HUT62016A - Process for producing new antithrombins - Google Patents

Description

A találmány új anti-trombinokra vonatkozik, főként olyan új antitrombinokra, amelyek pióca szövetből és pióca szekrétumokból származnak.

A hirudin jól ismert és jellemzett polipeptid, amelyről tudjuk, hogy trombinra specifikus, és a Hirudo medicinalis pióca faj extraktumaként kapjuk. Viszonylag alacsony molekulatömegű (kb. 7000) polipeptid és 65 aminosav alkotja. Az első elkülönített hirudin szekvenciáját Dodt, Muller, Seemuller és Chang határozták meg, amelyet a The complete amino acid sequence of hirudin, a thrombin-specific inhibitor; FEBS 165 (1984): pp. 180-184. című publikációjukban ismertetnek, és amelyet az alábbiakban mutatunk be:

1015 val-val-tyr-thr-asp-cys-thr-glu-ser-gly-gln-asn-leu-cys-leu-cys-glu

2530

-gly-ser-asn-val-cys-gly-gln-gly-asn-lys-cys-ile-leu-gly-ser-asp

4045

-gly-glu-lys-asn-gln-cys-val-thr-gly-glu-gly-thr-pro-lys-pro-gln

55 6065

-ser-his-asn-asp-gly-asp-phe-glu-glu-ile-pro-glu-glu-tyr-leu-gln

I

SO3H

Két további hirudin változat jellemzőit és aminosav sorrendjét szintén ismerjük. Az első változatot Dodt, Machleidt, Seemuller, Maschler és Fritz írják le az Isolation and characterisation of hirudin isoinhibitors and sequence analysis of hirudin PA, Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 367 (1986) pp. 803-811. című cikkükben. Ez a változat az alábbi aminosavak tekintetében különbözik a fent ismertetett hirudintól:

1. -He- az 1. helyen -val- helyett

2. -thr- a 2. helyen -val- helyett

3. -lys- a 24. helyen -gin- helyett

4. -asn- a 33. helyen -asp- helyett • · ·

5. -lys- a 35. helyen -glu- helyett

6. -gly- a 36. helyen -lys- helyett

7. -asn- a 47. helyen -lys- helyett

8. -glu- a 49. helyen -gin- helyett

9. -asn- az 53. helyen -asp- helyett

A második változatot Harvey Degryse, Stefani, Schamber és mts.-i ismertetik a Cloning and expression of a cDNA coding fór the anti-coagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinalis, Proc. Nat. Acad. Sci. U.SA. (1986) pp. 1084-1088. című publikációjukban. Ez a változat az 1 -32. helyeken megegyezik az elsőként említett változattal és ezt követően az alábbi aminosavak tekintetében különbözik az első hirudintól:

1. -gln-a 33. helyen-asp-helyett

2. -lys- a 35. helyen -glu- helyett

3. -asp- a 36. helyen -lys- helyett

4. -gin- az 53. helyen -asp- helyett

5. -pro- az 58. helyen -glu- helyett

6. -asp- a 62. helyen -glu- helyett

7. -asp- a 64. helyen -leu- helyett

8. -glu- a 65. helyen -gin- helyett

A fentiekben vizsgált hirudin a Hirudo medicinalis pióca fajtól származik. A Hirudinaria manillensis hasonlít a Hirudo medicinalisra, mégpedig abban, hogy mindkét faj képes kétéltűek és emlősök vérével táplálkozni. A Hirudinaria evolúciós szempontból fejletebb a Hirudo medicinalisnál. Azt semmilyen bizonyossággal nem lehet előre megmonda β ·

-4ni, hogy az első pióca fajnál talált hatóanyag várhatóan megtalálható-e más fajokban, és (ha a talált anyagok hasonló hatékonyságnak) mi a valószínűsége annak, hogy aminosav sorrendjük alapjában véve ugyanolyan, vagy lényegesen különböző.

Kutatásunk során új anti-trombint izoláltunk a Hirudinaria manillensis fajból, amely anti-trombin az alábbi aminosav sorrendet mutatja:

5 10 * 15 *

X-Y-tyr-thr-asp-cys-thr-glu-ser-gly-gln-asn-tyr-cys-leu-cys-val-gly-ser* * * ********

25 3035 asn-val-cys-gly-glu-gly-asp-asn-cys-asn-D-gln-leu-ser-ser-ser-gly-asn40 * 45 * ♦ 50 * * *55 gln-cys-val-E-gly-glu-gly-thr-pro-F-pro-gln-ser-gln-thr-glu-gly-asp60 *65 phe-glu-glu-ile-pro-asp-glu-Z-ile-lys (ahol X,Y és Z mindegyike valamilyen aminosav-maradékot jelent, D jelentése cys vagy pro, E jelentése glu, asp vagy his, F jelentése asp, trp vagy lys, és a * az anti-trombin molekula azon helyeit jelzi, amelyek eltérnek a fent említett első hirudin változat megfelelő pozícióitól).

Összehasonlítva a hirudinnal, a szekvencia hozzávetőlegesen 62% homológiát (azaz kb. 38% eltérést) mutat, amely meglehetősen lényeges eltérés. Főként a fontos C-terminálisnál mutatkoznak jelentős különbségek, és ezen felül léteznek még az alábbi eltérések:

13. helyen (-tyr- van -leu- helyett);

17. helyen (-val- van -glu- helyett);

24. helyen (-glu- van -gin- helyett);

26. helyen (-asp- van -asn- helyett);

27. helyen (-asn- van -lys- helyett);

29. helyen (-asn- van -ile- helyett);

30. helyen (-pro- vagy -cys- van -leu- helyett);

31. helyen (-gin- van -gly- helyett);

32. helyen (-leu- van -ser- helyett);

33. helyen (-ser- van -asp- helyett);

34. helyen (-ser- van -gly- helyett);

35. helyen (-ser- van -glu- helyett);

36. helyen (-gly- van -lys- helyett);

41. helyen (-glu-,-asp-vagy-his- van -thr- helyett);

47. helyen (-asp-, -lys- vagy -trp- van -pro- helyett);

51. helyen (-gin- van -his- helyett);

52. helyen (-thr- van -asn- helyett);

53. helyen (-glu- van -asp- helyett);

61. helyen (-asp- van -glu- helyett);

64. helyen (-ile- van -leu- helyett);

65. helyen (-lys- van -gin- helyett).

A 61. (glutamát helyett aszpartát), 64. (leucin helyett izo-leucin) és 65. (glutamát helyett lizin) helyeken lévő eltéréseknek különös jelentőséget tulajdonítunk, ugyanis ügy tűnik, hogy az 55-64. aminosav szekvencia kritikus tartomány a hirudin gátló hatása tekintetében (ezzel kapcsolatban lásd: Owen et al., N-terminal replacement of small peptide anticoagulants based on hirudin, 1988, J. Med. Chem. 31: pp. 1009-1011). A találmány szerinti anti-trombinban az új trombin-gátló tartományt az aszpartát (-asp-), izo-leucin (-ile-) és lizin (-lys-) jelenléte eredményezi; az 54-65. aminosav szekvencia önmagában is újnak tekinthető, amely ezen felül új anti-trombin sajátosságokat is mutat. Tehát a találmány vonatkozik még a fent meghatározott 54-65. aminosav szekvenciájú kis peptidre is.

• · ·

A 63. helyen lévő aminosv (amelyet a fenti képletben Z-vel jelölünk) lehet tirozin (tyr), amely jellemzően szulfatált. (Ezzel ellentétben a rekombináns hirudin általában nem szulfatált ezen a helyen).

A találmány szerinti piócából származó anti-trombin (és a megfelelő származtatott DNS szekvenciák) az eglinnel - amely elasztáz/kimotripszin néven ismert - nem homológ. Az eglinről tudjuk, hogy jelen van a Hirudo medicinalis orvosi pióca fajban. Részletesen Seemuller és mts-i ismertetik az Eglin: elastate-cathepsin G inhibitor from leeches; 1981 Meth. Enzymol. 80: pp. 804-816. című cikkükben.

A találmány szerinti anti-trombint elsősorban a Hirudinaria manillensis faj szövetéből nyerjük oldószeres extrakcióval és ezt követő kromatográfiás frakcionálással, vagy hasonló módszerekkel; emellett izolálhatjuk Hirudinaria manillensis szekrétumokból (így pl. nyálból) is hasonló módon.

További szempontból tehát a találmány a Hirudinaria manillensis pióca faj szöveteiből vagy szekrétumaiból származó anti-trombinra vonatkozik. Az anti-trombin aktivitásában trombinra specifikus.

A találmány magában foglalja továbbá a fenti képletű polipeptidek rekombináns technikával illetve tervezett fehérjefelépítési technikával előállított ekvivalenseit.

A találmány szerinti anti-trombint alkalmazhatjuk gyógyászati készítményben a gyógyászatban elfogadott hordozókkal vagy kötőanyagokkal összekeverve. Ilyen készítmény lehet pl. intravénás adagolásra alkalmas készítmény (ez esetben a hordozó általában megfelelő tisztaságú steril sóoldat vagy víz).

A találmány szerinti anti-trombin alkalmas trombus embóliás esetek gyógyítására, így pl. a véralvadás kezelésére. Kísérleteink során az anti-trombint együtt adagoltuk plazminogén aktivátorral, pl. szöveti

-7plazminogén aktivátorral; és azt találtuk, hogy a találmány szerinti antitrombin kompatibilis az utóbbival.

Az alábbi részletes példákban azokat az eljárásokat ismertetjük, amelyek a találmány szerinti anti-trombin pióca szövetből való izolálására vonatkoznak.

1. példa

1. lépés

Acetonos extrakció

600 g Hirudinaria manillensis piócát dehidratálunk kb. 2 1 96 %-os etanolban 24 órán keresztül. Az állatok elülső részét a maradék testrészről levágjuk és tovább dehidratáljuk kb. 200 ml 96 %-os etanolban 24 órán keresztül.

A dehidratált pióca fejeket végül apró darabokra vagdossuk és ehhez hozzáadjuk 40 ml aceton 60 ml vízzel készített elegyét. Az elegyet 30 percig keverjük szobahőmérsékleten, 15 percig 2700-as fordulatszámmal, és a felülúszót dekantáljuk.

A labdacsot további 100 ml aceton:víz = 40:60 eleggyel újra szuszpendáljuk, majd szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. Az elegyet 2700-as fordulatszámmal 15 percig keverjük, a felülúszót dekantáljuk és egybegyűjtjük az előzőleg kapott felülúszóval. Az egyesített felülúszóhoz hozzáadunk 80 ml acetont és 20 ml vizet, és az elegy pH-ját jeges ecetsavval 4,4-re állítjuk be.

Az elegyet 2700-as fordulatszámmal 15 percig keverjük majd a felülúszót dekantáljuk. Az oldat pH-ját 30 %-os ammóniával 6,0-ra állít • · · • · · juk. Az elegy térfogatát rotációs bepárlóban 35 °C-on kb. 30 ml-re csökkentjük.

Ezután az elegyhez triklór-ecetsav kristályokat adunk, abból a célból, hogy az oldat pH-ját 1,8-ra csökkentsük, majd a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A nyers anti-trombin kristályosításához acetont használunk a nyers termék térfogatára számított 9-szeres feleslegben.

Az elegyet 2700-as fordulatszámmal keverjük 15 percig, majd a felülúszót félretesszük. A labdacsot 50 ml acetonban újra szuszpendáljuk, és 2700 fordulatszámmal 10 percig keverjük. A mosófolyadékot eltávolítjuk és a csapadékot vákuum exszikkátorban szárítjuk 1 órán át. A nyers anti-trombint 40 ml vízben regeneráljuk.

A proteintartalmat 280 nm-en mért abszorbanciánál 78 mg/ml-re becsültük. Az aktivitás értékét trombin/fibrinogén alvadék prevenciós módszerrel 2400 anti-trombin egység/ml-re (vagy kb. 10000 anti-trombin egység / 200 g aprított fej-re) becsültük. A teljes aktivitás 9600 anti-trombin egység; a specifikus aktivitás számított értéke 30,7 anti-trombin egység / mg protein volt.

2. lépés

Etanolos extrakció

A nyers anti-trombin oldatot 3 °C-ra hűtjük. 5 perces időközönként hozzáadunk hatszor 1,2 ml jégbehűtött 96%-os etanolt. Az elegyet ezután 3 °C-on tartjuk további 10 percig, ezután 2400-as fordulatszámon 10 percig centrifugáljuk; a felülúszót dekantáljuk és megtartjuk.

A labdacsot 4 ml jégbehűtött desztillált vízzel újra szuszpendáljuk, és összekeverjük 7,2 ml jégbehűtött 96 %-os etanollal. Ezt 3 °C-on 30 percig állni hagyjuk, majd 2400-as fordulatszámon 10 percig centrifu* · · •·· ···

-9gáljuk. A felülúszót dekantáljuk és egyesítjük az előzőleg félretett felülúszóval.

A labdacsot 4 ml jégbehűtött 96 %-os acetonban újra szuszpendáljuk és 30 percig 3 °C-on állni hagyjuk. Az elegyet ezután 2400-as fordulatszámon 10 percig keverjük, a felülúszót dekantáljuk és egybegyűjtjük.

Az egyesített felülúszókat jégen 0 °C-ra hűtjük és ezután 50,7 ml 0,5 % ammónium-acetátot tartalmazó etanolt adunk hozzá -10 °C-on. Az elegyet 30 percig állni hagyjuk, és ezután 2400-as fordulatszámon 10 percig keverjük.

A felülúszót félretesszük és a csapadékot 50 ml jégbehűtött etanollal mossuk. A csapadékot ezután vákuum exszikkátorban szárítjuk egy órán át.

Ezt a továbbiakban vízben regeneráljuk, anti-trombin aktivitásra, protein tartalomra teszteljük és ezután ampullákba töltjük és fagyasztva szárítjuk; a termék térfogat 1,5 ml.

A proteintartalmat 280 nm-en mért abszorbanciánál 19 mg/ml-re becsültük.

Az aktivitást trombin/fibrinogén alvadás meghatározás módszerével becsültük, ennek értéke: 1000 anti-trombin egység (ATE)/ml. A specifikus aktivitás számított értéke 52,6 ATE/mg protein.

2. példa

Az 1. lépést az 1. példa szerint megismételjük, majd az alábbiak szerinti 2. és 3. lépéssel folytatjuk az eljárást.

• ·· • · ·

2. lépés

Kationcserélő kromatográfia

A nyers anti-trombint 10 millimólos ammőnium-acetát - ecetsavval (pH=4,0) regeneráljuk és az oldhatatlan anyagokat kiszűrjük.

Kereskedelemben kapható - CM Sephadex C50 márkanéven ismert - karboxi-metil-cellulóz gélt pufferben (10 mmol/1 ammőnium-acetát ecetsav; pH=4,0) duzzasztunk, és ezt 30 cm hosszú, 2,6 cm átmérőjű oszlopba töltjük. Ezután a mintát is az oszlopra töltjük.

100 ml puffért futtatunk át az oszlopon, amit összegyűjtünk (veszteség). A puffért ezután 10 mmol/1 ammónium-acetátra (pH=4,2) változtatjuk. Ezután 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, ezeket anti-trombin aktivitásra és protein tartalomra teszteljük. Minden frakcióra specifikus aktivitást számítunk és a küszöbérték fölötti specifikus aktivitással rendelkező frakciókat egybegyűjtjük, fagyasztjuk és fagyasztva szárítjuk.

3. lépés

Anioncserélő kromatográfia

A liofilizált nyersterméket - amelyet vagy etanolos extrakcióval vagy CM Sephadex-es extrakcióval nyertünk -, 10 millimólos Tris/HCl pufferrel regeneráljuk, 7,5-ös pH értéken, és DEAE-Sephadex A-25 oszlopon (0,9 x 7cm) kromatografáljuk, az oszlopot előzőleg ugyanazzal a pufferrel egyensúlyba hozva.

Az oszlopot 15 ml/h átfolyási sebesség mellett készítjük elő addig, amíg az eluátum abszorbanciája 234 nm-en 0,15 alá nem csökken. Ezután a kötött anyagot lineáris árammal eluáljuk, a kiegyenlítő puffer (tartályonként 60 ml) 0-1 mól nátrium-kloridot tartalmaz. Az eluátumot 2 • ·· ···

-11ml-es frakciókba gyűjtjük az abszorbancia és az inhibitoros aktivitás mérésekhez. A kapott elűciós profilokat - az etanollal extrahált anyagra - az

1. ábra, - a CM Sephadex-szel extrahált anyagra - a 2. ábra mutatja.

Az anti-trombin aktivitást mutató frakciókat egybegyűjtjük és a további tisztítások előtt betöményítjük és Sephadex G-25-ön sótalanítjuk. A részben tisztított mintákat affinitáskromatográfiával tovább tisztítjuk trombin Sepharose-on. Az oszlopot kiegyenlítő oldattal (0.1 mólos Tris/HCl, pH=8.0) mossuk és a kötött anti-trombint 1 mólos benzamidinnel eluáljuk. Az eluátumot liofilizáljuk és az előzőek szerint sótalanítjuk. A kapott anyagot ezután nagy nyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk. A betöményített minta 50 mikroliterét mikrofuratú RP-300 C-8 oszlopon (3 x 0,21 cm) tisztítjuk, amelyet előzőleg szobahőmérsékleten 0,1 %-os TFA-val hozunk egyensúlyba. A kötött anyagot 0.09 % TFA tartalmú 60 %-os acetonitril 0-100 % lineáris áramával eluáljuk 35 percig 0,25 ml/min áramlási sebesség mellett.

Az eluátum abszorbanciáját 215 nm-en észleljük. Minden csúcsot vagy részlegesen felbontott csúcsot szeparált frakcióként gyűjtünk, és ezek gátló aktivitását megmérjük. A kapott elúciós profilt a 3. ábrán mutatjuk be, amelyen látható, hogy az anti-trombin aktivitás csúcsai (5, 6, 7 csúcsok) elkülönülnek a többi csúcstól.

Szekvencia meghatározás

A fő anti-trombin aktivitást mutató csúcsokat (amelyek a 3. ábrán az 5, 6 és 7 csúcsok) vákuumban szárítjuk, és az N-terminális aminosav szekvenciát automata üzemmódú Biosystems gázfázisú szekvencia analizátorral (470A típus) - amelyhez on-line analizátort (120 típus) csatlakoztatunk - vizsgáljuk a ΡΊΉ aminosavak meghatározása céljából.

• ·· 4 • · · ·· * · · · * ♦ · 4 · · · · · * <t

-12A tisztított anti-trombin mintát közvetlenül a szekvencia szűrőre töltjük. A szekvenciában lévő cisztein maradékokat piridil-etil-cisztein leszármaztatása után határozzuk meg, amelyet a tisztított minta ditiotreitollal és 4-vinil-piridinnel való reagáltatása során nyerünk.

A redukált és piridil-etilezett anti-trombin tripszines kivonatát TPCK-tripszinnel nyerjük. A reakciót 0,05 mólos ammónium-bikarbonát pufferben folytatjuk le 37 °C-on 4 órán keresztül majd fagyasztva szárítással és 0,1 %-os TFA-ban való űjraszuszpendálással fejezzük be. A fragmenseket fordított fázisú HPLC-vel szeparáljuk hasonló körülmények között, mint amit a 3. példa 5. lépésében ismertettünk.

A C-terminális szekvencia meghatározásához a karboxi-peptidáz Y digerálás és DABS-C1 módszerek kombinációját alkalmazzuk, amelyet Chang ismertet a FEBS letts (1983), 164 pp. 307-313. cikkében. Tehát a szekvenciát a fentiek szerint határozzuk meg.

3. példa

A 2. példa 1. és 2. lépéseit megismételjük, és az alábbiak szerinti 3. és 4. lépésekkel folytatjuk az eljárást.

3. lépés

Anioncserélő kromatográfia

A 2. lépésből nyert oldat pH-ját 0,1 mólos nátrium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk, majd kereskedelemben kapható és Q-Sepharose néven ismert anioncserélőt tartalmazó oszlopra visszük fel, kiegyenlítő oldatként 20 millimólos Tris/HCl, pH=7,0 puffért alkalmazva. A puffért addig pumpáljuk át az oszlopon, amíg a meg nem kötött protein (280 nm-en ♦·⁴⁴ · ·»<····« • · · · · ⁴ * »·· «·· • · · · · •⁴ ♦ · · «·· ···

-13mért abszorbanciával detektálunk) lejön, és ezután sóoldat-gradienst (nátrium-klorid ugyanabban a pufferben) alkalmazunk lineáris vagy lépésenkénti módon, hogy a kötött anti-trombint eluáljuk. A jellemző kromatográfiás profilt a 4. ábra mutatja.

Az anti-trombin aktivitást mutató frakciókat egybegyűjtjük és ultraszűréssel 25-50 ml térfogatig töményítjük. Ezen a ponton az antitrombin preparátumok 100-400 anti-trombin egység/mg protein specifikus aktivitást mutatnak.

4. lépés

Gélszűrés

A feldolgozást a 3. lépésben kapott oldat ultraszűrésével folytatjuk, az ultraszűrést a kereskedelemben kapható Superdex 200 oszlopon végezzük, kiegyenlítő oldatként és eluensként 50 millimólos Tris/HCl-t, 0,1 mólos NaCl oldatot (pH=7,5) használunk. A jellemző kromatográfiás profilt az 5. ábra mutatja.

Az anti-trombin aktivitást mutató frakciókat egybegyűjtjük és liofilizáljuk. Ezen a ponton az anti-trombin preparátumoknak 1000-4000 anti-trombin egység/mg protein specifikus aktivitást mutatnak.

5. lépés

Végső tisztítás

A 4. lépésben kapott anyagot trombin-Sepharose affinitású oszlopon áramoltatjuk át 0,1 mólos Tris/HG-ben (pH=8,0) és a kötetlen anya• ·44· ···« '•4 ·

4 4· «44

-14got ugyanazzal a pufferrel eluáljuk. A kötött anti-trombint 1 mólos benzamidinnel eluáljuk az oszlopról, majd liofilizáljuk, és Sephadex G25 oszlop felhasználásával sótalanítjuk.

Az affinitáskromatográfiával tisztított anyagot tovább tisztítjuk HPLC (nagy nyomású folyadékkromatográfia) segítségével fordított fázisú (RP-300 C-8) oszlop felhasználásával. A mintát 0,1 %-os trifluorecetsavban (TFA), szobahőmérsékleten felvisszük az oszlopra, és a kötött anti-trombint 0,9 % TFA-t tartalmazó 60 %-os acetonitril lineáris áramával eluáljuk (6. ábra). A protein csúcsokat (amelyeket 215/280 nm-en mért abszoranciával detektálunk) gyűjtjük, és azokat, amelyek anti-trombint tartalmaznak, vákuumban szárítjuk.

Anti-trombin aktivitás meghatározása

Az anti-trombin aktivitást úgy határozzuk meg, hogy mérjük a trombin fibrinogénre gyakorolt alvadási aktivitásának gátlását lényegében Markwardt módszere szerint (Methods in Enzymology; XIX, pp. 924; Hirudin as an inhibitor of Thrombin (1970)), vagy kromogén szubsztrátumból (például S-238 szubsztrát) származó specifikus paranitro-fenol trombin általi hasításának gátlását.

A találmány szerinti anti-trombin aktivitást nem semlegesítették nagy koncentrációban alkalmazott hirudinra specifikus semlegesítő hatású monoklónozott antitestek (ez további immunológiai bizonyíték arra nézve, hogy a találmány szerinti ani-trombinok és a hirudin különbözőek).

Mindazonáltal a találmány szerinti anti-trombin és a hirudin - ekvivalens dózisok esetén - hasonló parciális tromboplasztikus időket mutat·**· · 9999 ···· ··· 9· < · · 999 · · • * · · · ·· ··· ··»··«

-15nak. Ez azt jelzi, hogy a humán vérre nézve hasonló antikoaguláns sajátosságokat mutatnak.

Claims (9)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosav sorrendet mutatja:

   X-Y-tyr-thr-asp-cys-thr-glu-ser-gly-gln-asn-tyr-cys-leu-cys-val-g ly-ser-asn-val-cys-gly-glu-gly-asp-asn-cys-asn-D-gln-leu-ser-ser-ser-gly -asn-gln-cys-val-E-gly-glu-gly-thr-pro-F-pro-gln-ser-gln-thr-glu-gly-as p-phe-glu-glu-ile-pro-asp-glu-Z-ile-lys;

   ahol X jelentése aminosav-maradék, Y jelentése aminosav-maradék és Z jelentése aminosav-maradék, D jelentése cys vagy pro, E jelentése glu, asp vagy his, F jelentése asp, lys vagy trp; vagy gyógyászatilag elfogadható sói, származékai vagy bioprekurzorai.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy X jelentése val.
3. 3. Az 1. vagy 2.igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy Y jelentése ser.
4. 4. Polipeptid, azzal jellemezve, hogy trombinra specifikus és az alábbi aminosav sorrendet mutatja:

   gly-asp-phe-glu-glu-ile-pro-asp-glu-Z-ile-lys ahol Z jelentése aminosav-maradék; vagy gyógyászatilag elfogadható sói, származékai vagy bioprekurzorai.
5. 5. Az 1-4. igénypontok szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy Z jelentése tyr vagy annak szulfatált származéka.

   • ·
6. 6. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1-5. igénypontok szerinti polipeptidet tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal összekeverve.
7. 7. Gyógyászati eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tromboembóliás folyamatok kezelésére alkalmazzuk.
8. 8. Gyógyászati eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet plazminogén aktivátorral együtt beadva a betegek kezelésére alkalmazzuk.
9. 9. Piócából származó specifikus anti-trombin, azzal j e 11 e m e z v e , hogy a Hirudinaria manillensis pióca faj szövetéből és szekrétumaiból származik.