[go: up one dir, main page]

HUT63456A - Process for filtering test of partner protein - Google Patents

Process for filtering test of partner protein Download PDF

Info

Publication number
HUT63456A
HUT63456A HU923283A HUP9203283A HUT63456A HU T63456 A HUT63456 A HU T63456A HU 923283 A HU923283 A HU 923283A HU P9203283 A HUP9203283 A HU P9203283A HU T63456 A HUT63456 A HU T63456A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
domain
myc
partner
fusion protein
Prior art date
Application number
HU923283A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert E Kingston
Christopher Alden Bunker
Original Assignee
Gen Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gen Hospital Corp filed Critical Gen Hospital Corp
Publication of HUT63456A publication Critical patent/HUT63456A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

A találmány a molekuláris biológia területére vonatkozik, és tárgya eljárás olyan peptidek azonosítására, amelyek egy másik peptiddel képesek heterodimer komplexet alkotni. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti heterodimer komplexképződés inhibitorainak azonosítására. A találmány hátterét az alábbi ismeretek képezik.
I. Onkogének
Feltételezik, hogy különféle típusú rákok keletkezését végső soron celluláris onkogének aktiválása okozza [Bishop J.
M., Science 235, 305-310 (1987); Barbacid M., Ann. Rév. Biochem. 56, 779-827 (1987); Colé M. D., Ann. Rév. Génét. 20, 361-384 (1986); és Weinberg R. A., Science 230, 770-776 (1985)]. Ezek az onkogének onkoproteineket expresszálnak, amelyek a sejtben találhatók, gyakran egy specifikus helyen, például a sejtmagban, citoplazmában vagy a sejtmembránban lokalizálódva.
így például a celluláris c-myc onkogén a c-myc proteineket kódolja. Nagy mennyiségű c-myc expresszálása számos sejttípusban lehetővé teszi a sejtek korlátlan szaporodását sejttenyészetben [áttekintését lásd Bishop J.M., Cell 42, 23-38 (1985); és Weinberg R. A., Science 230 770-776 (1985)]. A c-myc expressziója egyik faktorként az összes humán rákos megbetegedések legalább 10%-ában szerepel.
Ezenkívül a c-myc túlzott expressziója normális patkány fibroblasztokban egy aktivált ras onkogén termék expreszsziójával együtt átalakítja a fibroblasztokat és képessé teszi azokat tumorok képzésére élő állatban [Land H. és munkatársai: Natúré 304, 596-601 (1983); Ruley Η. E., Natúré 304. 602·· * • «· • ·«
- 3 -606 (1983)].
A myc protein funkciója még nem ismert annak ellenére, hogy vannak bizonyítékok lehetséges szerepére a transzkripciós szabályozásban, az RNS képződésében és a replikációban. A myc valójában a proteinek egy csoportját jelenti, amelyhez tartoznak az N-myc [DePinho R. A. és munkatársai, Genes Dev. 1, 1311-1326 (1987)], az L-myc [DePinho R. A. és munkatársai, Genes Dev. 1, 1311-1326 (1987)] és a c-myc [Battet és munkatársai, Cell 34, 779-787 (1983)] formák.
Nyilvánvaló, hogy a c-myc a szaporodás szabályozásában és a differenciálódásban játszik szerepet [Alt F. W. és munkatársai: Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 51, 931-941 (1986); Kelly K. és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 4, 327328 (1986)]. A legújabb tanulmányok utalnak arra, hogy az onkoproteinek, például a c-myc megváltoztatják a gén-expreszsziót és halhatatlanná teszik a sejteket oly módon, hogy specifikus cél-gének promoter aktivitását szabályozzák, és ezáltal aktiválják, vagy represszálják ezen cél-gének transzkripcióját [Varmus Η. E., Science 238. 1337-1339 (1987); Kingston R. E. és munkatársai, Cell 41, 3-5 (1985); Bishop J. M., Cell 42. 23-38 (1985); Weinberg R. A., Science 230. 770-776 (1985)].
II. Szabályozó proteinek
Sok szabályozó protein heterodimer, vagyis két különböző peptidláncból áll, amelyek egymással kölcsönhatásban képezik a natív proteint. A fenti szabályozó proteinek közé tartoznak a DNS-kötő proteinek, amelyek képesek specifikus DNS-szekvéneiákhoz kötődni, és ezáltal a DNS RNS-sé való ·· ···· ·· • · « · • · ··· ·· ···· ·· ·»*
- 4 transzkripcióját szabályozni. A fenti proteinek dimerizációja szükséges ahhoz, hogy ezek a proteinek kifejtsék a fenti kötő specificitást. Számos transzkripciós szabályozó proteint azonosítottak: Myc, Fos, Jun, Ebp, Fra-1, Jun-B, Spl, H2TF-1/NF-kB-szerű protein, PRDI, TDF, GLI, Evi-1, a glukokortikoid receptor, az ösztrogén receptor, a progeszteron receptor, a tiroid hormon receptor (c-erbA) és a ZIF/268, OTF-l(OCTl), OTF-2(OCT2) és PIT-1; a GCN4, GAL4, HAP1, ADRI, SWI5, ARGRII és LAC9 élesztő proteinek, az MATal, MATa2 és MATal típusú párosodási faktorok; a cys-3 és valószínűleg a cpc-1 neurospóra proteinek; a bsg 25D Drosophila protein stb. és az ilyen proteinek jellemzésére alkalmazott módszerekről is közöltek összeállítást [Johnson, P. F. és munkatársai, Annu. Rév. BÍOCh. 58, 799-839 (1989)].
A Jun/Fos és ATF/CREB transzkripciós szabályozó proteinek családjába tartozó proteinek csak dimer formában kötődnek a DNS-hez. Fenti csoportokba tartozó proteinek leucin cipzár proteinek, amelyek egy bázikus aminosavakban gazdag régiót tartalmaznak, amelyet egy mintegy 35 aminosavból álló,
4-5 leucin-maradékot tartalmazó rész követ, amelyeket egymástól 6 másik aminosav választ el (ez az u.n. leucin cipzár régió). A bázikus régió és a leucin cipzár régió kombinációját összefoglalóan bZIP doménnek nevezik.
Általában azt tapasztalták, hogy a bázikus régió az, amely elsősorban felel a DNS-hez való kapcsolódásért, míg a cipzár régió a dimerizációt mediálja. Sok dimer kombináció lehetséges, azonban a cipzár régió specifikus természete megszabja a megengedhető párosításokat [Ábel, T. és munkatársai, . ♦ *· «·♦· ·♦ * · · i · ··· « · ··· • · · · · · ·· ··*» » ·
-5Natűre 341» 24-25 (1989)].
A proteinek egy másik nagy családja olyan DNS-kötő/dimerizáció motívumot tartalmaz, amely bázikus hélix-hurok-hélix motívumként (bHLH) ismert [Jones, N. , Cell 61, 9-11 (1990)]. A bHLH protein általában egy bázikus N-terminálist tartalmaz, amelyet egy hélix-hurok-hélix szerkezet követ. A két rövid, amfipatikus hélix hidrofób maradékokat tartalmaz minden harmadik vagy negyedik helyzetben. A bázikus régió szekvenciája jellegzetesen nem mutat amfipatikus hélix szerkezetet. A közbeékelődő hurok régió rendszerint egy vagy több hélixet megtörő maradékot tartalmaz.
A bHLH motívumot először két proteinben, az E12-ben és az E47-ben detektálták, amelyek az immunglobulin erősítőkben ta lálható specifikus E box DNS erősítő (enhancer) szekvenciához kötődnek [Murre C. és munkatársai, Cell 56, 777-783 (1989)]. Az E motívumok általában az 5'-CAGGTGGC-3' konszenzus szekvencia kettős szálú variánsai. így például a μΕΙ motívum szekvenciája GTCAAGATGGC, a μΕ2 motívumé AGCAGCTGGC, a μΕ3 motívumé GTCATGTGGC, a μΕ motívumé TGCAGGTGT [Murre C. és munkatársai, Cell 56, 777-783 (1989)]. Sok transzkripciós faktorhoz hasonlóan, a bHLH motívumot tartalmazó peptidek gyakran dimerizálnak egymással, vagy homodimerként, amely két azonos peptidet vagy heterodimerként, amely két különböző peptidet tartalmaz. Ismeretesek két bHLH protein heterodimer komplexére példák, amelyek a DNS-t nagyobb hatékonysággal kötik meg, mint a heterodimert alkotó lévő bármelyik peptid homodimer komplexe [Murre C. és munkatársai, Cell 56, 777-783 (1989); Murre C. és munkatársai, Cell 58., 537-544 (1989)].
·· «·«« ·· • « i · „ _ · · ··· • * · · · » ·· ···« »« ·«
- 6 Az Myc egy bHLH protein, és a c-myc bHLH doménje a c-myc 255-410. aminosavjaiban van kódolva. A három myc gén által expresszált proteinek (humán N-myc 393-437, humán c-myc 346-401 és humán L-myc 289-338) és az egyéb, bHLH domént tartalmazó gének által expresszált proteinek közötti szekvencia-homológiát is megvizsgálták [Murre C. és munkatársai, Cell 56. 777-783 (1989)].
Partner-proteinek nélkül - amelyekkel dimerizálni képes - a myc két láncából álló homodimer nem kötődik a μΕ2 DNS-hez. Ezért szükség van azon partnerek azonosítására, amelyek irányítják az myc DNS-kötődését, valamint olyan vegyületek azonosítására, amelyek gátolják a myc aktivitást, azáltal, hogy gátolják az ilyen myc-partner kölcsönhatást. Azok a proteinek, amelyek - mint például a myc - tartalmazzák a bHLH motívumot, rendelkeznek azon képességgel is, hogy más bHLH motívumot tartalmazó proteinekkel dimerizálódjanak, ezért nagyon valószínű, hogy a myc partnerei is tartalmazni fogják a bHLH motívumot. A fenti kölcsönhatások gátlásával elérhető a myc-indukálta sejtnövekedés gátlása és/vagy szabályozása. A myc-partner képződés inhibitorainak adagolása gyógyászati jelentőségű olyan betegségek kezelésében, amelyekben a myc expressziója és aktivitása az egyik faktora a sejt növekedésnek vagy a sejtek transzformált állapotban való fenntartásának.
Napjainkig azonban nem azonosítottak myc inhibitorokat. Az ilyen inhibitorok azonosítására nincsenek egyszerű, olcsó és megbízható szűrővizsgálatok, amelyekkel gyorsan azonosítani lehetne a potenciális inhibitorokat és azok aktív ··· • · · V • · «Μ* • · « ♦
- 7 származékait. Ezért szükség van olyan gyors, gazdaságos szűrővizsgálati módszerekre, amelyekkel az onkogén aktivitás specifikus inhibitorai kimutathatók.
Felismervén az onkoproteinek inhibitorainak potenciális jelentőségét a rák számos formájának terápiás kezelésében, és ismerve olyan egyszerű vizsgálati rendszer hiányát, amellyel az ilyen inhibitorok azonosíthatók lennének, megvizsgáltuk kiméra onkogén szerkezetek alkalmazását modell rendszerként prokariota gazdákban in vitro vizsgálatokban olyan szerek kimutatására, amelyek megváltoztatják az onkogén expressziót.
Erőfeszítéseink egy olyan egyszerű, olcsó vizsgálati módszer kifejlesztését eredményezték, amely általában partner proteinek és főleg a transzkripciós szabályozó proteinek partnerei azonosítására alkalmazhatók.
A találmány szerinti eljárások különösen alkalmasak olyan partnerek azonosítására, amelyek transzkripciós szabályozó proteinek, és különösen onkoproteinek aktivitását befolyásolják.
A találmány szerinti eljárás alkalmas továbbá ilyen heterodimer-képződés inhibitorainak azonosítására, izolálására és jellemzésére, és főleg az onkoprotein aktivitás inhibitorainak azonosítására, izolálására és jellemzésére.
A találmány ezenkívül gyors, megbízható és pontos módszert nyújt különféle vegyületek, így a humán gyógyszerek objektív értékelésére is az onkogén aktivitás inhibitoraként.
A találmány ezenkívül eljárásra vonatkozik partner-proteinek azonosítására azon képességük alapján, hogy tönk- ” - -- * · ·· ·*··<* * ·· ···· ·· ··
- 8 - Α reteszik a lítikus szaporodás cl-indukálta represszióját bakteriális gazdasejtekben, amelyek a cl DNS-kötő domént és a partner B dimerizációs domént tartalmazó fúziós proteineket expresszálják. Az így azonosított partnerek már klónozott formában vannak és könnyen tovább jellemzhetők.
Az 1. áb'ra mutatja a humán c-myc exon 3 szekvenciáját és a c-myc HLH/LZ és HLH fragmenseinek szintetizálására alkalmazott helyeket.
A leírásban számos olyan kifejezést alkalmazunk, amelyeket a rekombináns DNS technológiában kiterjedten alkalmaznak. A leírás világosabb megértése érdekében azonban megadunk néhány definíciót az alábbiakban.
Működőképesen kötött
A leírásban két makromolekuláris elem akkor van működőképesen kötve, ha a két makromolekuláris elem fizikailag úgy van elrendezve, hogy azok a faktorok, amelyek az első elem aktivitását befolyásolják, arra késztetik az első elemet, hogy hatást fejtsen ki a második elemre.
Fúziós protein
Fúziós protein alatt a leírásban olyan hibrid proteint értünk, amely két különböző proteinből származó doméneket tartalmaz .
Fúziós protein gén alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely egy fúziós protein kódol, beleértve adott esetben annak transzkripciós és transzlációs regulátor elemeit is.
Variáns
Egy fúziós protein variánsa alatt olyan proteint értünk, amely a természetes körülmények között előforduló dómé • *
- 9 nekből szerkesztett fúziós protein aminosav-szekvenciájához lényegében hasonló, de azzal nem azonos aninosav-szekvenciát tartalmaz, azaz a natív aminosav-szekvenciát tartalmazó doméneket.
Lényegében hasonló aminosav-szekvencia alatt olyan aminosav-szekvenciát értünk, amely nagymértékben homológ, de nem azonos egy fúziós proteinben található aminosav-szekvenciával. Erősen homológ aminosav-szekvencia olyan szekvenciákat jelent, amelyek 80%, vagy annál nagyobb homológiát mutatnak, de lehet a homológia kisebb mértékű is, különösen abban az esetben, ha az az érdekes doménben koncentrálódik.
Funkcionális származék
Valamely fúziós protein funkcionális származéka egy olyan proteint jelent, amely képes egy partner-proteinnel dimerizálódni és/vagy képes a kívánt DNS célponthoz kötődni, azaz lényegében hasonló a találmány szerinti fúziós protein konstruktum dimerizációs képességéhez. Lényegében hasonló alatt azt értjük, hogy a fent említett biológiai aktivitások kvalitativan hasonlóak a találmány szerinti fúziós proteinekéhez, de kvantitativan attól eltérnek. így például egy fúziós protein funkcionális származéka felismerheti ugyanazt a célpontot, mint a fúziós protein, vagy képes heterodimert alkotni ugyanazzal a partner-proteinnel, de nem ugyanazon affinitással.
A leírásban funkcionális származék alatt olyan peptidet értünk például, amely a fúziós protein aminosav-vázát tartalmazza, és ezenkívül olyan kémiai maradékokat, amelyek rendszerint nem képezik egy fúziós protein részét. Ilyen maradékok javíthatják a származék oldhatóságát, abszorpcióját, • V « · · ·«· • · · · · ·
- 10 biológiai fél-élet idejét stb. A maradékok a származék toxicitását is csökkenthetik, vagy megszüntethetik vagy gyengíthetik a származék valamely nem kívánatos mellékhatását, stb. A fenti hatások kifejtésére alkalmas maradékok például a Remington's Pharmaceutical Sciences-ben (1980) találhátók. A fenti maradékok valamely molekulához való kapcsolására alkalmas eljárások a szakirodalomból ismertek.
A fúziós protein funkcionális származéka adott esetben poszttranszlációs módosításokat, például kovalensen kötött szénhidrátot is tartalmazhat attól függően, hogy ilyen módosítások szükségesek-e a találmány szerinti eljárás kivitelezésére.
Funkcionális származék alatt egy molekula funkcionális fragmenseit, variánsait, analógjait vagy kémiai származékait értjük.
Promoter
A promoter egy olyan DNS-szekvencia, amely az átírt szekvencia 5' végén a transzkripciós start kodon közelében helyezkedik el, és amelyhez az RNS-polimeráz kötődik, vagy amely a transzkripciót iniciálja. A promoter tartalmazhat több szabályozó elemet, amelyek közreműködnek a működőképesen kötött gén transzkripciójának szabályozásában.
Expresszió
Az expresszió az a folyamat, amelyben egy génben kódolt információ átíródik és proteinné transzlatálódik. Egy nukleinsav-molekula - például egy DNS vagy egy gén - akkor képes egy polipeptidet expresszálni, ha a molekula tartalmazza a polipeptidet kódoló szekvenciákat és az expressziót szabá11 lyozó szekvenciákat, amelyek megfelelő gazda környezetben biztosítják a DNS-ben tartalmazott genetikus információ átírását, feldolgozását és transzlációját egy protein termékké, ha az ilyen expessziós szabályozó szekvenciák működőképesen vannak kötve a polipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciához.
Klónozó eszköz
Klónozó eszköz alatt bármely olyan molekuláris entitást értünk, amely képes egy nukleinsav-szekvenciát egy gazdasejtbe továbbítani klónozás céljából. Klónozó eszközökre példaként említjük a plazmidokat, vagy a fág genomokat. Különösen előnyös az a plazmid, amely a gazdasejtben függetlenül képes replikálódni. Különösen hasznos egy olyan nukleinsav-molekula is, amely a gazdasejt kromoszomális DNS-ébe képes inszertálódni.
A klónozó eszközöket gyakran egy, vagy kis számú endonukleáz felismerő hely jellemzi, amelyeken ezek a DNS-szekvenciák meghatározható módon hasíthatok az eszköz alapvető biológiai funkciójának elvesztése nélkül, és amely helyre a DNS beilleszthető abból a célból, hogy annak replikációja és klónozása végbemenjen.
A klónozó eszköz tartalmazhat továbbá egy markert is, amely alkalmas a klónozó eszközzel transzformált sejtek azonosítására. Markerek például a tetraciklin rezisztencia vagy ampicillin rezisztencia. A klónozó eszköz helyett időnként a vektor kifejezést használjuk.
Expressziós eszköz
Az expressziós eszköz egy olyan eszköz vagy vektor, amely a klónozó eszközhöz hasonló, de főleg abból a célból
J
- 12 tervezték, hogy a gazdasejtbe való transzformáció után képes legyen a klónozott gént expresszálni. Az expressziós eszközben a klónozandó gén működőképesen van kötve bizonyos szabályozó szekvenciákhoz, például promoter szekvenciákhoz. Az expreszsziós szabályozó szekvenciák attól függően változnak, hogy a vektor a működőképesen kötött gén prokariota vagy eukariota gazdasejtben való expresszálására van-e tervezve, és tartalmazhat továbbá transzkripciós elemeket, gazda-specifikus elemeket, például operátor elemeket, 3' -> 5' irányban elhelyezkedő aktivátor régiókat, erősítő elemeket, terminációs szekvenciákat, szövet-specificitás elemeket és/vagy transzlációs iniciációs és terminációs helyeket. '
Gazda
Gazda alatt bármely olyan szervezetet értünk, amely egy klónozó vagy expressziós eszköz recipiense.
Válasz
A leírásban válasz alatt egy bármely paraméterben bekövetkező változást értünk, amely valamely vegyület egy protein aktivitására kifejtett hatásának mérésére és leírására alkalmazható. A válasz egy fizikai változásban (például fenotípikus változásban) vagy molekuláris változásban, például reakciósebességben vagy affinitási konstansban bekövetkező változásban nyilvánulhat meg. A válasz detektálását bármely arra alkalmas eszközzel végezhetjük.
Vegyület
Vegyület alatt a leírásban egy kémiai entitást értünk függetlenül attól, hogy az szilárd, cseppfolyós vagy gáz halmazállapotban van-e. A fenti kifejezés alatt értjük a szin
J
- 13 tetikus vegyületeket, a természetes termékeket és a makromolekuláris entitásokat, például polipeptideket, polinukleotidokat vagy lipideket, ugyanakkor a kis entitásokat, például neurotranszmittereket, ligandumokat, hormonokat vagy elemi vegyületeket is.
A
Bioaktív vegyület
Bioaktív vegyület alatt bármely olyan vegyületet értünk, amely mérhető választ indukál a találmány szerinti eljárásban.
A heterodimer proteinek két különböző peptidláncot tartalmazó proteinek, a láncok egymással például hidrogénkötéssel, ionos kölcsönhatással, hidrofób kölcsönhatásokkal, diszulfid kötéssel vagy hasonló módon kapcsolódnak, de aminosav kötéssel nincsenek egymáshoz kapcsolva. A heterodimer protein két polipeptid láncát a leírásban egymás partnereinek nevezzük. Kimutatták, hogy a heterodimer transzkripciós szabályozó proteinek egy elkülönülő domént tartalmaznak, amely szükséges ahhoz, hogy a dimerizáció végbemenjen. Egy másik különálló dómén szükséges a DNS-kötődés lejátszódásához.
A találmány értelmében ezeket a megfigyeléseket használtuk fel egy heterodimer protein partnerének azonosítására. A fenti partner-proteinek úgy azonosíthatók, hogy egy olyan kiméra peptidet szerkesztünk, amely saját dimerizációs doménjét megtartja, de egy olyan DNS-kötő domént tartalmaz, amely képes egy gazdasejtnek, előnyösen egy bakteriális gazdasejtnek (például E. colinak) fenotipikus expressziót biztosítani. Az ilyen fenotípus kimutatásával a heterodimer képződése és aktivitása kimutatható. A legelőnyösebb kiméra peptidek egy félté14 telezett heterodimer partner-protein dimerizációs doménjét és egy bakteriofág represszor, például a bakteriofág repressszor DNS-kötő doménjét tartalmazzák.
A bakteriofág képes egy bakteriális gazda fertőzésére és vagy (a) fertőző, lítikus módon replikálódik és szaporodik (lítikus ciklus) vagy (b) beépül a gazda kromoszómájába nem fertőző, lizogén módon (lizogén ciklus). A bakteriális kromoszóma részeként integrálódott inért fág DNS-t profágnak nevezzük. Profág-tartalmuk következtében a lizogén baktériumok az ugyanazon típusba tartozó további fág-részecskék általi felülfertőzéssel szemben immunisak. A /1 bakteriofág a lambdoid bakteriofágok családjának (például 434, 21 és 080) egyik tagja. Ezek a bakteriofágok mind egyenértékűek a Pl-val a találmány szerinti célra.
Ha a fág lítikus módon szaporodik a fertőzött baktériumokban, a baktériumok végül is lizálódnak. Ez a lízis a baktériumtenyészetre jellemző ·zavarosság vagy opak megjelenés kitisztulását eredményezi. A lítikus ciklusukban bakteriális sejteket lizáló fágok szaporodását és replikációs aktivitását baktériumot lizáló és ezáltal plakk-képző (a plakk tiszta terület, amelyben a baktérium lizálódott) képességük vizsgálatával határozhatjuk meg, agaron tenyésztett baktérium tenyészetben [The Backteriophage Lambda, szerk. Hershey A. D., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1971) ; Lambda II, szerk. Hendrix R. W. és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1983); Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. kiadás, Cold
A
Spring Harbor Laboratory, New York (1988)].
A cl gén a cl-t represszor proteint kódolja, amely a lizogén jelleg fenntartásához szükséges. Nativ állapotában a cl egy homodimer (két azonos láncból álló dimer) és a represszor Λ DNS-hez való erős kötődéséhez a dimer állapot szükséges. A cl két operátorhoz kötődik, amelyek a szomszédos gének transzkripcióját szabályozzák, amelyek termékei a lítikus fejlődésért felelős gének expressziójához szükségesek. A fenti operátorokhoz való kötődéssel a cl represszor az összes Λ gén transzkripcióját megakadályozza, kivéve a sajátját. A cl gén teljes aminosav- és nukleotid-szekvenciája ismert [Lamba II, szerk. Hendrix R. W. és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1983)].
A találmány értelmében szerkesztettünk egy olyan fúziós proteint, amely a cl DNS-kötő dóménjét (a 3· cl N-terminális 112 aminosavját) és egy feltételezett heterodimer partner protein dimerizációs doménjét tartalmazza. Egy igen előnyös kiviteli alakban dimerizációs doménként a c-myc bHLH régióját (a c-myc 225-410. aminosavjai) alkalmazzuk. Kívánt esetben egyéb dimerizációs domének is alkalmazhatók.
A dimerizációs doménekre a protein háromdimenziós szerkezetének analíziséből lehet következtetni a szakemberek által ismert aminosav-szekvencia és számítógépes analízis módszerek alkalmazásával, például a Chou-Fasman algoritmus segítségével. A fenti módszerek lehetővé teszik a helikális domének és egyéb érdekes területek, például a hidrofób vagy hidrofil domének azonosítását a peptidszerkezetben.
A HLH dimerizációs domént a proteinben 10 ismert HLH dimerizációs dómén aminosav-szekvenciájának összehasonlításé val lehet meghatározni (E12-ben a 336-393-as, E47-ben a 336-393-as, daughterless-ben az 554-613-as, twist-ben a 357-407-es, humán N-myc-ben a 393-437-es, humán L-myc-ben a 289-338-as, humán c-myc-ben a 346-401-es, MyoD-ben 108-164-es helyzetű aminosavak, és az achaete-scute lókusz génjei: a T4 101-167-es, a T5 26-95-ös helyzetű aminosavjai [Murre C. és munkatársai, Cell 56, 777-783 (1989)]. A HLH dimerizációs dómén két amfipatikus hélixet tartalmaz, amelyeket egymástól egy hurok választ el. Az első hélix 12 aminosavat, a második hélix 13 aminosavat tartalmaz. Bizonyos aminosavak konzerváltnak tűnnek a HLH szerkezetben, különösen a hélixekben jelenlévő hibrofób maradékok. A fent említett két szekvencia Összehasonlítása azt mutatja, hogy a homológ régiók 5' végében öt, szemmel láthatóan azonos hidrofil maradék van, és két rövid szegmensben lokalizálódó, főleg hidrofób maradékok sorozata, amelyeket egymástól egy olyan szekvencia választ el, amely általában prolinokat vagy egy csoport glicint tartalmaz.
A leucin cipzár dómén rendszerint mintegy 35 aminosav hosszú, és leucin-maradékokból egy ismétlődő héttagú elrendeződést tartalmaz, és rendkívül nagy sűrűséggel ellentétes töltésű (savas vagy bázikus) aminosavakat oly módon egymás mellett elhelyezve, amely alkalmas hélixen belüli ionpár képzésre. Valószínűleg az egyik polipeptid hélixből kinyúló leucinok összekapcsolódnak egy másik peptid (a partner) analóg hélixéből kinyúlóakkal, és ezáltal kialakul a leucin cipzárnak nevezett összekapcsolódás.
A találmány szerinti fúziós proteint rekombináns DNS-molekulaként szerkesztettük meg, amely képes bakteriális gaz dában a fúziós protein expresszálására. E. coli gazdák transzformálása egy, az ilyen fúziós proteinek expresszálására képes rekombináns A szerkezettel a bakteriális gazda immunitását eredményezi a fúziós protein, és különösen a cl dómén homodimer formává való dimerizációja következtében, amely képes a megfelelő A DNS operátorokhoz kötődni. Ezért a transzformálást és a fúziós protein expresszióját követően a λ lítikus szaporodása, vagy egy újabb, J^.-val való fertőzés gátolt.
Előnyösen egy kis példányszámú plazmidot alkalmazunk egy gyenge promoterrel (például a β-laktamáz promoterrel és a laktóz operátorral) együtt a fúziós gén transzkripciójára, annak érdekében, hogy a bakteriális gazdát ne árasszuk el a fúziós protein túl nagy feleslegével. Ha a fúziós protein túl nagy feleslege szintetizálódik, a homodimer fúziós protein mólaránya a heterodimer fúziós proteinhez viszonyítva (lásd alább) olyan nagy lehet, hogy a homodimer hatásosan represzszálja a fág szaporodását és így megakadályozza a heterodimer detektálását.
Bármely protein, amely olyan kötő doménnel rendelkezik, amely a fúziós proteinnel heterodimert tud képezni, csökkenti, vagy megakadályozza a homodimer fúziós proteinek kialakulását. Az ilyen proteineket ezért a fág-szaporodás fúziós protein által médiáit represszióját zavaró képességük alapján lehet azonosítani.
Az egyik kiviteli alakban a bakteriális gazdát, amely a fent ismertetett fúziós proteint expresszálja, egy expressziós könyvtárral transzformáljuk, amely klónozott eukariota géneket expresszál. így például a mRNS-ből expresz • · ·
- 18 sziós könyvtárak kialakítására alkalmas Λ gtll pakoló rendszerek - amelyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók - a szakirodalomból ismertek és kereskedelmi forgalomból hozzáférhetők (például a Promega Corporation-től, Madison, Wisconsin). Ezenkívül kereskedelmi forgalomból beszerezhetők rendelésre készített genomiális expressziós könyvtárak is.
Kereskedelmi forgalomban kapható készletek alkalmazásával előállítható egy oligo(dT)-prímelt cDNS könyvtár \ gtll-ben, bármely kívánt emlős forrásból származó, citoplazmatikus, poli(A)-tartalmú mRNS alkalmazásával. Az abban foglalt klónozott proteinek expresszióját 10 mmol/liter IPTG-t (izopropil-tiogalaktozidáz) hozzáadásával indukálhatjuk.
Igen jelentős, hogy mivel az összes gazdasejt termeli a yl represszor fúziós proteint, a fertőző A expressziós könyvtár lítikus szaporodása represszált. A λ expressziós könyvtár azon fertőző tagjai, amelyek nem expreszszálnak olyan dimerizációs doménnel rendelkező proteint, amely képes a fúziós protein dimerizációs doménjéhez kapcsolódni, nem fogják csökkenteni a homodimer fúziós protein által médiáit fág repressziót. Ezért nem fogjuk tapasztalni Ά fág lítikus szaporodását. Ha a A expressziós könyvtár valamelyik tagja expresszál egy olyan proteint, amely képes a fúziós protein homodimerizációját zavarni (például a fúziós peptid bHLH doménjével egy heterodimer kialakítása által, stb.), a represszor funkció elveszik és a λ lítikus szaporodása fog lejátszódni. Ezért a heterodimert képező partnerek azonosítása könnyen kivitelezhető a plakk-képző fágokra való • 4 · .··. ···:
• · • · · · ♦ ·
- 19 szűrővizsgálattal.
A találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható bármely partner-protein azonosítására, amely egy másik proteinnel partnert, különösen heterodimert képez. A partner-protein azonosítására szolgáló találmány szerinti eljárás egyik előnye, hogy az azonosított partner egy olyan protein, amely a fúziós proteinhez nagyobb affinitást mutat, mint a homodimer affinitás, és ezért ez a protein nagy valószínűséggel a protein biológiai aktivitásának fontos szabályozója. Ezenkívül az azonosított partner már klónozott, expresszáló formában van, amely lehetővé teszi a protein nagy mennyiségeinek előállítását izolálás és további jellemzés céljára, szakemberek számára jól ismert fehérjekémiai és molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával.
A partner-proteinek azonosítása az expressziós könyvtárban lehetővé teszi olyan vegyületek azonosítását, amelyek gátolják az ilyen partnerek heterodimer-képző képességét, oly módon, hogy a vegyület plakk-képződést gátló képességére végzünk szűrővizsgálatot.
így például, ha egy partnert már azonosítottunk tiszta vagy zavaros plakkok megjelenésével a fent leírtak szerint, azokat a vegyületeket, amelyek megakadályozzák yagy egyéb módon zavarják a partner-proteinek heterodimer képzését, úgy azonosíthatjuk, hogy ezeket a vegyületeket plakk-képződést gátló képességükre szűrjük. Egy vegyület, amely a fenti példában gátolja a plakk-képződést, egy olyan vegyület lehet, amely (a) megakadályozza, hogy a·fúziós protein a gazdában szintén expresszálódott partner-peptiddel kapcsolódjon, és ··«· » « « « · •·* · · ··· • · ♦ · · · ·« ··· · · · ··
- 20 (b) nem akadályozza meg a homodimer-képződést, azaz a fúziós protein cl doménjeinek dimerizációját, és (c) nem gátolja a sejtszaporodást a plakk-vizsgálat körülményei között.
Annak bizonyítására, hogy a fenti eljárással szelektált partner specifikus a fúziós·protein dimerizációjának szabályozására, és általában nem gátolja a transzkripciót, az ilyen partnert expresszáló ”X~t olyan bakteriális gazdatörzs fertőzésére alkalmazhatjuk, amely más proteinekből származó dimerizációs doménnel szerkesztett fúziós proteineket expresszál, és megvizsgáljuk a partner lítikus szaporodást indukáló képességét az ilyen gazdákban. Ha például olyan vegyületet akarunk azonosítani, amely gátolja a bHLH dimerizációt, de nem gátolja a bZIP dimerizációt, olyan fúziós proteint szerkesztünk, amely a fenti cl domént és a bZIP proteinből a megfelelő dimerképző domént tartalmazza.
A találmány szerinti bakteriális eljárással azonosíthatók bármely dimerré asszociálódó transzkripciós szabályozó protein partnerei, és azok a vegyületek, amelyek az ilyen partnerek asszociációját gátolják.
A fenti eljárások alkalmazásával sikerült felismernünk olyan specifikus partner-proteineket, amelyek in vivő asszociálódnak a c-myc-vel és elősegítik a c-myc kötődését a DNS-hez. Ezek a partnerek erősítik a c-myc-nek kötőeleméhez, a μΕ2 DNS-szekvenciához való kötődésének mértékét és időtartamát. A fenti partner-proteinek egyikének móltömege 46 000 dalton és c-myc távollétében az mE2 szekvenciához kötődik.
A proteinben lévő DNS-kötő dómén azonosítására számos szakirodalomból ismert, és az ilyen domének azonosítására ko·· ···«
- 21 rábban már alkalmazott módszer felhasználható [az ilyen domének áttekintését lásd például Johnson Ρ. E. és munkatársai, Annu. Rév. Biochem. 58 , 799-839 (1989)].
A DNS-kötő proteineket és a fenti proteinek DNS-kötő doménjeit DNS-sel szembeni affinitásuk alapján azonosítjuk és tisztítjuk. így például a DNS-hez való kötődést szűrő-hibridizációs kísérletekben mutathatjuk ki, amelyekben a proteint (rendszerint jelzett formában a detektálás megkönnyítésére) engedjük egy szűrőn immobilizált DNS-hez kötődni, vagy fordítva, amelyben a DNS-kötő helyet (rendszerint jelezve) kötjük egy szűrőhöz, amelyen a proteint immobilizáltuk. A fenti kötődés szekvencia-specificitása és affinitása DNS-védési vizsgálattal és gél-retardációs vizsgálattal mutathatók ki. Az ilyen proteinek tisztítását szekvencia-specifikus DNS affinitási kromatográfiás módszerekkel hajthatjuk végre, azaz oszlopkromatográfiás eljárással, olyan gyantát alkalmazva, amely azzal a DNS-vel van derivatizálva, amelyhez a dómén kötődik. A DNS-kötő proteinek proteolitikus lebontásával mutatható ki az a dómén, amely megtartja a DNS-kötő képességet.
A proteinben lévő dimerizációs dómén ismert dimerizációs doménekkel való homológiája alapján ismerhető fel, és a protein aminosav-szekvenciájából következtethető számítógép segítségével végzett szerkezet-analízis alkalmazásával a fentieknek megfelelően.
A kötő domént és a dimerizációs domént a fúziós proteinbe úgy építjük be, hogy egyik dómén funkciója sem károsodik; azaz a DNS-kötő dómén - ha megfelelően dimerizálódott - képes felismerni azt a DNS-elemet, amelyhez természe tesen kötődik, és a dimerizációs dómén megtartja a partnereivel való dimerizálódási képességét. Megfelelő kontroll vizsgálatok segítségével szakember meg tudja Ítélni, hogy a fúziós protein megfelelő módon funkcionál-e.
A találmány szerinti fúziós protein konstruktumot extrakromoszómálisan tarthatjuk fenn plazmádként, vagy gazdasejt genomjába inszertálva.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható a vegyületek szűrővizsgálatára tiszta formájukban, különféle koncentrációkban, de szennyezett formájukban is. A találmány szerinti eljárás alkalmazható ilyen inhibitorok jelenlétének kimutatására is nyers extraktumokban, és az inhibitorok azokból való tisztításának követésére. A találmány szerinti eljárás alkalmazható a fent említett inhibitorok stabilitásának kiértékelésére is, a különféle preparátumok hatékonyságának meghatározására.
A fenti vegyületek analógjai is alkalmazhatók, amelyek a bakteriális gazdasejt-membránokon inkább átjutnak. Például a dibutiril-származékok gyakran nagyobb permeabilitást mutatnak.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható a membránban lévő és/vagy citoplazmatikusan lokalizálódott proteinek partnereinek és a fenti partnerekkel interferáló vegyületeknek azonosítására is, ha a fenti proteinek képesek a fúziós protein dimerizációs doménjével kapcsolódni.
A fúziós protein és/vagy cél-gén DNS-szekvenciája kémiailag állítható elő, vagy rekombináns eszközökkel szerkeszthető meg szakirodalomból ismert módon. A DNS kémiai szintézisére szolgáló módszerek szakirodalomból jól ismertek
4 · -» Ο«4· · * 4 · 4· ··· 4 ·4 · · • · · · 4· ·· ·«·· 4444 [Oligonukleotide Synthesis, A Practical Approach, szerk. Gail M. J., IRL Press, Washington, D. C., 1094; Synthesis and Applications of DNA and RNA, szerk. Narang S. A., Academic Press San Diego, CA, (1987)]. Mivel a genetikus kód degenerált egy adott aminosav kódolására egynél több kodon alkalmazható a DNS-szekvencia megszerkesztésére [Watson J. D.: Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás, Benjámin W. A., Inc., Menlo Park, CA, (1977), 356-357. oldal].
A találmány szerinti rekombináns fúziós protein expresszálására a gazda által felismerhető transzkripciós és transzlációs jelek szükségesek. A fent említett eljárásokkal előállított klónozott fúziós protein előnyösen kettős szálú formában működőképesen köthető egy expressziós vektorban a transzkripciós expressziót szabályozó szekvenciákhoz és például transzformálással vihető be a gazdasejtbe abból a célból, hogy a rekombináns fúziós proteint, vagy annak funkcionális származékát előállítsuk a találmány szerinti eljárásban való alkalmazásra.
A transzkripciós iniciációs szabályozó jeleket ügy választjuk meg, hogy azok lehetővé tegyék a fúziós proteint kódoló gén expressziójának aktiválását vagy represszióját, ezáltal a fúziós szerkezet expressziója kívánt esetben szabályozható legyen. Érdekesek azok a szabályozó jelek, amelyek hőmérsékletérzékenyek, vagyis a hőmérséklet változtatásával az expresszió represszálható vagy iniciálható; vagy azok a szabályozó jelek, amelyek kémiailag befolyásolhatók, például a tápközeghez egy metabolit vagy egy szubsztrát adagolásával. A fúziós szerkezet konstitutivan is expresszálható a gazda·· ·*··
sejtben.
A proteint úgy kell a gazdasejtben expresszálni, hogy a protein ne legyen gátolva biológiai funkciójának megtartásában. Bakteriális gazdasejtekben a proteinek expresszióját előnyösen prokariota szabályozó jelek alkalmazásával érjük el.
Az expressziós vektorok általában diszkrét DNS-elemeket tartalmaznak, mint például (a) replikációs origót, amely lehetővé teszi a vektor autonóm replikációját vagy olyan elemeket, amelyek elősegítik a vektornak a gazda kromoszómájába való stabil inszertálását, és (b) specifikus géneket, amelyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotípikus szelekcióját. Számos megfelelő expressziós vektor-rendszer kapható kereskedelmi forgalomban, amely a találmány szerinti eljárásban alkalmazható.
Ha az expresszió céljából már előállítottuk a kívánt szerkezetet tartalmazó DNS-szekvenciát vagy vektort, a DNS-szerkezet megfelelő gazdasejtbe bármely arra alkalmas módszerrel bevihető, például transzformálással. A vektor bevitele után a recipiens sejteket szelektív tápközegen tenyésztjük, amely a vektort tartalmazó sejtek szaporodására szelektál. A klónozott gén-szekvencia vagy -szekvenciák expressziója fúziós protein képződését eredményezi.
Ha a fúziós proteint kódoló DNS-szekvenciát és egy működőképesen kötött promotert nem replikálódó DNS- (vagy RNS-) molekulaként - amely vagy egy lineáris molekula, vagy előnyösebben egy autonóm replikációra képtelen zárt, kovalens cirkuláris molekula lehet - viszünk be a recipiens gazdasejtV ·· «··« • · ♦ · ·
999 « e « ·« • · · » · · • V · 9 · 9 ·9 99
- 25 be a fúziós protein expressziója a bevitt szekvencia átmeneti expresszióján keresztül nyilvánulhat meg.
Genetikusán stabil transzformánsokat vektor rendszerekkel vagy transzformációs rendszerekkel szerkeszthetünk, amikoris a fúziós protein DNS-ét a gazda kromoszómába építjük be. Az ilyen beépítés de novo a sejten belül mehet végbe, vagy egy olyan vektor transzformációjával segíthető elő, amely magát funkcionálisan inszertálja a gazda kromoszómájába, például bakteriofággal, transzpozonokkal vagy egyéb DNS-elemekkel, amelyek elősegítik a DNS szekvenciák kromoszómákba való integrálódását.
A találmány szerinti fúziós protein DNS vektoraival transzformált sejteket egy vagy több marker együttes bevitele segítségével szelektálhatjuk, amelyek lehetővé teszik azon gazdasejtek kiválasztását, amelyek a vektort tartalmazzák, így például a marker egy biocid-rezisztenciát, például antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát vagy egyéb hasonló tulajdonságot biztosíthat.
A transzformált gazdasejtet ismert módon fermentálhatjuk az optimális sejtszaporodás eléréséig, és a klónozott fúziós protein szekvencia fragmensek optimális expressziójának eléréséig. A fúziós protein optimális expressziója az az expresszió, amely ugyanannyi, és nem több mól fúziós protein alegységet biztosít, mint az expresszálandó partner-protein móljainak száma. Azonban a fenti mennyiségben elfogadhatók olyan mértékű változások, amelyek nem zavarják a partner azon képessét, hogy heterodimer formában elnyomja a cl rep resszor aktivitást.
··· 9 9 999 * · · « 0 · ·· ···· ·* 99
Szükség lehet a találmány szerinti eljárással azonosított c-myc partner-proteineinek további jellemzésére is eukariota expressziós rendszerben. Az ilyen jellemzést a 07/210 253 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésünkben ismertetjük, amelyet 1990. április 19-én nyújtottunk be, és amelynek teljes tartalmát jelen leírásunkban referenciaként beépítjük.
A találmányt részleteiben - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal ismertetjük.
1. példa
A c-myc fúziós proteinek szerkesztése
Az összes fenti szerkezet promoter/operátor régiói azonosak és a β-laktamáz promoterből, a lac-operátorból és a Shine-Delgarno szekvenciából (S.D.) állnak. A szekvencia az alábbi:
GGA TCC TCT AAA TAC ATT CAA ATA AGT ATC CGC TCA TGA
BamHI -35
GAC ΆΑΤ AAC GGT AAC CAG AAT TGT GAG CGC TCA CAA TTT TG
-10 BstEII
ATC GAT AGG AAA CTC GAG ATG...
Clal S. D. Xhol +1 cl
A cl minden egyes szerkezetben az első 336 bázispárból (121 aminosavból) áll, amely a recA-val való hasítással képződött N-terminális polipeptidnek felel meg. Ezt polimeráz láncreakcióval (PCR) szintetizáljuk, 5' és 3' végen Xhol, illetve Xbal helyet tartalmazó primerekkel. A promoter/operátor és cl DNS-eket BamHI-gyel és Xbal-gyel hasított pUC18-ba klónozzuk. Az Xbal hely körüli szekvencia az alábbi:
- 27 5' CAG GCA GGG TCT AGA...
Gin Alá Gly Xbal cl kódoló szekvencia
A c-myc HLH/LZ (hélix-hurok-hélix/leucin cipzár) és
HLH fragmenseit PCR módszerrel állítjuk elő, templátként humán c-myc cDNS-t alkalmazva. A HLH/LZ egy 258 bp hosszúságú fragmens, amelyet a 2-es és 9-es helyzetben (1. ábra) induló, 5' és 3' végén Xbal, illetve Sáli helyet tartalmazó primerekkel szintetizálunk. A HLH egy 165 bp hosszúságú fragmens, 5' és 3' végein Xbal, illetve PstI helyekkel; a HLH határai a 2-es és 10-es számmal jelzett helyek. A 10-es helyzetben használt primer egy terminációs kodont foglal magában, ugyanúgy az is, amelyet a 9-es helyzetben használunk. A c-myc szekvenciák inszertálása a pU33cI-be a PCR printereken jelzetteknek megfelelő restrikciós helyeken történt.
A pUC18-ban előállított összes szerkezetet pACYC177-be szubklónozzuk az alábbiak szerint. A pACYC177-et BglI-gyel (Klenow-val betöltve) és BamHI-gyel emésztjük, és pUC18 alapú összes szerkezetet HindlII-mal (Klenow-val betöltve) és BamHI-gyel emésztjük. A kapott pYC-konstruktumok kanamicin-rezisztenciát mutatnak.
2. példa cDNS expressziós könyvtár szűrővizsgálata a c-Myc hélix-hurok-hélix dóménjével kölcsönhatásba lépni képes partner-proteinekre
A humán c-Myc hélix-hurok-hélix (HLH) dóménjével kölcsönhatásba lépni képes proteinek szűrővizsgálatára a c-Myc peptid bázikus régióját és HLH régióját tartalmazó 355-409-es helyzetű aminosavjait kódoló DNS-t ligáljuk a fentiek szerint a lambda represszor (cl) protein N-terminális 112 aminosavját kódoló DNS-fragmenshez. Az így kapott kiméra protein expreszszióját egy nagyon gyenge β-laktamáz promoter és a laktóz operátor szabályozása alá helyezzük. Ezt az expressziós egységet a pACYC177-be szubklónozzuk, amely egy alacsony példányszámú plazmid (10-15 példány/sejt) egy kanamicin-rezisztencia génnel. A fenti szerkezettel transzformált sejtek kimutathatóan rezisztensek lambda fág infekcióra pont-plakk vizsgálatban. A fenti pYC192cIHLH szerkezet a rezisztenssé teszi a sejteket > 108 pfu fág fertőzéssel szemben, míg azok a sejtek, amelyek csak a cl N-terminális régióját expresszálják, <102 pfu-val fertőződnek.
A pYC192cIHLH-val transzformált E. coli Y1090 sejteket alkalmaztuk egy humán mandula/B-sejt X gtll expressziós könyvtár szűrővizsgálatára, amelyet a gyártó (Promega) előírásai szerint szerkesztettünk meg. 5 x 106 pfu-t szűrtünk két párhuzamossal a fenti transzformált törzsön, valamint az Y1090:: X lizogén törzsön. A vizsgált lemezek mindegyikén 800 plakk képződött. A kontroll lemezeken (Y1090:: λ lizogén törzzsel szűrve) nem képződött plakk. Két párhuzamos vizsgálati lemezből összesen 160 plakkot egyszer plakk-tisztítottunk, és mindegyik lemezről egyetlen plakkot levettünk és szuszpenziós közegben (SM) szuszpendáltuk. A 160 tisztított plakkot a plakk mérete szerint csoportosítottuk: 20 kicsi, 70 közepes, 70 nagy. (A kis plakkok csoportjába tartozó 4 plakk nem képez plakkot a plakk-tisztítási lépésben). Ezután mindegyik plakkot a pJH370 plazmiddal transzformált
E. coli JM109 törzsön szűrtük pont-plakk vizsgálattal. A fenti transzformált törzs egy kiírtéra proteint expresszál, amely a cl N-terminálisából áll a GCN4 leucin zipzár doménjéhez fuzionálva. Az összes plakkot újra vizsgáltuk az első szűrővizsgálatban alkalmazott törzsön, valamint a A lizogén törzsön és a szülői Y1090 törzsön.
Pozitívnak tekintettük azokat a fágokat, amelyek a szülői Y1090 törzsön és a cI-Myc-expresszáló törzsön plakkot képeznek, de nem képeztek plakkot sem a lizogén törzsön, sem a cI-GCN4-et expresszáló törzsön. A pozitív plakkokat összesen kétszer szűrtük a fenti négy törzsön. A pont-plakk vizsgálatban 5-20 μΐ pozitív fág rendszerint 50-100 plakkot eredményezett. Ha csak egyetlen kicsiny plakkot láttunk a cI-GCN4en, akkor a fágot negatívnak tekintettük. Ezzel a vizsgálattal a 156 vizsgált fág közül 10-et találtunk pozitívnak. Ezek közül 3 a kis csoportba és 7 a közepes csoportba tartozott. Ezek a pozitivok olyan proteineket képviselnek, amelyek a c-myc-vel asszociálódnak olyan módon, hogy a homodimer képződést tönkreteszik.
3. példa
A c-Myc partner heterodimerizációt gátló vegyület azonosítása
Ha a a 2. példában leírtak szerint közepes c-myc partner-proteinként azonosított proteint expresszáló E. coli gazdasejteket valamely a W, X, Y és Z vegyülettel kezelük, és meghatározzuk ezen vegyületek hatását a y\ fág lítikus szaporodási képességére oly módon, hogy megvizsgáljuk a vegyület plakk-képződést gátló képességét szilárd agar lemezeken, egy ilyen kísérlet az 1. táblázatban bemutatott jellegzetes képet mutathatja.
1. Táblázat
C-myc partner-proteinek azonosítása
Vegyület gtll partner Plakk-képződés
semmi - nincs
+ van
W - nincs
+ van
X - van
+ van
Y - nincs
+ nincs
A fenti táblázat eredményei azt mutatják, hogy a partner-protein távollétében a W vegyület nem hat a Λ cl protein dimert képző és lítikus szaporodást represszáló képességére. A W vegyület nem fejt ki hatást a partner azon képességére sem, hogy a myc fúziós proteinnel heterodimert alkosson. Ezért a W vegyület nem tartozik az érdekes vegyületek közé.
Az X vegyület inferferál a homodimer képződéssel és nem zavarja a heterodimer asszociációt. Ezért az X vegyület nem gátolja a c-myc funkciót.
Az Y vegyület a heterodimer képződés inhibitora. Az Y vegyület nem zavarja a homodimer képződést, de zavarja a hete31 rodimer képződést. Ezért az Y vegyület egy olyan vegyület, amely tönkreteheti a c-myc aktivitását in vivő.
A leírásban idézett összes irodalmi hivatkozás teljes tartalmát beépítettük a leírásba. Ily módon a találmányt teljes egészében ismertetve szakemberek számára magától értetődő, hogy a találmány szerinti eljárás a körülmények, paraméterek és hasonlók tág határok közötti változtasával is végrehajtható anélkül, hogy a találmány lényegét vagy annak megvalósítását befolyásolná.

Claims (11)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás partner-protein azonosítására és osztályozására azzal jellemezve, hogy (a) egy bakteriális gazdasejtet egy genetikus szerkezettel transzformálunk, amely egy egy DNS-kötő domént és egy dimerizációs domént tartalmazó fúziós proteint expreszszál, mimellett a fúziós protein egy homodimert képez, amely egy bakteriofág lítiküs szaporodását represszálja;
    (b) az (a) pont szerinti gazdasejtet egy genetikus szerkezettel transzformáljuk, amely képes a partner-protein expresszálására;
    (c) a fenti (b) pont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely megengedi a fúziós protein és a partner-proteint expresszálja;
    (d) meghatározzuk a lítikus bakteriofág gazdasejt-lízist indukáló képességét; és (e) a partner-proteint a lízis jelenléte vagy hiánya alapján osztályozzuk.
  2. 2. Eljárás egy vegyület azonosítására é's osztályozására egy partner-proteinnel való dimerizáció inhibitoraként, azzal jellemezve, hogy (a) egy bakteriális gazdasejtet egy genetikus szerkezettel transzforrnálünk, amely egy egy DNS-kötő domént és egy dimerizációs domént tartalmazó fúziós proteint expreszszál, mimellett a fúziós protein egy homodimert képez, amely egy bakteriofág lítikus szaporodását represszálja;
    (b) az (a) pont szerinti gazdasejtet egy genetikus szerkezet tel transzformáljuk, amely képes a partner-protein expresszálására;
    (c) a fenti (b) pont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely megengedi a fúziós protein és a partner-proteint expresszálja;
    (d) meghatározzuk a vegyületnek a lítikus bakteriofág partner-protein-indukálta szaporodását gátló és gazdasejt lízisét gátló képességét; és (e) a lízis jelenléte vagy hiánya alapján a vegyületet mint a partner-protein képződés inhibitorát osztályozzuk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-kötő dómén a
    X bakteriofág cl represszor proteinjének DNS kötő doménje.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cl represszor protein DNS-kötő doménje a fenti represszor protein N-terminális 112 aminosavja.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fág a λ fág.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimerizációs dómén a bHLH dómén.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bHLH dómén az Myc-ből származik.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, jellemezve, hogy a myc a c-Myc.
    azzal
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bHLH dómén a c-Myc 255-410. aminosavja.
  10. 10. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, a z zal jellemezve, hogy a dimerizációs dómén egy bZIP dómén.
  11. 11. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, a z zal jellemezve, hogy a dimerizációs dómén egy cink finger dómén.
HU923283A 1990-04-19 1991-03-26 Process for filtering test of partner protein HUT63456A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51025490A 1990-04-19 1990-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT63456A true HUT63456A (en) 1993-08-30

Family

ID=24029983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU923283A HUT63456A (en) 1990-04-19 1991-03-26 Process for filtering test of partner protein

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0528827B1 (hu)
JP (1) JPH05507193A (hu)
AT (1) ATE142259T1 (hu)
AU (1) AU7676691A (hu)
CA (1) CA2077439A1 (hu)
DE (1) DE69121888T2 (hu)
FI (1) FI924713A0 (hu)
HU (1) HUT63456A (hu)
IL (1) IL97703A0 (hu)
WO (1) WO1991016429A1 (hu)
YU (1) YU66391A (hu)
ZA (1) ZA912303B (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5322801A (en) * 1990-04-19 1994-06-21 The General Hospital Corporation Protein partner screening assays and uses thereof
US7550561B1 (en) 1991-05-16 2009-06-23 Cold Spring Harbor Laboratory p16INK4 polypeptides
US5889169A (en) * 1991-05-16 1999-03-30 Cold Spring Harbor Laboratory Cell cycle regulatory protein p16 gene
US6211334B1 (en) * 1992-10-16 2001-04-03 Cold Spring Harbor Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto
US5962316A (en) * 1992-10-16 1999-10-05 Cold Spring Harbor Laboratory Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto
US6043030A (en) * 1992-12-17 2000-03-28 Cold Spring Harbor Laboratory Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto
US6331390B1 (en) 1992-12-17 2001-12-18 Cold Spring Harbor Laboratory Cell-cycle regulatory proteins, and uses related thereto
US5521066A (en) * 1993-09-13 1996-05-28 Bristol-Myers Squibb Company Periplasmic membrane-bound system for detecting protein-protein interactions
US7691632B2 (en) 1993-11-18 2010-04-06 Cold Spring Harbor Laboratory Kit for detecting the level of cyclin-dependent kinase inhibitor P16 gene expression
DE19502584C2 (de) * 1994-01-28 1999-08-12 Medigene Ag Ges Fuer Molekular Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines regulatorischen Faktors sowie Verwendung dieses Verfahrens
US6051373A (en) * 1994-12-07 2000-04-18 Scriptgen Pharmaceuticals, Inc. Methods for screening for inhibitors of the transcription-enhancing activity of the X protein of hepatitis B virus
WO2001053479A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Sangamo Biosciences, Inc. Molecular switches ii
ITMI20041370A1 (it) 2004-07-09 2004-10-09 Solvay Solexis Spa Separazione di perfluioropolirteri -pepe-bifunzionali a termninazione-ch20h dalle loro miscele con pepe monofunzionali-ch2oh

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4980281A (en) * 1988-02-10 1990-12-25 Housey Gerard M Method of screening for protein inhibitors and activators
AU7667191A (en) * 1990-04-19 1991-11-11 General Hospital Corporation, The Screening assays for compounds which inhibit the binding of c-myc to dna
WO1992005286A1 (en) * 1990-09-24 1992-04-02 Roger Brent Screening assays

Also Published As

Publication number Publication date
FI924713A (fi) 1992-10-16
YU66391A (sh) 1994-09-09
ZA912303B (en) 1991-12-24
DE69121888D1 (de) 1996-10-10
AU7676691A (en) 1991-11-11
ATE142259T1 (de) 1996-09-15
IL97703A0 (en) 1992-06-21
DE69121888T2 (de) 1997-02-13
EP0528827A1 (en) 1993-03-03
JPH05507193A (ja) 1993-10-21
EP0528827A4 (en) 1992-11-16
FI924713A0 (fi) 1992-10-16
CA2077439A1 (en) 1991-10-20
WO1991016429A1 (en) 1991-10-31
EP0528827B1 (en) 1996-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Casadaban et al. Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli
EP0781331B1 (en) Improvements in or relating to binding proteins for recognition of dna
Parma et al. The Rex system of bacteriophage lambda: tolerance and altruistic cell death.
Michaelis et al. Effects of signal sequence mutations on the kinetics of alkaline phosphatase export to the periplasm in Escherichia coli
Christmann et al. Epitope mapping and affinity purification of monospecific antibodies by Escherichia coli cell surface display of gene-derived random peptide libraries
HUT63456A (en) Process for filtering test of partner protein
CA2721199A1 (en) Isolating biological modulators from biodiverse gene fragment libraries
US5322801A (en) Protein partner screening assays and uses thereof
Pfau et al. Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter
EP0837872A1 (en) A cytotoxicity-based genetic selection system (toxsel)
Kozlowicz et al. Enterococcus faecalis pheromone‐responsive protein PrgX: Genetic separation of positive autoregulatory functions from those involved in negative regulation of conjugative plasmid transfer
Miller et al. Translational repression: biological activity of plasmid-encoded bacteriophage T4 RegA protein
EP2190989B1 (en) Method for manufacturing a modified peptide
WO1991016456A1 (en) Screening assays for compounds which inhibit the binding of c-myc to dna
Mukai et al. Creation of novel Protein Transduction Domain (PTD) mutants by a phage display-based high-throughput screening system
Daines et al. Use of LexA-based system to identify protein-protein interactions in vivo
US20020048792A1 (en) Methods and materials for regulated production of proteins
Henthorn et al. Identification of Functional Regions of the Nun Transcription Termination Protein of Phage HK022 and the N Antitermination Protein of Phage λ using Hybridnun-NGenes
Sohaskey et al. Tn4556 and luciferase: synergistic tools for visualizing transcription in Streptomyces
IE911303A1 (en) Protein partner screening assays and uses thereof
US20080248467A1 (en) System for pulling out regulatory elements using yeast
CA2081807A1 (en) Protein partner screening assays and uses thereof
Chattopadhyay A study of the interaction of a 67kDa glycoprotein (p67) with eukaryotic initiation factor 2 (eIF-2) and other cellular proteins
Freitag A UV-induced mutation in Neurospora crassa Shear & Dodge that affects translational regulation in response to arginine
Wood Protein/DNA interactions during site-specific recombination

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee