HUT58069A - Process for producing aminobenzodiazepines and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Description

Találmányunk /1/ általános képletű új amino-benzodiazepinek /mely képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, nitrocsoport, halogénatom· trifluor-metil, kis szénatomszámú alkil-, hidroxil-, kis szénatomszámú alkoxi- vagy oianoosoport és o

R jelentése hidrogénatom vagy metiloeoport/ és gyógyászatilag alkalmas sóik előállítására vonatkozik·

Találmányunk tárgya

- a fenti vegyületek)

- a fenti vegyületek felhasználása gyógyászati hatóanyagként, külőnüsen vírusos fertőzések, különösen előnyösen retrovirusos fertőzések /pl· HÍV 1 és/vagy HÍV 2 fertőzések/ kezelésére vagy megelőzésére vagy sejteknek a fenti fertőzésekkel szemben történő megvédésére)

- eljárás a fenti vegyületek előállítására;

- egy vagy több fenti vegyületet és adott esetben második vírusellenes szert /előnyösen valamely fordított transzkriptáz gátlót /pl· ddC-t, AZT-t, valamely HlV-proteáz gátlót, eC-, β- vagy /'-interferont, interleukin-2-t és/vagy GM-CSí-t/ tartalmazó gyógyászati készítmények és eljárás ezek előállítására)

- a fenti vegyületek felhasználása gyógyászati készítmények /különösen vírusos fertőzések, előnyösen retrovirusos fertőzések - pl· HÍV 1 és/vagy HÍV 2 fertőzések - kezelésére vagy megelőzésére vagy sejteknek a fenti fertőzósekkel szemben történő megvédéséré szolgáló készítmények/ előállítására·

- 3 A leírásban használt kis szénatomszámú kifejezés egyenes- vagy elágazóláncú, legfeljebb 7 szénatomos szénhidrogéncsoportokra vonatkozik /metil-, etil-, propil- és izopropilcsoport/·

A gyógyászatilag alkalmas sók kifejezés szerves savakkal /pl· tejsav, ecetsav, almasav vagy p-toluolszulfonsav/ vagy ásványi savakkal /pl· sósav vagy kénsav/ képezett sókra vonatkozik·

A fenti vegyületek sztereoizomer vagy tautomer formákban lehetnek jelen és találmányunk valamennyi forma előállítására és felhasználására kiterjed·

Előnyős tulajdonságokkal rendelkeznek az R^ helyén klóratomot tartalmazó /1/ általános képletU vegyületek, különösen a 7-klór-N-metil-5-/lH-pirrol-2-il/-3H-l,4-benzodiazepin-2-amin.

A találmányunk tárgyát képező eljárás szerint az /1/ általános képletű vegyületeket oly módon állíthatjuk elő, hogy valamely /11/ általános képletű benzodiazepin-tiont /mely képletben R^ jelentése a fent megadott/ vagy a megfelelő, a kénatom helyén oxigénatomot tartalmazó amidot valamely /111/ általános képletű vegyülettel reagáltatjuk /ahol R jelentése a fent megadott/·

A reakciót szokásos módon végezhetjük el pl· úgy, hogy a /11/ általános képletű benzodíazepin-tiont tetrahidrof uránban és metanolban -78 °C-on ammóniával vagy a megfelelő /111/ általános képletü aminnal inért oldószerben /pl· tetrahidrofuránban, toluolban vagy dioxánban/ Lewis-sav /pl. titán-tetraklorid vagy ón-tetraklorid/ jelenlétében reagáltatjuk· A /11/ általános képletű benzodiazepin• ·

- 4 -tionokat a megfelelő amid és foszfor-pentaazulfid vagy 2,4-bi8z/4->metox i-fenil/-l,3-ditio-2,4-difoazfetán-2,4-diszulfid /Lawessen-reagens/ inért szerves oldószerben /pl· tetrahidrofurán, toluol, piridin vagy dioxán/ előnyösen 50*100 °C-on végrehajtott reakciójával állíthatjuk elő·

Az /1/ általános képletü vegyületek és sóik értékes retrovirusellenes, különösen HIV-ellenes hatással rendelkeznek· Ez a vírus az AIDS és azzal összefüggő betegségek, pl· ARC /AIDS-el összefüggő komplex/ kialakulásában játszik szerepet· Az /1/ általános képletü vegyületek továbbá gátolják a HIV-replikáoiót, éspedig fontos HÍV vírus funkciók /pl· TAT, azaz transzaktiváló transzkripciós aktivitás/ gátlása útján·

Az /1/ általános képletü vegyületek HIV-citopatikus hatás gátló és a sejttel asszociált vírusos antigéneket csökkentő hatását az alábbi kísérlettel határozzuk meg·

Magas titérti virustörzseket /HIV-1 NIT törzs/ 10 % magzati szarvasmarhaszérummal és 0,1 mg/ml gentamicinnel kiegészített RMPI-1640 táptalajban /Qibco Laboratories/ CD^+CR10 sejtekben tenyésztünk. Az összegyűjtött táptalajt szűrjük, az izolált vírust 100-szorosra koncentráljuk és -80 °C-on tároljuk· A fenti táptalajban szaporított CD^+CEM sejteket 37 °C-on hígított törzsvlrussal 1 értékű fertőzöttség sokszorosoddá /MOI/ mellett 60 percen át inkubáljuk· A sejteket foszfáttal pufferőit konyhasó-oldattal mossuk és 2x10^ sejt/ml koncentrációban a táptalajban újra szuszpendáljuk· Ezután különböző mennyiségű teszt-vegyliléteket dímetil-szulfoxiában beadagolunk· A fertőzés után 4 nappal • · * as élő sejtek számát tripánkék kizárásos módszerrel megszámoljuk £Ί?τοο· Natl. Acad. Sci· 83» 1911 /1986/^7· A sejtek aliquot részeit egyidejűleg acetonnái rögzítjük és AIDS be* tegek anti-testjeivel megfestjük, majd fluoreszcein-konjugált kecske anti-humán IgG /Cappel/ felhasználásával második festést végzünk el· A fluoreszkáló anti-testtel megfestett sejteket fluoreszcensz mikroszkóp felhasználásával összeszámláljuk és az eredményeket a megszámlált sejtek teljes számának százalékában fejezzük ki 27*^· ^irol 19« 325 /1986/JT.

A kapott eredményeket / /UM/ formájában fejezzük ki· Es az érték a teszt-vegyület azon koncentrációja, amelynek hatására az immunofluoreszcensz pozitív sejtek száma %-kal csökken· Az 1· példa terméke /A-vegyület/ esetében az ID^₀ érték 0,5-1 /uM, mig a 2· példa terméke /B-vegyUlet/

A citotoxicitás meghatározására szolgáló teszt során CEM sejteket hasonló koncentrációjú /1/ általános képlet U vegyülettel kezelünk és a vegyület toxlcitását az élő sejtek megszámlálásával mérjük.

Az 1· és 2· ábrán az A-vagy ület HIV-ellenes aktivitását ábrázoljuk· Az 1· ábrán az A-vegyUlettel kezelt HIV-1 fertőzött CEM-sejtek túlélési arányát tüntetjük fel· Az 1· ábrából továbbá kitűnik, hogy amennyiben az A-vegyUlet mennyiségét növeljük, úgy a HIV-anti-testekkol történő festés után immunofluoreszcensz-pozitiv sejtek százalékos aránya csökken· A 2· ábrán az A-vegyület HIV-ellenes aktivitását az AZT és ddC megfelelő hatásával hasonlítjuk össze?

— 6 • meghatárosást a sejt túlélés és p₂₄ antigén és vírusos RHS mennyiség mérésével végezzük el·

As A- és B-vegyület anti-HIV-TAT aktivitását is meghatározzuk· Az alkalmazott teszt az alábbi lépésekből állt a·/ ^Á kiválasztott alkálikus fossfatás /SeAP/ gén és a vírusos transzaktivátor TAT gén kifejezését a HÍV transzaktivátor TAT hatására reagáló HÍV promotor LTR által szabályozzuk· b·/ Tenyésztett emlős sejteket a fenti a/ génszerkezetet tartalmazó és a transzaktiváló faktor TAT és SeAP sejttermelését előidéző plasmidokkal transzferáljuk· o·/ A teezt-vegyUletet - jelen esetben A- és B-vegyülst hozzáadjuk és a termelt SeAP mennyiségét a SeAP enzim-aktivitás mérésével meghatározzuk! a SeAP termelés az anti-TAT gátló aktivitással függ össze· Ennél a tesztnél a SeAP gátlása az anti-TAT-aktivitással egyenesen arányos· Minél nagyobb a teszt-vegyület SeAP gátló hatása, annál magasabb az anti-TAT aktivitás·

Az anti-HIV-TAT teszt részletes leírását az alábbiakban ismertetjük!

Transsfekció után 24 órával két plazmiddal transzferált COS-sejteket tartalmazó táptalajhoz 1, 10, 25 és 50/uM teszt-vegyUletet adunkf as egyik plasmid a HIV-IZTR szabályozása alatt S«AP-ot kódoló rsporter gént tartalmas, mig a másik ugyancsak a HIV-LTR szabályozása alatt HIV-TAT gént foglal magában· A táptalaj lúgos fossfatáz aktivitását

-.4

- 7 • teszt-vogyület hozzáadása után 48 órával p-nitro-fenil-fossfát szubsztrátum felhasználásával végzett küiorimetriás meghatározással mérj ük. Az anti-TAT aktivitást oly módon mérjük, hogy a HIV-LTR által szabályozott SeAP génkifojezés százalékos gátlását a TAT-ra nem reagáló RSV-LTR által szabályozott SeAP gén százalékos gátlásával hasonlítjuk baszó. Az A- és B- vegyülettol külön-külön végzett három meghatározás átlagában a gátlás 60 %-nál nagyobb.

Fentiekből kitűnik, hogy az A- és B-vegyUlet a HIV-TAT által szabályozott génkifejezést specifikusan gátolja, nem-specifikus citotoxikus hatások előidézése nélkül.

As A- és B-v egy Illet specifikus TAT-gátló hatását párhuzamosan elvégzett teást segítségével is meghatározzuk, amelynek során a SeAP génkifejesést TAT-ra nem reagáló Rous sarcomé vírus /RSV/-LTR szabályozza. A fenti teszt kizárja annak lehetőségét, hogy az A- és B-vegyUlet általános citotoxikus szer vagy a SeAP aktivitását gátolja.

A teszt-vegyülőtek anti-HIV-TAT aktivitását oly módon határozzuk meg, hogy az alkálikul foszfátén mennyiségét a HÍV LTR promotor által szabályozott SeAP génkifejezésnél nyert sejttenyésnot felUlúezójJában mérjük. A teszt-vegyIlletek fajlagos gátló aktivitását az alábbi képlet segítségével határozzuk maga

1OO£ ( 1-A/B? -(1-0/0)^7 ahol

A és B a HIV-LTR/SeAP által a teezt-vegyülőt jelenlétében vagy anélkUl termelt alkálikus fossfatáz aktivitási és

C és 0 a RSV-LTR/SeAP által a teszt-vegyülőt jelenlétében vagy anélkül termelt alkálikus foszfatás aktivitás.

·♦·· ··« ··· ··· ··

- 8 ▲ teszt során a koncentráció-tartomány 1-50 ^uM. Az eredmények legalább három meghatározás átlagát képezik. A teszt-vegyIlletet 24 órával a sejteknek a plazmiddal történő transzfektálása után adjuk hozzá, amikor SeAP specifikus mRNS és fehérje már jelen van és a fehérje nagyon stabil. Ezért a fenti teszt során 100 %-os gátlást nem észlelünk. A 3. ábrán az A-vegy Illettel mért eredményeket tüntetjük fel.

Az A-vegyület anti-HIV-TAT aktivitását olyan sejtvonalakkal is meghatározzuk, amelyek HIV-LTR szabályozása alatt a SeAP gént konstitutív módon kifejezik. A 1930, 191? és 199? sejtvonalak CHO sej tokból /kínai hörcsög petefészek eredet/ származnak· Minden sejtvonal klonális eredetű és HIV-LTR/SeAP és HIV-LTR/TAT szekvenciái a oellulária kromoszómába integráltak· A sejtek széleaztéoe után 1 nappal /kb. 30 % egybefolyás/ a tenyészethez kívánt koncentrációban A-vegyület dinztil-szulfoxidos oldatát adjuk /0,05 % koncentráció/· A sejteket mossuk és az A-vegyUletét egy nappal később pótoljuk· A SeAP aktivitást a teszt-vegyUlet második hozzáadása után két nappal határozzuk meg· A mórt oitotoxioitási értékeket a 4· ábrán tUntotjUk fel· Látható, hogy mig az A-vegy ület HTV-LTR-promotor szabályozása alatt a SeAP kifejezést szignifikánsan gátolja /lásd a felső vonalak) addig a sejtekre citotoxikus hatást nem fejt ki /alsó szaggatott vonalak/·

HÍV által fertőzött humán betegek és szimptomatikus és aszimptomatikus HÍV fertőzést mutató betegek esetében az /1/ általános képletű vegyületek vagy sóik virus-ellenee hatást kifejtő dózisa kb. 0,1-10 mg/kg testtömeg/nap,

előnyösen kb· 0,3-5 ng/kg testtöneg/nap, különösen előnyösen kb· 1-3 ng/kg testtömeg/nap. A fenti dózist párénterállsan vagy orálisan, egyezerre vagy több részletben adhatjuk be és előnyösen orálisan naponta egyezer adagolhatjuk·

A találmányunk szerinti eljárással előállított vegyIlletteket más vírus-ellenes szerrel és/vagy a biológiai reakciót módosító hatóanyaggal egy (itt is adagolhatjuk· így pl· as /1/ általános képletű vegyülőtekét ismert RT /fordított transzkriptás/ inhibitorokkal /pl. ddC, AZT és ddl/ vagy HÍV fehérjékkel szemben hatékony más inhibitorokkal /pl· proteás/ továbbá biológiai módosító szerekkel /pl· </-, /4vagy '‘-interferon, intorleukin-2 és/vagy ŰM-CSP/ együtt is adagolhatjuk· így pl· ddC a legtöbb betegen kb· 0,005-0,25 ng/kg testtömeg dózisban virosztatikua hatást fejt ki· Orális adagolás esetén a kezdeti dózistartomány valamivel tágabb, pl· 0,001-0,25 ng/kg, egy vagy több dózisban, 2, 4, 6, 8 vagy 12 óránként beadva· Előnyösen adagolhatunk 8 óránként jelen ismereteink szerint

0,1 ng/kg testtömeg ddC-t. A ddC dózis előnyös értéke Y 8 óránként 0,01 mg/kg testtömeg· Kombinációs kezelés esetén a másik HIV-ellenes vegyületet az /1/ általános képletű vegyület tel egyidejűleg adhatjuk be vagy a két hatóanyagot váltakozva adagolhatjuk· A két /vagy több/ hatóanyag egyetlen készitnényben közösen is kikészíthető· Kombinációs kezelés esetén az egyes hatóanyagok a külön történő felhasználásnál kisebb dózisban adagolhatók·

A találmányunk szerinti eljárással előállítható vagy öletek önmagukban oldat formájában is beadhatók· Előnyösen járhatunk el azonban oly módon, hogy a hatóanyagokat gyógyá- 10 azati készítmény alakjában alkalmazsuk· A gyógyászati készítmények legalább egy hatóanyagot és egy vagy több gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot és/vagy excipienst és adott esetben további gyógyászati hatóanyagot /pl· proteáz inhibitor/ tartalmaznak· A készítmények előállításához orális, rektális, nazális, helyi, bukkális, szubllngvális, vaginális vagy parenterális /pl. ssubkutáns, intramuszkuláris, intravénás és intradermális/ adagolásra alkalmas hordozóanyagokat alkalmazhatunk·

A találmányunk szerinti készítmények pl· az alábbi formákban állíthatók élői a hatóanyag/ok/ oldatai pl· vízben vagy konyhasó-oldatban) kapszulák, pl· lágyzselatinkapszulák, tabletták vagy szögletes tabletták, ezek a hatóanyag előre meghatározott mennyiségét tartalmazzák, pl· granulák) oldatok vagy szuszpenziók vizes folyadékban vagy olaj-a-vizben emulziókban vagy viz-az-olaj folyékony emulziókban·

A tabletták egy vagy több hordozóanyagot, pl· laktózt, mikrokristályos cellulózt, kolloid szilicium-dioxidot, oroscarmellóz-nátriumot, magnézium-sztearátot, sztearinsavat és más exoipienseket, színezőanyagokat és gyógy ásza tilag alkalmas más hordozóanyagokat tartalmazhatnak· A helyi alkalmazásra szolgáló készítmények a hatóanyagot Ízesítő anyagban /előnyösen szacharóz, akáoiágumi és tragakant gumit/ tartalmazhatják· Ide tartoznak a hatóanyagot és inért alapanyagot /pl· zselatin, glicerin, szacharóz és akáoiógumi/ tartalmazó pasztillák és a hatóanyagot megfelelő folyékony hordozóanyagban tartalmazó szájöblítő folyadékok· A rektális adagolásra szolgáló készítmények pl· kúpok lehetnek) ezek • · ··· ··· • · • ··· ·· • · ··· · • · · ··· ··

- 11 kakaóvajat vagy szalioilátot tartalmazó kupalapanyagot foglalnak magukban. Vaginális alkalmazásra pesszáriumok, tamponok, krémek, zselék, paszták, habok vagy spray-készitmények állíthatók elő. A páréntorálla adagolásra szolgáié készítmények oxidáoiógátlókat, puffereket, bakteriosztatikus anyagokat és a készítmény ízotóníás jellegét biztosító adalékokat tartalmazó vizes vagy nem-vizes ízotóníás steril szuszpendáló- és sűrítőszerek is jelen lehetnek.

injekciós oldatok lehetnekj/A készítmények egyszeri vagy többszöri adagolásra alkalmas zárt tartányok /pl. ampullák és csövecskék/ formájában állíthatók elő, amelyek liofilizált állapotban tárolhatók és közvetlenül felhasználás előtt steril folyékony hordozóanyaggal /pl. injekciós célokra alkalmas víz/ hígíthatók. Azonnal felhasználható injekciós oldatok és szuszpenziók a fentiekben leírt steril porokból, granulákból és tablettákból állíthatók elő.

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

- 12 lo példa

0,5 g 7-klór-l,3~dihidro-5-/lH-pirrol-2-il/-l,4“ -benzodiazepin-2-on 25 ni tetrahidrofuránnal képesett oldatát jeges-aootonos fürdőben lehűtjük· As oldaton netll-anint buborékoltatunk át· As oldathoz keverés közben 0,29 ni titán-tetrakloridot csepegtetünk, majd 5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk éa utána további 0,2 ni titán-tetrakloridot adunk hozzá. A reakolóélégyhas 1Θ óra elteltével kis jégdarabot adunk, as elegyet csűrjük, tetrahidrofuránnal mossuk és bepároljuk· Metllén-klorid és metanol elegyéből történő kristályosítás és etanolos átkristály ősitás után 0,25 g 7-klór-N-motil-5-/lH-plrrol-2-ll/-3H-l,4-benzodlazepin-2-amint kapunk, kitermelés 48 %, op.i 251 °0.

2. példa a/ 10 g 7-klór-l,3-dihidro-5-71H-pirrol-2-il/-l,4-benzodlazepln-2-on és 400 ml tetrahldrofurán oldatához keverés közben 10 g P^S^Q-t adunk és a reakcióelegyet ultrahanggal 40 °C-on besugározzuk· Az elégyhez 2,5 óra múlva további 10 g adunk. A reakciót 2 órán át folytatjuk.

Λ reakcióelegyet szobahőmérsékletre hütjük és leszűrjük. A szilárd terméket dlklór-metánnal mossuk és az egyesített szűrletökből az oldóezer 80 %-át vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó oldatot telített nátriun-hldrogén-karbonát-oldattal neglugositjuk· A kiváló terméket szűrjük, a csűrletet diklór-metánnal extraháljuk, majd vákuumban bepároljuk· A szilárd maradékot tetrahldrofurán és petroléter elegyéből átkristályősitjuk. 9,9 g 7-klór-l,3-dihidro-5-/lH-pirrol-2-il/-l,4*toensodiazepin-2-tiont kapunk, kitermelés 94 %, • ·» • 13 ορ.ι 258*260 °C /bomlás/· b/ 0,5 g. as a/ behasdás sserint előállított vegyülat, 5 el tetrahidrofurán és 200 el netanol -78 °C-ra hűtött oldatán ammóniát buborékolhatunk át· A roakolóélegyet szoba* hónérsékletre hagyjuk felmelegedni és további 12 Órán át ke* verjük. As oldóasert eltávolítjuk· A kapott 7-klór-5-/lH-pirrol-2-il/-3H*l,4-bensodiazepin*2-aain 177-179 °C-on boa* lás hősben olvad, kitermelés 40 %·

Hatóanyagként valamely /1/ általános képletU vegyülő tét vagy sóját tartalmazó, alábbi összetételű galenikua hé* szitaényeket önmagukban ismert

Tabletták»

Hatóanyag

Laktóz

Blősselatinált keményítő

Orális folyékony készítmény!

Komponens

Hatóanyag

Metil-parabén

SsaoharÓB

Isesitősser

Oitrát*puffor

Tisztított vís q«s.

módszerekkel állítunk elő* K»nn>i»ta M/tablatt.

mg

160 mg og

M»nn>i.<a nuVUBaltaénj

20,0 mg

20,0 Dg

q.s.

<1·8· (j.S·

5,0 Dl

Tabletta»

Komponens

Hatóanyag

Keményítő

Avioel

Laktóz

Magnézium-sztearát

Lágyzzelatin kapszula»

Komponens

Hatóanyag

Etoxilezett zsírsavak

PEG 4000

Növényi olajok q.s.

Mennyiség mg/tabletta mg mg mg

274 mg mg

416 mg

Mennyiség mg/kapszula mg

500 mg

100 mg

1,0 ml

Claims (5)

1· Eljárás /1/ általános képletű amino-benzodiazepinek /mely képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, nitrocsoport, halogénatom, trifluor-metil, kis szénatomszámú alkil-, hidroxil-, kis szénatomszámú alkoxi- vagy cianoosoport és

Λ

R jelentése hidrogénatom vagy metilcaoport/ és gyógyászatilag alkalmas sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely /11/ általános képletű benzodlazepin-tiont /mely képletben R^ jelentése a fent megadott/ vagy a megfelelő, a kénatom helyén oxigénatomot tartalmazó amidót valamely /111/ általános képletü vegyület tel reagáltatjuk /ahol R jelentése a font megadott.

2· Az 1. igénypont szerinti eljárás, helyén klóratomot tartalmazó /1/ általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk·

3· Az 1· vagy 2· igénypont szerinti eljárás 7-klőr-N-me t i 1-5-/ ΙΗ-pirr o 1-2-i 1/-3H-1,4-ben zod lazep in-2-amin előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk·

4· Eljárás gyógyászati készítmények - különösen vírusos fertőzések, különösen előnyösen retrovirusos fertőzések /pl· HÍV 1 és/vagy HÍV 2 fertőzések/ kezelésére vagy megelőzésére vagy a sejteket a fenti fertőzésekkel szemben megvédő gyógyászati készítmények - előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1· igénypont szerinti « eee • ·9 eee ·· ··· ♦ · · ee ·*· eljárásial előállított /1/ általános képletű vegyületet sóját és adott esetben második vlrus-ellenee szert - előnyösen valamely fordított transzkrlptáz inhibitort /pl· ddC, AZT/ valamely fíiv-proteáz inhibitort, <<-, fl- vagy X· -interferont, interleukin-2-t és/vagy OM-CSf-t - galenlkue formára hozunk·

5· As 1· 2« vagy 3· igénypont szerinti vegyület felhasználása vírusos fertőzések - különösen retrovirusos fertőzések mint pl. HÍV 1 és/vagy HÍV 2 fertőzések - megelőzésére vagy kezelésére szolgáló vagy sejteket a fenti fertőzésekkel szemben megvédő gyógyászati készítmények előállítására·

A bejelentő helyett a meghatalmazotti