HUT61593A - Process for producing proteins and nucleic acids - Google Patents

Description

A találmány tárgya szövet plazminogén aktivátor (t-PA) analógok, amelyek legalább egy szubsztitúciót taralmaznak a növekedési faktor (GF) területen, amely legalább részben csök kenti a máj receptorhoz való kötődésüket, anélkül, hogy jelen tősen rontaná fizikai-kémiai stabilitásukat a vérben, vagy fib rinolízisben kifejtett aktivitásukat. A vegyületek hosszabb plazmábani fél-élettartammal rendelkeznek. Különösen előnyös találmány szerinti vegyületek, amelyekben a 63-72 egységeket tartalmazó béta-lapon találhatók szubsztitúciók, különösen a Leu 66 és/vagy Tyr 67 és/vagy Phe 68 esetében szubsztituáltak.

A találmány szerinti eljárással előállított t-PA analógok embe ri és állatgyógyászatban alkalmazhatók.

i

53.205/SM

S.B.G. &K.

BUDAPESTI NEMZETKÖZI ÜGYVÉDI ÉS SZABADALMI IRODA

1061 BUDAPEST, DALSZÍNHÁZ U. 10. TELEFON: 183-3733

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

CH	Γ.	:)~X ’í í
0 í	u
h a A
ClrkJ

44/ 5# /o o

A- 6 4 !<.

Eljárás fehérjék és nukleinsavak előállítására

British-Bio-technology Limited, OXFORD, A41&LIA tTftkJM ι Λ

Feltalálók: EDWARDS Richard Mark,

DAWSON Keith,

FALLON Anthony,

CRA1G Stewart,

9XW, ΤΗΛΜΈ ₍ OAOfJ

IMJCK-fi·) ^ÁfLLocU , fKc.15 _? SWDH-ILLS_I

ANFrtíA

A bejelentés napja:

1989. 06. 23.

(PCT/GB89/00705)

Elsőbbsége:

1988. 06.

24. (GB 8815135.2)

A44C-Í-I-A

PcT /6r-3><?2 ^oo7or

A találmány tárgya eljárás fehérje-szerű vegyületek előállítására, amelyek javított t-PA-szerű aktivitással rendelkeznek, és ezek valamennyi részét kódoló nukleinsav (DNS és RNS) előállítására.

A Stövet típusú plazminogén aktivátor (t-PA) kulcs komponens a természetes fibrin lebontási rendszerben, amely kiegészítő ellenpárja a vérben az alvadás kaszkád folyamatnak. A vérzéscsillapítás fenntartásához kritikus az, hogy megfelelő egyensúlyt tartsunk fenn a fenti két ellentétes tendencia között. Bizonyos betegségek esetében, mint például akut szívizom infarctus (MI) a vérzéscsillapítási egyensúly megszűnik helyileg és tnrombus képződést eredményez. Ilyer esetekben a fibrin bontó szerek adagolása előnyös terápiát jelent a vérrög oldódás elősegítésében.

Az ilyen trombózisellenes terápia viszonylag széleskörűvé vált, mivel számos fibrin bontó szer ismeretes, mint például streptokináz, urokináz, APSAC és maga a t-PA. Az emberi t-PA elvi előnyökkel rendelkezik az egyéb fibrin bontó szerekkel szemben, mivel a fibrinhez affinitást mutat, és elsősorban a vérrög felületéhez kötött plazminogént aktiválja. Ez azt eredményezi, hogy kevésbé az egész szervezetre kiterjedő hatást fejt ki, ennélfogva a fibrinképző és más vérrögképzési faktorokat nem bontja le a szervezetben. Ezen túlmenően a t-PA természetes emberi plazma fehérje, és így kevésbé való színű, hogy nemkívánatos immun választ eredményez, amely az ilyen hatóanyaggal végzett egymásutáni kezelések lehetőségét kizárja. A t-PA cDNS és genom kiónjainak szekvencia analízisét és izolálását szakirodalomban leírták(Pennica és munkatársai 1983, Natúré 301, 214; Ny és munkatársai, 1984 , P . N . A.5. 81, 5355-5359) és így ezek aminosav szekvenciája ismert.

A t-PA esetében a fő probléma MI vagy más thrombosisos betegségek kezelésében az, hogy a plazma molekula felezési ideje igen rövid, és például emberben 5 perc nagyságrendű (Bounameaux és munkatársai: Contemporary Issues in Haemostasis and Thrombosis Vol I 85-91, 1985 (Collen és munkatársai szerk., Churchill Livingstone)), tz azt eredményezi, hogy a t-PA anyagot infúzió segítségével nagy dózisban kell adagolni. A kezelés ennélfogva drága, és azt igényli, hogy a kezelés előtt a beteget kórházba vihessük.

Ennélfogva kívánatos, hogy kidolgozzanak egy javított trombózisellenes szert, amely a t-PA előnyös tulajdonságaival rendelkezik, de meghosszabbított plazma fél-élettartamú.

A t-PA molekula és génjének analízise kimutatta, hogy ez mozaik fehérje, amely öt területből áll. A nagy szerin proteáz területet felismerhetjük arról, hogy más szerin proteázokkal homológ, és ez a terület katalitikusán aktív a plazminogén aktiválásban. A 4 N terminális területek egy űjj területből állnak, amelyet azért nevezünk így, mert hasonló az I típusú fibronectin homológokhoz, amelyek arról ismertek, hogy a molekula fibrin kötési tulajdonságait hordozzák. Továbbá egy növekedési faktor területet tartalmaz, amely azzal azonosítható, hogy homológ egy olyan terület osztállyal, amelyet közönségesen plazma fehérjékben ismerhetünk fel, amelyek az epidermális növekedési faktorban találhatók, eredeti szekvenciaként, valamint két kringle területet tartalmaz, amelyek homológ területek a plazminogénben, a prothrombinban és néhány más plazma fehérjében található területekkel. Számos t-PA származékot leírtak, amelyekből egy vagy több N-terminális terület hiányzik (Matsuo és munkatársai, 1985, FEBS Letters, 189, 145-149; van

Zonneveld és munkatársai, 1986,	P.N.A.S. 83, 4670-4674;
Larsen	és	munkatársai,	1988,	J.	Bioi.	Chem. 263,	1023-1029;
Browne	és	munkatársai ,	1988 ,	J.	Bioi.	Chem, 263,	1599-1602 ;
Kalyan	és	munkatársai ,	1988 ,	J.	Bioi.	Chem. 263,	3971-3978)
Általában	elfogadott a	fenti	és	más tanulmányok	eredményei
alapján ,	hogy az új^ terület,	valamint	a második	kringle te-

rület fontos mediátor a fibrin kötődésben és a t-PA által kifejtett plazminogén aktiválás fibrin stimulálásban. Az első kringle terület funkciója nem ismert. A növekedési faktor területtel kapcsolatban feltételezik, hogy valószínűleg a t-PA valamely májban található receptorhoz való kötődésében játszik szerepet, amely a t-PA vérrendszerből való kiürülésével kapcsolatos.

Különféle javaslatokat dolgoztak ki a fentiek alapján különféle hiányos t-PA származékokra, melyekből különféle N-terminális területek, a GF területet is beleértve hiányoznak. Bizonyítékokat találtak arra, hogy az ilyen molekulák meghosszabbított fél-élettartammal rendelkezhetnek in vivő körülmények között. Larsen és munkatársai leírtak egy olyan t-PA variánst, amely molekulából mind az újj terület, mind a GF terület hiányzik vagy ezek egyike hiányzik. Mindhárom fenti típusú variáns fibrinbontásban a t-PA anyaggal összehasonlítva kis koncentrációban hatástalannak bizonyult, azonban amennyiben nagyobb koncentrációban alkalmazzák őket, felületes szemlélésben hasonló hatást fejtenek ki, mint a t-PA anyag. Kalyan és munkatársai (supra) leírtak egy hasonló hiányos származékot, amelyből az újjés a GF terület hiányzik, és kimutatták, hogy ez a származék egér modellben 25-ször megnövelt fél-élettartammal rendelkezik. Azonban amint egy ΐ-pA molekuláról, amelyből az újjterület hiányzik várható is. Ez a mutáns molekula fibrin kötődésben hatástalan volt. Browne és munkatársai olyan t-PA származékot írtak le, amelyekből hiányzik az 51-87 aminosav maradék szekvencia, amely a GF területet képezi. Tengerimalac modellben a mutáns t-PA sokkal lassabban ürült ki, mint a természetes t-PA anyag. Az ilyen mutánsokkal kapcsolatban a főprobléma az, hogy ezek fibrin stimulálásban kifejtett katalitikus aktivitása^stabilitása, teljes konformációja vagy a fenti tulajdonságok bármely kombinációja jelentősen vál tozott. En-nélfogva ezek az anyagok csak behatárolt felhasználhatóságűak. Egy másik javaslat az volt, hogy olyan t-PA származékokat állítsanak elő, amelyekben a glikozilezós módját megváltoztatják, és amelyeket vagy eltérő sejtvonalból történő t-PA előállítás segítségével, vagy a glikozilezési helyeken enzimes vagy genetikus módosítással végrehajtott változtatással nyerhetünk (Lau ésmunkatársai, 1987 , Biotechnology, 5, 953-957). Az ilyen módosított t-PA származékok általában nem rendelkeznek jelentősen megnövekedett plazma fél-élettartammal, mivel a t-PA kiürülési út nem médiáit szénhidrát receptorral.

Ezzel szemben kimutatták, hogy amennyiben az Asn 117 helyzetről a t-PA molekulából a nagy mannóz oldalláncot eltávolítják, vagy endo-^-N-acetil-glukóz-aminidáz H (Endo-H) (Tanswell és munkatársai, 1989, Fibrinolysis 3:79-84) vagy az Asn 117 Gln-ra való mutációjával (Hotchkiss és munkatársai, 1989, Thrombosis and Haemostasis 60:255-261) segítségével eltávolítjuk, a plazma kiürülési sebessége körülbelül kétszeres értékben csökken.

A t-PA plazma koncentrációját általában részben szabályozzák természetes t-PA inhibitorok, de amennyiben elegendően nagy t-PA terápiás dózisokat alkalmazunk, ezek az inhibitorok hatását felülmúlhatják. Azonban lehetséges, hogy nagyobb fél-élettartammal rendelkező analógok kisebb dózis bán adagolhatok, mint a t-PA vegyület, vagy az inhibitorokkal kevésbé támadottak lehetnek. Feltételezik, hogy a t-PA egyláncú analógjai kevésbé reaktívok a természetesen előforduló t-PA inhibitorokkal szemben. A 274-277 terület maradékaiban végrehajtott mutáció a t-PA molekulában megakadályozza az Arg 275 Ile 276 kötés hasítását, és így aktív egyláncú t-PA molekulát eredményez (GB-A-2173804 és EP-A0292009 szabadalmak).

Ennélfogva kívánatos olyan t-PA származék előállítása, amely megnövelt fél-élettartammal rendelkezik anélkül, hogy konformációban, aktivitásban vagy fizikai-kémiai stabilitásban káros jellemzőket hordozna.

A t-PA vegyület növekedési faktor területét azért nevezzük ezzel a névvel, mert ennek elsődleges szekvenciája homológ az Spiderm'is Növekedési Faktorral (EGF). Hasonló területek találhatók számos más plazma fehérjében, mint például a IX és X vér alvadási fehérje faktorokban és a plazminogén aktivátor urokinázban. Megfigyelték, hogy azok a szintetikus peptidek, amelyek GF területük vonatkozásában megfelelnek az urokináz vegyületnek, kompetitíven kötődnek az urokináz receptorhoz az urokinázzal összehasonlítva a monocytákon (Appella és munkatársai, 1987, J. Bioi. Chem. 262, 4437-4440) ami az első információ volt a fenti terület funkciójával kapcsolatban. Magával a t-PA fehérjével kapcsolatban a fehérje vizsgálatokat nem végezték el, de a fenti tényt alátámasztják a GF terület kötődési funkciójával kapcsolatosan azok a tények, hogy megfigyelték, hogy a t-PA származékok, amelyekből a GF terület hiányzik általában megnövelt plazma fél-élettartamúak, és ugyanakkor a receptor médiáit kiürülésük csökkentett sebességű. Ezek a tanulmányok azonban csak viszonylagos bizonyítékot szolgáltatnak, mivel részletes szerkezeti vizsgálatokat nem végeztek abból a célból, hogy a kiürülési sebességre való indirekt befolyás lehetőségeit bizonyítsák vagy kizárják. Az A-0207589 számú Európai Szabadalomban olyan t-PA származékokat írtak le, amelyeket a GF területen módosítottak, részletesebben az 51-87 maradékokon a határoló maradékokat is beleértve változtattak meg. A találmányban leírt előnyös eljárásban a terület teljes mennyiségét elhagyták, de a találmányban leírták annak lehetőségét is, hogy bizonyos aminósavakat szubsztituáltak. A fenti szabadalom legszélesebb értelmezési kö.rében 3620 lehetséges egyes aminosav szubsztitúciót írtak le, azonban egyetlen példát sem közöltek. Az 51-87 maradékok elhagyása volt az egyetlen módosítás, amelyet példában is leírtak. Az ilyen elhagyásos variáns expresszálását írták le C127 sejtekben egérben, és a vegyület fibrin bontási aktivitását határozták meg teljes fibrin enzimvizsgálat segítségével.

Az A-0240334 ezt követő Európai Szabadalmi bejelentés

- 9 ben t-PA származékokat írtak le, amelyeket a Tyr67 és Ser69 közötti területen módosítottak. A leírásban ebben az esetben is a fent leírt terület teljes vagy részleges elhagyása szerepel, azonban nem részletezi az ugyancsak beleértett lehetséges módosításait ennek a területnek. A leírás széleskörű értelmezése 8000 (20^) lehetséges t-PA származékot foglal magában bármely további példa megadása nélkül. Az A-0240334 számú Európai Szabadalomban leírtak olyan t-PA expresszálást, amelyekből a 67-68 és a 67-69 maradék hiányzik L929 egyéb sejtekben. Valamint leírták az expreszszált anyag fibrinbontási aktivitását fibrin enzimológiai vizsgálat alapján. Egyik alkalmazás esetében sem végeztek jellemző biokémiai jellemzést, illetve plazma fél-élettartam adatot.

Az ilyen hiányos t-PA származékok bizonyos limittel rendelkeznek felhasználhatóság szempontjából amiatt, hogy a módosítás azt eredményezi a fehérjékben, hogy azok jelentősen eltérnek a természetes molekulától, és egyáltalán nem érik el a természetes molekula stabilitási, aktivitási és immun hatást kiváltó jellemzőit.

Újabban olyan t-PA GF területi változásokat dolgoztak ki, amelyek esetében figyelembe vették, hogy a receptorkötést megváltoztassák, de ugyanakkor nem hagyták el a GF területet, vagy a molekula más részeit abból a szempontból, hogy a természetes konformáció kialakítását biztosít* ·

- 10 sák. Az A-0207589 számú Európai Szabadalmi bejelentés és A-0240334 számú Európai Szabadalmi bejelentés az ilyen változtatásokat nem teszi lehetővé, meri egyáltalán nem vették figyelembe a változtatások során a szerkezeti behatároló tényezőket. Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás fibrin lebontásban aktív szövet plazminogén aktivátor (t-PA) analóg előállítása, amely legalább egy szubsztitúciót tartalmaz a növekedési faktor (GF) területen.

A növekedési faktor (GF) terület ilyen szubsztitúciója általában olyan, hogy legalább részben csökkenti a máj receptorhoz való kötődést anélkül, hogy jelentősen befolyásolná a fibrinbontási aktivitást. Hasonlóan, a vérben való fizikai-kémiai stabilitást ez a változtatás előnyösen nem rontja. Célzottan az előállított származékokban legalább a GF területen nem történik semmilyen szekvencia egység elhagyás .

A célzott módosítások a GF területen olyanok, hogy ezek lehetővé teszik ennek a területnek természetes konformáció felvételét, azaz olyan eljárások, amelyek az előre jósolt harmadlagos szerkezetet . Gt terület vonatkozásában figyelembe veszik. Az EGF oldatbani szerkezetének részletes vizsgálata lehetővé teszi a t-PA GF terület kötési modelljének kidolgozását, és ennek alapján a találmány szerinti változtatások megtervezését. Különösen jelentős a béta lap

• · terület, amely a 63-72 maradékokat foglalja magában, mivel ez az a terület, amely peptid vizsgálatok alapján az urokinázhoz való receptor kötőaésoen szerepet játszik. Modellkísérletek azt feltételezik, hogy a Tyr67 és a Phe68 maradékok hidrofób oldalláncai, amelyek a két lánc közötti béta fordulatban vannak jelen, a nem párhuzamos béta síkokban, azok, amelyek legalábbis részben a receptor kötési területének válaszát szolgáltatják. Ennélfogva számos szubsztitúciót terveztünk úgy, hogy ezek megváltoztassák ennek a területnek a jellemzőit anélkül, hogy befolyásolnák azt, hogy béta fordulatot vehessen fel.

Az ilyen finom változtatások jelentősek, amennyiben a vegyület jelentős teljes aktivitást biztosító és stabilitást biztosító tulajdonságait meg kívánjuk őrizni a mutáns származékban; és az alkalmazott szubsztitúciók a fent idézett irodalom javaslataival ellentétesek abban, hogy az itteni módosítások semmiképpen sem tartalmaznak elhagyásokat. Még igen kismértékű elhagyás is, amely egy vagy két aminosav maradékot érint a béta fordulatban, mint például a Tyr67 vagy a Phe68 egység elhagyását, kétségkívül azt eredményezné., hogy a béta lap, amelyik a kulcs szerkezeti tulajdonsága a GF területnek, egy egységgel rövidebb lesz, és ennélfogva ez bizonyos mértékig befolyásolja a GF terület stabilitását, ennélfogva az egész t-PA molekula stabilitását.

»··· • » ·

- 12 A találmány tárgya olyan módosítások végrehajtása a GF területen a t-PA molekulában, amelyek megszüntetik vagy nagyban csökkentik a receptorhoz való kötődést anélkül, hogy a molekula stabilitását_}aktivitását vagy teljes konformációját megszűntetnék, mivel a módosítások lehetővé teszik, hogy a GF terület felvegye az egyébként természetes konformációt. A vegyületek fibrin bontási aktivitását számos úton vizsgálhatjuk. Például alkalmazhatunk in vitro eljárást vérrög lízis kísérletben, vagy S-2251 chromogén kísérletben, vagy in vivő végtag artériás thrombosis vizsgálatban nyúlak esetében. A fibrinbontási aktivitást nem tekintjük jelentősen megszűntetettnek, amenynyiben a t-PA analóg vegyűlet legalább 20 %, 10 %, 5 % vagy akár 1 % aktivitással rendelkezik fibrinbontás szempontmából a természetes t-PA vegyülettel összehasonlítva.

A találmány szerinti előnyös eljárásban olyan egyszeres vagy többszörös aminosav szubsztitúciókat végzünk, a 63 és 72 maradékok között, amely maradékokat ebbe a sorba beleértünk, amelyek az előre jósolt másodlagos szerkezetnek megfelelőek.

A találmány szerinti t-PA analógok ezen túlmenően tartalmazhatnak más módosításokat is (a természetes t-PA vegyülettel összehasonlítva), amely módosítás lehet egy vagy több addició, elhagyás és/vagy szubsztitúció. Például figyelembe vettük, hogy a vérben jelenlevő t-PA inhibi ♦···· ·»

- 13 torok bizonyos elég jelentős hatást gyakorolhatnak a találmány szerinti t-PA analóg vegyületekre. A természetes típusú t-PA vegyületek esetében ezen inhibitorok hatása nem jelentős amiatt, hogy a hatóanyagokból nagy dózist kell alkalmazni ahhoz, hogy kompenzálják az igen kis, félélettartam jellemzőjét az aktív vegyületnek. Ennélfogva az előnyös t-PA analógok a találmány szerint olyan mutációt tartalmaznak a szerin proteáz területen, amely a t-PA inhibitor kötődéssel kölcsönhatásba lép. Ez a 275-276 hasítási hellyel kapcsolatos lehet, vagy pedig más helylyel kapcsolatos lehet a proteáz területen.

Más, többszörösen módcsított találmány szerinti t-PA analóg vegyületek lehetnek, amelyekben egy vagy két módosítás található, amely megakadályozza, csökkenti vagy megváltoztatja a glikozilezés módját. Ilyen módosítást vagy módosításokat hajthatunk végre a 117, 184 és/vagy 448 maradékok szerkezetén. Az ilyen t-PA analógok, amelyek egy vagy több fenti maradékon módosítást tartalmaznak hosszabb fél-élettartammal, csökkentett plazma ürítéssel és/vagy nagyobb, specifikus aktivitással rendelkezhetnek.

A találmány tárgya továbbá eljárás nukleinsav előállítására (amely lehet DNS vagy RNS), amely a fent leírt t-PA analóg vegyületet kódolja. Az ilyen nukleinsavak • ’ ***5 .··. ·« ···· . . * · ···· «... » ·. ··· ··· • · ’· ·. ♦.*

- 14 lehetnek vektor formájűak, mint például plazmidok, és bizonyos esetekben expresszálható formák. A találmány kiterjed sejtvonalakra, különösen emlős vagy más állati sejtvonalakra, amelyek képesek expresszálni az ilyen nukleinsavakat.

A találmány tárgya továbbá eljárás az előbbi leírás szerint meghatározott t-PA analóg alkalmazására emberi vagy állatgyógyászati gyógyszerben, különösen mint thrombosis ellenes szerként történő alkalmazásra.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerészeti formált alak előállítására azzal jellemezve, hogy a találmány szerinti egy vagy több t-PA analóg vegyületet, mint aktív hatóanyagot és gyógyszerészetileg vagy állatgyőgyászatilag elfogadható hordozóanyagot gyógyszerészeti készítménnyé feldolgozunk. Az ilyen készítményt alkalmazhatjuk intravénás adagolásban, és ennélfogva sterilnek kell lennie. A találmány szerinti formált alak példái u. a steril t-PA analóg vagy analógok izotóniás fiziológiai sóoldatban és/vagy puffer oldatban. A formált alak tartalmazhat helyi érzéstelenítő vagy fájdalomcsillapító anyagot az injekció forma esetében.

A találmány szerinti t-PA analóg vegyületeket alkal mazhatjuk egységdózis formában, például mint száraz por • ^: ···:.*· ···· »·ί· » \ ··; ··· * · ·· ·· vagy vízmentes koncentrátum formád, hermetikusan zárt tartóban, mint például ampullában vagy zacskóban, amelyen feltűntetjük a protein aktivitás egységét. Amennyiben a t-PA analóg vegyületet infúzió útján kívánjuk adagolni, ezt infúziós edényből adagolhatjuk, amely injekcióra alkalmas steril vizet vagy fiziológiás sóoldatot tartalmaz. Amennyiben a vegyületet injekció formában adagoljuk, ezt injekcióra alkalma* vizet vagy fiziológiás sóoldatot tartalmazó ampullából adagolhatjuk. Az infúzióra alkalmas vagy injektálható formált alakot előállíthatjuk úgy, hogy az adagolás előtt közvetlenül az aktív hatóanyagokat keverjük.

Az aktív hatóanyag alkalmazott mennyisége függ attól, hogy milyen mértékű fibrinbontást kívánunk elérni, milyen mértékű sebességet kívánunk ebben a hatásban, valamint hogy milyen mértékűén súlyos a thromboembolikus helyzete, és mérete a vérrögnek. Az adagolt pontos dózist az adott t-PA analóg jellemzőinek függvényében, illetve a kezelt betegség függvényében a kezelőorvos határozza meg. Közelítő adatként azonban megadhatjuk, hogy érett thrombus kezelésére a betegbe általában napi 0.01-10 mg/kg testsúly dózist alkalmazunk, akár 5 dózisból álló injekció formában, akár infúzió formában.

A találmány szerinti eljárást thrombosisos betegségek kezelésében vagy megelőzésében alkalmazhatjuk, azzal jel16 lemezve, hogy a találmány szerinti t-PA analóg hatásos nem toxikus mennyiségét adagoljuk. A találmány tárgya ennélfogva eljárás t-PA analóg alkalmazására a fentiek szerint thrombosis bontó szerként.

A találmány tárgya eljárás a fent leírt találmány szerinti t-PA analógok előállítására azzal jellemezve, hogy az egymást követő aminósav egységeket egymáshoz kapcsoljuk. Az analóg vegyületek ugyan előállíthatok elvben kémiai szintézissel, az előnyös előállítási út riboszóma transzláció előnyösen in vivő körülmények között, amelyben a megfelelő nukleinsav szekvenciát másoljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti nukleinsav előállítására azzal jellemezve, hogy az egymást követő nukleotidokat és/vagy oligo- és/vagy polinukleotidokat egymáshoz kötjük. A nukleinsav vegyülteket ugyan kémiailag szintetizálhatjuk, az előnyös előállítási eljárás során nukleinsav irányított polimerázt alkalmazunk előnyösen in vivő körülmények között.

A találmány szerinti eljárás további előnyös tulajdonságai az alábbiakból kitűnnek, amelyeket csatolt ábrákon is illusztrálunk, ahol:

1. ábra: diagram formában bemutatja a t-PA vegyület terület elosztását, és elsődleges szekvenciáját;

• * ·♦ ··· *·

2. ábra:	bemutatja a t-PA GF terület modelljét;
3. ábra:	bemutatja egy példa expresszié stratégia

diagramját;

4. ábra: bemutatja a TND-HBB expressziós vektor térképét;

5a ábra:

bemutatja a BBNT5 és BBNT6 t-PA analóg gé-

nek előállítására alkalmazott primerek^ amelyeket t-PA mutációjában alkalmazunk;

5b. ábra: a BBNT11 és BBNT12 t-PA analógok génjei előállításában alkalmazott primereket mutatja, amelyeket a t-PA mutációjában alkalmazunk (a BBNT5 génjének megfelelő részletét egyes DNS láncként is bemutatjuk, amelyből ezt a gént templátként alkalmaztuk);

6. ábra: bemutat egy SDS PAGE gélt, amely a tisztított t-PA analóg BBNT5 vegyületet mutatja; és

7. ábra: bal combi artéria rendszert mutat nyálban schematikus vázlatban, amelyben a találmány szerinti analógok thrombosis bontó hatásosságát in vivő megállapíthatjuk .

1. példa

BBNT5 konstruálása

A BBNT5 egy t-PA származék, amelyben 67 (tyr) és 68 (phe) aminosav egységeket egyaránt szerin egységekké alakítottuk. A vegyületeket TND-HBB expressziós vektor segítségével állítottuk elő.

A TND-HBB olyan expressziós vektor, amely alkalmas emlős sejtekben t-PA előállítására. A vektor egy E. coli replicont tartalmaz, amely egy t-PA anyagotkódoló cDNS molekulát tartalmaz, amelyet az RSV-ből leszármaztatott LTR anyagról másoltak. Ugyanez a kód egy poli-adenilező jelet tartalmaz, amelyet lefelé áramot befoglaló marha növekedési hormon génből nyertek. Abból a célból, hogy az expresszáló kazettákat a klónokból kiválasszuk, a kiválasztási DHFR (dihidro-folát reduktáz, amely biztosítja a lehetőséget, hogy methotrexat jelenlétében növekedés történhessen) és NEO (neomycin foszfotranszferáz, amely biztosítja az antibiotikum G418 jelenlétében történő növekedést) ugyancsak jelen vannak a készítményben. A NEO gént az egér béta-globin promotorból expresszáljuk, és ez magában foglalja az SV40 korai poli-adenilezési jelet. A 4. ábrán bemutatjuk a TND-HBB szkematikus vázlatát. A TND-HBB a plazmid TND származéka, amelyben bizonyos korlátozó helyzeteket módosítottunk. A plazmid TND konstruálását Connors és munkatár sai (DNA 7, 651-666 (1988)) közleményében leírták és ez a 137,892 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentés tárgykörébe tartozik, amelyet 1987 december 28-án nyújtottak be; ezt a közleményt és az Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentést referenciaként adjuk meg. Mint a 4. ábra tanulmányból kitűnik, a plazmid TND-HBB előállítható a TND plazmidból szokásosan alkalmazott eljárásokkal, amelyek a szakirodalomban jártas szakember számára ismertek.

Ez az expresszálási rendíjszer előnyösen alkalmazható hatásossága miatt, de alkalmazása nem limitált a találmány szerinti eljárás szempontjából. Számos ma leírt más eljárás alkalmas gének expresszálására emlős sejtekben és más gazdákban, mint például élesztőben és E. coli baktériumban, amelyek ugyancsak alkalmazhatók aktív t-PA előállítására. Az ilyen expresszálási rendszerek jól ismertek a gén technológiában jártas szakember számára és részben leírtak Gorman DNA cloning Vol II: A practical Approach (D.M. Glover, ed. IRL Press, Oxford (1985) 143-190) közleményében. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható t-PA cDNS leszármaztatható a HeLa sejt mRNS-ből, amint ezt a szakirodalomban leírták. A t-PA molekulának megfelelő cDNS molekula izolálására alkalmazott eljárás ugyancsak szakirodalomból ismert. Az A-2119804 számú Nagybritanniai szabadalmi bejelentésben leírt egyik példa, amelyet referencia20 ként adunk meg, ezt az eljárást mutatja be. Más eljárás, amely ugyancsak alkalmazható, az alábbiak szerint őszszegezhető:

1. Emberi májat nyertek 57 éves hím emberből trauma során bekövetkező baleseti operáció során, amelynek következtében a beteg szívelégtelenség miatt elhúnt.

2. Az mRNS molekulát guanidin-tiocianát eljárással előállították (Chirgwin és munkatársai Biochemistry 10:5294 (1979)) és tisztítottak oligo-dT oszlop alkalmazásával (Aviv és Leder PNAS 69:1408 (1972)).

3. A cDNS könyvtárat előállították Amersham Protocol (cDNA Synthesis and Cloning System, Amersham International plc, 1985) eljárása szerint, kivéve, hogy a kettős láncú cDNS molekulát lambda-zap vektorhoz kötötték, amelyet Stratageneből nyertek (Short és munkatársai Nucleic acids Rés. 16:7583 (1988)) eljárása szerint.

4. A lemezeket t-PA cDNS-re vizsgáljuk Escherichia coli BB^ törzs alkalmazásával nitrocellulóz replikátumokban való hibridizációval, amelynek során p-jelzett próbákat alkalmazunk %-os formamidban, továbbá 5 x SSC (az SSC

150 mmol NaCÍ, 15 mmol nátrium-citrát oldat), x Denhardt oldatot, 0.1 % SDS és 0.2 mg/ml

E. coli tRNS-t alkalmazunk 42°C hőmérsékleten.

A szűrt anyagot 2 x SSC, 0.1 % SDS oldattal mossuk 42°C - 45°C hőmérsékleten. A pozitív lemezeket tisztítottuk és automatikus kivágást végeztünk, majd a csomagolt rekombinációs plazmid kiónokat vagy szubklónjaikat dijaoxi-módszerrel szekvenciavizsgálatnak vetettük alá dATP-5-A(35)-tiofoszfát alkalmazásával Sanger és munkatársai eljárása szerint (Sanger és munkatársai PNAS 74:5463 (1977)).

A példában alkalmazott módosító stratégia az volt, hogy a legtöbb t-PA cDNS-ban megtalálható 1.7 Kb

HindiII-Xmal fragmenset a TND-HBB anyagból szubklónoztuk á(z egyláncú M13mpl8 bacteriophagba abból a célból, hogy a mutagenesist megkönnyítsük. Egyláncú templát DNS-t állítunk elő és a mutációt oligonukleotid által irányított rosszul illeszkedő mutagenesis segítségével készítjük. Ebben az esetben egy 24 alap egységet tartalmazó oligonukleotidot alkalmaztunk (5* ATCTGAGCTCGAGAGGGCCTGCTG 3^ ) a muta genesis irányítására (a 67 (Tyr) és 68 (Phe) aminosavak mindegyikét Ser aminósavvá alakítottuk). Ezek a mutációk a Xhol és SacI korlátozó enzimek megfelelő helyeire ugyan csak megfelelő jelzőket vezettek be, amelyek a kívánt mutáció genetikus jelei. A kívánt mutációt hordozó kiónokat szekvencia meghatározással azonosítottuk, és ezután a teljes szekvenciát meghatároztuk abból a célból, hogy meggyőződjünk arról, hogy más, nemkívánatos mutáció bevezetése nem történt. Ez után RF DNS-t állítottunk elő, és a mutációt az expresszáló vektorba másoltuk, úgy, hogy a HindlII - Apai fragmenseket kapcsoltuk. A mutáns t-PA cDNS molekula szekvenciáját ismét meghatároztuk az expreszsziós vektorban, mielőtt az expresszálási vizsgálatokat elkezdenénk. Ezt a módosítási protokollt a 2. ábrán mutatjuk be.

A mutáns t-PA gént hordozó TND-HBB plazmid DNS-t ezután korlátozó endonukleáz Xbal segítségével linearizáljuk és nem szekréciós, nem termelő egér myeloma P3X63-Ag8. 653 sejtvonalba vezetjük be a G418 rezisztens kolóniákat eredményező lemezeket,t-PA aktivitás szempontjából vizsgáljuk indirekt, amidolízis kísérlettel, amelyben a plazminogént fibrinogén jelenlétében aktiváljuk, majd ezt követően az S2251 .. . chromogen szubsztrátot hasítjuk. Ezt követően a t-PA vegyületet termelő kolóniákat újra klónozzuk, és a legjobb termelő kolóniákat mennyiségben megnöveljük edényekben, majd . u-. berendezésben, és így nagyobb mennyiségű t-PA származékot állítunk elő. A t-PA vegyületet a kondicionáló táptalajtól affin kromatográfia segítségével tisztítjuk· meg. Ε%£ . CNBr által aktivált

SEPHAROSE CL4B anyagon kötött Erythrina tripszin inhibitor alkalmazásával, majd 3 m KSCN elúció alkalmazásával végezzük. Ezután az anyagot SEPHADEX G25 oszlopon sómentesítjük, majd ultraszűréssel betöményitjük. (A SEPHAROSE és a SEPHADEX márkanevek.) A tisztított t-PA származékot ezután specifikus aktivitás szempontjából vizsgáltuk S2251 kísérletben, és receptor kötődését vizsgáltuk úgy, hogy meghatároztuk kompetitív készségét patkány máj hepatocytáki 125 hoz való kötődésk-v I jelzett t-PA vegyülettel szemben.

A vérrög lízisben kifejtett in vivő hatásosságot nyúl combi artéria modell segítségével határoztuk meg, amely vizsgálat lehetővé tette a plazma fél-élettartam mérését is, amelyet mind amidolízisben kifejtett aktivitással, mind t-PA antigén vizsgálatban meghatároztunk ELISA kísérletet alkalmazva .

Valamennyi fent alkalmazott eljárás a szakirodalomban ismert és a szakember számára világos. Az eljárásokat részletesebben az alábbiakban ismertetjük, amely eljárásokban kisebb módosításokat végeztünk a szakirodalomban közölt eljárásokhoz képest.

ELJÁRÁSOK

A példában leírt módosított t-PA származék előállításában, valamint a későbbi példákben alkalmazott gén manipulációs, expresszálási és fehérjetiszítási eljárások a szakirodalomban jól ismertek a gén technológiában. Az eljárások legtöbbjének leírását megtalálhatjuk az alábbi laboratóriumi kézikönyvekben: Molecular Cloning by T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, Box 100, New York vagy Basic Methods in Molecular Biology by L.G. Davis, M.D. Dibner and O.F. Battey,

Elsevier Science Co. Inc. New York.

Kiegészítő vagy módosított eljárásokat az alábbiakban részletesen ismertetünk:

1) Oligonukleotid szintézis

Az oligonukleotidokat automatizált foszforamidát kémia segítségével állíjuk elő, amelyben ciano-etil-foszforamidátokat alkalmazunk. Az eljárást széles körben alkalmazzák és a szakirodalomban leírták (Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters. 24, 245 (1981)).

2) Az oligonukleotidok tisztítása

Az oligonukleotid vegyületeket a CPG hordozóanyagról eltávolítjuk és védőcsoportjaikat lehasítjuk koncentrált ammóniában, NH^történő inkubálás segítségével. Jellemzően 50 mg 1 mikro-mol oligonukleotidot hordozó CPG anyagot 5 óráig 70°C hőmérsékleten 600 mikro 1 koncentrált ammóniában, NH-j, inkubálunk és így a védőcsoportot eltávolítjuk. A felúszót új edénybe visszük, és az oligomert 3 térfogat mennyiségű etanollal csapadékként lecsapjuk. Ezután az elegyet centrifugáljuk, a labdacsot megszárítjuk és 1 ml vízben újra szuszpendáljuk. A nyers oligomer koncentrációt ezután 260 nm mellett mért abszorpció mérésével határozzuk meg.

Géltisztítás céljára a nyers oligonukleotid 10 abszorpciós egységnyi mennyiségét megszárítjuk, majd 15 mcl jelzőfestékben újra szuszpendáljuk (90¾ ionmentes formamid, 10 mmol TRIS, 10 mmol borát, 1 mmol EDTA, 0.1¾ bróm-fenol kék). A mintákat 1 percig 90°C hőmérsékletre melegítjük, majd 1.2 mm vastag denaturáló poliakrilamid gélre visszük, amely 1.6 mm széles bevágásokat tartalmaz. A gélt 15¾ akrilamid, 0.6¾ bisz-akrilamid és 7m karbamid 1 x TBE anyagban raktározott formából állítjuk elő, ás 0.1¾ ammóniumperszulfát, valamint 0.025¾ TEMED segítségével polimerizáljuk. A gélt 1 óra időtartamig előfuttatjuk.

- 26 A mintákat 1500V alkalmazásával 4-5 óráig futtatjuk. A savukat UV árnyékolással tesszük láthatóvá és a teljes hosszúságú terméknek megfelelő sávokat kiváyjuk, majd mikro vizsgálati csövekbe visszük át. Az oligomereket a gélről AGEB elegyben történő éjjelen át végzett áztatásr sál eluáljuk (0.5m ammónium-acetát, O.Olm magnézium-acetát és 0.1¾ SSS). Az AGEB puffért ezután új kémcsőbe visszük és az oligomert háromszoros mennyiségű térfogatban alkalmazott etanol segítségével -70°C hőmérsékleten 15 perc időtartamig lecsapjuk. A csapadékot centrifugatással Eppendorf mikrocentrifugán 10 percig centrifugáljuk.

A labdacsot 80Vos etanollal mossuk, a tisztított oligomert megszárítjuk és 1 ml vízben újra oldjuk, majd végül 0.45 mikron méretű mikroszűrőn leszűrjük. A tisztított termék koncentrációját 260 nm mellett mutatott abszorpciója segítségével határozzuk meg.

3) Az oligomerek kinase kezelése

250 tmol oligomert megszárítunk, majd 20 mikro 1 kinase pufferben újra szuszpendálunk (70 mmol TRIS, pH 7.6,, 10 mmol MgCl₂, 1 mmol ATP, 0.2 mmol spermidin, 0.5 mmol ditio-treitol). Ezután az elegyhez 10 u mennyiségű T4 polinukleotid kinase-t adunk, majd 30 percig 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a kinase-t inaktiváljuk 15 percig 85°C hőmérsékletre való melegítéssel.

2Γ

4) Didéoxi szekvencia meghatározás

Az eljárás lényegében megegyezik a szakirodalomban leírt eljárással (Biggin, M.D., Gibson, T.J., Hong, g.F. P.N.A.S. 80 3963-3965 (1983)), ahol ez szükséges volt az eljárást módosítottuk, hogy lehetővé tegyük a plazmid DNS szekvencia maghatározását, amint ezt a szakirodalomban leírták. (Guo, L-H., Wu, R. Nucleic Acids Research 11 5521-5540 (1983)).

5) Transzformáció

A transzformációt a standard eljárások alkalmazásával véeztük. A plazmid vektorokat alkalmazó klónozásban felhasznált fogadó törzs HU87 volt, amely az alábbi geno típusú :

araD139(ara-leu)del7697 (lacIP0ZY)del74 galll galK hsdR rpsL srl recA56

A HW1085 egy mutL származéka az E. coli baktériumnak, amely FL-thordoz, ami lehetővé teszi a hím specifikus phaggal történő fertőzését. Alapvető előnye az, hogy a MutL mutáció a mutánsok nagyobb gyakoriságához vezet, helyzettel irányított mutagenesis esetében.

« · ·

- 28 A JM103 standard fogadó törzs manipulációk számára, amelyekben M13 alapú vektorokat alkalmazunk.

6) Helyzetirányított mutagenesis

Kinase kezelt mutagenesis prímért (10 pmol) kapcsolunk egyláncú templát DNS-hez (5 mikro g) univerzális szekvencia meghatározó primerrel együtt (10 pmol) végső reakcióelegyben, amely 10 mikro 1 térfogatú és 70 mmol TRIS-t, 10 mmol MgC^-t tartalmaz. A reakcióelegyet polipropilén mikro kémcsőbe helyezzük (Eppendorf) és a kémcsövet 250 ml 90°C hőmérsékletű vizet tartalmazó főzőpohárba helyezzük. A főzőpoharat polisztirollal fedjük, majd lassan hagyjuk keverés közben 30°C hőmérsékletre hűlni. A temperált elegyet ezután jégre tesszük, majd az alábbi reagenseket adjuk hozzá: 1 mcl 10 χ TM (700 mmol TRIS, 100 mmol MgC^, pH 7.6), 1 mcl elegyet, amely valamennyi 4-deoxi-ribonukleotid-trifoszfátot 5 mmol koncentrációban tartalmazza, 2 mikro 1 50 mmol ditiotreitolt, 1 mikro 1 T4 DNS ligázt (100 u), 0.5 mikro 1 klenow DNS polimeráz fragmenst és 45. mikro 1 vizet. A polimeráz reakcióelegyet ezután 4 óráig 12°C hőmérsékleten inkubáljuk. Miután a reakció befejeződik, az elegyhez 180 mcl TE oldatot adunk (10 mmol TRIS, 1 mmol EDTA, pH 8.0) és ezután a mutagenesis elegyet -20°C hőmérsékleten tároljuk .

- 29 A mutáns kiónok izolálása céljából az elegyet ezután mutL fogadó HW1085 anyagba transzfóráijuk az alábbiak szerint. HW1085 éjjelen át inkubált tenyészetének 5 ml-ét, amelyet 2 x YT-ben inkubáltunk (1.6¾ Bactotryptone , 1¾ élesztő e'x.traktum, 1¾ NaCl) hígítjuk 1:1000 arányban 50 ml előre melegített 2 x YT eleggyel. A tenyészetet 37°C hőmérsékleten tenyésztjük levegőztetéssel, amíg az A600 érték 0.4 értéket nem ér el. A sejteket ezután láb* dacosa alakítjuk, majd 0.5 1 térfogat 50 mmol CaCl₂ oldatban újra szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 15 percig jégen tartjuk. A sejteket ezután ismét labdaccsá alakítjuk 4°C hőmérsékleten, majd 2.5 ml hideg 50 mmol koncentrációjú CaCl₂-ban újra szuszpendáljuk. Az átviteli fertőzéshez 0.25 1, 2, 5, 20 és 50 mikro 1 mutagenesis mintákat adunk 200 mikro 1 megfelelő sejtekhez, amely elegyeket ezután 30 percig jégen tartunk. A sejteket ezután 2 percig 42°C hőmérséklet alkalmazásával hősokknak vetjük alá. Minden egyes kémcsőhöz ezután 3.5 ml YT lágy-agart adunk, amely 0.2 ml késői exponenciális JM103 tenyészetet tartalmaz. A kémcsövek tartalmát enyhén elkeverjük, majd ezután előre melegített lemez felületre öntjük, amely 1.5¾ agarral szilárdított 2 x YT anyagot tartalmaz. A lágy-agar réteget állni hagyjuk, hogy beálljon, majd ezután a lemezeket éjjelen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk.

Ezután izolált kiónból az alábbiak szerint egyláncú

- 30 DNS-t állítunk elő: egyes lemezeket helyezünk 4 ml x YT oldatba, amelyet ezután 10 mikro 1 friss éjjelen át tenyésztett JM1Ü3 2 x YT kultúrával oltunk be. A tenyészetet 6 óráig erősen rázatjuk. Ezután 0.5 ml tenyészetmintát veszünk, amelyet 0.5 ml 50%-os glicerolhoz adunk, és referencaként -20°C hőmérsékleten megőrzünk. A maradék tenyészetet centrifugáljuk, hogy a sejteket eltávolítsuk.

ml felúszót, amely a phag részecskéket tartalmazza új Eppendorf csőbe viszünk. A csőbe 250 mikro 1 20 % PED6000, 250 mmol NaCl anyagot tartalmazó oldatot adunk, az elegyet keverjük, majd 15 percig jégen inkubáljuk. Ezután a phage-ot 10.000 ford/perc alkalmazásával 10 percig labdacscsá alakítjuk. A felúszót eldupjuk, és a csöveket újra centrifugáljuk, hogy a PEG oldat maradványait gyűjtsük, amé^lyet ezután eltávolíthatunk és eldobhatunk. A phag labdacsot teljesen újra szuszpendáljuk 200 mikro 1 TEN oldatban (10 mmol TRIS, 1 mmol EDTA, 0.3 m NaOAc). A DNS-t ekvivalens térfogatú TRIS anyaggal telített fenollal végzett extrakcióval izo]?[iuk. A fázisokat rövid centrifugálással elválasztjuk, és a vizes fázist tiszta csőbe visszük. A DNS-t 100 mikro 1 fenol és 100 mikro 1 kloroform elegygyel újra extraháljuk, majd a fázisokat centrifugatással újra elválasztjuk. A fenol nyomait három egymásutáni kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítjuk, és a DNS-t végül 2.5 térfogatnyi etanol -20°C hőmérsékleten történő hozzáadásával és éjjelen át történő ezen a hőmérsékleten való * · • · ♦ » · · · • · · · · »·♦ ··* ··♦··»··· · » · • A ·« ·· 4«

-31 tárolással.lecsapjuk. A DNS-t 10.000 ford/perc 10 percig történő alkalmazásával labdaccsá alakítjuk, majd VOVos etanollal mossuk, megszárítjuk és végül 50 mikro 1 ΊΈ oldatban újra szuszpendáljuk.

7) Elektroporézis

Egér myeloma p3x63-Ag8.653 sejtvonalat tenyésztünk, majd közepes logaritmikus növekedési fázisban centrifugálással kinyerünk. A sejteket PBS oldatban újraszuszpendáljuk és az életképes sejteket számláljuk. A sejteket ezután labdaccsá alakítjuk és 1 x 10^ sejt/ml koncentrációban újra szuszpendáljuk. 1 ml térfogatú sejthez 40 mikro g linearizált DNS-t adunk és az elegyet hagyjuk 15 percig jégen állni. A sejteknek kereskedelemben kapható elektroporézis berendezést alkalmazva (BIORAD GENE PULSER - t kereskedelmi név) egyetlen 800V/25 mikroF impulzust adunk. A sejteket további 15 percig jégen inkubáljuk, majd 10 x 96 üreget tartalmazó lemezre visszük 200 mikro 1 kondicionált táptalajjal minden üregben (DMEM, 5¾ FCS, Pen/Strep, glutamin) és éjjelen át inkubáljuk. 24 óra elteltével minden üregből 100 mikro 1 közeget eltávolítunk, és ezt 100 mikro 1 szelektív G418 400 mikro g/ml koncentráció anyagot tartalmazó közeggel helyettesítjük. A táplálékmegvonást tjovábbi négy ezt követő napon végezzük. Körülbelül 14 nap múlva bizonyos üregekben nyilvánvaló a G418 rezisztens kolóniák jelenléte. A lemezeket t-PA aktivitásra vizsgáljuk úgy, hogy minden • * ·»·♦ 4« ·« • ’ 4 · <

• · ¹ « · ··* «· ·

- 32 egyes üregből mintát veszünk és S2251 vizsgálatban vizsgáljuk. A t-PA anyagot termelő kiónokat megsokszorozzuk és expressziós szintjüket mérjük abból a célból, hogy a legjobb termelőt kiválasszuk.

8) t-PA variánsok tisztítása

Kereskedelemben az American Diagnostica cégtől nyert Erythrina trypsin inhibitort (ET) kapcsolunk CNBr aktivált SEPHAR0SE-4B (Pharmacia) hordozóhoz a szállító előírásának megfelelő eljárással. 1 ml gélre 5 mikro g fehérjét táplálunk. Az oszlopot ezután legalább 10 oszlop térfogatnyi PBS oldattal pH 7.5 értéken kiegyenlítjük. Az oszlopra ezután kondicionált közeget táplálunk úgy, hogy 1 ml gélre 400 meg t-PA esik az S2251 kísérlet és a 700,000 u/mg KabiVitrum standard meghatározása szerint. Jellemzően 3 1 kondicionált közeget, amely 1 mg/ml t-PA-t tartalmaz adagolunk 10 ml oszlopra (H:0 = 4) lineáris áramlási sebesség alkalmazásával 85 ml/cm/óra értéknél 4°C hőmérsékleten. Amiután a betáplálás befejeződik, az oszlopot minimum 5 oszlop térfogatnyi PBS oldattal mossuk 7.5 pH mellett, amíg a nem specifikusan kötött fehérje már nem eluálódik az oszlopról. A kötött t-PA anyag elúcióját 3m KSCN segítségével végezzük, amely 0.15m NH^OAc pufferben oldott, pH 5.3, amely 1 mmol EDTA-t tartalmaz. Az oldatot felhasználás előtt 0.45 mikron pórusméretű PTFE membránon szűrjük. Az elúció két oszlop • tvt ·« • a « · ♦··· *··• · • · a *· aa·· •· · • «4··

- 33 térfogatnyi eluáló alkalmazását igényli és lineáris áramlási sebességgel 34 ml/cm/őra értékkel végezzük. A tisztított t-PA származék frakciókat -20 °C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk.

Eluálás után az oszlopot 5 térfogat O.lm NH^OAc, pH 4.0, majd 5 térfogat O.lm TRIS HC1, pH 8.0 oldattal történő mosással regeneráljuk.

Amikor 10 mg megfelelő tisztaságú t-PA származékot gyűjtöttünk, amelynek tisztaságát SDS PAGE homogenitás vizsgálattal, valamint 300-700,000 u/mg specifikus aktivitással haározzuk meg, a KSCN oldatot eltávolítjuk és 0.1 m NH^OAc pufferrel, pH 4.0 helyettesítjük Sephadex G-25M oszlopon végzett kromatográfia segítségével. Jellemzően 25 ml 0.4 mg/ml t-PA származékot tartalmazó elegyet adunk 100 ml ágy térfogatú oszlopra (2.5 x 20 cm), amelyet O.lm NH^OAc, pH 4.0 pufferrel hozunk egyensúlyba. A kromatográfiát lineáris áramlási sebességgel 40 ml/cm/óra alkalmazásával szobahőmérsékleten végezzük. A t-PA származékot tartalmazó frakciókat gyűjtjük és 4°C hőmérsékleten 0.75-1.0 mg/ml fehérje koncentrációra töményítjük, amely koncentrációt Bradford reagens (Biorad) segítségével Amicon keverőcellákban YM10 membrán és 20 psi nyomás alkalmazásával’határozunk meg.

• · · · ···· ··«· ··*< ··4* • · · ·9 · ♦ ♦·»·· • * · ·

2. példa

BBNT6 előállítása

Az 1. példa szerinti eljárást követjük azzal az eltéréssel, hogy az alkalmazott primer 24 mer (5¹ATCTGAGTCGG TGAGGGCCTGCTG 3')· A mutagenesist és az expresszálási vizsgálatokat a BBNT5-re leírt eljárással végezzük (1. példa). A kapott t-PA mutáns származékban a Tyr67 egységet treoninná, és a Phe68 egységet aszparaginsavvá alakítottuk.

3. példa

BBNT11 előállítása

Az 1. példa szerinti eljárást követjük azzal az eltéréssel, hogy az 1. példában kapott egyláncú DNS templát prímezéséhez 27 bázisú oligonukleotidet alkalmazunk, amelyet a BBNT5 generálására használtunk. A 27 mer az alábbi (5¹AATCTGACAGCGAGAGGGCCTGCTGGC 3')· Ebben a származékban a Tyr67 egységet szerinné, és a Phe68 egységet leucinná alakítottuk. A mutációt úgy terveztük, hogy eltávolítsuk az Xhol és SacI helyzeteket, amelyeket a BBNT5 előállításához bevezettünk (1. példa).

• · ··· ·· » t · · ···· ···· · l·· ·· • · · • ··· • · ·· *·

4, példa

B8NT12 előállítása

A származékban a Leu 66 egységet aszparaginsavvá, a Tyr67 egységet aszparaginsavvá és a Phe68 egységet treoninná módosítottuk. A származékot a BBNT11 előállításával analóg eljárással a 3. példa szerinti eljárással állítottuk elő, amelyben primerként 27 bázisú oligonukleotidot alkalmaztunk (5'AATCTGAGGTATCGTCGGCCTGCTGGC 3').

5. példa

BBNT12 mutáns származék előállítása, amelyből az N117 glikozilezés helyzet hiá¹. nyzik

Egy természetes t-PA fehérje normál esetben három helyzetben glikozilezett, amelyek az N117, az N184 és az N448 helyzetek. Az N117 helyzeten egy nagy mannóz glikozilezési forma található, és feltételezik, hogy ez a máj mannóz receptorokon keresztül hozzájárul a t-PA nagysebességű plazma kiürüléséhez. Egy kétszeres mutáció, amelyben a GF terület mutációját végezzük el, amely megnöveli a plazma fél-élettartamot, valamint egy glikozilezés típusra vonatkozó mutációt végzünk a molekulában, amely így eltérő kiürülési módot eredményez és így egy olyan anyagot kaphatunk, amely egyidőben • · «··· *· • · · · · · · • · · * · ··· ···· ···« 4 · · ··· » · ·· ·· ·· nagyobb plazma fél-élettartammal rendelkezik. Ezt a típusú ΐ-PA kombinált mutánst a nagy mannóz glikozilezési helyzet

BBNT12-ből való eltávolításával állíthatjuk elő (4. példa).

Egy második helyzet mutációt hajtunk végre, amely az

N117 egységet Q-vá alakítja a mutáns BBNT12 t-PA száérmazékban, és így a fenti helyzetből a glikozilezés helyet, eltávolítjuk. Ezt a származékot, amelyet GF13 névvel jelölünk 21 bázisú oligonukleotid primer alkalmazásával hoztuk létre, amelynek szekvenciája 5'CGCGCTGCTCTGCCAGTTGGT 3'. A mutagenesist és az expresszálási vizsgálatokat a BBNT5 anyagra leírt eljárással végezzük (az 1. példa szerinti eljárásban előállított anyag).

6. példa

A hiányos t-PA mutáns előállítása, amelyből az Y67 és az

F68 maradékok hiányoznak. Ez egy összehasonlítási példa.

Összehasonlítás céljából egy Browne és munkatársai által az A-0240334 számú Európai szabadalomban leírt mutáns t-PA származékot állítunk elő. A szabadalmi bejelentésben leírtak olyan t-PA analógokat, amelyekben a G területen hiányzó egységek találhatók. Részletesebben, az Y67 és F68 maradékokat kihagyták, helyzetirányított mutagenesis alkalmazásával, amelyben 23 bázisú oligonukleotid prímért alkalmaztak, amelynek szekvenciája 5' CACGAAATCTGACAGGGCCTGCT 3' a mutagenesist és az expresszálási vizsgálatokat a BBNT5 anyagra leírtak szerint végezzük. A kapott mutáns t-PA analóg vegyületet GF6 névvel nevezzük.

7. példa

A módosított t-PA gének expresszálása

A kívánt mutációkat befoglaló régiót a t-PA expressziós vektorba vezetjük be és minden egyes mutáns t-PA gén szekvenciáját meghatározzuk. Ezután myeloma sejtekbe elektroporézissel linearizált plazmiüot vezetünk be, és a G418 rezisztens mutáns t-PA anyagot termelő kiónokat proteáz aktivitás tesztvizsgálatban S2251 vizsgálatot alkalmazva azonosítjuk.

A magas koncentrációban t-PA származékot termelő kiónokat lépcsőzetesen szaporítjuk addig, amíg 5 1 táptalajból nyerhetjük ki azokat. A módosított t-PA anyagot ezután tisztítjuk és specifikus aktivitását meghatározzuk (lásd az 1. Táblázatot)

1. Táblázat

Variánsok

Változások

67 68 69

Specifikus aktivitás

U/mg S2251 próba

WT t-PA	Leu	T yr	Phe	Ser	522000
BBNT5	Leu	Ser	Ser	Ser	440000
BBNT6	Leu	Thr	Asp	Ser	473000
BBNT11	Leu	Ser	Leu	Ser	427000
BBNT12	Asp	Asp	Thr	Ser	304000
GF6	Leu	-	-	Ser	490000
GF13	Asp	Asp	Thr	Ser*	440000
* Asn 117	Gln-re	cserélt

8. példa

Variáns t-PA származékok chromogén próbája

A t-PA variánsok plazminogén aktiváló hatását S2251 (Rabi) alkalmazásával mérjük, amely plazmid számára specifikus tripeptid chromogén szubsztrátum. A minta kis térfogatát (50 mcl) elegyítjük 50 ml pufferrel (50 mmol TRIS, 0.1 m EDTA, 0.0005¾ Triton X100, pH 3.0), amely 0.6 mmol S2251 anyagot és 0.5 mikro mól plazminogént, valamint 0.4 mg/ml fibrinogént tartalmaz 96 üreges lemezeken (Costar).

Ezeket 37°C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A reakciót 50 mikro 1 0.5 m ecetsav hozzáadásával leállítjuk és az abszorpciót 405 nm mellett automatikus lemez leolvasóval (Dynatech) mérjük. A mennyiségi kifejezést a standard t-PA preparátummal való összehasonlítás segítségével végezzük el. A chromogen vizsgálatban mért BBNT5 specifikus aktivitása 4.4 x 10^ IU/mg a WHO t-PA standarddal összehasonlítva (33/517). Ez az érték a természetes típusú t-PA CHO értékének (5.32 x 10^ IU/mg) körülbelül 82 Vas.

9. példa

A BBNT5 és más analógok hepatocyta kötődési jellemzőinek meghatározása

A BBNT5 kompetitív képességét mérjük szövet plazminogén aktivátor felvétellel összehasonlítva frissen izolált patkány hepatocytákban. A hepatocytákat Sprague Dawley patkányok májából izoláljuk, a májat kollagenázzal kezelve» (Rush and Alberts Life Sci. 40:679-685, 1987). A sejteket

Ο ι o S

37°chőmérsékleten 0.01 nm ^?I-t-PA (Bugelski és munkatársai, Uptake of humán recombinant tissue-type plasminogen activator by rat hepatocytes in vivő: an electron microscope autoradiographic study. Thrombosis Research 53 287-303 (1989)) 1 x 10^ sejt/ml koncentrációban Kreb-Henseleit pufferben, amely 2% marha szérum albumint tartalmaz. Mosás után a sejt asszociátumokat mérjük Gamma afcintilláció számlálással. A hepatocyták jellemzően körülbelül 2 fmol t-PA/10^ sejtet vesznek fel 45 perces inkubálás alatt.

200 nmol hideg természetes típusú t-PA hozzáadás a felvételt körülbelül 75 %-kal csökkenti. Ezzel ellentétben

2 5

200 nmol BBNT5 hozzáadása nem kompetitív a I-t-PA felvétellel. Ebből arra következtethetünk, hogy a BBNT5 anyagot a hepatocyták nem nagy affinitású felvételi eljárásbanJeszik fel, mint ahogy az a t-PA természetes anyag esetében történik és ezt szakirodalomban leírták (Bakhit és munkatársa, J. Bioi. Chem. 262:8716-872o, 1987). A BBNT6, 11 és 12, valamint GF6 anagok ugyancsak nem kompetitív fel125 vételűek a I-t-PA anyagok esetében hepatocytákban.

10. példa

BBNT5 és más analógok vérrög lízisében kifejtett hatása

A BBNT5 anyag vérrög lízisben kifejtett hatását hasonlítjuk össze természetes t-PA hatásával nyúl combi artéria modellben.

0.6-1.5 kg súlyú hím újzélandi fehér nyúlakat 35 mg/kg nátrium-pentobarbitál szélső fül vénába történő adagolásával érzéstelenítünk. A testhőmérsékletet 39.5°C értéken tartjuk Yellow Spring THERMISTEMP (márkanév) hőmérséklet szabályozóval (71A modell), amelyet melegítő lámpával kapcsolunk. A nyaki verőérbe kanült vezetünk be, és így Stratham P50 átalakítóval az Artériás vérnyomást mérjük. A vérnyomásméréssel egyidőben 6 mg/kg/óra sebességgel 0.6 ml/óra térfogatban pentobarbitál-nátrium oldatot adagolunk a kanülön keresztül infúzióként az állatoknak. Az infúzió ahhoz szükséges, hogy az érzéstelenítés szintjét a nyúlban fenntartsuk és a kanül nyitottságát fenntartsuk.

A jobb combi 1 artériát (7. ábra) a lágyéki 2 szalag alatt izoláljuk és az oldal 3 kör artéria alatt traumát hozunk létre úgy, hogy az artériát egy csipesz pofáján dörzsöljük. A 7. ábrán ugyancsak bemutjuk az alsó 4 gyomortáji artéria és a 6 mély combi artéria helyzetét is. Egy elektromágneses áramlási mérőt 5 (Carolina Medical Electronics, Inc., King, NC, USA) helyezünk az oldal kör artéria 3 alá, hogy a comb artéria véráramát mérjük. A 7 felületi gyomortáji artériába kanült vezetünk thrombus indukálás céljából. A thrombusokat az oldal kör artériától 3 távol lokalizáljuk, közeli és távoli 9 és 11 kacsok segítségével, amelyeket körülbelül 1 cm távolságra helyezünk be, és 5 egység emberi thrombinű(5 mikro 1), 5 mikro 1

0.25 m CaClrjtés 10-20 mikro 1 artériás νό^ζ amely elegendő az 1 artéria felfújásához thrombust indukálunk. 30 perc elteltével a 9 és 11 kacsokat kioldjuk és további 30 percig az áramot mérjük, hogy kimutassuk a thrombus által a teljes ki alakult áramlás lezárást.

t-PA (természetes típus - UHO) vagy analóg vegyületeket

i.v. infúzióval adagolunk 90 percig 5.0 vagy 10.0 mikrog/kg/perc *

dózisban. A thrombolfczist úgy mérjük, hogy meghatározzuk a combi artériás véráram visszaállását a t-PA vegyületre vagy analóg infúzióra adott válaszként. Az újraáramlást akkor tekintettük teljesnek, amikor a combi artéria véráram a kontroll áram legalább 50 %-át eléri és ezen a szinten marad. Az infúziót 90 perc után leállítjuk, és a combi artéria véráramát további 30 percig mérjük. A 30 perc megfigyelési időtartam után a t-PA vagy analóg vegyület infúzióját követően az állatot megöljük és a maradék thrombust kivágjuk, leitatjuk és azonnal mérjük. Az eredményeket a 2. Táblázatban adjuk meg.

	2. Tábláazat
t-PA analógok és	természetes típusú t-PA analógok

összehasonlítása nyúl comb artéria modell thrombosisban

Vegyület áramíál mikrog/kg/perc _mértJ_ke

Az újraáramlás A thrombus visszaállásáig tömege (mg) eltelt idő (perc)

BBNT5 (10)	7/8 (88%)	48.9 + 6.4	1.1 +	0.5
w/t t-PA(10)	19/21 (90%)	58.7 + 4.9	2.0 +	0.5
Saline	0/5 (0%)	-	9.2 +	0.9

2. Táblázat (folytatása)

BBNT6(5)	3/8 (37.5%)	82+ 6	4.9	+	1.02
ΒΒΝΤ1Κ5)	1/4 (25%)	69	5.4	+	1.9
BBNT12(5)	7/8 (87.5%)	71.9 + 10	1.6	+	0.7
w/t t-PA(5)	8/24 (33%)	64.4 + 6.6	4.9	+	0.7
GF6(5)	1/4 (25%)	90	2.7	+	0.6

Az adatokból kitűnik, hogy számos szubsztitúciós analóg hatásosabb mint a t-PA vegyület, az újraáramlás indukálásban, valamint hogy a hiányos GF6 mutáns (a tyr 67 és Phe 68 elhagyásával) amelyet az A-0240334 számú Európai szabadalmi bejelentésben írtak le nem hatásosabb, mint a t-PA anyag.

11. példa

BBNT5 farmakokinetikai analízise nyúlban

Vérminták vétele és az aktív t-P& meghatározása

A plazma gyűjtése: maradó katéteren keresztül a nyaki artériából vérmintákat veszünk a t-PA infúziója során a 0, 5, 8, 11 és 14 percekben, majd az infúzió befejezése után 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30 és 60 perccel. Két injekció tűs technikát alkalmazunk, hogy a minták szennyezését elkerüljük. 0.5 ml vérmintát 70 mikro 1 hűtött 100 mmol trinátrium-citráttal elegyítünk, és azonnal Éppendorf mikrocentrifligában 1 percig centrifugálunk. A plazmát azonnal eltávolítjuk és azonos térfogatú 1 m ecetsav/nátriumacetát (pH 3.8) oldatban tartósítjuk, amelyet gyorsan fagyasztunk, és a próba elvégzéséig -80°C hőmérsékleten tárolunk. A palzmában található aktív t-PA koncentrációját módosított és kalibrált S-2251 chromogen próbával határozzuk meg (Crysler és Pong, Pharmacologist 28 117 (1986)). Egy standard görbét hozunk létre gyűjtött citráttal kezelt nyúl plazmában, amelyet ugyanazzal a t-PA anyaggal készítünk, mint amelyet in vivő adagolásra alkalmaztunk. Egy jellemző próba elegy 0.1 ml térfogata az alábbiakat tartalmazza:

0.5 mikro m (0.045 mg/ml) emberi glu-plazminogén, 0.9 mikrom (0.3 mg/ml) fibrinogén, 3 mmol S-2251, 0.005 % triton X-100, 0.05 mmol EDTA, 0.05 mg/ml anti-t-PA vagy normál immunoglobulin. Az anti-t-PA anyagot kettős mintákban alkalmaztuk, hogy kivonjuk a nem t-PA anyagból származó amidolízis aktivitást. 0.30 IU/ml koncentrációjú standard görbe 90 perc 37°C hőmérsékletű inkubálást igényel. E próbát 0.1 ml

0.5 m ecetsav hozzáadással állítjuk le. A szín kifejlődést 410 nm értéknél Dynatech MR 600 lemez leolvasón mérjük, ahol a referencia hullámhossz 490 nm.

Farmakoki.netikus adat analízis:

A farmakokinetikus paraméterekkel PHARM adat analízis programmal becsültük (Gomeni R: PHARM, An Interactive Graphic Program fór Individual and Population Pharmacokinetic Paraméter Estimation. Comput Bioi Med 14:25, 1980). A félélettartamot a log-transzformait infúzió utáni adatok nem súlyozott lineáris regressziójával becsüljük. A plazma kiürülést (Cl_s) ás az eloszlás állandó állapotú térfogatát (V0_Sg) nem területi eljárásokkal számoljuk (Gibaldi M, Perrier D: Phamacokinetics 2nd Edition. Marcel Dekker Inc., New York, 1982). A plazma koncentráció kontra időgörbe (AUC) alatti területet a trapéz módszerrel számoljuk. Az utolsó aaátkontroli a végtelen időig terjedő AUC terület a teljes adatvonalhoz legjobban illeszkedő extrapolálással becsültük. Az extrapolált terület a teljes AUC kis százaléka ( %) volt. Az eredményeket a 3. Táblázatban adjuk meg.

- 46 3. Táblázat

BBNT5 t-PA és CHO természetes típusú t-PA farmakokinetikája combi artéria thrombósis nyúl modellben

Kísérlet időpontja - 1988 május (1) 8BNT5 analóg t-PA

Dózis 10 mcg/kg/perc x 90 perc vagy 3650 IU/kg/perc x 90 p e r c i . v .

Nyúl szám	(ml/ oerc/k§)	VD (mlF^g)	t-1/2 (perc )	(IU/ml)	Css S(ng/ml)
1	6.17	94.7	11.80	594.4	1628.5
2	4.39	65.9	9.19	867.9	2377.8
3	3.25	57.2	10.80	1133.2	3104.7
4	3.85	71.2	13.36	960.8	2632.3

Átl.	4.42	72.21	11.29	889.1	2435.8
S.D.	1.26	16.0	1.75	225.1	616.7

(2) CHO t-PA 5.32 χ 10⁵ IU/mg)

Dózis: 10 mcg/kg/perc vagy 5032 IU/kg/perc x 90 perc i.v.

(Táblázat adatait lásd a köv. oldalon!)

-47 • · · · ·* »* • · » · ♦ · · • · ·· 4 ··· ··· «*«*····· · · · • * · · ·« «·

3. Tájlázat (folytatása)

Nyúl szám	Cl s (ml/perc/kg)	Vdcc s s /ml/kg/	t-1/2 (perc)	S (IU/ml)	SS (ng/ml)
1	25.78	218.14	1.74	214.8	426.9
2	24.99	104.23	2.57	222.5	422.2
3	24.34	161.04	2.31	231.0	459.1
4	24.59	71.54	2.02	215.6	427.3
5	24.56	157.08	3.96	219.0	432.2

Átlag	24.85	142.41	2.52	220.58	433.5
S.D.	0.57	56.52	0.86	6.58	14.7

Cl_g = plazma kiürülés

VD - a stacionárius állapot eloszlás térfogata

- stacionárius koncentráció az S-2251 aktivitás ss próba alapján t-1/2 = infúzió utáni fél élettartam

Az így meghatározott BBNT5 plazma koncentrációja jelentősen hosszabb fél-élettartamot mutat, mint amelyet a természetes típusú t-PA anyag esetében ebben a modellben tapasztalunk.

Hasonló infúziós vizsgálatokat végeztünk BBNT6 és BBNT12 anyagokkal. A BBNT6 anyag 5.76 + 1.5 ml/perc/kg plazma kiürülés! sebességet és 9.9 + 4.2 perc fél-élettartamot, azaz ·*«» • 9 · · « · « « · « · · · * · ··· «··«··*«« · « « • · · · · · *·

- 48 t-1/2 értéket mutatott, míg a BBNT12 anyag plazma kiürülési sebessége 2.8 + 0.1 ml/perc/kg, és tl/2 értéke 13.4 + 0.7 perc. így kimutattuk, hogy ezen analógok esetében a plazma kiürülési sebesség ugyancsak jelentősen alacsonyabb, mint a t-PA anyag kiürülési sebessge, és a plazma fél élettartam jelentősen nagyobb, mint a t-PA anyag esetében megfigyelt érték.

A BBNT5, 6, 11 és 12 anyagokról kimutattuk, hogy ezek enzim aktivitása és vérrög lízisben kifejtett hatása nem csökkent a GF területen végzett szubsztitúciós mutációk, a máj receptor kötődésnek csökenésével jártak, és ez a plazmában jelentősen megnövelt fél-élettartamot eredményez. Nyűlakban végzett kísérletek kimutatták, hogy ezek az analógok vér-rög lízisben jobb hatásúak, mint a t-PA anyag. Ezzel szemben ugyan S-2251 próbában nem romlott enzim aktivitást mutat és a hepatocyta t-PA receptorral szemben nem fejt ki kompetitív kötődést, a GF6 elhagyásos mutáns vér—rög lízisben rosszabb hatású, mint a t-?A anyag.

Claims (15)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Fibrinolízisban aktív szövet plazminogén aktivátor (t-PA) analóg, amely legalább egy szubsztitúciót tartalmaz a növekedési faktor (GF) területen.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy legalább két szubsztitúciót tartalmaz.
3. 3.Az. 1. vagy 2. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy legalább egy szubsztitúciót tartalmaz a 63-72 maradékokat befoglaló béta-lapon.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy a Tyr 67 és/vagy Phe 68 helyzetben tartalmaz szubsztitúciót.
5. 5. Az 1. vagy 2. igényxpont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy az analóg másodlagos szerkezete legalábbis a 63-72 területen lényegében megegyezik a természetes t-PA szerkezettel.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy legalább egy más mutációt tartalmaz.

   - 50 • · · · ···· ···· • · •••· 4« «φ • « · · * • ·*· ··· • · · «
7. 7. Α 6. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy ez a szerin proteáz területen tartalmaz mutációt, amely a t-PA inhibitor kötődéssel kapcsolatos.
8. 8. Nukleinsav kódolás szövet plazminogén aktivátor (t-PA) analóg számára, amely legalább egy módosítást tartalmaz a növekedési faktor (GF) területen, amely módosítás legalább részben csökkenti a máj receptor kötődést, anélkül, hogy jelentősen rontaná a vérbeni stabilitást vagy a fibrinolízisben kifejtett aktivitást.
9. 9. A 8. igénypont szerinti nukleinsav a 2. igénypontban megadott t-PA analóg kódolására.
10. 10. A 9. igénypont szerinti nukleinsavat expresszáló sejtvonal.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti t-PA analóg azzal jellemezve, hogy emberi vagy állatgyógyászati gyógyszerként alkalmazzuk.
12. 12. Eljárás gyógyszerészeti formált alak előállítására azzal jellemezve, hogy egy vagy több 1. igénypontban leírt t-PA analógot és valamely gyógyszerészetileg vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot formált alakká feldolgozunk.

    ··· ··
13. 13. ' A 12. igénypont szerinti formált alak azzal jellemezve, hogy intravénás adagolásra alkalmas .
14. 14. Eljárás az 1. igénypont szerinti t-PA analóg felhasználására thrombolisis hatóanyag előállítására.
15. 15. Eljárás thrombosisos betegség kezelésére vagy megelőzésére azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti t-PA analóg hatásos nem toxikus mennyiségét adagoljuk.