HUP0302738A2 - SARP-1 alkalmazása scleroderma kezelésére és megelőzésére - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát a humán SARP-1-receptor, valamint a receptorraható ágensek alkalmazása képezi scleroderma, közelebbről, szisztémássclerosis kezelésére és/vagy megelőzésére. Ó

Description

i

SARP-1 alkalmazása scleroderma kezelésére és megelőzésére

A találmány tárgyát a humán SARP-1 -receptor, valamint a receptorra ható ágensek alkalmazása képezi scleroderma, közelebbről, szisztémás sclerosis kezelésére és/vagy megelő5 zésére.

A scleroderma olyan kötőszöveti betegség, amelyre a bőr és a belső szervek fibrózisa jellemző, ami szervelégtelenséget és halált okoz [Black és mtsai. (1998); Clements és Furst (1996)]. A sclerodermának számos megnyilvánulási formája és több különféle terápiás vonatkozása van. Ide tartozik a lokalizált scleroderma, a szisztémás sclerosis, a scleroderma-szerű 10 rendellenességek és a Sine-scleroderma (Smith, 2000). Miközben a lokalizált sleroderma egy ritka dermatológiai betegség, amely fíbrózissal és kizárólag a bőrre korlátozódó manifesztációval jár, a szisztémás sclerosis több szervrendszert érint (a belső szervek érintettségének változó kockázatával és a bőrelváltozás változatos mértékével). A szisztémás sclerosisnak két fajtája van: a diffúz és a korlátozott szisztémás sclerosis. A korlátozott szisztémás sclerosist CREST15 nek is nevezik (calcinosis, Raynaud-féle oesophagus-dysfunctio, sclerodactylya, telangiectasiae). A scleroderma-szerű rendellenességek vélhetően az ipari környezet hatásainak tudhatok be. A Sine-féle sclerodermára bőrelváltozás nélküli belső szerv érintettség jellemző.

A scleroderma - és különösen a szisztémás sclerosis - legfőbb manifesztációi a nem megfelelő, túlzott mértékű kollagénszintézis és -lerakódás, az endothelialis dysfunctio, gör20 csők, kollapszus és fibrózis okozta elzáródás.

A scleroderma ritka betegség: egymillió személyre hozzávetőleg 19 megbetegedés jut. A scleroderma oka ismeretlen, azonban jelentős a genetikai prediszpozíció. A betegséggel kapcsolatos rendellenességek közé tartozik az autoimmunitás, valamint a belhámsejtek és fibroblasztok funkciójának megváltozása. A szisztémás sclerosis valójában a legsúlyosabb autoim25 mun betegség, amelyre a diagnózistól számított öt éven belül 50 %-os mortalitás jellemző (Silman, 1991).

A diagnosztizálás vonatkozásában lényeges klinikai paraméter a kézközép-ujjperci (metacarpophalangealis) ízületek közelében mért bőrvastagság. A Raynaud-féle jelenség a scleroderma gyakori, csaknem univerzális komponense. Ez a bőr hideg hatására bekövetkező 30 színváltozása alapján diagnosztizálható. A Raynaud-szindróma tünetei az ischaemia és a bőrvastagodás.

-2A scleroderma kialakulásában, súlyosbodásában és progressziójában több alapvető biológiai folyamat játszik szerepet, úgymint a vascularis diszfunkció, az endothelsejtek aktiválása és károsodása, a leukocita-felhalmozódás, autoantitestek termelődése és - ami kritikus jelentőségű - a kontrollálatlan fibrotikus reakció, ami halált okozhat (Clements és Furst, 1996). A betegség patogenezisében döntő szerepük van a fibroblasztoknak. A sclerodermában szenvedő betegektől vett primer fibroblasztokban a betegség in vivo jellemző sajátságai közül számos megfigyelhető, így pl. a fokozott mértékű extracelluláris mátrix-szintézis és -lerakódás (különösen a kollagén és a fibronektin esetében), valamint a növekedési faktorok és citokinek (úgymint a TGF-β és CTGF) megváltozott termelődése [Id. Strehlow és Korn (1998) és LeRoy (1974)].

A scleroderma kezelésére nem áll rendelkezésre megfelelő módszer. Innovatív, de nagy kockázattal járó terápia az autológ stem-sejtek transzplantációja [Martini és mtsai. (1999)]. Mindazonáltal, a scleroderma kezelésére jelenleg nincs olyan eljárás, amely a fibrotikus folyamatokra irányulna [Wigley és Boling (2000)].

A betegség kialakulásának kockázatával és progressziójával összefüggő gének azonosítása olyan hatásos stratégiák kifejlesztését eredményezhetné, amelyek alkalmasak lennének a betegség különböző stádiumaiba történő beavatkozásra.

A SARP-1 (szekretált, apoptózissal összefüggő protein-1) a szekretált proteinek azon családjának tagja, amely - hét transzmembrán-receptor alkotta frizzled-családban megfigyelt [Rattner és mtsai. (1997)] ciszteinben gazdag doménnel (CRD) mutatott homológia alapján frizzled-szerű szekretált proteinek néven ismert. A frizzled-géneket eredetileg Drosophilában azonosították; funkciójuk a szövetpolaritás szabályozása [Adler és mtsai. (1987)]. A frizzled proteinek a nagymértékben konzervált Wnt-család receptorai, mely családba legalább 16 szekretált jelátvivőmolekula tartozik, melyek az embriogenezis során sejt-sejt interakciókat szabályoznak [Id. Smalley és Dale (1999)]. A Wnt hatásmechanizmusának megismerése több forrásból adódott össze: Drosophila és C. elegáns genetikája; sejttenyészetben vizsgált biokémiai folyamatok; és Xenopus-embriókban ectopiás génexpresszió. Egerekben számos Wnt-gént mutagenizáltak, melyek nagyon specifikus fejlődési defektusokat eredményeztek. A Wnt frizzled proteinekkel bekövetkező interakciója által kiváltott Wnt jelátviteli reakcióút több citoplazmikus közvetítő (relé) komponensen keresztül játszódik le, és funkciója a β-catenin multiprotein turnover komplex aktivitásának szupresszalasa [lehetove téve ezáltal a citoszolban

-3 lévő β-catenin felépülését, amely később bekerül a sejtmagba, és a TCF-fel komplexet alkotva aktiválja a Wnt célgének transzkripcióját; Id. Miller és mtsai. (1999), Kühl és mtsai. (2000)].

A Wnt-frizzled interakciók a különböző Wnt-kötő proteinek, a frizzled-szerű szekretált proteinek (sFRP) korlátozott expressziója révén módosíthatók. Az sFRP-k a Wnthez az N-terminális CRD-doménen keresztül képesek kötődni, ezáltal elválasztják a Wnt-t promóterétől, gátolva annak hatásait [Bafico és mtsai. (1999)].

A SARP-1 több néven ismeretes, úgymint SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2. Az egéreredetű és humán SARP-1 részleges, illetve teljes hosszúságú aminosavés/vagy nukleinsav-szekvenciáját több szabadalmi iratban feltárták (Id. pl. WO 98/35043 számú nemzetközi közzétételi irat, WO 98/13493 számú nemzetközi közzétételi irat, EP 0 879 887 számú európai szabadalmi bejelentés és WO 99/46281 számú nemzetközi közzétételi irat).

Funkcionális szempontból, a frizzled-szerű szekretált proteinek (SFRP-k) a Wntjelátvitel szolubilis modulátoraiként működnek, oly módon, hogy a membránkötött frizzledreceptorrokkal versengenek a szekretált Wnt-ligandumokhoz történő kötődésért. Az eddig ismert, e családba tartozó humán proteinek - a SARP-1 mellett - a SARP-2 (SFRP-1) és a SARP-3 (SFRP-5). Az egéreredetű SARP-l-röl és a humán SARP-2-ről és -3-ról leírták, hogy képesek a sejteket apoptózisra szenzitizálni, illetve képesek az apoptózisos reakció gátlására [Melkonyan és mtsai. (1997)]. Az egéreredetű SARP-1 és a humán SARP-2 - emlőadenokarcinoma sejtvonalban expresszáltatva - ellentétes hatást gyakoroltak a sejtek proapoptózisos stimulusra vonatkozó érzékenységére. Míg a SARP-1-et expresszáló sejtek rezisztensek voltak, a SARP-2-t expresszáló sejtek érzékenyek lettek a tumornekrózis-faktor és a ceramid által indukált apoptózisra. A SARP-1, illetve SARP-2 expressziója módosította a βcatenin (a Wnt-közvetítette szignáltranszdukció indikátora) intracelluláris szintjét, ami arra utal, hogy a SARP-proteinek hatást gyakorolnak a Wnt-frizzled jelátviteli reakcióútra [Melkonyan és mtsai. (1997)].

Northern-blot analízis eredményei azt mutatták, hogy a SARP-génekre különböző expressziós mintázatok jellemzőek [Leimeister és mtsai. (1998)]. A SARP-1 számos humán szövetben 2,2 kb-os és 1,3 kb-os transzkriptum formájában létezik (legnagyobb mennyiségben a vastagbélben és a vékonybélben). Chang és mtsai. (1999) beszámoltak arról, hogy a SARP-1 (vagy SFRP-2) nagy mennyiségben - és specifikusan - expresszálódik a szarvasmarha retinában, az egész belső sejtmagi fázisban. A retinán belül a SARP-3 (vagy SFRP-5) specifikusan a retina pigment-epitheliumában expresszálódik.

-4Szomatikus sejthibridek analízisével Melkonyan és mtsai. (1997) a SARP-l-gént a 4. humán kromoszómán lokalizálták. Chang és mtsai. (1999) a térképi pozíciót - radiációs hibridanalízissel - a 4q31.3-ra finomították.

Kielégítő bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozólag, hogy a módosított SARP-1 expresszió rákkal hozható összefüggésbe (Id. a WO 98/13493 számú nemzetközi közzétételi iratot).

A találmány szerinti megoldás azon a felismerésen alapul, hogy a SARP-1 a scleroderma elfogadott állatmodelljében jótékony hatásúnak bizonyult.

Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi a SARP-1 scleroderma (közelebbről, szisztémás sclerosis) kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására történő alkalmazása. A találmány tárgyát képezi továbbá egy SARP-1-et expresszáló sejt vagy SARP-1 kódolószekvenciáját tartalmazó expressziós vektor alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá a SARP-1-et tartalmazó gyógyászati készítmények, továbbá kezelési eljárások, melyek a SARP1 embereknek történő adagolását foglalják magukban.

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az 1. ábrán a SARP-1-mRNS génfilter-analízissel - hét sclerodermás páciensből származó normális és beteg fibroblasztokban - kimutatott expressziójának mértékét szemléltetjük. Az egyes mintacsoportok (normál vagy abnormális) átlagos expressziós szintjét az 1/A ábrán, a mediánt az 1/B ábrán mutatjuk be.

A 2. ábrán a SARP-1-mRNS nyolc sclerodermás páciensből származó beteg, illetve normális fibroblasztokban - valós idejű polimeráz-láncreakcióval kimutatott - expressziójának arányát szemléltetjük (kis passzálási szám, <5 passzálás).

A 3. ábrán a SARP-1-mRNS expressziójának normális humán bőrfibroblasztokban (NHDF) végzett valós idejű PCR-analízisének eredményét mutatjuk be (a GAPDH-mRNS expressziójához viszonyítva).

A 4. ábrán a SARP-1-mRNS-expresszió klinikailag normális humán bőrbiopsziákban (n=6) és sclerodermás páciensekből vett rendellenes bőrbiopsziákban (n=2) végzett valós idejű PCR-analízisének (GAPDH-expresszióhoz viszonyított) eredményeit mutatjuk be.

Az 5/A és 5/B ábrán a SARP-l-cDNS nukleotidszekvenciáját és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát mutatjuk be. A szignálpeptid megjósolt hasítási pozícióit nyilakkal jelöljük.

-5A 6. ábrán humán és egéreredetű SARP-1-protein aminosav-szekvenciáját egymás alá rendezve hasonlítjuk össze. A két szekvenciában egymástól eltérő aminosavakat szürke háttérrel jelöljük.

A 7. ábrán SARP-1-gyei transzfektált és ál-transzfektált sejtek kontroll sejtekhez viszonyított apoptózis-szintjét mutatjuk be. (*** = statisztikailag szignifikáns csökkenés).

A 8. ábrán a SARP-1-proteinnel végzett kezelés - humán bőrfibroblaszt-tenyészetekből begyűjtött kondicionált tápközegben mért - össz-MMP-1-aktivitásra gyakorolt hatását szemléltetjük. A fíbroblasztok beteg szövetből (A, D, F), egészséges személyekből (B, C), illetve sclerodermás páciens nem beteg szövetéből (E) származtak.

A 9. ábrán stimulálatlan, illetve TGF-3-val stimulált NIH3T3-sejtekben a SARP-1gyel végzett együttes transzfekció kollagénpromóter-aktivitásra gyakorolt hatását mutatjuk be. Az ábra (A) részén a riportertesztben mért lumineszcencia-egységeket tüntetjük fel, míg az ábra (B) részén a lumineszcencia kontrolihoz viszonyított százalékos arányát szemléltetjük.

A 10. ábrán belomycin-indukálta tüdőfibrózis-modellben a tüdőnként! fibrózis-pontszámokat mutatjuk be. Az ábrán a hordozóval kezelt egerekben, SARP-1-gyei transzfektált sejtekben, ál-transzfektált sejtekben, illetve anti-TGF-terápiával kezelt egerekben mért pontszámokat tüntetjük fel (*** = statisztikailag szignifikáns csökkenés).

A találmány kidolgozása során azt találtuk, hogy a SARP-1 szekretált protein expressziója a sclerodermás páciensekből származó beteg fibroblasztokban lényegesen kisebb, mint a kontroll sejtekben. A sclerodermás páciensekből származó fibrotikus elváltozásokból izolált bőr-fibroblasztokban eltérően expresszálódó gének azonosítására DNS génfilter-mikromátrix technikát alkalmaztunk (összehasonlításul ugyanazon páciensek bőrének klinikailag nem érintett területeiről izolált fíbroblasztok bevonásával). A SARP-1 expressziója a hét vizsgált páciens közül ötben (az elváltozásokból származó fibroblasztokban) gátolt volt. Ezenfelül, a sclerodermás páciensek rendellenes bőréből származó teljes biopsziamintákból izolált összRNS valós idejű reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakció (RT-PCR) analízisének eredményei a SARP-1-mRNS kisebb mennyiségének jelenlétét mutatták, mint a klinikailag normális életkorra, nemre és anatómiai helyre egyeztetett - kontroll biopsziákban.

A fenti eredmények igazolásaként, a génfilter-mikromátrixon lévő összes gén expressziós szintjét összehasonlító statisztikai analízis eredményei azt mutatták, hogy a SARP-1 gátlása 95 %-os valószínűséggel összefüggésben áll a páciensek fibrotikus elváltozásaival, ami a betegség klinikai progressziójával való kapcsolatra utal.

-6• · · ····· * ··*· ·« s« · ·«·

A SARP-1 sclerodermában megfigyelhető jótékony hatását a scleroderma elfogadott egérmodelljében, a bleomycin-indukálta tüdőfíbrózis-modellben igazoltuk. E modellben a SARP-l-et expresszáló sejtek egerekbe történő bejuttatása jelentős mértékben csökkentette a tüdőfibrózis előfordulási arányát.

Ennek megfelelően, egy olyan anyag - scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására történő - alkalmazását tárjuk fel, amely kötődik a humán SARP-1 -receptorhoz és beindítja annak jelátviteli reakcióútját, vagy amely serkenti az endogén SARP-1 felszabadulását vagy elősegíti annak aktivitását. A szóban forgó anyag lehet maga az érett SARP-1-protein vagy annak bármely olyan fragmense, amely kötődik a SARP-1-receptorhoz és beindítja a SARP-1-receptoron keresztüli jelátvitelt, valamint bármely SARP-1 receptor agonista (pl. a SARP-1-receptorra irányuló agonista antitestek vagy kémiai agonisták).

A SARP-1 egyik feltételezett receptora a Wnt-protein, amely feltehetően a SARP-1 ciszteinben gazdag frizzled (frz) doménjéhez kötődik [Lin és mtsai. (1997)]. Ennek megfelelően, a találmány szerinti anyag lehet a SARP-1 fragmense, amely annak ciszteinben gazdag frizzled doménjét tartalmazza.

A scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas anyag előnyösen a következők egyike:

(a) Érett SARP-1-protein;

(b) a 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

(c) a 2. azonosítószámú szekvencia 21-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(d) a 2. azonosítószámú szekvencia 24-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(e) a 2. azonosítószámú szekvencia 25-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(f) a 2. azonosítószámú szekvencia 26-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(g) a 2. azonosítószámú szekvencia 27-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(h) a 2. azonosítószámú szekvencia 28-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(i) a 2. azonosítószámú szekvencia 37-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(j) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) szekvenciák legalább egyikével legalább 40 %-ban, legalább 50 %-ban, legalább 60 %-ban, legalább 70 %-ban, legalább 80 %-ban vagy legalább 90 %ban azonos;

(k) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelyet olyan DNSszekvencia kódol, amely mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens félté

- 7telek mellett hibridizál az (a)-(i) pontok bármelyike szerinti molekulát kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével;

(1) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) pontok szerinti aminosav-szekvenciáktól kizárólag konzervatív aminosav-szubsztitúciókban tér el;

(m) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének sója vagy izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív részlete vagy cirkulárisán permutált származéka.

A humán SARP-1 teljes hosszúságú cDNS-ét klónoztuk, és szekvenciáját az 5. ábrán, illetve a szekvencialista 1. azonosítószámú szekvenciájaként mutatjuk be. Az e cDNS-nek megfelelő aminosav-szekvenciát az 5. ábrán, illetve a szekvencialistában 2. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be. Ahogy az alábbi példákban leírjuk, felismertük, hogy a SARP-1 N-terminálisa rendkívül heterológ. A SARP-1 megjósolt szignálpeptidje a 2. azonosítószámú szekvencia 25-295. vagy 21-295. aminosavait foglalja magában. A HEK-293-sejtekben expresszáltatott, tisztított, rekombináns humán SARP-1 N-terminális szekvenciái alapján további N-terminális szekvenciák létezésére derült fény, melyek alapján az érett SARP-1 a 2. azonosítószámú szekvencia 24., 25., 26., 27., 28. vagy 37. aminosavával kezdődik.

Ahogy a leírásban használjuk, a „SARP-1” kifejezés a fenti (a)-(m) pontokban felsorolt anyagokat értjük.

A találmány leírásában a „kezelés és/vagy megelőzés” kifejezésen a betegség kialakulásának, fejlődésének, progressziójának - vagy a betegség egy vagy több vagy valamennyi tünete kialakulásának, fejlődésének vagy progressziójának - csillapítását, csökkentését vagy részleges, jelentős vagy teljes megelőzését vagy blokkolását értjük.

Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „scleroderma” kifejezés jelentése kiterjed a scleroderma valamennyi besorolására és definíciójára, valamint a scleroderma egy vagy több tünetére (részletesen lásd a bevezető szakaszt). Ezen túlmenően, a „scleroderma” kifejezés jelentésébe tartoznak azok a betegségek is, amelyekről ismert, hogy összefüggésben állnak a sclerodermával [Id. pl. a Smith (2000) által leírtakat, mely forrást teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintjük].

Ahogy itt használjuk, a „scleroderma” kifejezés további fibrotikus betegségeket is magában foglal, úgymint a májzsugorodást (cirrózis), interstitialis tüdőfibrózis, Dupuytren-görcs, keloid és egyéb hegesedési/sebgyógyulási rendellenességek, poszt-operatív adhéziók és reaktív fibrózis, valamint a krónikus szívelégtelenség (különösen szívinfarktus után). A találmány sze , · ··· · · β · · ···»· * · 4 « · · «.4 ♦ «

-8rinti megoldás értelmében a SARP-1 alkalmazását tárjuk fel fibrózisos betegségek (úgymint a fent felsoroltak) kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.

A SARP-1-gyei kezelhető további betegségek és rendellenességek közé tartoznak a sebgyógyulási rendellenességek, konkrétan a tüdőbeni sebgyógyulási rendellenességek, melyek a tüdő krónikus gyulladásával, végül a tüdöfelszínek fibrózisával és hegesedésével járnak. A tüdő gyulladásával járó rendellenességek közé tartozik, például, az idiopathiás tüdőfibrózis, a sarcoidosis, bronchopulmonaris dysplasia, fibroproliferatív ARDS, valamint szisztémás betegségek pulmonaris manifesztációi, pl. a rheumatoid arthritis esetében [Id. Krein és mtsai. (2001)].

A „scleroderma” kifejezés előnyösen a lokalizált, szisztémás, korlátozott és diffúz sclerodermát, valamint az ezekkel átfedő szindrómákat foglalja magában.

A lokalizált scleroderma elsősorban a bőrön manifesztálódik, de érinti a bőr alatti izmokat és csontokat is (a belső szerveket azonban nem). A lokalizált scleroderma viszonylag enyhe lefolyású betegség, és a szisztémás sclerodermával a hasonló felületi tünetek (pl. bőrbiopszia mikroszkópos vizsgálattal megfigyelhető megjelenése) vonatkozásában rokonítható.

A szisztémás scleroderma több tünettípussal és tünetcsoporttal (pl. CREST, korlátozott és diffúz) jellemezhető. A szisztémás scleroderma szisztémás sclerosis néven is ismer, de nevezik progresszív szisztémás sclerosisnak és örökletes progresszív szisztémás sclerosisnak is. A szisztémás scleroderma, például, a bőrt, a vérereket és/vagy a belső szerveket érintheti. A bőr érintettsége esetén a bőr - leggyakrabban a kézen és az arcon - megkeményedhet. Amennyiben a szisztémás scleroderma a vérereket érinti, Raynaud-szindrómát okozhat. A szisztémás sclerosis legsúlyosabb formája a belső szerveket támadja meg, és rokkantságot vagy akár halált is okozhat. A szisztémás sclerosis, többek között, a következő betegségeket foglalja magában: sclerodermás tüdőbetegség, sclerodermas vesekrízis, szív-manifesztációk, izomgyengeség (ideértve az izomkimerültséget és a korlátozott CREST-et), gyomor-bélrendszeri motilitászavar és görcs, valamint a központi, perifériás és autonóm idegrendszer rendellenességei. Az idegrendszeri abnormalitások közül leggyakoribb a carpal tunnel szindróma, melyet trigeminalis neuralgia követ.

A korlátozott scleroderma a kezekre korlátozódhat, bár az arc és a nyak ugyancsak érintett lehet.

A diffúz scleroderma bőrfeszülést okoz, és a csukló (vagy könyök) felett is előfordulhat. A diffúz szisztémás sclerosis számos alcsoportja létezik, mint például a „bőrkérgesedés

-9nélküli scleroderma”, amelyre belső szervet érintő fíbrózis jellemző, bőrfeszülés azonban nem; és az örökletes progresszív szisztémás sclerosis, amely egy ritka, családokban örökletesen előforduló alak.

Az átfedéses tünetegyüttesekről akkor beszélünk, ha egy sclerodermás páciens egyéb 5 autoimmun betegségben (pl. lupus, rheumatoid arthritis, stb.) is szenved; ilyen például, a lupusszal átfedő diffúz scleroderma. A scleroderma tünetei vegyes kötőszöveti betegség (MCTD) vagy differenciálatlan kötőszöveti betegség (UCTD) részeként is jelentkezhetnek.

Ahogy a leírásban használjuk, a „SARP-1” kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amely a 2. azonosítószámú szekvencia (humán) vagy 5. azonosítószámú szekvencia (egéreredetű) 10 egészét vagy részét tartalmazza, függetlenül az ilyen protein elnevezésétől, így ide tartoznak a SARP-1 egyéb ismert elnevezései (SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2 vagy FRP-2), továbbá a SARP-1 sói, izoalakjai, muteinjei, aktív frakciói, funkcionális származékai és cirkulárisán permutált származékai.

A „SARP-1” kifejezés, előnyösen, az érett - szignálpeptid nélküli - proteinre vonatko15 zik. A megjósolt szignálpeptid a SARP-1 aminosav-szekvenciájának (2. azonosítószámú szekvencia) első 20 vagy első 23, 24, 25, 26, 27 vagy 36 aminosavát tartalmazza, ami azt jelenti, hogy az érett protein a 2. azonosítószámú szekvencia 21-295, illetve 24-, 25-, 26-, 27-, 28vagy 37-295. aminosavaiból áll.

Ahogy a 6. ábrán látható, a humán SARP-1 aminosav-szekvenciája nagymértékben ho20 mológ az egéreredetű szekvenciával (5. azonosítószámú szekvencia). Ennek megfelelően, a találmány szerinti megoldás értelmében az egéreredetű SARP-1, továbbá egyéb fajokból származó proteinek is alkalmazhatók, feltéve, hogy kellő mértékű azonosságot mutatnak a humán SARP-1-gyei ahhoz, hogy emberben - jelentős immunreakciót kiváltása nélkül - fejthessék ki biológiai aktivitásukat.

A „SARP-1” kifejezés jelentése kiterjed a 2-5. azonosítószámú szekvencia bármely olyan fragmensére, részletére, doménjére vagy szubdoménjére, amely sclerodermára kívánt aktivitás kifejtésére képes. A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazhatók a protein fragmensei vagy a protein egy vagy több doménje, feltéve, hogy sclerodermára jótékony hatást (előnyösen a teljes hosszúságú proteinéhez legalább hasonló hatást) fejtenek ki. Ez a jótékony 30 hatás a kísérleti példákban bemutatott in vitro és in vivo tesztek valamelyikével (vagy más, a sclerodermára kifejtett hatás kimutatására alkalmas teszttel) mérhető. Például, a SARP-1 ciszteinben gazdag frizzled-domént és netrin-szerű domént [más néven NTR-modult, amely homológ a metalloproteinázok szöveti inhibitoraival (TIMP; Id. Bányai és Patthy, 1999)] tártál- 10maz. Ilyenformán, a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös fragmensek a SARP-1 frizzled-doménjét tartalmazó fragmens és az NTR-modult tartalmazó fragmens.

A találmány értelmében a SARP-1 természetben előforduló (azaz natív) vagy rekombináns protein. A rekombináns termeltetés eukarióta sejtekben (pl. élesztősejtekben vagy CHO-sejtekben, humán fibroblaszt-sejtekben vagy sejtvonalakban hajtható végre. Ezen túlmenően, alkalmazhatók prokarióta sejtek (pl. E. coli) is.

A SARP-1 előnyösen egy vagy több helyen glikozilált. A szükségletektől - és a protein előállítási vagy izolálási forrásától - függően alkalmazhatunk glikozilálatlan SARP-1-et is.

Ahogy a leírásban használjuk, a sók kifejezésen a SARP-1-molekula és analógjai karboxilcsoportjaival képzett sókat, illetve aminocsoportjaival képzett savaddíciós sókat értjük. A karboxilcsoport sói szokványos módszerekkel hozhatók létre, és közéjük tartoznak a szervetlen sók (pl. nátrium-, kalcium-, ammonium-, vas(III)- és cinksók, valamint a szerves bázisokkal alkotott sók, mint pl. az aminokkal, pl. trietanolaminnal, argininnal, lizinnel, piperidinnel, prokainnal és hasonlókkal képzett sók. A savaddíciós sók közé tartoznak az ásványi savakkal (pl. sósavval vagy kénsavval) alkotott sók, valamint a szerves savakkal (pl. ecetsavval vagy oxálsawal) alkotott sók. Természetesen az ilyen sók mindegyikének meg kell tartania a SARP-1 találmány szerinti megoldás szempontjából lényeges biológiai aktivitását (vagyis a sclerodermára jótékony hatást kell gyakorolniuk).

A találmány szerinti megoldás értelmében a SARP-1 splicing-változatainak izoalakjai szintén alkalmazhatók, feltéve, hogy képesek a scleroderma progressziójának gátlására és/vagy vagy a betegség tüneteinek enyhítésére. A két (1,3 kb-os és 2,2 kb-os) transzkriptum (melyek humán szövetekben eltérően expresszálódónak bizonyultak), például, a SARP-1 eltérő izoalakjait reprezentálhatják, melyek hasznosak a találmány gyakorlati kivitelezése szempontjából.

Ahogy itt használjuk, a muteinek kifejezésen egy SARP-1-molekula analógjait értjük, amelyben a természetes SARP-1 egy vagy több aminosava eltérő aminosawal van helyettesítve vagy deletálva van, vagy a SARP-1 természetes szekvenciájához egy vagy több aminosav van hozzáadva. Az ilyen analógok aktivitása legalább ugyanakkora vagy nagyobb, mint a vad típusú SARP-1-é. Ezek a muteinek ismert szintézises és/vagy helyspecifikus mutagenezises technikák vagy bármely egyéb, alkalmas eljárás alkalmazásával állíthatók elő.

A szóban forgó muteinek aminosav-szekvenciája előnyösen kellő mértékben azonosak a SARP-1 aminosav-szekvenciájával (2. azonosító számú szekvencia) ahhoz, hogy a SARP-1proteinével legalább lényegében hasonló aktivitás kifejtésére legyenek képesek. Egy SARP-1-

- 11 mutáns aktivitása szakember számára jól ismert vizsgálati eljárások (konkrétan a példákban ismertetett eljárások) alkalmazásával tesztelhető. Például, a SARP-1-mutánsok aktivitásának értékelésére jól alkalmazható a fibroblasztok kollagénszintézisének mennyiségi meghatározása (Id. 7. példa).

A találmány szerinti muteinek közé tartoznak a SARP-l-et kódoló DNS-sel vagy RNS-sel sztringens feltételek mellett hibridizáló nukleinsav (DNS vagy RNS) által kódolt proteinek. A sztringens feltételek kifejezésen olyan hibridizáltatási és mosási feltételeket értünk, amelyek szakember számára szokványosán sztringens feltételnek tekinthetők [Id. Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., 6.3 és 6.4 §, (1987, 1992); és Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)].

A sztringens feltételek jellemző példái közé tartoznak, többek között, a következők: a vizsgált hibrid számított olvadáspontjánál (T_m) 12-20 °C-kal kisebb hőmérsékleten végzett mosás, pl. 2 x SSC + 0,5 % SDS összetételű oldatban 5 percig; 2 x SSC + 0,1 % SDS oldatban 15 percig; 0,1 x SSC + 0,5 % SDS oldatban 37 °C-on 30-60 percig; majd 0,1 x SSC + 0,5 % SDS oldatban 68 °C-on 30-60 percig. Szakember számára jól ismert, hogy a sztringens feltételek a DNS-szekvencia, az oligonukleotid-próbák (10-40 bázis) vagy a vegyes oligonukleotidpróbák hosszúságától is függenek. Ha vegyes próbákat alkalmazunk, az SSC helyett előnyös tetrametil-ammónium-kloridot (TMAC) használni (Id. Ausubel és mtsai. fentebb idézett művét).

A szóban forgó muteinek aminosav-szekvenciája előnyösen kellő mértékben azonos a SARP-1 aminosav-szekvenciájával ahhoz, hogy lényegében hasonló vagy jobb biológiai aktivitás kifejtésére legyen képes, mint a SARP-1-protein.

A SARP-1 egyik könnyen mérhető aktivitása a kollagénszintézist gátló képessége. Ezen aktivitás mérésének vizsgálati eljárását a 6. példában ismertetjük részletesen. Amennyiben a mutáns jelentős kollagénszintézis-gátló aktivitással bír, a SARP-1 proteinével lényegében hasonló aktivitásúnak tekinthető. Ennek megfelelően, egy adott mutáns SARP-1-proteinével lényegében azonos aktivitásának meghatározása céljából a mutánst, például, a 7. példában leírt egyszerű vizsgálati eljárással teszteljük.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében a mutáns a 2. azonosítószámú aminosav-szekvenciával legalább 40 %-ban azonos vagy homológ, még előnyösebben, le · ··* * « » ·»,· ^·**<· a.

- 12galább 50 %-ban, legalább 60 %-ban, legalább 70 %-ban, legalább 80 %-ban, legelőnyösebben pedig legalább 90 %-ban azonos vagy homológ.

A szekvenciák azonossága két vagy több polipeptid-szekvencia vagy két vagy több polinukleotid-szekvencia közötti - szekvenciák összehasonlításával meghatározható - összefüggést tükröz. Általában a szekvencia-azonosság a két polinukleotid-szekvencia vagy két polipeptid-szekvencia nukleotidjainak, illetve aminosavainak pontos megfelelését jelenti (az összehasonlított szekvencia teljes hossza mentén).

Azon szekvenciák esetében, amelyekre nem áll fenn a pontos megfelelés, százalékos azonosság határozható meg. Általában a két összehasonlítani kívánt szekvenciát optimálisan - a maximális egyezésnek megfelelően - egymás alá rendezzük (alignment). Az egyezés mértékének növelése érdekében az egyik vagy mindkét szekvenciában hézagokat iktathatunk be. A százalékos azonosság egyrészt az összehasonlítani kívánt szekvenciák teljes hosszúságára állapítható meg (ún. globális alá rendezéssel), ami különösen alkalmas az egyforma vagy nagyon hasonló hosszúságú szekvenciák esetében; másrészt megállapítható rövidebb, meghatározott hosszúságú szakaszokra is (ún. lokális egymás alá rendezés), ami a különböző hosszúságú szekvenciák összehasonlítására alkalmas.

Két vagy több szekvencia azonosságának és homológiájának összehasonlítására alkalmas eljárások szakember számára jól ismertek. Például, két polinukleotid-szekvencia közötti százalékos azonosság, illetve két polipeptid-szekvencia közötti százalékos azonosság és százalékos homológia megállapítására alkalmasak a Wisconsin Sequence Analysis Package 9.1 változatában hozzáférhető programok [Devereux és mtsai. (1984)], pl. a BESTFIT- és a GAPprogram. A BESTFIT-program a Smith és Waterman (1981) által leírt lokális homológia algoritmust alkalmazza, és két szekvencia legnagyobb hasonlóságú régiójának azonosítására alkalmas. A szekvenciák azonosságának és/vagy hasonlóságának egyéb meghatározási módszerei is ismeretesek, mint például, a BLAST-programcsalád [Altschul és mtsai. (1990); Altschul és mtsai. (1997), melyek az NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov honlapján férhetők hozzá, valamint a FASTA-progam [Pearson (1990); Pearson (1988)].

A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható SARP-l-muteinek (mutánsok), illetve az azokat kódoló nukleinsavak lényegében egymásnak megfelelő szekvenciák (mint szubsztitúciós peptidek vagy polinukleotidok) véges sorozatát alkotják, amelyek a találmány leírása alapján, elvárható mennyiségű kísérleti munkával, rutinszerű eljárásokkal egyszerűen előállíthatok.

A találmány értelmében a muteinekben előnyösen végrehajtható módosítások az ún. konzervatív szubsztitúciók. A SARP-l-polipeptidek, illetve -proteinek konzervatív aminosav-szubsztitúciói közé tartoznak a lényegében hasonló fizikai-kémiai tulajdonságokkal bíró aminosavak alkotta csoportokon belüli aminosav-helyettesítések: az egy csoportba tartozó 5 aminosavak egymással történő helyettesítése nem változtatja meg az eredeti molekula biológiai funkcióját [Grantham (1974)]. Könnyen belátható, hogy a fenti szekvenciákban aminosavinszerciók és -deléciók is végrehajthatók, anélkül, hogy megváltoztatnánk az eredeti molekula funkcióját, különösen olyan esetekben, ha az inszerciók vagy deléciók csak néhány (pl. 30-nál kevesebb, előnyösen tíznél kevesebb) aminosavat érintenek, és nem okozzák olyan aminosavak 10 eltávolítását vagy áthelyeződését, amelyek kulcsfontosságúak a funkcionális konformáció fenntartása szempontjából (pl. ciszteinek). Az ilyen deléciók és/vagy inszerciók eredményeként létrejött proteinek és muteinek szintén a találmány igényelt oltalmi körébe tartoznak.

A hasonló aminosavak csoportjait az 1. táblázatban, a legelőnyösebb hasonló aminosav-csoportokat a 2. táblázatban, a legelőnyösebb hasonló aminosav-csoportokat a 3. táblázat15 ban mutatjuk be.

1. táblázat

Hasonló aminosavak előnyös csoportjai

Aminosav	Hasonló aminosavak
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Alá, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin, Thr
Alá	Gly, Thr, Pro, Alá
Val	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Gly	Alá, Thr, pro, Ser, Gly
He	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, He
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, He, Val, Leu, Met
Trp	Trp

2, táblázat

Hasonló aminosavak még előnyösebb csoportjai

Aminosav	Hasonló aminosavak
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, He, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Alá	Pro,Ala
Val	Val, Met, He
Gly	Gly
He	He, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, He, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, He, Val, Leu
Trp	Trp

3, táblázat

Hasonló aminosavak legelőnyösebb csoportjai

Amino sav	Hasonló aminosavak
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, He, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Alá	Alá
Val	Val
Gly	Gly
He	Ue, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, He, Leu
Trp	Trp

Á találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazható SARP-l-polipeptidek vagy -proteinek muteinjeinek előállítására alkalmas aminosav-szubsztitúciók bármely ismert mód5 szerrel létrehozhatók [Id. pl. a 4 959 314, 4 588 585 és 4 737 462 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat (Mark és mtsai.), az 5 116 943 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Koths és mtsai.), a 4 965 195 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Namen és mtsai.), a 4 879 111 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Chong és mtsai.), az 5 017 691 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Lee és mtsai.)]. A lizinnel 10 szubsztituált proteinek leírását illetően Id. a 4 904 584 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (Shaw és mtsai.).

- 17A fuzionált protein kifejezésen SARP-l-et vagy mutánsát tartalmazó polipeptidet értünk, amely egy másik proteinnel van fuzionálva, amely, például, a testfolyadékokban megnövelt tartózkodási idővel bír. A találmány szerinti megoldás szempontjából azok a fúziós proteinek előnyösek, amelyek a SARP-1 egészét vagy funkcionális részletét egy olyan protein egészéhez vagy funkcionális részletéhez fuzionálva tartalmazzák, amely képes a molekula biológiai aktivitásának (pl. humán testfolyadékokban a felezési idő) javítására. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a fuzionált protein immunglobulint (lg) tartalmaz. A találmány szerinti megoldás szempontjából azok a fúziós proteinek előnyösek, amelyek a SARP-1 egészét vagy részletét egy immunglobulin egészéhez vagy részletéhez fuzionálva tartalmazzák. A fúziós proteinek monomerek vagy multimerek, illetve hetero- vagy homomultimerek lehetnek. A fúziós protein előnyösen egy immunglobulin konstans régióját (konkrétan az Fcrégióját) tartalmazza. A találmány értelmében előnyösek azok a fúziós proteinek is, amelyek immunglobulinként IgGl- vagy IgG2-izotípusú immunglobulint tartalmaznak.

A fentiek értelmében, a SARP-1-protein más proteinhez, polipeptidhez vagy hasonlóhoz (pl. immunglobulinhoz vagy fragmenséhez) fuzionálható. A fuzionáltatás közvetlenül vagy rövid kapcsolópeptid beiktatásával valósítható meg. A kapcsolópeptid 1-3 aminosavas vagy hosszabb, pl. 13 aminosavas lehet. A három aminosavas kapcsolópeptid példájaként az E-F-M (Glu-Phe-Met) tripeptid, míg a 13 aminosavas kapcsolópeptid példájaként a Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met említhető, melyek a SARP-1-szekvencia és az immunglobulin-szekvencia közé iktathatok be.

Ahogy a leírásban használjuk, a funkcionális származékok kifejezésen a SARP-1 származékait, valamint azok mutánsait és fuzionált proteinjeit értjük, amelyek az aminosavoldalláncokon vagy az N- vagy C-terminális csoportokon elhelyezkedő funkciós csoportokból, szakember számára jól ismert módszerekkel állíthatók elő. Az ilyen származékok szintén a találmány igényelt oltami körébe tartoznak, feltéve, hogy gyógyászati szempontból elfogadhatók, azaz nem gátolják a protein aktivitását, amely legalább lényegében hasonló a SARP-1 aktivitásához, és a proteint tartalmazó készítménynek nem kölcsönöznek toxikus tulajdonságokat. Ennek megfelelően, a találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében a funkciós csoport származék az aminosav egy vagy több oldalláncán elhelyezkedő egy vagy több funkciós csoporthoz kapcsolva legalább egy molekularészt tartalmaz.

A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen előnyös molekularészek a polietilénglikol (PEG) oldalláncok, amelyek álcázhatják az antigénhatású helyeket, és meghosszabbíthatják a hozzájuk kapcsolt anyagok felelezési idejét a testfolyadékokban. Az egyéb

- 18származékok közé tartoznak a karboxilcsoportok alifás észterei, a karboxilcsoportok (ammóniával vagy primer vagy szekunder aminokkal végzett reagáltatással létrehozott) amidjai, az aminosavak szabad aminocsoportjainak acilgyökökkel (pl. alkanoilcsoportokkal vagy karbociklusos aroilcsoportokkal) létrehozott N-acil-származékai vagy a szabad hidroxilcsoportok (pl. a szerin vagy treonin szabad hidroxilcsoportjainak) acilgyökökkel létrehozott O-acil-származékai.

A SARP-1 (illetve mutánsai és fuzionált proteinjei) aktív részletei kifejezésen a proteinmolekula polipeptidláncának fragmensét vagy prekurzorát értjük [önmagában vagy hozzákapcsolt molekulákkal vagy gyökökkel (pl. cukor- vagy foszfátgyökökkel) együtt], amely a SARP-1-proteinéhez lényegében hasonló aktivitás kifejtésére képes.

A találmány tárgyához tartozik egy nukleinsav-molekula alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, mely nukleinsav-molekula a következő polipeptidek egyikét kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmaz:

(a) érett SARP-1-protein;

(b) a 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

(c) a 2. azonosítószámú szekvencia 21-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(d) a 2. azonosító számú szekvencia 24-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(e) a 2. azonosítószámú szekvencia 25-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(f) a 2. azonosítószámú szekvencia 26-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(g) a 2. azonosító számú szekvencia 27-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(h) a 2. azonosítószámú szekvencia 28-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(i) a 2. azonosítószámú szekvencia 37-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(j) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) szekvenciák legalább egyikével legalább 40 %-ban, legalább 50 %-ban, legalább 60 %-ban, legalább 70 %-ban, legalább 80 %-ban vagy legalább 90 %ban azonos;

(k) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelyet olyan DNSszekvencia kódol, amely mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens feltételek mellett hibridizál az (a)-(i) pontok bármelyike szerinti molekulát kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével;

(1) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) pontok szerinti amino sav-szekvenciáktól kizárólag konzervatív aminosav-szubsztitúciókban tér el;

(m) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének sója vagy izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív részlete vagy cirkulárisán permutált származéka.

Szintén a találmány tárgyát képezi az említett nukleinsav-molekulák scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazása.

A találmány szerinti megoldás értelmében a SARP-1 az említett nukleinsav-molekulát tartalmazó vektor formájában is bejuttatható az emberi szervezetbe. Ilyenformán, a találmány tárgyát képezi egy találmány szerinti nukleinsav-molekulát tartalmazó vektor alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására. A vektor előnyösen expressziós vektor, amely a SARP-1 kódolósezkvenciájának egészéhez vagy részéhez műkö10 dőképesen kapcsolva promótert tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint vektorként génterápiás vektort alkalmazunk. A génterápiás vektorok szakember számára jól ismertek; legtöbbjük víruseredetű vektor, mint pl. az adenovirus- és lentivírus-eredetű vektorok.

A találmány szerinti megoldás értelmében a SARP-1-et SARP-1-proteint termelő 15 és/vagy szekretáló sejt formájában is bejuttathatjuk az emberi szervezetbe. Ennek megfelelően, a találmány tárgyához tartozik egy SARP-1-et expresszáló sejt alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére (azaz scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas sejtterápia végrehajtására) szolgáló gyógyszer előállítására. Ilyen sejtként SARP-1-et természetes módon termelő sejtet vagy - rekombináns SARP-1-et termelő - transzfektált sejtet al20 kalmazhatunk A találmány szerinti alkalmazás szempontjából azok a sejtek előnyösek, amelyek nagy mennyiségben termelik a proteint; azaz olyan sejtek, amelyek a SARP-1-et kódoló nukleinsav-molekulát hordozó expressziós vektor nagy kópiaszámát tartalmazzák.

Mivel a fíbroblasztok szoros összefüggésben állnak a fibrózis mechanizmusával, ezek a legalkalmasabb sejtek az fibrózis- és scleroderma-ellenes terápiára. Ilyenformán, a találmány 25 értelmében előnyösen SARP-1-et expresszáló fibroblasztokat alkalmazunk.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy SARP-1 egészét vagy részét kódoló nukleinsav-molekulát hordozó vektort tartalmazó sejt scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére. A találmány tárgyához tartozik továbbá egy találmány szerinti polipeptid termelése érdekében genetikailag módosított sejt.

A találmány értelmében feltárjuk továbbá egy expressziós vektor alkalmazását SARP- endogén termelődésének indukálására és/vagy fokozására olyan sejtben, amely normális esetben nem (vagy nem elégséges mennyiségben) expresszálja az inhibitort. Ilyenformán, a talál

-20mány szerinti megoldás értelmében a kívánt protein termeltetésére endogén génaktiválás (EGA) néven ismert technikát alkalmazunk.

A szisztémás sclerosis a sclerodermán belüli egyik legsúlyosabb betegség, amely gyakran rokkantsághoz és elhalálozáshoz vezet. Ennek megfelelően, a találmány egy további előnyös megvalósítási módja szisztémás sclerosis-ra vonatkozik, amely a sclerodermán belüli indikáció, amelyre a belső szervek érintettsége jellemző (részletesen Id. fentebb).

A találmány értelmében számos kombinált terápiát részesítünk előnyben. Ennek megfelelően, a találmány szerinti gyógyszer további komponensekként a következőket tartalmazhatja:

- interferon, különösen az interferon-β;

- tumornekrózis-faktor (TNF) antagonistája, elsősorban a TBPI és/vagy TBPII;

- további scleroderma-ellenes hatóanyag;

- scleroderma-ellenes hatóanyag, a következők közül: ACE-inhibitorok, kalciumcsatornablokkolók, protonpumpa-inhibitorok, NSAID-k, COX-inhibitorok, corticosteroidok, tetraciklin, pentoxifíllin, bucillamin, geranilgeranil transzferáz inhibitorok, rotterlin, prolil-4-hidroxiláz inhibitorok, c-proteináz inhibitorok, lizil-oxidáz inhibitorok, relaxin, halofuginon, prosztaglandinok, prosztaciklinek, endothelin-1, nitrogén(II)-oxid, angiotenzin-II inhibitorok és antioxidánsok.

A hatóanyagokat együdejűleg, egymást követően vagy egymástól elkülönítve alkalmazhatjuk.

Bár a scleroderma kezelésére jelenleg nem áll rendelkezésre megfelelő eljárás, a scleroderma tüneteinek kezelésére több hatóanyagot és kezelési módot alkalmaznak. A találmány szerinti kombinált terápiában alkalmazható scleroderma-ellenes hatóanyagok összefoglaló ismertetését illetően Id. Leighton (2001) és Wigley és Sule (2001), mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének tekintjük.

Az interferonok elsősorban a vírusreplikációra és a sejtproliferációra gyakorolt gátló hatásaikról ismeretesek. Például, az interferon-γ az immunreakciók és gyulladásos folyamatok beindításában játszik fontos szerepet, míg interferon-β (IFN-β, I. típusú interferon) gyulladáscsökkentő hatású.

A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében a SARP-1-et TNFantagonistával kombinálva alkalmazzuk. A TNF-antagonisták többféle módon fejtik ki hatásukat. Az egyik lehetőség szerint az antagonisták magához a TNF-molekulához kötődnek, kellő

-21 affinitással és specifítással ahhoz, hogy részlegesen vagy jelentős mértékben semlegesítsék a TNF-receptorkötésért felelős TNF-epitópot vagy -epitópokat (a továbbiakban ezeket lefoglaló antagonisták-nak nevezzük). Ilyen lefoglaló antagonista, például, egy TNF ellen irányuló antitest.

Más módon, a TNF-antagonisták - a reakcióútban a TNF-kötődés után elhelyezkedő sejtfelületi receptor által aktivált TNF jelátviteli reakcióutat gátolják (ezeket jelátviteli antagonistáknak nevezzük). A TNF-antagonisták a natív TNF érzékeny sejtvonalakra in vitro kifejtett aktivitására gyakorolt hatásuk rutinszerű szkrínelésével (pl. humán B-sejtekben, amelyekben a TNF proliferációt és immunglobulin-szekréciót okoz) egyszerűen értékelhetők. A szkrínelés során a kiszemelt antagonisták különböző hígításait (pl. a tesztben alkalmazott TNF moláris koncentrációjának 0,1-100-szorosának megfelelő mennyiségeit) alkalmazzuk, a kontroll tesztet pedig TNF nélkül vagy csak antagonista jelenlétében végezzük [Tucci és mtsai. (1992)].

A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösen alkalmazható TNF-antagonisták a lefoglaló antagonisták, közülük is azok, amelyek nagy affinitással kötődnek a TNF-hez és kis immunogenitásúak. Különösen előnyösek a szolubilis TNF-receptormolekulák és a TNF elleni semlegesítő aktivitású antitestek. Például, előnyösen alkalmazhatók a TNF-RI (p55) és TNF-RII (p75) szolubilis alakjai. A találmány szerinti megoldás szempontjából még előnyösebb antagonisták az e receptorok olyan rövidített változatai, amelyek a receptorok extracelluláris doménjeit vagy funkcionális részleteit tartalmazzák. A lerövidített szolubilis TNF I. és II. típusú receptorokat, például, az EP914431 számú európai szabadalmi leírásban tárták fel.

A TNF-receptorok rövidített alakjai oldhatók, és ezeket vizeletben és szérumban 30 kD-os, illetve 40 kD-os TNF-gátló kötőproteinekként (TBPI, illetve TBPII) azonosították [Id. Engelmann és mtsai. (1990)]. A találmány szempontjából előnyös a SARP-1 TNF-antagonistákkal és/vagy interferonnal együttes, egymás utáni vagy elkülönített alkalmazása.

A találmány értelmében a SARP-1-gyei történő kombinált alkalmazásra TNF-antagonistaként előnyösen alkalmazható a TBPI és TBPII. E receptormolekulák származékai, fragmensei, régiói és biológiailag aktív részletei funkcionálisan olyan receptormolekulákra emlékeztetnek, amelyek szintén alkalmasak a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésére. A receptormolekula ilyen biológiailag aktív megfelelője vagy származéka a polipeptid (vagy a receptormolekulát kódoló szekvencia) olyan részlete, amely megfelelő méretű és képes a TNFhez olyan affinitással kötődni, ami elégséges a membránkötött TNF-receptorral való interakció gátlására vagy blokkolására.

-22A találmány egy további előnyös megvalósítási módja értelmében TNF-antagonistaként humán szolubilis ΤΝΓ-RI-et (TBPI) alkalmazunk. A természetes és rekombináns szolubilis TNF-receptorokat és előállítási eljárásaikat illetően Id. az EP 308 378, EP 398 327 és EP 433 900 számú európai szabadalmi leírásokat.

Miközben a TNF-a-t előnyös lehet a betegség korai stádiumában blokkolni, beszámoltak arról, hogy későbbi stádiumokban a TNF önmaga is jótékony hatást gyakorolhat a sclerodermára [Abraham és mtsai. (2000)]. Ennek megfelelően, a SARP-1 és a TNF-cc kombinált alkalmazását tárjuk fel scleroderma (különösen a betegség előrehaladott stádiumában) kezelésére vagy megelőzésére.

A COX-inhibitorok az idevonatkozó szakirodalomból jól ismertek. Például, a WO 01/00229 számú nemzetközi közzétételi iratban specifkus COX-2-inhibitorokat tárnak fel.

Szintén a találmány tárgyához tartozik egy gyógyászati készítmény scleroderma, közelebbről, szisztémás sclerosis kezelésére és/vagy megelőzésére, amely készítmény SARP-1 proteint, és, adott esetben, egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, diluendumot vagy segédanyagot tartalmaz. A találmány szerinti gyógyászati készítmény a fentebb felsorolt további komponensek bármelyikét (közelebbről, interverint, TBP-t vagy COXinhibitort) tartalmazhatja.

Ezen túlmenően, a találmány szerinti gyógyászati készítmény találmány szerinti nukleinsav-molekulát hordozó vektort vagy SARP-l-et expresszáló sejtet is tartalmazhat.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény aktív összetevői (azaz a találmány szerinti polipeptidek, nukleinsavak vagy sejtek és kombinációik), valamint a fentebb felsorolt anyagok kombinációi különféle módokon adagolhatok a páciensnek. Az adagolási módok példáiként említhető az intradermális, transzdermális (pl. lassú hatóanyag-felszabadulást biztosító készítmények formájában), intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután, orális, epidurális, topikus és intranazális adagolás. Ezeken felül egyéb, terápiás szempontból hatékony adagolási módok is alkalmazhatók, például, külhám- vagy belhámszöveten keresztüli abszorpció vagy génterápia, melynek során a páciensbe aktív hatóanyagot kódoló DNS-molekulát juttatunk be (pl. vektor alkalmazásával), miáltal az aktív hatóanyag expressziója és szekréciója in vivo következik be. Ezen túlmenően, a találmány szerinti protein(ek) egyéb biológiai aktivitású hatóanyag-komponensekkel (pl. gyógyászati szempontból elfogadható felületaktív anyagokkal, segédanyagokkal, hordozókkal és diluendumokkal) együtt is adagolható(k).

A gyógyászati szempontból elfogadható kifejezés olyan hordozóra vonatkozik, amely a gyógyászati készítmény aktív komponensének biológiai aktivitását nem csökkenti, és a

-23 kezelni kívánt páciensre nézve nem toxikus. Például, parenterális adagolás céljára az aktív protein(ek) injektálható egységdózis-alakban foglalhatók készítménybe (pl. sóoldat, dextrózoldat, szérumalbumin vagy Ringer-oldat alkalmazásával).

Parenterális (pl. intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris) céljára az aktív proteinek) gyógyászati szempontból elfogadható parenterális hordozóval (pl. vízzel, sóoldattal vagy dextrózoldattal), valamint izotonizáló adalékokkal (pl. mannitóllal) és kémiai stabilitást fenntartó anyagokkal (pl. tartósítószerekkel és pufferekkel) készített oldat, szuszpenzió, emulzió vagy liofílizált por alakjában foglalható(k) készítménybe. A készítmény szokványos technikák alkalmazásával sterilizálható.

A találmány szerinti aktív proteinek biológiai hozzáférhetősége olyan konjugálási módszerekkel fokozható, amelyek növelik a protein felezési idejét az emberi szervezetben (például, a molekulát polietilénglikolhoz kapcsolhatjuk, Id. a WO 92/13095 számú nemzetközi közzétételi iratot).

Az aktív protein(ek) terápiás szempontból hatásos mennyisége számos változó (így pl. a receptor típusa, a találmány szerinti anyag receptorára vonatkozó affinitása, az esetleges citotoxikus aktivitás, az adagolás módja és a páciens klinikai állapota) függvénye lehet.

A terápiás szempontból hatásos mennyiségen a találmány szerinti aktív anyag olyan mennyiségét értjük, amely a páciensnek beadva a SARP-1-receptor aktiválását - vagy a receptort in vivo stimuláló ligandumot inaktiválását eredményezi. A páciensnek (egy vagy több dózisban) beadandó mennyiség különböző tényezőktől függ, így a SARP-1 farmakokinetikai tulajdonságaitól, az adagolás módjától, a páciens állapotától, nemétől, életkorától, testtömegétől, a tünetek súlyosságától, az egyidejűleg végzett egyéb gyógykezelésektől, a kezelés gyakoriságától és az elérni kívánt hatástól. A megállapított dózistartományok pontos beállítása szakember számára nem okoz gondot.

A találmány szerinti polipeptidek szükséges dózisa kb. 0,0001 mg/kg-tól 100 mg/kgig, kb. 0,01 mg/kg-tól 10 mg/kg-ig, vagy 0,1 mg/kg-tól 5 mg/kg-ig vagy kb. 1 mg/kg-tól 3 mg/kg-ig terjedhet, de a konkrét dózis meghatározása minden esetben a kezelőorvos megítélésétől függ.

A napi dózist a kívánt hatás elérése céljából rendszerint több, kisebb dózisra felosztva vagy tartós hatóanyag-felszabadulást biztosító alakban adagoljuk. A kezelt személyek második vagy további dózisok is beadhatók, melyek a kezdő, illetve előző dózissal azonosak vagy annál kisebbek vagy nagyobbak lehetnek. A második vagy további dózisokat a betegség megjelenése alatt vagy azt megelőzően adagolhatjuk.

-24Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás scleroderma - közelebbről, szisztémás sclerosis - kezelésére és/vagy megelőzésére, melynek során egy rászoruló páciensnek találmány szerinti polipeptid hatásos mennyiségét - adott esetben gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval együtt - adagoljuk. Más módon, vagy ezen túlmenően, a páciensnek adagolhatunk SARP-1-et termelő sejtet vagy SARP-1-et kódoló nukleinsav-molekulát is (utóbbit, adott esetben, expressziós vektorba foglalva).

Az expressziós vektort szisztémásán, előnyösen intramuszkuláris injekcióval adhatjuk be. Egy másik előnyös beadási mód a belélegeztetés, különösen tüdőfíbrózis esetén.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás gyógyászati készítmény előállítására, melynek során SARP-1 hatásos mennyiségét gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval elegyítünk. Szintén a találmány tárgyához tartozik egy eljárás ízületi gyulladás kezelésére és/vagy megelőzésére, melynek során egy rászoruló páciensnek S ARP-1 hatásos gátló mennyiségét adagoljuk.

A találmány leírásában említett valamennyi hivatkozást (ideértve az azokban bemutatott adatokat, táblázatokat, ábrákat és szövegeket), továbbá az általunk említett hivatkozásokban felsorolt valamennyi hivatkozást teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintjük.

Az ismert eljárásokra, szokványos eljárásokra és azok lépéseire vonatkozó hivatkozásaink nem jelentik annak elismerését, hogy a találmány bármely szempontját vagy megvalósítási módját korábban feltárták, ismertették vagy javasolták volna.

A találmány speciális megvalósítási módjainak fenti leírása alapján szakember számára - elvárható mennyiségű kísérleti munka mellett - nem okoz gondot azok különböző alkalmazásoknak megfelelő módosítása és/vagy adaptálása. Az ilyen módosítások és adaptációk nem térnek el a találmányi gondolat lényegétől, és a találmány igényelt oltalmi körén belül maradnak. A leírásban használt terminológia a találmány szerinti megoldás bemutatását szolgálja, szakember számára lehetővé téve a találmány értelmezését, ugyanakkor, nem jelenti a találmány oltalmi körének korlátozását.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban kísérleti példákon keresztül ismertetjük, melyek a találmány előnyös megvalósítási módjait szemléltetik, és nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátázosát.

1. példa

A SARP-1 a sclerodermában szenvedő betegek bőr-fibroblasztjaiban eltérő mértékben expresszálódik

Módszerek

Mintavétel

Kilenc szisztémás diffúz bőrsclerosisban (SSc) szenvedő - életkorra és nemre egyeztetett - páciens elváltozásos, illetve elváltozások nélküli bőrfelületéről (rendszerint az alkar bőréről) 2 mm³-es biopszia mintákat vettünk. Valamennyi páciens megfelelt az American Rheumatology College szisztémás sclerosis diagnózisára megadott kritériumainak.

Fibroblaszt-tenyésztés

A biopsziákból Abraham és mtsai. (1991) leírása alapján in vitro tenyésztéssel fibroblasztokat nyertünk ki. Röviden összefoglalva: a biopsziákat feldaraboltuk és steril műanyag csészékbe vagy lombikokba helyeztük. Szobahőmérsékleten 15 perces szárítás után a biopsziadarabok hozzátapadtak a szövettenyésztő műanyagfelülethez. Ekkor a szöveteket fíbroblaszttenyésztő tápközegben [10 % magzati borjúszérumot (FCS), 2 mM L-glutamint, 1 mM nátrium-piruvátot, 100 egység/mL penicillint, 100 pg/mL sztreptomicint, 50 pg/mL gentamicint és 2,5 pg/mL amfotericin-B-t tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg], 5 % szén-dioxidot tartalmazó, párásított atmoszférában tenyésztettük, majd két-három hetes inkubálást követően a fibroblaszt-kinövéseket rövid tripszines kezeléssel leválasztottuk, majd gentamicin és amfotericin-B nélküli FGM-tápközegben továbbtenyésztettük. A kísérletekben a fibroblasztokat a 2. és 5. passzálás között használtuk fel. A fibroblasztok fenotípusát tipikus egyértegű morfológiájuk és háromdimenziós kollagéngél-struktúrájuk alapján igazoltuk.

RNS izolálása

Korai passzálású konfluens scleroderma-fibroblasztokból, illetve normál humán bőr(preputium-) eredetű fibroblasztok (melyeket a Promocell-től vásároltunk) primer tenyészeteiből (1-3. passzálás) - Trizol (Life Technologies) alkalmazásával, a gyártó által javasolt eljárással - össz-RNS-t izoláltunk. Az RNS-üledéket steril, DEPC-vel kezelt vízben 1 pg/mL koncentrációban újraszuszpendáltuk és -80 °C-on tároltuk.

cDNS-próba szintézise pg össz-RNS-t citokin-specifikus láncindítók (R&D Systems; katalógusszám: GAC11) 1,3 pL-ével elegyítettük, és 0,5 rnL-es Eppendorf-csőben 70 °C-on inkubáltuk. A csöveket két percre 50 °C-ra hűtöttük, majd 2 pL 5X reakciópuffert (250 mM Tris-HCl, pH =

8,3; 375 mM KC1; 15 mM MgCl₂), 1 pL 10X dNTP-elegyet (5 mM dGTP, 5 mM dCTP és 5 mM dTTP), 3,5 pL a³²P-dATP-t (3000 Ci/mmol; Amersham katalógusszám: PB10204), 0,5 pL DTT-t (100 mM) és 1 pL Superscript-II-t (Life Technologies) adtunk hozzájuk. A reakcióelegyet pipettázással összekevertük és 50 °C-on 25 percig inkubáltuk. A reakciót 1 pL (1 mg/mL glikogént tartalmazó) 0,1 M EDTA (pH = 8,0) hozzáadásával leállítottuk, majd ajelölt cDNS-t Chromaspin-200 DEPC-H20-oszlop (Clontech) alkalmazásával, a gyártó útmutatása szerint elválasztottuk a be nem épült dezoxinukleotidoktól. A cDNS-tartalmú frakciókat Czerenkov-számlálással azonosítottuk. A csúcsfrakciót (normális esetben hat összegyűjtött frakcióból a 2. frakciót) az RNS hidrolizálása céljából 1 mM EDTA-t tartalmazó 1 mM nátrium-hidroxid oldat 0,1-szeres térfogatával 70 °C-on 20 percig kezeltük, majd 2,5 pg humán Cot-l-DNS-t (Life Technologies) tartalmazó 1 M NaH₂PO₄-oldat azonos térfogatával 70 °Con 20 percig semlegesítettük. Ezt követően a hőkezelt, semlegesített cDNS-próbát közvetlenül a hibridizációs elegyhez adtuk.

Hibridizáció génfilter-mikromátrixokhoz

Génfilter-mikromátrixokat (humán citokin expressziós mátrix; R&D systems, katalógusszám: GA001) hengeres palackokban, Hybaid hibridizáltatókemencében (MWG Biotech) 68 °C-on két óra hosszat 5 mL - 0,5 pg/mL lazacsperma-DNS-t (Life Technologies) tartalmazó - Express Hybridization oldatban (Clontech) előhibridizáltattunk. Ezt követően az előhibridizációs oldatot friss hibridizációs oldatra cseréltük, amely 0,25-1x10⁶ cpm/mL specifikus aktivitású cDNS-próba készítményt tartalmazott. A hibridizációt 68 °C-on 16-20 óra hosszat folytattuk, majd a filtereket 2xSSC/l % SDS összetételű oldattal 68 °C-on négyszer 20 percig, és 0,lxSSC/0,5 % SDS oldattal kétszer 15 percig mostuk. A filtereket ezután Saran Wrap™ alkalmazásával lezártuk és szobahőmérsékleten, változó (4 órától 4 napig teijedő) időtartamban K-tipusú tároló típusú foszfor-alapú leképező ernyőre exponáltuk.

Képanalízis

A képalkotó ernyőket „Biorad Personal FX phosphoimager” alkalmazásával, 50 pmes felbontással szkenneltük. A kapott 16 bites digitális fájlt TIF-formátumba konvertáltuk, és a képet Arrayvision-szoftver (Imgaing Research, Inc.) alkalmazásával analizáltuk. Mindegyik minta esetében mértük a filterre (két-két példányban) cseppentett 384 gén pixel-intenzitását. A háttérjel levonása után a mátrix mindegyik foltpárjára átlagos pixelintenzitást számítottunk (= expressziós szint).

-27 A kiválasztott gének mikromátrix („microarray”} eredményeinek igazolása reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakcióval (RT-PCR)

Az egyes páciensekből vett mintákból származó össz-RNS 1 ng-ját 20 pL - 5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 0,1 % Triton X-100, 1-1 mM dATP, dGTP, dCTP és dTTP, 0,5 egység rekombináns RNázin ribonukleáz inhibitor (Promega) és 15 egység AMV reverz transzkriptáz (Promega) összetételű - oldatban, oligo-dT láncindító (Promega) alkalmazásával reverz transzkripciónak vetettük alá. A reakcióelegyet 42 °C-on 60 percig inkubáltuk, 5 percig 95 °C-ra melegítettük, majd steril vízzel 200 pL-re hígítottuk. A reakcióelegyek hígításait Taqman-készüléken (PE Applied Biosystems 7700) valós idejű PCR-analízisnek vetettük alá, melynek során az egyes génekhez - a génfílter gyártója által megadott adatbázisnyilvántartási szám alapján - Primer Express szoftver (PE Applied Biosystems) alkalmazásával tervezett specifikus láncindító-párokat alkalmaztunk. Az eredményeket minden egyes minta esetében a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) háztartási gén expressziójára normalizáltuk, és x-szeres változásként fejeztük ki, amit úgy kaptunk, hogy a rendellenes minta expressziós értékét elosztottuk a megfelelő, normál mintára kapott expressziós értékkel.

A sclerodermával kapcsolatos gének megjóslásának statisztikai módszere

A sclerodermával kapcsolatban álló gének megjóslásának statisztikai módszerét szomszédsági analízissel és osztályprediktor alkalmazásával hajtottuk végre [részletesen Id. Golub és mtsai. (1999), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk]. Eredmények

A génfilter-mikromátrix analízist hét sclerodermás betegtől vett normál és rendellenes fíbroblaszt-mintákkal hajtottuk végre. Az egyes páciensekből vett mintákban a SARP-1-cDNS átlagos expressziós szintjét az 1/A ábrán, míg az expresszió mediánját az 1/B ábrán mutatjuk be. Az átlag (középérték) és a médián a normális és rendellenes sejtek között jelentős eltérést mutat, mivel a SARP-1 normális expressziós szintje nagyobb, mint a rendellenes expressziós szint. A mediánokat általában a páciensekből származó minták analízisekor használják, mivel minimálisra csökkentik a csoporton belül nagy eltérést mutató minta hatását. Esetünkben rendellenes fíbroblasztok - a tesztelt hét páciens közül ötben - lényegesen kisebb mennyiségű SARP-1-mRNS-t expresszáltak, mint a normál fíbroblasztok.

A mikromátrix-analízissel kapott eredményeket a páciensekből származó minták SARP-1-specifikus PCR-láncindítók alkalmazásával végzett valós idejű PCR-analízissel is igazoltuk. Az eredményeket (Id. 2. ábra) az expressziós szint x-szeres változásaként (rendellenes

-28 minta eredménye osztva a normális minta eredményével) szemléltetjük. A SARP-1 -expresszió a nyolc tesztelt páciens közül hatból származó rendellenes fibroblasztokban legalább kétszeres mértékben volt gátolt az ugyanazon páciensből vett egészséges fibroblasztokhoz képest. A két maradék páciensből származó normális és rendellenes fibroblasztokban az expressziós szint hasonló volt.

Az ugyanazon páciensből származó normális és rendellenes fibroblasztokban megfigyelhető expressziós szint közötti különbségek nem a két sejtpopuláció tenyésztési feltételeinek különbségeiből adódnak, mivel normál humán bör-fibroblasztok elsődleges tenyészeteiben a SARP-l-mRNS expressziója a sejtek passzázsával nem változik jelentős mértékben (Id. 3. ábra). Ezenfelül, a sclerodermás betegek elváltozásos bőréből vett teljes biopsziákból izolált össz-RNS valós idejű, reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakciós analízise - a klinikailag egészséges, életkorra, nemre és anatómiai elhelyezkedésre egyeztetett kontroll biopsziákhoz képest - a SARP-l-mRNS kisebb mennyiségét jelezte (Id. 4. ábra).

Mindezeken túlmenően, statsztikai módszerekkel megállapítottuk, hogy a SARP-1 gátlása 95 %-os valószínűséggel mutatott összefüggést a scleroderma progressziójával.

Következtetések

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a sclerodermás páciensekből származó rendellenes szövetben a SARP-1 hiányzik, ellentétben az egészséges szövettel, ami azt jelzi, hogy a SARP-1 normális koncentrációjának helyreállítása segítheti a betegség gyógyítását. Ilyenformán, a SARP-1 a scleroderma részleges vagy teljes gátlására (vagy a scleroderma legalább egy vagy több tünetének enyhítésére vagy a betegség progressziójának gátlására) szolgáló gyógyszert reprezentálhat.

2. példa

A humán SARP-1-et kódoló teljes hosszúságú cDNS-szekvencia Anyagok és módszerek

A köz számára hozzáférhető humán dbEST-adatbázison szekvenciális BLASTkereséseket hajtottunk végre a SARP-1 részleges kódolószekvenciájával kezdve (EMBL nyilvántartási szám: AFO17986), és a releváns EST-ket ENTREZ alkalmazásával, a http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Search/index.html web-helyen visszakerestük. Az AF017986-OS szekvenciával a következő EST-ket kombináltuk, miáltal a SARP-1 teljes konszenzus kódolószekvenciáját kaptuk: AW580647, AW608301, AA976403 és W92531.

-29A SARP-1 teljes hosszúságú cDNS-kódolószekvenciáját reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakcióval - a fentiek szerint kapott konszenzus-szekvencián alapuló láncindítók [SARP-1F: 5' -GCC AAG CTT CCC ACG ATG CTG CAG GGC CCT (3. azonosítószámú szekvencia); és S ARP-ÍR. 5' -GCG CTC GAG CTA GCA CTG CAG CTT GCG GAT (4. azonosítószámú szekvencia)] 50-50 pmoljának alkalmazásával - 50 μΕ térfogatú reakcióelegyben klónoztuk, melynek összetétele a következő volt; 0,3 mM mindegyik dNTP-ből, 1 mM MgSO4, 5 μΐ normál humán bőr (preputium) fibroblaszt-cDNS templát (melyet a fentebb leírtak szerint kaptunk), 5 μΕ 10X Pfx amplifíkációs puffer (Life Technologies) és 1 μΕ Platinum Pfx DNS-polimeráz (Life Technologies). A reakcióéi egyet 94 °C-on két percig melegítettük, majd 35 ciklus ismétlésével - ciklusonként 94 °C-on 15 másodperces, 55 °C-on 30 másodperces és 68 °C-on 1 perces inkubálással - polimeráz-láncreakciót végeztünk. Az amplifíkált termékeket 1 % agarózgélen IX TAE-pufferben (Life Technologies) analizáltuk, és a megjósolt molekulatömegig (906 bp) vándorló PCR-termékeket Wizard PCR tisztító reagenskészlet (Promega) alkalmazásával tisztítottuk.

A gélen tisztított DNS 100 ng-ját HindlII- és Xhol-endonukleázzal (Pharmacia), a gyártó útmutatásai szerint emésztettük, majd standard molekuláris biológiai eljárásokkal, T4DNS-ligáz (New England Biolabs) alkalmazásával, az - ugyancsak HindlII/XhoI-gyel emésztett - pcDNA3.1(+)-plazmidhoz (Invitrogen) ligáltuk. A ligálási termékeket Biorad Gene Pulser alkalmazásával végzett elektroporációval E. coli TOP 10F' -törzsbe (Invitrogen) transzformáltuk. A kialakult kolóniákból növesztett tenyészetek 5 ml-éből plazmid-DNS-t izoláltunk, és a SARP-1 szekvenciájának megállapítása céljából - T7 és pcDNA3.1AS láncindítópár alkalmazásával - Applied Biosystems 3700 típusú automata szekvenálókészüléken szekvenciaanalízist végeztünk.

Eredmények

A SARP-1-aktivitás in vitro és in vivo karakterizálása céljából klónoztuk a teljes hosszúságú humán cDNS-kódolószekvenciát. A köz számára hozzáférhető dbEST-adatbázisban átfedő EST-k BLAST-programmal végzett azonosítására a humán SARP-1 részleges cDNS-szekvenciáját (EMBL nyilvántartási szám. AF017986) alkalmaztuk. A teljes hosszúságú cDNS-kódolószekvenciát a következő nyilvántartási számú szekvenciákból állítottuk össze; AF017986, AW580647, AW608301, AA976403 és W92531. A SARP-1 teljes hosszúságú DNS-szekvenciáját és az abból leszármaztatott aminosav-szekvenciát folytatólagosan az 5/A és 5/B ábrán mutatjuk be. A SARP-1 cDNS-kódolószekvenciáját reverz transzkriptázos polime

-30ráz-láncreakcióval - a megjósolt start- és stopkodonokat szegélyező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával - klónoztuk. A kapott SARP-1-cDNS-klónok szekvenciaanalízisével nukleotidszekvencia szinten - 93 %-os azonosságot mutattunk ki az egéreredetű SARP-1 közzétett szekvenciájával [Melkonyan és mtsai. (1997)], míg aminosav-szekvencia szintjén 95 “Zoos azonosságot találtunk. A humán és egéreredetű SARP-1 aminosav-szekvenciáját a 6. ábrán, egymás alá rendezve mutatjuk be. A megjósolt aminosav-szekvencia 295 aminosavas, amely SIGNALASE-programmal [Von Heijne (1986)] végzett jóslás alapján 20, SIGNALPprogrammal végzett jóslás alapján 24 aminosavas szignálpeptidet tartalmaz (Id. az 5/A ábrán feltüntetett nyilakat). A 6. ábrán kiemeltük a humán és egéreredetű szekvencia közötti aminosav-különbségeket: ezek az nter-minális szignálpeptidben (négy aminosav), illetve az érett protein szekvenciájában (két aminosav) találhatók.

A szekvencialista 1. azonosítószámú szekvenciája a humán SARP-1-cDNS kódoló szálát, míg a 2. azonosítószámú szekvencia a humán SARP-1 aminosav-szekvenciáját tartalmazza. Az egéreredetű aminosav-szekvenciát az 5. azonosítószámú szekvenciában mutatjuk be.

3. példa

A humán SARP-1 N-terminális szekvenciája

A SARP-1 megjósolt szignálpeptidje 20 vagy 24 aminosavból áll (Id. 5/A ábra). Az érett SARP-1 pontos N-terminálisának meghatározása érdekében HEK-293-sejtekben hat hisztidines jelölőt tartalmazó rekombináns SARP-1-et expresszáltattunk, és a termelődött proteint nikkel-kelát oszlopon tisztítottuk. A tisztított fehéije SDS-PAGE-elektroforézis során 32 kD-os csíkként vándorolt, ami megfelel a tömegspektrometriával meghatározott 34313 Daltonos molekulatömegnek.

A tisztított rekombináns protein N-terminális szekvenciáit Applied Biosystems Model 494 folyadékfázisú impulzusos proteinszekvenáló és 148C típusú on-line feniltiohidantoin aminosav-analizátor alkalmazásával, Maundrell és mtsai. (1997) leírása szerint határoztuk meg. Röviden összefoglalva: a tisztított SARP-1-et 90 pl - 1 M karbamidot, 20 mM metilamint, 1 mM ditiotreitolt és 5 pg tripszint (Boehringer Mannheim, szekvenálási tisztaságú) tartalmazó 100 mM Tris-HCl (pH=8,5) pufferben 37 °C-on egy éjszakás inkubálással emésztettük. A peptideket reverz fázisú, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (Hewlett Packard HP 1090), Brownlee C18-oszlopon (220 x 2,1 mm) választottuk el. A peptideket 0,1 %-os

- 31 trifluorecetsavban acetonitril-gradienssel (0 % —> 55 %, 60 percig; majd 55 % —> 70 %, 5 percig) eluáltuk. A frakciókat összegyűjöttük, és a szcintillációs spektrometriával azonosított, radioaktív ³³P-izotóppal jelölt foszfopeptideket Edman-lebontással, Applied Biosystems Model 494 folyadékfázisú impulzusos proteinszekvenáló és 148C típusú on-line feniltiohidantoin aminosav-analizátor alkalmazásával szekvenáltuk.

A GLFLFGQPDFSYK szekvenciát a redukált és alkilezett protein tripszines emésztményével végzett tandem tömegspektrometria alkalmazásával kaptuk. Az analíziseket NanoSpray ionforrással felszerelt Q-TOF-tömegspektrométer (Micromass UK Limited, Manchaster, Egyesült Királyság) alkalmazásával, Cavalli és mtsai. (2001) leírása szerint hajtottuk végre. Röviden összefoglalva: a tisztított protein 1 pg-ját 10 %-os SDS-poliakrilamid-gélen elektroforizáltuk. A proteincsíkokat kivágtuk az ezüstfestésű gélről, és a gélen tripszinnel emésztettük [Shevschenko és mtsai. (1996)]. A kivont peptidelegyet tandem tömegspektrometriás szekvenálással [Wilm és mtsai. (1996)], Nano-Spray ionforrással felszerelt Q-TOFtömegspektrométer (Micromass, Manchaster, Egyesült Királyság) alkalmazásával analizáltuk Eredmények

Az éretlen SARP-1 elméleti N-terminális szekvenciája a következő:

10 20 30 40

MLQGPGSLLL LFLASHCCLG SARGLFLFGQ PDFSYKRSNC KPIPANLQLC ...

A 2. megjósolt szignálszekvencia hasítási helye a 24. és 25. aminosav (G és L) között található.

A szekvenálási kísérletekben a SARP-1 N-terminálisának jelentős mértékű heterogenitását tapasztaltuk.

Az egyik kísérletben két fő szekvenciát találtunk: az egyik az FGQPD pepiiddel (vagyis a 2. azonosítószámú szekvencia 28. aminosavával), míg a másik az LFGQPD peptiddel (vagyis a 2. azonosítószámú szekvencia 27. aminosavával) kezdődik.

Ezen túlmenően, egy másik tisztított tételben négy szekvenciát találtunk: LFLFGQPDFS (amely a 25. aminosawal kezdődik);

FLFGQPDFS (amely a 26. aminosawal kezdődik);

LFGQPD (amely a 27. aminosawal kezdődik);

FGQPD (amely a 28. aminosawal kezdődik).

Létezik egy további szekvencia is, amely a 37. aminosawal kezdődik: RSNCKPIPAN, amely lizin utáni (tripszin-szerű) hasítás eredménye.

-32Egy másik kísérletben a 24. pozícióban lévő aminosawal kezdődő szekvenciát mutattunk ki: GLFLFGQPDFSYK.

Ilyenformán, a SARP-1 N-terminálisa nagyon heterogén, ami a SARP-1-re jellemző endopeptidáz- vagy proteáz-aktivitásnak is betudható. Az érett SARP-1 különböző Nterminálisokat tartalmazó, különféle változatok formájában fordul elő.

4. példa

A SARP-1-gyei végzett transzfekció in vitro apoptózist indukáló hatása Módszerek

Fibroblaszt-sejtvonalakat (egéreredetű NIH3T3-sejtek és humán AG1518-sejtek) és elsődleges fibroblaszt-tenyészeteket (normál humán bőrfibroblasztok, 1-5. passzálás; Promocell) - Geneporter 2 (Gene Therapy Systems, San Diego) vagy Fugene 6 transzfekciós reagens (Life Technologies) alkalmazásával - SARP-1-et kódoló cDNS-szekvenciát tartalmazó pcDNA3.1-plazmiddal vagy csak pcDNA3.1-plazmiddal (negatív kontrollként alkalmazott üres vektor), a gyártók útmutatásai szerint transzfektáltunk. Az apoptózist a transzfekció után 24 órával, TiterTacs 96 üregű apoptózis-tesztelő reagenskészlet (R&D Systems) alkalmazásával mértük, és a sejteket CyQuant-festék (Molecular Probes) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint számláltuk.

Eredmények

A SARP-1 fibroblasztokra gyakorolt hatásának vizsgálata céljából fibroblaszt-sejtvoanalt SARP-1-cDNS-sel transzfektáltunk, és mértük a kiváltott apoptózis mértékét. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. A SARP-1-gyei transzfektált sejtekben az apoptózis a pcDNA3.1-plazmiddal ál-transzfektált sejtekben megfigyelt apoptózishoz viszonyítva jelentős mértékben csökkent (P = 0,0009), ami azt jelzi, hogy a humán SARP-1 aktivitása hasonló az egéreredetű homológjáról leírt aktivitáshoz. Az apoptózis alapszintjét transzfektálatlan sejtekben határoztuk meg. Pozitív kontrollként a nukleázzal kezelt NIH3T3-sejtek szolgáltak. A 7. ábrán látható grafikonon a jelöletlen oszlop a háttérfestődés mértékét mutatja. A nukleázzal kezelt oszlop a pozitív kontroll eredményét mutatja.

5. példa

A SARP-1 hatása a TGF-βΙ-termelődésre

A TGF-βΙ egy profibrotikus citokin, amelynek termelődése scleroderma esetében fokozott mértékű, és amelyet korábban a scleroderma patogenezisével hoztak összefüggésbe [Kawakami és mtsai. (1998)]. A fibroblasztokban a SARP-1 TGF-βΙ-termelődést vagy -szekréciót gátló hatásának értékelése céljából fibroblaszt-tenyészetekhez - tisztított alakban SARP-1-proteint adagolhatunk. Más lehetőség szerint, a sejteket SARP-1-cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzfektálhatjuk, biztosítva ezáltal, hogy a sejttenyészetben megfelelő mennyiségű SARP-1 termelődjön. Egy további lehetőségnek megfelelően, a fibroblaszttenyészetekhez SARP-1-termelő sejtek tápközegét (adott esetben töményített formában) adhatjuk. Az ilyen kísérletekben egészséges vagy beteg személyekből (vagy sclerodermás páciensek normális vagy rendellenes bőréből) származó fibroblaszt-tenyészeteket vagy primer fibroblasztokat alkalmazhatunk.

A TGF-βΙ mennyiségét a tenyésztett sejtek kondicionált tápközegében ELISAteszttel, a TGF-β 1-hez kifejlesztett Quantikine ELISA-rendszer (R&D systems) alkalmazásával határozhatjuk meg (katalógusszám: DB 100).

6. példa

A SARP-1 adagolásának in vitro hatása az MMP-1-aktivitásra humán fibroblasztokban Módszerek

A humán SARP-1 - 3' -végén hat hisztidines toldalékot kódoló szekvenciát magában foglaló - cDNS-ét a pDEST Fastbac elnevezésű baculovírus-transzfer vektorba klónoztuk. A C-terminálisán hat hisztidines toldalékot tartalmazó SARP-1-proteint a rekombináns baculovírussal fertőzött Sf5-rovarsejtekben termeltettük, és Ni-NTA affinitási kromatográfiával tisztítottuk.

Sclerodermás betegek elváltozásos vagy normális bőréből, illetve egészséges személyekből származó, korai passzálású (2-5 passzálás) humán fibroblasztokat24 órán keresztül 0, 100 vagy 1000 ng/mL rekombináns SARP-1-gyei kezeltünk. A kondicionált tápközeg összegyűjtése után a sejtüledéket 1200-as percenkénti fordulatszámmal 4 °C-on 10 percig végzett centrifügálással eltávolítottuk, és az MMP-1-aktivitást a hígítás nélküli tenyésztő tápközegben MMP-1 fluorokin reagenskészlet (R&D systems) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint mértük. Ugyanezen mintákban meghatároztuk az ΜΜΡ-9-aktivitást is.

.:.. ·..· ..· ·τ .:.

-34Eredmények

Az MMP-1 felelős az I. típusú kollagén lebontásáért, ami azt jelzi, hogy az MMP-1 aktivitás csökkentése hozzájárul a scleroderma egyik alapvető - túlzott kollagén-lerakódással járó - defektusához.

A sclerodermában szenvedő páciensekből származó bőrfibroblasztok az egészséges személyekből izolált, illetve az ugyanazon beteg elváltozás nélküli bőréből izolált fibroblasztokhoz képest - csökkent mértékben expresszálják az MMP-1-et (mRNS és protein szintjén egyaránt). Bár a detektálható összes aktív MMP-1 páciensről páciensre igen változó volt, a SΑΕΡΙ-gyei kezelt fibroblasztokban nagyobb MMP-1-aktivitást figyeltünk meg, mint a kezelés nélküliekben - ez érvényes volt a sclerodermás páciensekből származó rendellenes fibroblasztokra (8/A, 8/D és 8/F ábra), a sclerodermás páciensek elváltozás nélküli, egészséges bőréből származó fibroblasztokra (8/E ábra), valamint a klinikailag egészséges, kontroll személyekből származó fibroblaszokra (8/B és 8/C ábra). Az ábrákon feltüntetett eredmények háromszori ismétléssel végzett kísérletek középértékeit reprezentálják. Az MMP-l-gyel ellentétben, a SARP-1 az ΜΜΡ-9-aktivitásra nem volt hatással (ábrát nem közlünk).

7. példa

A SARP-1-cDNS-sel végzett transzfekció NIH3T3-fibroblasztokban csökkenti a kollagén1α2-típusú promoter aktivitását

Anyagok és módszerek mM glutamint, 100 egység/mL penicillin-sztreptomicint és 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápközegben tartott NIH3T3-sejteket áttetsző aljú, fehér falú, szövettenyészeti minőségű 96 üregű tálcákra (Wallac) szélesztettük (50 %-os konfluens állapotban). A következő napon a sejteket a pcDNA3.1-SARP-l-plazmiddal és - a 3,5 kb-os kollagén-promótert és luciferáz-riportergént (Dr. David Abraham szíves adománya, Royal Free Hospital) tartalmazó - pGL3-vektorral (Promega) együttes transzfekciónak vetettük alá. A transzfekciót Geneporter transzfekciós reagens alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint hajtottuk végre. A transzfekció után 30 órával a sejtekhez 5 ng/mL TGFP-t (R&D systems) adtunk. A luciferáz-aktivitást 24-36 órával később, közvetlenül az üregekben, Bright-Glo tesztrendszer (Promega) alkalmazásával mértük.

Eredmények

Annak vizsgálata céljából, hogy van-e összefüggés a SARP-1 túlzott mértékű expressziója és a kollagénszintézis között, a SARP-1-cDNS-sel végzett transzfekció kollagén

-35promóter-aktivitásra gyakorolt hatását - Colla2-promóter/luciferáz-riportergén konstrukcióval együttesen transzfektált - NIH3T3-fibroblasztokban értékeltük.

A SARP-1-cDNS kollagén-promóter/luciferáz-riportergén konstrukcióval együttes transzfekciójával végzett kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a SARP-1 nemcsak az alapvető kollagénpromóter-aktivitást volt képes szupresszálni, hanem a kollagén-promóteraktivitás TGFP-indukálta fokozódását is (Id. 9. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a SARP1-géntermék - akár közvetlenül, akár SARP-1-közvetítette jelátviteli eseményeken keresztül közvetve - szerepet játszhatnak a kollagénpromóter-aktivitás in vitro szabályozásában.

A SARP-1 kollagénlerakódásra és/vagy -szintézisre és/vagy -szekrécióra fibrolbasztokban kifejtett hatása tesztelésének egy másik lehetősége szerint a fibroblasztok tenyészetéhez tisztított SARP-1-et adunk. Más módon, a fíbroblasztokat SARP-1-cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral transzfektálhatjuk, ezáltal biztosítva a megfelelő SARP-1-koncentrációt a sejttenyészetben.

További lehetőségként a fibroblaszt-tenyészethez SARP-1-et termelő sejtek tápközegét adhatjuk (amelyet a kellő SARP-1-koncentráció elérése érdekében betöményíthetünk). E kísérletben fibroblaszt-sejtvonalakat vagy az egészséges vagy beteg személyekből (illetve sclerodermás páciens egészséges vagy elváltozásos bőréből) származó primer fíbroblasztokat alkalmazhatunk.

A kollagén-szintézis humán fibroblasztok tenyészetében befogásos ELISA-rendszer (Southern Biotechnology Associates Inc.-től vásárolt antitestek) alkalmazásával, Shi-wen és mtsai. (1997) leírása szerint mérhető.

8. példa

A SARP-1-et túltermelő vagy rekombináns humán SARP-1-gyei kezelt humán bőrfibroblasztokban módosul a sclerodermával összefüggő gének mRNS-expressziója Anyagok és módszerek

Normál humán bőreredetű (preputium) fíbroblasztokat fibroblaszt-tenyésztő tápközegben (Promocell) tartottunk. A fíbroblasztokat 4 vagy 24 órán át - humán TGF31 jelenlétében vagy hiányában - rekombináns humán SARP-1-gyei (100 ng/mL) kezeltük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és Trizol™-reagens (Life Technologies) alkalmazásával, a gyártó útmutatása szerint össz-RNS-t izoláltunk belőlük. A RNS-ből a fentebb leírtak szerint ³²P-dATP-vel

- 36 jelölt cDNS-próbát készítettünk, és a fentiek szerint humán citokin gélfílter-mikromátrixhoz (R&D systems) hibridizáltattuk.

Eredmények

Bár a SARP-1-et eredetileg apoptózissal összefüggő proteinként írták le, pontos 5 funkciója ismeretlen. A SARP-1 sclerodermában betöltött szerepének megismerése céljából - a scleroderma-fenotípus utánzása érdekében TGFP-val előkezelt - humán bőrfíbroblasztokban mértük a SARP-1 fibroblasztok génexpressziójára gyakorolt hatását.

A 4. táblázatban a fibroblasztok - scleroderma-fenotípus utánzása céljából használt TGFct-val végzett előkezelés után négy órával - SARP-1-gyei végzett kezelése által befolyásolt 10 mRNS-eket mutatjuk be. E feltételek mellett a TGFa és az FGF5 gátlás alá került. Az endoglin (egy TGF31-kötő protein) csökkent mértékű expresszióját, a furin (mátrix-metalloproteázok aktiválásával összefüggő proteáz) fokozott mértékű expresszióját tapasztaltuk. A TARCmRNS szintén gátlás alá került. Ez a kemokin a bőrben lévő T-sejtek gyulladásos helyekre történő toborzásáért felelős. Ezek alapján elképzelhető, hogy a SARP-1 adagolása gyulladás- csökkentő hatású lehet. A TNFRl-alegység-mRNS serkentését szintén megfigyeltük. Ennek jelentősége nem világos, mivel a szakirodalmi adatok alapján ellentmondásos, hogy a TNF kóros vagy védő szerepet játszik a sclerodermában.

Egy külön kísérletben (melynek eredményeit nem mutatjuk be) a sclerodermás páciensekből származó fibroblasztokban lévő gének szabályozását egészséges kontroll fibroblasztok 20 génjeinek szabályozával hasonlítottuk össze. Érdekes módon, azt találtuk, hogy a 4. táblázatban bemutatott, szabályozott gének a slceroderma-mintákban szabályozottnak bizonyultak. Azok a gének, amelyek expressziója a sclerodermás fibroblasztokban serkentve volt, a fenti modellben a SARP-1-expressziót követően gátlás alá kerültek, míg az eredetileg gátolt gének expressziójára a SARP-1-expresszió, éppen ellenkezőleg, serkentő hatást gyakorolt. Ez tovább 25 erősíti a SARP-1 jótékony hatását a scleroderma kezelésében.

-37 4, táblázat

Arány*	TGFP-val kezelt sejtek	TGFp-val és SARP-1-gyei kezelt sejtek	Gén
-1,6	1346	830	FGF-5
-2,7	788	297	endoglin
3,3	157	515	TNFRI
3,3	128	428	furin
-4,6	275	60	TGFa
-4,7	164	34	TARC

* SARP-l/ál-transzfektált arány a TGFa-val és SARP-1-gyei kezelt/csak TGFa-val kezelt arányt reprezentálja. A bemutatott eredmények két független kísérletben kapott eredményeken alapulnak.

9. példa

A SARP-1 in vivo hatásának vizsgálata a scleroderma egérmodelljében

A belomicinnel indukált tüdőelváltozás a scleroderma elfogadott modellje. A betegséget bleomicin intratracheális adagolásával indukáltuk [Hattori és mtsai. (2000)]. A kezelt egerek tüdejében (legkésőbb a 7. nap körül) gyulladásos reakció alakul ki, melyet - az indukció után kb. 14 nappal tetőző - fibrózis követ. Ezt a modellt alkalmaztuk a SARP-1 adagolásának tüdőfibrózis kialakulására gyakorolt in vivo hatásának tanulmányozására. A SARP-1 in vivo termeltetésére sejtes célbajuttató rendszert (teljes hosszúságú SARP-l-cDNS-sel transzfektált NIH3T3-sejtek) alkalmaztunk.

Módszerek

Állatok kezelése

A tüdőfibrózis indukálása céljából 20-25 gramm testtömegű egereknek a kísérlet 1 napján intratracheálisan bleomicint (0,075 NE) adtunk be. Az egereket négy csoportra osztottuk (csoportonként 10 egér). Az egyik csoportba tartozó egereknek intraperitoneális injekcióval 10⁶ - SARP-l/pcDNA3.1-plazmiddal transzfektált - NIH3T3-sejtet adtunk be. A második csoportban 10⁶ ál-transzfektált (pcDNA3.1-vektorral) NIH3T3-sejtet adtunk be; a harmadik csoportnak 250 μg anti-TGFp antitestet (Anti Pan TGFP; Sigma, katalógusszám: T9429) adagoltunk, míg a negyedik csoportba tartozó egereket sóoldattal kezeltük. A kísérlet 14. napján valamennyi egeret leöltük, tüdejüket formaiinban fixáltuk, és szövettani vizsgálat céljából pa- 38 raffinba ágyaztuk. A tüdőmetszeteket tri-chrome vagy picro sirius red for collagen színezékekkel festettük (Id. Bancroft és Stevens: Theory and Practice of Histological Techniques), és pontoztuk a tüdőfibrózis mértékét.

NIH3T3-sejtek transzfektálása

A NIH3T3-sejteket a fentebb leírtak szerint, Geneporter 2 reagens alkalmazásával, SARP-l/pcDNA3.1-plazmiddal vagy csak pcDNA3.1-vektorral transzfektáltuk. A transzfekció után 24 órával a tenyésztő tápközeget eltávolítottuk, és a sejteket 37 °C-on 5 percig 1 mM EDTA-t tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal kezeltük. A sejteket sejtkaparóval (Costar) óvatosan leválasztottuk az edény faláról, 4 °C-on 4 percig centrifugáltuk, majd a sejtüledéket 10⁷ sejt/ml sejtsűrűséggel injekcióhoz való sóoldatban újraszuszpendáltuk.

Eredmények

A SARP-1 védettséget nyújt a bleomicinnel indukált tüdőfíbrózissal szemben

A csak belomicinnel kezelt, illetve az ál-transzfektált NIH3T3-sejtekkel kezelt egerekben jelentős tüdőfibrózis fejlődött ki (adatokat nem közlünk). A TGFpl-et a fibrózishoz vezető patológiai változásokért felelős egyik kulcsfontosságú anyagnak tartjuk. Korábban egy poliklonális anti-TGFpl antitestről kimutatták, hogy megelőzésszerű adagolás esetén védettséget biztosít a tüdőfíbrózissal szemben [Yamamoto és mtsai. (1999)], a scleroderma GvHDmodelljében pedig csökkenti a bőrfibrózist [McCormick és mtsai. (1999)]. Ennek megfelelően, kísérleteinkben pozitív kontrollként ezt az antitestet alkalmaztuk. Az anti-TGFp antitesttel kezelt egerekben kiterjedt tüdőfibrózis nem alakult ki. A SARP-1-gyei transzfektált sejtekkel kezelt egerekben a tüdő fíbrotikus elváltozásainak száma - a csak bleomicinnel, illetve az áltranszfektált sejtekkel kezelt egerekhez viszonyítva - jelentős mértékben csökkent. A hatás hasonló vagy még jobb volt, mint az anti-TGFp antitesttel végzett kezelés esetében (az adatokat nem mutatjuk be).

Az egerek tüdejének szövettani analízise azt mutatta, hogy a SARP-1-gyei kezelt állatokban a tüdők csaknem normális morfológiájúak voltak, csekély gyulladásos beszűrödéssel és többségében normális alveolaris architektúrával. Ez a morfológia az anti-TGFp antitesttel kezelt állatok tüdejének morfológiájára emlékeztet, és élesen eltér az ál-transzfektált sejtekkel kezelt, illetve a kezelés nélküli állatokban megfigyelt morfológiával. Az utóbbi két csoportban az alveolaris terek celluláris infiltrátummal és kollagénlerakódással voltak feltöltve (ábrákat nem közlünk).

.:.. ’..· ·τ .:.

-39A különböző kísérleti csoportokba tartozó egerek tüdejének fibrotikus elváltozásainak számát a 10. ábrán szemléltetjük. A SARP-l-gyel kezelt egerek tüdejében jóval kevesebb fibrotikus elváltozást találtunk, mint a sóoldattal vagy anti-TGFp antitesttel kezelt egerek tüdejében.

A bleomicin adagolása fokozott mortalitást eredményezhet. A SARP-1 fibrózissal szembeni védő hatásai mellett megfigyeltük azt is, hogy a SARP-l-gyel kezelt egerek nagyobb arányban élték túl a kezelést (tíz egér közül nyolc), mint a sóoldattal kezelt egerek (tízből hat), az anti-TGFP-val kezelt egerek (tízből négy) és az ál-transzfektált sejtekkel kezelt egerek (tízből három). Ilyenformán, a SARP-l-gyel végzett kezelés a tüdőfibrózis-modellben védelmet nyújtott az elhullással szemben is, ami azt jelzi, hogy e kísérleti rendszerben a SARP-l-gyel végzett kezelés egyértelműen jobb az anti-TGFP antitesttel végzett kezelésnél.

Összegzésül: a scleroderma elfogadott in vivo modelljében sikerült bizonyítani a SARP-1 jótékony hatását.

A SARP-l-adagolás hatásának tesztelésére további in vivo modellek alkalmazhatók, mint pl. a sclerodermaszerű graft-versus-host betegség (Scl GVHD) egérmodell, amelyben reprodukálhatók a scleroderma lényeges tulajdonságai, úgymint a bőrvastagodás, a tüdőfibrózis és a bőrkollagén-mRNS serkentése, amelyet megelőz a monocita-infiltráció és a bőreredetű TGFβΙ-mRNS serkentése. E modell részletes leírását illetően Id. McCormick és mtsai. (1999).

10. példa

A SARP-1 szisztémás adagolása expressziós plazmid-DNS intramuszkuláris injektálásával

A SARP-1 sclerodermával szembeni védőfaktorként betöltött szerepének bizonyítása céljából egereket in vivo egéreredetű SARP-1-cDNS-t tartalmazó plazmiddal transzfektáltunk, és az eredményeket a - kontrollként - üres plazmiddal transzfektált egerek esetében kapott eredményekkel hasonlítottuk össze.

A plazmidokat korábbi leírás szerint [Id. Dimmeler és mtsai. (1997); Mir és mtsai. (1999)] érzéstelenített egerek sípcsonti és koponyái izmaiba injektáltuk. Röviden összefoglalva: a láb mindkét oldalán, egymástól 4,2-5,3 mm-re elhelyezett rozsdamentes acél lapelektródák alkalmazásával, PS-15 elektropulzáló készülékkel transzkután elektromos impulzusokat gerjesztettünk (nyolc, egyenként 200 V/cm-es, 20 msec időtartamú, 2 Hz-es négyszöghullámimpulzus).

• · · · · *· · · • ·· · · · « * * ··»

-40Ezt követően, mind a SARP-1-gyei transzfektált, mind az ál-transzfektált állatokban megfigyeltük a belomicinnel indukált tüdőfibrózist (Id. az előző példában) és a betegség előrehaladását.

-41 Hivatkozások listája

1. Abraham D., Lupoli S., McWhirter A', Plater-Zyberk C., Piela T.H., Korn J.H., Olsen I. and Black C. (1991) Expression and function of surface antigens on scleroderma fibroblasts. Arthritis Rheum. 34,1164-1172.

2. Abraham DJ, Shiwen X, Black CM, Sa S, Xu Y, Leask A.J Biol Chem. 2000 May 19;275(20):15220-5.

3. Adler P.N. , Charltop J and Vinson C. (19§7) Dev. Genet. 8, 99-119.

4. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al. Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

5. Bafico B.A., Gazit A., Pramila T., Finch P.w., Yaniv A. and Aaronson S.A. (1999) Interaction of frizzled related protein (FRP) with Wnt ligands and the frizzled receptor suggests alternative mechanisms for FRP inhibition of Wnt signalling. J.Biol. Chem. 274, 16180-16187.

6. Bancroft J.D. and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone, England.

7. Banyai L. and Patthy L. (1999) The NTR module: domains of netrins, secreted frizzled related proteins and type I procollagen C-proteinase enhancer protein are homologous with tissue inhibitors of metalloproteases: Protein Sci. 8, 1636-1642.

8. Black C.M and Denton C.P. (1998) Systemic sclerosis and related disorders. In Oxford textbook of Rheumatology (P.G. Maddison, D.A. Isenberg, P.Woo and D.N. Glass, Eds.) pp 771-789, Oxford Univ. Press, New York.

9. Cavalli V, Vilbois F, Corti M, Marcote MJ, Tamura K, Karin M, Arkinstall S, Gruenberg J. Mol Cell 2001 Feb;7(2):421-32

10. Chang, J. T.; Esumi, N.; Moore, K.; Li, Y.; Zhang, S.; Chew, C.; Goodman, B., Rattner, A.; Moody, S.; Stetten, G.; Campochiaro, P. A.; Zack, D. J. : Cloning and characterization of a secreted frizzled-related protein that is expressed by the retinal pigment epithelium. Hum. Molec. Genet. 8: 575-583, 1999

11. Clements P.J. and Furst D.E. (1996) “Systemic Sclerosis” Williams and Williams, Baltimore.

12. Devereux J et al. Nucleic Acids Res, 12, 387-395,1984.

7. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the ’response to injury¹ hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

13. Finch P.W., He X., Kelley M.J., Uren A.,Schaudies R.P., Popescu N.C., Rudikoff S., Aaronson S.A., Varmus H.E. and Rubin J.S. (1997) Purification and molecular cloning of a screted frizzled related antagonist of Wnt action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6770-6775.

14. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Colter H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri., MA, Bloomfield CD, Lander ES (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531-7.

15. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

16. Hattori N., Degen J.L., Sisson T.Hl, Liu H., Moore B.B., Pandrangi R.G., Simon R.H. and Drew A.F. (2000) Bleomycin induced pulmonary fibrosis in fibrinogen null mice. J. Clin. Invest. 106, 1341-135

17. Kawakami T., Ihn H., Xu W., Smith E. , LeRdy C. and Trojanowska M (1998) Increased expression of TGF beta receptors by scleroderma fibroblasts: evidence for contribution of autocrine TGF-beta signalling to scleroderma phenotype. J. Invest. Dermatol. 10, 47-51.

18. Krein, PM, Huang Y amd Winston BW (2001). Expért Opin. Ther. Patents 11(7): 1065-1079.

19. Leighton, C. Drugs 2001 61(3), 419-427.

20. LeimeisterC, Bach A, Gessler M. Meeh Dev 1998 Jul;75(1-2):29-42.

21. LeRoy E.C. (1974) Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in vitro. J. Clin. Invest. 54, 880-889.

22. Lin K, Wang S, Julius MA, Kitajewski J, Moos M Jr, Luyten FP, Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Oct 14;94(21 ):11196-200.

23. Martini, Maccario, Ravelli et al.. Arthritis Rheum. 1999,42, 807-811.

24. McCormick LL, Zhang Y, Tootell E, Gilliam AC J. Immunol. 163(10) 5693 (1999).

25. Melkonyan H.S., Chang W.C., Shapiro J.P., Mahadevappa M., Fitzpatrick P.A., Kiefer M.C., Tomei L.D. and Umansky S.R. (1997) SARPs: a family of secreted apoptosis-related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,13696-13641.

26. Miller J.R., Hocking Á.M., Brown J.D. and Moon R.T. (1999) Mechanism and fuunction of signa) transduction by the Wnt/D catenin and Wnt/Ca2+ pathways. Oncogene 18, 7860-7872.

8. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.

9. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99,1990

10. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988

27. Rattner A., Hsieh J-C., Smallwood P.M., Gilbert D.J., Copeland N.G., Jenkins N.A., Nathans J. (1997) A family of secreted proteins contain homology to the cysteine rich ligand binding domain of frizzled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 28592863.

28. Shevchenko A., Wilm M.« Vorm O. and Mann M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68:850-858

Silman A.J. (1991) Moratlity from scleroderma in England and Wales 1968-1975. Ann. Rheu. Dis. 50, 95-96. ,

30. Shi-wen X-, Denton C.P., McWhirter A., Bou-Gharios G.. Abraham D.J., du Bois R.M.

and Black C.M. (1997) Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated and dysregulated collagen type I biosynthesis. Arthritis Rheum. 40,1237-1244.

31. Shi-wen X., Denton C.P., Dashwood M.R., Holmes A., Bou-Gharios G..Pearson J.D., Black C.M. and Abraham D.J. (2000) Fibroblast matrix gene expression and connective tissue remodelling: role of endothelin-1. J. Invest. Dermatol, (in press).

32. Smalley M.J. and Dale T.C. (1999) Wnt signalling in mammalian development and cancer. Cancer and Metastasis Rev. Ϊ8, 215-230.

33. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981. Advances in Applied Mathematics, 2,482-489,1981.

34. Strehlow D. and Korn J (1998) Biology of the scleroderma fibroblast. Curr. Opin. 25 Rheumatol. 10, 572-578.

35. Smith, Textbook of the Autoimmune Diseases, Edited by Lahita, Chiorazzi and Reeves, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2000.

36. Von Heijne G. (1986) Nucleic Acids Res. 14,4683-4690.

37. Wigley F. M. and Sule S. D. (2001) Expert Opinions on Investigational Drugs 10(1)

31-48.

__________________₃₈. Wigley F.M. and Boling C.L (2000) The treatment of scleroderma. 2, 276-292._____________________ 39. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve T.. Breit S., Schweigerer L., Fotsis T. and Mann

M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nanoelectrospray mass spectrometry. Nature, 379:466-469

E. ·./ ^:*r J.

40. Yamamoto T.S., Takagawa L., Katayama I. and Nishioka K. (1999) Anti-sclerotic effect of transforming growth factor-D antibody in a mouse model of bleomycin induced scleroderma. Clin Immunol. 92, 6.

Claims (29)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. (1) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) pontok szerinti aminosav-szekvenciáktól kizárólag konzervatív aminosav-szubsztitúciókban tér el;

   (m) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének izoalakja, fúziós proteinje vagy aktív részlete.

   (1) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) pontok szerinti aminosav-szekvenciáktól kizárólag konzervatív aminosav-szubsztitúciókban tér el;

   (m) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének sója vagy izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív részlete vagy cirkulárisán permutált származéka.

   1. Humán SARP-1-receptorhoz kötődő vagy annak jelátviteli reakcióútját beindító, vagy az endogén SARP-1 felszabadulását serkentő vagy aktivitását elősegítő anyag alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
2. 2. Egy anyag alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, mely anyag a következők bármelyike:

   (a) érett SARP-1-protein;

   (b) a 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid, (c) a 2. azonosítószámú szekvencia 21-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (d) a 2. azonosítószámú szekvencia 24-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (e) a 2. azonosítószámú szekvencia 25-295. aminosavait tartalmazó polipeptid, (f) a 2. azonosítószámú szekvencia 26-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (g) a 2. azonosítószámú szekvencia 27-295. aminosavait tartalmazó polipeptid, (h) a 2. azonosítószámú szekvencia 28-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (i) a 2. azonosítószámú szekvencia 37-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (j) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) szekvenciák legalább egyikével legalább 40 %-ban, legalább 50 %-ban, legalább 60 %-ban, legalább 70 %-ban, legalább 80 %-ban vagy legalább 90 %ban azonos;

   (k) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelyet olyan DNSszekvencia kódol, amely mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens feltételek mellett hibridizál az (a)-(i) pontok bármelyike szerinti molekulát kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével;
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint egy vagy több helyen glikozilált anyagot alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint fúziós proteinként immunglobulin (lg) fúziós partnert tartalmazó fúziós proteint alkalmazunk.

   -46-....···>· .:.
5. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint funkcionális származékként az aminosavak egy vagy több oldalláncán elhelyezkedő egy vagy több funkciós csoporthoz kapcsolva legalább egy gyököt tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint polietilén-gyököt tartalmazó funkcionális származékot alkalmazunk.
7. 7. Nukleinsav-molekula alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, mely nukleinsav-molekula a következők egyikét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciát tartalmaz:

   (a) érett SARP-1-protein;

   (b) a 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

   (c) a 2. azonosítószámú szekvencia 21-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (d) a 2. azonosítószámú szekvencia 24-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (e) a 2. azonosítószámú szekvencia 25-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (f) a 2. azonosítószámú szekvencia 26-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (g) a 2. azonosítószámú szekvencia 27-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (h) a 2. azonosítószámú szekvencia 28-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (i) a 2. azonosítószámú szekvencia 37-295. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (j) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelynek aminosavszekvenciája az (a)-(i) szekvenciák legalább egyikével legalább 40 %-ban, legalább 50 %-ban, legalább 60 %-ban, legalább 70 %-ban, legalább 80 %-ban vagy legalább 90 %ban azonos;

   (k) az (a)-(i) pontok szerinti molekulák bármelyikének muteinje, amelyet olyan DNSszekvencia kódol, amely mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens feltételek mellett hibridizál az (a)-(i) pontok bármelyike szerinti molekulát kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével;
8. 8. A 7. igénypontban ismertetett nukleinsav-molekulát tartalmazó vektor alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
9. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint expressziós vektort alkalmazunk.
10. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint génterápiás vektort alkalmazunk.
11. 11. Az 1. vagy 2. igénypontban ismertetett polipeptid alkalmazása sejtbeni endogén termelődésének indukálására és/vagy serkentésére alkalmas vektor alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
12. 12. A 8-11. igénypontok bármelyikében ismertetett vektort tartalmazó sejt alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
13. 13. Az 1-4. igénypontok bármelyikében ismertetett anyagot expresszáló sejt alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
14. 14 1-4. igénypontok bármelyikében ismertetett polipeptid termelése céljából genetikailag módosított sejt alkalmazása scleroderma kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerinti a megadott anyagokat sclerodermaként szisztémás sclerosis kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására alkalmazzuk.
16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerinti a megadott anyagokat olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely egyidejű, egymás utáni vagy elkülönített használatra interferont is tartalmaz.
17. 17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a megadott anyagokat interferon-3-t is tartalmazó gyógyszer előállítására alkalmazzuk.
18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint a megadott anyagokat olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely egyidejű, egymás utáni vagy elkülönített használatra tumornekrózis-faktor (TNE) antagonistát is tartalmaz.
19. 19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a megadott anyagokat TNFantagonistaként TBPI-et és/vagy TBPII-t tartalmazó gyógyszer előállítására alkalmazzuk.
20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint a megadott anyagokat olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely egyidejű, egymás utáni vagy elkülönített használatra scleroderma elleni hatóanyagot is tartalmaz.
21. 21. A 20. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a megadott anyagokat olyan gyógyszer előállítására alkalmazzuk, amely scleroderma elleni hatóanyagként a következők bármelyikét tartalmazza: ACE-gátlók, kalciumcsatorna-blokkolók, protonpumpa-inhibitorok, NSAID-k, COX-inhibitorok, corticosteroidok, tetraciklin, pentoxifillin, bucillamin, geranilgeranil transzferáz inhibitorok, rotterlin, prolil-4-hidroxiláz inhibitorok, c-proteináz inhi- .ΰ. ·.*· ”· ··]·

    -48bitorok, lizil-oxidáz inhibitorok, relaxin, halofiiginon, prosztaglandinok, prosztaciklinek, endothelin-1, nitrogén(II)-oxid, angiotenzin-II inhibitorok és antioxidánsok.
22. 22. Gyógyászati készítmény scleroderma (közelebbről, szisztémás sclerosis) kezelésére és/vagy megelőzésére, amely készítmény a 7-11. igénypontok bármelyikében ismertetett nukleinsav-molekulát tartalmazó vektort, és, adott esetben, egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, diluendumot vagy segédanyagot tartalmaz.
23. 23. Gyógyászati készítmény scleroderma (közelebbről, szisztémás sclerosis) kezelésére és/vagy megelőzésére, mely készítmény az 1-4. igénypontok bármelyikében ismertetett polipeptidet termelő sejtet, és, adott esetben, egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, diluendumot vagy segédanyagot tartalmaz.
24. 24. Gyógyászati készítmény, amely az 1-6. igénypontok bármelyikében ismertetett anyagot a következő, scleroderma elleni hatóanyagok bármelyikével kombinálva tartalmaz: ACE-gátlók, kalciumcsatorna-blokkolók, protonpumpa-inhibitorok, NSAID-k, COXinhibitorok, corticosteroidok, tetraciklin, pentoxifíllin, bucillamin, geranilgeranil transzferáz inhibitorok, rotterlin, prolil-4-hidroxiláz inhibitorok, c-proteináz inhibitorok, lizil-oxidáz inhibitorok, relaxin, halofiiginon, prosztaglandinok, prosztaciklinek, endothelin-1, nitrogén(II)-oxid, angiotenzin-II inhibitorok és antioxidánsok.
25. 25. Eljárás scleroderma, közelebbről, szisztémás sclerosis kezelésére és/vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy egy arra rászoruló páciensnek 1-6. igénypontok bármelyikében ismertetett anyag hatásos mennyiségét - adott esetben gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval együtt - adagoljuk.
26. 26. Eljárás scleroderma, közelebbről, szisztémás sclerosis kezelésére és/vagy megelőzésére, azzal jellemezve, hogy egy arra rászoruló páciensnek 22-24. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítményt adagolunk.
27. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot vagy gyógyászati készítményt szisztémásán adagoljuk.
28. 28. A 25. vagy 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot vagy gyógyászati készítményt intramuszkuláris injektálással adagoljuk.
29. 29. A 25. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot vagy gyógyászati készítményt inhalálással adagoljuk.

    DrJPethö Árpád í / J -j ^7 szabadalmi ügyvivő /