HUP0303132A2

HUP0303132A2 - Szabályozó és kiegészítő HIV-peptidek, antigének, vakcinakészítmények, immunológiai mérési reagenskészletek és HIV által indukált antitestek detektálására szolgáló eljárás

Info

Publication number: HUP0303132A2
Application number: HU0303132A
Authority: HU
Inventors: Birger Sörensen
Original assignee: Bionor Immuno As
Priority date: 2000-09-04
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2005-03-29
Also published as: NO314587B1; DE60131432D1; SK4012003A3; AU8633601A; EP1322666B1; NO20004412L; CA2421199A1; ES2296793T3; EA200300335A1; WO2002020555A3; NZ524557A; HUP0303132A3; EA006210B1; NO20004412D0; ATE378350T1; WO2002020555A2; EP1322666A2; DE60131432T2; AR033997A1; US7097971B2

Abstract

A találmány tárgyát képezik: - új és módosított peptidek, amelyekalapját HIV-szabályozó Tat- és Rev-fehérjéi és a Nef-kiegészítőfehérjéje képezik, és amelyek alkalmasak HIV-1-specifikus immunválaszkiváltására citotoxikus T-sejt-aktivitásra kifejtett antagonizálóhatás nélkül, valamint a fenti peptideket tartalmazó antigének, - azantigéneket tartalmazó vakcinakészítnények, - eljárás HIV vagy HIV-specifikus peptidek vagy fehérjék által indukált antitestektestfolyadék-mintában történő detektálására. A találmány alkalmazhatóa HIV diagnosztikájában és HIV-terápiás célokra. Ó

Description

célokra.

Szabályozó- és kiegészítő HIV-peptidek, antigének, vakcmakészítmények, immunológiai mérési reagenskészletek és HÍV által indukált antitestek detektálására szolgáló eljárás

A találmány tárgyát képezik szabályozó- és kiegészítő HIV-fehérjék konzervált régióin alapuló új peptidek, a fenti peptidek közül legalább egyet tartalmazó szabad vagy hordozóhoz kötött antigének, az antigének közül legalább egyet tartalmazó vakcinakészítmény, az ilyen antigéneket alkalmazó, humán immundeficiencia-vírus (HÍV) vagy HIV-specifikus peptidek által indukált antitestek detektálására szolgáló eljárás és immunológiai reagenskészletek.

Az 1. típusú, humán immundeficiencia-vírus (HIV-1), a szerzett immundeficiencia-szindróma (AIDS) kórokozója a fejlődő országokban az egészségügy számára folyamatosan komoly kihívást jelent. A nyugati világban a HIV-1 replikációját és érését célzó terápiás stratégiák feltűnő hatást értek el a betegség előrehaladása terén. A jelenleg alkalmazott kezelési módok nagy költsége, a hatóanyagok nagymértékű toxicitása és a gyógymód hiánya azonban azt jelenti, hogy a biztonságos és hatásos vakcinák kifejlesztése az AIDS-járvány kontrollja szempontjából kiemelkedő jelentőségű.

A HIV-1 komplex retrovirus, amely hat olyan szabályozó és kiegészítő gént kódol, amelyek nem találhatóak meg az egyszerű retrovírusban, konkrétan a tat, rév, nef, vif, vpr és vpu géneket (1. táblázat). Eukarióta sejtekben csak a teljes mértékben megszerkesztett {„spliced”') mRNS-ek exportálódnak a citoplazmába transzláció céljára. A nem megszerkesztett vagy részlegesen megszerkesztett RNS-ek visszamaradnak és végső soron a nukleuszban lebomlanak. Ilyen módon a többszörösen megszerkesztett {„spliced”) RNSfajtákból származó tat-, rév-, nef-génék által kódolt fehérjék (amelyeket Tat-, Rév- és Neffehérj éknek neveznek) expresszálódnak először, és a korai HIV-1 génexpressziót képezik. Az egyszeresen megszerkesztett RNS-ek expressziója céljából, és a nem szerkesztett, teljes hosszúságú RNS-genom citoplazmába, pakolás {„packaging”) céljából történő expressziója céljából a HIV-1 eszközöket fejlesztett ki az RNS-transzport korlátozásának elhárítására. A szabályozófehérjék, a Tat és a Rév, alapvető fontosságúak a HIV-1 replikációjához, mivel e fehérjék mutációi megszüntetik a HIV-1-termelést [Dayton, A.I. és mtsai., Cell, 44: 941947 (1986); Fisher, A.G. és mtsai., Nature, 320: 367-371 (1986)].

- 2 A kiegészítő gének olyan exonokból származnak, amelyek teljes mértékben a HIV-1-burokgéntől („envelope gene”) 3'-irányban helyezkednek el, mint például a vif, vagy olyan exonokból, amelyek az env-től 3'-irányban, valamint azon belül helyezkednek el, azonban különböző leolvasási keretben, mint például a tat, rev. A splicing hatékonysága részben szabályozza a különböző kiegészítő fehérjék génjeinek expressziós szintjeit.

A HIV-1 provirális DNS integrálódását követően a celluláris polimeráz-II-RNS túlnyomóan az mRNS rövidített formáit szintetizálja, amelyek a provirális DNS 5'-irányú hosszú terminális ismétlődő szekvenciáival (long terminal repeat, LTR) lépnek kölcsönhatásba. A tat az egyik az első gének közül, amely expresszálódik és nukleáris lokalizálódási szignált hordoz. Ez egy hatásos transzkripciós aktivátor, amely az LTR által vezérelt transzkripciót ezerszeresére növeli. A Tat folyamatos expressziója pozitív visszacsatolási kört biztosít a folyamatos, magas szintű génexpresszió számára. A “hagyományos”, DNSszekvenciákkal kölcsönhatásba lépő transzkripciós aktivátorokkal ellentétben a Tat minden HIV-1-RNS esetében közvetlenül az 5'-vighez, specifikus, másodlagos „stem-loop” (szárhurok) szerkezeteknél, a T47?-elemeknél (transzaktiváló válaszelem) kapcsolódik. A hurok szerkezete nagymértékben konzervatív és a Tat működéséhez alapvetően szükséges. A Ύ &HTAR kölcsönhatás szerkezetét vizsgálták magmágneses rezonancia (NMR) alkalmazásával [Puglisi és mtsai., Science 257: 76-80 (1992)]. A Tat a L47?-t egy celluláris fehéije, a ciklin-T-vel kapcsolódva köti, amely viszont CDK9-et köt. Ez utóbbi foszforilálja az RNSpolimeráz-II C-terminális doménját, ezáltal elősegítve az RNS-átirat elongációját. Ezek a celluláris Tat-kofaktorok csak aktivált sejteken vannak jelen, hiányuk elnyomja a provirális DNS transzkripcióját, a T-limfocitákban „kvázilátenciát” eredményezve.

A Tat két exonból expresszálódik; a nukleáris lokalizációs szignál és a 7L47?-kötő régió is az első exonban helyezkedik el. A Tat fertőzött sejtekből szekretálódik és a szomszédos sejteken heterológ hatást fejthet ki. Ez többek között celluláris aktiváció [Hofman és mtsai., Blood 82: 2774-2780 (1993)], celluláris apoptózis indukálása [Macho és mtsai., Oncogene 18: 7543-7551 (1991)], szekretálható növekedési faktorként kifejtett hatás [Trinh, D.P. és mtsai., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 256: 299-306 (1999)] és a vírusfehérje-szintézis érdekében a sejt fehérjeszintézisének modulálása [Xiao és mtsai., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 244: 384-389 (1998)]. A Tat-ot megcélzó terápiás stratégiák ezáltal erős hatást gyakorolnak a HIV-1-fertőzésre.

A Tat-ot, Rev-et és Nef-et kódoló, kicsi, többszörösen megszerkesztett mRNS-ek vannak túlsúlyban a fertőzés utáni korai fázisban. Ha a Rév termelődése egy bizonyos határértékszintet elér, a nem szerkesztett (unspliced) és egyszeresen szerkesztett RNS-ek ··· ······ • ··♦· · ····· ···· * ··* ·

- 3 halmozódnak fel a citoplazmában transzlációra, ezáltal lehetővé téve a produktív fertőzés folyamatát. A Rév ilyen határértékszintje elérésének meghiúsulása hozzájárulhat a HÍV látszólagos látenciájához. A Rév csak olyan RNS-ekhez kötődik, amelyek egy olyan RNSszerkezetet, az RRE-t hordozzák, (Rev-válaszelem), amely a genom env-et kódoló régiójában lokalizálódik. A Rév az RRE-vel multimerként lép kölcsönhatásba, egy bázikus, argininben gazdag régión keresztül, amely a fehérje amino-terminális felében van jelen. E kölcsönhatás következménye a részlegesen megszerkesztett RNS-ek transzportja, amely lehetővé teszi az olyan génterméket szolgáltatását, mint az Env, a Vif, a Vpu és Vpr; valamint a nem szerkesztett RNS-ek transzportja, amely az összeszerelődő részecskékbe beépülő új genomként szolgál. A Rev-RRE-kölcsönhatás szerkezeti vizsgálatát szintét elvégezték NMR alkalmazásával [Battiste és mtsai., Science 273: 1547-1551 (1996)]. A Rév leucinban gazdag exportszignált hordoz, amely lehetővé teszi, hogy a sejtmag és a citoplazma között “ingázzon”, az újonnan szintetizálódott RNS-ek transzportja céljából [Kalland és mtsai., J. Virol. 68: 1475-1485 (1994)]. Ezáltal a Rév biztosítja azt, hogy struktúrgének expresszálódjanak “későn”, a szabályozógéneket követően. A Rev-re irányuló terápiás stratégiák a vírus életciklusát a fertőzés korai szakaszában szakítják meg.

Annak ellenére, hogy a Nef-et eredetileg negatív faktorként írták le, később kimutatták, hogy a vírusreplikációra pozitív hatást gyakorol és a Tat-nál és Rev-nél nagyobb mennyiségben expresszálódik, a fertőzés korai szakaszában és a fertőzés során mindvégig, A Nef mirisztilált az N-terminálisán, és a plazmamembrán belső oldalához kapcsolódik. A Nef részlegesen felelős a felszíni CD4 endocitózissal történő, csökkentő szabályozásáért és degradálódásáért [Piguet és mtsai., EMBO J. 17: 2472-2481 (1998)]. A CD4 sejtfelszínről történő eltávolítása megakadályozza a más HIV-1-törzsekkel történő felülfertőzést vagy az újonnan kibocsátódó vírussal történő újbóli fertőzést. A Nef felelős az I. osztályú MHC csökkentő szabályozásáért is, ezáltal megvédve a fertőzött sejteket a citotoxikus Tlimfociták által történő lebontástól [Le Gall és mtsai., Res. Virol. 148: 43-47 (1997)]. A Nef nem alapvető fontosságú vírusfehérje, mivel nem szükséges a perifériás vérlimfociták vagy T-sejt-vonalak in vitro fertőzéséhez. A Nef-deléciósmutánsok azonban kevésbé patogének hosszú időtartamon keresztül. A Nef szintén komplex hatásokat közvetít a jelátviteli reakcióutakon át a sejtben, és prolinban gazdag régiót tartalmaz, amely kölcsönhatásba léphet a T-sejt-aktiválásban részt vevő kinázok SH3-doménjával, amely tulajdonság szükséges a hatékony HIV-replikációhoz [Moarefí és mtsai., Nature 385: 650-653 (1997)]. A Nef-et tartalmazó vírusok nagyobb mértékű virális-DNS-szintézisre képesek, mint a Nef-génben hiányos vírusok, ami azt valószínűsíti, hogy a Nef közvetlenül vagy közvetett

- 4 módon aktiválja a vitális reverz transzkriptázt. A virionokkal asszociált Nef alacsony szintje lehet a felelős ezért a jelenségért. Alacsony szinten Nef a fertőzött sejtekből ki is szabadul, azonban a szomszédos sejtekre gyakorolt potenciális hatás nem tisztázott. Mivel a Nef a fertőzés korai szakaszában expresszálódik és jelentős hatást gyakorol a CD4-exresszióra 5 és az I. osztályú MHC expressziójára, valamint a betegség előrehaladására is, ezért fontos célpontot jelent a jövő terápiás stratégiái számára.

A Tat és a Nef szekretálódik és felvehető makrofágok számára, továbbá II. osztályú MHC-molekulákkal asszociálva expresszálódik. Ez javítja alkalmasságukat olyan pepiiden alapuló terápiák célpontjaként, amelyek szintén II. osztályú MHC-vel kapcsolva 10 expreszálódnának. Világos, hogy a HIV-1 replikáció számára alapvető fontosságú korai géntermékek, mint a Tat és Rév megcélzása a Nef mellett elsődleges kell legyen, amely (a fertőzés során) szintén korán expresszálódik és hatást gyakorol a betegség lefolyására.

1. táblázat

Szabályozó és kiegészítő HIV-fehérjék

Gén	Fehérje	Név	Expresszió	Lokalizáció	Funkció
Tat	Tat	A virális transzkripció transzaktivátora	Korai	Sejtmag	Aktiválja a virális transzkripciót. Szekretálódik a fertőzött sejtekből, ahol Tsejtekeket aktiválhat, apoptózist indukál és növekedési faktorként szolgál.
Rév	Rév	Nukleáris RNSexport-faktor	Korai	Nukleólusz, Nukleopazma citoplazma	Szabályozza az RNS szerkesztését és a citoplazmába történő transzportját. Ingázó (shuttle) fehéije.
Nef	Nef	Számos effektorfunkció	Korai	Citoplazma, membránasszociált. Virionok	CD4-endocitózist vált ki, csökkentőén szabályozza az MHC-I expresszióját. Kinázokhoz köt és Hatást gyakorolhat a T-sejtjelátvitelre ás akti vációra.

Vpu	Vpu	Vitális u-fehérje	Késői	Citoplazma, membránasszociált.	Intracelluláris CD4endocitózist vált ki, csökkentőén szabályozza az MHC-I-et, a retrovirális részecskekibocsátás nem specifikus elősegítője.
Vif	Vif	Virális infektivitási faktor	Késői	Citoplazma, membránok, virionok	Növeli a vírusrészecske infektivitását sejtíuggő módon. Javítja a virális DNS-szintézist a reverz transzkripció során.
Vpr	Vpr	Virális r-fehérje	Késői	Alapvetően setjmag, virionok	Hozzájárul a preintegrációs komplex nukleáris importjához. A sejtciklus G2Mfázisában “feltartóztatja” a sejtet.

Vakcinajelöltekben (potenciálisan vakcinaként alkalmazható molekulákban) természetes körülmények között előforduló HIV-szekvenciák nem alkalmasak stabil, hosszú távú immunválasz stimulálására, a HÍV természetéből adódó tulajdonsága, az immunrend5 szer számára nyújtott epitópok megjelenésének változtatása által történő elrejtőzésnek közönhetően. Az epitópok ilyen, változó bemutatásának legyőzése céljából bizonyos aminosav-szubsztitúciók és aminosav-kombinációk segítséget nyújtanak az imunrendszer számára az ilyen idegen vírusantigének megbízható módon, és így nagyobb mértékben történő prezentálásában.

A fent ismertetett háttéren alapján határoztuk el, hogy megvizsgáljuk olyan új, szintetikus peptidek tervezésének lehetőségét, amely peptidek a szabályozó és kiegészítő HIV-fehérjék epitópjait utánozhatják olyan módon, hogy azokat kitehetőek az immunrendszer humorális, valamint cellluláris része hatásának abból a célból, hogy a terápiás és/vagy profilaktikus vakcina iránti szükségletet kielégítsük.

A kiindulási alapot képező munka a Korber, B. és munkatársai által publikált

[Korber, B. és mtsai., Human Retroviruses and AIDS, Szerk.: Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM] szekvenciákon alapult. Az első Tat-epitóp a tat-fehérje 1. és a 24. aminosava között lokalizálódik:

2. táblázat

Tat-epitóp

Aminosavszám	Aminosav-szekvencia	Természetes körülmények között előforduló aminosavak
1	Μ	S
2	Ε	D, V
3	S	Q, P, L, V, A
4	V	I
5	D	N
6	P	H, A
7	R	N, S, K, E, D
8	L	I, Q, R, V, Μ, T
9	E	D,P
10	P	S
11	w
12	K	N, Ε, H, L
13	H	R,Q
14	P
15	G	P
16	S	N, A
17	Q	K, T
18	P	H
19	K	T, S, A, R, P, E, Q
20	T	A, I
21	A	P, D, V
22	C	S
23	T	N, S
24	N	K, R, Q, A, P, T

A leírásban megadott, az aminosavak meghatározására alkalmazott egybetűs, va- lamint hárombetűs kódok megfelelnek a nemzetközi tankönyvekben, például Lehninger könyvében [Lehninger, A.L., Principles of Biochemistry, kiad.: Worth Publisher Inc., New

- 7 York (1982)] megadott standardoknak. A jobboldali oszlopban megadott aminosavak a szekvencia természetes variációit mutatják be. Vizsgálataink a következő, módosított epitópot tartalmazó szekvenciát eredményezték:

CSWVNPRLEPWLHPGSQPN1TACTN

Az NI 2-aminohexánsavat jelöl (norleucin, amelyet Nie-vel és Nl-lel rövidítünk a hárombetűs és az egybetűs kódban) és a ciszteincsoportok oxidált állapotban vannak, azaz láncon belüli diszulfídhidat képeznek. Mivel a peptid C-terminális részén levő ciszteincsoport (a 22. pozícióban) a kiválasztott epitópon kívüli diszulfidhíd részét képezi, ezért hasonló, pepiiden belüli diszulfidkötést alakítunk ki úgy, hogy a kiválasztott epitón Nterminális részére ciszteint helyezünk. Egy másik alternatíva intermolekuláris diszulfidkötés kialakítása a szekvenciák dimerizálásával:

WVNPRLEPWLHPGSQPN1TACTN

Egy további alternatíva a Tat-ból választott más epitóppal történő dimerizálás. A Tat másik epitópja a 35. és 57. aminosav között helyezkedik el, az első epitóptól 10 aminosawal elválasztva, amely 5 Cys-t tartalmaz az epitópok által tartalmazott Cys-csoporton túl. A Cys-csoportok viszonylagosan nagy száma változatos inter- és intramolekuláris keresztkötési lehetőséget kínál. Valószínű, hogy a Cys-ben gazdag dómén a fehérje immunológiai kitettségét donimálja, és így a két fontos epitóp “elrejtését” okozza. A két szomszédos epitóp kiválasztása és módosítása a Tat-fehérje alapvetően fontos részét exponálja, optimálisabb módon.

“Szökevénymutánsok” kialakulása valószínűségének csökkentése céljából az epitópok számát tovább növeltük és két további peptidszekvenciát választottunk ki. Ezek a szekvenciák a Rev-en (58-78 aminosavak) és a Nef-en (65-85 aminosavak) helyezkednek el. A Human Retroviruses and AIDS c. kiadványban tették közzé [Human Retroviruses and AIDS 1999, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, szerk.: Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos]:

3. táblázat Tat-epitóp

Aminosavszám	Aminosav-szekvencia	Természetes körülmények között előforduló aminosavak
35	Q	P, I, L, T, Y,V
36	V	A, C, L
37	c
38	F
39	I	L, Q, Μ, T
40	T	N, K, R
41	K	Q
42	G	A
43	L
44	G	S
45	I
46	S	F, Y
47	Y	N
48	G
49	R	K,S
50	K
51	K
52	R
53	R	K, S, G
54	Q	R, P
55	R
56	R
57	R	G,S

4. táblázat

Rev-epitóp.

Aminosavszám	Aminosav-szekvencia	Természetes körülmények között előforduló aminosavak
58	R	W,Q
59	I	V, L, F
60	L	I,P
61	G	S, N, D, C, V, T, A, R
62	T	A, D, N, S
63	Y	C, F, R, H, S, V, L
64	L	V
65	G	H
66	R	G
67	S	P, F,L
68	A	T, E, Q, V, P, S
69	E	K, Q, D, N
70	P	S, A, N
71	V	N,G,P
72	P	Q, H, S, L, R, T, D, I
73	L	F, V
74	Q	L, P, H, D, E
75	L
76	P
77	P	L,E
78	L	V,P

- 10Valamint aNef-epitóp:

5. táblázat

Nef-epitóp:

Aminosavszám	Aminosav-szekvencia	Természetes körülmények között előforduló arninosavak
65	E	G,D,S
66	N	G,D,E
67	E	V
68	A	G
69	L	F
70	P
71	I	V
72	T	R, K, A, M
73	P
74	Q	H
75	V	L, I
76	P
77	L	V,T
78	R
79	P
80	M	V,I
81	T	D
82	Y	F,R
83	K	R
84	A	G, S, E, Q
85	A	S, V

Néhány módosított pepiidet szintetizáltunk a szekvenciák egyedisége meghatározása céljából, valamint azért, hogy meghatározzuk tulajdonságaikat az immunrendszer stimulációja szempontjából, és specificitásukkal és érzékenységükkel kombinálva HIV-110 antigénekként.

-11 Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány szerinti peptidek a HIV-1 Tat-, Rév- és Nef-fehérjéi négy különböző, konzervált régiójából származnak, amelyeket a fentiekben ismertettünk, és amelyek rendelkeznek a HIV-I-epitópok egyedisége (immunogenitás, érzékenység és specifícitás) fenntartása képességével. Ráadásul a találmány szerinti új peptidek nem fejtenek ki a citotoxikus T-limfocitákra (CTL) felismert antagonista hatást, és legalább egy potenciális CTL-epitópot tartalmaznak.

A találmány szerinti peptid, amely megfeleln a fenti jellegzetességeknek, az alábbiak bármelyike lehet:

- Xaai Xaa2 Xaa₃ Xaa4 Xa5₂ Xaaé Xaa?Leu Glu Pro Trp Xaai₂ His Pro Xaai5 Xaai6 Xaan Xaaj8 Xaai9 Xaa₂o Xaa₂i Xaa₃2 Xaa₂₃ Xaa₂₄ (1. azonosítószámú szekvencia, a továbbiakban a. sz.), ahol a láncban az aminosavak a következőket jelenthetik:

Xaa jelentése az 1. pozícióban Met, Ser, Cys vagy semmi

Xaaa 2. pozícióban Glu, Asp, Val, Ser vagy semmi

Xaa a 3. pozícióban Ser, Gin, Pro, Leu, Val, Alá, Trp, Tyr vagy Phe,

Xaaa 4. pozícióban Val vagy He,

Xaa az 5. pozícióban Asp, Asn vagy He,

Xaa a 6. pozícióban Pro, His vagy Alá,

Xaaa 7. pozícióban Arg, Asn, Ser, Lys, Glu vagy Asp,

Xaaa 12. pozícióban Leu, He bagy Nle,

Xaa a 15. pozícióban Gly vagy Pro,

Xaaa 16. pozícióban Ser, Asn vagy Alá,

Xaaa 17. pozícióban Gin, Lys vagy Thr,

Xaaa 18. pozícióban Pro vagy His,

Xaaa 19. pozícióban Lys, Thr, Ser. Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, He vagy Nle,

Xaaa 20. pozícióban Thr, Alá vagy He,

Xaa a 21. pozícióban Alá, Pro, Asp vagy Val,

Xaaa 22. pozícióban Cys vagy Ser,

Xaaa 23. pozícióban Thr, Asn vagy Ser,

Xaaa 24. pozícióban Asn, Lys, Arg, Gin, ALa, Pro vagy Thr.

-12A pepiid tartalmazza az 1. a. sz. legalább hat egymást követő aminosavát, ráadásul két vagy több Cys-csoport képezhet láncon belüli vagy láncok közötti diszulfídhidat, -S-(CH₂)_P-S- vagy -(CH₂)_P- hidat, ahol p értéke 1-8, adott esetben egy vagy több heteroatom, mint például Ο, N vagy S közbeiktakásával,

- Xaai Xaa₂ Xaa₃ Phe Xaa₅ Xaaó Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa_]0 Xaan Xaai₂ -Z-Tyr Xaaj Gly Xaa,5 Lys Lys Arg Xaai₉ Xaa₂o Xaa₂i Xaa₂₂ Xaa₂₃ (4. a. sz.) ahol a láncban az aminosavak a következőket jelenthetik:

Xaaaz 1. pozícióban Pro, He, Leu, Thr, Tyr vagy Val,

Xaaa 2. pozícióban Val, Alá, Cys, Leu,

Xaa a 3. pozícióban Cys, He, Leu, Val vagy Nle,

Xaaaz 5. pozícióban He, Leu, Gin, Met vagy Thr,

Xaaa 6. pozícióban Thr, Asn, Lys vagy Gin,

Xaaa 7. pozícióban Lys, Arg vagy Gin,

Xaaa 8. pozícióban Gly vagy Alá,

Xaa a 9. pozícióban Leu vagy He,

Xaaa 10. pozícióban Gly, Ser vagy Alá,

Xaa all. pozícióban He vagy Gly,

Xaaa 12. pozícióban Ser, Phe vagy Tyr,

Xaaj a 14. pozíció előtt Leu, He, Nle,

Xaaa 15. pozícióban Arg, Lys, Ser vagy citrullin (Cit),

Xaaa 19. pozícióban Arg, Lys, Ser vagy Cit,

Xaaa 20. pozícióban Gin, Arg vagy Pro,

Xaa a 21. pozícióban He vagy Leu,

Xaaa 22. pozícióban Gly, Leu, He, Cys vagy semmi.

Xaaa 23. pozícióban Gly vagy semmi, ahol a 4. a. sz. tartalmaz legalább hat, egymást követő aminosavat, -Z- adott esetben kapcsoló, és ez lehet PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3, ráadásul két vagy több Cys-csoport képezhet láncon belüli vagy láncok közötti diszulfidhidat, -S-(CH₂)_P-S- vagy -(CH₂)p- hidat, ahol p értéke 1-8, adott esetben egy vagy több heteroatom, mint például Ο, N vagy S közbeiktatásával,

- Xaaj He Leu Xaa4 Xaa₅ Xaae Leu Gly Arg Xaaio Xaan -Z- Xaai₂Leu Xaa, Xaa, Xaau Xaais Xaai₆ Xaai₇ Xaai₈ Xaai₉ Leu Pro Pro Leu (7. a. sz.) ahol Xaaaz 1. pozícióban Phe, Tyr, Trp vagy Arg,

-13Xaaa 4. pozícióban Gly, Ser, Asn, Cys, Vai, Thr, Ala vagy Arg,

Xaaaz 5. pozícióban Thr, Ala, Asp, Asn vagy Ser,

Xaaa 6. pozícióban Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Vai vagy Leu,

Xaaa 10. pozícióban Ser, Pro, Phe, Leu vagy He,

Xaa a 11. pozícióban Ala, Thr, Glu, Gin, Vai, Pro vagy Ser,

Xaaa 12. pozícióban Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, trp vagy Phe,

Xaa, a 13. pozíció után Ser, Pro, Phe, Leu vagy He,

Xaa, a 14. pozíció előtt Ala, Thr, Glu, Gin, Vai, Pro vagy Ser,

Xaaa 14. pozícióban Glu, Lys, Gin, Asp vagy Asn,

Xaaa 15. pozícióban Pro, Ser, Ala vagy Asn,

Xaaa 16. pozícióban Vai, Asn, Gly vagy Pro,

Xaaa 17. pozícióban Pro, Gin, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp vagy He,

Xaaa 18. pozícióban Leu, Phe vagy Vai,

Xaaa 19. pozícióban Gin, Leu, Pro, His, Asp vagy Glu, ahol a 7. a. sz. legalább hat egymást követő aminosavból áll, -Z- adott esetben kapcsoló, és ez lehet PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3,

- Xaai Leu Val Glu Xaa₅ Pro Xaa₇ Xaa₈ Pro Xaa_]0 Xaan Pro -Z-[Arg]_m Xaa, Xaan Xaau Pro Xaaió Xaai₇ Xaa_]8 Xaai9 Xaa₂o Xaa₂i (10. a. sz.), ahol Xaaaz 1. pozícióban Lys vagy Arg, a Xaaaz 5. pozícióban Phe vagy Leu,

Xaa a 7. pozícióban He vagy Val,

Xaaa 8. pozícióban Thr, Arg, Lys, Alá vagy Met,

Xaaa 10. pozícióban Gin vagy His,

Xaa all. pozícióban Val, Leu vagy He,

Xaaa 13. pozíció előtt Leu,

Xaaa 13. pozícióban Leu, Val vagy Thr,

Xaaa 14. pozícióban Arg vagy citrullin (cit),

Xaa a 16. pozícióban Met, Val, He vagy Nle, Leu,

Xaa a 17. pozícióban Thr vagy Asp,

Xaaa 18. pozícióban Tyr, Phe vagy Arg,

Xaaa 19. pozícióban Lys vagy Arg,

Xaaa 20. pozícióban Alá, Gly, Ser, Glu vagy Gin,

Xaa a 21. pozícióban Alá, Ser vagy Val, • · · « »· * · » : .„···}·

-14ahol a 10. a. sz. legalább hat egymást követő aminosavból áll, -Z- adott esetben kapcsoló, és ez lehet PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3, és ntől függetlenül az -[Arg]_m kifelezésben m értéke 0, 1, 2 vagy 3, a szekvencia terminális végei lehetnek szabad karboxil- vagy aminocsoportok, ezek amidjai, aciljai, acetiljai, vagy sói, és/vagy a peptidszekvencia lehet szilárd hordozón immobilizálva.

Az új peptidszekvenciának van esélye arra, hogy jó antigénként szolgáljon, ahol az antigén tartalmaz legalább egy pepiidet az 1., 4., 7. vagy 10. azonosítószámú szekvenciák közül. Az antigenitás adaptálható olyan módon, hogy beállítjuk a különböző peptidek arányát vagy koncentrációját, vagy a peptidek méretét például dimerizációval vagy polimerizációval és/vagy szilárd fázishoz való immobilizálással. Az antigén tartalmaz egy vagy több, találmány szerinti polipeptid-szekvenciát, amelyek lehetnek kapcsolva híddal, például akár a láncok Cys-csoportjai közötti diszulfidhíddal, vagy akár Ci-Cg-alkilén-szerű hidakkal, esetlegesen egy vagy több heteroatom, mint O, S vagy N közbeiktatásával, előnyösen ezek nincsenek kapcsolva. A láncok lehetnek szilárd hordozón immobilizálva monomer, dimer vagy oligomer formában. További aminosavakat adhatunk a végekhez “kar” létrehozásához az immobilizálás lehetővé tétele céljából.

A PEG poli-etilénglikol, (HO(CH₂CH2O)_aH, és lehet része a -Z-kapcsolónak adott esetben a PEG-et dikarboxilsawal (HO(CH2CH2O)_a CO(CH₂)b COOH) vagy terminális karboxilcsoporttal módosítjuk (HO(CH2CH2O)_a.i (CH2COOH), ahol a értéke 1-10 és b értéke 2-6, a kapcsolás előtt.

A -Z-kapcsoló állhat PEG-ből, módosított PEG-ből vagy ezek kombinációjából és/vagy kombinálható egy vagy több Gly-csoporttal. Alternatív módon a a -Z-kapcsoló tartalmazhat Gly-hidat [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3.

A találmány szerinti peptidekben mindegyik aminosav lehet D- vagy L-formában is, azonban előnyös a természetes körülmények között előforduló L-forma.

A peptidszekvencia C- és N-terminális végei eltérhetnek a természetes szekvenciáktól a terminális NE^-csoport vagy COOH-csoport módosítása által, ezek lehetnek például acilálva, acetilálva, amidálva, vagy hordozó vagy más molekula számára kötőhely biztosítása céljából módosítva.

A találmány szerinti peptidek 6-50 aminosavból, előnyösen 10-30 aminosavból állnak. Az azonosított pozíciókban ezek lefednek minden természetes aminosav-változatot.

A találmány szerinti polipeptid-antigén lehet szabad vagy akár hordozóhoz kötött formában. A hordozó vagy szilárd hordozó, amelyhez a pepiid adott esetben kötött, lehet az ismert hordozók széles választékából bármelyik. Kiválasztásakor figyelembe kell venni

“.J ··♦.·• * * * · » ·>« ♦ Λ · _r

- 15azt, hogy az immobilizált polipeptidet diagnosztikus antigénként vagy vakcinában immunizáló komponensként kívánjuk alkalmazni.

A például diagnosztikai célokra alkalmazható hordozókra példaként említhetjük a mágneses gyöngyöket vagy latex kopolimereket, mint például a sztirén-divinil-bezolt, a hidroxilált sztirén-divinil-benzolt, a polisztirént, a karboxilált polisztirént, karbonfeketegyöngyöket, a nem aktivált, vagy polisztirénnel vagy polivinil-loriddal aktivált üveget, epoxi-aktivált porózus mágneses üveget, zselatint vagy poliszacharid-részecskéket vagy más fehérjerészecskéket, vörösvértesteket, mono- vagy poliklonális antitesteket vagy az ilyen antitestekyhh-fragmenseit.

A találmány egy további megvalósítási módja szerint az antigén képezheti vakcina részét, esetleg hordozókkal, adjuvánsokkal kombinálva, vagy más, immunstimuláló elemmel, mint például az env-gént hordozó kanáripoxvírussal kombinálva. Vakcina céljaira történő alkalmazáskor a hordozókra és/vagy adjuvánsokra példaként említhetünk más fehérjéket, mint például a humán vagy marhaeredetü szérumalbumint és a kürtőscsiga— hemocianint és zsírsavakat.

Az immunstimuláns anyagokat három csoportra oszthatjuk: adjuvánsok, antigénhordozók és vivőanyagok. Az adjuvánsok például többek között az alumínium-hidroxid, alumíniumsók, szaponin, muramil-dipeptidek és -tripeptidek, monofoszforil-lipid-A, palmitinsav, B. pertussis és különböző citokinek, többek között a Thl-citokin IL-12 és IL-1. Számos fehérjetoxin alkalmazható abból a célból, hogy az „utasfehérjét” a sejtmembránon átvigye a citoszolba, és amelyek alkalmazhatóak a CTL-vakcinák kifejlesztésében. Hordozók többek között a bakteriális toxoidok, mint például az inaktivált tetanusz- és koleratoxinok, genetikailag detoxifikált bakteriális toxinok, mint például az E. coli hőlabilis enterotoxinja, zsírsavak, élő vektorok, mint például a poliokimérák, és hibrid fehérjék, amelyek részecskéket képeznek, mint például az élesztő-retrotranszpozon hibrid-TYrészecskék és HbcAg-részecskék. A modem vakcinákban komponensként gyakran előforduló vivőanyagok többek között ásványiolaj-emulziók, Freund-féle komplett és inkomplett adjuváns, növényiolaj-emulziók, nemionos, felületaktív blokk-kopolimer-anyagok, szkvalén vagy szkvalaén, lipopeptidek, liposzómák és biológiailag lebomló mikrogömbök. Új vakcinák kifejlesztésében jelentős lehetőséget jelent két új adjuváns, többek között az olaj-a-vízben mikroemulzió (MF59) és a polimer mikrorészecskék. Bármely, az antigén immunogenitása növelésére alkalmas anyag alkalmazható, és a hordozók és az adjuvánsok néhány további alternatíváját adja meg az amerikai vagy az európai gyógyszerkönyv.

-16Az antigén immun-stimulátorként történő alkalmazásaira alkalmas formula tartalmazhat többek között interferonokat, mint például az IFN-γ, antivirális kemokineket vagy hematopoietikus növekedési faktorokat, mint a granulocita makrofág növekedési faktor.

A stimulálás és például a gyomorban az abszorpció növelését szolgáló másik megközelítés a találmány szerinti peptidek kis peptidekkel, mint például di-, tri- vagy tetrapeptidekkel történő beadása. Ezek a peptidek beadhatók a találmány szerinti peptidek mellett vagy azokkal kombinálva. Előnyösen a peptideket az YGG-tripeptiddel együtt adjuk be, amely D- vagy L-formájú aminosavakat tartalmaz, előnyösen D-formájú aminosavakat.

A vakcinák nem parenterális bejuttatásának újabb megközelítése például a via mucosa bejuttatás, génfuziós technológia a mukózális adjuváns nem toxikus származékai előállítása céljából, genetikailag inaktivált antigének alapvető fontosságú deléciójával, antigén és olyan, specifikus citokin koexpressziója, amely mukózális immunválasz modulálásában és szabályozásában fontos szerepet játszik, és az olyan genetikai anyag maga, amely lehetővé teszi a DNS- vagy RNS-felvételt, a gazdasejtben történő endogén expresszióját.

Az olyan, tartós válaszreakciók kifejlesztésének egyik megközelítése, ahol sejtközvetített immunitás szükséges, az olyan plazmid-DNS-sel történő vakcinázás, amely egy vagy több specifikus antigént (antigéneket) kódol. A HIV-fertőzés elleni védelem célját szolgáló vakcináknak mukózális és szisztémás immunválaszt is indukálniuk kell, és beadhatóak bármely, alkalmas módon, például parenterálisan vagy nem parenterálisan, mint szubkután, intrakután, intravénás, intramuszkuláris, perorális, mukózális vagy intranazális úton.

A találmány szerinti vakcina előnyös megvalósítási módja szerint a vakcina tartalmaz az 1, 4, 7. és 10. a. szekvenciák közül legalább az egyik pepiidet tartalmazó antigéneket, előnyösebben a különböző peptidek azonos mennyiségekben fordulnak elő.

Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a vakcinakészítmény tartalmazza a következő antigéneket:

F VIHRLEP WLHPGSQHN1T ASTN-NH₂(14. a. sz.), és

RL V G F P V KP Q V P G L LRP L T YK A A-NH₂ (15. a. sz.)

Ezek a szekvenciák aktiválhatják a celluláris immunrendszert, és hozzájárulhatnak a CTL-epitópokhoz. A CTL-epitókok keretében végrehajtott aminosav-változtatásokat a

- 17megnövelt kötés elérésére terveztük. Más aminosav-változtatásokat hajtottunk végre a peptidszintézis lehetővé tétele és/vagy a peptid oldhatósága növelése céljából.

Az ismertetett antigének alkalmazásával a HIV-1 vagy HIV-1-specifikus peptidek által indukált antitestek testfolyadékban történő detektálására szolgáló eljárás a találmány egy további megvalósítási módja. Az ilyen detektálásra tervezett immunológiai mérési reagenskészlet, és az antigénekkel szelektív reakcióra alkalmas antitestek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Az alábbiakban a peptidek előállítása leírását adjuk meg.

A találmány szerinti peptidek előállíthatóak lineáris aminosav-szekvencia előállítására szolgáló bármely eljárással, mint például rekombináns DNS-technikákkal. A találmány szerinti egy vagy több pepiidet vagy a peptidek multimerj ét kódoló nukleinsavszekvenciát expressziós vektorba juttatjuk. Alkalmas expressziós vektorok például többek között a plazmidok, kozmidok, vírusok és YAC-k (mesterséges élesztőkromoszómák), amelyek tartalmazzák a replikációhoz és expresszióhoz szükséges kontrollrégiókat. Az expressziós vektor stimulálható gazdasejtben történő expresszióra. Alkalmas gazdasejtek többek között baktériumok, élesztősejtek és emlőssejtek. Az ilyen technikák jól ismertek a technika állása szerint, és leírásuk megtalálható például Sambrook kézikönyvében [Sambrook és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)]. Más, jól ismert technika a degradáció, vagy egy aminosav következőhöz történő kapcsolása folyadékfázisban vagy előnyösen szilárd fázisban (gyantán), például az ún. Merrifield-szintézissel. Lásd például Bárány és Merrifield a Peptides, Analysis, Synthesis, Biology c. kiadványban [Bárány és Merrifield, Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2. kötet, szerk.: Gross, E. és Meinhofer, kiad.: Acad. Press, N.Y. (1980); Kneib-Coronier és Mullen, Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705739 (1987) és Field és Noble, Int. J. Peptide Protein Res., 35,161-214 (1990)].

Ha kapcsolt vagy ciklikus pepiidre van szükség, akkor az aminosav-szekvenciát kémiai oxidációs lépésnek tesszük ki abból a célból, hogy ciklizáljunk, vagy egy peptidszekvencián belül vagy két peptidszekvencia között két ciszteincsoportot összekapcsoljunk, amikor a megfelelő lineáris aminosav-szekvenciát szintetizáljuk [lásd Akaji és mtsai., Tetrahedron Letter, 33 (8), 1073-1076 (1992)].

Az alábbiakban a szintézis általános leírását adjuk meg.

Az alábbiakban a Példáknál megadott minden, előállított peptidszármazékot Milligen 9050 peptidszintetizátoron, standard program alkalmazásával szintetizáltunk. Az alkalmazott gyanta a Tenta Gel P RAM volt, 0.20 meq/g elméleti terhelhetőséggel (RAPP

-18POLYMERE GmbH, Tubingen). A szintézis végső termékét egy éjszakán át szárítottuk vákuum alatt. A pepiidet ezután a gyantáról 90%-os trifluor-ecetsavas kezeléssel (1.5 óra, szobahőmérsékleten) hasítottuk le, etándiol (5%) és víz (5%) gyökfogóként történő alkalmazásával. A gyantát ezután szűrtük és a szűrőn tovább mostuk trifluor-ecetsawal (100%) (2x20 ml). Az egyesített szűrleteket vákuumban bepároltuk (vízfürdőn, szobahőmérsékleten), és a maradékot eldörzsöltük etiléterrel (200 ml) és a kicsapódott terméket kiszűrtük. A szilárd anyagot azonnal feloldottuk szűrőn jégecetasawal (100 ml) és 1.5 1 20% ecetsavat tartalmazó metanolhoz adtuk és 0.1 M metanolos jódoldattal kezeltük, míg halvány barna szín maradt. Ezután Dowex 1x8 ioncserélőt adtunk acetátformában (15 g) (Bio-Rad, Richmond, CA) és a keveréket szűrtük. A szűrletet ezután bepároltuk és a maradékot ecetsavból fagyasztva szárításnak vetettük alá. A terméket ezután reverz fázisú folyadékkromatográfia alkalmazásával tisztítottuk Kromasil® 100-5 C8 tölteten (EKA Nobel, Surte, Svédország), acetonitril 0.1% trifluor-ecetsavas vizes oldatát tartalmazó alkalmas rendszerben. Az oszlopról gyűjtött mintákat Kromasil® 100-5 CS-cal felszerelt, analitikai, nagy teljesítményű folyadékkromatográfía (HPLC) (Beckman System Gold, USA) alkalmazásával vizsgáltuk. A tiszta anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, az oldószert elpárologtattuk és a terméket ecetsavból fagyasztva szárításnak vetettük alá. A végső HPLCvizsgálatot végrehajtottuk a végtermékből, és a pepiid szerkezetét aminosav-analízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk. A szintézis során minden aminosav L-aminosav volt, és ezeket fluorofenil-metoxi-karbonil-csoporttal védtük az aaminocsoporton. Az oldalláncokat a következőképpen védtük:

Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu) A zárójelekben a rövidítések: Trt: trifenil-metilt-Bu: tere, butilOtBu: tere, butilészterAz aminosav-származékokat a Bachem ^4G-tól (Svájc) szereztük be.

1. Példa

CSWVNPLRLEPWN1PGSOHN1TACTN -NH? (2. a. sz.) előállítása

A pepiidet amidformában szintetizáltuk a megfelelő kiindulási anyagokból, a szintézis általános leírásának megfelelően. A pepiidet ezután I₂-vel történő oxidációval ciklizáltuk. A peptidet ecetsav-metanol (1:4) elegyben oldottuk, és 0.1 M I₂-t adtunk hozzá

- 19metanolban. A tisztaságot HPLC-vizsgálattal határoztuk meg, és a szerkezetet aminosavanalízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk.

Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb) Molekulatömeg (szabad bázis): 2746.2

2. Példa

V.I.P.R.L.E.P.W.N1 HPGSOPN1TACT N-NH? (3. a. sz.) előállítása

A pepiidet amidformában szintetizáltuk a megfelelő kiindulási anyagokból, a szintézis általános leírásának megfelelően. A tisztaságot HPLC-vizsgálattal határoztuk meg, és a szerkezetet aminosav-analízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk.

Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 2538.0

3. példa

YLLFLTKGLGISGGGYNlGCitKKRCitQIL G-NFL (5. a. sz.) előállítása

A peptidet amidformában szintetizáltuk a megfelelő kiindulási anyagokból, a szintézis általános leírásának megfelelően. A tisztaságot HPLC-vizsgálattal határoztuk meg, és a szerkezetet aminosav-analízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk.

4. Példa

Y L Ni F L T R GI S G G G Y NI Cit K K R Cit ΟIG-NH? (6. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 3097.7

5. Példa

RILSTYLGRISGGGWLSAEPVPLQPP L-NH₂ (8. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 2990.6

6. Példa

RILSTYLGRISGGGYLS AEPVPLQLPP L-NH₂ (11. a. sz.) előállítása

7. Példa

KLVGFPVKPOVPGGGRLLCit PN1TYKA A-NH? (11, a. sz.) előállítása

8. Példa

RLVGFP VKPO VPGGGRLLRPLT YKAA-NH₂(12. a. sz.)előállítása

-21 Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb) Molekulatömeg (szabad bázis): 2790.4

Molekulaképlet: C130H217O39N29

9. Példa

Dimerképzés diszulfidhídon keresztül

A 2. példánál leírt peptidszekvenciákat oxidációs lépésssel kapcsoltuk olyan dipeptid kialakítása céljából, ahol a ciszteincvsoportok diszulfidhidat képeznek. A hidat kialakíthatjuk az alábbi módozatok bármelyikével:

A) I₂-vel történő oxidáció. A peptideket (azonos mennyiségben, ha nem azonosak) ecetsav-metanol (1:4) elegyben oldjuk, és metanolos I₂-t adunk hozzá, amely homodimer-keveréket eredményez, vagy

B) Oxidáció a [Cys(Spy)²²] - 3. a. sz. által. A 3. azonosítószámú szekvencia peptidje 2.3 mM-ját 2 M (vizes) AcOH-ban és 2-propanolban (1:1), és 2,2-ditiodipiridinnel kezeljük (3 eqv) a [Cys(Spy)²²] - [3. a. sz. pepiid] előállítása céljából. A (Cys(Spy)²²] - 3. a. sz.-t 10 mM hTLOAc-ban (vizes, pH 6.5) és metanolban (5:2) oldjuk a 13. a. sz pepiid, dimerje előállítása céljából.

Az eredményül kapott dimer tisztaságát HPLC-vizsgálattal határoztuk meg, és a szerkezetet aminosav-analízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk.

10. Példa

FVIHRLEPWLHPGSOHN1TASTN NH? (14. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 98%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 2540.2

11. Példa

RLVGFPVKPVKPOVPGLLRPLTYKAA -NH? (15, a, sz.) előállítása

A peptidet amidformában szintetizáltuk a megfelelő kiindulási anyagokból, a szintézis általános leírásának megfelelően. A tisztaságot HPLC-vizsgálattal határoztuk • ·«·· · «*··· • 4 · * · « <r I

-22meg, és a szerkezetet aminosav-analízis és tömegspektrometria (LDI-MS) alkalmazásával igazoltuk.

Tisztaság (HPLC) 99%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 2520.3

12. Példa: referenciapélda

A natív táti-szekvencia: ME S VD PRLEP WKHP G S OPKT AC TNNH? (16. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 97%-osnál nagyobb (egyszeres szennyezés, 1%-nál kevesebb)

Molekulatömeg (szabad bázis): 2708.1

13. Példa

A tat2-szekvencia: Ο V CFITKGLGISY GRKKRRQ RR R-NH? (17. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 94%-osnál nagyobb

Molekulatömeg (szabad bázis): 2806.4

14. Példa: referenciapélda

A natív bef-szekvencia: EEVGFPVRPQVPLRPMTYKA A-NH? (18. a. sz.) előállítása

Tisztaság (HPLC) 95%-osnál nagyobb

Molekulatömeg (szabad bázis): 2384.8

15. Példa

A 3. és 12. azonosítószámú szekvencia peptidjeit tartalmazó vakcinát állítottunk elő. A fagyasztva szárított peptideket steril vízben oldottuk 4 mg/ml-es végkoncentrációban. Előállítottuk granulocita-makrofág kolóniastimuláló fatort (GM-CSF) is, a gyártó alkalmazási utasításai szerint, 0.3 mg/ml-es végkoncentrációval. A két oldatot intrakután módon adtuk be. Egy tipikus injeltálási dózis 100 pl.

16. Példa

A 14. és 15. azonosítószámú szekvencia peptidjeit tartalmazó vakcinát állítottunk elő. A fagyasztva szárított peptideket steril vízben oldottuk 4 mg/ml-es végkoncentrációban. Előállítottuk granulocita-makrofág kolóniastimuláló fatort (GM-CSF) is, a gyártó alkalmazási utasításai szerint, 0.3 mg/ml-es végkoncentrációval. A két oldatot intrakután módon adtuk be. Egy tipikus injektálási dózis 100 pl.

17. Példa

Antigénoldatot vagy antigén-szuszpenziót egyenlő arányban kevertünk komplett vagy inkomplett, Behring-íéle FreunJ-adjuvánssal, és injekciós fecskendővel történő felszívással és erőteljes kinyomással, vagy homogenizátor alkalmazásával finoman emulgeáltuk. Szükséges, hogy az emulzió legalább 30 percen át stabil maradjon. Az antigénadjuváns emulziót a legelőnyösebb szubkután módon, ítepctf-ként (“raktározó” módon) injektálni.

18. Példa

HIV-1-által indukált antitestek detektálására szolgáló immunológiai mérési eljárások

A mágnesesrészecske-reagenseket az alkalmazott Dynabead gyártója, a Dynal AS utasításai szerint állítottuk elő. A ligandummal burkolt mágneses részecskéket 1. reagensnek neveztük el. A találmány szerinti pepiidet kovalens módon kapcsoltuk a mágneses részecskék előaktivált felszínére. Lehetséges a pepiidnek a mágneses részecskék felszínére fizikailag történő abszorbciója is. Az 1. reagensben a részecskék koncentrációja 1 mg/ml és 15 mg/ml kzé esik. A részecskeméret 0,2 pm is 15 pm közé esik. A peptidek koncentrációja 0.01 mg/mg részecske és 1 mg/mg részecske közötti.

-24A humán lg elleni, alkalikus foszfatázzal (AP) konjugált antitest-reagenst a Dako AS által rendelkezésünkre bocsájtott ajánlott előiratnak megfelelően állítottuk elő. Ez az előirat a technikában standard eljárás. Ezt a reagenst 2. reagensnek neveztük el.

A fenolftalein-monofoszfát szubsztrátot a a Fluka AG által rendelkezésünkre bocsájtott ajánlott előiratnak megfelelően állítottuk elő. Ez az előirat a technikában standard eljárás. Ezt a reagenst 3. reagensnek neveztük el.

Az alkalmazott mosó- és inkubáló puffer standard 0.05 M TRIS-bázis puffer volt a következő, további vegyületekkel: Tween-20 (0.01% - 0.1%), glicerin (0.1% - 10%) és nátrium-klorid (0.2% -0.1 %).

A mérési eljárás tartalmaz inkubálási lépést, amikor 1 csepp 1. reagenst keverünk 2 csepp mosópufferrel minden “üregben”. Keverés után 30 μΐ mintát adtunk hozzá, és az oldatot 5 percig inkubáltuk. A mágneses részecskék mágnessel csapdába ejthetjük, és a folyadékot eltávolítjuk, mielőtt a mágnest elválasztjuk. Ezután az üregeket kétszer mossuk 4 csepp mosóoldattal, majd a 2. reagenssel inkubáljuk. 1 csepp 2. reagenst adunk minden üreghez 2 csepp mosópufferrel, és az oldatot 5 percig inkubáljuk. A mágneses részecskéket mágnessel csapdába ejthetjük, és a folyadékot eltávolítjuk, mielőtt a mágnest elválasztjuk. Ezután a mosási lépést megismételjük, majd az oldatot a 3. reagenssel inkubáljuk 3 percig. Az eredményeket fehér háttérrel szemben leolvashatjuk. A pozitív eredményeket leolvassuk (3+: sötétvörös), míg a negatív eredmények tiszta, világos sárga/bama oldatok, amelyeket a negatív kontrollok esetében kapunk.

Az immunológiai mérési reagenskészlet alkalmazható olyan antitestek detektálására, amelyeket HIV-vírus vagy HIV-specifikus peptidek vagy fehérjék, például a találmány szerinti peptidek indukáltak.

19. Példa

Terápiás vagy profílaktíkus vakcina

A találmány szerinti polipeptidek közüli legalább az egyik, az 1., 4., 7. vagy 10. azonosítószámú szekvenciák közül bármelyik képezhet antigént, és képezheti aktív alapját olyan, profílaktíkus vagy terápiás vakcinának, 1. típusú humán immundeficiencia-vírus (HIV-1) elleni aktív védelem biztosítása célját szolgálja. A vakcina tartalmazhat olyan vegyületeket, amelyek előnyös hatást gyakorolnak a gazda (ember vagy gerinces állat) immunrendszere védelme vagy stimulálása szempontjából, például tartalmazhat interkeukinokat, interferonokat, granulocita-makrofág növekedési faktorokat, hematopoietikus növekedési faktorokat vagy ezekhez hasonlókat. Előnyösen a vakcinakészítmény ráadásul

-25 tartalmaz adjuvást vagy vivőanyagot, előnyösebben az adjuváns vagy vivőanyag monofoszforil-lipid-A (MPL®), esetleg timsóval, Freund-íéle adjuvánssal (komplett vagy inkomplett) vagy alumínium-hidroxiddal. Az adjuváns/vivőanyag optimális mennyisége a választott típustól (típusoktól) függ.

A találmány szerinti peptidek C-terminálisukon lehetnek módosítva egyszeres zsírsav, mint például egyszeres palmitillánc hozzáadásával lipopeptid-vakcina kialakítása céljából. Ráadásul a lipopeptideket liposzóma-membránokba juttathatjuk fagyasztásolvasztási eljárással, amely a peptidliganumokat felszínükön hordozó liposzómákat eredményez.

A pepiid- vagy vakcinakészítményt tárolás előtt fagyasztva szárításnak vethetjük alá. A fagyasztva szárított peptidek oldhatóak steril vízben 0.1 - 100 mg/ml-es végkoncentrációban. A vakcina tárolható előnyösen alacsony hőmérsékleten, egy vagy több dózisegységet tartalmazó ampullákban. A találmány szerinti peptid tipikus dózisegysége 0.05 pg - 1 mg / kg testtömeg, előnyösen 0.15 pg - 0.15 mg / kg testtömeg közé esik. A szakember számára nyilvánvaló, hogy az alkalmas dózis a beteg testtömegétől, a betegség típusától, az állapota súlyosságától, a beadás módjától és néhány más faktortól függ. Terápiás vakcinaként alkalmazva a vakcinát 12-szer adhatjuk be injekción át. További erősítések követhetik, és bizonyos esetekben ez a beteg egész életét végigkísérheti. Injekciós oldat előállításakor a pepiidet steril vízben oldjuk 1 mg/ml /pepiid végkoncentrációban. Tipikusan egy injekció térfogata 100 pl - 200 pl (2x 100 pl). A pepiidet előnyösen alkalmas adjuvánnsal és/vagy granulocita-makrofág növekedési faktorral, például Leucomax® “Shering Plough”-val együtt adjuk be, amely koncentrációját 0.1 mg/ml - 1 mg/ml-re állítjuk be, vagy a gyártó alkalmazási utasításainak megfelelően. Különösen előnyös az olyan kombinációs terápia, ahol a találmány szerinti peptideket a közzétett PCT/N000075 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt peptidekkel együtt adjuk be, és/vagy az azzal egyidejűleg függőben lévő 2000 4413. sz. norvég szabadalmi bejelentésben leírt peptidekkel együtt. Ezeket a peptideket beadhatjuk egyidejűleg vagy egymást követően. Az alkalmas beadási mód lehet intrakután, szubkután, intravénás, perorális, intramuszkuláris, intranazális, mukózális vagy bármely más, alkalmas beadási mód. Erősítő beadásra lehet szükség a védelem fenntartása céljából. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vakcinakészítmény nemcsak a fertőzés megelőzésében, hanem a fertőzés kezelésében is alkalmazható.

Nem tapasztaltak a találmány szerinti peptidek esetében toxikus hatást egérbe történő injektáláskor, 100 pg/kg testtömeg dózisnál.

-26A fenti példák csak a találmány illusztálását szolgálják. Magától értetődik, hogy szakember módosíthatja az itt leírt peptideket, antigéneket és vakcinákat anélkül, hogy a találmány koncepciójától és a szabadalmi igénypontokban összefoglalt oltalmi körétől eltávolodna.

Claims

-27Szabadalmi igénypontok

1. A HIV-1 szabályozó és kiegészítő fehérjéből származó pepiid, amely tartalmaz legalább egy olyan aminosav-szekvenciát, amely a természetes szekvenciához viszonyítva módosításokat tartalmaz, és amely az alábbi szekvenciák bármelyike:a) Xaai Xaa₂ Xaa₃Xaa4 Xaa₅ Xa^ Xaa₇ Leu Glu Pro Trp Xaai₂ His Pro Xaai₅ Xaai₆ Xaa_n Xaai₈ Xaai₉ Xaa₂₀Xaa₂i Xaa₂₂ Xaa₂₃ Xaa₂₄ (1. azonosítószámú szekvencia), ahol a láncban az aminosavak jelentése az alábbiak bármelyike:

Xaa a peptidszármazék 1. pozíciójában Met, Ser, Cys vagy semmi,26. ol

Xaaa 2. pozícióban Glu, Asp, Val, Ser vagy semmi,

Xaa a 3. pozícióban Ser, Gin, Pro, Leu, Val, Alá, Trp, Tyr vagy Phe,

Xaaa 4. pozícióban Val vagy He,

Xaa az 5. pozícióban Asp, Asn vagy He,

Xaaa 6. pozícióban Pro, His vagy Alá,

Xaaa 7. pozícióban Arg, Asn, Ser, Lys, Glu vagy Asp,

Xaaa 12. pozícióban Leu, He bagy Nle,

Xaa a 15. pozícióban Gly vagy Pro,

Xaaa 16. pozícióban Ser, Asn vagy Alá,

Xaaa 17. pozícióban Gin, Lys vagy Thr,

Xaaa 18. pozícióban Pro vagy His,

Xaa a 19. pozícióban Lys, Thr, Ser. Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, He vagy Nle,

Xaaa 20. pozícióban Thr, Alá vagy He,

Xaa a 21. pozícióban Alá, Pro, Asp vagy Val,

Xaa a 22. pozícióban Cys vagy Ser,

Xaaa 23. pozícióban Thr, Asn vagy Ser,

Xaaa 24. pozícióban Asn, Lys, Arg, Gin, ALa, Pro vagy Thr.

A peptid tartalmazza az 1. a. sz. legalább hat egymást követő aminosavát,

b) Xaai Xaa₂ Xaa₃ Phe Xaa₅ Xaa^ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa_w Xaan Xaa_]2 -Z-Tyr Xaa, Gly Xaais Lys Lys Arg Xaa,₉ Xaa₂₀ Xaa₂i Xaa₂₂ Xaa₂₃ (4. a. sz.) ahol a láncban az aminosavak a következőket jelenthetik:

Xaa az 1. pozícióban Pro, He, Leu, Thr, Tyr vagy Val,

Xaaa 2. pozícióban Val, Alá, Cys, Leu,

Xaaa 3. pozícióban Cys, He, Leu, Val vagy Nle,

-28Xaaaz 5. pozícióban He, Leu, Gin, Met vagy Thr,

Xaaa 6. pozícióban Thr, Asn, Lys vagy Gin,

Xaa a 7. pozícióban Lys, Arg vagy Gin,

Xaaa 8. pozícióban Gly vagy Ala,

Xaaa 9. pozícióban Leu vagy He,

Xaaa 10. pozícióban Gly, Ser vagy Ala,

Xaaa 11. pozícióban He vagy Gly,

Xaaa 12. pozícióban Ser, Phe vagy Tyr,

Xaaj a 14. pozíció előtt Leu, He, Nie,

Xaaa 15. pozícióban Arg, Lys, Ser vagy citrullin (Cit),

Xaaa 19. pozícióban Arg, Lys, Ser vagy Cit,

Xaaa 20. pozícióban Gin, Arg vagy Pro,

Xaaa 21. pozícióban He vagy Leu,

Xaaa 22. pozícióban Gly, Leu, He, Cys vagy semmi,

Xaaa 23. pozícióban Gly vagysemmi, ahol a 4. a. sz. tartalmaz legalább hat, egymást követő aminosavat, -Z- kapcsoló, amely adott esetben eleme a pepiidnek és jelentése PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1,2 vagy 3,

c) Xaai He Leu Xaa₄ Xaa₅ Xaaó Leu Gly Arg Xaaio Xaai j -Z- Xaa^Leu Xaa, Xaa, Xaai₄ Xaais Xaaie Xaai7Xaais Xaai9 Leu Pro Pro Leu (7. azonosítószámú szekvencia), ahol

Xaa az 1. pozícióban Phe, Tyr, Trp vagy Arg,

Xaaa 4. pozícióban Gly, Ser, Asn, Cys, Val, Thr, Alá vagy Arg,

Xaa az 5. pozícióban Thr, Ala, Asp, Asn vagy Ser,

Xaaa 6. pozícióban Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Val vagy Leu,

Xaaa 10. pozícióban Ser, Pro, Phe, Leu vagy He,

Xaaa 11. pozícióban Alá, Thr, Glu, Gin, Val, Pro vagy Ser,

Xaaa 12. pozícióban Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, trp vagy Phe,

Xaaj a 13. pozíció után Ser, Pro, Phe, Leu vagy He,

Xaaj a 14. pozíció előtt Alá, Thr, Glu, Gin, Val, Pro vagy Ser,

Xaaa 14. pozícióban Glu, Lys, Gin, Asp vagy Asn,

Xaaa 15. pozícióban Pro, Ser, Alá vagy Asn,

Xaaa 16. pozícióban Val, Asn, Gly vagy Pro,

Xaaa 17. pozícióban Pro, Gin, His, Ser, Leu, Arg, Thr, Asp vagy He,

-29Xaaa 18. pozícióban Leu, Phe vagy Val,

Xaaa 19. pozícióban Gin, Leu, Pro, His, Asp vagy Glu, ahol a 7. azonosítószámú szekvencia legalább hat egymást követő aminosavból áll, -Z- kapcsoló, amely adott esetben eleme a pepiidnek és jelentése PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3,

d) Xaai Leu Val Glu Xaa₅ Pro Xaa₇ Xaa₈ Pro Xaa_]0 Xaan Pro -Z-[Arg]_m Xaa, Xaai3 Xaan ProXaaiö Xaap Xaa_t8 Xaaig Xaa₂o Xaa₂i (10. azonosítószámú szekvencia), ahol Xaa az 1. pozícióban Lys vagy Arg, a Xaa az 5. pozícióban Phe vagy Leu, Xaaa 7. pozícióban He vagy Val, Xaa a 8. pozícióban Thr, Arg, Lys, Alá vagy Met, Xaaa 10. pozícióban Gin vagy His, Xaa all. pozícióban Val, Leu vagy He, Xaaa 13. pozíció előtt Leu, Xaaa 13. pozícióban Leu, Val vagy Thr, Xaaa 14. pozícióban Arg vagy citrullin (cit), Xaaa 16. pozícióban Met, Val, He vagy Nle, Leu, Xaaa 17. pozícióban Thr vagy Asp, Xaaa 18. pozícióban Tyr, Phe vagy Arg, Xaaa 19. pozícióban Lys vagy Arg, Xaaa 20. pozícióban Alá, Gly, Ser, Glu vagy Gin, Xaaa 21. pozícióban Alá, Ser vagy Val, ahol a 10. a. sz. legalább hat egymást követő aminosavból áll, -Z- kapcsoló, amely adott esetben eleme a peptidnek és jelentése PEG, módosított PEG és/vagy [Gly]_n, ahol n értéke 1, 2 vagy 3, és n-től függetlenül az -[Arg]_m kifejezésben m értéke 0, 1, 2 vagy 3, a szekvencia terminális végei lehetnek szabad karboxil- vagy aminocsoportok, ezek amidjai, aciljai, acetiljai, vagy sói, két vagy több Cys-csoport láncon belüli vagy láncok közötti diszulfidhidat képezhet, -S-(CH₂)_p-S- vagy -(CTLjp——hidat, ahol p: 1-8, adott esetben egy vagy több heteroatommal, mint például Ο, N vagy S és/vagy a pepiid lehet szilárd hordozón immobilizálva.

2. Az 1. igénypont szerinti pepiid, ahol az 1. azonosítószámú szekvencia aminosav-szekvenciája a 2., 3. vagy 14. azonosítószámú szekvenciával azonos.

3. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol a 4. azonosítószámú szekvencia aminosav-szekvenciája az 5. vagy 6. azonosítószámú szekvenciával azonos.

4. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol a 7. azonosítószámú szekvencia aminnsav-szekvenciája a 8. vagy 9. azonosítószámú szekvenciával azonos.

5. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol a 10. azonosítószámú szekvencia aminosav-szekvenciája all. vagy 12. vagy 15. azonosítószámú szekvenciával azonos.

6. Antigén, amely az 1. igénypont szerinti peptidek közül legalább egyet tartalmaz.

7. A 6. igénypont szerinti antigén, amely tartalmaz legalább egy pepiidet az 1., 4., 7. vagy a 10. azonosítószámon megadottak közül.

8. Vakcinakészítmény, amely tartalmaz a 6. igénypont szerinti antigént, gyógyászatiig elfogadott hígítóval és adott esetben adjuvánssal, hordozóval és/vagy vivőanyaggal és adott esetben immunstimuláló vegyülettel (vegyületekkel).

9. A 8. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely tartalmaz egy pepiidet az 1., 4., 7. vagy 10. azonosítószámon megadottak közül.

10. A 9. igénypont szerinti vakcinakészítmény, amely 14. és 15. azonosítószámú peptideket tartalmaz.

11. A 8-10 igénypontok szerinti vakcinakészítmény, ahol a peptideket steril vizes oldatban vannak feloldva és az adott esetben alkalmazott immunstimuláló vegyület granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor.

12. A 8-11 igénypontok szerinti vakcinakészítmény, ahol a készítmény tartalmaz adjuvánst, amely a monofoszforil-lipid-A (MPL®), vagy Freund-féle komplett vagy inkomplett adjuváns vagy alumínium-hidroxid.

13. Vakcinakészítmény, ahol a 6. igénypont szerinti antigén lipopeptidként és/vagy liposzómaként van formulázva.

14. Eljárás HÍV vagy HIV-specifíkus peptidek vagy fehérjék által indukált antitestek testfolyadék-mintában történő detektálására, azzal jellemezve, hogy a mintát olyan immunológiai mérési eljárásnak vetjük alá, ahol az antigén (antigének) az 1., a 2., a 3., a 4. és/vagy 5. igénypont szerinti peptid (peptidek).

15. Immunológiai mérési reagenskészlet HÍV vagy HIV-specifíkus peptidek vagy fehérjék által indukált antitestek testfolyadék-mintában történő detektálására, ahol a diagnosztikai antigén az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptid.

16. Antitest, amely alkalmas a 6. és 7. igénypontok szerinti antigénnel való szelektív reakcióra.

A meghatalmazott: DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Dr. Svingor Ádám szabadalmi ügyvivő

-27SZEKVENCIALISTA

A szekvencialistában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása:

5 <210> 1 < 223> Met, Ser, Cys vagy semmi < 223> Glu, Asp, Val, Ser vagy semmi < 223> Ser, Gin, Pro, Leu, Val, Alá, Trp, Tyr vagy Phe < 223> Val vagy He

10 <223> Asp, Asn vagy He < 223> Pro, His vagy Alá < 223> Arg, Asn, Ser, Lys, Glu vagy Asp < 223> Leu, He vagy Nle < 223> Gly vagy Pro

15 <223> Ser, Asn vagy Alá < 223> Gin, Lys vagy Thr < 223> Pro vagy His < 223> Lys, Thr, Ser, Ala, Arg, Pro, Glu, Leu, He vagy Nle < 223> Thr, Alá vagy He

20 <223> Alá, Pro, Asp, vagy Val < 223> Cys vagy Ser < 223> Thr, Asn vagy Ser < 223> Asn, Lys, Arg, Gin, Alá, Pro vagy Thr

25 <210>2 <223> Nle <223> Nle <210>3

30 <223> Nle <223> Nle <210>4 <223> Pro, He, Leu, Thr, Tyr vagy Val < 223> Vai, Ala, Cys vagy Leu < 223> Cys, He, Leu, Vai vagy Nie < 223> He, Leu, Gin, Met vagy Thr < 223> Tin·, Asn, Lys vagy Arg < 223> Lys, Arg vagy Gin < 223 > Gly vagy Ala < 223> Leu vagy He < 223> Gly, Ser vagy Ala < 223> He vagy Gly < 223> Ser, Phe vagy Tyr < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Leu, He vagy Nie < 223> Arg, Lys, Ser vagy Cit < 223> Arg, Lys, Ser, Gly vagy Cit < 223> Gly, Arg vagy Pro < 223> He vagy Leu < 223> Gly, Leu, lie, Cys vagy semmi <223> Gly vagy semmi <210> 5 <223> Nie <223> Cit <223> Cit <210>6 <223> Nie <223> Nie <223> Cit <223> Cit

-29<210>7 < 223> Phe, Tyr, Trp vagy Arg < 223> Gly, Ser, Asn, Asp, Cys, Vai, Thr, Ala vagy Arg < 223> Thr, Ala, Asp, Asn vagy Ser

5 <223> Tyr, Cys, Phe, Arg, His, Ser, Vai vagy Leu < 223> Ser, Pro, Phe, Leu vagy He < 223> Ala, Thr, Glu, Gin, Vai, Pro vagy Ser < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker

10 <223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Glu, Lys, Gin, Asp, Asn, Tyr, Trp vagy Phe < 223> Ser, Pro, Phe, Leu vagy He < 223> Ala, Thr, Glu, Gin, Vai, Pro vagy Ser < 223> Glu, Lys, Gin, Asp vagy Asn

15 <223> Pro, Ser Ala vagy Asn < 223> Vai, Asn, Gly vagy Pro < 223> Pro, Gin, His, Ser, Leu Arg, Thr, Asp vagy He < 223> Leu, Phe vagy Vai < 223> Gin, Leu, Pro, His, Asp vagy Glu <210>8 < 223> A mesterséges szekvencia leírása: pepiid <210> 9

25 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <210> 10 < 223> Lys vagy Arg < 223> Phe vagy Leu

30 <223> He vagy Val < 223> Thr, Arg, Lys, Alá vagy Met < 223> Gin vagy His < 223> Val, Leu vagy He < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Gly vagy semmi vagy PEG linker < 223> Gly vagy N semmi vagy PEG linker < 223> Arg vagy semmi < 223> Arg vagy semmi

5 <223> Arg vagy semmi < 223> Leu, Vai vagy Thr < 223> Arg vagy Cit < 223> Met, Vai, He, Leu vagy Nie < 223> Thr vagy Asp

10 <223> Tyr, Phe vagy Arg < 223> Lys vagy Arg < 223> Ala, Gly, Ser, Glu vagy Gin < 223> Ala, Ser vagy Vai

15 <210>ll <223> Cit <223> Nie <210> 12

20 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <210> 13 <223> Nie <223> Nie <210> 14 <223> Nie <210> 15

30 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid <210> 16 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid

-31 <210> 17 <223> Λ mesterséges szekvencia leírása: peptid <210> 18

5 <223> A mesterséges szekvencia leírása: peptid