[go: up one dir, main page]

HUP0303632A2 - Eljárások kettős szálú DNS célszekvenciák tisztítására és detektálására hármas hélix kölcsönhatás alkalmazásával - Google Patents

Eljárások kettős szálú DNS célszekvenciák tisztítására és detektálására hármas hélix kölcsönhatás alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HUP0303632A2
HUP0303632A2 HU0303632A HUP0303632A HUP0303632A2 HU P0303632 A2 HUP0303632 A2 HU P0303632A2 HU 0303632 A HU0303632 A HU 0303632A HU P0303632 A HUP0303632 A HU P0303632A HU P0303632 A2 HUP0303632 A2 HU P0303632A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
oligonucleotide
double
dna
stranded dna
Prior art date
Application number
HU0303632A
Other languages
English (en)
Inventor
Francis Blanche
Béatrice Cameron
Original Assignee
Gencell S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0103953A external-priority patent/FR2822476B1/fr
Application filed by Gencell S.A. filed Critical Gencell S.A.
Publication of HUP0303632A2 publication Critical patent/HUP0303632A2/hu
Publication of HUP0303632A3 publication Critical patent/HUP0303632A3/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát képezik egy harmadik DNS-szállal kölcsönhatásbalépni és stabil hármas hélixet kialakítani képes új kettős szálú DNS-célszekvenciák. A találmány tárgyát képezi ezen túl egy kettős szálúDNS-molekula tisztítására szolgáló eljárás, amely során az említettDNS-molekulát tartalmazó oldatot érintkeztetik egy harmadik DNS-szállal, amely képes hibridizáció révén egy hármas hélix szerkezetetlétrehozni az említett DNS-molekula által hordozott, kettős szálú DNS-célszekvenciával. Ó

Description

s. B. G. & K.
Szabadalmi Ügyvivői Iroda H-1062 Budapest. Andrassy^ut A5. telefon: 461-1000, Fax: 461-1099
'7 7:
Eljárások kettős szálú DNS célszekvenciák tisztítására és detektálására hármas hélix kölcsönhatás alkalmazásával
A találmány tárgyát hármas hélix szerkezetek kialakítására képes új DNS célszekvenciák, valamint egy új DNS tisztítási eljárás képezi. Részletesebben meghatározva a találmány szerinti tisztítási eljárás megvalósít egy hibridizációt egy DNS célszekvencia és egy oligonukleotid között. A találmány szerinti eljárás különösen hasznosnak bizonyul, mivel lehetővé teszi kettős szálú DNS farmakológiai minőségű tisztítását magas kitermeléssel .
Hasonlóképpen a találmány tágyát képezik az említett specifikus célszekvenciákat tartalmazó DNS molekulák detektálására, mennyiségi meghatározására, izolálására és szelekciójára szolgáló új eljárások.
A találmány szerinti tisztítási eljárás lényegében egy sajátos DNS célszekvencia és egy természetes vagy módosított bázisokból álló oligonukleotid közötti hármas hélix kölcsönhatáson alapszik.
A közelmúltban kimutatták, hogy a homopirimidin oligonukleotidok képesek specifikusan kölcsönhatásba lépni a DNS kettős hélixével annak nagy barázdájában, és így helyileg egy hármas hélixet alakítanak ki [Moser et al., Science 238, 645 (1987) ; Povsiz et al., J. Am. Chern. 111, 3059 (1989)]. Ezek az oligonukleotidok a DNS kettős hélixét szelektíven az oligopurin-oligopirimidin szekvenciáknál ismerik fel, azaz az olyan területeknél, melyeknél az egyik láncon oligopurin, a komplementer láncon oligopirimidin szekvencia található, és ott lokálisan hármas hélixet képeznek. A homopirimidin oligonukleotid harmadik lánc bázisai hidrogénkötéseket (Hoogsteen típusú kötések) képeznek a Watson-Crick bázispárok purinjaival.
Hasonló módon, hármas hélix típusú szerkezetek létrejöhetnek egy homopurin oligonukleotid és egy kettős szálú homopurin-homopirimidin DNS között. Az ilyen típusú szerkezetekben az oligonukleotid purin bázisai inverz Hoogsteen kötéseket képeznek a kettős szálú DNS purin bázisaival.
Ilyen helyspecifikus hármas hélix kölcsönhatásokat alkalmaztak többek között Looney és munkatársai [Science 241, 456 (1988)] bizonyos gének expressziójának szabályozására, valamint Helene és munkatársai [BBA 1049, 99 (1990); WO 95/18223], akik leírják hármas hélix szerkezetek kialakulását oligonukleotidok és promóterekben vagy kódoló régiókban megtalálható célszekvenciák között, s ezáltal a szabályozás lehetőségét e gének expressziós profiljára, valószínűleg az RNS polimeráznak az iniciáció és/vagy az elongáció szintjén történő gátló hatása révén.
Hasonlóképpen leír egy plazmid DNS tisztítására szolgáló hármas hélix típusú kölcsönhatást a WO 96/18744 számú nemzetközi közzétételi irat, amelynek kiindulási komplex elegye a DNS molekulát más összetevőkkel elegyítve tartalmazza. Részletesebben meghatározva ez a közzétételi irat kettős szálú DNS tisztítására szolgáló eljárást ír le, amely során a komplex elegyet érintkeztetik egy hordozóval, amelyen a specifikus DNS célszekvenciával hibridizáció révén hármas hélixet kialakítani képes oligonukleotid található, kovalens kötéssel kapcsolva.
77.377/BE
A tisztítási célra szolgáló hármas hélix típusú specifikus kölcsönhatás során a specificitás egyrészről az oligonukleotid által alkotott harmadik szál timin (T) bázisai, másrészről a kettős szálú DNS AT bázispárjai közötti, T*AT triászokat létrehozó Hoogsteen típusú hidrogén kötés révén kialakuló párosodásoknak köszönhető. Éppúgy, a harmadik szálon elhelyezkedő protonált citozinok párosodnak a kettős szálú DNS GC bázispárjaival +C*GC triászok kialakítására [Sun et al., Curr. Opin. Struc. Bioi. _3' 345 (1993)]. Megállapították, hogy a T*AT és +C*GC triászok (elnevezésük kanonikus triász) maximális stabilitást biztosítanak a hármas hélixnek. Mindazonáltal számos más faktor hasonlóképpen szerepet játszik a hármas hélix stabilizációjában, mint például a citozinok százalékos aránya, a hármas hélix közegének vagy környezetének pH-ja és sótartalma. Hasonlóképpen több helyen leírták, hogy nem-kanonikus (azaz a T*AT és +C*GC triászoktól különböző) triászok bevitele a hármas hélix kisebb vagy nagyobb jelentőségű szerkezeti deformációjához vezet, és annak jelentős mértékű destabilizációját okozza. Összehasonlító tanulmányokban vizsgálták a különböző nem-kanonikus triászok bevitelét [Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9397; Fossella et al., Nucleic Acids Research 21, 4511 (1993); Govers et al., Nucleic Acids Research 25, 3878 (1997)], és a hármas hélix változó mértékű destabilizációját mutatták ki a bevitt nem-kanonikus triász természetének függvényében.
Noha az eljárás lehetővé teszi egy cél DNS gyors és hatékony tisztítását farmakológiai minőségben, szükséges, hogy a tisztítani kívánt DNS szálak legalább egyikén jelen legyen egy elegen
77.377/BE dő hosszúságú, előnyösen teljesen homopurin szekvencia, és ez komplementer legyen a harmadik DNS szállal. Ez a szekvencia lehet természetesen jelenlévő vagy a tisztítani kívánt kettős szálú DNS célszekvenciába mesterségesen beinszertált szekvencia.
A bejelentésben meglepő és nem várt módon kimutatjuk, hogy az egyik szálán nem kizárólag purin bázisokból álló DNS célszekvenciát hordozó DNS molekula hasonlóképpen képes stabil hármas hélix szerkezet létrehozására egy harmadik DNS szállal, nem-kanonikus triászok kialakulásához vezető, az oligonukleotidéval nem komplementer bázisok jelenléte ellenére is.
Részletesebben meghatározva, a bejelentő által újonnan azonosított kettős szálú DNS célszekvenciák egyik szálukon meghatározott számú pirimidin bázissal megszakított homopurin szekvenciát foglalnak magukba. A bejelentésben hasonlóképpen kimutatjuk, hogy e tökéletlen homopurin-homopirimidin DNS szekvenciák alkalmazhatóak az őket magukba foglaló DNS molekulák hatékony tisztítására hármas hélix kölcsönhatás segítségével.
Az újonnan azonosított szekvenciák ezenkívül különösen alkalmasak az őket magukba foglaló DNS molekulák detektálására, menynyiségi meghatározására, izolálására vagy szelekciójára.
A találmány tárgyát képezik tehát új DNS célszekvenciák, amelyek egyik szálukon egy
5'-(R)n-(N)t-(R')m-3' általános képletű szekvenciát foglalnak magukba, amelyben:
R és R' jelentése kizárólag purin bázisokból álló nukleotid-szekvencia;
n és m jelentése 9-nél kisebb egész szám, és n+m értéke nagyobb,
77.377/BE mint 5;
N jelentése egy purin bázisokat és pirimidin bázisokat egyaránt magába foglaló nukleotid-szekvencia;
t jelentése 8-nál kisebb egész szám; és az említett DNS szekvencia képes kölcsönhatásba lépni egy harmadik DNS szállal, és így egy hármas hélix szerkezetet kialakítani.
A DNS célszekvencia 5' illetve 3' részében elhelyezkedő R illetve R' homopurin szekvenciák teljes hosszúsága tehát 6 vagy annál nagyobb. Egy harmadik szállal kölcsönhatásba lépni képes adenin és guanin bázisokat foglalnak magukba, egy T*AT és +C*GC kanonikus triászokból álló hármas hélix szerkezet kialakításának céljából. Az R és R' homopurin szekvenciák előnyösen összesen legalább 2 guanint és összesen legalább 2 adenint foglalnak magukba. A purin szekvenciák még előnyösebben magukba foglalnak egy (AAG) típusú motívumot.
A központi N szekvencia hosszúsága t, amely 8 purin és pirimidin bázisnál rövidebb és képes a találmány szerint egy harmadik DNS szállal kölcsönhatásba lépni, nem-kanonikus triászok kialakítása céljából. A központi N szekvencia hosszúsága előnyösen egyenlő vagy nagyobb, mint 1 és kisebb, mint 8. A központi N szekvencia hosszúsága még előnyösebben egyenlő vagy nagyobb, mint 2 és kisebb, mint 8.
A kanonikus triász kifejezés jelentése két nukleotid triász, amely a kettős szálú DNS AT és GC bázispárjainak a T és +C bázisokkal történő kölcsönhatásából létrejövő T*AT illetve +C*GC triász. Ez a két triász a létező 16 triász közé tartozik, amelyek közül a legnagyobb stabilitásúak.
77.377/BE
A nem-kanonikus triász kifejezés jelentése a fennmaradó 14 másik nukleotid triász együttese. Ezek egy kettős szálú DNS és egy harmadik DNS szál nem specifikus kölcsönhatása révén jönnek létre és a T*AT és +C*GC kanonikus triászokhoz képest kisebb stabilitásúak. Megemlíthetjük különösen a T*CG és T*GC nem-kanonikus triászokat, amelyek a célszekvencia CG illetve GC bázispárjai és a harmadik szál egy timinje (T) közötti kölcsönhatás révén alakulnak ki, a G*CG nem-kanonikus triászt, amely a célszekvencia CG bázispárja és a harmadik szál egy guaninja (G) közötti kölcsönhatás révén alakul ki, a C*AT és C*TA nem-kanonikus triászokat, amelyek a célszekvencia AT illetve TA bázispárjai és a harmadik szál egy citozinja (C) közötti kölcsönhatás révén alakulnak ki, a G*CG triászt, amelyek a célszekvencia CG bázispárja és a harmadik szál egy guaninja (G) közötti kölcsönhatás révén alakul ki, és a T*TA triászt, amelyek a célszekvencia TA bázispárja és a harmadik szál egy timinje (T) közötti kölcsönhatás révén alakul ki.
Egyértelmű, hogy a 5' és 3' purin végekhez hasonlóan a központi N szekvencia is létrehozhat T*AT és +C*GC kanonikus triászokat az AT illetve GC bázispárok és a harmadik DNS szál timin (T) illetve citozin (C) bázisai közötti kölcsönhatás eredményeképpen .
A központi N szekvencia előnyösen legfeljebb 6, nem-kanonikus triász kialakulásához vezető purin és pirimidin bázist foglal megába. A központi rész és az oligonukleotid kölcsönhatása révén kialakuló nem-kanonikus triászokat még előnyösebben a T*CG, T*GC, C*AT és C*TA nem-kanonikus triászok közül választjuk. A
77. 377/BE triászok előnyös megoszlására példaképpen megemlíthetjük hat nem-kanonikus triász létrejöttét, amelyek magukba foglalnak egy C*AT, egy C*TA, két T*CG és két T*GC triászt, öt nem-kanonikus triászt, amelyek magukba foglalnak két C*AT és három T*GC triászt, vagy három nem-kanonikus triászt, amelyek magukba foglalnak két T*GC és egy C*AT triászt. Több T*TA nem-kanonikus triász hasonlóképpen jelen lehet, de ebben az esetben a hármas hélixben egymással nem szomszédosak.
A központi szekvencia előnyösen legfeljebb három C vagy T pirimidin bázist foglal magába, amely a T*CG, C*TA vagy G*TA nem-kanonikus triászok kialakulásához vezet. A három pirimidin bázis előnyösen nem egymás után következik, hanem A vagy G purin bázisokkal elválasztott, amelyek képesek kölcsönhatásba lépni a harmadik DNS szállal T*GC és C*AT nem-kanonikus triászok, csakúgy, mint T*AT és +C*GC kanonikus triászok létrehozására.
A találmány egy sajátos megvalósítási módja szerint a kettős szálú DNS célszekvencia az 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' szekvencia (1. számú szekvencia).
A találmány szerinti kettős szálú DNS szekvenciákkal kölcsönhatásba lépni képes harmadik DNS szál lehet például egy oligonukleotid vagy egy másik kettős szálú DNS lokálisan szétvált egyik szála, és magába foglalhatja a következő bázisokat:
- a timint (T) , amely képes a kettős szálú DNS célszekvencia AT bázispárjaival a T*AT kanonikus triászok kialakítására, valamint a DNS célszekvencia CG és GC bázispárjaival a T*CG illetve T*GC nem-kanonikus triászok kialakítására [Soyfer et al., Triple Helical Nucleic Acids, pp. 151-93, Springer, New York (1996)];
77.377/BE
- a guanint (G) , amely képes a kettős szálú DNS ΤΑ bázispárjaival a G*TA triászok kialakítására [Soyfer et al., Triple Helical Nucleic Acids, pp. 151-93, Springer, New York (1996)];
- a citozint (C) , amely képes a kettős szálú cél DNS GC, AT illetve TA bázispárjaival a +C*GC (C+ = protonált citozin) kanonikus triászok vagy a C*AT illetve C*TA nem-kanonikus triászok kialakítására; és az uracilt, amely képes tripletek létrehozására a célszekvencia AU vagy AT bázispárjaival [Bates et al., Nucleic Acids Research 23, 3627 (1995)].
Az alkalmazott harmadik DNS szál előnyösen magába foglal egy citozinban gazdag homopirimidin szekvenciát, ahol a citozinok protonált állapotban savas pH értéken találhatóak és stabilizálják a hármas hélixet. Ilyen oligonukleotidok magukba foglalhatnak például (CTT)n szekvenciát, (CT)n szekvenciát vagy (CTT)n szekvenciát, amelyben n értéke 1 és 20 közötti egész szám. Különösen előnyös (CT)n, (CTT)n típusú szekvenciák vagy (CCT), (CT) vagy (CTT) motívumokból kombinált szekvenciák alkalmazása.
Amennyiben a harmadik DNS szál oligonukleotid alakjában található, lehet természetes, azaz természetes, nem módosított bázisokból álló, vagy kémiailag módosított. Jellemzően az oligonukleotid előnyösen rendelkezhet bizonyos kémiai módosításokkal, amelyek megnövelik nukleázokkal szembeni ellenállását vagy védelmét, vagy megnövelik a specifikus szekvenciához való affinitását .
A találmány értelmében oligonukleotid minden nukleozid lánc, amelynek váza módosított annak érdekében, hogy a nukleázokkal 77.377/BE szemben ellenállóbb legyen. A lehetséges módosítások közül megemlíthetjük a foszforotioát oligonukleotidokat, amelyek képesek hármas hélixet alkotni a DNS-sel [Xodo et al., Nucleic Acids Research 22, 3322 (1994)], csakúgy, mint a formacetál vagy metil-foszfonát vázzal rendelkező oligonukleotidokat [Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 7767 (1991)]. Hasonlóképpen alkalmazhatóak nukleotidok α-anomerjeivel szintetizált oligonukleotidok, amelyek szintén hármas hélixet képeznek a DNS-sel [Le Doan et al., Nucleic Acids Research 15, 7749 (1987)]. A váz egy másik módosítása a foszforamidit kötés. Példaképpen megemlíthetjük a Gryaznov és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 116, 3143 (1994)], által leírt N3'-P5' internukleotid foszforamidit kötést, amely a DNS-sel rendkívül stabil hármas hélixet alkotó oligonukleotidokat szolgáltat. A váz másféle módosításai közül megemlíthetjük ribonukleotidok, 2'-O-metil-ribóz vagy foszfodiészter alkalmazását [Sun et al., Curr. Opin. Struc. Bioi. 3_r 3143 (1993)]. A foszforilált vázat végül helyettesíthetjük poliamid vázzal, mint például a PNA-ban ((Peptide Nucleic Acid, peptid nukleinsav), amely szintén képes hármas hélixek létrehozására [Nielsen et al., Science 254, 1497 (1991); Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 115, 6477-81 (1993)].
A harmadik szál timinjét helyettesíthetjük 5-bróm-uracillal, amely növeli az oligonukleotid affinitását a DNS-hez [Povsiz et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 3059 (1989)]. A harmadik szál hasonlóképpen tartalmazhat nem természetes bázisokat, amelyek közül megemlíthetjük a 7-dezaza-2'-dezoxi-xantozint [Milligan et al., Nucleic Acids Research 21, 327 (1993)], az 1-(2-dezoxi-alfa-D
77.377/BE
-ribofuranozil)-3-metil-5-amino-lH-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ont [Koh et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 1470 (1992)], a 8-oxo-adenint, a 2-amino-purint, a 2'-O-metil-pszeudoizocitidint vagy a szakemberek által ismert bármely más módosítást [Sun et al., Curr. Opin. Struct. Bioi. .3' 345 (1993)].
A harmadik szál egy másik típusú módosításának célja különösen a harmadik szál és a specifikus szekvencia közötti kölcsönhatás és/vagy affinitás javítása. Jellemzően egy, a találmány szerinti nagyon előnyös módosítás az oligonukleotid citozinjainak metilezése az 5 pozícióban. Az így metilezett oligonukleotid meglepő tulajdonsága stabil hármas hélix alkotása a specifikus szekvenciával semlegeshez közeli pH értékeken (>5) [Xodo et al., Nucleic Acids Research 19, 5625 (1991)]. Ez lehetővé teszi tehát, hogy a korábbiakban alkalmazott oligonukleotidokhoz képest magasabb pH értékeken dolgozzunk, azaz olyan pH-η, ahol a plazmid DNS lebomlásának veszélye jóval alacsonyabb.
A hosszúság a szakember által esetenként változtatható a kívánt kölcsönhatás szelektivitásának és stabilitásának függvényében .
A találmány szerinti harmadik DNS szálak szintetizálhatóak bármely ismert módszerrel. Jellemzően előállíthatóak nukleinsav szintetizátorral. A szakemberek által ismert bármely más módszer nyilvánvalóan alkalmazható.
E harmadik DNS szálak vagy oligonukleotidok képesek hármas hélix létrehozására egy, a fentiekben leírt specifikus kettős szálú DNS szekvenciával, amely magába foglal egy 8 nukleotidnál rövidebb középső vegyes (pirimidin-purin) N régiót, amelyet az R
77.377/BE
és R' homopurin régiók vesznek körül. Ez utóbbiak magukba foglalhatnak például egy GAA típusú motívumot.
Példaképpen megemlíthetjük a következő szekvenciának megfelelő kettős szálú DNS célszekvenciát: 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' (1. számú szekvencia), amely képes egy hármas hélixet alkotni egy, a következő szekvenciák közül választott szekvenciát magába foglaló oligonukleotiddal:
5'-TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (2. számú szekvencia),
5'-TT CTT CTT GCT TCT CTT CTT-3' (3. számú szekvencia),
5'-TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT-3' (4. számú szekvencia),
5'-TT CTT CTT CTT TCT CTT CTT-3' (5. számú szekvencia),
A hármas hélix létrehozása megvalósítható Mg2+ ionok jelenlétében, amelyek esetlegesen előmozdíthatják e szerkezet stabilitását [Vasquez et al., Biochemistry 34, 7243 (1995); Beái et al., Science 251, 1360 (1991)].
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti DNS célszekvenciák lehetnek a kettős szálú DNS-en természetesen megtalálható szekvenciák, és különösen előnyös egy ilyen szekvenciával, például kívánt génekben, mint például terápiás vagy kísérleti kívánt génekben vagy marker génekben megtalálható szekvenciával hármas hélixet alkotni képes oligonukleotid alkalmazása. E tekintetben különböző kívánt gének nukleotid-szekvenciáját elemeztük és vizsgáltuk egy (CTT)n típusú oligonukleotiddal alkotott hármas hélix kölcsönhatás stabilitását, és kimutattuk, hogy e gének bizonyos régiói stabil hármas hélix kialakulásához vezetnek nem-kanonikus triászok, mint például T*CG, T*GC, C*AT, C*TA és T*TA jelenléte ellenére is.
77.377/BE
A kettős szálú DNS-en természetesen megtalálható szekvenciák közül megemlíthetjük a humán FGF1 gén szekvenciájában megtalálható 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' (ID1 elnevezésű) szekvenciát (1. számú szekvencia) [Jaye et al., Science 233, 541 (1986)], a véralvadásban szerepet játszó IX faktort kódoló humán gén 5'-GAA GAA GCA CGA GAA G-3' szekvenciáját (6. számú szekvencia) [Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6461 (1982)], a szekretált alkalikus foszfatáz (SeAP) gén 5'-AAA GAA AGC AGG GAA G-3' (7. számú szekvencia) és 5'-GAA GAG GAA GAA G-3' (8. számú szekvencia) szekvenciáját [Millan et al., J. Bioi. Chem. 261, 3112 (1986)], a humán alfa fetoprotein (haFP) gén 5'-AAG GAG AAG AAG AA-3' szekvenciáját (9. számú szekvencia) [Gibbs et al., Biochemistry 26, 1332 (1987)], a resztenózis szabályozásában résztvevő humán GAX gén 5'-AA GAT GAG GAA GAA G-3' szekvenciáját (10. számú szekvencia) [Gorski et al., Mol. Cell. Bioi. 13, 3722 (1993)], végül a humán VEGFB-167 gén 5'-GGC AAC GGA GGA A-3' szekvenciáját (13. számú szekvencia) [Olofsson et al., J. Bioi. Chem. 271, 19310 (1996)]. Hármas hélix létrehozása egy terápiás vagy kísérleti kívánt génben megtalálható szekvenciával különösen előnyös abban az esetben, amikor a célszekvencia természetesen jelen van a kettős szálú DNS-en és nem szükséges módosítani a kettős szálú cél DNS-t vagy a gént hordozó plazmidot egy mesterséges specifikus szekvencia bejuttatása céljából. Alternatív módon egy célszekvenciát bevihetünk mesterségesen is a kettős szálú DNS-be.
A találmány egy másik tárgyát képezi egy eljárás kettős szálú DNS tisztítására, amely során érintkeztetünk egy DNS-t más ösz77.377/BE
szetevőkkel elegyítve tartalmazó oldatot egy, a korábbiakban leírt harmadik DNS szállal, amely előnyösen egy, a fentiekben leírt kettős szálú DNS-en megtalálható specifikus szekvenciával hibridizáció révén hármas hélix létrehozására képes oligonukleotid. A kettős szálú DNS-t előnyösen egy oldatban érintkeztetjük egy hordozóhoz rögzített oligonukleotiddal. Még előnyösebben az oligonukleotid a hordozóhoz stabil módon, kovalensen vagy nem kovalensen kötött. így a kettős szálú DNS-t tartalmazó oldat érintkeztetésének lépése előnyösen magába foglalhatja a más öszszetevőkkel elegyített DNS oldat átengedését a hordozón, amelyhez kapcsolt az oligonukleotid, a tisztítani kívánt kettős szálú DNS hatékony és gyors kinyerésének céljából.
Ilyen hordozók a szakemberek számára jól ismertek és állhatnak például gyöngyökből vagy mikrorészecskékből, mint például latex részecskékből, vagy bármely más szuszpenziós hordozóból. Az oligonukleotid lehet hasonlóképpen kapcsolt egy természetes vagy szintetikus eredetű polimer típusú molekulához. Az oligonukleotidot rögzítő polimer előnyösen rendelkezik egy olyan tulajdonsággal, amely lehetővé teszi könnyű elválasztását az oldattól a kettős szálú DNS-sel alkotott hármas hélix létrejöttét követően. A természetes polimerek körül megemlíthetjük a fehérjéket, a lipideket, a cukrokat vagy a poliolokat. A szintetikus polimerek körül megemlíthetjük a poliakril-amidokat, a polietilén glikolokat, a sztirol származékokat vagy a hőérzékeny polimereket, mint például a poli(N-izopropil-akrilamid) típusú vegyületeket, amelyek alacsony hőmérsékleten oldhatóak, de fázistranzíciós hőmérsékletük fölött oldhatatlanná válnak [Móri
77.377/BE et al., Biotechnology and Bioengineering 72, 261 (2001)].
A találmány szerinti tisztítási eljárás különösen előnyös, mivel lehetővé teszi i) egy homopirimidin oligonukleotiddal stabil hármas hélix szerkezet létrejöttéhez elengendő hosszúságú homopurin szekvenciát nem tartalmazó DNS molekulák tisztítását, de hasonlóképpen ii) több pirimidin bázissal megszakított homopurin szekvenciájú DNS molekulák tisztítását. Többféle DNS molekula tisztításának lehetővé tételén túlmenően az eljárás hasonlóképpen gyors és különösen magas kitermelést és tisztasági fokot eredményez.
Másfelől lehetővé teszi DNS molekulák tisztítását más nukleinsavakat, fehérjéket, endotoxinokat (mint például a lipopoliszacharidok) , nukleázokat stb. tartalmazó komplex elegyekből kiindulva, és farmakológiai minőségű tisztított DNS kinyerését.
A hordozóhoz történő kovalens kötés létrejöttéhez az oligonukleotid általában funkcionalizált. így módosítható egy terminális merkapto-, amino- vagy karboxi-csoporttal 5' vagy 3' pozícióban. Jellemzően, egy merkapto-, amino- vagy karboxi-csoport hozzátoldása lehetővé teszi például az oligonukleotid rögzítését diszulfid-, maleimid-, amino-, karboxi-, észter-, epoxi-, bróm-cián- vagy aldehid-funkciós csoportokat viselő hordozóhoz. E kapcsolódások az oligonukleotid és a hordozó között diszulfid-, tioéter-, észter-, amid- vagy amino-kötések révén jönnek létre. A szakemberek által ismert bármely más módszer alkalmazható, mint például a bifunkcionális kötések reagensei.
Másfelől a kapcsolt oligonukleotid hibridizációjának javítása céljából előnyös lehet, ha az oligonukleotid egy kart és egy
77.377/BE
távtartó bázisszekvenciát tartalmaz. Egy kar alkalmazása valójában lehetővé teszi az oligonukleotid rögzítését a hordozóhoz egy választott távolságban, amely javítja a DNS-sel történő kölcsönhatás körülményeit. A kar előnyösen egy lineáris szénláncból áll, amely 1-18, előnyösen 6-12 CH2 típusú csoportot foglal magába, valamint egy amint, amely az oszlophoz kötést teszi lehetővé. A kar az oligonukleotid egy foszfátjához vagy a hibridizációt nem befolyásoló bázisokból álló távtartóhoz kapcsolt. A távtartó tartalmazhat purin bázisokat. Példaképpen a távtartó magába foglalhatja a GAGG szekvenciát.
A tisztítási hordozóhoz kapcsolt oligonukleotid magába foglalhatja például az 5'-GAGG CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' szekvenciát [GAGG (CTT)7; 11. számú szekvencia], amelyben a GAGG bázisok nem vesznek részt a hármas hélix szerkezetben, azonban lehetővé teszik egy távolság kialakítását az oligonukleotid és a kötőkar között.
A találmány megvalósítása során különböző típusú hordozók alkalmazhatóak. Szóba kerülhetnek funkcionalizált kromatográfiás hordozók, ömlesztve vagy oszlopon előkondícionálva, funkcionalizált műanyagfelületek, mágneses vagy nem mágneses funkcionalizált latex gyöngyök. Előnyösen gélpermeációs kromatográfiás hordozókról van szó. Alkalmazható kromatográfiás hordozók például az agaróz, akrilamid vagy dextránok, valamint származékaik (mint például Sephadex®, Sepharose®, Superose® stb.), polimerek, mint például poli(sztirol-divinil-benzol), vagy beoltott vagy nem beoltott szilikagél. A kromatográfiás oszlopok működhetnek diffúziós vagy perfúziós módon, vagy egy úgynevezett fluid ágy
77.377/BE rendszerben egy kromatográfiás hordozó alkalmazásával, ahol a sűrűség a sajátos megvalósítási mód szerint választott.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható bármely típusú kettős szálú DNS tisztítására. Szóba kerülhet például cirkuláris DNS, mint például egy cirkuláris mini DNS [Darquet et al., Gene Therapy 6, 209 (1999)], egy lineáris fragmentum, általában egy vagy több kívánt terápiás vagy kísérleti gént hordozó plazmid. Ez a plazmid hordozhat hasonlóképpen egy replikációs origót, például feltételes típusút, mint például a Soubrier és munkatársai [Gene Therapy 6^, 1482 (1999)] által leírt pCOR plazmidok, egy marker gént stb. A találmány szerinti eljárás alkalmazható közvetlenül sejtlizátumon. E megvalósítási mód szerint a transzformációval, majd sejtkultúrával amplifikált plazmidot közvetlenül a sejtek lízisét követően tisztítjuk. A találmány szerinti eljárás hasonlóképpen alkalmazható tiszta lizátumon, azaz a sejtlizátum neutralizálása és centrifugálása után kapott felülúszón. Nyilvánvalóan alkalmazható egy ismert módszerekkel előtisztított oldat esetében is. Az eljárás lehetővé teszi egy kívánt szekvenciát hordozó lineáris vagy cirkuláris DNS tisztítását különböző szekvenciájú DNS-eket tartalmazó elegyből kiindulva. A találmány szerinti eljárás hasonlóképpen alkalmazható kettős szálú RNS tisztítására.
A sejtlizátum lehet prokarióta vagy eukarióta sejtek lizátuma. Prokarióta sejtek közül megemlíthetjük például az E. coli, B. subtilis, S. typhimurium, S. aureus vagy Streptomyces baktériumokat. Eukarióta sejtek közül megemlíthetjük például az állati sejteket, az élesztőket, a gombákat stb., és különösen a
77.377/BE
Kluyveromyces vagy Saccharomyces élesztőket vagy a COS, CHO, C127, NIH3T3, MRC5, 293 sejteket stb.
A találmány szerinti eljárás különösen előnyös, mivel lehetővé teszi plazmid DNS gyors és egyszerű kinyerését igen magas tisztaságban. Jellemzően, mint azt a példákban illusztráljuk, az eljárás lehetővé teszi plazmid DNS hatékony elválasztását szenynyező alkotórészektől, mint például fragmentált kromoszomális DNS, RNS-ek, endotoxinok, fehérjék vagy nukleázok.
A találmány szerinti eljárás ezen túlmenően alkalmazható DNS molekulák tisztítására és dúsítására, különösen terápiás kívánt gének, mint például az FGF1 gén esetében, amelyeket ipari menynyiségben termelnek és tisztítanak, viszont farmakológiai alkalmazásra megfelelő tisztaság szükséges.
A találmány egy további tárgyát képezi egy eljárás legalább egy, a fentiekben leírt célszekvenciát magába foglaló kettős szálú DNS molekulák detektálására, mennyiségi meghatározására és szelekciójára, amely során a) az említett molekulákat feltételezhetően tartalmazó oldatot érintkeztetjük egy harmadik DNS szállal, például egy jelölt oligonukleotiddal oly módon, hogy stabil hármas hélixet alkossanak, és b) detektáljuk a kettős szálú DNS és a harmadik DNS szál között esetlegesen kialakult komplexet.
Az eljárás alkalmazható többek között genomanalízis során, például egy sajátos DNS szekvencia detektálására egy genomban vagy specifikus szekvenciák szelektálására.
A találmány e megvalósítási módja szerint a harmadik DNS szál vagy az oligonukleotid lehet jelölt, magába foglalhat egy spekt77.377/BE , ► ···
·....· t ’ —' · ·* roszkópiás, fotokémiai, biokémiai, immunkémiai vagy kémiai módszerekkel detektálható markert.
Ilyen markerek lehetnek például radioaktív izotópok (32P, 33P, 3H, 35S) vagy fluoreszcens molekulák (5-bróm-dezoxi-uridin, fluoreszcein, acetil-amino-fluorén, digoxigenin).
A jelölés megvalósítható előnyösen jelölt molekulák beépítésével a polinukleotidokba primerek elongációjával vagy az 5' vagy 3' végekre történő hozzátoldással.
Nem-radioaktív jelölésre példákat találhatunk többek között az FR 78 109 75 számú szabadalmi iratban, Urdea és munkatársai [Nucleic Acids Research 11, 4937-57 (1988)] vagy Sanchez-Pescador és munkatársai [J. Clin. Microbiol. 26(10), 1934-8 (1988)] cikkeiben.
A találmány e különös megvalósítási módja szerint a harmadik DNS szálat vagy oligonukleotidot hasonlóképpen rögzíthetjük egy, az előzőekben leírt hordozóhoz.
A találmány egy további tárgyát képezi egy találmány szerinti kettős szálú DNS komplex elegyből történő tisztítására és/vagy jelenlétének detektálására szolgáló készlet vagy kit, ahol az említett készlet magába foglal egy vagy több, a fentiekben leírt oligonukleotidot. Ezek lehetnek egy hordozóhoz rögzítve és/vagy magukba foglalhatnak egy detektálható markert.
A találmány e megvalósítási módja szerint a fentiekben leírt detekciós kit magába foglal több, találmány szerinti oligonukleotidot, amelyek alkalmazhatóak kívánt kettős szálú DNS célszekvenciák detektálására.
A hordozóhoz rögzített oligonukleotidok lehetnek mátrixokba
77.377/BE elrendezve. Ilyen rendezett mátrixot ír le az 5,143,854 számú USA-beli szabadalmi leírás és a WO 90/15070 és WO 92/10092 számú nemzetközi közzétételi irat.
Oligonukleotidokat nagy sűrűségben rögzített hordozó mátrixokat leír például az 5,412,087 számú USA-beli szabadalmi leírás és a WO 95/11995 számú nemzetközi közzétételi irat.
A találmányt részletesebben a következő, illusztrációképpen szolgáló és a találmány oltalmi körét nem korlátozó példák segítségével szemléltetjük.
Az ábrák leírása
1. ábra: A pXL3179 plazmid vázlatos szerkezete.
2. ábra: A pXL3296 plazmid vázlatos szerkezete.
3. ábra: A pXL3426 plazmid vázlatos szerkezete.
4. ábra: A pXL3402 plazmid vázlatos szerkezete.
5. ábra: A pXL3678 plazmid vázlatos szerkezete.
6. ábra: A pXL3207 plazmid vázlatos szerkezete.
7. ábra: A pXL3388 plazmid vázlatos szerkezete.
8. ábra: A pXL3579 plazmid vázlatos szerkezete.
9. ábra: A pXL3601 és a pXL3977 plazmid vázlatos szerkezete.
Általános klónozásí és molekuláris biológiai módszerek
A molekuláris biológia klasszikus módszereit, mint a restrikciós enzimes emésztések, gélelektroforézis, E. coli transzformálása, a nukleinsav kicsapása, stb. a szakirodalom ismerteti [Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook: Molecular cloning: a laboratory manual; second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J.
77.377/BE
A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl: Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York (1987)]. A restrikciós enzimeket a New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs) szállította.
Az oligonukleotidokat a foszforamidites módszer alkalmazásával szintetizáljuk, a helyzetben ciano-etil csoporttal védett foszforamiditet alkalmazva [Sinha et al., Nucl. Acids Res. 12, 4539-4557 (1984); Giles, (1985)], Société Applied Biosystem 394 automatikus DNS szintetizátorral, a gyártó előírásai szerint.
Az affinitás gélek szintéziséhez alkalmazott oligonukleotidokat a Société Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Svédország) vagy az Eurogentec (Seraing, Belgium) szolgáltatta, alkalmazásuk a gyártó előírásai szerint történt.
A pCOR plazmidok replikációjához szükséges törzsek, a tenyésztési körülmények és a plazmidok szelekciója már leírásra került [Soubrier et al., Gene Therapy 1482 (1999)].
Példák
1. példa
A plazmidok szerkesztése
1.1. A pXL3179 plazmid (pCOR-FGFl)
Az 1. ábrán bemutatott pXL3179 plazmid a pXL2774 plazmidból [WO 97/10343; Soubrier et al., Gene Therapy 1482 (1999)] származó vektor, amelybe humán fibroblaszt interferon szignál peptidjének és az FGF1 (Fibroblast Growth Factorl) [sp-FGFl, Jouanneau et al., PNAS 88, 2893-7 (1991)] cDNS-ének fúzióját kódoló gént visszük be, humán citomegalovírus korai szakaszából származó promoter (hCMV IE E/P), valamint SV40 vírus késői sza
77.377/BE kasz poliadenilációs jelének (SV40 késői poliA; Genbank SV4CG) irányítása alatt.
1.2. A pXL3296 plazmid
A pXL3296 plazmid a pXL3179 plazmidból származik oly módon, hogy az sp-FGFl gén szekvenciáját a pUC28 plazmid [Benes et al., Gene 130, 151 (1993)] multiklónozó helyével helyettesítjük. A pXL3296 plazmidot a 2. ábra mutatja be.
1.3. A pXL3426 plazmid (pCOR-IDl)
A pXL3426 plazmid a pXL3296 plazmidból származik oly módon, hogy az 5'-GATCCAAGAAGCATGCAGAGAAGAATTC-3' szekvenciát inszertáljuk a BglII és az Xhol helyek közé. A pXL3426 plazmidot a 3. ábra mutatja be.
2. példa
Célszekvenciákat hordozó egyéb plazmidok szerkesztése
A pXL3675 plazmid a pXL3296 plazmid származéka, amelybe inszertáljuk az 5'-GAAGAAGGGAAAGAAGATCTG-3' szekvenciát a Hpal és az Xbal helyek közé. A pXL3676 plazmid szintén a pXL3296 plazmid származéka, amelybe inszertáljuk az 5'-GAAGAAAGGAGAGAAGATCTG-3' szekvenciát a Hpal és az Xbal helyek közé, végül a pXL3713 plazmid az 5'-GAAGAAGTTTAAGAAGATCTG-3' DNS szekvenciát tartalmazza a pXL3296 plazmid Hpal és az Xbal helyei közé inszertálva. Az így létrehozott plazmidokat cézium-klorid gradiensen tisztítjuk, és az inszertumok szekvenciáját szekvenálással ellenőrizzük. E készítményeket alkalmazzuk a továbbiakban leírt példák során.
77.377/BE
3. példa
Stabil hármas hélixet létrehozó 20 bázisnyi belső szekvencia azonosítása az FGF1 génben
Az előző példákban leírt különböző plazmidokat hármas hélix kölcsönhatás affinitás kromatográfiával kromatografáljuk standard körülmények között. Az affinitás hordozót a következő módon szintetizáljuk Sephacryl® S-1000 SF (Amersham Pharmacia Biotech) kromatográfiás hordozóból kiindulva. Első lépésben a 0,2 M nátrium-acetát pufferben diszpergált Sephacryl® S-1000 gélt nátrium-meta-perjodáttal (3 nM, 20°C, 1 óra) aktiváljuk, majd második lépésben az oligonukleotidot terminális 5'-NH2 végénél az aktivált mátrix aldehid csoportjaihoz kapcsoljuk, reduktív aminálási reakcióval aszkorbinsav jelenlétében (5 mM) , egy fehérjék kapcsolására szolgáló hasonló eljárást követve [Hornsey et al., J. Immunol. Methods 93, 83 (1986)]. Az oligonukleotidokat a találmányban bemutatott kísérletek mindegyikében ezen általános eljárást követve kapcsoljuk, és mindegyik oligonukleotid rendelkezik egy funkcionalizált NH2-(CH2)6 karral, amely az oligonukleotid 5' végén található.
Egy oligonukleotid és egy kettős szálú DNS közötti hármas hélix szerkezet kialakulásának azonosítására és stabilitásának mérésére szolgáló kísérletek mindegyikét a következő körülmények között valósítjuk meg. Minden kísérlet során, 2 M NaCl-ot tartalmazó 50 mM nátrium-acetát puffer (pH=4,5) 6 ml-ében feloldott 300 pg tisztított plazmidot a találmány szerinti oligonukleotiddal funkcionalizált affinitás gél 1 ml-ét tartalmazó HR 5/5 oszlopra (Amersham Pharmacia Biotech) injektáljuk 30 cm/óra át77.377/BE folyással. Az oszlopot ugyanezen puffer 5 ml-vel mossuk, majd eluáljuk a plazmidot 0,5 mM EDTA-t tartalmazó 100 mM Tris/HCl oszlop puffer (pH=9,0) 3 ml-ével és a pH=9,0 pufferrel eluált plazmid mennyiségét meghatározzuk i) az oldat abszorbanciájának mérésével 260 nm-en és ii) anioncserélő kromatográfiával egy Millipore GenPak-Fax oszlopon [Marquet et al., BioPharm 8_, 26 (1995)].
Az 5'—NH2— (CH2) 6-TT(CTT)6~3 ' (2. számú szekvencia) oligonukleotiddal funkcionalizált oszlopból kiindulva, az alábbi 1. táblázatban bemutatott eredmények egy stabil hármas hélix kialakulását mutatják, akár a teljes FGF1 gént (pXL3179), akár a humán FGF1 gén egy belső ID1 szekvenciáját magukba foglaló plazmidokkal, ellentétben egy kontroll plazmiddal (pXL3296), amely a humán FGF1 szekvencia semmilyen szekvenciáját nem tartalmazza, s amely nem maradt fenn a kérdéses oszlopon.
1. táblázat
Plazmidok Az oligonukleotid szekvenciája Célszekvencia a plazmidban Kapacitás (pg fixált plazmid/ml gél)
pXL 3179 (pCOR-FGFl) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT 175
pXL3426 (pCOR-IDl) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 130
pXL3296 (pCOR) TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT <1
A pXL3426 plazmid szekvenciáját az FGF1 gén minél kisebb méretű különböző fragmentumainak klónozása révén azonosítjuk. Az
77.377/BE
FGF1 gén ID1 elnevezésű 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' belső szekvenciája (1. számú szekvencia) tehát stabil hármas hélix szerkezetet hoz létre az alkalmazott 2. számú szekvenciájú oligonukleotiddal. A kapott hármas hélix szerkezet két pirimidin-purin-pirimidin (Pi*PuPi) típusú, T*AT és +C*GC kanonikus triászokat alkotó zónát tartalmaz, amelyek 6 egység (R, 5' oldal) és 7 egység (R', 3' oldal) hosszúságúak, s amelyeket egy 7 triász hosszúságú belső zóna (T) választ el, ahol a triászok közül 6 nem-kanonikus, és pontosan két T*GC triászt, két T*CG triászt, egy C*AT triászt és egy C*TA triászt foglal magába.
4. példa
A hármas hélix szerkezet stabilitásához szükséges bázisok azonosítása az FGF1 gén 20 bázisnyi belső ID1 szekvenciájából
A belső ID1 szekvenciából kiindulva 4 oligonukleotidot állítottunk elő. Ezek közül kettőben 7 vagy 13 nukleotid hiányzik az ID1 5' végéről, a másik kettőben pedig 7 vagy 14 nukleotid hiányzik a 3' végről. A pXL3426 plazmidot az 5'-TT(CTT)¢-3' oligonukleotiddal (2. számú szekvencia) vagy az FRB36, FRB38, FRB39 vagy FRB40 oligonukleotidokkal funkcionalizált hármas hélix kölcsönhatás oszlopon kromatografáljuk. Ezután a különböző csonkolt belső ID1 szekvenciákkal létrehozott hármas hélix szerkezetek stabilitását vizsgáljuk az oszlopon fennmaradó plazmidok mennyiségének mérése segítségével.
77.377/BE
2. táblázat
Oligonukleotid Célzott szekvencia a pXL3426 plazmidban Kapacitás (pg fixált plazmid/ml gél)
(CTT)7 AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 130
FRB36 —---------—A GAA GAA <1
FRB38 AA GAA G-------------- <1
FRB39 AA GAA GCA TGC AG- --- --- 22
FRB4 0 —---—A TGC AGA GAA GAA 33
A fenti 2. táblázatban ábrázolt eredmények mutatják, hogy a pXL3426 ID1 szekvenciájának egésze szükséges egy stabil hármas hélix szerkezet létrehozásához egy 5'-TT(CTT) g-3' típusú oligonukleotiddal. Jellemzően az 5' és 3' végeken elhelyezkedő két Pi*PuPi rész, és a középső rész is nagymértékben és egymással együttműködőleg hozzájárul a végső szerkezet stabilitásához.
5. példa
A kanonikus triászok és a nem-kanonikus triászok számának hatása a hármas hélix stabilitására
Az 5'-TT(CTT) 6-3' oligonukleotid (2. számú szekvencia) szekvenciáját módosítjuk és vizsgáljuk a különböző oligonukleotidok (FRB15, FRB16 és FRB17) képességét stabil hármas hélix kialakítására a pXL3426 plazmid ID1 (5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3'; 1. számú szekvencia) belső szekvenciájával.
77.377/BE
3. táblázat
Oligonukleotid Oligonukleotid-szekvencia ID1 célszekvencia a plazmidban Nemkanonikus triászok száma Kapacitás (pg fixált plazmid/ml gél)
(CTT)7 TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 6 130
FRB15 TT CTT CTT GCT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 3 189
FRB16 TT CTT CTT GTT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 4 171
FRB17 TT CTT CTT CCT TCT CTT CTT AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA 3 183
A fenti 3. táblázatban ábrázolt eredmények mutatják, hogy lehetséges a hármas hélix szerkezet stabilitásának növelése az oligonukleotid szekvenciájának módosításával oly módon, hogy növekedjen a T*AT és +C*GC kanonikus triászok száma, amely egyidejűleg a nem-kanonikus triászok számának csökkenését jelenti a hármas hélix központi belső N zónájában.
6. példa
A nem-kanonikus triászok hatása a hármas hélix szerkezetének stabilitására
Az FGF1 génnek az 5'-TT(CTT)¢-3' oligonukleotiddal (2. számú szekvencia) stabil hármas hélixet létrehozni képes belső ID1 szekvenciáját (1. számú szekvencia) magába foglaló pXL3426 plazmid szekvenciáját módosítottuk oly módon, hogy az N központi zónába bevigyünk két egymást követő T*GC típusú egyforma nemkanonikus triászt, amelyet 5' irányban egy nem-kanonikus C*AT triász követ (pXL3675). Egy másik kísérletben a C*AT, T*GC, T*GC, C*AT és T*GC egymást követő öt nem-kanonikus triászt (pXL3676) vittük be a plazmidba. Végül a pXL3426 plazmid szekvenciáját úgy módosítottuk, hogy a középső zónába két T*TA típu
77.377/BE sú egymást követő nem-kanonikus triászt vittünk be, valamint emellé 5' irányban egy C*TA nem-kanonikus triászt (pXL3713).
4. táblázat
Plazmidok Oligonukleotid-szekvencia Célszekvencia a plazmidban Kapacitás (μΐ fixált plazmid/ml gél)
pXL3426 TT CTT CTT CTT CTT CTT CTT ΆΆ GAA GCA TGC AGA GAA GAA 112
pXL3675 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA GGG AAA GAA GA 99
pXL3676 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA AGG AGA GAA GA 78
pXL3713 CTT CTT CTT CTT CTT CT GAA GAA GTT TAA GAA GA <1
A különböző plazmidoknak a fenti 4. táblázatban ábrázolt tisztítási eredményei mutatják, hogy egy stabil hármas hélix szerkezet jön létre abban az esetben, ha a központi nemkanonikus zóna T*CG, T*GC, C*AT és C*TA típusú triászokat alkot. Mint ahogy azt a pXL3675 és pXL3676 plazmidok gélaffinitás fixációs teljesítménye mutatja, hasonlóképpen stabil hármas hélix alakul ki, ha két egymást követő T*GC nem-kanonikus triászt viszünk be bármilyen környezetben, tehát a szomszédos triászok akár kanonikus, akár nem-kanonikus természetűek. Ezzel ellentétben két T*TA típusú triász és ezzel szomszédosán egy C*TA triász bevitele a hármas hélix szerkezet teljes destabilizálódásához vezet.
77.377/BE
7. példa
Egy SeAP, haFP, F IX és GAX gént kódoló kazettát tartalmazó plazmidok szerkesztése
A találmány szerinti vegyületek aktivitásának kimutatására szolgáló kísérletekben alkalmazott gének közé tartozik például az F IX faktort kódoló humán gén [Kurachi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6461 (1982)], a SeAP szekretált alkalikus foszfatázt kódoló humán gén [Millan et al., J. Biol. Chem. 261, 3112 (1986)], a haFP humán alfa fetoproteint kódoló gén [Gibbs et al., Biochemistry 26, 1332 (1987)], és a humán GAX gén [Gorski et al., Mol. Cell. Bioi. 13, 3722 (1993)]. Ezeket a géneket PCR-rel amplifikáljuk plazmidokból vagy cDNS bankokból (Clontech) kiindulva, majd a CMV E/P eukarióta promoter alá és az SV40 késői poliA szignál szekvencia fölé klónozzuk egy pCOR plazmidba, amely a pXL3296 származéka. A szekretált alkalikus foszfatázt (SeAP) kódoló gént a pXL3296-ból származó pCOR plazmidba visszük be a pXL3402 plazmid létrehozásához (4. ábra). Az alfa fetoproteint kódoló gént a pXL3296-ból származó pCOR plazmidba visszük be a pXL3678 plazmid létrehozásához (5. ábra). A GAX-t kódoló gént a pXL3296-ból származó pCOR plazmidba viszszük be a pXL3207 plazmid létrehozásához (6. ábra). Az FIX faktort kódoló gént a pXL3296-ból származó pCOR plazmidba visszük be a pXL3388 plazmid létrehozásához (7. ábra).
8. példa
Egy 5'-(CTT) 7-3' típusú oligonukleotid alkalmazása stabil hármas hélix szerkezetek kialakulásának előidézésére különböző
77.377/BE kívánt génekkel
Tanulmányozzuk a különböző szekvenciák kölcsönhatását az 5'TT(CTT)6-3' (2. számú szekvencia) oligonukleotiddal funkcionalizált hármas hélix kölcsönhatás géllel azáltal, hogy mérjük a különböző géneket hordozó plazmidokkal elért kapacitást. A vizsgált gének i) az F IX faktort kódoló humán gén, ii) a SeAP szekretált alkalikus foszfatázt kódoló humán gén, iii) a haFP humán alfa fetoproteint kódoló gén és iv) a humán GAX gén.
5. táblázat
Gének Célszekvencia/ák a génben Kapacitás (μΐ fixált plazmid/ml gél)
IX faktor GAA GAA GCA CGA GAA G 71
SeAP AA GAA AGC AGG GAA G GAA GAG GAA GAA G 100
haFP AAG GAG AAG AAG AA 146
hGAX AA GAT GAG GAA GAA G 118
A fenti 5. táblázatban ábrázolt eredmények mutatják, hogy lehetséges egy (CTT)n típusú oligonukleotiddal stabil hármas hélix szerkezetek létrehozása egy kívánt génnel, bár ez a gén nem foglalja magába az oligonukleotiddal komplementer 5'-(GAA) n-3 ' típusú célszekvenciát. A hármas hélix szerkezet tolerálja T*CG, C*CG, T*GC és C*AT típusú triászokat alkotó bázisok jelenlétét a célszekvencia középső részében, csakúgy, mint egy izolált T*TA triász jelenlétét (GAX gén).
77.377/BE
9. példa
Egy 5'-(CTT)7-3' típusú oligonukleotiddal funkcionálizált oszlop alkalmazása az ID1 belső szekvenciát (5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' szekvencia; 1. számú szekvencia) hordozó plazmid tisztítására
A 8. példától kezdődően vizsgáljuk az előbbiekben leírt 5'(R) n-(N) t-(R')m-3 ' típusú szekvenciát hordozó plazmidok tisztításának lehetőségét egy 5'-(CTT)7-3' típusú oligonukleotiddal funkcionalizált hármas hélix kölcsönhatás affinitás-kromatográfiai hordozó segítségével.
A pXL3179 plazmidot (magába foglalja az 5'-AA GAA GCA TGC AGA GAA GAA-3' szekvenciát tartalmazó humán FGF1 gént) egy 5'-NH2- (0¾) 6_(CTT)7-3' oligonukleotiddal funkcionalizált Sephacryl S-1000 kölcsönhatás oszlopon kromatografáljuk. Ehhez 2 M NaCl-ot tartalmazó 50 mM nátrium-acetát puffer (pH=4,5) 60 ml-ében feloldott 9,4 mg tisztított plazmidot Sephacryl S-100 SF-hez kovalens módon kötött 5'-NH2- (CH2) 6“(CTT)7-3 ' oligonukleotidot tartalmazó 10 ml-es affinitás oszlopra injektáljuk 30 cm/óra átfolyással, mint azt a 3. példában leírjuk. Az oszlopot ugyanezen puffer 5 térfogatával mossuk, majd eluáljuk a fixált plazmidot 0,5 mM EDTA-t tartalmazó 100 mM Tris/HCl oszlop puffer (pH=9,0) két térfogatával és meghatározzuk mennyiségét az UV abszorbancia mérésével (260 nm) és ioncserélő kromatográfiával egy GenPak-Fax oszlopon (Waters). PCR alkalmazásával megmérjük a kiindulási készítmény és a tisztított frakció E. coli genomiális DNS tartalmát, a WO 96/18744 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint. Az eluált frakcióban (elúciós hatásfok 84%) 7,94 mg
77.377/BE pXL3179 plazmid található és az E. coli genomiális DNS általi szennyezettség 7,8-ról 0,2%-ra csökken a leírt affinitás kromatográfia alkalmazásával. Az RNS általi szennyezettség szintje éppúgy csökken a kiindulási plazmid 43%-áról 0,2%-ra a tisztított plazmidban.
A pXL3179 plazmid különböző készítményeiből kiindulva végzett különböző egyéb kromatográfiás kísérletek során, amikor 5'-NH2-(CH2) 6-(CTT)7-3' oligonukleotiddal funkcionalizált Sephacryl S-1000 affinitás oszlopon kromatografálunk, a genomiális DNS tartalom 0,2%-ról 0,007%-ra, 0,7%-ról 0,01%-ra, 7,1%-ról 0,2%-ra vagy
7,8%-ról 0,1%-ra csökken.
10. példa
5'-CCT TTT CCT CCT T-3' (12. számú szekvencia) típusú oligonukleotid alkalmazása stabil hármas hélix szerkezetek létrejöttének előidézésére a humán VEGFB-167 kívánt terápiás génnel
Vizsgáljuk egy kívánt terápiás gén, mint például a humán VEGFB-167 gén egy belső szekvenciájának kölcsönhatását az 5'-CCT TTT CCT CCT T-3' (12. számú szekvencia) típusú oligonukleotiddal funkcionalizált hármas hélix kölcsönhatás hordozóval, a humán VEGFB-167 gént [Olofsson et al., J. Biol. Chem. 271, 19310 (1996)] hordozó pXL3579 plazmiddal (8. ábra) nyert kapacitás mérése révén. A 8. ábrán bemutatott pXL3579 plazmid magába foglalja a VEGFB-167 gént, amelyet humán szív cDNS bankból (Clontech) kiindulva PCR-rel amplifikálunk, majd a CMV E/P eukarióta promoter alá és az SV40 késői poliA szignál szekvencia fölé klónozzuk a pXL3296 NSil és Xbal multiklónozó helyei közé. 77.377/BE
6. táblázat
Oligonukleotid Célszekvencia a génben (VEGFB-167 vagy kontroll) Kapacitás (pg fixált plazmid/ml gél)
CCT TTT CCT CCT T GGC AAC GGA GGA A 87
nincs (kontroll vektor) <0,5
CCT CCT T GGA GGA A <0,5
nincs (kontroll vektor) <0,5
TTT TTT TTC CT ΆΆΆ ΆΆΆ AAG GA 15
nincs (kontroll vektor) <0,5
A fenti 6. táblázatban ábrázolt eredmények mutatják, hogy lehetséges egy oligonukleotid, mint például az 5'-CCT TTT CCT CCT T-3' (12. számú szekvencia) oligonukleotid alkalmazásával, egy 5 ' - (R) η-(N) t_ (R')m-3 ' típusú szekvenciát, itt a humán VEGFB-167 gén 5'-GGC AAC GGA GGA A-3' régióját (13. számú szekvencia) megcélozva egy stabil hármas hélix szerkezetet kialakítani egy kívánt gén egy régiójával. Bár a humán VEGFB-167 gén magába foglal egy 5'-AAA ΆΆΆ AAG GA-3' homopurin szekvenciát, amely az 5'-TTT TTT TTC CT-3' oligonukleotid (6. táblázat) által megcélzott, az 5'-CCT TTT CCT CCT T-3' oligonukleotiddal kapott kölcsönhatás nagymértékben felülmúlja a homopirimidin oligonukleotiddal nyertet. Éppúgy, az 5'-GGA GGA A-3' homopurin belső szekvencia nem elegendően hosszú egy stabil hármas hélix kialakulásának lehetővé tételéhez az 5'-CCT CCT T-3' oligonukleotiddal.
Ez a példa világosan mutatja az 5 ' - (R) n- (N) t- (R’) m -3 ' típusú szekvenciák érdekeltségét stabil hármas hélix szerkezetek kialakításában, még abban az esetben is, amikor a vizsgált kettős szálú DNS rendelkezik különben legalább egy jelentős hosszúságú 77.377/BE homopurin szerkezettel.
11. példa
Egy 5'-T CCT CTCCCT C-3' (14. számú szekvencia) típusú oligonukleotid alkalmazása nem-deletált VEGFB-186 cDNS elválasztására stabil hármas hélix szerkezetek létrehozása révén a módosított VRGFB-186 cDNS-ében található célszekvenciával
Megfigyelték, hogy a humán VEGFB-186 gén fermentorban történő előállításának lépései során genetikai átrendeződések és deléciók történnek többek között a 6A exon területén. Csendes pontmutációkat viszünk be tehát szekvenciális és mutagenetikus PCRrel az 510 (A/C) , 513 (C/T) , 516 (A/T), 519 (C/T) és 522 (C/T) nukleotidok helyére a fordítás +1 pontjához viszonyítva. A VEGFB-186 fehérje aminosav szekvenciája a 170-174. aminosavak között változatlan marad. Ezzel ellentétben az így módosított VEGFB-186 génen (VEGFB-186m) megtalálható az 5'-A GGA GCG GGA G-3' (15. számú szekvencia) találmány szerinti DNS célszekvencia, amely képes stabil hármas hélix kölcsönhatást létrehozni egy 5’-T CCT CTC CCT C-3' (14. számú szekvencia) szekvenciájú oligonukleotiddal. Ez a stabil hármas hélix kölcsönhatás előnyösen alkalmazható a találmány szerinti eljárás megvalósítására és az átrendeződést és deléciót nem szenvedett módosított VEGFB-186 gén elválasztására a fermentorban történő előállítását követően.
A módosított VEGFB-186 gén hármas hélix kölcsönhatással történő tisztítási eljárásának szemléltetéséhez a 9. ábrán bemutatott pXL3601 és pXL3977 plazmidokat alkalmazzuk. Legelőször a VEGFB-186 gént PCR-rel amplifikáljuk a humán szív egy cDNS bank
77.377/BE jából (Clontech) kiindulva, majd a CMV E/P eukarióta promoter alá (-522/+74) és az SV40 késői poliA szignál szekvencia fölé klónozzuk a pXL3296 NSil és Xbal multiklónozó helyei közé (1.2 példa), a pXL3601 plazmid létrehozása céljából. Ez utóbbit szekvenciális és mutagenetikus PCR-rel módosítjuk a pXL3977 plazmid létrehozása céljából, amelyben a VEGFB-186 gén a 6A exon területén módosított, mint azt a fentiekben leírjuk.
Vizsgáljuk a VEGFB-186m gén belsejében található 5'-A GGA GCG GGA G-3' (15. számú szekvencia) célszekvencia kölcsönhatását az 5'-T CCT CTC CCT C-3' (14. számú szekvencia) oligonukleotiddal funkcionalizált hármas hélix kölcsönhatás hordozóval, a módosított humán VEGFB-186 gént hordozó pXL3977 plazmiddal (9. ábra) nyert kapacitás mérése révén. Mivel a VEGFB-186m szekvenciája magába foglalja a VEGFB-167 szekvenciát, a 10. példában leírt, humán VEGFB-167 gént tartalmazó pXL3579 plazmidot alkalmazzuk negatív kontrollként.
7. táblázat
Oligonukleotid pCOR-VEGFB-186m (pXL3977) (pg fixált plazmid/ml gél) pCOR-VEGFB-167 (pXL3579) (pg fixált plazmid/ml gél) Üres pCOR (pXL3296) (pg fixált plazmid/ml gél)
14. számú 234 32 <1,0
16. számú 224 0,5-1,0 <1,0
A fenti 7. táblázatban ábrázolt eredmények mutatják, hogy lehetséges egy oligonukleotid, mint például az 5'-T CCT CTC CCT C3' (14. számú szekvencia) oligonukleotid alkalmazásával, egy 5'77.377/BE (R) η-(N) t—(R’)m—3 ’ típusú szekvenciát, itt a módosított humán VEGFB-186 gén 5'-A GGA GCG GGA G-3’ régióját (15. számú szekvencia) megcélozva egy stabil hármas hélix szerkezetet kialakítani egy kívánt gén egy régiójával, és ezáltal hatékonyan tisztítani. Az 5'-TTT CCT CTG CCT C-3' oligonukleotid (16. számú szekvencia) hasonlóképpen alkalmazható a módosított humán VEGFB-186 gén tisztítására.
77.377/BE

Claims (36)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás kettős szálú DNS molekula tisztítására, azzal jellemezve, hogy az említett kettős szálú DNS molekulát érintkezésbe hozzuk egy harmadik DNS szállal, ahol az említett kettős szálú DNS molekula magába foglal legalább egy
    5'-(R)n-(N)t-(R')m-3' általános képletű célszekvenciát, amelyben
    R és R' jelentése kizárólag purin bázisokból álló nukleotid-szekvencia;
    n és m jelentése 9-nél kisebb egész szám, és n+m értéke nagyobb, mint 5;
    N jelentése purin bázisokat és pirimidin bázisokat egyaránt magába foglaló nukleotid-szekvencia;
    t jelentése 8-nál kisebb egész szám;
    az említett DNS szekvencia képes kölcsönhatásba lépni egy harmadik DNS szállal és így egy hármas hélix szerkezetet kialakítani.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N régió és a harmadik DNS szál közötti kölcsönhatás legfeljebb 6 nem-kanonikus triász kialakulásához vezet.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az így kialakult triászokat a T*CG, T*GC, C*AT és C*TA triászok közül választjuk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az R és R' régiók összesen legalább két guanint (G) foglalnak magukba.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal
    77.377/BE jellemezve, hogy az R és R' régiók legalább két adenint foglalnak magukba.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az R és R' régiók a harmadik DNS szállal a T*AT és +C*GC közül választott kanonikus triászokat képeznek.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik DNS szál homopirimidin típusú.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik DNS szál magába foglal egy poli-CTT szekvenciát.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik DNS szál egy oligonukleotid.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kettős szálú DNS molekulán található célszekvencia nagába foglalja az 1. számú szekvenciát, és az említett oligonukleotidot a 2-5. szekvencia szerinti oligonukleotidok közül választjuk.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célszekvencia természetesen megtalálható a kettős szálú DNS molekulán, vagy a kettős szálú DNS molekulába mesterséges úton bejuttatott célszekvencia.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS molekulában természetesen megtalálható célszekvencia kívánt terápiás vagy kísérleti gének kódoló szekvenciájában helyezkedik el.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán FGF1 génben található 1. számú szekvencia egészét vagy egy részét.
    77.377/BE
  14. 14. A 12.' igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán IX faktort kódoló génben található 6. számú szekvenciát.
  15. 15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán szekretált alkalikus foszfatázt kódoló génben található 7. vagy 8. számú szekvenciát.
  16. 16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán alfa fetoproteint (aFP) kódoló génben található 9. számú szekvenciát.
  17. 17. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán GAX génben található 10. számú szekvenciát.
  18. 18. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS célszekvencia magába foglalja a humán VEGFB-167 génben található 13. számú szekvenciát.
  19. 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kettős szálú DNS molekula egy cirkuláris DNS, mint egy plazmid, egy cirkuláris mini DNS, vagy egy lineáris fragmentum.
  20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti tisztítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid stabil módon, kovalensen vagy nem-kovalensen egy hordozóhoz kötött.
  21. 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid egy természetes vagy szintetikus eredetű polimerhez kapcsolt.
  22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    77.377/BE < 1· .
    hogy a hordozót a funkcionalizált kromatográfiás hordozók, műanyag felületek és latex gyöngyök közül választjuk.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás hordozó egy gélpermeációs hordozó.
  24. 24. Az 1-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kettős szálú molekulát tartalmazó oldat egy sejtlizátum.
  25. 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtlizátum egy tiszta lizátum.
  26. 26. Az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kettős szálú DNS molekula előtisztított.
  27. 27. A 20-26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid magába foglalja a GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT szekvenciát (11. számú szekvencia).
  28. 28. A 20-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot a hordozóhoz diszulfid-, tioéter-, észter- amid- vagy amino-kötéssel kapcsoljuk.
  29. 29. A 20-28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot a hordozóhoz egy (CH2)n szénláncból álló kar közvetítésével rögzítjük, amelyben n értéke 1 és 18 közötti egész szám, és az említett kart az oligonukleotidhoz foszfát-kötéssel, a hordozóhoz amino-kötéssel kötjük.
  30. 30. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid legalább egy kémiai módosítással rendelkezik, amely a nukleázokkal szemben ellenállóbbá teszi vagy növeli affinitását a specifikus szekvenciához.
  31. 31. Az 1-30. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal
    77.377/BE jellemezve, hogy az oligonukleotid magába foglal egy szekvenciát, amelyben a citozinok közül legalább egy az 5' pozícióban metilezett.
  32. 32. Az 1-31. igénypontok bármelyike szerinti tisztítási eljárás, azzal jellemezve, hogy magába foglal legalább egy lépést, ahol az említett kettős szálú DNS-t más összetevőkkel elvegyítve tartalmazó oldatot érintkeztetjük egy hordozóval, amelyhez az említett oligonukleotid kovalens módon kapcsolódik.
  33. 33. Az 1-32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kettős szálú DNS-t más összetevőkkel elvegyítve tartalmazó oldatot átengedjük egy kromatográfiás hordozón, amelyhez az említett oligonukleotid kovalens módon kapcsolódik.
  34. 34. Az 1-33. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett harmadik DNS szál vagy az említett oligonukleotid jelzett.
  35. 35. Tisztított kettős szálú DNS, amely az 1-34. igénypontok bármelyike szerinti eljárással nyerhető.
  36. 36. Eljárás egy kettős szálú DNS detektálására, azzal jellemezve, hogy az említett kettős szálú DNS molekulát feltételezhetően tartalmazó oldatot érintkezésbe hozzuk egy harmadik, jelölt DNS szállal, amely képes egy hármas hélixet képezni az említett kettős szálú DNS molekula egy célszekvenciájával, ahol az említett szekvencia az
    5'-(R)n-(N)t-(R')m-3' általános képletű, amelyben
    R és R' jelentése kizárólag purin bázisokból álló nukleotid77.377/BE
    -szekvencia;
    n és m jelentése 9-nél kisebb egész szám, és n+m értéke nagyobb, mint 5;
    N jelentése purin bázisokat és pirimidin bázisokat egyaránt magába foglaló nukleotid-szekvencia;
    t jelentése 8-nál kisebb egész szám.
    S.B.G.&K.
    Szabadalmi Ügyvivői Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099
    A meghatalmazó
    77.377/BE
HU0303632A 2001-03-23 2002-03-25 Methods for purifying and detecting double stranded dna target sequences by triple helix interaction HUP0303632A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0103953A FR2822476B1 (fr) 2001-03-23 2001-03-23 Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
US28527201P 2001-04-23 2001-04-23
PCT/FR2002/001034 WO2002077274A2 (fr) 2001-03-23 2002-03-25 Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0303632A2 true HUP0303632A2 (hu) 2004-01-28
HUP0303632A3 HUP0303632A3 (en) 2005-12-28

Family

ID=26212934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0303632A HUP0303632A3 (en) 2001-03-23 2002-03-25 Methods for purifying and detecting double stranded dna target sequences by triple helix interaction

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1370692A2 (hu)
JP (1) JP4444564B2 (hu)
KR (2) KR20030088464A (hu)
CN (1) CN1498276A (hu)
BR (1) BR0208292A (hu)
CA (1) CA2440133A1 (hu)
HU (1) HUP0303632A3 (hu)
IL (2) IL158017A0 (hu)
MX (1) MXPA03008642A (hu)
NO (1) NO20034184L (hu)
NZ (1) NZ528507A (hu)
PL (1) PL365208A1 (hu)
WO (1) WO2002077274A2 (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI1737945T1 (sl) 2004-04-19 2011-05-31 Aventis Pharma Sa Postopek za čiščenje plazmidne DNA
MX357692B (es) * 2009-11-06 2018-07-19 Univ Hong Kong Chinese Analisis genomico a base de tamaño.
ES2399502T3 (es) * 2010-07-13 2013-04-01 Cnrs Procedimiento para el aislamiento de las proteínas unidas a cualquier tipo de secuencia de ácido nucleico de interés
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
JP7264877B2 (ja) * 2017-08-25 2023-04-25 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー 核酸プローブ、及び固形担体に核酸プローブを固定する方法
CN109959691B (zh) * 2019-04-15 2021-06-08 济南大学 一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法
CN116396963B (zh) * 2023-04-12 2023-10-13 南通大学 一类抑制血管内皮生长因子a表达的三链形成寡核苷酸及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992011390A1 (en) * 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
FR2728264B1 (fr) * 1994-12-16 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise
FR2731014B1 (fr) * 1995-02-23 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique
FR2746412B1 (fr) * 1996-03-21 1998-06-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique
FR2776669B1 (fr) * 1998-03-24 2001-06-15 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
BR0208292A (pt) 2004-04-13
IL158017A (en) 2011-07-31
KR101002499B1 (ko) 2010-12-17
MXPA03008642A (es) 2004-06-30
WO2002077274A3 (fr) 2003-10-02
KR20030088464A (ko) 2003-11-19
CN1498276A (zh) 2004-05-19
CA2440133A1 (fr) 2002-10-03
WO2002077274A2 (fr) 2002-10-03
HUP0303632A3 (en) 2005-12-28
PL365208A1 (en) 2004-12-27
NO20034184D0 (no) 2003-09-19
IL158017A0 (en) 2004-03-28
NO20034184L (no) 2003-11-04
NZ528507A (en) 2005-08-26
AU2002253261C9 (en) 2002-10-08
JP4444564B2 (ja) 2010-03-31
AU2002253261C1 (en) 2002-10-08
EP1370692A2 (fr) 2003-12-17
JP2004523245A (ja) 2004-08-05
KR20090094870A (ko) 2009-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2009045070A (ja) 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製
KR100502116B1 (ko) 약제성 플라스미드 디엔에이의 정제
US8399636B2 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide
HUP0303632A2 (hu) Eljárások kettős szálú DNS célszekvenciák tisztítására és detektálására hármas hélix kölcsönhatás alkalmazásával
US7514218B2 (en) Processes for purifying and for detecting target double-stranded DNA sequences by triple helix interaction
AU2007202804B2 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide
AU2001263459A1 (en) Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
PL206844B1 (pl) Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA
IL152860A (en) Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
FH91 Appointment of a representative

Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): RATHONYI ZOLTAN, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVIVOEI IRODA, HU

Representative=s name: DANUBIA SZABADALMI ES JOGI IRODA KFT., HU

FH92 Termination of representative

Representative=s name: RATHONYI ZOLTAN, S.B.G. & K. SZABADALMI UEGYVI, HU

GB9A Succession in title

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR

Free format text: FORMER OWNER(S): GENCELL S.A., FR; CENTELION, FR

HC9A Change of name, address

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR

Free format text: FORMER OWNER(S): GENCELL S.A., FR; CENTELION, FR

FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees