes sejt Shigella flexneri védőhatását az orron át fertőzött egereken vizsgáljuk C.P. Mailett és munkatársai [ Vaccine, 11:190-196 (1993)] módszerével. Röviden, a Shigella flexneri baktériumot például a 9. példában leírtak szerint növesztjük és gyűjtjük össze, majd a 30. példában ismertetett módon 0,075 % formalinnal inaktiváljuk. Kb. 10 inaktivált baktériummal vakcinálunk 14-16 hetes, nőstény Balb/c egereket. Az inaktiváltThe protective activity of Shigella flexneri whole cell grown in a formalin-fixed cell grown in accordance with the present invention was investigated in nasally infected mice C.P. Mailett et al., Vaccine, 11: 190-196 (1993). Briefly, Shigella flexneri is grown and harvested as described in Example 9 and inactivated with 0.075% formalin as described in Example 30. Approximately 10 inactivated bacteria are vaccinated in 14-16 week old female Balb / c mice. It is inactivated

S.flexneri baktériumokat steril, endotoxin-mentes PBS-ben szuszpendáljuk 10 /ml koncentrációban, és 35 μΐ szuszpenziót viszünk orron keresztül az enyhén érzéstelenített állatokba. Egy vizsgálati csoportba 10 állat tartozik. 14. napos intervallumonként három immunizálást végzünk.S.flexneri bacteria were resuspended in sterile endotoxin-free PBS at a concentration of 10 / ml and a 35 μΐ suspension was applied orally to mildly anesthetized animals. 10 animals per study group. Three immunizations are performed at 14 day intervals.

Az adjuvánsoknak a Shigella teljes sejt vakcina védőképességére gyakorolt hatásának vizsgálatához, az állatok csoportjait olyan inaktivált baktérium vakcinával immunizáljuk, ami E.coli- 77 ·*· · ·· · · b · · * · • · · « « · * ····· ··« · • · · «··«*· * ·*«···· · · · ·* ból származó 5 μg hőlabilis enterotoxint (LT) is tartalmaz. 14 nappal a harmadik immunizáló kezelés után, az állatokat orron keresztül élő S.flexneri vagy S.sonnei szubletális dózissal (105 CFU) fertőzzük meg. Közvetlenül a fertőzés előtt, majd az azt követő ., 2., 5. és 7. napon az állatok súlyát megmérjük és meghatározzuk a csoport átlagát. Az eredményeket a XIX. táblázatban foglaltuk összeTo investigate the effect of adjuvants on the protective capacity of the Shigella whole cell vaccine, groups of animals are immunized with an inactivated bacterial vaccine that contains E. coli. It also contains 5 μg of heat-labile enterotoxin (LT) from * *, *, *, *, *, *. Fourteen days after the third immunization, the animals were challenged with an intranasal S.flexneri or S.sonnei sublethal dose (10 5 CFU). Immediately before infection, and on days 2, 5, and 7, the weight of the animals is weighed and the group mean is determined. The results were published in XIX. are summarized in Table

XIX. TÁBLÁZATXIX. SPREADSHEET

Inaktivált Shigella flexneri teljes sejtes vakcina védőhatása egereknél az orron át bejuttatott élő S.flexneri vagy S.sonnei baktériumokkal szemben fertőző vakcinálás fertőzés utáni testsúlyváltozás mikroorganizmus_1_._2 ,_5 ._7 . napProtective Effect of Inactivated Shigella Flexneri Whole Cell Vaccine in Mice against Infectious Vaccination against Live S.flexneri or S.sonnei Bacterial Weight Changes after Infection Microorganism_1_. Sun

S.flexneri S.flexneri PBS PBS -8,1 -8.1 -18,2 -18.2 -17,7 -17.7 -18,3 -18.3 vakcina vaccine -5,4 -5.4 -2, 9 -2, 9 -2,5 -2.5 -1, 6 -1,6 vakcina + vaccine + adj uváns give me uvant -7,0 -7.0 -2,0 -2.0 -1,5 -1.5 1,5 1.5 S.sonnei S.sonnei PBS PBS -8,1 -8.1 -17,5 -17.5 -9,3 -9.3 -6,4 -6.4 vakcina vaccine -6,7 -6.7 -11,3 -11.3 -6,5 -6.5 -6,0 -6.0 vakcina + vaccine + adj uváns give me uvant -6,4 -6.4 -5,2 -5.2 -1,3 -1.3 -2, -2,

Minden csoportban 10 egeret immunizáltunk háromszor, orron keresztül 10 , a 9. példában lerrtak szerint növesztett és inaktivált S.flexneri baktériummal.In each group, 10 mice were immunized three times with 10 S.flexneri bacteria grown and inactivated orally, as described in Example 9.

A találmány szerint növesztett, inaktivált S.flexnerit tartalmazó vakcinával immunizált egerek védelmet nyernek az élő S . flexnerivei szemben. Ezeknél az egereknél kisebb a súlyveszte- 78 .·· » - W · ·'.Mice immunized with an inactivated S.flexneri vaccine grown according to the invention are protected by live S. flexing. These mice have less weight loss- 78 ·· »- W · · '.

• * <4 · « « · «··«· ·«« · • ·· »··««· · ··«··»· ·» ’ ·» ség és gyorsabban visszanyerik súlyukat, mint a nem-vakcináit, azaz csak PBS-sel kezelt kontroll állatok. Meglepő módon az• * <4 * and regain weight faster than non-vaccines , i.e., control animals treated with PBS only. Surprisingly it is

S.flexneri vakcina az egereket az élő S. flexneri baktériumokkal történő fertőzéssel szemben is megvédi. Érdekes módon az LT adjuvánst nem tartalmazó vakcinát kapott állatok jobb védelmet nyernek a homológ S.flexneri fertőzéssel szemben, mint azokat az állatok, melyek adjuvánst is tartalmazó vakcinával immunizálunk. A csak S.flexneri baktériumot tartalmazó vakcina a heterológ S.sonnei ellen is védelmet nyújt. Az LT adjuváns jelenléte viszont észrevehetően fokozza az S.sonnei fertőzéssel szembeni védelmet. Ezek az eredmények jelzik, hogy a jelen találmány szerint előállított, inaktivált Shigella baktériumot tartalmazó vakcina hatékony egy ismert Shigella megbetegedés modell esetében, és nincs szükség adjuvánsra ahhoz, hogy védelmet nyújtson a különféle Shigella fertőzésekkel szemben vagy, hogy a fertőzéseket enyhíteni lehessen vele.The S.flexneri vaccine also protects mice against infection with live S. flexneri bacteria. Interestingly, the animals receiving the LT adjuvanted vaccine have better protection against homologous S.flexneri infection than the animals immunized with the adjuvanted vaccine. The vaccine, which contains only S.flexneri bacteria, also protects against the heterologous S.sonnei. However, the presence of LT adjuvant noticeably enhances protection against S.sonnei infection. These results indicate that the inactivated Shigella bacterial vaccine of the present invention is effective in a known model of Shigella disease and does not require adjuvant protection against or amelioration of various Shigella infections.

Az alábbi példában azokat a tényezőket szemléltetjük, melyek befolyásolják a H.pylori állati sejteken való megtapadást.The following example illustrates the factors that influence the adhesion of H.pylori to animal cells.

38. példaExample 38

A H.pylori megtapadását fokozza a glikokolát vagy az epe jelenlétében történő tenyésztés. A H.pylori NB3-2 vagy G-l-4 törzsek sejtjeit 4 % szarvasmarha szérumot tartalmazó BHI tápközeghez adjuk. Beoltás előtt az edényt 10 % CO2, 5 % O2 és 85 % N2 összetételű gázeleggyel öblítjük át, majd a tenyészetet 22 órán keresztül rázatjuk 37°C hőmérsékleten. Az inkubálás után a tenyészetet 10 edényben hígítjuk, melyek mindegyike 1 liter BHI *» · *»«· ··« tápközeget tartalmaz, kiegészítve 4 % szarvasmarha szérummal és különböző koncentrációjú szarvasmarha epével (0, 025-0,2 %) . Ezeket az edényeket ismét átöblítjük az említett gázeleggyel, és 37°C hőmérsékleten inkubálunk. A baktériumokat különböző időben összegyűjtjük - a maximális koruk 18 órás -, majd a 28. példában leírt módszerrel vizsgáljuk az INT-407 sejtekhez való kötődésüket. Az eredmények azt mutatják, hogy az epe jelenlétében történő tenyésztésük fokozza a H.pylori INT-407 sejtekhez való kötődését (12. és 13. ábra).Adhesion of H.pylori is enhanced by culturing in the presence of glycolate or bile. Cells of H.pylori NB3-2 or Gl-4 strains are added to BHI medium containing 4% bovine serum. Prior to inoculation, the vessel was rinsed with 10% CO 2 , 5% O 2, and 85% N 2 , and the culture was shaken for 22 hours at 37 ° C. After incubation, the culture is diluted in 10 dishes, each containing 1 liter of BHI * · * «· · · medium supplemented with 4% bovine serum and bovine bile at various concentrations (0.025-0.2%). These vessels were again rinsed with said gas mixture and incubated at 37 ° C. Bacteria were harvested at various times, with a maximum age of 18 hours, and tested for binding to INT-407 cells using the method described in Example 28. The results show that culturing them in the presence of bile enhances the binding of H.pylori to INT-407 cells (Figures 12 and 13).

Az NB3-2 törzs esetében kb. 8 óra növesztésnél jelentkező maximális kötődés 4-6-szorosa az epe távollétében növesztett baktériumokénak (12. ábra). A Gl-4 törzs esetében ez a csúcs a és 14 órás, 0,2 % epe jelenlétében történő növesztés között jelentkezik, a kötődés itt 2-3-szorosára nő az epe nélkül növesztett baktériumokhoz viszonyítva (13. ábra). Mindegyik törzs esetében ezeknek a „csúcsoknak az ideje általában enybe esik a növekedés lóg fázisával.For strain NB3-2, approx. The maximal binding at 8 hours of growth is 4-6 times that of bacteria grown in the absence of bile (Fig. 12). For the Gl-4 strain, this peak occurs between 1 and 14 hours of growth in the presence of 0.2% bile, where binding is increased 2-3 fold compared to bacteria grown without bile (Figure 13). For each strain, the time of these peaks usually coincides with the log phase of growth.

Az alábbi példával a jelen találmány szerinti módszerrel növesztett Eelicobacter vakcina hatékonyságát szemléltetjük.The following example illustrates the efficacy of the Eelicobacter vaccine grown by the method of the present invention.

39. példaExample 39

A találmány szerint növesztett, formalinnal rögzítettGrowth according to the invention, fixed with formalin

Helicobacter pylori teljes sejteket tartalmazó vakcina védő hatását Chen és munkatársai módszerével [Láncét, 339:1120-1121 (1992)] határozzuk meg. A módszer a Helicobacter telis baktériumának az egér gyomrában való megtelepedésén alapszik. A Helicobacter pylori Gl-4 törzset az oltóanyag elkészítéséhez 4 % • · • · · · szarvasmarha szérummal kiegészített BHI tápközegben tenyésztjük 22 órán át, 37°C hőmérsékleten és 10 % CO2, 90 % levegő összetételű gázelegy alatt. A tenyészet kivétjével beoltunk egy tízszeres térfogatú ugyanilyen tápközeget, ami 0,1 % (térf./térf.) szarvasmarha epét tartalmaz. 12-14 órás, 37°C hőmérsékleten való tenyésztés után a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és az eredeti térfogat 1/10-ét kitevő Hank' s Balanced Salts Solution (HBSS) közegben szuszpendáljuk szobahőmérsékleten. A sejteket ismét centrifugáljuk, majd ismét szuszpendáljuk az eredeti HBSS térfogat 0/100 részében. A pufferolt sejtszuszpenzióhoz 0,075 % koncentrációban formaiint adunk, és a sejteket szobahőmérsékleten 6 órán át kevertetve, majd 18 órán át 4°C hőmérsékleten tartva inaktiváljuk.The protective efficacy of Helicobacter pylori whole cell vaccine was determined by the method of Chen et al. (1992, Chain 339: 1120-1121). The method is based on the colonization of Helicobacter telis bacteria in the mouse stomach. Helicobacter pylori Gl-4 strain was cultured in BHI medium supplemented with 4% bovine serum for 22 hours at 37 ° C and 10% CO 2 in 90% air to prepare the vaccine. The culture medium was inoculated with a 10-fold volume of the same medium containing 0.1% (v / v) bovine bile. After 12-14 hours at 37 ° C, the cells are harvested by centrifugation and resuspended in 1/10 of the original volume of Hank's Balanced Salts Solution (HBSS) at room temperature. The cells were centrifuged again and resuspended in 0/100 volumes of the original HBSS. Formalin (0.075%) was added to the buffered cell suspension and the cells were inactivated by stirring at room temperature for 6 hours and then kept at 4 ° C for 18 hours.

A védőhatást a rutin eljárással mérjük, a 6-8 hetes nőstény Balb/c Helicobacter-mentes egereknek a 0., 7. és 14. vagy a 0.,The protective effect was measured by the routine method, at 0, 7 and 14, or 0, in 6-8 week old female Balb / c Helicobacter

7. és a 21. napon szájon át három dózisban beadott, inaktivált teljes sejteket tartalmazó vakcina beadását követően. Az egyes dózis 10 baktériumot tartalmaz holabil E.coli enterotoxin jelenlétében. A harmadik immunizáló dózis beadását követő 14. naponOn days 7 and 21 following the administration of a three-dose oral vaccine containing inactivated whole cells. Each dose contains 10 bacteria in the presence of the holabile E. coli enterotoxin. On the 14th day after the third immunization dose

-y az állatokat szájon át élő H.felis egyetlen dózissal (10 CFU/dózis) fertőzzük.-y animals are challenged orally with a single dose of H.felis (10 CFU / dose).

Két héttel a fertőzés után az állatokat elöljük, és az antralis gyomorszegmensek ureáz aktivitását analizáljuk, hogy meghatározzuk a H.felis jelenlétét. Az ureázaktivitás meghatározásához az antralis szövetmintákat 0,5 ml Stuart' s Urease Broth (Remei) reagensben inkubáljuk 4-24 órán át szobahőmérsékleten.Two weeks after the infection, the animals are sacrificed and the urease activity of the anterior gastric segments is analyzed to determine the presence of H.felis. To determine the urease activity, the anterior tissue samples were incubated in 0.5 ml of Stuart's Urease Broth (Remei) reagent for 4-24 hours at room temperature.

Ez alatt az idő alatt az oldat színe pozitív ureázvizsgálat esetében pirosra változik.During this time, the solution turns red in the case of a positive urease test.

• ·• ·

Amint a XX. táblázat adatai mutatják, a H. pylori G-l-4 törzset alkalmazva, a fokozott aktivitású Helicobacter teljes sejteket tartalmazó vakcina beadásával az állatok megvédhetők az orális H.felis fertőzéssel szembenAs the XX. The data shown in Table III show that using H. pylori strain G-1-4, the vaccine containing the highly active Helicobacter whole cells can be used to protect the animals against oral H.felis infection.

XX, TÁBLÁZATTABLE XX

Helicobacter fertőzéssel szembeni védelem a jelen találmányThe present invention provides protection against Helicobacter infection

szerinti módszerrel tenyésztett, bred according to the method, inaktivált H. pylori baktériumot inactivated H. pylori tartalmazó with vakcinával vaccine immunizáló immunization fertőzős mikro- infectious micro- megtelepedett/ settled / százalékos percent ágens3 agent 3 7 organizmus (10 CFU) 7 organisms (10 CFU) /összes /all védelem protection 1 . 1. kísérlet experiment H. pylori' H. pylori ' b H.felis b H.fell 4/13 4/13 71 71 PBS + LT PBS + LT H.felis H.felis 9/9 9/9 0 0 2 . 2. kísérlet experiment H.pylori H.pylori b H.felis b H.fell 2/15 2/15 87 87 PBS + LT PBS + LT H.felis H.felis 10/10 10/10 0 0

a valamennyi ágenst, 10 pg LT-vel (ETEC labilis toxin) együtt dózisban, szájon át adjuk be 7 napos időközönként b 0,25 ml-ben beadva lxlO9 CFu Gl-4 törzs. b solution was ml of 0.25 9 CFU administered lxlO Gl-4 strain at 7-day intervals in each agent, 10 g LT (labile toxin of ETEC), with a dose, by oral route.

A kísérletek eredményei mutatják a bélbaktériumok fokozottan aktív tulajdonságainak jelentőségét az in vivő immunizálásban.The results of the experiments show the importance of the highly active properties of intestinal bacteria in in vivo immunization.

A jelen találmány módszerével olyan baktériumokat állítunk elő, melyek képesek védelmet nyújtó immunogén választ kiváltani, és ezáltal felhasználhatók vakcinaként.The method of the present invention provides bacteria which are capable of inducing a protective immunogenic response and thus useful as a vaccine.

Az American Type Culture Collection törzsgyűjteményben (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) az alábbi mikroorganizmusokat helyeztük letétbe:The following microorganisms were deposited in the American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA):

mikroorganizimus_letéti szám letétbehelyezés idejemicroorganizimus_deposit number deposit time

Helycobacter pylori NB3-2 1995. szeptember 29.Helycobacter pylori NB3-2 September 29, 1995

Helycobacter pylori Gl-4_1995. szeptember 29.Helycobacter pylori Gl-4_1995. September 29

A jelen találmány eljárásaival ekvivalens más eljárások a szakemberek részéről könnyen meghatározhatók, és ezek beletartoznak a találmány oltalmi körébe. A leírás valamennyi lényegesnek tartott információt tartalmazza ahhoz, hogy egy szakember az igénypontokban összefoglaltakat a gyakorlatban megvalósíthassa. Minthogy az ideért szabadalmak és publikációk további hasznos információkat nyújthatnak, valamennyi idézett anyag a találmány referenciájába beépített.Other methods equivalent to those of the present invention are readily determined by those skilled in the art and are included within the scope of the invention. The description includes all information considered to be essential for the practitioner to practice the claims summarized in the claims. Since the patents and publications herein may provide additional useful information, all cited materials are incorporated herein by reference.

Claims (48)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. Eljárás fokozott antigénaktivitású bélbaktériumok, nevezetesen Campylobacter sp. , Yersinia sp. , Bacteroides sp.,A method for the treatment of intestinal bacteria with increased antigenic activity, namely Campylobacter sp. , Yersinia sp. , Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Gastrospirillum sp., Enterobacter sp. ,Klebsiella sp. , Gastrospirillum sp., Enterobacter sp. . Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp.,Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. és Escherichia coli előállítására, mely abból áll, hogy a bélbaktérium tenyészetét a korai lóg fázis, a korai lóg fázis és a stacioner fázis közti vagy a stacioner fázis állapotának eléréséig szükséges idő át in vitro növesztjük a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:Clostridium sp., Enterococcus sp. and Escherichia coli, which comprises growing the intestinal bacterial culture in vitro for a period of time between reaching the early-onset phase, the early-onset phase and the stationary phase, or a combination of the following environmental factors: a) 0,05-3 % epe vagy 0,025-0,6 % egy vagy több epesav vagy sói j elenlétében;(a) 0.05% to 3% bile or 0.025% to 0.6% in the presence of one or more bile acids or salts thereof; b) 30-42°C hőmérsékleten;b) at 30-42 ° C; c) levegő alatt mikroaerofill körülmények között, ahol a mikroaerofill körülmény (i) 5-20 % CO2, 80-95 % levegő, vagy (ii)(c) under air under microaerophilic conditions where the microaerophilic condition is (i) 5 to 20% CO 2 , 80 to 95% air, or (ii) 5-10 % O2, 10-20 % CO2, 70-85 % N2 összetételű gázelegyet jelent;5 to 10% O 2 , 10 to 20% CO 2 , 70 to 85% N 2 ; ésand d) kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, amit 0-100 μΜd) in the presence of a divalent cationic chelating agent which is 0-100 μΜ BAPTA/AM, 1-10 mM EGTA vagy 0-100 μΜ EGTA/AM közül választunk ki.BAPTA / AM, 1-10 mM EGTA or 0-100 μΜ EGTA / AM are selected. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett epesavsó a deoxikolát vagy a glikokolát.The process of claim 1, wherein said bile salt is deoxycholate or glycocholate. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Campylobacter sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is a Campylobacter sp. • ·· ·• ·· · 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium a Campylobacter jejuni vagy a Campylobacter coli.The method of claim 3, wherein said intestinal bacterium is Campylobacter jejuni or Campylobacter coli. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett Campylobacter jejuni az alábbi törzsek valamelyike:The method of claim 4, wherein said Campylobacter jejuni is one of the following strains: Campylobacter jejuni 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52,Campylobacter jejuni 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 vagy HC.VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 or HC. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a Campylobacter jejuni a Campylobacter jejuni 81-176 törzs, melynek tenyészetét a stacioner fázis állapot eléréséig szükséges időn át növesztjük a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:The method of claim 5, wherein Campylobacter jejuni is a strain of Campylobacter jejuni 81-176, the culture of which is grown for a period of time until the stationary phase is reached, with the following combination of environmental factors: a) 0,1 % epesavsó - ami deoxikolát - vagy 0,8 % epe jelenlétében;(a) 0.1% bile salt, which is deoxycholate, or 0.8% bile; b) 37°C hőmérsékleten;(b) at 37 ° C; c) 10-20 % CO2 és 80-90 % levegő összetételű gázelegyben.c) 10-20% CO 2 and 80-90% air in a gas mixture. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Shigella sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is a Shigella sp. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktrium az alábbi Shigella fajok valamelyike:The method of claim 7, wherein said gut bacterium is one of the following Shigella species: S.flexneri, sonnei, dysentaariae vagy boydii.S.flexneri, sonne, dysentaariae or boydii. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett Shigella a Shigella flexneri vagy a Shigella dysentariae.The method of claim 8, wherein said Shigella is Shigella flexneri or Shigella dysentariae. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett ··· ·The method of claim 9, wherein said ··· · - 85 - ........- 85 - ........ Shigella flexneri a Shigella flexneri 2457T törzs, melynek tenyészetét a korai lóg fázis állapot eléréséig szükséges időn át növesztjük, a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:Shigella flexneri is a strain of Shigella flexneri 2457T cultivated for the time necessary to reach an early hanging state with the following combination of environmental factors: a) 0,1 % deoxikolát vagy 0,8 % epe jelenlétében;(a) 0.1% deoxycholate or 0.8% bile; b) 37°C hőmérsékleten;(b) at 37 ° C; c) levegő alatt.(c) under the air. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Yersinia sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is a Yersinia sp. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium az Escherichia coli.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is Escherichia coli. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett Escherichia coli egy entero-toxikus, entero-hemorrhagiás, entero-patogén vagy entero-invazív Escherichia coli.The method of claim 12, wherein said Escherichia coli is an enterotoxic, entero-haemorrhagic, entero-pathogenic or entero-invasive Escherichia coli. 14 . 14th Az 1 1 . igénypont szerinti . According to claim 1 eljárás, process ahol where a the nevezett said bél- bowel- baktérium bacterium egy one Vibrio sp. Vibrio sp. 15 . 15th Az 1 1 . igénypont szerinti . According to claim 1 eljárás, process ahol where a the nevezett said bél- bowel- baktérium bacterium egy one Salmonella sp. Salmonella sp. 16 . 16th Az 1 1 . igénypont szerinti . According to claim 1 eljárás, process ahol where a the nevezett said bél- bowel- baktérium bacterium egy one Bacteroides sp. Bacteroides sp. 17 . 17th Az 1 1 igénypont szerinti According to claim 1 eljárás, process ahol where a the nevezett said bél- bowel-
baktérium egy Clostridium sp.bacterium is a Clostridium sp. • · · · · · «*** :6 ···· · · · · · • »·····• · · · · «***: 6 ···· · · · · · · ·····
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Enterococcus sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is an Enterococcus sp. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Klebsiella sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is a Klebsiella sp. 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Enterobacter sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is an Enterobacter sp. 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett bélbaktérium egy Gastrospirillum sp.The method of claim 1, wherein said intestinal bacterium is a Gastrospirillum sp. 22. Eljárás fokozott antigénaktivitású bélbaktérium, nevezetesen Campylobacter sp., Yersinia sp. , Bacteroides sp. ,22. A method for the treatment of intestinal bacteria with increased antigenic activity, namely Campylobacter sp., Yersinia sp. , Bacteroides sp. . Klebsiella sp., Enterobacter sp., Gastrospirillum sp.,Klebsiella sp., Enterobacter sp., Gastrospirillum sp., Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp. ,Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp. . Clostridium sp., Enterococcus sp. és Escherichia coli előállítására, mely abból áll, hogy a bélbaktérium tenyészetét a korai lóg fázis, a korai lóg fázis és a stacioner közötti vagy a stacioner fázis állapot eléréséig szükséges időn át in vitro növesztjük a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:Clostridium sp., Enterococcus sp. and Escherichia coli, which comprises culturing the intestinal bacterium in vitro for a period of time up to the time between early log phase, early log phase and stationary phase or stationary phase, with the following combination of environmental factors: a) kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, amit 1,0-25 μΜa) in the presence of a divalent cationic chelator, which is 1.0-25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 mM EGTA vagy 1,0-100 μΜ EGTA/AM közül választunk ki;BAPTA / AM, 0.5-10 mM EGTA or 1.0-100 μ-1 EGTA / AM; b) 30-42°C hőmérsékleten;b) at 30-42 ° C; c) levegőn vagy mikroaerofill körülmények között, ahol a mikroaerof ill körülmény (i) 5-20 % CO2 és 80-95 % levegő, vagy • · · · · · · (ii) 5-20 % CO2 és 80-95 % N2, vagy (iii) 5-10 % O2, 10-20c) in air or under microaerophilic conditions where the microaerophilic condition is (i) 5-20% CO 2 and 80-95% air, or (ii) 5-20% CO 2 and 80-95% % N 2 , or (iii) 5-10% O 2 , 10-20 CO, és 70-85CO, and 70-85 N2 összetételű gázelegyet jelent.It represents a gas mixture of N 2 . 23. Fokozott antigénaktivitású bélbaktérium, nevezetesen Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp. , Gastropirillum sp., Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. vagy Escherichia coli, mely bélbaktériumot olyan tenyészetből gyűjtjük össze, ahol a bélbaktérium tenyészetét a korai lóg fázis, a korai lóg fázis és a stacioner fázis, vagy a stacioner fázis állapot eléréséig in vitro a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett növesztettünk:23. An intestinal bacterium with increased antigenic activity, namely, Campylobacter sp., Yersinia sp., Bacteroides sp., Klebsiella sp. , Enterobacter sp. , Gastropirillum sp., Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp., Vibrio sp., Clostridium sp., Enterococcus sp. or Escherichia coli, the intestinal bacterium of which is collected from a culture in which the culture of the intestinal bacterium is grown in vitro to the early-onset phase, the early-onset phase and the stationary phase, or the following combination of environmental factors: a) 0,05-3 % epe vagy 0,025-0,6 % egy vagy több epesav vagy sói jelenlétében;(a) 0.05% to 3% bile or 0.025% to 0.6% in the presence of one or more bile acids or salts thereof; b) 30-42°C hőmérsékleten;b) at 30-42 ° C; c) levegő alatt mikroaerofill körülmények között, ahol a mikroaerofill körülmény (i) 5-20 % CO2, 80-95 % levegő, vagy (ii) 5-20 % CO2, és 80-95 % N2 vagy (iii) 5-10 % O2, 10-20 % CO2 ésc) under air under microaerophilic conditions, wherein the microaerophilic condition is (i) 5-20% CO 2 , 80-95% air, or (ii) 5-20% CO 2 , and 80-95% N 2, or (iii) 5-10% O 2 , 10-20% CO 2 and 70-85 % N2 öösszetételű gázelegyet jelent; és70-85% N 2 is a 5 gas mixture; and d) kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, amit 0-100 pMd) in the presence of a divalent cationic chelator at 0-100 pM BAPTA/AM, 0-10 mM EGTA vagy 0-100 pM EGTA/AM közül választunk ki.BAPTA / AM, 0-10 mM EGTA or 0-100 pM EGTA / AM are selected. 24. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett epesavsó deoxikolát vagy glikokolát.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said bile salt is deoxycholate or glycocholate. 25. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium egy Campylobacter sp.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is a Campylobacter sp. 26. A 25.26. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett Camylobacter sp. a Campylobacter jejuni vagy a Campylobacter coli .The intestinal bacterium of claim 1, wherein said Camylobacter sp. Campylobacter jejuni or Campylobacter coli. 27. A 26. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezettThe enteric bacterium of claim 26, wherein said bacterium is Campylobacter jejuni az alábbi törzsek valamelyike:Campylobacter jejuni is one of the following strains: Campylobaceter jejuni 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52,Campylobaceter jejuni 134, 195, 170, 81-176, 6, 81-116, 35, 52, VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 vagy HC.VC-167, 88, 244, 544, 699, 1180, 910 or HC. 28. A 27. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett Campylobacter jejuni törzs a 81-176 törzs, amelynek tenyészetét stacioner fázisig növesztjük a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:The enteric bacterium of claim 27, wherein said strain Campylobacter jejuni is strain 81-176, the culture of which is grown to a stationary phase under the following combination of environmental factors: a) 0,1 % deoxikolát vagy 0,8 % epe jelenlétében;(a) 0.1% deoxycholate or 0.8% bile; b) 37°C hőmérsékleten;(b) at 37 ° C; c) 10-30 % CO2 és 80-90 % levegő összetételű gázelegyben.c) 10-30% CO 2 and 80-90% air in a gas mixture. 29. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium egy Shigella sp.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is a Shigella sp. 30. A 2930. A 29 Shigella faj boydii .Shigella faj boydii. 31. A 30 igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett a Shigella flexneri, sonnei, dysenteriae vagy igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium a Shigella dysenteriae.The gut bacterium of claim 30, wherein said gut bacterium is Shigella flexneri, sonnei, dysenteriae, or the gut bacterium of claim 30, wherein said gut bacterium is Shigella dysenteriae. • ·• · 32. A 30. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium a Shigella flexneri.The intestinal bacterium of claim 30, wherein said intestinal bacterium is Shigella flexneri. 33. A 32. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett Shigella flexneri a Shigella flexneri 2457T törzs, melynek tenyészetét a korai lóg fázisig növesztjük a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett:The intestinal bacterium of claim 32, wherein said Shigella flexneri is a strain of Shigella flexneri 2457T, the culture of which is grown to the early hanging stage with the following combination of environmental factors: a) 0,1 % doxikolát vagy 0,8 % epe jelenlétében;(a) 0.1% doxycolate or 0.8% bile; b) 37°C hőmérsékleten;(b) at 37 ° C; c) levegő alatt.(c) under the air. 34. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium az Escherichia coli.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is Escherichia coli. 35. A 34. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezettThe enteric bacterium of claim 34, wherein said bacterium is Escherichia coli egy enterotoxikus, enterohaemorrhagiás, enteropathogén vagy enteroinvazív Escherichia coli törzs.Escherichia coli is an enterotoxic, enterohaemorrhagic, enteropathogenic or enteroinvasive strain of Escherichia coli. 36. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium egy Vibrio sp.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is a Vibrio sp. 37. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium egy Salmonella sp.,The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is a Salmonella sp. 38. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett bélbaktérium egy Bacteroides sp.38. The gut bacterium of claim 23, wherein said gut bacterium is a Bacteroides sp. 39. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium, ahol a nevezett • · bélbaktérium Clostridium sp.The intestinal bacterium of claim 23, wherein said intestinal bacterium is Clostridium sp. 40. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium egy Enterococcus sp. 40. The method of claim 23 intestinal bacterium is an Enterococcus sp. bélbaktérium, intestinal bacteria, ahol where a the nevezett said 41. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium egy Klebsiella sp. 41. The method of claim 23 intestinal bacterium is a Klebsiella sp. bélbaktérium, intestinal bacteria, ahol where a the nevezett said 42. A 23. igénypont szerinti bélbaktérium egy Enterobacter sp. 42. The method of claim 23 intestinal bacterium is an Enterobacter sp. bélbaktérium, intestinal bacteria, ahol where a the nevezett said 43. A 23. igénypont szerinti 43. The method of claim 23 bélbaktérium, intestinal bacteria, ahol where a the nevezett said
bélbaktérium egy Gastrospirillum sp.intestinal bacterium is a Gastrospirillum sp.
44. Fokozott antigénaktivitású bélbaktérium, nevezetesen Camylobacter sp . , Yersinia sp . , Bacteroides sp . , Klebsiella sp . , Gastrospirillum sp., Enterobacter sp. , Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. vagy Esherichia coli, mely bélbaktériumot olyan tenyészetből gyújtjuk össze, ahol a bélbaktérium tenyészetét a korai lóg fázis és a stacioner fázis eléréséig in vitro a környezeti tényezők alábbi kombinációja mellett növesztettük:44. An intestinal bacterium with increased antigenic activity, namely, Camylobacter sp. , Yersinia sp. , Bacteroides sp. , Klebsiella sp. , Gastrospirillum sp., Enterobacter sp. , Salmonella sp. , Shigella sp. , Aeromonas sp. , Vibrio sp., Clostridium sp. , Enterococcus sp. or Esherichia coli, the intestinal bacterium of which is grown from a culture in which the culture of the intestinal bacterium is grown in vitro until the early hanging phase and the stationary phase are reached, using the following combination of environmental factors: a) kétértékű kation-kelátképző jelenlétében, amit 1,0-25 μΜa) in the presence of a divalent cationic chelator, which is 1.0-25 μΜ BAPTA/AM, 0,5-10 mM EGTA vagy 1,0-100 μΜ EGTA/AM közül választottunk ki;BAPTA / AM, 0.5-10 mM EGTA, or 1.0-100 μΜ EGTA / AM; b) 30-42°C hőmérsékleten;b) at 30-42 ° C; c) levegőn vagy mikroaerofill körülmények között, ahol a mikro•« »Μ» «· · ·· · · • · · · · · ···«« · · · · • · · ······ «(c) in air or in micro-aaerophilic conditions where the micro- - 91 - ............- 91 - ............ aerofill körülmény (i) 5-20 % CO2 és 80-95 % levegő, (ii) 5-20 %aerophilic condition (i) 5-20% CO 2 and 80-95% air, (ii) 5-20% CO2 és 80-95 % N2, vagy (iii) 5-10 % O2, 10-20 % CO2 és 70-85 % N2 összetételű gázelegyet jelent.CO 2 and 80-95% N 2 , or (iii) a gas mixture of 5-10% O 2 , 10-20% CO 2 and 70-85% N 2 . 45. Vakcina, mely a 23., 26., 28., 29., 30. vagy 33-44 igénypont szerinti bélbaktériumot, immunogén fragmensét vagy származékát tartalmazza.45. A vaccine comprising the intestinal bacterium, immunogenic fragment or derivative according to claims 23, 26, 28, 29, 30 or 33-44. 46. A 45. igénypont szerinti vakcina, mely gyógyászati szempontból alkalmazható vívőanyagot vagy közeganyagot tartalmaz.46. The vaccine of claim 45, which comprises a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. 47. A 45. igénypont szerinti vakcina, ahol a nevezett bélbaktérium inaktivált.47. The vaccine of claim 45, wherein said intestinal bacterium is inactivated. 48. A 47. igénypont szerinti vakcina, ahol a nevezett bélbaktérium formalinos kezeléssel intaktivált.48. The vaccine of claim 47, wherein said intestinal bacterium is inactivated by formalin treatment. 49. A 45. igénypont szerinti vakcina, ahol a nevezett vakcina alkalmas a nyálkahártyán át történő vagy a parenterális bevitelre vagy a nyálkahártyán át történő és parenterális bevitelre.49. The vaccine of claim 45, wherein said vaccine is suitable for transmucosal or parenteral administration, or for transmucosal and parenteral administration. 50. A 45. igénypont szerinti vakcina, mely adjuvánst is tartalmaz .50. The vaccine of claim 45, further comprising an adjuvant. 51. Eljárás potenciálisan antimikrobiális tulajdonságú hatóanyag vizsgálatára, mely abból áll, hogy a 23., 26., 28., 29.,51. A method for testing an agent having a potential antimicrobial property comprising the steps of 23, 26, 28, 29, 30. vagy 33-34. igénypont szerinti bélbaktériumot a nevezett hatóanyaggal érintkezésbe hozzuk, és vizsgáljuk a nevezett ható**» · sztatikus hatását.30 or 33-34. The intestinal bacterium of claim 1 is contacted with said active ingredient and assayed for its static activity. 52. Eljárás gazdaszervezet bélbaktériumokkal szembeni antitestjeinek kimutatására a szervezetben vagy az abból nyert biológiai mintában, mely abból áll, hogy (a) a nevezett biológiai mintát érintkezésbe hozzuk a 23., 26., 28., 29., 30. vagy 33-34. igénypontok szerinti bélbaktériummal vagy fragmensével, és (b) vizsgáljuk az antitestnek a bélbaktériumhoz vagy fragmenséhez való kötődését.52. A method of detecting host antibodies to gut bacteria in or on a biological sample of the organism, comprising: (a) contacting said biological sample with an antibody of the 23rd, 26th, 28th, 29th, 30th, or 33-34; . and (b) assaying the binding of the antibody to the intestinal bacterium or fragment thereof. 53. Eljárás bélbaktériumok szervezetben vagy az abból származó biológiai mintában történő kimutatására, mely abból áll, hogy (a) a nevezett biológiai mintát érintkezésbe hozzuk olyan antitesttel, mely kötődik a 23., 26., 28-, 29. 30. vagy 33-34. igénypont szerinti bélbaktériumhoz vagy szegmenséhez, és (b) vizsáljuk az antitestnek bélbaktériumhoz vagy fragmenséhez való kötődését.53. A method for detecting intestinal bacteria in an organism or a biological sample thereof, comprising: (a) contacting said biological sample with an antibody that binds to a protein of the invention; 34th and (b) assaying the binding of the antibody to the intestinal bacterium or fragment thereof. 54. Immundiagnosztikai készlet egy gazdaszervezet bélbaktériumokkal szembeni antitesttermelésének vagy a bélbaktériumnak a kimutatására, mely a 23., 26., 28., 29., 30. vagy 33-44. igénypont szerinti bélbaktériumot vagy az elleni antitestet és az immunológiai vizsgálathoz szükséges valamennyi lényeges készletalkotórészt tartalmazza.54. An immunodiagnostic kit for detecting the production of an antibody against a gut bacterium by a host or a gut bacterium as described in any of claims 23, 26, 28, 29, 30 or 33-44. The intestinal bacterium or antibody of claim 1 and all essential kit components for immunoassay. 55. Eljárás antibakteriális antitestek termelésére élőlényekben, mely abból áll, hogy az élőlényt a 23., 26., 28., 29., 30. vagy 33-34. igénypont szerinti bélbaktériumot tartalmazó •· w·*· ····55. A method of producing antibacterial antibodies in an animal, comprising the step of: 23, 26, 28, 29, 30 or 33-34. Intestinal bacterium according to claim 1 · · w · * · ···· V ···· · · • · · ·«(>··<· · * immunogén hatásos mennyiségével immunizáljuk, ahol a bélbaktériumokkal szembeni antitestek a nevezett bélbaktériumhoz vagy komponenséhez kötődnek.V is immunized with an effective amount of an immunogen, whereby antibodies against the gut bacteria bind to said gut bacterium or component. 56. Eljárás élőlények immunválaszának stimulálására, mely abból áll, hogy a 23., 26., 28., 30. vagy 33-4. igénypont szerinti bélbaktériumot tartalmazó immunogén hatásos mennyiségét juttatjuk az élőlénybe, és a nevezett immunválasz az élőlény bélbaktérium, nevezetesen Campylobacter sp., Yersinia sp. , Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp. , Clostridium sp., Enterococcus sp. vagy Escherichia coli okozta fertőzését vagy betegségét megelőzi, enyhíti, illetve gyógyítj a.56. A method of stimulating an immune response in a living organism comprising the steps of: 23, 26, 28, 30 or 33-4. An effective amount of an intestinal bacterium containing an intestinal bacterium according to claim 1, wherein said immune response is an intestinal bacterium, namely Campylobacter sp., Yersinia sp. , Bacteroides sp., Klebsiella sp., Gastrospirillum sp. , Enterobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Aeromonas sp., Vibrio sp. , Clostridium sp., Enterococcus sp. or to prevent, alleviate, or cure an infection or disease caused by Escherichia coli.
HU9702303A 1994-10-05 1995-10-04 A method for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity and vaccines containing them HUT77876A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31840994A 1994-10-05 1994-10-05
US08/538,543 US5681736A (en) 1994-10-05 1995-10-03 Methods for producing enhanced antigenic shigella bacteria and vaccines comprising same
US08/538,545 US5679564A (en) 1994-10-05 1995-10-03 Methods for producing enhanced antigenic campylobacter bacteria and vaccines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77876A true HUT77876A (en) 1998-09-28

Family

ID=27405987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9702303A HUT77876A (en) 1994-10-05 1995-10-04 A method for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity and vaccines containing them

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0804542A4 (en)
JP (1) JP3394047B2 (en)
CN (1) CN1168693A (en)
AU (1) AU704283B2 (en)
BR (1) BR9509276A (en)
CA (1) CA2202027A1 (en)
CZ (1) CZ104397A3 (en)
FI (1) FI971403L (en)
HU (1) HUT77876A (en)
IL (1) IL115521A0 (en)
MX (1) MX9702431A (en)
NO (1) NO971519L (en)
NZ (1) NZ295907A (en)
PL (1) PL182700B1 (en)
SG (2) SG73509A1 (en)
WO (1) WO1996011258A1 (en)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0792347T3 (en) * 1994-10-05 2006-04-03 Emergent Immunosolutions Inc Methods for Preparation of Enhanced Antigenic Heliobacter sp. and vaccines comprising the same
EP1629005A2 (en) * 2003-05-30 2006-03-01 Intercell AG Enterococcus antigens
US20100074846A1 (en) * 2006-03-17 2010-03-25 Ellis John A Campylobacter Vaccines and Methods of use
WO2008146830A1 (en) * 2007-05-28 2008-12-04 The Kitasato Institute Bordetella parapertussis-containing whole-cell vaccine composition
CN107513553B (en) * 2017-09-18 2021-05-18 江南大学 Method for screening lactobacillus with antagonistic campylobacter jejuni infection function
CN109633151B (en) * 2018-12-26 2022-03-11 西北农林科技大学 A kind of Salmonella Enteritidis detection method, test strip and application

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU657168B2 (en) * 1991-09-18 1995-03-02 Amgen, Inc. Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant

Also Published As

Publication number Publication date
FI971403L (en) 1997-06-04
CN1168693A (en) 1997-12-24
BR9509276A (en) 1997-11-18
SG73510A1 (en) 2000-06-20
NO971519D0 (en) 1997-04-03
EP0804542A4 (en) 1998-10-28
CA2202027A1 (en) 1996-04-18
JPH10507347A (en) 1998-07-21
NO971519L (en) 1997-05-27
JP3394047B2 (en) 2003-04-07
AU704283B2 (en) 1999-04-15
PL319580A1 (en) 1997-08-18
EP0804542A1 (en) 1997-11-05
SG73509A1 (en) 2000-06-20
IL115521A0 (en) 1996-06-18
MX9702431A (en) 1998-05-31
CZ104397A3 (en) 1998-06-17
PL182700B1 (en) 2002-02-28
FI971403A0 (en) 1997-04-04
AU3956195A (en) 1996-05-02
WO1996011258A1 (en) 1996-04-18
NZ295907A (en) 1999-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5869066A (en) Vaccine containing a campylobacter bacterium having an enhanced antigenic property
Law Adhesion and its role in the virulence of enteropathogenic Escherichia coli
AU663858B2 (en) Diagnostic testing for campylobacter jejuni or coli infections using antigens
Chatterjee et al. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae: III. Biological functions
CN104470539A (en) Outer membrane proteins of histophilus somni and methods thereof
HUT77574A (en) Methods for producing enhanced antigenic helicobacter sp. and vaccines comprising same
HUT77876A (en) A method for producing intestinal bacteria with increased antigenic activity and vaccines containing them
WO1996011257A9 (en) Methods for producing enhanced antigenic helicobacter sp. and vaccines comprising same
WO1996011258A9 (en) Methods for producing enhanced antigenic enteric bacteria and vaccines comprising same
KR20120129777A (en) Vaccine composition comprising attenuated and immunopotentiated mutant of Salmonella Enteritidis for preventing salmonellosis
Davies Biochemical and cell-surface characteristics of Yersinia ruckeri in relation to the epizootiology and pathogeneis of infections in fish.
Fang Intestinal Escherichia coli infections
CN105307677A (en) Campylobacter vaccine
Lockman Motility and adherence as Salmonella typhimurium virulence factors: The pathogenesis of fla, mot, andfim mutants in murine typhoid fever
Ngwai et al. Comparison of immunoblot analysis of emergent multidrug-resistant Salmonella typhimurium definitive phage type 104 with a non-multidrug-resistant definitive phage type 104 strain
Aziz Annotated bibliography on classical vibrio cholerae
Holmes Isolation and molecular characterisation of toxins from Campylobacter jejuni and related species
WO2002030321A2 (en) Bird diagnostics and treatments