[go: up one dir, main page]

HUT77251A - Borrelia burgdorferi OspG-t tartalmazó vakcina - Google Patents

Borrelia burgdorferi OspG-t tartalmazó vakcina Download PDF

Info

Publication number
HUT77251A
HUT77251A HU9701727A HU9701727A HUT77251A HU T77251 A HUT77251 A HU T77251A HU 9701727 A HU9701727 A HU 9701727A HU 9701727 A HU9701727 A HU 9701727A HU T77251 A HUT77251 A HU T77251A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ospg
protein
burgdorferi
vaccine
purified
Prior art date
Application number
HU9701727A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael D. Kramer
Markus M. Simon
Reinhard Wallich
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9416667A external-priority patent/GB9416667D0/en
Priority claimed from GBGB9503867.5A external-priority patent/GB9503867D0/en
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum, MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum
Publication of HUT77251A publication Critical patent/HUT77251A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

A találmány Borrelia burgdorfériből származó új antigénekre és azok származékára, ezek előállítási eljárására, alkalmazására humán és állatgyógyászatban és -diagnosztikában, továbbá ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.
A találmány különösen egy új, polimorf B. burgdorféri lipoprotein, az OspG klónozó expressziójára vonatkozik. Ez a lipoprotein korábban lp77 néven ismert volt. A protein kikövetkeztetett aminosav-szekvenciája nem mutat szignifikáns homológiát más ismert Borellia antigénekkel, például az OspA, OspB, OspC, OspD, OspE, OspF és P27 jelű antigénekkel. Ezen külső felületi proteinek 41 % és 65 % közötti hasonlóságot mutatnak az OspG-vel (lásd 1. táblázatot).
A Lyme-kór a mérsékelt égöv leggyakoribb, vektor által közvetített fertőzőbetegsége. Az etiológiai ágens, a Borellia burgdorféri spirochéta, emberekben sok szervre kiterjedő betegséget okoz, ami érintheti a bőrt, az idegrendszert, az ízületeket és a szívet [8, 44]. A különböző biológiai forrásokból és földrajzi területekről izolált B. burgdorféri törzsek eltérőek [2, 19, 38, 45, 50] és feltételezhető, hogy a betegség-manifesztálódások mintázatát a spirochéta törzsek közötti antigén-különbözőség befolyásolja. Bár számos kísérletet tettek arra, hoy a B. burgdorféri törzseket immunológiai és molekuláris kritériumok alapján osztályozzák, a B. burgdorféri taxonómiája még mindig vita és aktív kutatás tárgya.
Jelenleg különböző B. burgdorféri antigének, például külső felületi protein A (OspA) , OspB, pC és plOO használatosak szerológiai diagnosztizálásban és a vakcina-fejlesztésben feltételezett hatóanyag-jelöltként [13, 14, 36, 38, 40, 41]. Nyilvánvaló heterogenitásuk következtében azonban mindeddig hiányoznak az egyértelmű kritériumok a fajspecifikus diagnosztikai standardok létrehozásához és egy olyan polipeptid-vakcina kifejlesztéséhez, amely bármely alfaj elleni védelmet garantálna.
Kísérleteink során találtunk egy további B. burgdorferi lipoproteint, amelyet OspG jellel jelölünk. E molekulának a látszólagos molekulatömege mintegy 22 kDa, izoelektromos pontja PI=5,2 és 196 aminosavból áll. Az érett fehérjére jellemző továbbá, hogy az OspG aminoterminális részénél egy kb. 20 aminosavból álló nagy hidrofób területtel rendelkezik. Ez az N-terminális peptid megfelel a tipikus prokarióta lipoprotein prekurzorokban található vezető szignálpeptidnek. A hidrofób mag karboxi-végénél található egy hasítási hely, amelyet feltételezhetően felismer a B. burgdorferi szignálpeptidáz. Az Ospb-ben a potenciális hasítási hely a 19-helyzetben levő szerin és a 20-helyzetben levő cisztein között található. Az OspG hasítási helye körüli szekvencia:
L-l-l-S-C.
Az OspA, B, C, D, E, F és p27 génjétől eltérően az OspG génje természetes esetben a B. burgdorferi ZS7-ben található 55 kb méretű plazmádon helyezkedik el. A 45 kb méretű plazmáddal az OspG próba gyenge keresztreaktivitást mutatott. Az OspG aminosav-szekvenciaja lényegében véve megegyezik az 1. ábrán bemutatottal. Jellemző rá továbbá, hogy csak fertő-
zés közben expresszálódik, és in vitro tenyésztett B. burgdorferiben nem mutatható ki.
A találmány értelmében tehát biztosítunk egy B. burgdorferi eredetű izolált proteint, amelynek a molekulatömege kétdimenziós SDS gélelektroforézissel meghatározva 20-22 kDa és izoelektromos pontja 4,9 és 5,4 között van.
Biztosítunk továbbá egy proteint vagy annak egy immunológiai vagy antigén szempontból ekvivalens fragmensét vagy származékát, amely legalább 80 % homológiát mutat az 1. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával.
A protein és az annak megfelelő DNS és RNS szekvenciák a vakcinagyártási és diagnosztikai területen hasznosíthatók.
A találmány szerinti protein legalább 85 %, előnyösen legalább 90 %, még előnyösebben legalább 95 % homológiát mutat az 1. ábrán bemutatott proteinnel.
A találmány szerinti protein lehet fúziós protein, ebben az esetben a fúziós proteinre jellemző, hogy tartalmaz egy olyan részt vagy fragmenst, amely legalább 80 %, előnyösen legalább 85 %, még előnyösebben legalább 90 % vagy legelőnyösebben legalább 95 % homológiát mutat az 1. ábrán bemutatott proteinnel.
A protein SDS poli(akril-amid) gélelektroforézissel meghatározva előnyösen legalább 70 %-os, még előnyösebben 80 %-os, legelőnyösebben legalább 90 %-os tisztaságú.
A találmány szerinti protein lehet lipoprotein vagy előállítható bármilyen lipiddel való asszociálódás nélküli proteinként. Rekombináns módszerrel előállítva a lipoprotein a szignálszekvenciával együtt expresszálódik. A szignál-
szekvencia N-terminális 19 aminosav eltávolítása céljából végzett hasításával egy nem-lipidezett molekulát kapunk.
Az immunfolt analízis azt mutatja, hogy az OspG-t felismeri az olyan egerekből származó szérum, amelyeket előzőleg intakt spirochétákkal fertőztünk, ami arra utal, hogy a natív fehérje ezekben a fajokban immunogén.
Ezenkívül azonosítottuk és szekvenáltuk az OspG génjét. Ennek megfelelően a találmány továbbá egy olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amely OspG proteint vagy annak fragmensét vagy származékát kódolja. A DNS-szekvencia előnyösen lényegében véve megegyezik az 1. ábrán bemutatottal.
A lényegében véve kifejezés legalább 70 % azonosságot, előnyösen 80 % azonosságot, még előnyösebben legalább 85 % azonosságot és legelőnyösebben legalább 95 % azonosságot jelent az 1. ábrán bemutatott szekvenciával.
A találmány tehát közelebbről egy olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amely lényegében véve megegyezik az 1. ábrán bemutatottal, vagy annak egy fragmensére vagy egy olyan DNS-szekvenciára, amely ahhoz hibridizálódik és amely olyan proteint kódol, amely OspG-antigenitással rendelkezik.
A találmány szerinti DNS enzimatikus polímerizációval állítható elő, amely in vitro hajtható végre DNS-polimeráz, pl. DNS polimeráz I (Klenow fragmens) segítségével, alkalmas pufferben, amely a nukleozid-trifoszfátokat: dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t tartalmazza, 10 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten, 50 pl vagy ennél kisebb térfogatban. A DNS-fragmensek enzimatikus ligálása DNS-ligáz, pl. T4 DNS-ligáz segítségével, alkalmas pufferben, pl. 0,05 mól/1 Tris (pH=7,4), ·· · · · • ·
0,01 mól/1 MgCl2 0,01 mól/1 ditiotreitol, 1 mmól/l spermidin, 1 mmól/l ATP és 0,1 mg/ml szarvasmarhaszérum-albumin összetételű pufferben, 4 °C és szobahőmérséklet közötti hőfokon, általában 50 μΐ vagy ennél kisebb térfogatban hajtható végre. A DNS polimer vagy fragmens kémiai szintézise szokásos foszfotriészter, foszfit vagy foszforamidit módszerrel végezhető, szilárdfázis-technikával, például a következő irodalmi helyeken ismertetett módszerekkel, 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual* (szerk. H.G. Gassen és A. Láng), Verlag Chemie, Weinheim (1982), M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, és
R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 10, 6243 (1982); B.S. Sproat és W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 24, 5771, (1983); M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron
Letters, 21, 719 (1980); M.D. Matteucci és M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 103, 3185 (1981);
S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 105, 661 (1983); N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus és H. Koester, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984) és H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 2_, 801 (1984).
Eljárhatunk úgy is, hogy a kódoló szekvenciát B. burgdorferi mRNS-ből vezetjük le ismert módszerekkel (például az mRNS reverz transzkripciójával a komplementer cDNS-szál kialakítására) és kereskedelemben kapható cDNS készletek alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás nem korlátozódik az ismertetett szekvenciára, hanem magában foglalja az összes • ··· · · »- I • · ·· ·· · · · «*«'·· · ♦ ·*· olyan molekulát, amelyek a fenti proteint vagy annak immunogén származékát kódolják.
Az olyan DNS polimerek, amelyek a találmány szerinti protein mutánsát kódolják, a proteint kódoló cDNS helyspecifikuks mutagenezisével állíthatók elő szokásos ismert módszerekkel, például a következő helyeken ismertetett módszerekkel: G. Winter et al., Natúré, 299, 756-758 (1982) és
Zoller és Smith, Nucl. Acids Rés., 10, 6487-6500 (1982), vagy deléciós mutagenezissel, a következő helyen ismertetett módszerrel: Chan és Smith, Nucl. Acids Rés., 12, 2407-2419, (1984) és G. Winter et al., Biochem. Soc. Trans, 12,
224-225 (1984) .
A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti protein előállítására, amelynek során
i) előállítunk egy replikálódó vagy integrálódó expressziós vektort, amely egy gazdasejtben képes expresszálni egy olyan DNS polimert, amely OspG protein vagy annak immunogén származékát kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, ii) az említett vektorral egy gazdasejtet transzformálunk, iii) az említett gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik az említett DNS polimer expressziójával az említett protein termelődését, és iv) az említett proteint kinyerjük.
A transzformálunk kifejezésen azt értjük, hogy egy idegen DNS-t transzformálással, transzfekcióval vagy fertőzéssel egy alkalmas plazmid vagy vírusvektor segítségével bejuttatunk egy gazdasejtbe, például a következő irodalmi ·* ·94· · • · « ··· · · w • · · ···► «a » a helyen ismertetett módszerekkel: Genetic Engineering; szerk. S.M. Kingsman és A.J. Kingsman, Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988.
A transzformált vagy transzformáns kifejezésen a kapott gazdasejtet értjük, amely a kérdéses idegen gént tartalmazza és expresszálja.
Az expressziós vektor új és szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
A replikálódó expressziós vektor a találmány értelmében úgy állítható elő, hogy egy a gazdasejttel kompatibilis vektort hasítunk, így egy lineáris DNS-szegmenst kapunk, amely egy intakt replikont tartalmaz, és az említett lineáris szegmenst egy vagy több olyan DNS molekulával kombináljuk, amely az említett lineáris szegmenssel együtt a kívánt terméket kódolja, például az OspG proteint vagy annak fragmenseit kódoló DNS polimerrel kombináljuk ligáló körülmények között.
A DNS polimer tehát a vektor konstruálása során előre képezhető.
A vektor megválasztását részben meghatározza a gazdasejt, amely lehet prokarióta vagy eukarióta. Alkalmas vektorok például a plazmidok, bakteriofágok, kozmidok és a rekombináns vírusok.
A replikálódó expressziós vektorok előállítását szokásos módon, a DNS restrikciójához, polimerizálásához és ligálásához alkalmas enzimek segítségével, pl. Maniatis et al. által ismertetett módszerekkel végezhetjük.
A rekombináns gazdasejtet a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy egy gazdasejtet transzformáló körülmények között egy találmány szerinti replikálódó vektorral transzformálunk. Alkalmas transzformáló körülmények ismertek, és például Maniatis et al. az idézett helyen vagy a 'DNA Cloning’, II. kötet, szerk. D.M. Glover, IRL Press Ltd., 1985 irodalmi helyen ismertetik.
A transzformáló körülmények megválasztását a gazdasejt határozza meg. így például egy baktérium gazdasejtet, pl. E. colit kalcium-klorid-oldattal [Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 69, 2110 (1973)] vagy egy következő összetételű oldattal kezelhetünk: RbCl, MgCl, kálium-acetát és glicerin, majd 3-[N-morfolino]-propánszulfonsav, RbCl és glicerin. Emlős sejttenyészetet úgy transzformálhatunk, hogy a vektor DNS-t kalciummal együtt csapjuk ki a sejtekre. A találmány kiterjed a találmány szerinti replikálódó expressziós vektorral transzformált gazdasejtre is.
A transzformált gazdasejt olyan körülmények között történő tenyésztését, amelyek lehetővé teszik a DNS polimer expresszálódását, szokásos módon végezzük, például a Maniatis et al. által ismertetett és a 'DNA Cloning' című munkában ismertetett módon. így a sejtet előnyösen tápanyagokkal látjuk el, és 45 °C alatti hőmérsékleten tenyésztjük.
A terméket a gazdasejtnek megfelelő, szokásos módszerekkel nyerjük ki. így, ha a gazdasejt baktérium, pl. E.coli, akkor kémiai úton vagy enzimatikusan lizáljuk, és a proteinterméket izoláljuk a kapott lizátumból vagy a felülúszóból. Ha a gazdasejt emlős sejt, a termék általában a tápközegből vagy a sejtmentes extraktumhól izolálható. A szokásos proteinizolálási módszerek közé tartozik a szelektív kicsapás, abszorpciós kromatográfia és az affinitáskromatográfia, beleértve a monoklonális antitest affinitáskromatográfiáj át.
Az expresszió végezhető rovarsejtben is egy alkalmas vektor, például baculovirus felhasználásával. A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a proteint Lepidoptera sejtekben expresszáljuk és immunogén polipeptideket állítunk elő. A protein Lepidoptera sejtekben történő expresszálásához előnyösen baculovirus expressziós rendszert alkalmazunk. Az ilyen rendszerben a proteint kódoló, egy baculovirus promoterhez működőképesen kapcsolt szekvenciát magában foglaló expressziós kazettát tipikusan egy ingázó vektorba helyezzük. Egy ilyen ingázó vektor elegendő bakteriális DNS-t tartalmaz ahhoz, hogy az ingázó vektor E.coliban vagy valamilyen más alkalmas prokarióta gazdasejtben szaporodjék. Az ingázó vektor szintén tartalmaz elegendő baculovirus DNS-t, amely körülveszi a kívánt proteint kódoló szekvenciát és így lehetővé teszi, hogy a vadtípusú baculovirus és a heterológ gén között rekombináció jöjjön létre. A rekombináns vektort azután kontranszfektáljuk Lepidoptera sejtekbe egy vadtípusú baculovirusból származó DNS-sel. A homológ rekombinációból létrejövő rekombináns baculovirusokat azután szelektáljuk és standard módszerekkel plakk-tisztítjuk [Summers és et al., TAES Bull (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin) NR 1555, 1987. május].
• · · ·· · · ···
A CS protein rovarsejtekben történő expresszálására szolgáló eljárást ismertetnek a 287 934 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (WO/US89/05550).
Rovarsejteket előállíthatunk úgy is, hogy rovarlárvákat fertőzünk. így például a protein előállítható Heliothis virescens hernyókban úgy, hogy a találmány szerinti rekombináns baculovirussal és nyomnyi mennyiségű vadtípusú baculovirussal etetjük őket, majd kb. két nap múlva a proteint a vér-nyirok folyadékból extraháljuk. Lásd pl. a W088/02030 (Miller et al.) számon közrebocsátott nemzetközi (PCT) szabadalmi bejelentést.
A találmány szerinti új protein élesztősejtekben is expresszálható, amint azt a CS protein esetére az
EP-A-0278941 számú dokumentumban ismertetik.
A találmány továbbá olyan vakcinára vonatkozik, amely OspG proteint vagy annak fragmensét vagy származékát tartalmazza .
A találmány szerinti vakcinában a protein(ek) vizes oldata közvetlenül alkalmazható. Eljárhatunk úgy is, hogy a proteint - előzetes liofilizálással vagy anélkül - ismert adjuvánssal keverjük vagy arra adszorbeáltatjuk. Ilyen adjuvánsok például - de nem kizárólag - az alumínium-hidroxid, murami1-peptid és a szaponinok, pl. a Quil A. Különösen előnyös adjuváns az MPL (monofoszforil-lipid A) és a 3D-MPL (3-dez-0-acilezett monofoszforil-lipid A) . Egy további előnyös adjuváns a QS21. A 3D-MPL-t a Ribi Immunochem forgalmazza, illetve előállítható a GB-2 220 211 számú szabadalom szerinti eljárással, míg a QS21-t a Cambridge Biotech forgalmazza, illetve előállítható az US-5 057 540 számú szabadalom szerinti eljárással.
Eljárhatunk úgy is, hogy a proteint mikrorészecskékbe, pl. liposzómákba kapszulázzuk, vagy egy olaj-a-vízben emulzióval kombináljuk. Egy további lehetőség, hogy a proteineket immunstimuláló makromolekulával, pl. elölt Bordetella vagy tetanusz-toxoiddal konjugáljuk. A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti antigén más Borrelia antigéneket, különösen OspA-t is tartalmaz.
A találmány szerinti proteinek expresszáltathatók élő vektorokkal, pl. BCG, Listeria vagy Salmonella vektorokkal és ilyen vektorokat felhasználó élő vakcinák formájában formálhatók.
A vakcinagyártást általánosságban ismerteti a New Trends and Developments in Vaccines, szerk. Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. A liposzómákba történő kapszulázást az US-4 235 877 (Fullerton) sz. dokumentum ismerteti. A proteinek makromolekulákkal történő konjugálását például az US-4 372 945 (Likhite) és az US-4 474 757 (Armor et al.) sz. dokumentum ismerteti. A Quil A alkalmazását Dalsgaard et al., Acta Vet Scand, 18, 349 (1977) helyen ismertetik.
A vakcinadózisokban a találmány szerinti protein mennyiségét úgy kell megválasztani, hogy immunvédő választ váltson ki, szignifikáns káros mellékhatás nélkül. A mennyiség változó az alkalmazott immunogéntől és attól függően, hogy a vakcina adjuvált-e vagy sem. Egy dózis általában 1-1000 pg, előnyösen 1-200 pg proteint tartalmaz. Az adott vakcina optimális mennyiségét szokásos módszerekkel, pl. a kezelt személyben kialakuló antitest-titer és más válaszok meghatározásával állapíthatjuk meg. Az első vakcina után a kezelt személyeknek egy kiegészítő vakcinát is adagolhatunk, immuválaszuk fokozása céljából.
A találmány továbbá antitestekre, előnyösen monoklonális antitestekre is vonatkozik, amelyek az OspG-re specifikusak. Az ilyen antitestek a diagnosztizálásban és a Lyme-kór megelőzésében alkalmazhatók.
A találmány továbbá egy OspG antigént tartalmazó diagnosztikai készletre is vonatkozik.
A találmány szerinti megoldást egy konkrét kísérletsor alábbi leírásával illusztráljuk.
I. Anyagok és módszerek
I.l. Borrelia törzsek
Kísérleteinkben a Wallich R.C. és munkatársai által az
Infect. Immunoi. 60, 4856-4866 (1992) helyen ismertetett B.
burgdorferi törzseket használtuk. A tenyésztést módosított Barbour-Stoenner-Kelly II (BSK II) tápközegen [2] 33 °C-on végeztük. A spirochétákat 4 °C-on 20 percig 10000 g-vel végzett centrifugálással gyűjtöttük össze, PBS-sel kétszer mostuk és a sejtszámot sötétlátóteres mikroszkópiával határoztuk meg.
B. burgdorferi expressziós könyvtár készítése és átvizsgálása
Lizozim/SDS módszerrel genomi DNS-t készítettünk B. burgdorferi ZS7 törzsből, és ultrahangos kezeléssel DNS-frag• · · · · · ·
menseket állítottunk elő. pUEXl vektorba adaptor klónozó stratégiával [7,31] tompavégű DNS-t inszertáltunk. A ligáit DNS-t E.coli MC1061 törzsbe transzformáltuk, és expresszióra nézve átvizsgáltuk olyan DBA/2 egerektől vett immunszérumokkal, amelyeket 104 (illetve kevesebb) B. burgdorferi (ZS7) mikroorganizmussal oltottunk be.
1.2. Southern biot hibridizáció
Ossz genomi DNS-t extraháltunk Borrelia mikroorganizmusokból korábban ismertetett módon [32]. Kb. 5 pg DNS-t emésztettünk 100 egység restrikciós nukleázzal (KindlII) a gyártó (Boehringer, Mannheim) által javasolt körülmények között. Mintákat '0,7 %-os agaróz gélen elektroforézisnek vetettünk alá. A DNS-fragmenseket Hybond™-N nylon membránra (Amersham) vittünk át, majd UV-térhálósításnak és hibridizációnak vetettük alá: 32 [P]-vei jelölt mintákkal egy éjszakán át 65 °C-on 0,5 mól/1 NaHPO4/7% NaDodS04 (pH=7,2) összetételű oldatban hibridizáltattuk. 40 nmol/1 NaHPO4/l% NaDodS04 (pH=7,2) összetételű oldattal szobahőmérsékleten 30 percig mostuk, majd a száraz membránokat erősítő ernyővel
-80 °C-on 1-12 óra hosszat Kodak XAR-5 filmen autoradiografáltuk. Hibridizáló mintaként egy az LA7 kódoló területet magában foglaló 500 bp-méretű DNS-fragmenst használtunk. A vizsgált génfragmenseket alacsony olvadáspontú agaróz gélen nyertük ki, etanolos kezeléssel kicsaptuk, és véletlenszerű primerekkel rádiójelzésekkel láttuk el az említett módon.
• · * * ·♦ · · ····· · · ♦
1.5. Gélelektroforézis
Egydimenziós SDS/PAGE géllemezeken Laemmli [21] szerint végzett elektroforézishez minden lizátumból 40 μΐ-t (ami kb. 108 mikroorganizmusnak felel meg) 10 μΐ 5xredukáló minta pufferrel kevertünk.
Kétdimenziós poli(akril-amid) gélelektroforézist O'Farrel módszerével [29] végeztünk, az első dimenzióban IEF-t (Pharmacia/LKB amfolitok: 1,45 % pH 3,5-10; 0,1 % pH
2, 5-4,0; 0,2 % pH 4-6; 0,2 % pH 9-11) használtunk. A lizátumok ugyanolyan mennyiségét vittük fel, mint az egydimenziós gélelektroforézisnél. A géleket vagy ezüstfestéssel értékeltük ki, vagy Western biot eljárásban [15] tovább feldolgoztuk.
A felületi proteolízist proteináz K segítségével (Boehringer, Mannheim, NSzK) Barbour és munkatársai módszerével végeztük [20]. A proteineket ezután SDS-PAGE módszerrel elválasztottuk, és az egyes antigéneket immun biot módszerrel azonosítottuk.
1.6. Western biot eljárás
A kétdimenziós SDS-PAGE eljárást követően a proteineket 1 óra hosszat 60 mA állandó áramerősséggel, szemiszáraz elektroblot kamrák (BIO-RAD, München, NSzK) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint végzett elektroblot eljárással Hybond C nitrocellulóz lapokra (Amersham) vittük, Egy éjszakán át blokkoló pufferben (50 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 5 % zsírmentes tejpor) végzett inkubálás után az immunfoltokat két óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáltuk 1:100 térfogatarányban hígított egér és humán antiszérumokkal 50 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 1 % tejpor, 0,2 % Tween 20 összetételű oldatban, illetve egér monoklonális antitestek (LA7) tenyészetének felülúszójával. A nitrocellulóz szűrőket ötször mostuk hígítópufferrel, és további egy óra hosszat inkubáltuk alkálikus foszfatázzal konjugált kecske antinyúl antiszérummal (Dianova, Hamburg, NSzK, 1:400 térfogatarányú hígítás). A foltokat négyszer mostuk a fenti pufferrel és kétszer TBS-sel, majd az immunreaktív csíkokat 20 ml DEA-pufferben [0,1 mol/1 dietanol-amin (Sigma), 0,02 % NaN3, 5 mmol/1 MgCl2 (pH=9,0)] láthatóvá tettük, amely 165 pg/ml 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfátot (BCIP, Sigma) és szubsztrátként 330 pg/ml nitrokék-tetrazóliumot (NBT, Sigma) tartalmazott. A reakciót 50 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA összetételű oldattal végzett mosással állítottuk le.
1.7. DNS-szekvenálás
A pUEXl plazmidokba (Amersham) klónozott B. burgdorferi genomi DNS-fragmenseket T7 szekvenálókészlet (Pharmacia) segítségével szekvenáltuk a gyártó előírásai szerint.
1.8. Aminosav-szekvencia elemzése
A protein-szekvenciák párhuzamos meghatározására és a filogenetikai fa meghatározására HÚSÁR szoftvert használtunk.
1.9. Immunfluoreszcencia
B. burgdorferi mikroorganizmusokat kétszer mostunk PBSsel, adhéziós lemezekre (Superior, Bad Mergentheim, NSzK) vittük (lxlO5 spirochéta/reakciómező), 2 percig -20 °C-on abszolút etanollal fixáltuk, és levegőn megszárítottuk. A fixált spirochétákat a megfelelő, PBS-sel hígított monokloná··· • · · · ···· · • · · · · · * ··· lis antitestekkel és fluoreszcein-izotiocianáttal inkubáltuk nedves kamrában 30 percig. Ezután PBS-sel háromszor mostuk, majd fluoreszcencia-mikroszkóppal vizsgáltuk, és 400 ASA fekete-fehér filmen (HP5; Illford, GB) dokumentáltuk.
1.10. Immunfloureszcencia
B. burgdorferi mikroorganizmusokat kétszer mostunk PBSsel, adhéziós lemezekre (Superior, Bad Mergentheim, NSzK) vittük (lxlO5 spirochéta/reakciómező), 2 percig -20 °C-on abszolút etanollal fixáltuk, és levegőn megszárítottuk. A fixált spirochétákat az egyedi, PBS-sel hígított monoklonális antitesttel inkubáltuk nedves kamrában 30 percig. Ezután PBSsel háromszor mostuk, és fluoreszcens izotiocianáttal jelzett kecske anti-egér immunglobulin antiszérummal (Medac, Hamburg NSzK) inkubáltuk sötét nedves kamrában 30 percig. Ezután PBS-sel háromszor mostuk, és a preparátumokat fluoreszcencia mikroszkóppal vizsgáltuk, és 400-ASA fekete-fehér filmen (HP5; ···, Illford, GB) dokumentáltuk.
EL ISA
B. burgdoríeri-specifikus antitesteket szilárdfázisú ELISA rendszerben B. burgdorferi antigénekkel mértünk, a korábban ismertetett módszerrel [15].
2.1. Az OspG gén egy részletének PCR-amplifikálása
A hidrofób vezetőpeptidet kódoló szekvenciát nem tartalmazó OspG gént az 5'-GTGGATCCAAGATTGATGCGAGTAGTG-3' (a 61-79. nukleotidnak megfelelő) és 5’GTGAATTCTATTTTTTATCTTCTATATTTTGAGGCTCTG-3 ’ (az 560-590. nukleotidnak megfelelő) olígonukleotid primerekkel PCR-amplifikáltuk. A pZS7 plazmid-DNS-t 30 PCR-ciklusnak vetettük
alá egy DNS-Thermal Cycler (Bio-Med) készülékben. A denaturálást 94 °C-on 60 másodpercig, az összeolvasztást 48 °C-on 90 másodpercig és a kiterjesztést 72 °C-on 90 másodpercig végeztük. Az amplifikált fragmenseket a glutation-S-transzferáz génnel keretben, BamHI és EcoRI enzimmel végzett emésztés után pGEX-2T vektorba ligáltuk, és DH5a gazdasejtek transzformálására használtuk.
2.2 A rekombináns OspG expresszálása és tisztítása
A glutation-S-transzferáz-OspG fúziós protein expresszálását E.coli DH5a sejtekben, majd a fúziós protein affinitás-tisztítását és trombin endoproteináz hasítását a gyártó (Pharmacia) előírásai szerint végeztük.
2.3. [3H]-palmitát-jelölés és Triton X-100 fázismegosztás
Az OspG gén megrövidített változatának (pOspG) teljes hosszát hordozó plazmidokkal (pZ577) transzformált E.coli sejteket [9,10- (n) -3H]-palmitinsav (specifikus aktivitás mintegy 50 Ci/mmol, Amersham) jelenlétében tenyésztettünk, és a radiojelzéssel ellátott lipoproteineket Triton Χ-114-gyel végzett fázismegosztással extraháltuk, a korábban ismertetett módon [46].
2.4. Immunszérumok képzése és szerológia
Immunszérumokat olyan egerekből nyertünk, amelyeket farokban 108 (C.B.-17; IS anti-108) , illetve 103 (DBA/2; IS anti-103) életképes B. burgdorferi ZS7 törzs spirochétával oltottunk, illetve szubkután adjuvánsban (ABM2; Sebac, idenbach, NSzK) 5-10 pg rekombináns (rec) recOspG-vel (BALB/c; IS anti-lipOspA), illetve 5-10 pg rekombináns (rec) recOspG-vel (BALB/c; IS anti-recOspG) előoltottuk, majd 10 és 20 nap múlva emlékeztetőt adtunk nekik. A szérumokat spirochéta-specifikus immunglobulin (lg) mennyiségére nézve ELISA módszerrel elemeztük vagy a teljes spirochéta-lizátumon (B.b.Ig), vagy recOspA-n (OspA lg), vagy recOspG-n (OspG lg) a korábban ismertetett módon [39].
2.5. Védő kísérletek
SCID egereket nem kezeltünk, illetve normál egér szérummal (NMS) vagy összegyűjtött immunszérummal (IS) oltottunk. Az egyes IS-okkal átvitt spirochéta-specifikus lg mennyiségek (ELISA a teljes B. burgdorferi sejtlizátumon): IS anti-108 4, 4 pg Ig/egér; IS anti-103 4,5 pg Ig/egér; IS antilipOspA 5 pg/egér; IS anti-recOspG 72 ng/egér RecOspG-re vizsgálva a specifikus lg mennyisége kb. 10-20-szor magasabb volt az IS anti-recOspG-ben az IS anti-103-hoz képest. Az immunszérumokat i.p. adagoltuk, majd egy órával később 105 spirochétával (B. burgdorferi ZS7) szubkután fertőzést végeztünk. Az egereket a klinikai ízületi gyulladás kifejlődésére nézve és a spriochéták jelenlétére nézve értékeltük ki, az utóbbit úgy végeztük, hogy fülbiopszia mintákat BSK tápközegben tenyésztettünk a korábban ismertetett módszerrel [37,40].
2.6. Patológia
A sípcsont-lábtői ízületen a klinikai ízületi gyulladás fejlődését követtük nyomon a korábban ismertetett [37,40] vak módszerrel. Az értékelést a következő pontozással végeztük:
++: súlyos +: kevésbé súlyos (+): mérsékelt +/-: enyhe duzzanat (+/-): elhanyagolható duzzanat, kipirosodás
-: nincs klinikai tünet az ízületeken.
EREDMÉNYEK
OspG klónozása és a rekombináns konstrukció elemzése
B. burgdorferi ZS7 genomi DNS expressziós könyvtárat egy olyan egerektől származó immunszérummal vizsgáltunk át, amelyeket előzőleg 103 spirochétával (IS anti-103) fertőztünk. Az IS-ről előzőleg kimutattuk, hogy OspA és OspB elleni antitesteket nem tartalmaznak, de a SCID egereket utóbb megvédik a fertőzéssel szemben [35]. Emellett ezen IS négy, 19-20 kDa relatív molekulatömegű proteint és két kb. 40 kDa molekulatömegű különálló proteint ismert fel a ZS7 törzs teljes sejtlizátumának kétdimenziós gélelektroforézissel elválasztott immunbiotjain vizsgálva. Kb 20 kiónt azonosítottunk, ebből egy, a pZS77 jelű különösen reaktív volt. A rekombináns pZS77 plazmidot restrikciós analízisnek, szubklónozásnak és szekvenálásnak vetettük alá. Az OspG gén nukleotidszekvenciáját az OspG kikövetkeztetett aminosavszekvenciájával együtt az 1. ábrán mutatjuk be. Az OspG gén ATG startkodonjától 10 bp-vel fölfelé egy konszenzus riboszóma kötőhely (GGAG) helyezkedik el. Ezen transzlációs iniciációs szekvenciától tovább fölfelé helyezkedik el a -10 régió (TATATT), a (-70)-(-64) helyzetben, valamint a -35 régió (TTGTTA) , a (-105)-(-100) helyzetben. A (-118)-(-49) helyzet között két rövid, fordított szekvencia, az ATATTT és a TTACATTT helyezkedik el. Az ospG gén +1 helyzetben levő ATG ♦ ··· ····· · · * start kodeinját egy 588 nukleotidból álló nyitott leolvasási keret követi, amely egy 196 aminosavból álló, 22,049 Da számított molekulatömegű proteinnek felel meg. A 620. és 656. helyzet között egy lehetséges rho-tól független terminátort azonosítottunk. Az ospG gén ATG startkodontól fölfelé elhelyezkedő DNS-szekvenciájának a nemrégen ismertetett ospE-ospF operon promoter régiójával történő összehasonlítása a GAP algoritmus segítségével 94 %-os azonosságot fedett fel. Megjegyzendő, hogy az ospG promoter két nagymértékben konzervatív oktamer DNS-motívumot az ATGTATTT (a -187-helyzettől a -180-helyzetig) és az AATTACAT (a -120-heyzettől a -113helyzetig) szekvenciát tartalmazza, amelyekről korábban kimutatták, hogy asszociálódnak egy negatív regulátor molekula, az MATot2 protein kötőhelyével és az élesztő differenciálódása során szabályozzák a génexpressziót [5,25]. E két DNS-motívumot két Sacharomyces cerevisiae génen, az MFoc2 és BARI génen azonosították, és ezek egy olyan motívum imperfekt fordított ismétlődését tartalmazzák, amely hasonlít az ATTTGCAT immunglobulin oktamer motívumra. A legérdekesebb az, hogy egy további, az immunglobulin (lg) oktamerhez hasonló szekvencia, az ATTTGCAA szekvencia helyezkedik el (a -154- -147-helyzetben) a két S. cerevisiae motívumhoz hasonló motívum között, amely az Ig-oktamer motívumtól mindössze egy átmeneti helyettesítésben különbözik.
Az OspG aminosav-szekvenciájának elemzése
Az OspG hidropátiás profilja arra utal, hogy a protein nagymértékben hidrofil, egy 20 aminosavból álló hidrofób domént tartalmaz az amino-terminális részen. Ez az N-termi-
*· · · nális régió hasonló az olyan vezető szignálpeptidekhez, amelyek tipikus prokarióta lipoproteinekben vannak jelen [51,52], A szignálszekvencia karboxi-terminális végénél egy vélhetőleg szignálpeptidáz II felismerő motívum, a Leu-X-Y-Z-Cys (3a. ábra) helyezkedik el. Az OspG-ben a potenciális hasítási hely a 19-helyzetben levő szerin és a 20-helyzetben levő cisztein között helyezkedik el. A számított izoelektromos pont pl=5,2. Az OspG aminosav-szekvenciájának összehasonlítása az ismert, B. burgdorferi külső felületi fehérjékkel, az OspA-OspF és P27 fehérjével azt mutatja, hogy az OspG a legnagyobb homológiát (65 %) az OspF fehérjével mutatja (1. táblázat). Ezenkívül az OspG bázikus N-terminális peptid motívuma, Az M-N-K-K-M megegyezik az OspE és OspF proteineknél megfigyelhetővel.
Az OspG térképezése
Néhány B. burgdorferi törzs plazmid- és kromoszomális DNS-ét pulzáló térerősségű gélelektroforézissel elválasztottuk, és ospA- és ospG-specifikus mintákhoz hibridizáltuk. Az ospA-t tartalmazó plazmid méretét 53 kb-nek becsültük a német B. burgdorferi ZS7 izolátum esetén. Az ACA-1 törzs ospA-t tartalmazó plazmidja alig volt látható a gélre felvitt DNS kis mennyisége következtében, de hosszabb exponálás után láthatóvá vált. Az ospG próba alkalmazásával egy mintegy 48 kb méretű lineáris plazmiddal egy feltűnő csík volt látható és egy gyengébb a ZS7 törzs 45 kb méretű plazmidjával. Ezzel ellentétben az amerikai B31 törzsben két, egy 45 kb és egy 35 kb méretű plazmid hibridizált az ospG gén próbával. Megjegyzendő, hogy hibridizáció nem volt megfigyelhető, ha B.
garinii ZQ1 és 200047 törzs és B. japonica H014 törzs genomi DNS-ét vittük fel. Egy kontroll kísérletben a ZS7 törzsből származó ospE-ospF próbát alkalmaztunk annak meghatározására, hogy e genomi DNS-ekkel különálló csíkok megfigyelhetők-e. E kísérletben két plazmidot, egy 45 kb méretű és egy 45 kb méretű plazmidot találtunk a ZS7, B31, 20047 és 21038 törzsek esetén. Más Borrelia törzsekből, így a B. coriaceae Co53, B. hermsii és B. turicatae törzsekből, valamint Treponema palliduiriból izolált DNS-ek nem hibridizáltak az ospG próbával, ami a B. burgdorferi faj iránti specificitásra utal.
Az ospG gén RFLP elemzése
Az ospG restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) elemzése Hindii! endonukleázzal legalább hét különálló hibridizációs mintát mutatott 20 vizsgált B. burgdorferi izolátumban: a B. burgdorferi sensu stricto izolátumok nagy részére két, egy 1,8 kb és egy 3,8 kb méretű hibridizációs fragmens (6. ábra, 1. sor) jellemző; 6 vizsgált B. garinii izolátumból három nem hibridizált az ospG próbával, míg a B. garinii 20047 és S90 törzsek egy 1,8 kb, egy 1,7 kb és egy 3 kb méretű fragmenst mutattak; a B. afzelii törzsek esetén legalább három különböző hibridizációs minta volt megfigyelhető: az ACA-1 törzs esetén egy 1,9 és egy 2 kb méretű csík (4. sor), míg az NE40 törzs esetén egy 2 kb és egy 5 kb méretű csík (5. sor) .
A rekombináns OspG protein expresszálása E. coliban
Az OspG PCR útján történő amplifikálásához a primereket úgy választottuk meg, hogy a végső rekombináns termék ne tar· · » · · • « * ··- 9 · • 99 9 talmazza a vezetőpeptidet tartalmazó 20 aminosavas részt [46] . Az amplifikált, OspG-t kódoló terméket a pGEX2T expressziós vektor (Pharmacia, Freiburg, NSzK) hordozó fehérjéjével leolvasási keretben inszertáltuk, majd IPTG-vel történt indukálás után egy kb. 44 kDA moltömegű GST-OspG fúziós proteint kaptunk. A GST-OspG fúziós proteint az E.coli lizátumából glutation-agaróz gyöngyök segítségével dúsítottuk, majd a megkötött GST-OspG fúziós proteint egy helyspecifikus proteázzal emésztettük.
[3H]-palmitáttal való jelölés
Annak megállapítására, hogy az OspG E.coliban lipoproteinként expresszálódik-e DH5a sejteket pZS77, illetve pOspG plazmiddal transzformáltunk és [3H]-palmitáttal jelöltünk (8. ábra). A pZS77 plazmid a norál N-terminális szignálszekvenciával rendelkező, teljes hosszúságú OspG prekurzor proteint kódolja, míg a pOspG egy olyan proteint, amelyben az OspG prekurzor első 21 maradékát a Met-Lys szekvencia helyettesíti. Detergens fázismegosztással végzett extrahálás és SDS-PAGE elválasztás után a radioaktív termékeket fluorográfiával tettük láthatóvá. A teljes hosszúságú ospG gént (pZS77 plazmid) tartalmazó E.coli sejtek egy 20 kDa moltömegű lipoproteint expresszáltak, amely a megosztáskor a detergens fázisba került, míg a megcsonkított ospG gént tartalmazó DH5oc sejtek esetén lipoproteinek nem voltak megfigyelhetők.
Az OspG szubcelluláris lokalizálása
Az OspG intakt organizmusban való szubcelluláris elhelyezkedésének meghatározására spirochétákat proteináz-K·* .·· ••'•t · • ·-· .· ϊ • · « «· * ·>·» ·· ; ·· val kezeltünk, majd immunbiot útján elemeztük, melynek során anti-103 szérumot alkalmaztunk az expressziós könyvtárból izolált ospG-re. Az anti-103 immunszérum négy kis molekulatömegű proteint mutatott ki, amelyek proteolízis után részben eltűntek, míg két, kb. 40 kDa molekulatömegű szerkezetet nem érintett a proteinázos kezelés [17]. Annak megállapítására, hogy az rOspG-t felismeri-e az anti-103 szérum, Western biot elemzést végeztünk. Anti-103 szérumot abszorbeáltattunk rOspG-vel, és megállapítottuk, hogy az anti-103 ugyanolyan méretű nagy proteineket ismert fel (7A. ábra), ami arra utal, hogy az OspG nem lehet jelen az in vitro tenyésztett ZS7 lizátumában levő kis molekulatömegű proteinek között, vagy az is lehetséges, hogy az OspG proteolízise következett be. Az OspG azonosítására és annak megállapítására végzett kísérletben, hogy az OspG-t in vitro tenyésztett B. burgdorferi ZS7 expresszálhatja-e, hiperimmun rágcsáló anti-rOspG szérumok nem mutattak ki OspG-t 109 in vitro tenyésztett ZS7 mikroorganizmusban. Néhány kísérletben gyenge, nem remélt reaktivitás volt megfigyelhető egy 40 kDa-os polipeptiddel, amely vagy egy OspG variáns volt, vagy olyan B. burgdorferi protein, amelynek néhány epitopja megegyezett az OspG-ével. Az ospG gén in vitro tenyésztett B. burgdorferi ZS7 törzsben történő expressziójának vizsgálatához teljes RNS-t izoláltunk, és Northern biot hibridizációval ospG-transzkriptum jelenlétére nézve analizáltuk. Az in vitro expresszió kontrolijaképpen és az RNS degradációjának vizsgálatára az NC-szűrőt ospA génnel ellenőriztük. Az ospA mintával ellentétben, amely egyetlen, mintegy 2 kb méretű transz26 • ·· ·«··· ·· · · · · • · · · · · • · · · ···· ····· * · * kriptumhoz kötődött, az ospG minta nem detektált ospG transzkriptumot. Ez az eredmény arra utal, hogy az in vitro tenyésztés során az OspG expresszió hiányossága az mRNSstabilitás ospG transzkripciójának a szintjén jelentkezik. Míg az OspG-t nem lehetett detektálni az in vitro tenyésztett B. burgdorferi ZS7 lizátumában, az OspG expressziója ettől eltérő lehet egy emlős gazdaszervezetben. Humán Lyme-kóros betegektől és kísérleti úton fertőzött egerektől vett reprezentatív szérummintákkal végzett immunbiot elemzés azt mutatta, hogy OspG-specificitást mutató antitestek voltak jelen. 13 dokumentált Lyme-borreliosisos betegtől származó szérummintából 6-ról kimutattuk, hogy anti-OspG antitesttel rendelkeznek. Ezzel szemben egészséges donorok (n=8) szérumának egyike sem tartalmazott olyan antitestet, amely felismeri az rOspG-t. E megfigyelések arra utalnak, hogy az OspG csak fertőzés során expresszálódik.
SCID egerek részleges védelme anti-OspG immunszérummal
Az anti-OspG immunszérum védőkapacitásának vizsgálatára SCID egereket IS (immunszérum) készítményekből összegyűjtött B. burgdorferi-specifikus lg következő mennyiségeivel kezeltünk: C.B-17 IS anti-108 (4,4 pg B.b. Ig/egér), DBA/2 IS anti-103 (4,5 pg B.b. Ig/egér), BALB/c IS anti-lipOspA (5 pg B.b. Ig/egér) és BALB/c IS anti-recOspG (72 ng B.b. Ig/egér). Az IS anti-recOspG azonban több mint tízszeres resOspG elleni antitestet tartalmazott, mint az IS anti-103. A SCID egereknek i.p. injektáltuk az említett IS mennyiségekkel, majd 105 B. burgdorferi mikroorganizmussal fertőztük őket. Az ízületi gyulladás klinikai jeleit, valamint fül-biopsziából a
spirochéták jelenlétét vizsgáltuk. A fertőzött, de egyébként nem kezelt, illetve NMS-sel (normál egér szérummal) kezelt SCID egerek esetén a fertőzés utáni 65. naptól az ízületi gyulladás klinikai jelei voltak megfigyelhetők, súlyos duzzadás a sípcsont-lábtői ízületnél, amely a 13-24. napon fejlődött. Amint az előzőekben említettük az IS anti-108, IS anti-103 és RS anti-lipOspA passzív immunizálást kapott egerek esetén az ízületi gyulladásnak csak marginális jelei voltak megfigyelhetők, vagy nem is voltak megfigyelhetők. Ezzel szemben az IS anti-recOspG-vel passzívan immunizált SCID egerek esetén az ízületi gyulladás kifejlődése csökkent mértékű volt, amint azt a 6. és 18. nap között kifejlődő enyhe duzzadás mutatta. Későbbi időpontban ezen egereknél az ízületi gyulladás sokkal súlyosabb formája fejlődött ki, ami azt mutatja, hogy ez az IS a fertőzés leküzdésében kevésbé hatékony, mint más IS-ek. Az a tény, hogy az IS anti-recOspG több mint tízszer több resOspG elleni antitestet tartalmazott, mint az IS anti-103, de mégis kevésbé volt hatékony, arra utal, hogy az IS anti-103-ban jelenlevő további specificitások hozzájárulnak a fertőzés leküzdéséhez.
Hivatkozások
1. Áron L., M. Alekshun, L. Perlee, I. Schwartz, H.P.
Godfrey and F.C. Cabello: Cloning and DNA sequence analysis of bmpC, a gene encoding a potential membráné lipoprotein of Borrelia burgdorferi, FEMS Microbiol.
Lett. 123, 75-82 (1994).
2. Barbour A.G., S.L. Tessier and S.F. Hayes: Variation in a major surface protein of Lyme disease spirochetes,
Infect. Immun., 45, 94-100 (1984).
3. Barbour A.G. and H.G. Stoenner: Antigenic variation of Borrelia hermsii, UCLA Symp.Mól.Cell.Bioi.New Ser., 20, 123-125 (1985).
4. Bergström S., V.G. Bundoc and A.G. Barbour: Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochaete Borrelia burgdorferi, Mól. Microbiol., 3_, 479-486 (1989).
5. Borst P. and D.R. Greaves: Programmed gene rearrangements altering gene expression, Science, 235, 658-667 (1987).
6. Brandt M.E., B.S. Riley, J.D. Radolf and M.V. Norgard: Immunogenic integrál membráné proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins, Infect. Immun., 58, 983-991 (1990).
7. Bressan G.M. and K.K. Stanley: pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal hőst specificity, Nucl. Acids, Rés., 15, 10056 (1987).
8. Burgdorfer W., A.G. Barbour, S.F. Hayes, J.L. Benach, E. Grunwaldt and J.P. Davis: Lyme disease - a tick-borne spirochestosis? Science 216, 1317-1319 (1982) .
9. Champion C.I., D.R. Blanco, J.T. Skare, D.A. Haake, M. Giladi, D. Foley, J.N. Miller and M.A. Lovett: A 9.0kilobase-pair circular plasmid of Borrelia burgdorferi encodes an exported protein: Evidence fór expression only during infection, Infect. Immun., 62, 2653-2661 (1994).
10. Church G.M. and W. Gilbert: Genomic sequencing, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1991-1995 (1984).
11. Craft J.E., D.K. Fischer, G.T. Shimamoto and A.C.Steere: Antigens of Borrelia burgdorferi recognised during Lyme disease, J.Clin.Invest., 78, 934-939 (1986).
12. Dattwyler R.J., D.J. Volkman, J.J. Halperin, B.J. Luft, J. Thomas and M.G. Golightly: Specific immuné responses in Lyme borreliosis, Ann., NY Acad.,Sci., USA 539, 93-102 (1988) .
13. Fikrig E., S.W. Barthold, F.S. Kantor and R.A. Flavell: Longterm protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA. Infect., Immun., 60, 773-777 (1992) .
14. Fikrig E., S.W. Barthold, N. Marcantonio, K. Deponte, F.S. Kantor and R.A. Flavell: Roles of OspA, OspB and flagellin in protective immunity to Lyme borreliosis in laboratory mice, Infect., Immun. 60, 657-661 (1992).
15. Fikrig E., H. Tao, F.S. Kantor, S.W. Barthold and R.A. Flavell: Evasion of protective immunity by Borrelia • · · · · · · • · · • · · · • · · · · · *♦ · · · burgdorferi by truncation of outer surface protein B.,
Proc., Natl. Acad. Sci., USA, 90, 4092-4096 (1993).
16. Fuchs H., R. Wallich, M.D. Kramer and M.M. Simon: The outer surface protein A of Borrelia burgdorferi is a plasmin (ogen) binding protein, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91, 12594-12598 (1994).
17. Gern. L., U.E. Schaible and M.M. Simon: Mode of inoculation of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi influences infection and immuné responses in inbred strains of mice, J. Infect.Dis., 167, 971-975 (1993).
18. Hughes C.A.N., S.M. Engstrom, L.A. Coleman, C.B. Kodner and R.C. Johnson: Protective immunity is induced by a Borrelia burgdorferi mutant that lacks OspA and OspB, Infect. Immun. 61, 5115-5122 (1993).
19. Jonsson M., L. Noppa, A.G. Barbour and S. Bergström: Heterogenity of outer membráné proteins in Borrelia burgdorferi: Comparison of osp operons of three isolates of different geographic origins, Infect., Immun. 60, 1845-1853 (1992).
20. Kurashige S., M. Bissett and L. Oshiro: Characterisation of a tick isolate of Borrelia burgdorferi that posseses a major low-molecular-weight surface protein, J. Clin. Microbiol., 28, 1362-1366 (1990).
21. Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Natúré 227,
680-685 (1970).
22. Lám T.T., T.-P.K. Nguyen, R.R. Montgomery, F.S. Kantor,
E. Fikrig and R.A. Flavell: Outer surface proteins E and F
of Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease,
Infect. Immun. 62, 290-298 (1994).
23. Margolis N. and P.A. Rosa: Regulation of expression of major outer surface proteins in Borrelia burgdorferi,
Infect. Immun. 61, 2207-2210 (1993).
24. Masuzawa T., H. Kawabata, Y. Beppu, K. Miyamoto, M.
Nakao, N. Sato, K. Muramatsu, R.C. Johnson and Y.
Yanagihara: Characterisation of monoclonal antibodies fór Identification of Borrelia japonica, isolates from Ixodes ovatus, Microbiol. Immunoi. 38, 393-398 (1994).
25. Miller A.M., V.L. MacKay and K.A. Nasmyth: Identification and comparison of two sequence elements that confer celltype specific transcription in yeast, Natúré 314, 598-603 (1985).
25a. Miller J.F., J.J. Mekalanos and S. Falkow: Co-ordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence, Science 243, 916-922 (1989).
26. Needleman S.B. and C.D. Wunsch: A generál method applicable to the search fór similarities in the amino acid sequence of two proteins, J.Mól.Bioi. 48, 443-453 (1970) .
27. Nguyen T.-P.K., T.T. Lám, S.W. Barthold, S.R. Telford,
III., R.A. Flavell and E. Fikrig: Partial destruction of Borrelia burgdorferi within ticks that engorged on OspEor OspF-immunised mice, Infect., Immun. 62, 2079-2084 (1994).
28. Norris S.J., C.J. Carter, J.K. Howell and A.G.Barbour: Low-passage-associated proteins of Borrelia burgdorferi • ·
Β31: Characterisation and molecular cloning of OspD, a surface-exposed, plasmid-encoded lipoprotein, Infect.,
Immun. 60, 4662-4672 (1992).
29. O’Farrel P.H.: High resolution two-dimensional polyacrylamide gél electrophoresis, J. Bioi. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
30. Padula S.J., A. Sampieri, F.Dias, A. Szczepanski and R.W. Ryan: Molecular characterisation and expression of p23 (OspC) from a North American strain of Borrelia burgdorferi, Infect., Immun. 61, 5097-5105 (1993).
31. Preac-Mursic V., B. Wilske, E. Patsouris, S. Jauris,
G.Will, E. Soutschek, S. Rainhardt, G. Lehnert, U. Klockmann and P. Mehraein: Active immunisation with pC protein of Borrelia burgdorferi protects gerbils against B. burgdorferi infection, Infection 20, 342-349 (1992) .
32. Reindl Μ., B. Redl and G. Stöffler: Isolation and analysis of a linear plasmid-located gene of Borrelia burgdorferi B29 encoding a 27 kDa surface lipoprotein (P27) and its overexpression in Escherichia coli, Mól. Microbiol. 8, 1115-1124 (1993).
33. Reindl Μ., B. Redl and G. Stöffler: A restriction map of the ospAB operon containing linear plasmid of Borrelia garinii B29, 57-60, In: R. Cevenini, V. Sambri, M. Piaca, (szerk.), Advances in Lyme Borreliosis research, Proc. of the VI., Int. Conf. on Lyme Borreliosis, Bologna, Italy (1994).
34. Sadziene A., B. Wilske, M.S. Ferdows and A.G. Barbour:
The cryptic ospC gene of Borrelia burgdorferi B31 is located on a circular plasmid, Infect. Immun. 61,
2192-2195 (1993).
35. Schaible U.E., L. Gern, R. Wallich, M.D. Kramer, M. Prester and M.M. Simon: Distinct patterns of protective antibodies are generated against Borrelia burgdorferi in mice experimentally inoculated with high and low doses of antigén, Immunoi. Lett. 36, 219-226 (1993).
36. Schaible U.E., M.D. Kramer, K. Eichmann, M. Modotell, C.
Museteanu and M.M. Simon: Monoclonal antibodies specific fór the outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgdorferi prevent Lyme borreliosis in severe combined immunodéiiciency (scid) mice, Proc.Natl.Acad.Sci, USA 87, 3768-3772 (1990).
37. Schaible U.E., M.D. Kramer, C. Museteanu, G. Zimmer, H.
Mossmann and M.M. Simon: The severe combined immunodeficiency (scid) mouse. A laboratory model fór the analysis of Lyme arthritis and carditis, J. Exp.Med. 170, 1427-1432 (1989).
38. Schaible U.E., R. Wallich, M.D. Kramer, L. Gern, J.F.
Anderson, C. Museteanu and M.M. Simon: Immuné sera to individual Borrelia burgdorferi isolates or recombinant OspA thereof protect SCID mice against infection with homologous strains bút only partially or nőt at all against those of different OspA/OspB genotype, Vaccine 11 1049-1054 (1993).
39. Schouls L.M., H.G.J. van dér Heide and J.D.A. van Embden Characterisation of the 35-kilodalton Treponema pallidum subsp. pallidum recombinant lipoprotein TmpC and antibody
response to lipidated and nonlipidated T. pallidum antigens, Infect., Immun. 59, 3536-3546 (1991).
40. Simon M.M., U.E. Schaible, M.D. Kramer, C. Eckerskorn, C.
Museteanu, H.K. Müller-Hermelink and R. Wallich:
Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in mice, J. Infect. Dis. 164,
123-132 (1991) .
41. Simon M.M., U.E. Schaible, R. Wallich and M.D. Kramer: A mouse model fór Borrelia burgdorferi infection: Approach to a vaccine against Lyme disease, Immunoi. Today 12,
11-16 (1991).
42. Simpson W.J., W. Burgdorfer, M.E. Schrumpf, R.H. Karstens and T.G. Schwan: Antibody to a 39-kilodalton Borrelia burgdorferi antigén (P39) as a marker fór infection in experimentally and naturally inoculated animals, J. Clin.
Microbiol. 29, 236-243 (1991).
43. Simpson W.J., W. Cieplak, M.E. Schrumpf, A.G. Barbour and T.G. Schwan: Nucleotide sequence and analysis of the gene in Borrelia burgdorferi encoding the immunogenic P39 antigén, FEMS Microbiol. Lett. 119, 381-388 (1994).
44. Steere, A.C.: Lyme disease, N.Engl.J.Med. 321, 586-596 (1989).
45. Wallich R., C. Helmes, U.E. Schaible, Y. Lobét, S.E. Moter, M.D. Kramer and M.M. Simon: Evaluation of genetic divergence among Borrelia burgdorferi isolates by use of OspA, fia, HSP60 and HSP70 gene probes, Infect. Immun. 60, 4856-4866 (1992).
·· ·
46. Wallich R., S.E. Moter, M.M. Simon, K. Ebnet, A.
Heiberger and M.D. Kramer: The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigén (flagellin): Molecular cloning, expression and amplification of the gene, Infect. Immun. 58, 1711-1719 (1990).
47. Wallich R., U.E. Schaible, M.M. Simon, A. Heiberger and M.D. Kramer: Cloning and sequencing of the gene encoding the outer surface protein A (OspA) of a European Borrelia burgdorferi isolate, Nucleic Acids Rés. 17, 8864 (1989).
48. Wallich R., M.M. Simon, H. Hofmann, S.E. Moter, U.E.
Schaible and M.D. Kramer: Molecular and immunological characterisation of növel polymorphic lipoprotein of Borrelia burgdorferi, Infect. Immun. 61, 4158-4166 (1993)
49. Wallich R., et al., Nem publikált adatok.
50. Wilske B., A.G. Barbour, S. Bergström, N. Burmán, B.I.
Restrepo, P.A. Rosa, T. Schwan, E. Soutschek and R. Wallich: Antigenic variation and strain heterogenity in Borrelia spp., Rés. Microbiol. 143, 583-596 (1992).
51. Wu H.C.: Posttranslational modification and Processing o membráné proteins in bacteria, 37-74, In: M. Inouye (szerk.) Bacterial outer membranes as model systems, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987).
52. Wu H.C. and M. Tokunaga: Biogenesis of lipoproteins in bacteria, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 125, 127-157 (1986).
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐK: Max Planck-Gesellschaft zűr Förderung de
Wissenschaften E.V.
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Vakcinák (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 2 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(v) KOMPUTERREL OLVASHATÓ FORMA:
(vi) AKTUÁLIS BEJELENTÉSI ADATOK:
(viii) KÉPVISELŐ:
(ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
(2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 196 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (iii) HIPOTETIKUS: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS (A) SZERVEZET: B. burgdorferi (C) EGYEDI IZOLÁTUM: OspG (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia
Met 1 Asn Lys Lys Met 5 Lys Asn Leu Ile Ile 10 Cys Alá Val Phe Val 15 Leu
Ile Ile Ser Cys 20 Lys Ile Asp Alá Ser 25 Ser Glu Asp Leu Lys 30 Gin Asn
Val Lys Glu 35 Lys Val Glu Gly Phe 40 Leu Asp Lys Glu Leu 45 Met Gin Gly
Asp Asp 50 Pro Asn Asn Ser Leu 55 Phe Asn Pro Pro Pro 60 Val Leu Pro Alá
Ser 65 Ser His Asp Asn Thr 70 Pro Val Leu Lys Alá 75 Val Gin Alá Lys Asp 80
Gly Gly Gin Gin Glu 85 Gly Lys Glu Glu Lys 90 Glu Lys Glu Ile Gin 95 Glu
Leu Lys Asp Lys 100 Ile Asp Lys Arg Lys 105 Lys Glu Leu Glu Glu 110 Alá Arg
Lys Lys Phe 115 Gin Glu Phe Lys Glu 120 Gin Val Glu Ser Alá 125 Thr Gly Glu
Ser Thr 130 Glu Lys Val Lys Lys 135 Gin Gly Asn Ile Gly 140 Gin Lys Alá Leu
Lys 145 Tyr Alá Lys Glu Leu 150 Gly Val Asn Gly Ser 1S5 Tyr Ser Val Asn Asp 160
Gly Thr Asn Thr Asn 165 Asp Phe Val Lys Lys 170 Val Ile Asp Asp Alá 175 Leu
Lys Asn Ile Glu Glu Glu Leu Glu Lys Leu Alá Glu Pro Gin Asn Ile
130 185 190
Glu Asp Lys Lys 195 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 591 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLSZÁM: egyszálú
4 (D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomi) (iii) HIPOTETIKUS: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS (A) SZERVEZET: Borrelia burgdorferi (B) TÖRZS: ZS7 (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:
(B) KLÓN: ospG (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia
ATGAATAAGA AAATGAAAAA TTTAATTATT TGTGCAGTTT TTGTTTTGAT AATTTCTTGC 60
AAGATTGATG CGAGTAGTGA AGATTTAAAA CAAAATGTAA AAGAAAAAGT TGAAGGATTT 120
TTAGATAAAG AGTTAATGCA AGGTGACGAT CCTAATAACA GTCTGTTTAA TCCACCACCA 180
GTATTGCCGG CAAGTTCCCA CGATAACACA CCCGTATTAA AAGCGGTGCA AGCAAAAGAT 240
GGTGGTCAAC AAGAAGGAAA AGAAGAGAAA GAAAAAGAAA TTCAAGAATT AAAGGATAAA 300
ATAGATAAAA GAAAAAAAGA ATTAGAAGAG GCTAGAAAGA AATTTCAAGA ATTTAAAGAA 350
CAAGTTGAAT CTGCAACTGG AGAAAGTACT GAGAAAGTTA AAAAACAAGG AAATATTGGA 420
CAAAAAGCTT TAAAGTATGC TAAAGAATTG GGTGTAAATG GAAGTTATTC TGTTAATGAT 480
GGTACTAATA CTAATGATTT TGTAAAAAAG GTTATAGATG ATGCTCTTAA AAATATTGAG 540
GAAGAACTTG AAAAGCTAGC AGAGCCTCAA AATATAGAAG ATAAAAAATA A 591 ·« ··«· ·
1. táblázat
Borrelia burgdorferi külső felületi lipoproteinjei
Név Eredet (törzs) Hossz (amino- sav) Mol- tömeg (kDa) El Plazmid elhelyezkedése Hason- lóság OspG- hez (%) Hivat- kozás
OspA ZS7 273 29,3 8,9 49 kb lineáris 48,4 (47)
OspB B31 296 31,8 9,9 49 kb lineáris 43,1 (4)
OspC B31 210 22,3 8, 6 26 kb cirkuláris 41,8 (30)
OspD B31 257 28,4 5,2 38 kb lineáris 45,6 (28)
OspE N40 171 19,2 8,1 45 kb 52,9 (22)
OspF N40 230 26,1 5,3 45 kb 64,9 (22)
OspG ZS7 196 22 5,2 55 kb e vizsgálat
P27 B29 248 28,9 8,6 49 kb lineáris 45,2 (32)
• ·
2. táblázat: Az ízületi gyulladás klinikai jeleinek fejlődése olyan SCID egerek esetén, amelyeket előzetesen a megadott immunszérumokkal i.p. kezeltünk, illetve nem kezeltünk, majd lxlO5 Borrelia burgdorferi ZS7 törzzsel fertőztünk.
Adagolt szérum Egerek száma 0 , ízületi gyulladás klinikai jelei a fertőzés utáni megadott napon Ujratenyésztés
6 13 18 20 27 fülből
Nőne 1 - +/+ + +/ + + + +/ + + + +/ + + +
2 . (±)/(±) +/+ + +/+ + + +/ + + + +/ + + +
NMS 1 (±)/± +/ + + +/ + + + +/ + + + +/ + + +
[5 pg/mouse] 2 ±/(±) +/+ + +/ + + + +/ + + + +/+ + +
3 (±)/(±) +/+ + +/+ + + +/ + + + +/ + + +
IS anti-10^ 1 • -
(DBA/2) 2 - - - - - -
[4,5 pg spec. 3 ±/± - - - ±/(±) -
Tg/mouse] 4 - - - (±)/- ±/- -
IS anti-10^ 1 ±1- ±/- • • •
(C.B-17) 2 - -/± - - - -
[4,4 pg spec. 3 - - - - - -
Tg/mouse] 4 -/± - - +/- -
IS anti- 1 (±)/(±) - - (±)/- •
IipOspA 2 ±/± - - - - -
(BALB/c) [5 p 3 - - - - - -
g spec. Tg/mouse] 4 -/(±)
IS anti- 1 - (+)/(+) ±/- +/++ + +/++ +
recOspG 2 - (+)/(+) ±/± (+)/(+) + +/+ + +
(BALB/c) [72 3 - (+)/(+) ±/± ++/+ + ++/+ + +
ng spec. Tg/mouse] 4 (+)/(+) (+)/+ + +/+ + + +/+ + +
mAb LA 10* 1 - - - (±)/± (+)/(+) +
[5 pg spec. 2 - (+)/(+) +/+ + +/+ + + +/+ + +
Tg/mouse] 3 - (+)/(+) +/ + + +/+ + + +/(+) +
4 - (+)/(+) + +/+ + + +/+ + + +/+ + +
mAB LA2* [5 1 - • •
pg spec. 2 - ±/- (±)/- - - -
lg/mouse] 3 4 ±/- • • •
Pontozás: ++ súlyos; + kevésbé súlyos; (+) mérsékelt; ± enyhe duzzadás;
(±) elhanyagolható duzzadás, kipirosodás; - klinikai jelek hiánya a jobb és bal sípcsont-lábtői ízületben.
*Korábban ismertetett [20,35,39] mAB

Claims (17)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. B. burgdorfériből tisztított OspG és annak immunológiailag megfelelő származéka.
  2. 2. B. burgdorfériből tisztított OspG és annak immunológiailag megfelelő származéka, amelynek látszólagos molekulatömege 22 kDa, izoelektromos pontja mintegy PI=5,2 és 196 aminosavból áll.
  3. 3. B. burgdorfériből tisztított OspG, amely lényegében véve megegyezik az 1. ábrán bemutatottal.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti tisztított OspG, amely legalább 80 % homológiát mutat az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciával.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti tisztított OspG alkalmazása gyógyszerkészítmények előállítására.
  6. 6. Vakcina, amely egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti tisztított OspG-t tartalmaz.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti vakcina, amely további B. burgdorferi antigént tartalmaz.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti vakcina, amely még Borreliáből származó OspA antigént is tartalmaz.
  9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely még QS21-t vagy 3D-MPL-t is tartalmaz.
  10. 10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti OspG alkalmazása Lyme-kórban szenvedő vagy arra fogékony betegek immunprofilaktikus vagy immunterápiás kezelésére szolgáló vakcina előállítására.
  11. 11. Izolált DNS-szekvencia, amely egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti OspG proteint vagy annak ixnmunológiailag megfelelő származékát kódolja.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti, OspG proteint kódoló izolált DNS-szekvencia, amely lényegében véve megegyezik az
    1. ábrán bemutatottal.
  13. 13. Expressziós vektor, amely egy a 12. vagy 13. igénypont szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz.
  14. 14. Gazdasejt, amely egy a 11. vagy 12. igénypont szerinti DNS-szekvenciával van transzformálva.
  15. 15. Eljárás egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti tisztított OspG előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtet egy a 14. igénypont szerinti vektorral transzformálunk, tenyésztjük, és a kapott proteint izoláljuk.
  16. 16. Eljárás egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti OspG-t tartalmazó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett OspG-t vagy immunológiailag megfelelő származékát egy vagy több farmakológiailag elfogadható hordozóanyaggal keverünk.
  17. 17. Diagnosztikai készlet, amely B. burgdorferi Ospb-t tartalmaz.
HU9701727A 1994-08-17 1995-08-11 Borrelia burgdorferi OspG-t tartalmazó vakcina HUT77251A (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9416667A GB9416667D0 (en) 1994-08-17 1994-08-17 Vaccines and diagnostics
GBGB9503867.5A GB9503867D0 (en) 1995-02-25 1995-02-25 Vaccines and diagnostics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77251A true HUT77251A (hu) 1998-03-02

Family

ID=26305468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701727A HUT77251A (hu) 1994-08-17 1995-08-11 Borrelia burgdorferi OspG-t tartalmazó vakcina

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0781338A1 (hu)
JP (1) JPH10504455A (hu)
KR (1) KR970705636A (hu)
CN (1) CN1159831A (hu)
AU (1) AU687620B2 (hu)
BR (1) BR9508802A (hu)
CA (1) CA2197712A1 (hu)
CZ (1) CZ42497A3 (hu)
HU (1) HUT77251A (hu)
NZ (1) NZ291818A (hu)
PL (1) PL318672A1 (hu)
WO (1) WO1996005313A1 (hu)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19632862B4 (de) 1996-08-14 2006-08-03 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe
CA2812759A1 (en) * 2010-09-27 2012-04-12 Cornell University Methods for diagnosing lyme disease
CN111196842A (zh) * 2020-01-09 2020-05-26 济南大学 一种外膜转运通道蛋白的非跨膜结构域的表达纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0781338A1 (en) 1997-07-02
JPH10504455A (ja) 1998-05-06
PL318672A1 (en) 1997-07-07
AU3345495A (en) 1996-03-07
WO1996005313A1 (en) 1996-02-22
CZ42497A3 (en) 1997-10-15
BR9508802A (pt) 1997-12-30
CN1159831A (zh) 1997-09-17
KR970705636A (ko) 1997-10-09
CA2197712A1 (en) 1996-02-22
AU687620B2 (en) 1998-02-26
NZ291818A (en) 1998-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wallich et al. Molecular cloning and immunological characterization of a novel linear-plasmid-encoded gene, pG, of Borrelia burgdorferi expressed only in vivo
Probert et al. Protection of C3H/HeN mice from challenge with Borrelia burgdorferi through active immunization with OspA, OspB, or OspC, but not with OspD or the 83-kilodalton antigen
US7605248B2 (en) Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
US5530103A (en) Method for the purification of PC protein from Borrelia burgdorferi
Probert et al. Identification and characterization of a surface-exposed, 66-kilodalton protein from Borrelia burgdorferi
US6248562B1 (en) Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor
Nguyen et al. Partial destruction of Borrelia burgdorferi within ticks that engorged on OspE-or OspF-immunized mice
US8680236B2 (en) Altered OspA of borrelia burgdorferi
EP0540457A1 (en) Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
ES2298246T3 (es) Constructos recombinantes de borrelia burgdorferi.
PT1194559E (pt) Grupos de borrelia burgdorferi e borrelia afzelii que causam a doença de lyme em seres humanos
US5807685A (en) OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi
US5777095A (en) Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90
US20030059894A1 (en) Surface antigens and proteins useful in compositions for the diagnosis and prevention of lyme disease
Wallich et al. Molecular and immunological characterization of a novel polymorphic lipoprotein of Borrelia burgdorferi
KR20130125771A (ko) 다가 키메라 ospc 백시노겐 및 진단 항원
AU687620B2 (en) Vaccines containing borrelia burgdorferi OspG
US6676942B1 (en) Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines
MXPA97001224A (en) Vaccines against borrelia burgdorferi o
EP1939294A1 (en) Recombinant constructs of borrelia burgdorferi
US6716591B1 (en) B. burgdorferi polypeptides
WO1995009919A1 (en) Vaccines and diagnostics for borrelia burgdorferi
Probert Identification and evaluation of Borrelia burgdorferi antigens as components of a subunit lyme disease vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal