HUP0401841A2

HUP0401841A2 - Combined micropropagating process and bioreactor

Info

Publication number: HUP0401841A2
Application number: HU0401841A
Authority: HU
Inventors: Miklos Gabor Dr Fari; Tamas Kertesz; Miklos Dr Laszlo; Zsuzsanna Varga
Original assignee: Agroinvest Kuelkereskedelmi
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2006-07-28
Also published as: HU0401841D0

Description

Ρθ 4 Ο 1 8 4 1Ρθ 4 Ο 1 8 4 1

KOMBINÁLT MIKROSZAPORÍTÓ ELJÁRÁS ÉS BIOREAKTORCOMBINED MICROPROPAGATION PROCESS AND BIOREACTOR

AGROINVEST Rt.AGROINVEST Co., Ltd.

BudapestBudapest

Feltalálók:Inventors:

Dr. FARI Miklós Gábor Dr. Miklós Gábor FARI Budakeszi Budapest 50% 50% KERTÉSZ Tamás GARDENER Tamás Budapest Budapest 30% 30% Dr. LÁSZLÓ Miklós Dr. Miklós LÁSZLÓ Budapest Budapest 10% 10% VARGA Zsuzsanna Zsuzsanna VARGA Budapest Budapest 10% 10%

A bejelentés napja: 2004. szeptember 10.Date of announcement: September 10, 2004.

A találmány tárgya kombinált mikroszaporító eljárás, melynél vegetatív szöveteket steril állapotban zárt térben tagúk célszerűen 20-30 °C közötti hőmérsékleten, megvilágítjuk, 25-60 perces időközönként 5-10 percre ismételten folyékony táptalajba merítjük, a merítések között a táptalaj fölött tartjuk és bioreaktor, melynek fényáteresztő folyadék- és gáztömören zárt, önhordó héjazata legalább egy fedéllel, valamint csonkokkal van ellátva, a héjazat belső tere pedig egy célszerűen V-szelvényű, a szaporítandó vegetatív szövetekhez rendelt fény-, folyadék- és gázáteresztő hordozó elemmel van két részre osztva.The subject of the invention is a combined micropropagation method, in which vegetative tissues are illuminated in a sterile closed space, preferably at a temperature between 20-30 °C, repeatedly immersed in a liquid medium for 5-10 minutes at intervals of 25-60 minutes, held above the medium between immersions, and a bioreactor, the light-permeable, liquid- and gas-tight, self-supporting shell of which is provided with at least one lid and stubs, and the interior of the shell is divided into two parts by a light-, liquid- and gas-permeable carrier element, preferably V-shaped, assigned to the vegetative tissues to be propagated.

·· :* .:. .:.·· :* .:. .:.

Jelen leírásunkban a „kombinált eljárás és bioreaktor” meghatározás alatt a laboratóriumi kutatás, a féküzemi kísérlet és az iparszerű termelés külön-külön, egymástól független és az egymás melletti, egyidejű megvalósítására, továbbá az egy növény azonos szövetelemeinek és egymástól eltérő, más és más szövetelemeinek, valamint egymástól eltérő, más és más növények szövetelemeinek mikroszaporítására való alkalmasságot értjük.In this description, the term “combined process and bioreactor” refers to the ability to carry out laboratory research, brake plant experiments and industrial production separately, independently of each other and side by side, simultaneously, as well as to micropropagate identical tissue elements of a plant and different, different tissue elements of different, different plants.

A hagyományos mikroszaporítás nagy kézimunkaerőt igénylő növénybiotechnológiai módszer, ami a szaporítóanyag árát jelentősen növeli. A hagyományos módszer terjedését korlátozza az is, hogy bizonyos fajok és fajták továbbra is nehezen tenyészthetők, és/vagy nem fejlődnek tökéletesen, többnyire az eddig alkalmazott in vitro nevelési módszerek által okozott speciális stressz-feltételek között. Példánul az agar-agarral és más anyagokkal gélesített táptalajok nem megfelelően szolgálják a növények tökéletes tápanyagfelvételét, ezzel a vegetatív növekedést. A hagyományos tenyésztő edények záró rendszeréről ismert, hogy a külső fertőzések megelőzése általában azzal a következménnyel jár, hogy a belső térben hormonhatású, a biológiai öregedést serkentő gáz halmazállapotú anyag, az etilén halmozódik fel. Fentiek akkumulálódó hatása következtében számos faj in vitro tényésztése, mikroszaporítása ma még nem lehet versenyképes a hagyományos módszerekkel.Traditional micropropagation is a labor-intensive plant biotechnology method, which significantly increases the price of the propagation material. The spread of the traditional method is also limited by the fact that certain species and varieties are still difficult to cultivate and/or do not develop perfectly, mostly under the special stress conditions caused by the in vitro cultivation methods used so far. For example, media gelled with agar-agar and other substances do not adequately serve the plants' perfect nutrient uptake, and thus vegetative growth. It is known from the closing system of traditional cultivation vessels that the prevention of external infections usually results in the accumulation of ethylene, a gaseous substance with hormonal effects that stimulates biological aging, in the internal space. Due to the cumulative effect of the above, the in vitro cultivation and micropropagation of many species cannot yet be competitive with traditional methods.

A bioreaktor általában sejtek, szövetek és szervek hatékony steril (in vitro) tenyésztésére kifejlesztett, többnyire automatikus irányítással vezérelt speciális eszközök. Legfontosabb részei a következők: üvegből készített tenyésztő tartályok, a tenyészetek növekedését érzékelő szondák, illetve ennek függvényében a növekedést programozottan irányítani képes technikai eszközök.A bioreactor is a special device, usually controlled by automatic control, developed for the efficient sterile (in vitro) cultivation of cells, tissues and organs. Its most important parts are the following: culture containers made of glass, probes that detect the growth of the cultures, and technical devices capable of programmatically controlling the growth accordingly.

A mikroszaporító bioreaktor a mesterséges megvilágítással ellátott, un. fito-bioreaktorok egyik legújabb alcsoportját képezik. Közös jellemzőjük, hogy elsősorban vegetatív szövetek, például rügyek, hajtások, magok, csírák, gyökerek optimális növekedésének programozott irányítására alkalmasak, az in vitro morfogenezist befolyásoló belső és külső tér kémiai, fiziko-kémiai, és fizikai fényezőinek (táptalaj, fény minősége és mennyisége, illetve a belső gáztér) szabályozásával.Micropropagation bioreactors are one of the newest subgroups of so-called phytobioreactors equipped with artificial lighting. Their common feature is that they are primarily suitable for the programmed control of the optimal growth of vegetative tissues, such as buds, shoots, seeds, germs, and roots, by controlling the chemical, physicochemical, and physical factors of the internal and external space (culture medium, quality and quantity of light, and the internal gas space) that influence in vitro morphogenesis.

A mikroszaporítás a kertészeti (és általában a növényi) biotechnológia egyik világszerte bevezetett, számottevő gyakorlati és tudományos jelentőséggel bíró ága. Az elmúlt évekb en az egymilliárd kézimunkaerő igény (az önköltség 70-75 %-a körüli hányaddal), ami a szaporítóanyag árát jelentősen drágítja. Ezenkívül számos műszaki-biológiai probléma akkumulálódó hatása következtében az in vitro mikroszaporítás ma még sok fej esetében nem versenyképes a hagyományos klónszaporítással. E közös gondok miatt az iparszerű mikroszaporítás súlypontja nagyrészt a fejlődő országokba tevődött át, elsősorban Kínába és Indiába. A kutatók egyöntetű véleménye szerint a mikroszaporítás közeljövője elsősorban a műszaki-technikai haladás eredményességétől, másodsorban a célzott biológiai kutatások felgyorsulásától függhet. A szakterületet megalapozó K+F jellemző iránya ma a speciális mikroszaporító bioreaktorok kifejlesztése. Ezek közös jellemzője, hogy folyékony táptalajon történik a tenyésztés. A nagyobb felületen táptalajjal érintkező inokulumok, növények gyorsabban és egészségesebben fejlődnek a hagyományos agar-agarral szilárdított táptalajokhoz képest. A növények optimális fejlődését újabb és újabb technikai megoldásokkal kívánják biztosítani. Áttekintve az elmúlt évtizedek nemzetközi fejlesztésének fö irányait és eredményeit, elmondható, hogy a létrehozott mikroszaporító bioreaktorok, új laboratóriumok nem, vagy csak nagyon alacsony szinten képviselik a korunkra jellemző digitális műszaki világot. A növényi szövettenyésztés és bioreaktor kutatások kezdete tulajdonképpen 100 évre nyúlik vissza.Micropropagation is a branch of horticultural (and plant) biotechnology that has been introduced worldwide and has considerable practical and scientific significance. In recent years, it has required a billion manual labor (about 70-75% of the cost), which significantly increases the price of the propagation material. In addition, due to the cumulative effect of numerous technical and biological problems, in vitro micropropagation is still not competitive with traditional clonal propagation in many cases. Due to these common problems, the focus of industrial micropropagation has largely shifted to developing countries, primarily China and India. According to the unanimous opinion of researchers, the near future of micropropagation may depend primarily on the success of technical progress and secondarily on the acceleration of targeted biological research. The characteristic direction of R&D that has established the field today is the development of special micropropagation bioreactors. Their common feature is that they are grown on liquid media. Inocula and plants that come into contact with the media on a larger surface area develop faster and healthier compared to traditional media solidified with agar-agar. The optimal development of plants is sought to be ensured with newer and newer technical solutions. Reviewing the main directions and results of international development in recent decades, it can be said that the micropropagation bioreactors and new laboratories that have been created do not, or only at a very low level, represent the digital technical world typical of our time. The beginning of plant tissue culture and bioreactor research actually dates back 100 years.

A folyadékban történő in vitro növényi szövettenyésztés ötlete nem új, jelentős hagyományokra tekint vissza. A 19. század elején a Mosonmagyaróvárott született grazi, majd berlini növényélettan professzor, Gottlieb Haderlandt - jóllehet a steril tenyésztési feltételeket még nem tudta megteremteni - lényegében egy „mini bioreaktort” létesített, amikor mikroszkópi tárgylemez fuggőcseppjében kívánta tanulmányozni a mechanikus úton elkülönített növényi sejtek osztódását és növekedését. Alexis Carrel munkáihoz hasonlóan White folyamatosan növekvő paradicsom gyökérkultúráit ugyancsak folyékony táptalajon tenyésztette. Az ötvenes években több szerző foglalkozott folyadékkultúrára alapozott, periodikus bemerülésű növényi szövettenyésztő készülékek szerkesztésével, mint például de Ropp, vagy Sossounchev. Eszközeik üvegből készültek, és érzékenyek voltak a külső fertőződésre, így nem terjedhettek el. A következő évtizedekben a növényi mikroszaporítást az agar-agarral szilárdított, un. szemiszolid táptalajon történő tenyésztés jellemezte. A mikroszaporítás automatizálása iránt fokozódó elvárás - a múlt század nyolcvanas éveinek közepétől - ismét felkeltette az érdeklődést a periodikus folyékony táptalaj ellátás elve iránt.The idea of in vitro plant tissue culture in liquid is not new, it looks back on significant traditions. At the beginning of the 19th century, Gottlieb Haderlandt, a professor of plant physiology from Graz, who was born in Mosonmagyaróvár and later in Berlin, created what was essentially a “mini bioreactor” when he wanted to study the division and growth of mechanically separated plant cells in a hanging drop of a microscope slide, although he was not yet able to create sterile cultivation conditions. Similar to the work of Alexis Carrel, White also cultivated continuously growing tomato root cultures on liquid medium. In the 1950s, several authors worked on the construction of plant tissue culture devices based on liquid culture, with periodic immersion, such as de Ropp or Sossounchev. Their devices were made of glass and were sensitive to external contamination, so they could not spread. In the following decades, plant micropropagation was carried out using agar-agar-solidified, so-called The increasing demand for automation of micropropagation - from the mid-1980s - has once again aroused interest in the principle of periodic liquid medium supply.

A korai mikroszaporító bioreaktorok a folyadékközeghez speciálisan tervezett tenyészedények voltak.Early micropropagation bioreactors were culture vessels specially designed for liquid media.

Magyarországon az 1980-as évek közepén folyadékkultúrán alapuló üzemi mikroszaporítási technológia kialakítását kutatták. Az egyik rendszer célja orchidea üzemi szaporítása volt. A folyadékban történő magvetés és tenyésztés céljára kialakított henger alakú eszköz belső terét három kamrára osztották. E „háromkamrás karibrátor” nevű, folyékony táptalajjal feltöltött eszköz mind tengely irányban elhelyezve un. roller-csőként működött, mind pedig rázógépre helyezve, vagy mágneses keverövel kombinálva lehetett az orchidea protokormokat (hajtásrügyeket) benne tenyészteni. A harmadik üzemmódban az orchidea protokormokat méret szerint lehetett elkülöníteni (Fári et al., 1986). A másik kísérleti irány célja rekalcitráns (makacs, nehezen tenyészthető) szőlőfajták folyadékkultúrában történő mikroszaporítása volt. A szaporítás autoklávozható, a tengely körül folyamatosan forgó, horizontális transzparens üveg hengerekben („rotary drum” rendszer), a gyökereztetés előre sterilezett Veg-Boksz műanyag konténerekben történt.In Hungary, in the mid-1980s, research was conducted on the development of a plant micropropagation technology based on liquid culture. The aim of one system was the plant propagation of orchids. The inner space of a cylindrical device designed for seeding and cultivation in liquid was divided into three chambers. This device, called a “three-chamber caribrator”, filled with liquid culture medium, functioned as a so-called roller tube when placed in the axial direction, and could be placed on a shaker or combined with a magnetic stirrer to cultivate orchid protocorms (shoot buds). In the third mode, orchid protocorms could be separated by size (Fári et al., 1986). The aim of the other experimental direction was the micropropagation of recalcitrant (stubborn, difficult to cultivate) grape varieties in liquid culture. Propagation was carried out in autoclavable, horizontal transparent glass cylinders rotating continuously around an axis (rotary drum system), and rooting was carried out in pre-sterilized Veg-Box plastic containers.

Tisserat and Vandercook (1985) voltak az elsők, akik számítógéppel vezérelt szerkezetükkel megalapozták a periodikus folyékony táptalaj ellátású, mai növényi mikroszaporító bioreaktor építés alapjait. A periodikus folyékony táptalaj ellátás elvét azóta mások is kutatták és alkalmazzák (Farrell, 1987; Aitken-Christie, 1988; Aitken-Christie, 1991; Simonton et al. 1991; Teisson and Alvard, 1985; Berhouly and Etienne, 2002; Etienne and Berthouly, 2002; Espinosa et al. 2002; Firoozobady and Gutterson, 2003). A folyadékközegre épülő növényi mikroszaporítás biológiai-technikai alapjainak fejlesztése terén további újdonságok ismertek. Ezek közül figyelmet érdemel az in vitro gáztér CO₂ tartalmának növelésével és a szénhidrát megvonásával elérhető un . „photoatotrophic” tenyésztés (Fujiwara et al. 1988; Kozai et al. 1992; Tisserat et al. 1997; Tisserat et al. 2000; Kozai and Kubota, 2001), a belső légtér összetételének, etilén tartalmának ismerete és erőteljes cseréjére irányuló kutatások (Gamborg and LaRue, 1968; De Profit et al. 1985; Zobayed et al. 1999; Heo et al. 2001; Wilson et al. 2001; Jackson, 2002) és a megvilágításhoz használt fény szerepének felértékelődése a tenyésztéskor és az akklimatizálás időszakában (Desjardins et al. 1987; Hvoslef-Eide et al. 2002; Xiao et al. 2003).Tisserat and Vandercook (1985) were the first to lay the foundations for the construction of a modern plant micropropagation bioreactor with periodic liquid medium supply using their computer-controlled structure. The principle of periodic liquid medium supply has since been researched and applied by others (Farrell, 1987; Aitken-Christie, 1988; Aitken-Christie, 1991; Simonton et al. 1991; Teisson and Alvard, 1985; Berhouly and Etienne, 2002; Etienne and Berthouly, 2002; Espinosa et al. 2002; Firoozobady and Gutterson, 2003). Further novelties are known in the field of developing the biological and technical foundations of plant micropropagation based on _liquid media. Among these, the so-called . “photoatotrophic” cultivation (Fujiwara et al. 1988; Kozai et al. 1992; Tisserat et al. 1997; Tisserat et al. 2000; Kozai and Kubota, 2001), research on the composition and ethylene content of the indoor air and its intensive exchange (Gamborg and LaRue, 1968; De Profit et al. 1985; Zobayed et al. 1999; Heo et al. 2001; Wilson et al. 2001; Jackson, 2002) and the appreciation of the role of light used for illumination during cultivation and the acclimation period (Desjardins et al. 1987; Hvoslef-Eide et al. 2002; Xiao et al. 2003).

További nagy jelentőségű fejlesztési irány a szomatikus embriók bioreaktorban történő tenyésztése és felhasználása mesterséges mag előállítására (Preil, 1991; Takayama et al. 1994; Cantlifife, 2001; Sorvari et al. 1997; Sorvari et al. 2002), különböző bioreaktorok felhasználása steril hajtások szaporítáára (Takayama and Misawa, 1981; Vasil, 1991; Ziv, 1995; Ziv, 2000; Yu et al. 2000; Paek et al. 2001; Thakur et al. 2002; Pruski et al. 2002; Damiano et al. 2002; Dey, 2002; Grigoroadou et al. 2002; Konstas and Kintzios, 2003; Lian et al. 2003; Piao et al. 2003).Another important development direction is the cultivation and use of somatic embryos in bioreactors for the production of artificial seeds (Preil, 1991; Takayama et al. 1994; Cantlifife, 2001; Sorvari et al. 1997; Sorvari et al. 2002), the use of various bioreactors for the propagation of sterile shoots (Takayama and Misawa, 1981; Vasil, 1991; Ziv, 1995; Ziv, 2000; Yu et al. 2000; Paek et al. 2001; Thakur et al. 2002; Pruski et al. 2002; Damiano et al. 2002; Dey, 2002; Grigoroadou et al. 2002; Konstas and Kintzios, 2003; Lian et al. 2003; Piao et al. 2003).

A humán sejttenyészetekben és a fermentor technológiában ismert un. horizontális „rotary drum” (forgó dob) bioreaktorok a mikroszaporításbhan nem kerültek bevezetésre. Ennek a rendszernek a lényege, hogy a reaktor csövek, dobok a tengely mentén egyirányban forognak (Sajc et. Al. 2000). A legfejlettebb, miniatürizált, az űrrepülésre is szánt horizontális dobbioreaktor legújabb generációját a NASA Johnson Research Center fejlesztette ki 1994-1996 között. Ezen reaktor teste egy speciális, ugyancsak egyirányban forgó, a tenyészeteket magába foglaló műanyag henger, amelyek belső levegőztetésével a vérerek funkcióját töltik be. Ezt a hossztengely mentén középen elhelyezett, a forgás közben is tömítetten maradó speciális csővel oldják meg, melybe a levegőt egy kis szivattyú préseli be (Ingram et al. 1996; Ingram et al. 1997; Mitteregger et al. 1999).The so-called horizontal “rotary drum” bioreactors known in human cell cultures and fermentor technology have not been introduced in micropropagation. The essence of this system is that the reactor tubes and drums rotate in one direction along the axis (Sajc et. Al. 2000). The most advanced, miniaturized, latest generation of horizontal drum bioreactors intended for space flight was developed by NASA Johnson Research Center between 1994-1996. The body of this reactor is a special, also unidirectional rotating plastic cylinder containing the cultures, which, by internal aeration, fulfill the function of blood vessels. This is achieved by using a special tube located centrally along the longitudinal axis, which remains sealed even during rotation, into which air is forced by a small pump (Ingram et al. 1996; Ingram et al. 1997; Mitteregger et al. 1999).

Megállapítható, hogy a bioreaktorra épülő fejlesztéseknek köszönhetően a kereskedelmi laboratóriumokban új mikroszaporítási generáció technológiája körvonalazódik, amely a hagyományos technológiát számos faj esetében versenyképtelenné teheti (Savingicar et al. 2002; Ahoroni, 2002; Gontier et aL 2002). Az új technológiának a kifejlesztése műszaki és biológiai high-tech tudományos kutatásokat követel. Új, zárt rendszerű, online irányítást is feltételező mikroszaporító bioreaktorok létrehozása a 21. század első évtizedének közepén reálissá vált, mely munka nem nélkülözheti a bioreaktor-technológia más területeken szerzett tapasztalatainak közvetlen hasznosítását. A jövő fejlesztéseiben az in vitro tenyésztés stresszfüggő biokémiai folyamatait az eddigieknél mélyebb, molekuláris szinten is tanulmányozni kell (Gribble et al. 1998; Paek et al. 2001; Curtis, 2002; Joyce et al. 2003). A fentiek alapján látható, hogy a jövő mikroszaporító iparának egyik nagy, eddig a látókörön kívül maradt lehetősége a horizontális dobbioreaktor koncepció, amennyiben az eddig alkalmazott költséges és precíziós — technikát fel lehetne váltani olcsóbb, es a szeptikus munkát mégis garantáló, biztonságos megoldásokkal.It can be stated that, thanks to the developments based on bioreactors, a new generation of micropropagation technology is emerging in commercial laboratories, which may make traditional technology uncompetitive in the case of many species (Savingicar et al. 2002; Ahoroni, 2002; Gontier et al. 2002). The development of the new technology requires technical and biological high-tech scientific research. The creation of new, closed-system micropropagation bioreactors, also assuming online control, became realistic in the middle of the first decade of the 21st century, and this work cannot do without the direct utilization of the experiences gained in other areas of bioreactor technology. In future developments, the stress-dependent biochemical processes of in vitro cultivation should be studied at a deeper, molecular level than before (Gribble et al. 1998; Paek et al. 2001; Curtis, 2002; Joyce et al. 2003). Based on the above, it can be seen that one of the great opportunities for the micropropagation industry of the future, which has remained out of sight until now, is the horizontal drum bioreactor concept, if the expensive and precision technology used so far could be replaced with cheaper, safe solutions that still guarantee septic work.

···'· ·♦* *·’ ·ί.···'· ·♦* *·’ ·ί.

A találmányunkhoz mind technológiai, mind berendezés-technikai szempontból a legközelebbi megoldásoknak az E. Firoozabady — N. Guttersom „Cost-effective in vitro propagation methods for pineapple” című. /Plant Cell Reports. 21 (9). 844-850, 2003/ közleményéből ismertté váltakat tekintjük.We consider the solutions closest to our invention, both technologically and from an equipment-technical point of view, to be those known from the publication by E. Firoozabady — N. Guttersom entitled “Cost-effective in vitro propagation methods for pineapple”. /Plant Cell Reports. 21 (9). 844-850, 2003/.

Az ismert legkorszerűbb megoldások fö hátrányát továbbra is a nagy élőmunka-igényben és az ezekkel mikroszaporítható növények szűk körében jelöljük meg.The main disadvantage of the known state-of-the-art solutions is still the high labor requirement and the narrow range of plants that can be micropropagated with them.

A találmány feladata a szóbajöhető növények szempontjából sokoldalú, az alkalmazástechnika szempontjából többcélú megoldás kidolgozása.The task of the invention is to develop a solution that is versatile in terms of the plants involved and multi-purpose in terms of application technology.

A találmány szerint ezt a feladatot azzal oldjuk meg, hogy szaporítás közben az előnyösen 30 mikroEinsetin/m² sec energiával megvilágított vegetatív szöveteket billentéssel merítjük a táptalajba, majd ellentett forgásértelmű billentéssel visszaemeljük a táptalaj fölé.According to the invention, this task is solved by immersing the vegetative tissues, preferably illuminated with an energy of 30 microEinsetin/m ² sec, into the culture medium by tilting them, and then lifting them back above the culture medium by tilting them in the opposite direction of rotation.

A találmány szerinti bioreaktor lényege az, hogy körszelvényű felfekvő felülete/i/ van/nak, amely/ek/ a menesztő-egységre van/nak/ telepítve, továbbá legalább egy, a menesztőegységhez épített végálláskapcsoló/k/hoz rendelt mágnese van, adott esetben a belépőcsonk/ok/ flexibilis csöv/ekk/el önmagukban ismert steril-gáz- és/vagy steril-táptalajtápegységekre van/nak/ kötve, végül héjazata egy önmagában ismert megvilágító-egység fényudvarában van elrendezve.The essence of the bioreactor according to the invention is that it has a circular contact surface(s) which is/are installed on the drive unit, furthermore it has at least one magnet assigned to the limit switch(es) built into the drive unit, optionally the inlet branch(es) are/are connected to sterile gas and/or sterile culture medium supply units known per se by flexible tube(s), and finally its shell is arranged in the halo of an illumination unit known per se.

A találmányt a továbbiakban a bioreaktor egy célszerű példaként! kiviteli változatának rajza segítségével részletesen ismertetjük. A rajzon azThe invention will be described in detail below with the aid of a drawing of a preferred exemplary embodiment of the bioreactor. In the drawing,

1. ábra a bioreaktor vázlatos oldalnézete metszetben, aFigure 1 is a schematic side view of the bioreactor in section,

2. az 1 ábra II.-II. vonala mentén vett lépcsős szelvény.2. stepped section taken along line II.-II. of Figure 1.

A rajzon egyes, a működés szempontjából elengedhetetlen, de a találmányi gondolat kifejtése körében mellőzhető egységeket és alkatrészeket nem tüntettük fel a könnyebb áttekintés érdekében. Egyebek között ilyenek a steril-gáz-tápegység, a steril-táptalaj-tápegység, a kézi és számítógépes program-vezérlések kapcsolása és felépítése, az egyes műveleti paraméterek érzékelő-ellenőrző-elemeinek beépítése és kapcsolása, végül a különféle csapok, szelepek, tömítések és kötőelemek.In the drawing, some units and components that are essential for operation but can be omitted in the context of the development of the inventive idea have not been shown for the sake of easier overview. These include, among others, the sterile gas supply unit, the sterile culture medium supply unit, the connection and structure of the manual and computer program controls, the installation and connection of the sensor and control elements of the individual operating parameters, and finally the various taps, valves, seals and fasteners.

Leírásunkban a „bioreaktor” szót kettős értelemmel használjuk: a szaporítandó növényt és a folyékony táptalajt tartalmazó edényt, továbbá a célszerűen több edénnyel felszerelt és működő, a különféle tápegységekkel és program-vezérlő-egységekkel összekötött, építőkockaszerűen bővíthető modulokat értjük alatta.In our description, we use the word "bioreactor" with a double meaning: we mean the vessel containing the plant to be propagated and the liquid culture medium, as well as the modules that are conveniently equipped and operating with multiple vessels, connected to various power supplies and program control units, and can be expanded like building blocks.

A találmány szerinti 1 bioreaktor autoklávozható és fényáteresztő anyagból készült, folyadékés gáztömören zárt, önhordó héjazata, esetünkben 2 körhenger legalább egy fedéllel, esetünkben két síkfedéllel, a 3 hátsó fedéllel és a 4 mellső fedéllel van bezárva.The bioreactor 1 according to the invention is made of an autoclavable and light-permeable material, is closed in a liquid- and gas-tight, self-supporting shell, in our case a circular cylinder 2 with at least one lid, in our case two flat lids, the rear lid 3 and the front lid 4.

A 3 hátsó fedélre az 1 bioreaktor belső teréhez viszonyítva kívülről és koncentrikusan van az 1 bioreaktor billenő mozgásának behatárolásához szükséges 5 mágnes/ek/ 6 tartógyűrűje felszerelve. Az 5 mágnes a 6 tartógyűrűn fokozatmentesen helyzetbe állítható és rögzíthető.The 5 magnet(s)/6 support ring necessary for limiting the tilting movement of the bioreactor 1 are mounted on the rear cover 3 from the outside and concentrically with respect to the interior of the bioreactor 1. The magnet 5 can be continuously adjusted and fixed in position on the support ring 6.

A 3 hátsó fedél geometriai tengelyével koaxiálisán kiképzett, átmenőfurattal ellátott fészekben van a menetes szárával az 1 bioreaktor belső terébe benyúló 7 vonócsavar rögzítve. A 4 mellső fedélen koaxiálisán keresztülvezetett 8 furatokkal ellátott 9 csőtengely hátsó végén kiképzett belső menete van a 7 vonócsavarra felhajtva. A 4 mellső fedélen kívül a 9 csőtengely mellső végének szomszédságában van a 9 csőtengelyen rögzítve egy 10 tárcsa. A 10 tárcsával felhajtott 9 csőtengellyel, mint vonórúddal van a 2 körhenger, a 3 hátsó fedél és a 4 mellső fedél folyadék- és gáztömören összefeszítve. A 9 csőtengely visszaforgatásával ezek szétbonthatóvá válnak.A draw screw 7, which extends into the interior of the bioreactor 1 with its threaded shank, is fixed in a nest formed coaxially with the geometric axis of the rear cover 3 and provided with a through hole. The internal thread formed at the rear end of the tubular shaft 9, which is coaxially guided through the front cover 4, is folded up onto the draw screw 7. In addition to the front cover 4, a disc 10 is fixed on the tubular shaft 9 in the vicinity of the front end of the tubular shaft 9. The circular cylinder 2, the rear cover 3 and the front cover 4 are clamped together in a liquid- and gas-tight manner by means of the tubular shaft 9 folded up with the disc 10. By turning the tubular shaft 9 back, they can be disassembled.

A 9 csőtengely mellső vége csonkként van kiképezve és a rajzon 11 nyíllal értelmezett sterilgáz-tápegységbe flexibilis csövön át bekötve, mint légzőcső. A 4 mellső fedélnek egy második 12 csonkja, a rajzon 13 nyíllal jelképesen ábrázolt steril-táptalaj-tápegységre van flexibilis csövön át rákötve.The front end of the tubular shaft 9 is designed as a stub and is connected to a sterile gas supply unit, indicated by arrow 11 in the drawing, via a flexible tube, as a breathing tube. A second stub 12 of the front cover 4 is connected to a sterile culture medium supply unit, indicated symbolically by arrow 13 in the drawing, via a flexible tube.

Az 1 bioreaktor belső tere egy célszerűen V-szelvényű, a szaporítandó vegetatív szövetekhez rendelt fény-, folyadék- és gázáteresztő hordozóelemmel, esetünkben 14 vályúval van két részre osztva. A 1 bioreaktomak a 2. ábrán feltüntetett alaphelyzete - azaz amikor a szaporítandó szövetek a jelképesen ábrázolt folyékony táptalaj-töltet fölött vannak értelmében a 14 vályú gerince a táptalaj és a 9 csőtengely között van elrendezve. A 14 vályú gerincén a táptalajt keresztülvezető, a szaporítandó szövetek átesését vagy kiáramlását megakadályozó méretű 15 átereszek vannak kiképezve.The interior of the bioreactor 1 is divided into two parts by a light, liquid and gas permeable carrier element, preferably V-shaped, assigned to the vegetative tissues to be propagated, in our case a trough 14. In the basic position of the bioreactor 1 shown in Figure 2 - i.e. when the tissues to be propagated are above the symbolically depicted liquid medium filling - the ridge of the trough 14 is arranged between the medium and the tube axis 9. On the ridge of the trough 14, culverts 15 are formed, which guide the medium through and prevent the tissues to be propagated from falling through or flowing out.

₈ ::·· r j, ₈ ::·· rj,

A 14 vályú mellső élei a 4 mellső fedéllel, két oldalába a 2 körhenger belső palástjával, végül hátsó élei - azaz egy összeállított 1 bioreaktorban a 2 körhenger geometriai tengelyére vagy a 9 csőtengelyre - merőleges síkban fekvő 16 vezetőtárcsával vannak anyagzáró kötéssel egy darabbá egyesítve.The front edges of the trough 14 are joined together in one piece by a material-sealing bond with the front cover 4, with the inner shell of the circular cylinder 2 on both sides, and finally with the rear edges - i.e. with a guide disk 16 lying in a plane perpendicular to the geometric axis of the circular cylinder 2 or the tube axis 9 in an assembled bioreactor 1.

A tágabb értelmezésünk szerint modulnak tekintett 1 bioreaktor 17 vázának alapsíkjában rögzített 18 menesztő-egységre, a 18 menesztő-egység 19 görgőire és egy 20 hajtott görgőjére van a héjazat, esetünkben a 2 körhenger négy ponton felfektetve. A 20 hajtott görgővel van a 2 körhenger billentve.In our broader interpretation, the shell of a bioreactor 1, considered as a module, is mounted on a drive unit 18 fixed in the base plane of its frame 17, on the rollers 19 of the drive unit 18 and on a driven roller 20, in our case the circular cylinder 2 is supported at four points. The circular cylinder 2 is tilted by the driven roller 20.

A héjazatnak a 18 menesztő-egységre történő telepítése gömbhéj esetén két egymással párhuzamos gömbi kör mentén rögzített abroncsokkal, míg parallel-epipedon-héjazat esetén a testéleken rögzített, egymással párhuzamos síkokban fekvő abroncsokkal, mint körszelvényű felfekvő felületekkel oldható meg.The installation of the shell on the drive unit 18 can be achieved with tires fixed along two parallel spherical circles in the case of a spherical shell, while in the case of a parallel-epiped shell, with tires fixed on the body edges and lying in parallel planes as circular contact surfaces.

A mikroszaporításhoz szükséges billentés mértékét az 5 mágnes/ek/ és a 17 vázon rögzített 21 végálláskapcsoló/k/ kölcsönös helyzetének beállításával lehet szabályozni.The amount of tilting required for micropropagation can be controlled by adjusting the mutual position of the 5 magnet(s) and the 21 limit switch(es) mounted on the 17 frame.

A mikroszaporításhoz szükséges 30 mikroEinstein/m² sec körüli energiával történő megvilágításra a 17 vázra a héjazat fölött 22 megvilágító-egység van elrendezve. Vízszintes bővítés esetén több 1 bioreaktor is megvilágítható egyetlen egy 22 megvilágító-egységgel. Függőleges bővítés esetén viszont „emeletenként” külön-külön 22 megvilágító-egységre van feltétlenül szükség.For illumination with an energy of around 30 microEinstein/m ² sec required for micropropagation, 22 illumination units are arranged on the 17 frames above the shell. In the case of horizontal expansion, several 1 bioreactors can be illuminated with a single 22 illumination unit. In the case of vertical expansion, however, separate 22 illumination units are absolutely necessary for each “floor”.

A 18 menesztő-egységhez és ezen keresztül az összes többi egységhez kézikapcsolású 23 program-vezérlő-egység, míg a jelképesen ábrázolt 14 sorozatkapcson keresztül adott esetben automatikus, célszerűen számítógépes program-vezérlő-egység van csatlakoztatva. A technológia egyes műveleti paramétereinek érzékelő-ellenőrző-elemei célszerűen számítógépre vannak kapcsolva.A manually connected program control unit 23 is connected to the drive unit 18 and through it to all other units, while an automatic, preferably computer-based program control unit is optionally connected via the symbolically illustrated serial terminal 14. The sensor-control elements of the individual operating parameters of the technology are preferably connected to a computer.

A továbbiakban az 1 bioreaktor működését mutatjuk be. Ezzel értelemszerűen az eljárást ismertetjük részletesen.In the following, we will present the operation of bioreactor 1. Accordingly, the process will be described in detail.

* · · ♦ · · · ..· : j, .:.* · · ♦ · · · ..· : j, .:.

A találmány célja olyan új eszköz kialakítása volt, amely alkalmazásával elérhető, hogy a horizontális dob-bioreaktorok tenyésztő csöveiben a növények, és/vagy inokulumok (tenyésztő táptalajra oltott részek) periodikusan úgy érintkezhessenek a táptalajjal, hogy közben csöveken keresztül közvetlenül lehessen mind a levegő, mind a táptalaj összetételét változtatni. Jelen találmány alapjául szolgáló felismerés lényege az, hogy a bioreaktorok tenyésztő csövei nem folyamatosan és csak egyirányban forognak, hanem térben és időben programozott módon hol előre, hol visszafelé forognak különböző ciklusidőnként tartva.The aim of the invention was to develop a new device that allows plants and/or inoculums (parts inoculated onto the culture medium) in the culture tubes of horizontal drum bioreactors to periodically come into contact with the culture medium, while simultaneously changing the composition of both the air and the culture medium directly through the tubes. The essence of the recognition underlying the present invention is that the culture tubes of the bioreactors do not rotate continuously and in only one direction, but rotate forward and backward in a spatially and temporally programmed manner, at different cycle times.

A találmány szerinti berendezés használhatósága azokon a kísérleti eredményeinken nyugszik, amelyek félreérthetetlenül bizonyították, hogy a megfelelő módon előre-hátra forgatott tenyésztő csövekben egy térelválasztó hálón elhelyezett, levegővel, gázokkal és cserélhető táptalajjal programozottan kezelt növényi inokulumok lényegesen kedvezőbben fejlődnek, mint a hagyományos in vitro tenyésztési módszerek esetében.The usability of the device according to the invention is based on our experimental results, which have unequivocally proven that plant inocula placed on a partition mesh in appropriately rotated culture tubes and programmed with air, gases and replaceable culture medium develop significantly more favorably than in the case of traditional in vitro culture methods.

A kísérletek kivitelezése céljából elkészített eszköz két részből áll: magából a mikroszaporító bioreaktorból, és a kontroll tenyészetek nevelésére szolgáló fényállványból. Ezzel a megoldással azt kívántuk elérni, hogy a kutatómunka során a kontrol tenyészeteket is azonos megvilágítású és hőmérsékletű környezetben, egyszerre tudjuk vizsgálni. A két berendezés egymástól szerkezetileg független, különválasztható. Elhelyezhetők egymás mellett, és egymás felett is.The device prepared for the purpose of carrying out the experiments consists of two parts: the micropropagation bioreactor itself, and the light stand for growing the control cultures. With this solution, we wanted to achieve that during the research work, we could also examine the control cultures at the same time in an environment with the same lighting and temperature. The two devices are structurally independent of each other and can be separated. They can be placed next to each other or above each other.

A kísérleti mikroszaporító bioreaktor fö részei: elektronikus hajtómű; forgató mű, fénymegvilágítás; tenyésztő csövek és táptalaj levegőztető egység.The main parts of the experimental micropropagation bioreactor are: electronic drive; rotating mechanism, light illumination; culture tubes and medium aeration unit.

A tenyésztő csövek a bioreaktor alsó felében vízszintesen találhatók, felül mesterséges fénymegvilágítással. A csövek mögött, a vázhoz erősítve található a hajtómű. Ez hat darab, max. 16 W teljesítményű 12 V-os villanymotorból és műanyag alkatrészekből készített fogaskerekes erőátviteli elemekből áll. A villanymotorokat egyenáramú adapterrel kell a hálózathoz csatlakoztatni. A hajtóművek úgy kerültek elhelyezésre, hogy az aszeptikus tenyésztő csövek egymás közötti távolsága a lehető legkisebb legyen. A forgató művet 2 darab forgató tüske és 4 darab pontosan illesztett siklótönk alkotja. A speciálisan esztergált, 20 mm hosszú forgató tüskék a hajtómű fogaskerék-tárcsájába rögzülnek.The culture tubes are located horizontally in the lower half of the bioreactor, with artificial light above. Behind the tubes, attached to the frame, is the drive unit. It consists of six 12 V electric motors with a maximum power of 16 W and gear transmission elements made of plastic parts. The electric motors must be connected to the mains using a DC adapter. The drives are positioned so that the distance between the aseptic culture tubes is as small as possible. The rotating mechanism consists of 2 rotating pins and 4 precisely matched sliding blocks. The specially turned, 20 mm long rotating pins are fixed in the gear wheel of the drive unit.

A forgató tüskéknek három funkciójuk van: pozícionálják a tenyésztő csöveket; tengely irányú forgatással mozgatják azt és működtetik a vezérlőkapcsolókat. A siklótönkök megfelelő méretezésű teflon hengerekből állnak, a vázhoz kerültek rögzítésre.The rotating mandrels have three functions: they position the culture tubes; they move them by axial rotation and they operate the control switches. The slide blocks consist of appropriately sized Teflon cylinders, which are attached to the frame.

Az ismertetett kísérleti mikroszaporító bioreaktor segítségével egy időben hat párhuzamos kísérletet lehet elvégezni. Ezt az teszi lehetővé, hogy hat függetlenül tenyésztő cső, „reaktor modul” forog előre és hátra, ciklusonként 180 fokos fordulatot téve, önállóan vezérelt meghajtó motorokkal és elektronikával. A csövek 1 perc és 24 óra között - 1 perces skálán széles tartományban tartózkodnak a végpontokban, ezért a biológiai szempontból optimális programozási módot könnyen meg lehet határozni. A kísérletek során négyféle összeállítású tenyésztő csövet szerkesztettünk és vontunk be az in vitro kísérletekbe. Ezek közül az autokválozható, polikarbonát (PC) köpenyből készült transzparens csöveket találtunk a legmegfelelőbbnek. A csövet vízszintes irányban elhelyezett rozsdamentes acélból készült háló két kamrára osztja. A tenyészeteket az egyik kamrába kell belehelyezni, majd folyékony halmazállapotú táptalajjal felönteni. A kísérlethez használt tenyésztő csövek hossza 20 cm, külső átmérője 10 cm, űrtartalma 3.000 ml, és 500 ml folyékony táptalajjal töltöttük fel. A csövekbe helyezett tenyészetek vagy a táptalajba merülnek (szubmersz üzemmód, 1. ciklus végpontja), vagy a tenyésztő csövet elválasztó rozsdamentes háló felületén terülnek szét (emersz üzemmód, 2. ciklus végpontja). Ez úgy lehetséges, hogy a tengelyirányú előre-hátra forgás során a folyékony táptalaj mindig átfolyik a rozsdamentes hálón, a tenyészetek viszont sohasem, azaz az inokulumok hol a táptalajból kiemelve fennmaradnak a hálón, hol pedig a táptalajba merülnek. A tenyésztő csövekre zárófedélre erősített levegőztető csövek nem tekerednek fel az oda-vissza forgás miatt.The described experimental micropropagation bioreactor allows six parallel experiments to be performed simultaneously. This is made possible by six independently rotating culture tubes, “reactor modules”, with 180-degree rotations per cycle, each driven by independently controlled drive motors and electronics. The tubes are positioned at the endpoints over a wide range of 1 minute to 24 hours - on a 1-minute scale, so the biologically optimal programming mode can be easily determined. During the experiments, four different culture tube configurations were constructed and included in the in vitro experiments. Of these, autoclavable, transparent tubes made of polycarbonate (PC) were found to be the most suitable. The tube is divided into two chambers by a horizontally placed stainless steel mesh. The cultures are placed in one chamber and then filled with liquid culture medium. The culture tubes used for the experiment have a length of 20 cm, an outer diameter of 10 cm, a volume of 3,000 ml, and were filled with 500 ml of liquid culture medium. The cultures placed in the tubes are either immersed in the culture medium (submerged mode, end point of cycle 1) or spread out on the surface of the stainless steel mesh separating the culture tube (emergent mode, end point of cycle 2). This is possible because during the axial forward and backward rotation, the liquid culture medium always flows through the stainless steel mesh, but the cultures never do, i.e. the inoculums are either lifted out of the culture medium and remain on the mesh, or they are immersed in the culture medium. The aeration tubes attached to the closure lid of the culture tubes do not coil up due to the back and forth rotation.

A kísérleti mikroszaporító bioreaktor tesztelését banan (Musa sp.), ananász (Ananas comosus), Cimbidium-orchidea (Cimbidium sp.), burgonya (Solanum tuberosum) és ámyéklilom (Hosta sp.) tenyészetekkel végeztük el. Az alábbiakban a banán hajtásokkal folytatott in vitro klónozási kísérletek példáján keresztül mutatjuk be a találmányunk szerint elkészített berendezés alkalmazhatóságát.The experimental micropropagation bioreactor was tested with banana (Musa sp.), pineapple (Ananas comosus), Cymbidium orchid (Cimbidium sp.), potato (Solanum tuberosum) and hosta (Hosta sp.) cultures. Below, we demonstrate the applicability of the device prepared according to our invention through the example of in vitro cloning experiments with banana shoots.

PéldaExample

A fentiekben részletezett kísérleti mikroszaporító bioreaktor tesztelésére használt Cevendish fajtájú banán tenyészetek növekedését és élettani folyamatait tanulmányoztuk. Mind a tenyésztő csöveket, mind a kontrol tenyészeteket steril oltófulkében oltottuk át. A kísérlethez kétféle hormon összetételű szaporító táptalajt készítettünk. A bioreaktor forgató fészkébe helyezett tenyésztő csövekbe 500 ml táptalaj került. A 28 napos inkubálás során 12 perces ciklusidőt alkalmaztunk (5 perc táptalajba merülés = szubmersz fázis + 7 perc táptalajból kiemelés = emersz fázis) (1. táblázat).The growth and physiological processes of Cevendish banana cultures used to test the experimental micropropagation bioreactor detailed above were studied. Both the culture tubes and the control cultures were inoculated in a sterile inoculation booth. For the experiment, two types of hormone-containing propagation media were prepared. 500 ml of medium were added to the culture tubes placed in the rotating nest of the bioreactor. During the 28-day incubation, a 12-minute cycle time was used (5 minutes immersion in medium = submerged phase + 7 minutes removal from medium = emergent phase) (Table 1).

1. táblázatTable 1

Cevendish banán in vitro klónozási programja mikroszaporító bioreaktorban (12 perc/ciklus)Cevendish banana in vitro cloning program in a micropropagation bioreactor (12 min/cycle)

VEZÉRLÉS CONTROL KEZELÉSI IEDÖ / CIKLUS (PERC) TREATMENT TIME / CYCLE (MINUTES) KEZELÉSI IEDÖ / NAP (ÓRA)__ TREATMENT TIME /DAY (HOUR)__ 1. Reaktor modul 1. Reactor module 2.Reaktor modul 2.Reactor module 1. Reaktor modul ______ 1. Reactor module ______ 2.Reaktor modul 2.Reactor module 180 FOK JOBBRA FORGATÁS ___________________________________ 180 DEGREES ROTATE RIGHT ___________________________________ EMERSZ FÁZIS EMERSZ PHASE 7 7 7 7 11,2 11.2 11,2 11.2 180 FOK BALRA FORGATÁS _________________________ 180 DEGREES LEFT ROTATION _________________________ SZUBMERSZ FÁZIS SUBMERSE PHASE 5 5 5 5 12,8 12.8 12,8 12.8 ÖSSZESEN TOTAL 12_________ 12_________ ________12________ ________12________ 24 24 24 24

A megvilágítás időtartama 16 óra/nap volt; a tenyésztő szobahomersekletét 22+/-1 C-ra állítottuk. Az inkubálás során nem történt rendellenesség, a berendezések kifogástalanul üzemeltek. 28 nap elteltével a tenyésztő csöveket kiemeltük a reaktor forgató fészkéből és átvittük az oltófülkébe., amelyet előzőleg a tenyészetek kiszedéséhez előkészítettünk. A tenyésztő csöveket függőleges állásba helyeztük, és egyszerű mozdulatokkal eltávolítottuk a homlok oldalon található, rozsdamentes anyagból készült levegőző és leeresztő csonkok zárókupakját. A reaktorcsöveket vízszintes helyzetbe fordítottuk és az alsó csonkokon át üvegpohárba leeresztettük a táptalajt. A folyamat gyors és könnyen kivitelezhető volt. A reaktor modulok nyitására szolgáló műanyag csavarfejet kicsavartuk, és ezzel a homlokrész zárófedele előbb résnyire megnyúlt, majd tovább csavarva teljesen szabaddá vált.The illumination period was 16 hours/day; the room temperature of the culture chamber was set to 22+/-1 C. No abnormalities occurred during the incubation, and the equipment operated flawlessly. After 28 days, the culture tubes were removed from the reactor rotating nest and transferred to the inoculation booth, which had been previously prepared for the removal of the cultures. The culture tubes were placed in a vertical position and the stainless steel aeration and drain plugs on the front side were removed with simple movements. The reactor tubes were turned to a horizontal position and the culture medium was drained into a glass beaker through the lower plugs. The process was quick and easy to perform. The plastic screw head used to open the reactor modules was unscrewed, and the front cover first extended a little, and then, when further twisted, became completely free.

• · ·* 4 ·« ·· > ··* · « '··* ··· ' J.• · ·* 4 ·« ·· > ··* · « '··* ··· ' J.

Ezt követően a reaktorcső hengeréből kihúztuk a növényeket tartó, belső rozsdamentes hálóból kialakított tálcát. A kifejlett növényeket egyenként kiszedtük, majd az alábbi növényélettani vizsgálatokat végeztük:After that, the inner stainless steel mesh tray holding the plants was pulled out of the reactor tube cylinder. The mature plants were removed one by one and the following plant physiological tests were performed:

1. bonitálás (hajtásszám számolás, hajtáshosszak mérése)1. grading (counting the number of shoots, measuring the lengths of shoots)

2. fotoszintézis mérése hordozható infravörös gázanalizátorral2. Photosynthesis measurement with a portable infrared gas analyzer

3. fotoszintetikus pigmenttartalom meghatározása3. Determination of photosynthetic pigment content

4. szárazanyagtartalom meghatározása4. determination of dry matter content

BonitálásRating

A száraz táptalajon és a nevelő hengerben nevelt banán növényeket kivettük a nevelő edényből és a hajtásokat megszámolva és hosszukat lemérve az adatokat rögzítettük, majd értékeltük (Windows Microsoft Excel 97 programmal).Banana plants grown on dry medium and in a growth cylinder were removed from the growth container, shoots were counted and their lengths were measured, the data were recorded and then evaluated (using Windows Microsoft Excel 97).

Fotoszintézis mérése hordozható infravörös gázanalizátorralPhotosynthesis measurement with a portable infrared gas analyzer

A készülék LI-6200 típusú, LI-COR Inc. által gyártott készülék, amelynél a legkisebb kamrát alkalmaztuk, a 250 cm’³ köbtartalmút. A kamrán átpumpált levegő széndioxidtartalmát a készülék infravörös fényelnyelés alapján méri. A programban megadott képletekkel a levelek fotoszintézisét a megvilágítás során felhasznált széndioxid mennyiség alapján számolja a készülék. Ha a széndioxid mennyisége nem csökken, hanem nő, akkor légzést mérünk. A bonitálás után 5-5 növény 1-2 levelét a mérőkamrába helyeztük és a nevelőkamra fényerejénél nagyobb fényerő mellett (80-110 μΕ cm'² s’¹) megmértük a levélke CO₂forgalmát.The device is a LI-6200 type device manufactured by LI-COR Inc., in which the smallest chamber was used, the one with a cubic capacity of 250 cm' ³ . The device measures the carbon dioxide content of the air pumped through the chamber based on infrared light absorption. Using the formulas given in the program, the device calculates the photosynthesis of the leaves based on the amount of carbon dioxide used during illumination. If the amount of carbon dioxide does not decrease, but increases, then respiration is measured. After the calibration, 1-2 leaves of 5-5 plants were placed in the measuring chamber and the CO ₂ turnover of the leaf was measured at a brightness higher than the brightness of the growth chamber (80-110 μΕ cm' ² s' ¹ ).

Fotoszintetikus pigmentek mennyiségének meghatározásaDetermination of the amount of photosynthetic pigments

Klorofill-a és klorofill-b, illetve a karotinoidok mennyiségének meghatározását Amon módszerével végeztük. A friss mintákból 100-200 mg levélkedarabot hűtött 80 %-os acetonban (8 rész aceton, 2 rész víz) eldörzsöltünk, centrifugáltunk és három hullámhosszon mértünk. A kapott értékekből számoltuk az összklorofill- és karotinoidtartalmat (Amon, D.L, 1949: Plant Physiol. 24: 1-15 nyomán).The determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b, as well as the amount of carotenoids, was carried out by the Amon method. 100-200 mg of leaf pieces from the fresh samples were ground in chilled 80% acetone (8 parts acetone, 2 parts water), centrifuged and measured at three wavelengths. The total chlorophyll and carotenoid content was calculated from the obtained values (Amon, D.L, 1949: Plant Physiol. 24: 1-15).

Szárazanyagtartalom méréseDry matter content measurement

A fotoszintézis mérés után több növényt összegyűjtve a friss súlyt lemértük és két napra 90 °C-on szárítottuk. A száraz súlyokat ismét megmértük analitikai mérlegen és kiszámoltuk a szárazanyagtartalmt. Az adatokat százalékban adtuk meg. A hajtásszám, hajtáshossz és szárazanyagtartalom alakulásának eredményei a 2. táblázaton láthatók.After the photosynthesis measurement, several plants were collected, the fresh weight was measured and dried at 90 °C for two days. The dry weights were again measured on an analytical balance and the dry matter content was calculated. The data were given as a percentage. The results of the development of shoot number, shoot length and dry matter content are shown in Table 2.

2. táblázat. Szilárd MS táptalajon és mikroszaporító bioreaktorban (lásd: „tápoldat”) nevelt banán növények hajtásszáma, hajtáshossza és szárazanyag-tartalmaTable 2. Shoot number, shoot length and dry matter content of banana plants grown on solid MS medium and in a micropropagation bioreactor (see: “nutrient medium”)

EJ MS szilárdEJ MS solid

Banán □ tapoidatBanana □ tapoidat

hajtásszám (db) hajtáshossz (cm) szárazanyagtart. (°/4number of shoots (pcs) shoot length (cm) dry matter content (°/4

A 2. táblázaton látható, hogy a kétféle nevelési módszerben, azaz szilárd táptalajon és a mikro szaporító bioreaktorban szignifikáns elterest a hajtashosszban mertük, a reaktorcsövekben való nevelés esetében nagyobb hajtásokat kaptunk. A hajtásszám eltérése nem volt szignifikáns.Table 2 shows that in the two cultivation methods, i.e. on solid medium and in the micro propagation bioreactor, significant differences were measured in shoot length, while in the case of cultivation in reactor tubes, larger shoots were obtained. The difference in shoot number was not significant.

A szárazanyagtartalom különbsége is csak kismértékű volt, habár a levelek vitrifikációja (üvegesedése) látható volt.The difference in dry matter content was also only small, although vitrification of the leaves was visible.

A fotoszintézis-aktivitás mérésének eredményeit és a fotoszintetikus pigmentek mennyiségének alakulását a 3. táblázatban szemléltetjük.The results of the measurement of photosynthetic activity and the development of the amount of photosynthetic pigments are illustrated in Table 3.

3. táblázat. Szilárd táptalajon és CLONE-GERM bioreaktorban (lásd: „folyadékkultúra”) nevelt banán növényeinek fotoszintézisepfnol CO ₂ m²/s) és pigmentkoncentrációja (összklorofill- és karotinoid-tartalom - mg/g friss súly). Mintaszám a fotoszintézismérésnél n=6-6, a pigmenttartalom mérésénél n=4 ill. 12.Table 3. Photosynthesis (CO ₂ m ² /s) and pigment concentration (total chlorophyll and carotenoid content - mg/g fresh weight) of banana plants grown on solid medium and in CLONE-GERM bioreactor (see: “liquid culture”). Sample number for photosynthesis measurement n=6-6, for pigment content measurement n=4 and 12.

Nevelés Education Fotoszintézis Photosynthesis Klorofill-tartalom Chlorophyll content Karotin-tartalom Carotene content pmol CO2 pmol CO2 Mg/g fr. súly Mg/g fresh weight mg/g fr. súly mg/g fr. weight Agar-agarral szilárdított táptalaj Agar-agar solidified medium -1,29 ±4,95 * -1.29 ±4.95 * 0,777 ±0,15 0.777 ±0.15 0,203 ± 0,045 0.203 ± 0.045 Mikroszaporító bioreaktor, folyékony táptalaj___ Micropropagation bioreactor, liquid medium___ 2,59 ±2,14 2.59 ±2.14 0,889 ±1,11 0.889 ±1.11 0,213 ±0,054 0.213 ±0.054

* légzés* breathing

A fotoszintézis aktivitása az agar-agarral szilárdított táptalajon nevelt növények esetében negatív érték volt, azaz a növények nem fotoszintetizáltak, de intenzíven lélegeztek. A mikroszaporító biorektorban folyékony táptalajon nevelt növények fotoszintézise már kialakult, aktivitásuk ugyan nem volt túl magas, de a légzést felülmúlták. Minden esetben nagyon nagy volt a szórás, ami azt támasztja alá, hogy a növények nem egyforma mértékben tértek még át az autotróf életmódra. Az agar-agarral szilárdított táptalajon nevelkedett növények között is volt olyan, amely mutatott gyenge fotoszintézist, ennek következménye a nagyon magas szóró érték.The photosynthetic activity of plants grown on agar-agar-solidified medium was a negative value, meaning that the plants did not photosynthesize, but respired intensively. The photosynthesis of plants grown on liquid medium in the micropropagation bioreactor had already developed, although their activity was not very high, it exceeded respiration. In all cases, the standard deviation was very large, which confirms that the plants had not yet switched to an autotrophic lifestyle to the same extent. Among the plants grown on agar-agar-solidified medium, there were also some that showed weak photosynthesis, which is the consequence of the very high standard deviation.

A pigment koncentrációjában nem mutatkozott szignifikáns eltérés, habár a bioreaktorban folyékony táptalajon nevelt növények pigment mennyisége magasabb koncentrációt eredményezett.There was no significant difference in pigment concentration, although plants grown on liquid medium in the bioreactor resulted in higher pigment concentrations.

A közölt élettani vizsgálatok eredményeit összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a mikroszaporító bioreaktor műnyag reaktor moduljaiban folyékony táptalajon nevelt, „in plastic” növények hajtásnövekedésére kedvezőbbek a körülmények, szignifikánsan nagyobbra nőnek, mint a hagyományos rendszerben, agar-agarral szilárdított táptalajon kapott „in vitro növények esetében. Autotróf életmódjuk lehetővé teszi a kiültetés okozta stressz könnyebb leküzdését.Summarizing the results of the published physiological studies, we can conclude that the conditions for shoot growth of "in plastic" plants grown on liquid medium in the plastic reactor modules of the micropropagation bioreactor are more favorable, they grow significantly larger than in the case of "in vitro" plants grown on agar-agar-solidified medium in the traditional system. Their autotrophic lifestyle allows them to more easily overcome the stress caused by transplanting.

Az előzőekben ismertetett kísérletek során kapott eredmények föbb megállapításait a párhuzamosan elvégzett növényanatómiai vizsgálatok is teljes mértékben alátámasztották. A növények leveléből az alábbi anatómiai preparátumokat készítettük:The main findings of the results obtained during the experiments described above were also fully supported by the plant anatomical studies carried out in parallel. The following anatomical preparations were prepared from the leaves of the plants:

1. Fiatalabb és fejlettebb növények levélnyél- és levél keresztmetszetének összehasonlítása scanning (pásztázó) elektromikroszkóppal (SM preparátumok);1. Comparison of petiole and leaf cross-sections of younger and more developed plants using scanning electron microscopy (SM preparations);

Fiatalabb és fejlettebb növények levélnyél- és levél keresztmetszetének összehasonlítása félvékony metszeteken, fénymikroszkóppal,Comparison of petiole and leaf cross-sections of younger and more developed plants in semi-thin sections, using a light microscope,

3. Fiatalabb és fejlettebb növények levél színének és fonákénak összehasonlítása scanning (pásztázó) elektromikroszkóppal (SM preparátumok).3. Comparison of leaf color and morphology of younger and more developed plants using scanning electron microscopy (SM preparations).

A vizsgálatok eredménye a következő volt. A mikroszaporító bioreaktor tenyésztő csövekben folyékony táptalajon fejlődött növények anatómiai képe megközelítette a normális körülmények között fejlődő banán szövettani képét. Az autótróf táplálkozásra való áttérés egyértelmű jelének tartjuk a vastagabb epidermisz réteget, a légcserenyílások funkcionálását, és a viaszlerakódás kezdetét. Az agar-agarral szilárdított táptalajon nőtt banán levelek epidermisz sejtsora vékony volt, a légcserenyílások minden mintán zárva maradtak és a viaszképződés nem indult meg. A levélnyél felépítésében nem fedeztünk fel lényegi különbséget.The results of the studies were as follows. The anatomical picture of plants grown on liquid medium in micropropagation bioreactor culture tubes approached the histological picture of bananas growing under normal conditions. We consider the thicker epidermis layer, the functioning of the stomata, and the beginning of wax deposition to be clear signs of the transition to autotrophic nutrition. The epidermal cell layer of banana leaves grown on agar-agar-solidified medium was thin, the stomata remained closed in all samples, and wax formation did not start. We did not discover any significant difference in the structure of the petiole.

A megoldás előnyös tulajdonságait foglaljuk össze az alábbiakban.The beneficial features of the solution are summarized below.

A kutatások kiszolgálására tervezett alap bioreaktorral - párhuzamosan üzemelve - egy időben több független tenyésztési kísérletet lehet folytatni. Ezt az teszi lehetővé, hogy a független „reaktor modul” önállóan vezérelt meghajtó motorokkal és elektronikával, levegőztető pumpával rendelkezik. A modulok 1 perc és 24 óra között - 1 perces skálán biztosítják a folyékony táptalajjal történő érintkezést. Ezért a biológiai szempontból optimális programozási módot könnyen meg lehet határozni. A függetlenül vezérelt modulok száma nem kötött, tehát a felhasználó is változtathatja, tetszés szerint akár növelhető, ha pl. több berendezést állít be a kísérletbe.The basic bioreactor designed for research purposes can be used to run multiple independent cultivation experiments simultaneously - operating in parallel. This is made possible by the fact that the independent "reactor module" has independently controlled drive motors and electronics, and an aeration pump. The modules provide contact with the liquid medium on a 1-minute scale from 1 minute to 24 hours. Therefore, the optimal programming mode from a biological point of view can be easily determined. The number of independently controlled modules is not limited, so the user can change it, or even increase it if desired, e.g. by adding more equipment to the experiment.

A kutatások szerint a bioreaktor jelentősen növeli mind a szaporítási fázis, mind a gyökereztetési fázis hatékonyságát. Ennek mértékét automatikusan üzemelő programok beállításával teszteltük. Egy hat modulból épített bioreaktor összesen 3000 ml folyékony táptalaján hat hét alatt - 300 ananász inokulumból - 3000 db, 0,5 cm-nél nagyobb új hajtás képződött. A kiinduló táptalaj tömegének fele a növények élő szövetébe oly módon épült be, hogy azok szárazanyag tartalma a kontrollal azonos volt, miközben friss súlyuk 3-4-szer volt több. Hasonló tapasztalatokat szereztünk banánnal és számos kultúrával is.According to research, the bioreactor significantly increases the efficiency of both the propagation phase and the rooting phase. We tested the extent of this by setting up automatically operating programs. In a bioreactor built from six modules, 3000 ml of liquid medium in a total of 3000 ml produced 3000 new shoots larger than 0.5 cm in six weeks - from 300 pineapple inoculums. Half of the mass of the starting medium was incorporated into the living tissue of the plants in such a way that their dry matter content was the same as the control, while their fresh weight was 3-4 times higher. We have gained similar experiences with bananas and many other crops.

A bioreaktor tenyésztő moduljaiban nevelt „in plastic” növények hajtásnövekedésére lényegesen kedvezőbbek a körülmények, ezért jobban nőnek az agar-agarral szilárdított táptalajon nevelt „in vitro” növényeknél. Ennek egyik lehetséges élettani magyarázata fokozott „in plastic fotoszintézis”. A fotoszintetikus aktivitás változását LI-6200 típusú infravörös gázanalizátorral, illetve a klorofill-a, klorofill-b és karotin mérésével követtük nyomon. Az agar-agarral szilárdított táptalajon nevelt kontroll növénynek esetében ez negatív érték volt, azaz a növények nem fotoszintetizáltak, de intenzíven lélegeztek. A bioreaktorban nevelt növéynek fotoszintézise kialakult, aktivitásuk a légzést felülmúlta. A bioreaktorban előállított növények levelének klorofill-tartalma is magasabb volt. Lehetővé válik a takarékos és biztonságos léptéknövelés, illetve a „fotoautotróf’ technológia alkalmazása a mikroszaporító bioreaktorok körében.The conditions for shoot growth of “in plastic” plants grown in the bioreactor’s cultivation modules are significantly more favorable, therefore they grow better than “in vitro” plants grown on agar-agar-solidified medium. One possible physiological explanation for this is increased “in plastic photosynthesis”. The change in photosynthetic activity was monitored with a LI-6200 infrared gas analyzer and by measuring chlorophyll-a, chlorophyll-b and carotene. In the case of the control plant grown on agar-agar-solidified medium, this was a negative value, meaning that the plants did not photosynthesize, but respired intensively. The plants grown in the bioreactor developed photosynthesis, their activity exceeded respiration. The chlorophyll content of the leaves of the plants produced in the bioreactor was also higher. It becomes possible to scale up economically and safely, and to apply “photoautotrophic” technology in micropropagation bioreactors.

A bioreaktorban nevelt „in plastic” növények - megfelelő fejlődési fázisban - programozottan kialakított autotróf életmódja teszi lehetővé a kiültetés okozta stressz eredményes leküzdését, az „ex vitro gyökereztetés” bevezetését. Ezt a bioreaktor tenyésztő modulok speciális kialakításával értük el. Ezek lehetnek passzív szellőzésűek és működtethetők levegőztető üzemmódban. Ezek a funkciók tovább bővíthetők speciális CO₂-kezelő rendszerrel. A levegő és CO₂ mennyisége és a kezelés időtartama az alábbiak szerint programozható: levegő és CO₂bejuttatása a folyékony táptalajba; levegő és CO₂ bejuttatása a tenyésztő modulok belső gázterébe; levegő és CO₂ egyidejű programozott bejuttatása részben a folyékony táptalajba, részben a tenyésztő modulok belső gázterébe.The programmed autotrophic lifestyle of the “in plastic” plants grown in the bioreactor - at the appropriate developmental stage - enables the successful overcoming of the stress caused by the transplanting and the introduction of “ex vitro rooting”. This was achieved by the special design of the bioreactor cultivation modules. They can be passively ventilated and can be operated in aeration mode. These functions can be further expanded with a special CO ₂ treatment system. The amount of air and CO ₂ and the duration of the treatment can be programmed as follows: introduction of air and CO ₂ into the liquid medium; introduction of air and CO ₂ into the internal gas space of the cultivation modules; simultaneous programmed introduction of air and CO ₂ partly into the liquid medium and partly into the internal gas space of the cultivation modules.

Banánnal végzett kutatásaink szerint bioreaktor modulokban fejlődött a növények leveleinek anatómiai képe megközelítette a normális levelek szövettani állapotát. Az autotróf táplálkozásra való áttérésre utalt a vastagabb epidermisz, a légcserenyílások szabályos kialakulása és a viaszlerakódás megindulása. Az agar-agarral szilárdított táptalajon fejlődött banánlevelek epidermisz sejtsora vékonyabb, a légcserenyílások zártak voltak és a felületi viasz képződése elmaradt.According to our research with banana, the anatomical appearance of the leaves of plants grown in bioreactor modules approached the histological state of normal leaves. The transition to autotrophic nutrition was indicated by the thicker epidermis, the regular formation of stomata and the onset of wax deposition. The epidermal cell layer of banana leaves grown on agar-agar-solidified medium was thinner, the stomata were closed and the formation of surface wax was absent.

Tapasztalataink szerint a bioreaktor biológiai mutatói mellett a gazdaságossági mutatók, ezek között elsősorban az élő munkaerő takarékossági kiemelkedő. A bioreaktor tenyésztő modulok technikai megoldásai lehetővé teszik különböző térfogatú egységek kialakítását. A 0,5-5 liter bruttó térfogat közötti modulokból un. „reaktor falat” lehet összeállítani.According to our experience, in addition to the biological indicators of the bioreactor, the economic indicators, especially the saving of living labor, are outstanding. The technical solutions of the bioreactor cultivation modules allow the creation of units of different volumes. The modules with a gross volume of 0.5-5 liters can be used to assemble a so-called "reactor wall".

Ezek kiviteli alakjai sokféle módon kombinálódhatnak. Lehetnek modulonként külön-külön, és csoportban programozottak (tetszés szerinti modulszám).Their designs can be combined in many ways. They can be programmed individually for each module or in groups (any number of modules).

A felhasznált irodalom jegyzékét hármas-szándékkal oldjuk meg:The list of references is structured in a three-part manner:

./ a technika állásának teljesebb feltárása érdekében, ./ elhatároltsági kérdések egyszerűbb megoldásáért, végül ./ bejelentésünk oltalmi körén belüli, esetleges új részmegoldások megkönnyítésére../ for a more complete disclosure of the state of the art, ./ for a simpler resolution of delimitation issues, and finally ./ to facilitate possible new partial solutions within the scope of protection of our application.

A felhasznált irodalom:Literature used:

- Aharoni, M. 2002. Aspects of commercial plant tissue culture propagation in liquid media. 1st Int. Symp. On Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 7677.- Aharoni, M. 2002. Aspects of commercial plant tissue culture propagation in liquid media. 1st Int. Symp. On Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 7677.

- Aitken-Christie, J. 1991. Automation. In: Debergh, P.C. and Zimmermann, R.H. eds. Micropropagation. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. 342-354- Aitken-Christie, J. 1991. Automation. In: Debergh, P.C. and Zimmermann, R.H. ed. Micropropagation. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers. 342-354

- Aitken-Christie, J. Davies, H. 1988. Development of a semi-automated micropropagation system. Acta Hort. 230: 81-87.- Aitken-Christie, J. Davies, H. 1988. Development of a semi-automated micropropagation system. Acta Hort. 230: 81-87.

- Berthouly, M and Etienne, H. 2002. Temporary immersion system: A new concept for use liquid medium in mass propagation. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 42-43.- Berthouly, M and Etienne, H. 2002. Temporary immersion system: A new concept for using liquid medium in mass propagation. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 42-43.

Cantliffe, D.J. 2001. Bioreactor technology in plant. Proc. IV. Intern. Symp. on In Vitro Culture & Hortic. Breeding. Acta Hort. 560: 345-351.Cantliffe, D.J. 2001. Bioreactor technology in plants. Proc. ARC. Intern. Symp. on In Vitro Culture & Hortic. Breeding. Acta Hort. 560: 345-351.

Curtis, W.R. 2002. Application of bioreactor design pronciples to plant micropropagation. 1st Int. Symp. on. Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 64-65.Curtis, W.R. 2002. Application of bioreactor design principles to plant micropropagation. 1st Int. Symp. tin. Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 64-65.

Damiano, C. La Starza, s.R., Monticelli, S. Gentile, E., Caboni, A. and Fratarelli, A. 2002. Propagation of Prunus and Malus by temporary immersion. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 138-140.Damiano, C. La Starza, s.R., Monticelli, S. Gentile, E., Caboni, A. and Fratarelli, A. 2002. Propagation of Prunus and Malus by temporary immersion. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 138-140.

De Profi, M.P., Maene, L.J. and Debergh, P.C. 1985. Carbon dioxide and ethylene evaluation in the culture atmosphere of Magnolia cultured in vitro. Hysiol. Plant. 65: 375-379.De Profi, M.P., Maene, L.J. and Debergh, P.C. 1985. Carbon dioxide and ethylene evaluation in the culture atmosphere of Magnolia cultured in vitro. Hysiol. Plant. 65: 375-379.

Desjardins, Y. Gosslin, a. and Yelle, S. 1987. Acclimatiozation of ex vitro strawberry plantlets in CO2-enriched envimments and supplementary lighting. J. Amer. Soc. Hort. Sci 112:846-851.Desjardins, Y. Gosslin, a. and Yelle, S. 1987. Acclimatization of ex vitro strawberry plantlets in CO2-enriched environments and supplementary lighting. J. Amer. Soc. Hort. Sci 112:846-851.

J, .:,J, .:,

Dey, S. 2002. Cost-effective mass cloning of plants in liquid media useing a novel Growtek bioreactor. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation os plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 69.Dey, S. 2002. Cost-effective mass cloning of plants in liquid media using a novel Growtek bioreactor. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 69.

Espinosa, P., Lorenzo, J.C., Inglesias, A., Yabor, L., Menendez, E., Borroto, J., Hernandez, L., and Arencibia, A.D., 2002. Production of pineapple transgenic plants assisted by temporary immersion bioreactors Plant Cell Reports. 21 (2): 136-140.Espinosa, P., Lorenzo, J.C., Inglesias, A., Yabor, L., Menendez, E., Borroto, J., Hernandez, L., and Arencibia, A.D., 2002. Production of pineapple transgenic plants assisted by temporary immersion bioreactors Plant Cell Reports. 21 (2): 136-140.

Etienne, H. and Berthouly, M. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 69 (3): 215-231.Etienne, H. and Berthouly, M. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 69 (3): 215-231.

Farrell, M.A. 1987. Liquid medium system for plant micropropagation. Moet-Hennessy, Electronic et Pilotage des Plantes, Monaco, September 14-16. 1987. Procedings, 32.Farrell, M.A. 1987. Liquid medium system for plant micropropagation. Moet-Hennessy, Electronic et Pilotage des Plantes, Monaco, September 14-16. 1987. Proceedings, 32.

Fari, M., Rumpier J., Kotroczó, G. and Bene, L. 1986. New method in the propagation of orchids (Orchideák szaporítása új utakon). Kertészet és Szőlészet, 42:5 (in Hungarian).Fari, M., Rumpier J., Kotroczó, G. and Bene, L. 1986. New method in the propagation of orchids. Horticulture and Viticulture, 42:5 (in Hungarian).

Fári, M. 1987. Development of technical and biological basis of micropropagation toward automation and industrialisation. Moet-Hennessy, Electronic et Pilotage des Plantes, Monaco, September 14-16. 1987. Proceedings, 55-56.Fári, M. 1987. Development of technical and biological basis of micropropagation towards automation and industrialisation. Moet-Hennessy, Electronic et Pilotage des Plantes, Monaco, September 14-16. 1987. Proceedings, 55-56.

Firoozabady, E. and Gutterson, N. 2003. Cost-effective in vitro propagation method for pinapple. Plant Cell Reports. 21 (9): 844-850.Firoozabady, E. and Gutterson, N. 2003. Cost-effective in vitro propagation method for pineapple. Plant Cell Reports. 21 (9): 844-850.

Fujiwara, K., Kozai., T. and Watabe, I. 1988. Development of a photoautrotrophic tissue culture system for shoots and/or plantlets at rooting and acclimitization stages. Acta Hortic. 230: 153-158.Fujiwara, K., Kozai., T. and Watabe, I. 1988. Development of a photoautotrophic tissue culture system for shoots and/or plantlets at rooting and acclimation stages. Acta Hortic. 230: 153-158.

Gamborg, O.L. and LaRue, T.A.G. 1968. Ethylene produced by plant cells in suspension cultures. Nature. 220: 604-605.Gamborg, O.L. and LaRue, T.A.G. 1968. Ethylene produced by plant cells in suspension cultures. Nature. 220: 604-605.

Gontier, E., Grabner, A., Piutti, S., Massot, B., Milesi, S., Goergen, J.L. and Bourgaud, F. 2002. Development and validation of an efficient low cost bioreactor for furanocoumarin production with Ruta graveolesn L. shott cultures. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 70.Gontier, E., Grabner, A., Piutti, S., Massot, B., Milesi, S., Goergen, J.L. and Bourgaud, F. 2002. Development and validation of an efficient low cost bioreactor for furanocoumarin production with Ruta graveolesn L. shott cultures. 1st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 70.

Gribble, K., Tingle, J., Sarafix, V., Heaton, A. and Holford, P. 1998. Position of water in vitrified plants visualised by NMR imaging. Protoplasma. 201 (1-2): 110-114.Gribble, K., Tingle, J., Sarafix, V., Heaton, A. and Holford, P. 1998. Position of water in vitrified plants visualized by NMR imaging. Protoplasm. 201 (1-2): 110-114.

Grigoroadou, K., Vasilakakis, M. and Elefteriou, E.P. 2002. Effect of temperature and liquid medium on olive microshoot development using a novel temporary immersion system. 1 st. Int. Symp on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 106-107.Grigoroadou, K., Vasilakakis, M. and Elefteriou, E.P. 2002. Effect of temperature and liquid medium on olive microshoot development using a novel temporary immersion system. 1 pc. International Symp on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 106-107.

J. .:,J. .:,

Heo, J., Wilson, S.B., and Kozai, T. 2001. A forced ventilation micropropagation system for photoautotrophic production of sweetpotato plug plantlets in a scaledup culture vessel: I. Growth and uniformity. Hortic Technoi. 11 (1): 90-94.Heo, J., Wilson, S.B., and Kozai, T. 2001. A forced ventilation micropropagation system for photoautotrophic production of sweetpotato plug plantlets in a scaledup culture vessel: I. Growth and uniformity. Hortic Technoi. 11 (1): 90-94.

Hvoslef-Eide, A.K., Olsen, O.A.S, Lyngved, R. and Heyerdahl, P,.H. 2002. Bioreactor design for clonal propagation of somatic embryos. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. proceedings. 71-73.Hvoslef-Eide, A.K., Olsen, O.A.S, Lyngved, R. and Heyerdahl, P,.H. 2002. Bioreactor design for clonal propagation of somatic embryos. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. proceedings. 71-73.

Ingram, M., Spaulding, G.F., Craft, J.J.g., Ng, C-P, Saroufeem, R, Techy, G.B. and Yazan, O. 1996. Hydrodynamic cell culture environment for three demensional tissue growth. U.S. Patent Number 5,523,228.Ingram, M., Spaulding, G.F., Craft, J.J.g., Ng, C-P, Saroufeem, R, Techy, G.B. and Yazan, O. 1996. Hydrodynamic cell culture environment for three dimensional tissue growth. U.S. Patent Number 5,523,228.

Ingram, M., Techy, G.B., Saroufeem, R., Yazan, 0., Narayan, K.S., Goodwin, T.J. and Spaulding, G.F. 1997. Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor. In Vitro Cell Dev-An 33 (6):459-466.Ingram, M., Techy, G.B., Saroufeem, R., Yazan, 0., Narayan, K.S., Goodwin, T.J. and Spaulding, G.F. 1997. Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor. In Vitro Cell Dev-An 33(6):459-466.

Jackson, .B. 2002. Ventillation of plant tissue cultures. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro maqss propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 56-57.Jackson, .B. 2002. Ventilation of plant tissue cultures. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro maqss propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 56-57.

Joyce, S.M., Cassells, A.C. and Jain, S.M. 2003. Stress and aberrant phenotypes in vitro culture Plant Cell Tissue and Organ Culture, 74 (2): 103-121.Joyce, S.M., Cassells, A.C. and Jain, S.M. 2003. Stress and aberrant phenotypes in vitro culture Plant Cell Tissue and Organ Culture, 74 (2): 103-121.

Konstas, J. and Kintizios, S. 2003. Deveoping a scale-up system for the micropropagation of cucumber (Cucumis sativus L.): the effect of growth retardants, liquid culture and vessel size. Plant Cell Reports. 21 (6): 538-548.Konstas, J. and Kintizios, S. 2003. Deveoping a scale-up system for the micropropagation of cucumber (Cucumis sativus L.): the effect of growth retardants, liquid culture and vessel size. Plant Cell Reports. 21 (6): 538-548.

Kozai, T., Fujiwara, K., Hayashi, M. and Aitken-Christie, J. 1992. The in vitro environment and its control in micropropagation. In: Kurata, K. and Kozai, T. eds. Transplant production systems. Kluwer, Dordrecht. 247-282.Kozai, T., Fujiwara, K., Hayashi, M. and Aitken-Christie, J. 1992. The in vitro environment and its control in micropropagation. In: Kurata, K. and Kozai, T. eds. Transplant production systems. Kluwer, Dordrecht. 247-282.

Kozai, T. and Kubota, C. 2001. Developing a photoautotrophic micropropagation system for woody plants. J. Plant Res. 114: 525-537.Kozai, T. and Kubota, C. 2001. Developing a photoautotrophic micropropagation system for woody plants. J. Plant Res. 114: 525-537.

Lian, M-L., chakrabarty, D. and Paek, K-Y. 2003. Growth of Lilium oriental hybrid „Casablanca” bulbet using bioreactor culture. Scientia Horticulturae. 97(1): 41-48.Lian, M-L., chakrabarty, D. and Paek, K-Y. 2003. Growth of Lilium oriental hybrid "Casablanca" bulb using bioreactor culture. Scientia Horticulturae. 97(1): 41-48.

Itteregger, R, Vogh, G., Rossmanith, E. and Falkenhagen, D. 1999. Rotary Cell Culture System (RCCS): A new method for cultivation hepatocytes on microcarriers. Int J. Artif Organs: 12:816-82Itteregger, R, Vogh, G., Rossmanith, E. and Falkenhagen, D. 1999. Rotary Cell Culture System (RCCS): A new method for cultivating hepatocytes on microcarriers. Int J. Artif Organs: 12:816-82

Paek, K-Y., Hahn, E-J. and Peak, S-H. 2001. Application of bioreactors for scale-up micropropagation systems of plants. In Vitro Cell Dev. Biol.- Plants. 37:149-157.Paek, K-Y., Hahn, E-J. and Peak, S-H. 2001. Application of bioreactors for scale-up micropropagation systems of plants. In Vitro Cell Dev. Biol.- Plants. 37:149-157.

Piao, X-C., Chakrabarty, D., Hahn, E-J, Paek, K-Y. 2003. A simple method for mass production of potato microtubers using a bioractor system. Current Schience. 84(8): 11291132.Piao, X-C., Chakrabarty, D., Hahn, E-J, Paek, K-Y. 2003. A simple method for mass production of potato microtubers using a bioreactor system. Current Science. 84(8): 11291132.

Preil, W. 1991. Application of bioreactors in plant propagation. In: Debergh, P.C. and Zimmermann, R.H. eds. Micropropagation. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 425445.Preil, W. 1991. Application of bioreactors in plant propagation. In: Debergh, P.C. and Zimmermann, R.H. ed. Micropropagation. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers, 425445.

Pruski, K., Astatkie, T., Mirza, M and Nowak, J. 2002. Photoautotrophic micropropaation of Russet Burbank potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 69(2): 197-200.Pruski, K., Astatkie, T., Mirza, M and Nowak, J. 2002. Photoautotrophic micropropagation of Russet Burbank potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 69(2): 197-200.

Sajc, L., Grubisic, D. and Vunjak-Novakovic, G. 2000. Bioreactors for plant engineering: An outlook for further researc. Biochemical Engineering Journal. 4 (2): 89-99.Sajc, L., Grubisic, D. and Vunjak-Novakovic, G. 2000. Bioreactors for plant engineering: An outlook for further research. Journal of Biochemical Engineering. 4 (2): 89-99.

Savangicar, V.A., Savangicar, C., Daga, R.S. and Pathak, S. 2002. Potentials of reduction in cost of production in a new model of comercial micropropagation. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 2223.Savangicar, V.A., Savangicar, C., Daga, R.S. and Pathak, S. 2002. Potentials of reduction in cost of production in a new model of commercial micropropagation. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 2223.

Simonton, W., Robacker, C. and Kruger, S. 1991. A programmable micropropagation apparatus using cycled liquid medium. Plant Cell Tissue Org. Culture. 27.211-218.Simonton, W., Robacker, C. and Kruger, S. 1991. A programmable micropropagation apparatus using cycled liquid medium. Plant Cell Tissue Org. Culture. 27.211-218.

Sorvari, S., Toldi, O., Ahanen, K., Viinamaki, T., Hakonen, T. and Tahvoven, R. 1997. Using polyaccharides and galactomannans as gelling agent in capsule formation of artifical seeds. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 122 (6): 878-883.Sorvari, S., Toldi, O., Ahanen, K., Viinamaki, T., Hakonen, T. and Tahvoven, R. 1997. Using polysaccharides and galactomannans as gelling agent in capsule formation of artificial seeds. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 122 (6): 878-883.

Sorvari, S., Ahanen, K. and Toldi, O. 2002. Carrot as a model system in plant cloning. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 66-68.Sorvari, S., Ahanen, K. and Toldi, O. 2002. Carrot as a model system in plant cloning. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29June 2. Proceedings. 66-68.

Takayama, S. and Misawa, M. 1981. Mass propagation of Begonia x hiemalis plantlets by shake culture. Plant Cell Physiol. 22:461-467.Takayama, S. and Misawa, M. 1981. Mass propagation of Begonia x hiemalis plantlets by shake culture. Plant Cell Physiol. 22:461-467.

Takayama, S. and Akita, M. 1994. The types of bioreactors used for shoots and embryos.Takayama, S. and Akita, M. 1994. The types of bioreactors used for shoots and embryos.

Plant Cell Tissue and Organ Culture. 39(2): 147-156.Plant Cell Tissue and Organ Culture. 39(2): 147-156.

Teisson, C. and Alvard, D. 1995. A new concept of plant in vitro cultivation in liquid medium: temporary immersion. In: Terzi et aLeds. Curent Issues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. 105-110.Teisson, C. and Alvard, D. 1995. A new concept of plant in vitro cultivation in liquid medium: temporary immersion. In: Terzi et aLeds. Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. 105-110.

Thakur, R., Sood, A. and Ahuja, P.S. 2002. Development and testing of a bioreactor system anebling large scale production of micropropagated plants through control misting and temporary immersion. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 46.Thakur, R., Sood, A. and Ahuja, P.S. 2002. Development and testing of a bioreactor system enabling large scale production of micropropagated plants through controlled misting and temporary immersion. 1 st Int. Symp. on Liquid systems for in vitro mass propagation of plants. As, Norway, May 29-June 2. Proceedings. 46.

Tisserat, B. and Silman R. 2000. Interactions of culture vessels, media volume, culture density, and carbone levels on lettuce and spearmint shoot growth in vitro. Plant Cell Reports. 19:464-471.Tisserat, B. and Silman R. 2000. Interactions of culture vessels, media volume, culture density, and carbon levels on lettuce and spearmint shoot growth in vitro. Plant Cell Reports. 19:464-471.

·»·· ..· ; j,·»·· ..· ; j,

Tisserat, B. and Vandercook, C.E. 1985. Development o fan automated plant culture system. Plant Cell Tissue Organ Culture. 5:107-117.Tisserat, B. and Vandercook, C.E. 1985. Development o fan automated plant culture system. Plant Cell Tissue Organ Culture. 5:107-117.

Tisserat, B., Herman, C., Silman, R. and Bothast, R.J. 1997. Using ultra-high carbon dioxide levels enhances plantlet growth in vitro. Hortic Technoi. 7:282-289.Tisserat, B., Herman, C., Silman, R. and Bothast, R.J. 1997. Using ultra-high carbon dioxide levels enhances plantlet growth in vitro. Hortic Technoi. 7:282-289.

Vasil, I.K. 1991. Rationale for the scale-up and automation of plant propagation. In: Vasil, I.K., ed. Schale-up and automation in plant propagation. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 8., San Diego. Academic Press. 1-12.Vasil, I.K. 1991. Rationale for the scale-up and automation of plant propagation. In: Vasil, I.K., ed. Scale-up and automation in plant propagation. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 8th, San Diego. Academic Press. 1-12.

Wilson, S.B., Heo, J., Kubota, C. and Kozai, T. 2001. A forced ventilation micropropagation system for photoautotrophic production of sweetpotato plug plantlet in a scaled-up culture vessel: II. Carbohydrate status. Hortic TechnoL 11 (1): 95-99.Wilson, S.B., Heo, J., Kubota, C. and Kozai, T. 2001. A forced ventilation micropropagation system for photoautotrophic production of sweetpotato plug plantlet in a scaled-up culture vessel: II. Carbohydrate status. Hortic TechnoL 11 (1): 95-99.

Xiao, Y-L., Lok, Y-H., Kozai, T. 2003. Photoautotrophic growth of sugarcane plantlets in vitro as affected by photosynthetic photon flux and vessel air exchanges. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 39(2): 186-192.Xiao, Y-L., Lok, Y-H., Kozai, T. 2003. Photoautotrophic growth of sugarcane plantlets in vitro as affected by photosynthetic photon flux and vessel air exchanges. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 39(2): 186-192.

Yu, W-C., Joyce, P.J., Cameron, D.C. and McCown, B.H. 2000. Sucrose uilization during potato microtuber growth in bioreactor. Plant Cell Reports, 19:407-413.Yu, W-C., Joyce, P.J., Cameron, D.C. and McCown, B.H. 2000. Sucrose utilization during potato microtuber growth in bioreactor. Plant Cell Reports, 19:407-413.

Ziv, M. 1995. In vitro acclimatization. In: AitkenChristie, J., Kozai, T. and L. Smith, M.A.eds. Automation and environmental control in plant tissue culture. Kluwer, Dordrecht, 493-516.Ziv, M. 1995. In vitro acclimatization. In: AitkenChristie, J., Kozai, T. and L. Smith, M.A.eds. Automation and environmental control in plant tissue culture. Kluwer, Dordrecht, pp. 493-516.

Ziv, M. 2000. Bioreactor for plant micropropagation. Horticultural Reviews. John Wiley & Sons, Inc. Vol. 24:1-30.Ziv, M. 2000. Bioreactor for plant micropropagation. Horticultural Reviews. John Wiley & Sons, Inc. Vol. 24:1-30.

Zobayed, S.M.A., Kubota, C. and Kozai T. 1999. Development of a forced ventilation micropropagation system for large-scale photoautotrophic culture and its utilization in sweed potato. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 35 (4): 350-355.Zobayed, S.M.A., Kubota, C. and Kozai T. 1999. Development of a forced ventilation micropropagation system for large-scale photoautotrophic culture and its utilization in seed potato. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 35 (4): 350-355.

Claims

4. ·’

Patent claims:

1./ Combined micropropagation method, in which vegetative tissues are kept in a sterile state in a closed space, preferably at a temperature between 20-30 °C, illuminated, repeatedly immersed in liquid culture medium for 5-10 minutes at intervals of 25-60 minutes, and kept above the culture medium between immersions, characterized in that during propagation, the vegetative tissues, preferably illuminated with an energy of 30 microEinstein/m2 sec, are immersed in the culture medium by tilting, and then raised back above the culture medium by tilting in the opposite direction of rotation.

2./ The method according to claim 1, characterized in that the intensity of the illumination and/or the light-dark intervals and their frequency are repeatedly modified.

3./ The method according to claim 1./ or 2./, characterized in that the culture medium is replaced at least once between two immersions with a culture medium of modified composition.

4./ The method according to any one of claims 1-3, characterized in that fresh air is passed over the culture medium.

5./ The method according to any one of claims 1-3, characterized in that fresh air is introduced into the culture medium.

6./ The method according to any one of claims 1-3, characterized in that fresh air is supplied above and into the culture medium.

7./ The method according to any one of claims 4-6, characterized in that the fresh air is enriched with carbon dioxide.

8./ The method according to any one of claims 4-7, characterized in that the amount of fresh air and/or the enrichment ratio is modified.

9./ The method according to claim 2./, 3./ or 8./, characterized in that the method is modified according to the increase in the number of immersions and/or the development of the vegetative tissues.

~·· -* j. .:.

10./ The method according to any one of claims 1-9, characterized in that at least two groups of vegetative tissues are propagated simultaneously and independently of each other.

11./ The method according to claim 10, characterized in that identical vegetative tissues are propagated by identical operations.

12./ The method according to claim 10, characterized in that different vegetative tissues per group are propagated by identical operations.

13./ The method according to claim 10, characterized in that identical vegetative tissues are propagated by different operations per group.

14./ The method according to any one of claims 1-13, characterized in that the propagation is manually program-controlled.

15./ The method according to any one of claims 1-13, characterized in that the propagation is program-controlled by an automation system, preferably by a computer.

16./ The method according to claim 14./ or 15./, characterized in that the propagation data is collected and advantageously analyzed on a computer.

17./ Bioreactor for implementing the method according to claims 1-16, the light-transmitting, liquid- and gas-tight, self-supporting shell of which is provided with at least one lid and with stubs, the interior of the shell is divided into two parts by a light-, liquid- and gas-permeable carrier element, preferably V-shaped, assigned to the vegetative tissues to be propagated, the shell is installed on a drive unit, characterized in that it has a circular-section bearing surface(s), which is/are/installed on the drive unit (18), and furthermore has at least one magnet (5) assigned to the limit switch(es) (2) built into the drive unit (18), optionally the inlet stub(s)/ flexible tube(s)/ for sterile-gassing/or sterile-culture-medium-feed units known per se is/are/ are connected, finally its shell is arranged in the halo of an illumination unit (22) known per se.

j. .:

18./ Bioreactor according to claim 17, characterized in that its shell is a circular cylinder (2), which is closed with two flat covers, the supporting ring (6) of the magnet(s) (5) is fixed to the rear cover (3) concentrically from the outside, and the tubular shaft (6) is coaxially from the inside, the front end of the tubular shaft (9) with holes coaxially passed through the front cover (4) is connected to a sterile gas supply unit as a stub, and the internal thread of the rear end is mounted on a draw bolt (7) coaxially fixed in the rear cover (3) and is designed as a draw rod for clamping the circular cylinder (2), the rear cover (3) and the front cover (4) in a liquid- and gas-tight manner, the front edges of the carrier element formed as a trough (13) are connected to the front cover (4), two side edges The inner shell of the circular cylinder (2) and its rear edges are connected to a guide disk (15) perpendicular to the ridge of the trough (13) by a material-sealing connection. Finally, the front cover (4) has a second stub (12) connected to a sterile culture medium supply unit.

19./ Bioreactor according to claim 18, characterized in that the shell is installed on four rollers (19,20) of the drive unit (18), where at least one of the rollers (20) is driven.

20./ Bioreactor according to claim 18./ or 19./, characterized in that its structure is multiplied like a building block.

21./ Bioreactor according to claim 20, characterized in that separate illumination units (22) are installed on each floor in a multi-level arrangement.

22./ Bioreactor according to any one of claims 17-21, characterized in that it has an individual manually switched program control unit (23).

23./ Bioreactor according to any one of claims 17-22, characterized in that it has an automatic, preferably computer program control unit.

24./ Bioreactor according to any one of claims 17-23, characterized in that its sensor-control elements are connected to a computer.

The authorized person:

151% Lajos Kis lawyer, mechanical engineer, patent attorney 1701 Budapest/ Pf.t 33,