HUP0302396A2

HUP0302396A2 - Transzgénikus úton előállított dekorin

Info

Publication number: HUP0302396A2
Application number: HU0302396A
Authority: HU
Inventors: Harry M. Meade; Michael Pierschbacher
Original assignee: Gtc Biotherapeutics, Inc.; Integra Lifesciences Corp.
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-05-04
Publication date: 2003-10-28
Also published as: CA2408124A1; NO20025289D0; AU5946501A; AU2001259465B2; US20050160483A1; EP1282433A4; MXPA02010907A; WO2001085192A1; CN1431911A; NZ522971A; NO20025289L; EP1282433A1; KR20030060772A; IL152429A0; BR0110577A; US20040205832A1; JP2003532681A

Abstract

A találmány tárgyát transzgénikus úton előállított dekorin éstranszgénikus úton előállított dekorin előállítására és alkalmazásáraszolgáló eljárások képezik. A találmány szerinti megoldás alkalmasTGF-b által indukált sejtproliferáció és extracelluláris mátrixtermelődésének megakadályozására, valamint ezzel kapcsolatosbetegségek kezelésére. Ó

Description

P03 02396

Képviselő:

Danubia

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

A k

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

Transzgénikus úton előállított dekorin

A találmány tárgyát transzgénikus úton előállított dekorin és transzgénikus úton előállított dekorin előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások képezik.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható TGF-β által indukált sejtproliferáció és extracelluláris mátrix termelődésének megakadályozására, valamint ezzel kapcsolatos betegségek kezelésére.

Bár rekombináns terápiás, diagnosztikai, mezőgazdasági, állatgyógyászati, táplálkozási és más célokra növekvő számban kerülnek kifejlesztésre rekombináns fehérjék, azonban e fehérjék legnagyobb részét hagyományos eljárások alkalmazásával bonyolult és költséges funkcionális formában és jelentős mennyiségben előállítani.

A hagyományos eljárások során gyakran valamely konkrét fehérje előállításáért felelős gént illesztünk be gazdasejtbe, például baktérium-, élesztő- vagy emlőssejtekbe. A sejteket ezután tápoldaton szaporítjuk és a kívánt fehérjét kinyerjük a sejtből vagy a tápoldatból. Tradicionális baktérium- vagy élesztőrendszerek néha képtelenek komplex

Aktaszámunk: 97831-13919/SG fehérjéket funkcionális formában előállítani. Annak ellenére, hogy bizonyos emlőssejtek képesek komplex fehérjéket reprodukálni, e sejteket gyakran nehézkes és költséges szaporítani, és e sejtek csak viszonylag alacsony mennyiségben termelik a kívánt fehérjét. Ezenfelül, nem szekretálódó fehérjéket viszonylag bonyolult prokarióta vagy emlőssejtekből tisztítani, mivel e fehérjék gyakran nem szekretálódnak a tápoldatba.

A PG-II vagy PG-40 néven is ismert dekorin a fibroblasztok által termelt, kisméretű proteoglikán. A központi fehérjerészének molekulatömege körülbelül 40.000 dalton. A fehérjamagot már megszekvenálták [Krusius és Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci USA 8_3, 7683 (1986); amely publikáció a kitanítás részét képezi] és ismert, hogy a fehérje egyetlen, kondroitinszulfát/dermatánszulfát-típusú glükózaminoglikán láncot hordoz [Ruoslahti, Ann. Rev. Cell Biol. 4, 229-255 (1988); amely publikáció a kitanítás részét képezi]. A dekorin magját képező fehérjében 24 aminosavból álló, leucinban gazdag ismétlődés (leucine rich repeat, LRR) van jelen.

Proteoglikánok olyan fehérjék, amelyek egy vagy több glükózaminoglikán láncot hordoznak. Az ismert proteoglikánok különféle funkciókat végeznek és a sejt különféle részeiben találhatók meg. Sok proteoglikán az extracelluláris mátrix alkotóeleme, ahol résztvesznek a mátrix összeszerelődésében és határt gyakorolnak a sejtnek a mátrixhoz való tapadására.

Dekorint alkalmaztak TGF-β által indukált sejtproliferáció és extracelluláris mátrix termelődésének egakadályozására. így a dekorin alkalmas TGF-β által szabályozott aktivitások - mint például rák, glomerulonephritis, és túlzott mennyiségű mátrix meglétével jellemezhető patológiák - okozta patológiák csökkentésére vagy megakadályozására. Rák esetében, például, dekorin alkalmazható a TGFβΐ-eknek a ráksejtekre gyakorolt serkentő hatásának megszüntetésére. A dekorin alkalmas még sebek összehúzódásának (amelyben résztvesznek az extracelluláris mátrix fehérjéi) csökkentésére vagy gátlására.

Ezen bejelentés a korábban, 60/201932-es számon benyújtott amerikai egyesült államokbeli előzetes bejelentésen alapul, amelynek tartalma teljes egészében a kitanitás részét képezi.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

Általában, a találmány tárgya transzgénikus úton előállított dekorin, előnyösen emberi dekorin, preparátuma.

A transzgénikus úton előállított dekorint transzgénikus szervezetben, azaz transzgénikus növényben vagy állatokban, állítjuk elő. Előnyösen transzgénikus állatok közé az a 1ábbi ak tartoznak: emlősök; madarak; hüllők; és kétéltűek. Alkalmas emlősállatok közé az alábbiak tartoznak: kérődzők; patások; háziasított emlősök; és fejősállatok. Különösen előnyös állatok közé az alábbiak tartoznak: kecskék, juhok, tevék, szarvasmarhák, sertések, lovak, ökrök, nyulak és lámák. Alkalmas madarak közé az alábbiak tartóz4 nak: csirkék, ludak és pulykák. Abban az esetben, ha a transzgénikus fehérje a transzgénikus állat tejébe szekretálódik, az állatnak képesnek kell lennie legalább 1, előnyösebben legalább 10 vagy 100 liter tejet termelnie évenként.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus úton előállított dekorin preparátum, előnyösen ahogyan a transzgénikus szervezet állítja elő, kevesebb mint 80%-ban, 70%-ban, 60%-ban, 50%-ban, 40%-ban, 30%-ban, 20%-ban, 10%-ban vagy 5%-ban glikozilált (a preparátumban lévő glikozilált molekulák számát tekintve vagy a preparátumban a cukor teljes részvétele a molekulatömegben) a természetben előforduló vagy természetben előforduló, nem transzgénikus forrásból izolált vagy sejttenyészetben rekombináns eljárással előállított és izolált dekorin glikoziláltságához képest. Transzgénikusan előállított dekorinon előnyösen nincs glükózaminoglikán (GAG) lánc. A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus szervezetben előállított dekorinpreparátum olyan preparátum, amelyben a dekorinmolekulák 50%-án, 40%-án, 30%-án, 20%-án, 10%-án, 5%-án, 2%-án vagy 1%-án van GAG lánc. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus szervezetben előállított preparátumban a GAG láncot tartalmazó dekorinmolekulák és a GAG láncot nem tartalmazó dekorinmolekulák aránya körülbelül 1:2, 1:3, 2:3, 1:4, 3:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus preparátum, amelyet előnyösen transzgénikus szervezetben állítottunk elő, tartalmaz glikozilált és nem glikozilált formákat, és a glikozilált formák egy részét vagy mindet standard fehérjeelválasztási eljárásokkal eltávolítottuk, például testfolyadékból, például tejből.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorint a transzgénikus emlős, például kérődző, például kecske, emlőmirigye állítja elő.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorin a transzgénikus emlős, például kérődző, például kecske, tejébe szekretálódik.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorin emlőmirigyre specifikus promoter, például tejspecifikus promoter, például tejszérumfehérje- vagy kazein promótere, szabályozása alatt termelődik. A tejspecifikus promoter lehet^- kazeinpromóter, β-laktoglobulin promótere, tej savó promoter vagy laktalbumin-promóter.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorin húgyhólyagra vagy tojásra specifikus promoter szabályozása alatt termelődik és a vizeletbe vagy tojásba szekretálódik.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum átlagos molekulatömeg, aktivitás, a szervezetből való kiürülés ideje vagy proteolitikus lebontással szembeni ellenálló-képesség tekintetében különbözik a nem transzgénikus formától.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum glikoziláltsága eltér a természetben található vagy a sejttenyészetből izolált rekombináns dekorinétól.

A találmány előnyös megvalósítási módjában a transzgénikusan előállított dekorint transzgénikus szervezetben expresszáljuk és a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum glikoziláltsága eltér a természetben található vagy baktériumsejtből, élesztősejtből, rovarsejtből, tenyésztett emlőseredetű sejtből - például CHO, COS vagy HeLA sejtből - izolált dekorinétól. Például, eltér az olyan tenyésztett, emlőseredetű sejtben előállított fehérjétől, amely sejtbe a dekorin expresszióját kódoló vagy irányító nukleinsavat illesztettünk be.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorinpreparátum - például, SDS-PAGE-vel meghatározott elektroforetikus mobilitása eltér a természetes körülmények között előforduló, emberi dekorin elektroforetikus mobilitásától; a preparátum elektroforetikus mobilitása eltér az emlőseredetű sejtben - például CHO, COS vagy HeLA sejtben vagy prokarióta sejtekben - például baktérium vagy élesztővagy rovarsejtekben előállított rekombináns, emberi dekorin elektroforetikus mobilitásától.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorin legalább egy aminosav tekintetében eltér a természetes körülmények között előforduló, emberi dekorintól; a dekorin legalább egy aminosav tekintetében eltér az emlőseredetű sejtben - például CHO, COS vagy HeLA sejtben vagy prokarióta sejtekben - például baktérium vagy élesztő- vagy rovarsejtekben előállított rekombináns, emberi dekorintól.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorin aminosav-szekvenciája megegyezik az emlőseredetű vagy főemlős-eredetű, előnyösen emberi, dekorinéval.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a preparátum legalább 1, 10 vagy 100 milligramm dekorint tartalmaz. A találmány előnyös megvalósítási módjában, a preparátum legalább 1, 10 vagy 100 gramm dekorint tartalmaz.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a preparátum milliliterenként legalább 1, 10, 100 vagy 500 milligramm dekorint tartalmaz.

A találmány egy másik szempontja szerint, a találmány tárgya szövetspecifikus promóterhez - például emlőmirigyre specifikus promóterhez - működőképesen kapcsolt dekorinfehérjét kódoló szekvenciát tartalmazó, izolált nukleinsav molekula, amely a fehérjének a transzgénikus állat tejébe történő szekrécióját eredményezi.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a promoter tej specifikus promoter, például tej-szérumfehérjevagy kazein promótere. A tejspecifikus promoter lehet kazeinpromóter, β-laktoglobulin promótere, tej savó promoter vagy laktalbumin-promóter.

A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya eljárás transzgénikus dekorin vagy transzgénikus dekorint tartalmazó preparátum előállítására.

Az eljárás az alábbi lépésekből áll:

transzgénikus szervezetet, azaz transzgénikus állatot vagy növényt, állítunk elő, amely dekorin - előnyösen emberi dekorin - expresszióját irányító transzgént tartalmaz;

hagyjuk a transzgént expresszálódni; és kinyerjük a transzgénikus úton előállított dekorint vagy transzgénikus úton előállított dekorinpreparátumot a szervezetből vagy a szervezet által előállított termékből, például tejből, magokból, vérből, tojásokból vagy vizeletből.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, az eljárás tartalmazza az alábbi lépést:

a dekorin expresszióját irányító nukleinsavat sejtbe juttatjuk be és hagyjuk, hogy a sejtből transzgénikus szervezet fejlődjön ki;

A transzgénikus úton előállított dekorint transzgénikus szervezetben, azaz transzgénikus növényben vagy állatokban, állítjuk elő. Előnyösek transzgénikus állatok közé az alábbiak tartoznak: emlősök; madarak; hüllők; és kétéltűek. Alkalmas emlősállatok közé az alábbiak tartoznak: kérődzők; patások; háziasított emlősök; és fejősállatok. Különösen előnyös állatok közé az alábbiak tartóz nak: kecskék, juhok, tevék, szarvasmarhák, sertések, lovak, ökrök, nyulak és lámák. Alkalmas madarak közé az alábbiak tartoznak: csirkék, ludak és pulykák. Abban az esetben, ha a transzgénikus fehérje a transzgénikus állat tejébe szekretálódik, az állatnak képesnek kell lennie legalább 1, előnyösebben legalább 10 vagy 100 liter tejet termelnie évenként.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus úton előállított dekorinpreparátum, előnyösen ahogyan a transzgénikus szervezet állítja elő, kevesebb mint 80%-ban, 70%-ban, 60%-ban, 50%-ban, 40%-ban, 30%-ban, 20%-ban, 10%-ban vagy 5%-ban glikozilált (a preparátumban lévő glikozilált molekulák számát tekintve vagy a preparátumban a cukor teljes részvétele a molekulatömegben) a természetben előforduló vagy természetben előforduló, nem transzgénikus forrásból izolált vagy sejttenyészetben rekombináns eljárással előállított és izolált dekorin glikoziláltságához képest. Transzgénikusan előállított dekorinon előnyösen nincs glükózaminoglikán-lánc (GAGlánc) . A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus szervezetben előállított dekorinpreparátum olyan preparátum, amelyben a dekorinmolekulák 50%-án, 40%án, 30%-án, 20%-án, 10%-án, 5%-án, 2%-án vagy 1%-án van GAG lánc. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus szervezetben előállított preparátumban a GAG láncot tartalmazó dekorinmolekulák és a GAG láncot nem tartalmazó dekorinmolekulák aránya körülbelül 1:2, 1:3, 2:3, 1:4, 3:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus preparátum, amelyet előnyösen transzgénikus szervezetben állítottunk elő, tartalmaz glikozilált és nem glikozilált formákat, és a glikozilált formák egy részét vagy mindet standard fehérjeelválasztási eljárásokkal eltávolítottuk a transzgénikus dekorint tartalmazó, például, testfolyadékból, például tejből.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorin emlőmirigyre specifikus promoter, például tej specifikus promoter, például tejszérumfehérje- vagy kazein promótere, szabályozása alatt termelődik. A tej specifikus promoter lehet kazeinpromóter, β-laktoglobulin promótere, tej savó promoter vagy laktalbumin-promóter.

A találmány előnyös megvalósítási módjában a transzgénikusan előállított dekorint transzgénikus szervezetben expresszáljuk és a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum glikoziláltsága eltér a természetben található vagy baktériumsejtből, élesztősejtből, rovarsejtből, tenyésztett, emlőseredetű sejtből - például CHO, COS vagy HeLA sejtből - izolált dekorinétól. Például, eltér az olyan tenyésztett, emlőseredetű sejtben előállított fehérjétől, amely sejtbe a dekorin expresszióját kódoló vagy irányító nukleinsavat illesztettünk be.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya eljárás olyan transzgénikus preparátum előállítására, amely transzgénikus állat tejében lévő, exogén dekorint tartalmaz, amely eljárás során a preparátum előállítása céljából tejet nyerünk olyan transzgénikus állattól, amelynek ivarsejtjeibe (csíravonal, „germ line) promóterszekvenciához működőképesen kapcsolt, dekorinfehérjét kódoló szekvenciát vittünk be, amelynek eredményeként a fehérjét kódoló szekvencia az emlőmirigy epitéliumsejtjeiben expresszálódik, ezáltal a dekorin az emlős tejébe szekretálódik.

Alkalmas emlősállatok közé az alábbiak tartoznak: kérődzők; patások; háziasított emlősök; és fejősállatok. Különösen előnyös állatok közé az alábbiak tartoznak: kecskék, juhok, tevék, szarvasmarhák, sertések, lovak, ökrök, nyulak és lámák. A transzgénikus állatnak képesnek kell lennie legalább 1, előnyösebben legalább 10 vagy 100 liter tejet termelnie évenként.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus úton előállított dekorin preparátum, előnyösen ahogyan a transzgénikus szervezet állítja elő, kevesebb mint 80%-ban, 70%-ban, 60%-ban, 50%-ban, 40%-ban, 30%-ban, 20%-ban, 10%-ban vagy 5%-ban glikozilált (a preparátumban lévő glikozilált molekulák számát tekintve vagy a preparátumban a cukor teljes részvétele a molekulatömegben) a természetben előforduló vagy természetben előforduló, nem transzgénikus forrásból izolált vagy sejttenyészetben rekombináns eljárással előállított és izolált dekorin glikoziláltságához képest. Transzgénikusan előállított dekorinon előnyösen nincs glükózaminoglikán (GAG) lánc. A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus szervezetben előállított dekorinpreparátum olyan preparátum, amelyben a dekorinmolekulák 50%-án, 40%-án, 30%-án, 20%-án, 10%-án, 5%-án, 2%-án vagy 1%-án van GAG lánc. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus szervezetben előállított preparátumban a GAG láncot tartalmazó dekorinmolekulák és a GAG láncot nem tartalmazó dekorinmolekulák aránya körülbelül 1:2, 1'3, 2·3 1:4, 3:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus preparátum, amelyet előnyösen transzgénikus szervezetben állítottunk elő, tartalmaz glikozilált és nem glikozilált formákat, és a glikozilált formák egy részét vagy mindet standard fehérjeelválasztási eljárásokkal eltávolítottuk a transzgénikus dekorint tartalmazó tejből.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorin emlőmirigyre specifikus promoter, például tej specifikus promoter, például tejszérumfehérje— vagy kazein promótere, szabályozása alatt termelődik. A tejspecifikus promoter lehet kazeinpromóter, β-laktoglobulin promótere, tej savó promoter vagy laktalbumin-promóter.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum glikoziláltsaga eltér a természetben található vagy a sejttenyészetből izolált rekombináns dekorinétól.

A találmány előnyös megvalósítási módjában a transzgénikusan előállított dekorint transzgénikus szervezetben expresszáljuk és a transzgénikusan előállított dekorinpreparátum glikoziláltsága eltér a természetben ta laiható vagy baktériumsejtből, élesztősejtből, rovarsejtbol, tenyésztett, emlőseredetű sejtből - például CHO, COS vagy HeLA sejtből - izolált dekorinétól. Például, eltér az olyan tenyésztett, emlőseredetű sejtben előállított fehérjetol, amely sejtbe a dekorin expresszióját kódoló vagy irányító nukleinsavat illesztettünk be.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorin ammosav-szekvenciája megegyezik az emlőseredetű vagy főemlős-eredetű, előnyösen emberi, dekorinéval.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a tej milliliterenként legalább 1, 10, 100, 500, 1000 vagy 2000 milligramm dekorint tartalmaz.

A találmány másik nézőpontja szerint, a találmány tárgya transzgénikus dekorint, előnyösen emberi dekorint, expresszáló transzgénikus szervezet, amelyből transzgénikus dekorint tartalmazó preparátumot állíthatunk elő.

A transzgénikus szervezet transzgénikus növény vagy állat. Előnyösek transzgénikus állatok közé az alábbiak tartoznak: emlősök; madarak; hüllők; és kétéltűek. Alkalmas emlősállatok közé az alábbiak tartoznak: kérődzők; patások; háziasított emlősök; és fejősállatok. Különösen előnyös állatok közé az alábbiak tartoznak: kecskék, juhok, tevék, szarvasmarhák, sertések, lovak, ökrök, nyulak és lámák. Alkalmas madarak közé az alábbiak tartoznak: csirkék, ludak és pulykák. Abban az esetben, ha a transzgénikus fehérje a transzgénikus állat tejébe szekretálódik, az állatnak képesnek kell lennie legalább 1, előnyösebben legalább 10 vagy 100 liter tejet termelnie évenként.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus preparátum, amelyet előnyösen transzgénikus szervezetben állítottunk elő, tartalmaz glikozilált és nem glikozilált formákat, és a glikozilált formák egy részét vagy mindet standard fehérjeelválasztási eljárásokkal eltávolítottuk a transzgénikus dekorint tartalmazó tejből..

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya terápiásán hatékony mennyiségű dekorint vagy transzgénikus úton előállított dekorint, és gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati preparátum.

A transzgénikusan előállított dekorin vagy dekorinpreparátum előállítható bármely itt leírt eljárással vagy bármely itt leírt szervezetben.

A transzgénikusan előállított dekorin vagy dekorinpreparátum lehet az itt leírtak bármelyike.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya transzgénikus úton előállított dekorinpreparátumot, előnyösen emberi eredetű dekorinpreparátumot, és legalább egy más, a dekorintól eltérő összetevőt, például táplálkozási összetevőt, tartalmazó készítmény.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a készítmény lehet szilárd vagy folyékony.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a készítmény még folyékony hordozóanyagot is tartalmaz.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a táplálkozási összetevő lehet fehérje - például tejfehérje -, vitamin, —például A vitamin, B vitamin, D vitamin —, szénhidrát, ásványi anyag - például kalcium, foszfor, vas.

A transzgénikusan előállított dekorin vagy dekorinpreparátum előállítható bármely itt leírt eljárással vagy bármely itt leirt szervezetben.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya dekorin beadását igénylő alany számára a dekorin biztosítására szolgáló eljárás. Az eljárásban az alanynak transzgénikusan előállított dekorint vagy transzgénikus dekorinpreparátumot adunk be.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, az alany valamely személy, aki a dekorin beadását igénylő páciens. Például, a találmány tárgya eljárás hegesedés megelőzésére vagy csökkentésére, amely eljárásban a sebre transzgénikusan előállított dekorint viszünk fel. A dermális hegképződés különböző bőrsérüléseket követő folyamat, amelynek eredményeként kollagénből, fibronektinből és proteoglikánokból álló, szálas szövetek túlzott mértékben akkumulálódnak. A szálas mátrix akkumulációját a sérülés helyén a trombiciták és gyulladásos sejtek által felszabadított növekedési faktor indukálja. A szálas forradási szövet lerakódásának indukálásában szerepet játszó fő növekedési faktornak a transzformáló növekedési faktort-p-t (TGFβ) tartják. A dekorin kötődik a TGF-p-hoz és semlegesíti annak különféle biológiai funkcióit, így az extracelluláris mátrix indukálását is. E szálas extracelluláris mátrix elasztikus tulajdonságának következtében, valamely súlyos bőrsérülés eredményeként létrejött hegszövet gyakran károsít lényeges szövetfunkciókat és eredményezhet csúnya forradást .

A transzgénikusan előállított dekorin alkalmazásának előnye a találmány szerinti eljárásban az, hogy e fehérje normális, emberi fehérje és feltételezések szerint részt vesz a TGF-β természetes szabályozási útvonalában. így, transzgénikus dekorint alkalmazhatunk égési sérülések vagy más invazív bőrsérülések eredményeként létrejövő, illetve a kozmetikai és rekonstruáló sebészet során keletkező dermális hegesedés megakadályozására vagy csökkentésére.

A dekorinnal nem kezelt sérülésekkel összehasonlítva, a dekorinnal kezelt sérüléseken lényegében nem látszik kimutatható hegképződés. A felnőttek és harmadik időszakban lévő emberi magzatok esetében a TGF-β által indukált hegképződési folyamat egyedinek mutatkozik, azonban az első két időszakban lévő magzatoknál lényegében hiányzik. A magzati sérülések estében a hegképződés hiánya összefüggésbe hozható a TGF-β hiányával a sebágyban. Viszont, a felnőttkori szövetekben lévő sebágyak igen nagy mértékben tartalmaznak TGF-β-Ι és a teljes mértékben gyógyult sérülés helyén kiterjedten szálas, kollagénszerű mátrixot tartalmazó, megvörösödött, ráncos heg képződik. A dekorinnal kezelt sérülések szövettanilag normálisak voltak és hasonlítottak az első két időszakban lévő magzatoknál tapasztaltakéhoz.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya a fenti eljárásokban alkalmazható, transzgénikusan előállított dekorint és gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény. Gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagok közé tartozik például hialuronsav, és vizes oldatok, mint például bikarbónát pufferek, foszfát pufferek, Ringer-féle oldat, és igény szerint - 5% dextrózzal vagy emberi szérumalbuminnal kiegészített fiziológiás sóoldat. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak még más, a szakember számára ismert, sebgyógyulást elősegítő ágenseket is. Ilyen ágensek például az alábbiak lehetnek: biológiailag aktív kemikáliák és polipeptidek — így biológiailag lebontható polimerhez kötött, RGD-t tartalmazó polipeptidek [lásd, WO 90/06767 sz. nemzetközi közzétételi irat (1990, június 28); amely irat a kitanítás részét képezi]. Ilyen polipeptideket a technikában ismert bármely eljárással - így például kovalens vagy ionos kötéssel - köthetünk polimerekhez.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya valamely alanynál keletkezett sérülés összehúzódásának csökkentésére vagy gátlására szolgáló eljárás, amely eljárásban az alanynak transzgénikus dekorint tartalmazó gyógyászati készítményt adunk be.

A találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya valamely alanyban rákos megbetegedés, például mellrák, kezelésére szolgáló eljárás, amely eljárásban az alanynak terápiásán hatékony mennyiségű, transzgénikus dekorint tartalmazó gyógyászati készítményt adunk be.

Az itt leírt készítmények és eljárások bármelyikében, a transzgénikus dekorinpreparátum vagy -készítmény lehet glükózaminoglikán (GAG) láncoktól mentes, igy a dekorinpreparátum igen homogén. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus szervezetben előállított dekorinpreparátum olyan preparátum, amelyben a dekorinmolekulák 50%—án, 40%-án, 30%-án, 20%-án, 10%—án, 5%-án, 2%-án vagy 1%-án van GAG lánc. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a transzgénikus szervezetben előállított preparátumban a GAG láncot tartalmazó dekorinmolekulák és a GAG láncot nem tartalmazó dekorinmolekulák aránya körülbelül 1:2, 1:3, 2:3, 1:4, 3:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9.

Bizonyos transzgénikus fehérjék expressziója nem kívánt hatást válthat ki a transzgénikus állat vagy utódja metabolizmusában vagy egészségi állapotában.

így, a találmány másik szempontja szerint, a találmány tárgya transzgénikus állatban transzgénikus fehérje előállítására szolgáló eljárás (ahol a transzgénikus fehérje az, amely a transzgénikus állat metabolizmusára hatást fejt ki), amely az alábbiakat tartalmazza:

a transzgénikus fehérjét expresszáljuk - például a transzgénikus állat tejébe -; és a transzgénikus fehérjének a transzgénikus állatra gyakorolt hatásának gátlása céljából kezeljük a transzgénikus állatot.

Például, az állatba beadhatunk, vagy az állatban transzgénikusan expresszálhatunk olyan - például a transzgénikus dekorin aktivitását gátló - anyagot, amely gátolja a transzgénikus dekorinnak az állatra kifejtett hatását. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, az anyag polipeptid. Az anyag, például, lehet enzim vagy receptor vagy annak fragmentuma vagy más olyan molekula, amely transzgénikus dekorinnal kölcsönhatásba képes lépni vagy azt megkötni. A dekorin eloszlásának vagy transzportjának megváltoztatásával, az anyag hathat a transzgénikus dekorin kompetitív vagy nem kompetitív gátlójaként.

Ha a transzgénikus fehérjét a transzgénikus állat egy bizony részében — azaz például, valamely szövetben, folyadékban vagy szervben - találtuk meg, akkor az anyagot beadhatjuk vagy expresszálhatjuk azon a helyen. Például, ha a transzgénikus fehérje a transzgénikus állat tejében expresszálódik, az anyag beadható vagy expresszálható a transzgénikus állat tejében.

Ha az anyagot transzgénikusan úton expresszáljuk a transzgénikus dekorint és az anyagot azonos típusú promóterrel - például mindkettőt emlőre specifikus promóterekkel, például tej specifikus promóterekkel expresszálhatjuk. A transzgénikus dekorin és az anyag olyan promóterrel expresszálható, amely alkalmazása a két anyag egyenlő expresszióját eredményezi, vagy a két anyag különböző erősségű, egymástól eltérő promóterekkel is expresszálható. Ez utóbbi az egyik vagy másik anyag nagyobb vagy kisebb mértékű expresszióját eredményezi. Bizonyos esetekben kívánatos lehet, ha az anyag expressziója - például molárisán vagy tömeg alapján - meghaladja a transzgénikus dekorin expresszióját. Más esetekben ennek ellenkezője optimalizálja az anyag termelődését. Az anyag expresszálható a dekorinnal megegyező vagy attól eltérő helyen. Például, az anyag beadható vagy expresszálható azon a helyen, ahol a dekorin jelenléte nem kívánatos, például ott, ahová a transzgénikus fehérje feltehetően beszivárog, például a vérbe. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a transzgénikus dekorin a transzgénikus állat tejébe expresszálódik, és az anyagot a transzgénikus állat vérébe adjuk be vagy oda expresszáljuk.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus dekorint kötő antitestet adjuk be vagy expresszáljuk a transzgénikus állatba. Az antitest lehet, például, egyszálú antitest vagy intratest („intrabody). A találmány előnyös megvalósítási módjában, a transzgénikus dekorin a tejbe expresszáljuk, az antitestet pedig a vérbe.

Az anyag beadható vagy második transzgénikus fehérjeként expresszálható a transzgénikus állatban. Azonban, mielőtt transzgénikus állatot, például nagyméretű transzgénikus állatot, például transzgénikus kecskét, állítanánk elő az anyag hatékonyságát le kell tesztelni. Ezt úgy végezhetjük el, ha a dekorint és az anyagot - például injekcióval - állatnak - például kecskének - adjuk be, és nyomonkövetjük a dekorinnak az állat metabolizmusára vagy egészségi állapotára gyakorolt hatását. Ha az anyag megfelelőképpen hatékony, előállíthatjuk a transzgénikus állat. Amennyiben kívánatos lehet, transzgénikus dekorint expresszáló transzgénikus állatot állítunk elő, és a kérdéses anyagot beadjuk az állatnak abból a célból, hogy értékeljük az anyag alkalmasságát kétszeresen transzgénikus állat - azaz amely dekorinra nézve és az anyagra nézve is transzgénikus - előállítására.

Gazdaszervezet egészségi állapota is optimalizálható szövetspecifikus expresszióval, azaz emlőmirigyben, előnyösen a tejben, történő expresszióval.

A transzgénikus dekorin szerkezetét módosíthatjuk a terápiás vagy profilaktikus hatékonyság vagy stabilitás (például, ex vivo életidő és proteolitikus in vivo degradáció) céljából, vagy az állat egészségi állapotának optimalizálására. Ilyen módosított dekorin - amennyiben úgy lett tervezve, hogy a természetes dekorinnak legalább egy akti vitását megtartsa - a részletesebben leírásra kerülő dekorinnal funkcionálisan egyenértékűnek tekintjük. Ilyen módosított pepiidet elő lehet állítani, például, aminosavszubsztitúcióval, delécióval vagy addícióval.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a transzgénikus dekorint valamely második polipeptiddel fuzionáltatott transzgénikus fúziós fehérjeként is expresszálhatjuk, amely fúzió a dekorinnak a transzgénikus állat metabolizmusára vagy egészégére gyakorolt, nem kívánt hatásának minimalizálását eredményezi. A második polipeptid lehet a fúzió részét képező dekorin aktivitását megváltoztató fehérje, például a dekorinfragmentum és valamely második molekula, például receptor, például dekorinreceptor, közötti kölcsönhatást megváltoztatni képes polipeptid. A második fehérje lehet a fúziós fehérje szöveti megoszlását megváltoztatni képes fehérje. Például, a második polipeptid és a dekorin fúziójával megakadályozható a fúzió elvándorlása vagy transzportja az expresszió helyéről, például emlőszövet vagy tej, a transzgénikus állat valamely más részébe, például a keringésbe vagy a vérbe.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a fúziós fehérje expressziója vagy izolálása után második fehérje lehasad a dekorinfragmentumról.

A transzgénikus dekorin, fúziós fehérjeként expresszálható valamely második polipeptiddel, amely polipeptid optimalizálja a transzgénikus dekorin izolálását vagy kinyerését. Például, a második polipeptid optimalizálhatja az izolálást oly módon, hogy megfelelő oldékonysági tulajdonságot biztosit a fúziós fehérjének, -például jobban vagy kevésbé oldhatóvá teszi azt - vagy a tisztítást egyszerűsítő fragmentumot biztosít - például affinitási fragmentumot biztosít.

A leírás szerinti értelemben, két fehérje glikozilációja egymástól eltér, ha az alábbi paraméterek közül egy vagy több tekintetében eltérnek egymástól:

(1) a fehérjéhez kapcsolt cukorfragmentumok összes molekuláris tömege;

(2) a fehérjéhez kapcsolt cukorfragmentumok összes száma;

(3) a kapcsolt cukorfragmentumok alegység-összetétele;

(4) a kapcsolt cukrokban az elágazások száma;

(5) a kapcsolt cukrokban az elágazások helye;

(6) a fehérje és a cukrok kapcsolódási helyeinek száma;

(7) a fehérjében azon hely vagy helyek, ahová cukrok kapcsolódnak;

(8) az O-glikozilációs helyek száma; és (9) az N-glikozilációs helyek száma.

Két preparátum akkor különbözik egymástól, ha valamely kérdéses jellemző tulajdonsággal - például, a közvetlenül fent leírtak közül egy vagy több tulajdonsággal - bíró dekorin egy része a második preparátumban különbözik a megegyező tulajdonsággal bíró molekularésztől. Például, mindkét preparátum tartalmazhat glikozilált dekorint és GAG lánctól mentes dekorint.

A leírás szerinti értelemben, a preparátum egy vagy több transzgénikus állat által termelt molekulák sokaságát jelenti. Tartalmazhat glikoziláltság tekintetében eltérő vagy homogén molekulákat. A leírás szerinti értelemben, a „transzgénikus úton előállított dekorin lényegében homogén preparátuma kifejezés olyan dekorinpreparátumot jelent, amelyben a dekorinmolekuláknak kevesebb mint 10%-a, 5%-a, 2%-a vagy 1%-a tartalmaz GAG láncot.

A leírás szerinti értelemben, a tisztított preparátum, a polipeptid lényegében tiszta preparátuma vagy az izolált polipeptid - a transzgénikus úton előállított polipeptid esetén - olyan polipeptidet jelent, amely el van különítve legalább egy, a transzgénikus állatban vagy folyadékban, például tej vagy más, a transzgénikus állat által produkált anyagban, például tojásban, előforduló fehérjétől, lipidtől vagy nukleinsavtól. A polipeptidet előnyösen valamilyen, a polipeptid tisztítására alkalmazott anyagról, például antitestek vagy gélmátrix, például poliakrilamid, különítjük el. A polipeptid a tisztított preparátum száraz tömegének előnyösen legalább 10, 20, 50, 80 vagy 95%-át teszi ki. A preparátum előnyösen fehérjeszekvenálást lehetővé tevő polipeptidet, legalább 1, 10 vagy 100 pg polipeptidet, legalább 1, 10 vagy 100 mg polipeptidet tartalmaz.

A lényegében tiszta nukleinsav olyan nukleinsav, amely az alábbiak egyike vagy mindkettő: nem közvetlenül szomszédos azon szekvenciák - például kódoló szekvenciák egyikével vagy mindkettővel, amellyel annak az organizmus nak a természetes genomjában közvetlenül szomszédos (azaz, egy az 5 -végnél és egy a 3'—végnél), amelyből a nukleinsav származik; vagy amely lényegében mentes olyan nukleinsavszekvenciától, amellyel abban az organizmusban fordul elő együtt, amelyből a nukleinsav származik. A kifejezés felöleli, például, a valamely vektorba - például, autonóm replikálódó plazmidba vagy vírusba - vagy prokarióta— vagy eukariótaeredetű genomi DNS—be beépített rekombináns DNS—t vagy amely elkülönült molekulaként (például, PCR-rel vagy restrikciós endonukleázzal végzett kezeléssel előállított DNS vagy genomi DNS fragmentuma) , más DNS-szekvenciáktól függetlenül létezik. Lényegében tiszta DNS-nek tekintjük a további dekorinszekvenciát kódoló hibridgén részét képező rekombináns DNS-t is.

A leírás szerinti értelemben a peptidek, fehérjék és polipeptidek kifejezéseket egymással felcserélhetően alkalmazzuk .

A leírás szerinti értelemben, a homológia vagy szekvenciaazonosság kifejezés két polipeptid molekula vagy két nukleinsav molekula közötti szekvenciahasonlóságot jelenti. Ha az első szekvenciában és a második szekvenciában, ugyanazt a helyet ugyanaz az aminosav foglalja el, akkor arra pozícióra nézve a két molekula homológ (azaz, a leírás szerinti értelemben aminosav— vagy nukleinsav—„homológia egyénértékű az aminosav— vagy nukleinsav „azonossággal). A két szekvencia közötti százalékos homológia a szekvenciákban az azonos pozíciók számának függvénye (azaz, % homológia= az azonos pozíciók száma/az összes pozíció száma * 100) .

Például, ha két szekvenciában 10 pozícióból 6 megegyezik vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-ban homológ vagy a két szekvencia közötti szekvenciaazonosság 60%os) . Például, az ATTGC és TATGGC DNS-szekvenciák 50%-ban homológok vagy köztük a szekvenciaazonosság 50%-os. Általában, összehasonlítást akkor teszünk, ha két szekvenciát maximális homológiát vagy szekvenciaazonosságot adó módon egyeztetettünk.

A két szekvencia között a szekvenciák összehasonlítása és a százalékos homológra megállapítása matematikai algoritmus alkalmazásával végezhető el. A szekvenciák összehasonlítására alkalmazott algoritmus például - minden korlátozás nélkül - előnyösen a Kariin és Altschul féle algoritmus [Kariin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 2264-2268 (1990), módosítva Karlin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 5873-5877 (1993)]. Ilyen algoritmust építettek be az NBLAST és XBLAST programokba (ver. 2.0) [Altschul és mtsai., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)]. BLAST nukleotidkeresést NBLAST programmal végezhetünk (score=100, wordlenght=12) abból a célból, hogy a találmány szerinti ITALY nukleinsav-molekulákkal homológ nukleotidszekvenciákhoz jussunk. BLAST fehérjekereséseket az XBLAST programmal végezhetünk (score=50, wordlenght=3) abból a célból, hogy a találmány szerinti ITALY fehérjemolekulákkal homológ aminosav-szekvenciákhoz jussunk. Összehasonlítási célokra, réseit (gapped) egyeztetéseket állít hatunk elő a Gapped BLAST programmal [lásd, Altschul és mtsai., Nucl. Acid. Res. 25, 3389-3402 (1997)]. Ha BLAST és Gapped BLAST programokat hasznosítunk, a megfelelő programmal (például, XBLAST és NBLAST) kapcsolatos alapbeállításokat alkalmazhatunk [lásd, http://ncbi.nlm.nih.gov]. A szekvenciák összehasonlítására hasznosított matematikai algoritmusra - a találmányt semmiben sem korlátozó - előnyös másik példa a Myers és Miller algoritmusa [Myers és Miller, CABIOS (1989)]. Ilyen algoritmus van beépítve a GCG egyeztetéses szoftvercsomag részét képező ALIGN programba (2.0 verzió). Ha aminosavszekvenciák összehasonlítására az ALIGN programot hasznosítjuk, akkor PAM120 weight residue table, gap lenght penalty=12, és gap penalty=4 beállításokat alkalmazhatunk.

A leírás szerinti értelemben, a transzgénikus kifejezés olyan (kódoló, például egy vagy több dekorin polipeptidet kódoló) nukleinsav-szekvenciát jelent, amely részben vagy teljes egészében vagy heterológ - azaz idegen - arra a transzgénikus állatra vagy sejtre nézve, amelybe bevittük vagy pedig homológ annak a transzgénikus állatnak vagy sejtnek endogén génjére nézve, amelybe bevittük, amely nukleinsav-szekvenciát úgy terveztünk, hogy beilleszthető legyen vagy beilleszthető az állat genomjába oly módon, hogy megváltoztassa annak a sejtnek a genomját, amelybe beillesztettük (például, a természetes gén helyétől eltérő helyre vittük be vagy a bevitel „knockout hatást eredményez) . Valamely transzgén tartalmazhat egy vagy több, a dekorint kódoló kiválasztott nukleinsav optimális expressziójához és szekréciójához esetleg szükséges transzkripciós szabályozó szekvenciát, és bármely más nukleinsavat, mint például intront, például, emlőmirigyben, ilyeneket működőképesen kapcsoltunk a kiválasztott, dekorint kódoló nukleinsav-szekvenciához, és ilyen szekvenciák közé tartozik az „enhancer szekvencia is. A dekorint kódoló szekvenciát működőképesen kapcsolhatjuk szövetspecifikus promóterhez, például emlőmirigyre specifikus promóterszekvenciához - amelynek eredményeként a fehérje a transzgénikus állat tejébe szekretálódik -, vizeletre specifikus promóterhez vagy tojásspecifikus promóterhez.

A leírás szerinti értelemben, a „transzgénikus sejt kifejezés transzgént tartalmazó sejtet jelent.

A leírás szerinti értelemben, a „transzgénikus szervezet kifejezés transzgénikus állatot vagy növényt jelent.

A leírás szerinti értelemben, a „transzgénikus állat olyan, az embertől eltérő, állat, amelyben az állat egy vagy több, előnyösen lényegében az összes, sejtje emberi beavatkozással — mint például, a technikában ismert transzgénikus eljárásokkal - bevitt heterológ nukleinsavat tartalmaz. A transzgén a sejtbe bevihető közvetlenül vagy a sejt prekurzorába - szándékos genetikai manipuláció útján, mint például mikroinjekcióval vagy rekombináns vírussal végzett fertőzéssel - történő bevitellel, közvetve.

A leírás szerinti értelemben, az emlősök kifejezés jelent minden olyan állatot, kivéve embert, amelynek emlőmirigye van és tejet termel.

A leírás szerinti értelemben, a „tejelő állat tejet termelő állatot jelent. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a tejelő állat nagy mennyiségben termel tejet és a szoptatási periódusa hosszú, például tehenek vagy kecskék .

A leírás szerinti értelemben, a „növény kifejezés vagy egész növényt, növényi részt, növényi sejtet vagy egy csoport növényi sejtet jelent. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható növényi osztályok általában azokat a növényi osztályokat - egyszikű és kétszikű növények - foglalják magukban, amelyek transzformációs eljárásokkal módosíthatók. Ebbe a körbe sorolunk különböző számú genomot tartalmazó - poliploid, diploid és haploid -növényeket.

A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászati szempontból elfogadható készítmény terápiásán hatékony mennyiségű, transzgénikus dekorint tartalmazó és egy vagy több, gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyaggal kiszerelt készítmény.

A leírás szerinti értelemben, a „kiszerelés kifejezés transzgénikus dekorint tartalmazó, szilárd, például por vagy folyékony formájú készítményt jelent. A kiszerelés biztosíthat terápiás vagy táplálkozási előnyöket. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a kiszerelés legalább egy, a dekorintól eltérő táplálkozási összetevőt foglalhat magában. E kiszerelések tartalmazhatnak tartósítószert a mikroorganizmusok szaporodásának megakadályozása céljából.

A leírás szerinti értelemben, az „étkezési anyag (nutraceutical) kifejezés a transzgénikus dekorint tartalmazó táplálékanyagot vagy táplálékrészt jelenti. Az étkezési anyagok gyógyászati vagy egészségügyi előnyöket, ideértve a betegség megelőzését, kezelését vagy kúráját, biztosíthatnak. A transzgénikus fehérje az étkezési anyagban gyakran 1 mg/kg koncentrációban van jelen. Az étkezési anyag lehet a transzgénikus állat teje.

A leírás szerinti értelemben, a „dekorin kifejezés a dekorinnak legalább egy biológiai aktivitását mutató proteoglikánt vagy annak fragmentumát vagy analógját jelenti. A dekorin biológiai aktivitását akkor mutatja valamely polipeptid, ha az alábbi tulajdonságok bármelyikét mutatja: 1) kölcsönhatásba lép, például kötődik, az extracelluláris mátrix valamelyik komponensével, például fibronektinnel (például, a fibronektin celluláris kötődőménjével és/vagy heparint kötő doménjével), kollagénnel (például, I, II, VI, XIV. kollagén); 2) módosítja, például gátolja, a fibrillogenézist; 3) trombosporinnal kölcsönhatásba lép, például kötődik; 4) epidermális növekedési faktorral lép kölcsönhatásba, például kötődik; 5) módosítja, például aktiválja, az epidermális növekedési faktor receptorát; 6) szignál-útvonalat módosít, például előrelendít vagy gátol, például előrendíti bizonyos kinázgátlók - például p21 elnevezésű, ciklintől függő kinázgátló - indukálásának útvonalát; 7) növekedési faktorral, például TGF-0-val, kölcsönhatásba lép, például kötődik; 8) módosítja, például gátolja, a sejtproliferációt; 9) módosítja, például gátolja, a sejt36 vándorlást; 10, módosítja a sejtek adhézióját; és 11) módosítja a mátrix összerendeződését és szerveződését. Az emberi dekorin előnyösen a Krusius és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 7683 (1986)] által leírt aminosav-szekvenciájú dekorinnak vagy változatának felel meg. A természetes körülmények között előforduló dekorinban lévő szerin aminosavon, például a Krusius és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 7683 (1986)] által leírt aminosav-szekvenciában a 4. pozícióban lévő szerinen, egyetlen GAG lánc található. Ezenfelül, a természetes körülmények között előforduló dekorinban két vagy több, aszparaginhoz kötött oligoszaccharid is van [Glossl, J. Biol. Chem. 259, 14144-14150 (1984)].

A leírás szerinti értelemben, az „alany kifejezés magában foglalja az embert és az embertől eltérő állatokat. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, az alany az a személy, például páciens, akinek dekorinra van szüksége: például, abnormális TGF-β aktivitással társult betegségben - például, rák, diabetikus vese-rendellenesség, invazív bőrsérülések, például égési sérülések, illetve kozmetikai vagy rekonstruktív sebészeti eljáráson átesett személy vagy kötőszöveti rendellenesség vagy csontvesztéssel vagy abnormális csontnövekedéssel társult betegségek (például, osteogenesis imperfecta, osteorthriritis) - szenvedő személy. A leírás szerinti értelemben, az „embertől eltérő állat kifejezés magában foglalja az összes gerincest, például emlősöket és nem emlősöket, mint például az embertől eltérő főemlősöket, kérődzőket, madarakat, kétéltűeket, hül löket. A transzgénikus eljárások alkalmazása rekombináns fehérjék transzgénikus állatok tejében történő nagytömegű előállítására jelentős előnyöket biztosít a hagyományos fehérje-előállítási eljárásokkal szemben. Ezen előnyök közé az alábbiak tartoznak: a szükséges tőkeberuházások összes mennyiségének csökkenése, a termék-előállítás korai szakaszában szükséges berendezések építési költségének megszűnése, az egységnyi komplex fehérjére eső közvetlen termelési költség csökkenése. Kulcsfontosságú annak valószínűsége, hogy bizonyos komplex fehérjék nagytömegű termelése esetében, a transzgénikus előállítás az egyetlen technológiai és gazdaságilag megvalósítható eljárás.

A leírás szerinti értelemben, a „seb-összehúzódás kifejezés a sebgyógyulási folyamat egyik lépését jelenti, amikoris a seb szélei összeérnek a seb bezárása céljából [lásd például, Grinnel, J. Cell Bioi. 124, 401-404 (1994)]. A leírás szerinti értelemben, a „sebgyógyulás kifejezés, szélesebb értelemben, a sérülés jelentkezésétől, a seb gyógyulásával járó fiziológiai jellemzők teljesüléséig tartó folyamatot jelenti. A seb-összehúzódás, például, a sebgyógyulási folyamat részét képezi. így, a seb összehúzódását csökkentő vagy gátló készítmény fokozhatja a sebgyógyulást. Egyértelmű, hogy a sebgyógyulás nem feltétlenül eredményezi azt, hogy a sérült szövet eléri a sérülést megelőző időben meglévő szervezettség szintjét.

Az emberekben egyaránt termelődik glikozilált dekorin és egy vagy több GAG lánctól mentes dekorin is. A GAG lánctól mentes dekorin biológiailag aktív. A transzgénikus szervezetek, például állatok, a GAG lánctól mentes dekorin előnyös forrásai, és ezen állatokban homogénebb dekorinpreparátumot lehet előállítani.

A találmány más tulajdonságai és előnyei az alábbi részletes leírásból es a mellékelt igénypontokból világosak lesznek.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldást.

Transzgénikus emlősök

Embertől eltérő transzgénikus állatok generálására szolgáló eljárásokat e részben és az alábbi „példák című részben írunk le.

Ilyen eljárások során transzgénikus emlős előállítására DNS-konstrukciókat vihetünk be az emlős ivarsejtjeibe. Például, a konstrukció egy vagy több kópiáját építhetjük be az emlős embriójába standard transzgénikus eljárások alkalmazásával .

Bár párosujjú patások közé tartozó kérődzők (szarvasmarhafélék) és kecskék az előnyösek, más, az embertől eltérő emlősök is alkalmazhatok. Előnyös, az embertől eltérő állatok, kérődzők, például tehén, juh, tevék és kecskék. További előnyös, az embertől eltérő állatok közé tartoznak lovak, sertések, nyulak, egerek és patkányok. Sejtmagtranszferen alapuló eljárásokra, a sejtek -például génsebészettel módosított sejt - forrásaként alkalmazott emlős kiválasztása az előállítani kívánt transzgénikus emlőstől függ. Például, szarvasmarhából származó genomot alkalmazhatunk szarvasmarha oocitával történő sejtmagtranszferre.

A technikában ismertek a különféle transzgénikus állatok előállítására szolgáló eljárások. A technikában ismertek a transzgénikus kecskék előállításnak leírásai. Például, transzgént vehetünk be a kecske ivarsejtjébe mikroinjekcióval, például Ebert és mtsai. [Bio/Technology 12, 699b (1994)] szerint vagy sejtmag-transzfer eljárásokkal, például, a WO 98/30683 sz. nemzetközi bejelentésben leírtak szerint. Transzgénikus sertés előállításának leírását megtaláljuk számos publikációban megtalálhatjuk [White és Yannoutsos, Current topics in complement research; 64th Forum in Immunology, 88-94; US5.523.226 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; US5.573.933 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; WO95/04744 sz. nemzetközi bejelentés]. Transzgénikus patkány előállítására szolgáló eljárást írt le Bader és Ganten [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 3., S81 —S87 (1996)], míg transzgénikus szarvasmarha előállításának leírását is publikálták mások [US5.741.957 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; WO98/30683 sz. nemzetközi bejelentés; és Transgenic animal technology, A handbook, szerk.: Pinkert, kiad.: Academic Press, Inc. (1994)]. Transzgénikus juh előállításának leírását is megtalálhatjuk az irodalomban [WO97/07669 sz. nemzetközi közzétételi irat; és

Transgenic animal technology, A handbook, kiad.: Academic Press, Inc. (1994)].

szerk.: Pinkert,

Transzfektált sejtvonalak

Transzgénikus állat létrehozásának céljából, sejtmag transzferével előállított, génsebészeti úton módosított sejtekhez olyan sejtvonalból juthatunk, amelybe a kérdéses nukleinsavat, például fehérjét kódoló nukleinsavat, vittünk be.

Valamely konstrukciót sejtbe bevihetünk hagyományos transzformációs vagy transzfekciós eljárásokkal. A leírás szerinti értelemben, a „transzfekció és „transzformáció kifejezés különféle olyan eljárásokat foglal magában, amellyel transzgénikus szekvenciát gazdasejtbe vihetünk be, így például, kalciumfoszfát vagy kalciumklorid koprecipitáció, DEAE-dextrán által közvetített transzfekció, lipofekció vagy elektroporáció. Ezen felül, biológiai vektorok, például vírusvektorok, is alkalmazhatók az alábbiakban leírtak szerint. Gazdasejtek transzformálására vagy transzfektálására alkalmas eljárások az irodalomban ismertek [lásd például, Sambrook és mtsai., Molecular cloning: A laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989); és más alkalmas laboratóriumi kézikönyvek].

Két alkalmas megközelítés az elektroporáció és lipofekció. Ezekre az alábbiakban találunk rövid példákat.

A DNS-konstrukció elektroporációval stabilan bevihető valamely donor sejtvonalba, például embriósejt - például, embrionális szomatikus sejtvonal-, az alábbi leírás szerint: a sejteket PBS-ben felszuszpendáljuk (4*10⁶ sejt/ml). Ötven mikrogramm linearizált DNS-t adunk 0,5 ml sejtszuszpenzióhoz, és a szuszpenziót 0,4 cm es elektród résküvettába (electro gap cuvette) (BioRad) helyezzük. Az elektroporációt BioRad Gene Pulser elektroporátorban végezzük 330 V impulzussal (25 mA áramerősség, 1000 μΡ, végtelen ellenállás). Amennyiben a DNS—konstrukció szelekciós célból Neomicinrezisztencia-gént tartalmaz, neomicinre rezisztens kiónokat szelektálunk 350 μg/ml G418-cal (Gibco BRL), 15 napig történő inkubálással.

A DNS-konstrukció lipofekcióval stabilan bevihető valamely donor sejtvonalba, például az alábbi leírás szerint: körülbelül 2*10⁵ sejtet 3,5 cm átmérőjű lemezre kenünk ki és 2 pg linearizált DNS-sel, LipofectAMINE™ (Gibco BRL) alkalmazásával transzfektálunk. A transzfekció után 24 órá val a sejteket 1:1000 és 1:5000 arányban szétosztjuk, és ezekhez — amennyiben a DNS—konstrukció szelekciós célból Neomicinrezisztencia-gént tartalmaz - G418-at adunk 0,35 mg/ml végkoncentrációban. Neomicinre rezisztens kiónokat izolálunk és szaporítunk fagyasztva-tárolásra és sejtmagtranszferre .

Fehérjék szövetspecifikus expressziója

Gyakran kívánatos, hogy valamely fehérjét, például heterológ fehérjét, a transzgénikus állat specifikus szövetében vagy folyadékában, például a tejben, vérben vagy vizeletben, expresszáljunk. A heterológ fehérjét kinyerhetjük abból a szövetből vagy folyadékból, amelyben az expresszió megtörtént. Például, gyakran kívánatos az, hogy a heterológ fehérjét tejben expresszáljuk. Heterológ fehérjék tejre specifikus promoter szabályozása alatti előállítására szol gáló eljárásokat az alábbiakban írunk le. Ezenfelül, más szövtespecifikus promótereket, és más szabályozó elemeket, például szignálszekvenciákat és a nem szekretálódó fehérjék szekrécióját elősegítő szekvenciákat az alábbiakban írunk le.

Tejre specifikus promóterek

Alkalmas promóterek azok a promóterek, amelyek előnyösen az emlő epiteliumsejtjeiben aktiválódnak, ideértve tej fehérjéit kódoló géneket - például, kazeinek génjeit, β-laktoglobulin génjét [Clark és mtsai., Bio/Technology 7, 487-492 (1989)], tejsavó-fehérje génjét [Gordon és mtsai., Bio/Technology 5, 1183-1187 (1987)], és laktalbumin génjét [Soulier és mtsai., FEBS Lett. 297, 13 (1992)] - szabályozó promótereket. Kazeinpromóterek származhatnak bármely emlősfaj a-, β-,γ-, és κ-kazeinjét kódoló génből; az előnyös promoter a kecske β-kazeinjét kódoló génből [DiTullio, Bio/Technology 10, 74-77 (1992)] származik. Tejre specifikus fehérjepromóter vagy az emlősejtekben specifikusan aktiválódó promóterek származhatnak cDNS vagy genomi szekvenciákból, azonban előnyösen genomi eredetűek.

Az emlőmirigy, fent felsorolt specifikus génjeire vonatozó DNS-szekvencia-információ elérhető legalább egy, de gyakran számos szervezet esetében [lásd például, Richards és mtsai., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (patkányeredetű cclaktalbumin) ; Campbell és mtsai., Nucl. Acid Res. 12, 8685-8697 (1984) (patkányeredetű WAP); Jones és mtsai., J. Bioi. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (patkányeredetű βkazein); Yu-Lee és Rosen, J. Bioi. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (patkányeredetű γ-kazein); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (emberi α-laktalbumin); Stewart, Nucl. Acid Res. 12, 389 (1984) (szarvasmarha-eredetű asl- és κ-kazein cDNS-ei); Gorodetsky és mtsai., Gene 66, 87-96 (1988) (szarvasmarha-eredetű β-kazein); Alexander és mtsai., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (szarvasmarha-eredetű k— kazein); Brignon és mtsai., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (szarvasmarha-eredetű as2-kazein); Jamieson és mtsai., Gene 61, 85-90 (1987); Ivanov és mtsai., Biol. Chem. HoppeSeyler 369, 425-429 (1988); Alexander és mtsai., Nucl. Acid Res. 17, 6739 (1989) (szarvasmarha-eredetű β-laktalbumin); Vilotte és mtsai., Biochimie 69, 609-620 (1987) (szarvasmarha-eredetű a-laktalbumin)]. A különböző tejfehérjegének szerkezetét és funkcióját Mercier és Vilotte [Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993)] foglalta össze (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). Amennyiben további túlnyúló szekvenciák alkalmasnak bizonyulnak a heterológ fehérje expressziójának optimalizálására, ilyen szekvenciát klónozhatunk a már meglevő szekvenciák próbaként történő alkalmazásával. Emlőmirigyre specifikus szabályozó szekvenciákat különböző szervezetekből úgy állíthatunk elő, ha ilyen szervezetekből származó könyvtárakon, ismert rokon nukleotidszekvenciák alkalmazásával vagy rokon fehérjék elleni antitestekkel, mint próbákkal, szűrővizsgálatot végzünk.

Szignálszekvenciák

Alkalmas szignálszekvenciák tejspecifikus szignálszekvenciák vagy olyan más szignálszekvenciák, amelyek eukarióta vagy prokarióta fehérjék szekrécióját eredményezik. A szignálszekvenciát előnyösen tej specifikus szignálszekvenciák közül választjuk ki, azaz olyan gén szignálszekvenciáját választjuk, amely tejbe szekretálódó terméket kódol. Legelőnyösebben, a tej specifikus szignálszekvencia az alábbi konstrukcióban alkalmazott promóterrel áll összefüggésben. A szignálszekvencia mérete nem lényeges. A szekvenciának megfelelő méretűnek kell lennie ahhoz, hogy hatást gyakoroljon a kívánt rekombináns fehérje szekréciójára, például, az emlő szövetállományában. Például, alkalmazhatunk kazeineket, például α-, β-,γ-, és κ-kazeint, βlaktoglobulint, tejsavófehérjét, és laktalbumint kódoló génekből származó szignálszekvenciát. Előnyös szignálszekvencia a kecske β-kazeinjének szignálszekvenciája.

Más, szekretálódó fehérjék, például, vesesejtek, hasnyálmirigy-sejtek vagy májsejtek által szekretált fehérjék — szignálszekvenciáit is alkalmazhatjuk. A szignálszek— vencia előnyösen a fehérje, például, vizeletbe vagy vérbe történő szekretálódását eredményezi.

Más szövetekre specifikus promóterek

Egy konkrét szövetben expressziót biztosító, más szövetspecifikus promóterek is alkalmazhatók. A szövetspecifikus promóterek olyan promóterek, amelyek egy konkrét szövetben sokkal erősebben expresszálódnak mint a többiben. Szövetspecifikus promóterek gyakran kizárólag a specifikus szövetben expresszálódnak. Például, ha a megváltoztatott fehérje normális körülmények között a májban expresszálódik, alkalmazhatunk májra specifikus promótert. Ugyan ez történik abban az esetben, amikor szupresszor tRNS-t alkalmazunk szérumalbumin megváltoztatására. Ebben a helyzetben, a szupresszor tRNS-t kódoló transzgénikus szekvencia lehet a májra specifikus promoter szabályozása alatt.

Alkalmas szövetspecifikus promóterek például az alábbiak: idegspecifikus promoter, például nestin, Wnt-1, Pax1, Engrailed-1, Engrailed-2, Sonic hedgehog; máj specifikus promoter, például albumin, alpha-1, antitripszin; izomspecifikus promoter, például miogenin, aktin, MyoD, miozin; oocitára specifikus promoter, például ZP1, ZP2, ZP3; herékre specifikus promoter, például protamin, fertilin, synaptonemalis complex protein-1; vérre specifikus promoter, például globulin, GATA-1, porfobilinogén deamináz; tüdőspecifikus promoter, például felületaktív fehérje C; bőr- és gyapjúspecifikus promoter, például keratin, elasztin; endotéliumra specifikus promóterek, például Tie-1, Tie-2; és csontspecifikus promoter, például BMP.

Ezenfelül, általános promóterek is alkalmazhatók számos szövetben történő expresszióra. Ilyen általános promóterek például az alábbiak: β-aktin, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A, és Jun-B.

Szigetelő {insulator) szekvenciák

A transzgénikus állat előállítására alkalmazott DNS— konstrukciónak tartalmazhat legalább egy szigetelő szekvenciát. A leírás szerinti értelemben, a „szigetelő , „szige telő szekvencia és „szigetelő elem kifejezések egymással felcserélhetően alkalmazhatók. A szigetelő elem olyan szabályozó elem, amely hatáskörén belül elszigeteli a genek transzkripcióját, azonban - sem negatívan, sem pedig pozitívan - nem avatkozik be a gének expressziójába. Szigetelő szekvenciát, előnyösen, 200 bp - 1 kb távolságra helyezzük el a promótertől 5' irányba, és a kérdéses gén 3' végénél, legalább 1-5 kb távolságra a promótertől. A szakember meg tudja határozni a szigetelő szekvencia távolságát a promótertől és a kérdéses gén 3' végétől annak ismeretében, hogy a kérdéses génnek, a konstrukcióban alkalmazott promóternek és enhancernek mekkora a relatív mérete. Ezenfelül, egynél több szigetelő szekvencia is elhelyezhető a promótertől 5' irányba vagy a transzgén 3' végénél. Például, két vagy több szigetelő szekvenciát helyezhetünk el a promótertől 5' irányban. A transzgén 3' végénél, a szigetelő vagy szigetelők elhelyezhetők a kérdéses gén 3' végénél vagy a 3' szabályozó szekvencia - például, 3' nem transzlálódó régió (UTR) vagy 3' túlnyúló szekvencia - 3' végénél .

Az előnyös szigetelő olyan DNS—szegmens, amely a csirkeeredetű β-globin lokusz 5' végét övezi és megfelel a csirkeeredetű 5' konstitutív hiperérzékeny helynek

- 47 [WO94/23046 sz. nemzetközi bejelentés; amelynek tartalma a kitanítás részét képezi].

DNS-konstrukciók

Heterológ fehérjét kódoló kazettát az alábbiakat tartalmazó konstrukcióvá állíthatunk össze: promoter, például szövetre — például az emlő epitéliumsejtjeire, például ka zeinra, például kecskeeredetű β-kazeinra - specifikus promoter; tej specifikus szignálszekvencia, például kazein szignálszekvenciája — például β—kazein szignálszekvenciája -; és a heterológ fehérjét kódoló DNS.

A konstrukció, tartalmazhat még 3' nem transzlálódó régiót a nem szekretálódó fehérjét kódoló DNS-től 3' irányban. Ilyen régió stabilizálhatja az expresszios rendszer működésekor keletkező RNS-transzkriptumot és így növeli az expresszios rendszerből a kívánt fehérje kitermelését. A találmány szerinti konstrukciókban alkalmazható 3' nem transzlálódó régiók között poly—A szignált szolgáltató szekvenciák is vannak. Ilyen szekvenciák származhatnak, például az SV40 kisméretű τ antigénjéből, a kazein 3' nem transzlálódó régiójából vagy a technikában ismert más 3' nem transzlálódó régióból. A találmány egyik szempontja szerint, a 3' nem transzlálódó régió tejspecifikus fehérjéBől származik. A 3' nem transzlálódó régió mérete nem lé nyeges, azonban poly-A transzkriptumának stabilizáló hatása lényegesnek tűnik az expresszios szekvencia RNS-ének stabilizálásában .

Igény szerint, a konstrukció tartalmazhat 5' nem transzlálódó régiót a promoter és a szignálszekvenciát kódoló DNS-szekvencia között. Ilyen nem transzlálódó régió származhat ugyanabból a szabályozó régióból, ahonnan a promoter ered vagy származhat más génből, például származhat más szintetikus, félszintetikus vagy természetes forrásokból. Ezek specifikus mérete szintén nem lényeges, azonban hasznosak lehetnek az expresszió szintjének fokozására.

A konstrukció tartalmazhat körülbelül 10%-ot, 20%-ot, 30%-ot vagy többet az emlő epitéliumsejtjeiben előnyösen expresszálódó gén N-terminális kódoló régiójából. Például, az N-terminális kódoló régió megfelelhet az alkalmazott promóternek, például kecskeeredetű β-kazein N-terminális kódoló régiója.

A konstrukciót a technikában ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. A konstrukciót egy nagyobb plazmid részeként is elkészíthetjük. Ilyen preparátumok lehetővé teszik a helyes konstrukció hatékonyan történő klónozását és kiválasztását. A konstrukciót elhelyezhetjük két kényelmesen alkalmazható restrikciós hely közé a plazmidban, így a kívánt állatba történő beépítés esetén a konstrukciót könnyen el tudjuk különíteni a plazmidszekvenciák többi részétől.

Gyógyászati készítmények

A találmány szerinti, transzgénikus úton előállított polipeptid vagy preparátum beépíthető betegség vagy elváltozás, például rák vagy invazív bőrsérülések, például égési sérülések, csillapítására, gátlására, kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítménybe. A készítmény nek tartalmaznia kell a transzgénikus úton előállított dekorin terápiás vagy profilaktikus mennyiségét gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagban vagy a transzgénikus állat tejében.

A gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyag lehet bármely kompatíbilis, nem toxikus anyag, amely alkalmas a polipeptid páciensbe történő bevitelére. Steril víz, alkohol, zsírok, viaszok és inert, szilárd halmazállapotú anyagok alkalmazhatók hordozóanyagként. Gyógyászati szempontból elfogadható adjuvánsok, pufferképző-ágensek, diszpergáló ágensek, és hasonlók szintén beépíthetők a gyógyászati készítménybe. A transzgénikus úton előállított polipeptid vagy más aktív ágens koncentrációja a gyógyászi készítményben széles határok között változhat, például kevesebb mint körülbelül 0,1%-tól (tömegre nézve) általában legalább 1% és 20% közötti koncentrációig vagy lehet ennél magasabb arányú is.

Orális bevitel esetén, az aktív összetevőt szilárd dozírozású formákban, mint például kapszulák, tabletták és porok vagy folyékony dozírozású formákban, mint például elixírek, szirupok és szuszpenziók, adhatjuk be. Aktív öszszetevő(ke)t az inaktív összetevőkkel és porított hordozókkal, mint például glükóz, laktóz, szacharóz, mannitol, keményítő, cellulóz vagy cellulóz származékok, magnéziumsztearát, sztearinsav, nátrium szacharinét, talkum, magnéziumkarbonát és hasonlók, együtt kapszulázhatjuk zselatinkapszulákba. A készítménynek megfelelő színt, ízt, stabilitást, pufferkapacitást, diszperziót vagy más ismert, kívánt tulajdonságokat biztosító további inaktív összetevőket - például vörös vasoxidot, szilikagélt, nátrium-laurilszulfátot, titánoxidot, ehető fehér tintát és hasonlókat adhatunk a készítményhez. Hasonló oldószereket alkalmazhatunk préselt tabletták készítésére. Mind a tablettákat és mind pedig a kapszulákat elő lehet állítani késleltetett felszabadulás biztosító termékként, így biztosítva a gyógyszer órákon át tartó, folyamatos felszabadulását. Préselt tabletták lehetnek cukorral vagy filmmel bevontak a tabletta kellemetlen ízének elfedése vagy a tablettának a környezeti hatások elleni védelme céljából vagy bevonatosak a gyomor-bél traktusban történő szelektív felbomlás biztosítására. Orális beadásra szánt folyékony dozírozású formák tartalmazhatnak színesítő és ízesítő anyagokat azért, hogy a készítmény a páciens számára elfogadhatóbb legyen.

Orron át történő beadásra a polipeptideket aeroszolként formulázhatjuk. A leírás szerinti értelemben, az „aeroszol kifejezésbe tartozik bármilyen, a találmány szerinti vegyület gázzal készült szuszpenziós fázisa, amelyet a bronchiolákba vagy az orrjáratokba lehet inhalálni. Konkrétan, aeroszolnak tekintjük a találmány szerinti vegyületek cseppjeinek gázzal készült szuszpenzióját, amelyet dózisinhalátorban vagy porlasztókészülékben vagy ködporlasztóban állathatunk elő. Aeroszolok közé tartozik a levegőben vagy más vivőgázban szuszpendált, találmány szerinti vegyületet tartalmazó készítmény száraz pora, amelyet például inhalátor alkalmazásával adhatunk be [lásd, Ganderton és Jones, Drug delivery to the respiratory tract, kiad.:

Ellis Horwood (1987); Gonda, Crit. Revs. Ther. Drug Carrier Syst. 6, 273-313 (1990); és Raeburn és mtsai., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 27, 143-159 (1992)].

Készítmények

A készítmény tartalmaz transzgénikus úton előállított dekorint. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a készítmény tartalmaz transzgénikus dekorint, és legalább egy, a dekorintól eltérő táplálkozási összetevőt. Táplálkozási összetevő lehet, például fehérje, például tejfehérje; vitamin, például A vitamin, B vitamin, D vitamin; szénhidrát; ásványi anyag, például kalcium, foszfor, vas. A készítmény lehet szilárd vagy folyékony halmazállapotú. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a készítmény tartalmaz még folyékony hordozóanyagot, például diluenst, például vizet.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, e készítmények alkalmasak orális, topikális vagy intravénás illetve intramuszkuláris beadásra valamely alanynak. A készítmények alkalmasak terápiás és/vagy étkezési alkalmazásokra .

Étkezési anyagok

Transzgénikus dekorin valamely étkezési anyag részét képezheti. Az előnyös táplálék a találmány szerinti transzgénikus fehérjét expresszáló, transzgénikus emlőstől nyert tej vagy tejtermék vagy transzgénikus növényből származó növényi rész. Egyéb étkezési anyagok lehetnek például - minden korlátozás nélkül - a találmány szerinti transzgénikus fehérjét tartalmazó desszertek, jégkrémek, pudingok, zselék mellett, levesek és üdítőitalok is. Ezen felül, a találmány szerinti izolált fehérje előállítható ismert adalékanyagokat, hordozóanyagokat, térfogatnövelőket és diluenseket is tartalmazó vagy nem tartalmazó por vagy tabletta formájában. Étkezési anyagok az irodalomban ismertek [Hegenhart, Food product design (1993. dec.)].

Transzgénikus növények

A transzgénikus szervezet lehet transzgénikus növény, amelyben a DNS transzgént a sejtmag vagy a plasztidok genomjába illesztettük be. A növények transzformációja a technikában ismert [lásd általában, Methods Enzymol., 153, szerk.: Wu és Grossman, kiad.: Academic Press (1987); és EP693554 sz. európai közzétételi irat].

Idegen nukleinsav mechanikus úton, mikroinjekcióval, mikropipetták alkalmazásával is transzferálható növényi sejtbe. Idegen nukleinsav transzferálható növényi sejtbe polietilénglikol alkalmazásával, amely a genetikai anyaggal precipitációs komplexet képez és ezt a sejt felveszi [Paszkowski és mtsai., EMBO J. 2' 2712-2722 (1984)].

Idegen nukleinsavat bevihetünk növényi sejtbe elektroporációval [Fromm és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 5824 (1985)]. Ezen eljárásban, növényi protoplasztokat elektroporálunk a releváns genetikai konstrukciót tartalmazó plazmidok vagy nukleinsavak jelenlétében. A biomembránokat nagy térerejű elektromos impulzusokkal reverzibilisen permeabilizálva lehetővé tesszük a plazmid bevitelét. Elektroporált növényi protoplasztok újraépítik a sejtfalat, osztódnak, és növényi kalluszt képez53

nek. A transzformált génnel transzformált növényi sejteket fenotipusos markerek alkalmazásával szelektálhatunk.

Karfiol-mozaikvirus (CaMV) szintén alkalmazható vektorként idegen nukleinsav bevitelére növényi sejtekbe [Hohn és mtsai., Molecular biology of plant tumors, 549-560, kiad.: Academic Press, New York (1982); US4.407.956 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. CaMV vírus DNS-genomjának, parentális bakteriális plazmidba történő beillesztésével baktériumban szaporítható, rekombináns DNS molekulát állíthatunk elő. Klónozás után, a rekombináns plazmidot újra klónozhatjuk és tovább módosíthatjuk a kívánt DNS-szekvenciának a linker egyedi restrikciós helyére történő bevitelével. Ezután, a rekombináns plazmád módosított vírusrészét kivághatjuk a parentális bakteriális plazmidból, és a növényi sejtek vagy növények oltására alkalmazzuk .

Idegen nukleinsavak növényi sejtbe történő bevitelére szolgáló másik eljárás a nukleinsavat belül vagy a felszínén hordozó kisméretű partikulumok (vagy apró gyöngyök), nagy sebességű ballisztikus behatolásán alapul [Klein és mtsai., Nature 327, 70-73 (1987)]. Bár jellemzően, valamely új nukleinsav-szegmentumnak csak egyszeri bevitele szükséges, ezen eljárás különösen alkalmas többszörös bevitelre.

A nukleinsav növényi sejtbe történő bevitelére szolgáló előnyös eljárás a növényi sejt, explantátum, merisztéma vagy mag fertőzése a nukleinsavval transzformált Agrobactérium tumefacienssel. A technikában ismert megfelelő körülmények között, a transzformált növényi sejtet sza*« • « · « · ·

- 54 poritjük hajtások, gyökerek növesztésére, és a továbbiakban növénnyé fejlődésre. A nukleinsavakat alkalmas növényi sejtekbe vihetjük be az Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidjának segítségével. A Ti plazmád az Agrobacterium tumefacienssel történő fertőzés esetén a növényi sejtekbe kerül át, és stabilan integrálódik a növény genomjába [Horsch és mtsai., Science 233, 496-498 (1984); Fraley és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 4803 (1983)].

A Ti plazmid két, a transzformált sejtek előállítása szempontjából lényeges régiót tartalmaz. Ezek egyike, a „transfer DNA (transzfer DNS, T DNA) elnevezésű tumor kialakulását indukálja. A másik, „a virulens régió nevű, pedig elengedhetetlen a T DNS növényekbe történő beviteléhez. A transzfer DNS-régió, amely a növényi genomba történő transzfert végzi, méretében megnövelhető az idegen nukleinsav-szekvencia beillesztésével anélkül, hogy a fertőzőképesség megváltozna. A tumort okozó gének eltávolításával módosított Ti plazmidot alkalmazhatjuk vektorként a találmány szerinti génkonstrukció, megfelelő növényi sejtbe történő transzferére.

Jelenleg legalább három különböző út létezik a növényi sejtek Agrobacteriummal történő transzformálására: (1) Agrobactériummal együtt inkubálunk tenyésztett, izolált protoplasztokat; (2) Agrobacteriummal sejteket vagy szöveteket transzformálunk; vagy (3) Agrobacteriummal magokat vagy merisztémadarabokat transzformálunk. Az első eljáráshoz olyan, megalapozott tenyésztési rendszerre van szükség, amely lehetővé teszi protoplasztok tenyésztését és tenyész

- 55 tett protoplasztokból a növények regenerálását. A második eljáráshoz Agrobactériummal transzformálható növényi sejtekre vagy szövetekre van szükség és ahhoz, hogy a transzformált sejteket vagy szöveteket indukálni tudjuk egész növénnyé történő regenerálás céljából. A harmadik eljárásban mikrotenyésztésre van szükség.

A bináris rendszerben a fertőzéshez két plazmádra van szükség: T DNS-t tartalmazó plazmidra és vir plazmidra. Bármely számú T-DNS-tartalmú plazmidot alkalmazhatunk, az egyedüli megkötés az, hogy képesek legyünk egymástól függetlenül szelektálni a két plazmidra külön—külön.

A növényi sejt vagy növények transzformálása után, a Ti plazmiddal transzformált, tehát kívánt DNS-szegmenst integráltan tartalmazó, növényi sejteket vagy növényeket bármilyen megfelelő fenotípusos marker alapján szelektáljuk. Ilyen fenotípusos marker lehet - minden korlátozás nélkül antibiotikum-rezisztencia, herbicidrezisztencia vagy vizuális szemrevételezés. Más, a technikában ismert fenotípusos markerek is alkalmazhatók a találmány megvalósításában.

Olyan növényeket, amelyekből protoplasztokat lehet izolálni és tenyészteni abból a célból, hogy egész növényeket regenerálhassunk, oly módon transzformálhatunk, hogy a felnevelt növény tartalmazza a transzformait idegen gént. Néhány alkalmas növény lehet például az alábbiak bármelyike: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrynchis, Trifolium, Inigone11a, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum,

Petunia, Digitalis, Majoránna, Ciohorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hereocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum és Datura génuszokból származó fajok .

Számos növényt regenerálhatunk tenyésztett sejtekből vagy szövetekből. A leírás szerinti értelemben, a „regenerálás kifejezés növényi sejtből, növényi sejtek csoportjából, növényi részből vagy növénydarabból (például, protoplaszt, kallusz vagy szövetdarab) egész növény felnevelését jelenti [Methods in Ezymology, 153. köt., szerk.: Wu és Grossman, kiad.: Academic Press (1987); Methods in Ezymology, 118. köt., szerk.: Wu és Grossman, kiad.. Academic Press (1987); Klee és mtsai., Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467-486 (1987)].

Tenyésztett protoplasztból történő növényregeneráció az irodalomban ismert [Protoplast isolation and culture, Handbook of plant cultures 1, 124—176, kiad.: MacMillan Publishing Co, New York (1983); Davey, Recent developments in the culture and regeneration of plant protoplasts, Protoplasts - Lecture Proceedings, 12-29, szerk.: Birkhauser (1983); Dale, Protoplast culture and plant regeneration of cereals and other recalcitrant crops, Protoplasts - Lecture Proceedings, 31-41, szerk.: Birkhauser (1983); és Binding, Regeneration of plants, Plant Protoplasts, 21-73, kiad.: CRC Press, Boca Raton (1985)] .

A protoplasztok regenerációja a növényeknél fajonként eltér, de általában először az exogén szekvencia kópiáit tartalmazó, transzformált protopasztok szuszpenzióját készítjük el. Bizonyos fajok esetében, ekkor a protoplaszt szuszpenzióból csira kialakulását indukálhatjuk a természe tes csírának megfelelően végbemenő csrrázási és érési stá diumba. A tenyészoldat tartalmazhat különféle aminosavakat és hormonokat, mint például auxinokat és citokineket. Elő nyös lehet az, ha a tápoldathoz glutaminsavat és prolint adunk (különösen olyan fajok esetében, mint a kukorica és lucerna). Hajtások és gyökerek normális esetben szimultán fejlődnek. A hatékony regenerálás a tápoldattól, a genotípustól és a tenyészet történetétől függ. Ha e változókat szabályozzuk, akkor a regenerálás teljes mértékig reprodu kálható és megismételhető.

Vegetatív úton szaporítható növények esetében, az érett transzgénikus növényeket tesztek, mint például termelési jellemzők vizsgálata, céljából úgy szaporítunk, hogy nyesedékeket vágunk vagy szövettenyésztési eljárásokat alkalmazunk több, azonos növény előállítására. A kívánt transzgénikus növényt szelektálásával új változatokhoz jutunk, amelyeket kereskedelmi célból vegetatív úton továbbszaporítunk. Maggal szaporítható növényeknél, az érett transzgénikus növényt önmagával keresztezzük homozigóta, beltenyésztett növény előállítása céljából. A beltenyésztett növény által termelt magok tartalmazzák az újonnan beillesztett, idegen gén aktivitását kódoló gént. E magokat felnevelhetjük a szelektált fenotípust mutató nővé nyék előállítására. A találmány szerinti beltenyésztett növények új hibridek kifejlesztésére alkalmazhatók. Ezen eljárásban a szelektált beltenyésztett vonalat egy másik beltenyésztett vonallal keresztezve hibridet állítunk elő.

A találmány tárgyát képező, regenerált növényi részek, mint például virágok, magok, levelek, ágak, gyümölcs és hasonlók gondoskodnak arról, hogy e részek a fentiekben leírtak szerint transzformált sejteket tartalmazzanak. Az utódok és változatok, és a regenerált növények mutánsai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak, és gondoskodnak arról, hogy e részek tartalmazzák a bevitt DNSszekvenciát. Az utódok és változatok, és a regenerált növények mutánsai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Azonban, bármilyen további vektorszekvencia, amely a bevitt nukleinsav-fragmentum - a genomba történő integráció folyamata során fennálló — degradálódása elleni reziszten ciát szolgáltat vagy a transzformált sejtek vagy növények szelektálását megkönnyíti, előnyös és nagymértékben csökkenti az alkalmazható transzgénikus növények vagy növényi sejtek szelektálásának problémáját.

Transzgénikus növények vagy növényi sejtek szelektálása jellemzően vizuális esszén alapul, mint például színváltozások megfigyelése (például fehér virág, változatos pigmenttermelés, és egységes színmintázat a növényeken vagy nem szabályos mintázat) , de lehet enzimaktivitás vagy termékmennyiség vizsgálatára irányuló biokémiai esszé. Transzgénikus növények vagy növénnyé fejlődött transzgénikus növényi sejtek hordozzák a kérdéses növényi részt és a génaktivitások nyomonkövethetők, például részt és a génaktivitasok nyomonkövethetók, például lathato megjelenés alapján (flavonoid gének esetében) vagy biokémiai esszékkel (Northern biotok); Western biotokkal; enzim esszékkel és flavonoid vegyületek kimutatására irányuló esszékkel, például spektroszkópiával [The flavonoids szerk.: Harborne, kiad.: Academic Press (1975)]. Megfelelő növényeket szelektálunk és tovább értékelünk. Génsebészeti úton előállított növények generálására szolgáló eljárások részletesen le vannak írva az irodalomban [US5.283.184 sz. és US5.482.852 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és EP 693554 sz. európai közzétételi irat].

Tejből történő tisztítás

A transzgénikus fehérje viszonylag magas koncentrációban és nagy térfogatban állítható eló tejben, ezáltal fo lyamatosan nagy mennyiségű, normálisan processzált pepiidhez juthatunk, amelyet megújuló forrásból könnyen összegyűjthetünk. A technikában számos eljárás ismert a tejből történő fehérje izolálására.

Tejfehérjéket általában különböző folyamatok kombinálásával izolálunk. A nyers tejet először is a zsírok eltá volítására frakciónáljuk, például fölözéssel, centrifugá— lássál, ülepítéssel [Swaisgood, Development in dairy chemistry, I: Chemistry of milk protein, kiad.: Applied Science Publishers, NY (1982)] vagy savas lecsapással [US4.644.056 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat], illetve reninnel vagy kimotripszinnel végzett enzimatikus koagulálással [Swaisgood, mint fent]. Ezután, a főbb tejfehérjéket vagy tiszta oldattá vagy pedig ömlesz tett csapadékká frakcionáljuk, amelyből a kérdéses fehérje könnyen tisztítható.

A 248764 sz. francia szabadalmi irat leírja a tejfehérjék sovány tejből vagy tej savóból történő izolálását membránon végzett ultraszűrés és méretkizárásos kromatográfia vagy ioncserélő kromatográfia kombinálásával. Először tejsavót állítanak elő a kazein, tejoltónak használt szárított oltógyomorral vagy tej savval végzett koagulálásával. Az US4.485.040 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírják, hogy a tej savó két, egymást követő ultraszűrése után a visszamaradt oldat gazdag volt alaktoglobulinban. Az US4.644.056 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat tárgya eljárás immunglobulin tisztítására tejből vagy kolosztrumból, amely eljárásban savas lecsapást végeztek pH 4,0-5,5-ön, majd először keresztáramlásos szűrést végeztek 0,1-1,2 pm pórusméretű membránon a termék tisztítására, ezután 5-80 kd membránon töményítették a terméket.

Hasonlóképpen, az US4.897.465 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat ismerteti valamely fehérje, például immunglobulin vérszérumból, tejfehérjéből vagy tejsavóból történő töményítését és dúsítását fémoxidmembránon, pH-eltolással végzett, egymást követő ultraszűréssel. Először a szűrtek a kiválasztott fehérje izoelektromos pontja (pl) alatti pH-értéken az ömlesztett kontaminánsok eltávolítására a fehérjeoldatból, és ezután szűrtek a kiválasztott fehérje pl-értéke fölötti pH-η a szennyeződések visszatartására és a kiválasztott fehérjét az átfolyó oldatba nyomták. Eltérő, szűréssel történő tömé nyítési eljárást ismertetnek az EP 467482B1 sz. európai szabadalmi iratban, amelyben zsírmentesített sovány tej pHját lecsökkentették 3-4-re, a tejfehérjék pl-értéke alá, a kazein és tej savó-fehérjék szolubilizálására. Három, egymást követő ultraszűrés vagy diafiltráció után, a fehérjéket betöményítették 15-20% szárazanyag-tartalmú oldatra, amely szárazanyag 90%-a fehérje volt. Másfelől, a 2179947 sz. brit szabadalmi irat ismerteti a laktoferrin izolálását tejfehérjéből, amely eljárásban ultraszűréssel töményítették a mintát, majd gyenge kationcserélő kromatográfiát végeztek semleges pH—n. Nem ismertették a tisztaság fokát. A WO95/22258 sz. nemzetközi bejelentésben, fehérjét, például laktoferrint, vontak ki olyan tejből, amelynek ionerősségét először, koncentrált só hozzáadásával magasra állították be, majd ezt követően kationcserélő kromatográfiát végeztek .

Ezen eljárások mindegyikében, a tejet először a szűrésre alkalmazott membránokat vagy kromatográfiás gyantát elszennyező zsírok, lipidek és más partikuláris anyag eltá volítása céljából kezelték. Az így előállított kiindulási frakció kazeint, tejsavó-eredetű fehérjéket vagy a tej öszszes fehérjéit tartalmazta, amelyből a kérdéses fehérjét izolálták.

A WO94/19935 sz. nemzetközi bejelentésben ismertet eljárás során biológiailag aktív fehérjét izoláltak tejből úgy, hogy az összes tejfehérje oldékonyságát pozitív töltésű ágenssel, például argininnel, imidazollal vagy Bis

Trissel, stabilizálták. E kezelés során tisztított oldat jött létre, amelyből a fehérjék izolálhatok voltak, például membránokon át történt szűréssel (amelyek egyébként eltömődtek volna a kicsapódott fehérjéktől).

Az 08/648.235 bejelentési számú USA-beli szabadalmi bejelentés eljárást ismertet oldható tej komponensek, például peptidek, biológiailag aktív formában történő izolálására teljes tejből vagy tejfrakcióból tangenciális átfolyásos szűrés alkalmazásával. A korábbi izolálási eljárásoktól letérőén, ezen eljárásban nem szükséges a teljes tej első frakcionálása, azaz a zsír és a kazein micellák eltávolítása, ezáltal a folyamat egyszerűbb és elkerüli a visszanyerésből származó veszteségeket és a bioaktivitás csökkenését. Ezen eljárás, további tisztítási lépésekkel kombinálva alkalmazható a kontaminánsok további eltávolítására és a kívánt komponens tisztítására.

A dekorin szekvenciája

A leírás szerinti értelemben, a „dekorin kifejezés a dekorinnak legalább egy biológiai aktivitását mutató proteoglikánt vagy annak fragmentumát vagy analógját jelenti. dekorin biológiai aktivitását akkor mutatja valamely polipeptid, ha az alábbi tulajdonságok bármelyikét mutatja: 1) kölcsönhatásba lép, például kötődik, az extracelluláris mátrix valamelyik komponensével, például fibronektinnel (például, a fibronektin celluláris kötődőménjével és/vagy heparint kötő doménjével), kollagénnel (például, I, II, VI, XIV. kollagén); 2) módosítja, például gátolja, a fibrillogenézist; 3) trombosporinnal kölcsönhatásba lép, például kötődik; 4) epidermális növekedési faktorral lép kölcsönhatásba, például kötődik; 5) módosítja, például aktiválja, az epidermális növekedési faktor receptorát; 6) szignál-útvonalat módosít, például előrelendít vagy gátol, például előrendíti bizonyos kinázgátlók - például p21 elnevezésű, ciklintől függő kinázgátló - indukálásának útvonalát; 7) növekedési faktorral, például TGF-p-val, kölcsönhatásba lép, például kötődik; 8) módosítja, például gátolja, a sejtproliferációt; 9) módosítja, például gátolja, a sejtvándorlást; 10, módosítja a sejtek adhézióját; és 11) módosítja a mátrix összerendeződését és szerveződését. Az emberi dekorin előnyösen a Krusius és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 7683 (1986)] által leírt aminosav-szekvenciájú dekorinnak vagy változatának felel meg. A természetes körülmények között előforduló dekorinban lévő szerin aminosavon, például a Krusius és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 7683 (1986)] által leírt aminosav-szekvenciában a 4. pozícióban lévő szerinen, egyetlen GAG lánc található. Ezenfelül, a természetes körülmények között előforduló dekorinban két vagy több, aszparaginhoz kötött oligoszaccharid is van [Glossl, J. Biol. Chem. 259, 1414414150 (1984)].

Dekorin fragmentumai és analógjai

A transzgénikus úton előállított dekorin aminosavszekvenciája megegyezhet a természetes körülmények között előforduló fehérje aminosav-szekvenciájával vagy lehet a természetes körülmények között előforduló fehérje fragmentuma vagy analógja.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a dekorin polipeptid aminosav-szekvenciája egészen, de nem több, mint 1, 2, 3, 5 vagy 10 aminosav tekintetében eltérhet a természetes körülmények között előforduló fehérje aminosavszekvenciájától. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a dekorin polipeptid aminosav-szekvenciája egészen, de nem több, mint 1, 2, 3, 5 vagy 10%-ban eltérhet a természetes körülmények között előforduló fehérje aminosavszekvenciájától. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a különbségek olyanok, hogy a dekorin polipeptid mutatja a dekorin biológiai aktivitását. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a különbségek olyanok, hogy a dekorin polipeptid nem mutatja a dekorin biológiai aktivitását. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a különbségek közül egy vagy több vagy mind konzervatív aminosav-csere. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában a különbségek közül egy vagy több vagy mind konzervatív aminosav-cserétől eltérő aminosav-csere.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a dekorinfragmentum a teljes hosszúságú dekorin polipeptid fragmentuma, azaz a természetes körülmények között előforduló dekorin fragmentuma.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a fragmentum legalább 5, 10, 20, 50, 100 vagy 150 aminosav hoszszúságú; a fragmentum kevesebb, mint 200, 150, 100 vagy 50 aminosav hosszúságú vagy azzal egyenlő; a fragmentum a természetes körülmények között előforduló dekorin biológiai aktivitását mutatja; a fragmentum a természetes körülmények ·<·

- 65 között előforduló dekorin biológiai aktivitásának agonistája vagy antagonistája; a fragmentum képes gátolni, például kompetitiven vagy nem kompetitiven gátolni, a dekorin receptorhoz vagy enzimhez történő kötődését.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a fragmentum legalább 60%-os, és előnyösebben legalább 70, 80, 90, 99 vagy 100%-os szekvenciazonosságot mutat a természetes körülmények között előforduló dekorin megfelelő aminosav-szekvenciájával.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a fragmentum gerinces, például emlős, például főemlős, például emberi, dekorin polipeptid fragmentuma.

A találmány előnyös megvalósítási módjában, a fragmentum aminosav-szekvenciája egészen, de nem több, mint 1, 2, 3, 5 vagy 10 aminosav tekintetében eltérhet a természetes körülmények között előforduló dekorin aminosavszekvenciájától. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a fragmentum aminosav-szekvenciája egészen, de nem több, mint 1, 2, 3, 5 vagy 10%-ban eltérhet a természetes körülmények között előforduló dekorin aminosavszekvenciájától. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a különbségek olyanok, hogy a fragmentum mutatja a dekorin biológiai aktivitását. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a különbségek olyanok, hogy a fragmentum nem mutatja a dekorin biológiai aktivitását. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, a különbségek közül egy vagy több vagy mind konzervatív aminosav-csere. A találmány másik előnyös megvalósítási módjában a különbsé66 gek közül egy vagy több vagy mind konzervatív aminosavcserétől eltérő aminosav-csere.

A találmány szerinti polipeptidek felölelik azokat a polipeptideket, amelyek többszörös gének jelenlétének, alternatív transzkripciós események, alternatív RNS „splicing események, és alternatív transzlációs és poszttranszlációs események következtében keletkeztek.

Fragmentumok és analógok előállítása

Fragmentumok vagy analógok előállításával a szakember képes megváltoztatni a dekorin leírt szerkezetét, és tesztelni az újonnan előállított szerkezetek aktivitását. A technika jelenlegi állása szerinti eljárásokat, amelyek lehetővé teszik fragmentumok és analógok előállítását és tesztelését, az alábbiakban ismertetjük. Ezek, és más eljárások, alkalmazhatók a dekorin polipeptid fragmentumainak és analógjainak előállítására és szkrínelésére. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, a módosításra került dekorin emberi dekorin.

Fragmentumok generálása

Valamely protein fragmentumai különféle úton, például rekombináns úton, proteolitikus emésztéssel vagy kémiai szintézissel, állíthatók elő. Valamely polipeptid belső vagy terminális fragmentumai úgy állíthatók elő, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsav egyik végéről (terminális fragmentum esetében) vagy mindkét végéről (belső fragmentum esetében) egy vagy több nukleotidot eltávolítunk. A mutagenizált DNS expressziója polipeptid-fragmentumokat eredményez. „Végeket emésztő (end—nibbling) endo—

- 67 nukleázokkal végzett emésztéssel fragmentumok sorozatát kódoló DNS-eket generálhatunk. Fehérjefragmentumokat kódoló DNS-eket előállíthatunk véletlenszerűen történő hasítással, restrikciós emésztéssel vagy a fentiekben tárgyalt eljárások kombinálásával.

Fragmentumokat kémiai úton is szintetizálhatunk a technikában ismert eljárások - mint például a hagyományos Merrifield-féle szilárd fázisú f-Moc vagy t-Boc kémia - alkalmazásával. Például, a találmány szerinti peptideket önkényesen megválasztott, kívánt méretű, egymást nem átfedő fragmentumokra vagy kívánt hosszúságú, egymást átfedő fragmentumokra oszthatjuk.

Analógok generálása: Véletlenszerűen megváltoztatott DNS- és peptidszekvenciák előállítása

Valamely fehérje aminosavszekvencia-változatai előállíthatok a fehérjét vagy a fehérje konkrét régióját vagy doménjét kódoló DNS random mutagenezisével. Alkalmas eljárások közé tartozik PCR-mutagenezis és telítési mutagenezis. Véletlenszerűen generált aminosav-szekvenciákat tartalmazó könyvtárat degenerált oligonukleotidokat tartalmazó készlet szintetizálásával állíthatunk elő. (Változatokat tartalmazó könyvtárakban lévő fehérjék szkrínelésére szolgáló eljárásokat máshol alább ismertetünk) .

PCR-mutagenezis

PCR-mutagenezisben, csökkentett leolvasási pontosságú Taq-polimerázt alkalmazunk véletlenszerű mutációk, klónozott DNS-fragmentumokba történő bevitelére [Leung és mtsai., Technique 1., 11-15 (1989)]. Ez igen hatékony és viszonylag gyors eljárás véletlenszerű mutációk bevitelére. A mutagenizálni kívánt DNS-régiót polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával olyan körülmények között amplifikáljuk, amely csökkenti a DNS, Taq-polimeráz általi szintézisének pontosságát, például dGTP/dATP-t 5:1 arányban alkalmazunk és a PCR-reakcióhoz Mn²⁺-ot adunk. Az amplifikált DNSfragmentumkészletet megfelelő klónozó vektorba illesztve állítunk elő véletlenszerű mutánsokat tartalmazó könyvtárakat .

Telítési mutagenezis

Telítési mutagenezis lehetővé teszi nagyszámú, egyetlen bázist érintő szubsztitúciók gyors bevitelét klónozott DNS-fragmentumokba [Mayers és mtsai., Science 229, 242 (1985)]. Ezen eljárás során mutációkat generálunk, például egyszálú DNS in vitro kémiai kezelésével vagy besugárzásával, és komplementer DNS-szálat szintetizálunk. A mutációs frekvencia módosítható a kezelés súlyosságának módosításával, és lényegében elérhetjük az összes lehetséges bázis szubsztituálását. Mivel ezen eljárásban mutáns fragmentumokra nem szelektálunk, mind semleges mutációk és mind pedig a funkció megváltozását okozó mutációkat nyerhetünk. A pontmutációk eloszlása nem tolódik el a konzervált szekvenciaelemek irányába.

Degenerált oligonukleotidok

Homológokat tartalmazó könyvtárat generálhatunk degenerált oligonukleotidokból álló készlettel is. Degenerált szekvenciákat kémiai úton szintetizálhatunk automata DNS69 szintetizátorban, és a szintetikus géneket megfelelő expressziós vektorba ligálhatjuk. A degenerált oligonukleotid szintézise a technikában ismert [lásd, például Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983); Itakura és mtsai., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, 273-289, szerk.: Walton, kiad.: Elsevier, Amsterdam (1981); Itakura és mtsai., Annu. Rév. Biochem. 53, 323 (1984); Itakura és mtsai., Science 198, 1056 (1984); Ike és mtsai., Nucl. Acid Res. 11, 477 (1983);]. Ilyen eljárásokat alkalmaztak más fehérjék irányított evolúciója során [lásd például, Scott és mtsai., Science 249, 386-390 (1990); Roberts és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 2429-2433 (1992); Devlin és mtsai., Science 249, 404-406 (1990); Cwirla és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6378-6382 (1990); és US5.223.409 sz. és US5.096.815 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok].

Analógok generálása: Irányított mutagenezissel megváltoztatott DNS- és peptidszekvenciák előállítása

Nem véletlenszerű, hanem irányított mutagenezis eljárásokat alkalmazhatunk specifikus régiókban specifikus szekvenciák vagy mutációk előállítására. Ezen eljárások alkalmazhatók valamely fehérje ismert aminosav-szekvenciáját alkotó aminosavak változatainak, például, delécióval, inzercióval vagy szubsztitúcióval történő előállítására. A mutáció helyei módosíthatók egyedileg vagy sorozatban, például, (1) az első konzervált aminosav szubsztitúciójával, majd az elérni kívánt eredménytől függően, ennél radikálisabb választással; (2) a kiválasztott aminosav

ΊΟ deletálásával; vagy (3) a lokalizált hellyel szomszédos helyre azonos vagy eltérő osztályba tartozó aminosavak inzertálásával vagy az 1-3 lehetőségek kombinálásával.

Alanin kereső mutagenezis(alanine scanning mutagenesis)

Alanin kereső mutagenezis hasznos eljárás bizonyos aminosavak vagy a kívánt fehérje mutációja szempontjából előnyös helyek vagy domének azonosítására [Cunningham és Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)]. Az alanin keresésben, aminosavakat vagy célzott aminosavak csoportját azonosítjuk (például, töltéssel rendelkező aminosavak, például Arg, Asp, His, Lys és Glu) és semleges vagy negatív töltésű aminosavval (legelőnyösebben alaninnal vagy polialaninnal) helyettesítjük. Valamely aminosav helyettesítése hatással lehet, a sejtben vagy a sejten kívül, az aminosav és az azt körbevevő vizes környezet közötti kölcsönhatásra. A szubsztitúcióra funkcionális szenzitivitást mutató doméneket, további vagy más változatoknak a szubsztitúció helyeire vagy helyeinél történő bevitelével finomítjuk így, bár az aminosav-szekvencia változatainak helyét előre meghatározzuk, a mutáció természetét önmagában nem határozhatjuk meg. Például, adott helyen a mutáció hatékonyságának optimalizálására alanin keresést vagy random mutagenezist végezhetünk a célbavett kodonon vagy régión, és a kívánt fehérje expresszált alegység-változatait szkríneljük a kívánt aktivitás optimális kombinációjára.

Oligonukleotid által közvetített mutagenezis

Oligonukleotid által közvetített mutagenezis hasznos eljárás valamely DNS szubsztitúciós, deléciós és inzerciós változatainak elkészítésére [lásd például, Adelman és mtsai, DNA 2, 183 (1983)]. Röviden, a kérdéses DNS-t, a DNS-templát mutációját kódoló oligonukleotiddal végzett hibridizálással változtatjuk meg, amely templát a kérdéses fehérjét kódoló, változatlan vagy natív DNS-t tartalmazó plazmid vagy bakteriofág egyszálú formája. Hibridizálást követően, DNS-polimerázt alkalmazunk a templát teljes második, komplementer szálának megszintetizálására, így a komplementer szál tartalmazni fogja az oligonukleotidláncindítót, és kódolni fogja a kívánt fehérje DNS-ének kérdéses megváltozását. Általában, legalább 25 nukleotid hosszúságú oligonukleotidokat alkalmazunk. Optimális oligonukleotid tartalmaz 12-15, a templáttal teljes mértékig komplementer nukleotidot, amely a mutációt kódoló nukleotido(ka) t mindkét oldalról határolja. Ez biztosítja, hogy az oligonukleotid megfelelőképpen hibridizáljón az egyszálú DNS-templát molekulával. Az oligonukleotidokat a technikában ismert eljárásokkal [például, Crea és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 7 5, 5765 (1978)] könnyen megszintetizálhatjuk.

Kazetta-mutagenezis

Változatok előállítására szolgáló másik eljárás, a kazetta-mutagenezis, a Wells és mtsai. által leírt [Wells és mtsai., Gene 34, 315 (1985)] eljáráson alapul. A kiindulási anyag a mutálni kívánt fehérje-alegységet kódoló DNS-t tartalmazó plazmid (vagy más vektor). Az azonosított mutációs hely(ek) mindkét végén egyedi restrikciós helyeknek kell lennie. HA ilyen restrikciós hely nincs, akkor ezeket elő lehet állítani a fent leírt, oligonukleotid által közvetített mutagenezis eljárással történő bevitellel a kívánt fehérje-alegységet kódoló DNS megfelelő helyeire. Miután a restrikciós helyeket a plazmidba bevittük, a plazmidot linearizálás céljából ezeken a helyeken hasítjuk. A restrikciós helyek közötti, de a kívánt mutáció(ka)t tartalmazó DNS-szekvenciát kódoló kettősszálú oligonukleotidot szintetizálunk standard eljárások alkalmazásával. A két szálat külön-külön szintetizáljuk meg, majd standard eljárások alkalmazásával, egymással hibridizáltatjuk. E kettősszálú oligonukleotidot nevezzük a kazettának. A kazettát úgy tervezzük, hogy annak 3' és 5' végei megfeleljenek a linearizált plazmid végeinek, így ezeket közvetlenül lehet a plazmidba ligálni. E plazmid így tartalmazza a kívánt fehérje DNS-szekvenciájának mutációját.

Kombinatorikus mutagenezis

Kombinatorikus mutagenezis is alkalmazható mutánsok generálására. Például, homológcsoportot vagy más rokon fehérjéket kódoló aminosav-szekvenciákat egyeztetünk, előnyösen a lehetséges legmagasabb homológia eléréséig. Degenerált, kombinatorikus szekvenciakészlet előállítására kiválasztjuk az összes olyan aminosavat, amely az egyeztetett szekvenciák meghatározott pozíciójában van. A változatokból, a nukleinsav szinten, kevert könyvtárat állítunk elő kombinatorikus mutagenezissel.

Például szintetikus oligonukleotidok keverékét enzimatikus úton génszekvenciákba ligálunk úgy, hogy a lehetséges degenerált szekvenciák készlete egyedi peptidekként expresszálható legyen vagy esetleg, a degenerált szekvenciakészletet tartalmazó, nagyobb fúziós fehérjekészletet generálunk.

Peptidfragmentumok vagy -homológok könyvtárainak elsődleges szkrinelésére szolgáló, nagy teljesítményű eljárások

A technikában különféle eljárások ismertek generált mutáns gének termékeinek szkrinelésére. Nagy génkönyvtárak szkrínelési eljárásai gyakran magukban foglalják a génkönyvtár replikálódásra képes, expressziós vektorokba történő klónozását, megfelelő sejtek transzformálását a kapott vektorkönyvtárral, és a gének olyan körülmények között végzett expresszálását, amelyben valamely kívánt aktivitás, például ez esetben , a kölcsönhatás, például dekorin kötődése dekorinnal kölcsönhatásba lépő polipeptiddel, például dekorin receptorával, kimutatása vagy a kölcsönhatás, például valamely kérdéses polipeptid kötődése dekorin polipeptiddel, elősegíti azt a gént kódoló vektornak a viszonylag könnyű elkülönítését, amelynek termékét kimutattuk. A fent leírt eljárások mindegyike alkalmazható a nagyszámban, például véletlenszerű mutagenezis eljárásokkal, előállított szekvenciák nagyteljesítményű szkrinelésére.

Két hibridrendszer

Két hibrid esszé, mint amilyen a fentiekben leírt rendszer (akárcsak az itt ismertetett más szkrínelési eljá rások) , alkalmazhatók dekorin-polipeptidnek dekorininteraktort kötő fragmentumai vagy -analógjai azonosítására. Ezek közé tartozhatnak agonisták, szuperagonisták és antagonisták.

Prezentációs {display) könyvtárak

A szkrínelési esszék egyik lehetséges módjában, a kiválasztott peptideket sejt vagy vírusrészecske felszínére visszük fel, és a kérdéses sejtek vagy vírurészecskék, megfelelő receptorfehérjéhez történő kötődési képességét mutatjuk ki úgy, hogy a kirakott terméket egy pásztázási eszszében kimutatjuk. Például, a génkönyvtárat baktériumsejt felszíni membránfeérjéjét kódoló génbe klónozzuk, és az eredményül kapott fúziós fehérjét pásztázással kimutatjuk [WO88/06630 sz. nemzetközi közzétételi irat; Fuchs és mtsai., Bio/Technology 9, 1370-1371 (1991); és Goward és mtsai., TIBS 18, 136-140 (1992)]. Hasonló módon, kimutatható jelzéssel ellátott ligandumot alkalmazhatunk poteciálisan funkcionális peptidhomológok osztályozására. Fluoreszcensen jelzett ligandumok, például receptorok, alkalmazhatók ligandumot megkötő képességűket megőrző homológok kimutatására. A fluoreszcensen jelzett ligandumok lehetővé teszik azt, hogy a sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizuálisan vizsgáljuk és elkülönítsük vagy, ha a sejt morfológiája megengedi, akkor a sejtek elkülönítésére fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozót alkalmazzunk.

Génkönyvtárat fúziós fehérjeként expresszálhatunk a vírusrészecske felszínén. Például, a fonalas fágrendszerben, idegen peptidszekvenciákat expresszálhatunk a fertőzőképes fág felszínén, így két lényeges előnyhöz is jutunk. Először, mivel e fagokat 10 fág/milliliternél na gyobb koncentrációban alkalmazhatjuk affinitás! mátrixokon, egyidejűleg nagyszámú fágot szkrinelhetünk. Másodszor, mivel minden egyes fertőző fág felszínén génterméket hordoz, ha valamely konkrét fagot az affinitasi mátrixról csak ala csony kitermeléssel tudunk kinyerni, a fágot egy második fertőzési körben amplifikalni tudjuk. Fágprezentacios könyvtárakban, az E. coli csaknem azonos, M13, fd., és fi fonalas fágjait alkalmazzák leggyakrabban. A gill vagy gVIII fágok burokfehérjéi alkalmazhatók fúziós fehérjék előállítására a víruspartikulum alapvető becsomagolásának megzavarása nélkül. Idegen epitópokat a pill fág N— terminálisánál expresszálhatunk, és az ilyen epitópokat hordozó fágot kivonhatjuk nagymennyiségben lévő, de az epitópot nem hordozó, fágok közül [W090/02909 sz. nemzetközi bejelentés; W092/09690 sz. nemzetközi bejelentés, Marks és mtsai., J. Biol. Chem. 267, 16007-16010 (1992);

Griffiths és mtsai., EMBO J. 12, 725—734 (1993) ; Clackson és mtsai., Nature 352, 624-628 (1991); és Barbas és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 4457-4461 (1992)].

Egy általános megközelítésben, az E. coli maltózreceptorát (a LamB, külső membránfehérje) alkalmazták valamely peptid fúziós partnerének [Charbit és mtsai., EMBO J. 5, 3029-3037 (1986)]. Oligonukleotidokat illesztettek be a LamB gént kódoló plazmidokba abból a célból, hogy a fehérje extracelluláris hurokrégiói egyikével fuzionálhatott peptidet állítsanak elő. E peptidek elérhetők ligandumokkal, például antitestekkel, való kötődésre és im—

- 76 munválaszt válthatnak ki ha a sejteket állatoknak adjuk be. Peptid-kimutatásra más felszíni fehérjék, például OmpA [Schorr és mtsai., Vaccines 91, 387-392 (1991)], PhoE

[Agterberg és mtsai., Gene 88, 37-45 (1990)], és PAL [Fuchs és mtsai., Bio/Techniques 1369-1372 (1991)], és nagy, bakteriális felszíni szerkezetek is szolgáltak hordozóként. Peptideket fuzionáltathatunk pilinnel, amely egy, genetikai információk baktériumok közötti cseréjére szolgáló vezetékké polimerizálódó fehérje [Thiry és mtsai., Appl. Environ, Microbiol. 55, 984-993 (1989)]. Mivel e fehérje funkcióját más sejtekkel való kölcsönhatás során fejti ki, a pilus hasznos segítség a peptideknek az extracelluláris környezetbe történő prezentálására. Egy másik, peptid kimutatásra alkalmazott nagy, felszíni szerkezet a baktériumok mozgásszerve, a flagellum. A flagellin alegység-fehérjéivel fuzionáltatott peptidek a gazdasejten sűrű elrendezésben elhelyezkedő peptidkópiákat szolgáltatnak [Kuwajima és mtsai., Bio/Technology 6, 1080-1083 (1988)]. Más baktérium fajok felszíni fehérjéi, például a Staphilococcus protein A és a Neisseria külső membránproteáza, az IgA [Hansson és mtsai., J. Bacteriol. 174, 4239-4245 (1992); és Klauser és mtsai., EMBO J. 9, 1991-1999 (1990)], szintén lehetnek fúziós partnerek .

A fent leírt fonalas fágrendszerben és a LamB rendszerben, a peptid és az azt kódoló DNS közötti fizikai kapcsolat a DNS-nek a pepiidet a felszínén hordozó partikulumon (sejt vagy fág) belüli visszatartása vonatkozásában áll fenn. A peptid befogásával befogjuk a álló részének megfelelő, konszenzus szekvenciával [Cull és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 1869 (1992)].

E séma, amelyet néha „peptid a plazmádon néven is neveznek, két fontos részen különbözik a fágprezentációs eljárásoktól. Először, a peptideket a fúziós fehérje Cterminálisához kötik, ezért a könyvtár tagjait szabad Cterminálissal rendelkező peptidekként mutatjuk be. A fonalas fágok mindkét burokfehérjéje, a pill és pVIII, a fághoz C-terminálisukon keresztül kapcsolódnak, és a bevitt peptideket a kifelé nyúló N-terminális doménhoz kapcsoljuk. Bizonyos módozatokban, a fággal bemutatott peptidek közvetlenül a fúziós fehérjék N-terminálisán prezentálhatok [Cwirla és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6378-6382 (1990)]. A második különbség, a könyvtárakban jelenlévő, a peptidek populációira ható biológiai súlyponteltolódások. A Laci fúziós molekulák a gazdasejt citoplazmájában vannak elkülönítve. A fágburok-fúziók a transzláció során csak kismértékben vannak kitéve a citoplazmának, és gyorsan átszekretálódnak a belső membránon keresztül a periplazmatikus kompartmentbe, de C-terminális hidrofób dóménjuknál fogva lehorgonyozva maradnak a membránban, a peptideket tartalmazó N-terminálisukkal benyúlnak a periplazmába, amíg fágrészecskékké össze nem szerelődnek. A Lacl-ben és fágkönyvtárakban lévő peptidek lényegesen különbözhetnek egymástól, mivel különböző mértékben vannak kitéve a különféle proteolitikus aktivitásoknak. A fág burokfehérjéit transzportálni kell a belső membránon át, a fágba történő beépülésüket szignálpeptidáz processzálás előzi meg. Bizonyos peptidek káros hatást fejtenek ki e folyamatokra és ezért ezek nem megfelelő mértékben vannak a könyvtárakban [Gallop és mtsai., J. Med. Chem. 37, 1233— 1251 (1994)]. E konkrét torzulások nem játszanak szerepet a Laci bemutatási rendszerben.

A rekombináns, véletlenszerűn generált könyvtárakban elérhető, kisméretű peptidek száma roppant nagy. Rutinszerűen állítanak elő 10⁷-10⁹ független kiónból álló könyvtárakat. Előállítottak már akár 10¹¹ rekombinánst tartalmazó könyvtárakat is, de méret megközelíti a klónkönyvtárak praktikusan alkalmazható méretét. A könyvtár méretét behatároló tényezők a randomizált szegmentumokat tartalmazó DNS bakteriális gazdasejtbe történő transzformálásánál jelentkeznek. E behatárolás kikerülésére, nascens peptidek poliszómakomplexekben történő bemutatásán alapuló, in vitro rendszert fejlesztettek ki nemrég. E könyvtárprezentációs eljárásban meg van az a lehetőség, hogy a jelenleg elérhető fág/fagemid- vagy plazmidkönyvtáraknál 3-6 nagyságrenddel nagyobb könyvtárakat állítsunk elő. Továbbá, a könyvtárak készítése, a peptidek expresszálása, és a szkrínelés teljes egészében sejtmentes körülmények történik.

Ezen eljárás egyik alkalmazásában [Gallop és mtsai., J. Med. Chem. 37, 1233-1251 (1994)] 10¹² dodekapeptidet kódoló molekuláris DNS-könyvtárat készítettek és a könyvtárat E. coli S30 in vitro kapcsolt transzkripciós/transzlációs rendszerben expresszálták. Olyan körülményeket választottak, hogy a riboszómák a mRNS-en elakadjanak, így az RNS lényeges része a poliszómában akkumulálódott és ennek ered ményeként olyan komplexek jöttek létre, amelyekben nascens peptidek még mindig az őket kódoló RNS-hez kapcsoltan voltak jelen. A poliszómák elégségesen robusztusak ahhoz, hogy immobilizált receptoron affinitási eljárással tisztíthatok legyenek, csaknem úgy, ahogyan a hagyományosabb rekombináns peptidprezentációs könyvtárat szokás szkrínelni. A kötött komplexekből az RNS-t kinyerték, cDNS-sé alakították, és PCR-rel amplifikálták hogy templátot kapjanak a következő szintetizálási és szkrínelési körhöz. A poliszómaprezentációs eljárás összekapcsolható a fágprezentációs rendszerrel. Több körben végzett szkrínelést követően, poliszómában gazdag gyűjteményből származó cDNS-t fagemid vektorba klónoztak. E vektor egyrészt peptidexpressziósvektorként, a burokfehérjéhez fuzionált peptidek bemutatására, másrészt pedig DNS-szekvenálási vektorként szolgál peptidek azonos!tására. Ebben a formában, a poliszómából származó peptidek fágon történő expresszálásával affinitáson alapuló szelekciós eljárást végezhetünk vagy egyedi kiónokon lévő peptideken, fág-ELISA-val történő szűrővizsgálattal biológiai aktivitást vagy kiegészítő fág-ELISA alkalmazásával kötési specificitást tesztelhetünk [Barrett és mtsai., Anal. Biochem. 204, 357-364 (1992)]. Egy szekvencián az aktív peptidek szekvenciáinak azonosítására a DNS-t fagemid gazdában állítjuk elő.

Másodlagos szűrővizsgálatok

A fent leírt nagy teljesítményű esszét követheti másodlagos szűrővizsgálat további biológiai aktivitások meghatározására, amely vizsgálattal a szakember számára lehe·»«·'

-Öltővé válik az antagonisták és agonisták megkülönböztetése. A másodlagos szűrővizsgálat típusa a tesztelni kívánt aktivitástól függ. Például, esszét fejleszthetünk ki a kérdéses fehérje és annak megfelelő liganduma közötti kölcsönhatást gátló képesség meghatározására, és ezzel az esszével antagonistákat azonosíthatunk a fentiekben leírt elsődleges szkrínelés során izolált peptidek közül.

Tehát, fragmentumok és analógok generálására, és ezek aktivitásra történő tesztelésére szolgáló eljárások a technikában ismertek. Miután a kérdéses kiindulási (core) szekvenciát azonosítottuk, a szakember számára rutin feladat az analógok és fragmentumok előállítása.

A találmányt az alábbi - a találmányt semmiben sem korlátozó - példákban tovább részletezzük. Az összes hivatkozás (így, irodalmi hivatkozások, közzétett szabadalmak, publikált közzétételi iratok, és egymástól függő szabadalmi iratok) tartalma a kitanítás részét képezi.

PÉLDÁK

Dekorinkonstrukciók készítése

Az 1,7 kb emberi dekorin cDNS-ét tartalmazó pGEMDec plazmidot részlegesen emésztettük BspHl enzimmel és annellált BSPHXH01 (CATGCTCGAG CCGCCAC, a szekvencialistában 1. azonosítószámon megadott szekvencia) és BSPHXHO2 (CATGGTGGCG GCTCGAG, a szekvencialistában 2. azonosítószámon megadott szekvencia) oligonukleotidokat ligáltunk, az emberi dekorin transzlációs starthelyétől közvetlenül 5' irányban lévő BspHl helyre. Ezzel optimális

Kozak-féle riboszómakötő-szekvenciát és egy Xhol klónozó helyet állítottunk elő. A plazmádba, az emberi dekorin stop kodonjától 3' irányban 2 bp távolságra, mutációval Xhol helyet vittünk be. A teljes méretű, emberi dekorint kódoló szekvenciát tartalmazó, 1,1 kb Xhol fragmentumot izoláltuk és Xhol enzimmel hasított, BC451 kódjelű, kecskeeredetű βkazein expressziós vektorba (Beta Casein expression vector) ligálással készítettük el az emberi dekorint tartalmazó BC543 emlős expressziós kazettát. E plazmidot teljesen megszekvenáltuk az orientáció és a lehetséges mutációk azonosítására .

Injektálásra kerülő fragmentumok előállítása

A kecskeeredetű β-kazein -emberi dekorin expressziós kazettát elkülönítettük a plazmád vázától NotI enzimmel történt teljes emésztéssel, és a „Wizard eljárással mikroinjektálásra előkészítettük. Plazmid DNS-t (100 pg) különítettünk el a vektor vázától NotI enzimmel történt teljes emésztéssel. Az emésztményt agaróz gélen, 1*TAE futtatópufferben végzett elektroforézissel elválasztottuk [Maniatis és mtsai., Molecular cloning , a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1983)] . Az expressziós kazettának megfelelő DNSfragmentumot tartalmazó gélszakaszt UV-fénnyel (hosszú hullámhossz) láthatóvá tettük. A kérdéses DNS-t tartalmazó sávot kivágtuk, dialízis-zsákba helyeztük, és a DNS-t 1*TAEben végzett elektroelúcióval izoláltuk.

Az elektroelúciót követően, a DNS-fragmentumot töményítettük és a „Wizard DNA clean-up system (Promega, katalógusszám: A7280) alkalmazásával tisztítottuk, a gyártó útmutatásait követve, és 125 ml mennyiségű mikroinjekciós pufferbe (10 mM Tris, pH 7,5, 0,2 mM EDTA) eluáltuk. A fragmentum koncentrációját összehasonlító agarózgélelektroforézissel értékeltük. A mikroinjekciós fragmentum törzsoldatának becsült koncentrációja 150 ng/ml volt. A törzsoldatot mikroinjekciós pufferben hígítottuk közvetlenül a sejtmagba történő injektálás előtt, amikor a végső koncentráció 1,5 ng/ml volt.

Mikroinj ekció

Nőstény CDI egereket szuperovulációra késztettük és megtermékenyített petesejtet vettünk ki a petevezetékből. Hím pronukleuszokat ekkor mikroinjekciós pufferben hígított DNS-sel mikroinjektáltunk. Mikroinjekciózott embriókat 12 órán át CZB tápoldatban tenyésztettük vagy rögtön bevittük az álvemhes befogadó CDI nőstény egér petevezetékébe. Húszharminc kétsejtes vagy 40 egysejtes embriót transzferáltunk egyes befogadó nősténybe és ellésig hagytuk kifejlődni.

Alapító állatok azonosítása

A farok szövetéből izopropanolos lecsapással genomi DNS-t izoláltunk és analizáltunk polimeráz-láncreakcióval (PCR) a csirkeeredetű β-globin szigetelő DNS-szekvencia jelenlétére nézve. A PCR-reakciókra, körülbelül 250 ng genomi DNS-t 50 μΐ PCR-pufferben (20 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 100 μΜ dezoxinukleotid-trifoszfátok, és 600600 nM az egyes láncindítókból) feloldottunk és ehhez 2,5 egység Taq-polimerázt adtunk és a keveréket az alábbi hőmérsékleti programmal kezeltük:

1	ciklus	94°C	60	mp
5	ciklus	94°C	30	mp
		58°C	45	mp
		74°C	45	mp
30	ciklus	94°C	30	mp
		55°C	30	mp
		74°C	30	mp

A láncindítók az alábbiak voltak:

GBC 332 TGT GCT CCT CTC CAT GCT GG (a szekvencialistában 3. azonosítószámon megadott szekvencia)

GBC 38 6 TGG TCT GGG GTG ACA CAT GT (a szekvencialistában 4. azonosítószámon megadott szekvencia).

Az egerek fejése

Miután a nőstény egerek fiókáikat természetes úton világra hozták, a fejésre általában az ellés után 7 és 9 nappal került sor. A fejési eljárás előtt körülbelül egy órával az egereket elkülönítettük az almuktól. Az egy órás várakozási idő után, az egereket tejelésre késztettük 5 NE, steril PBS-ben (foszfáttal puffereit sóoldat) oldott oxitocin beadásával (25-ös tűvel, i.p.). Hormon beadása után 1-5 percet vártunk, amíg az oxitocin kifejtette hatását .

A szívó és gyűjtő rendszer 15 ml-es kónikus, végén gumidugóval lezárt csőből és az abba beillesztett, két 18as tűből állt. Az egyik, csatolási végénél (hub end) emberi mellpumpához csatlakoztatott gumicsőbe befogott tűt alkalmaztuk fejésre. Az egereket a tartódoboz tetejére helyeztük, csak a farkuknál fogva tartottuk és máskülönben a mozgásban nem korlátoztuk vagy akadályoztuk. A másik tű csatolási végét az egerek csecseire helyeztük (egyszerre egyet) a tej begyűjtése céljából. A tejet egyedenként, a 15 ml-es kónikus csőbe helyezett Eppendorf-csőbe gyűjtöttük. Minden egyes mintagyűjtésre másik Eppendorf-csövet alkalmaztunk. A fejést addig folytattuk, amíg legalább 150 μΐ tejet nem nyertünk. Begyűjtés után, az egereket visszatettük az almukba .

Fehérj eanalízis

Western biot analízist a Harlow és Lane által leírt [Harlow és Lane, Antibodies, a laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988)] eljárás szerint végeztünk, emberi dekorinra specifikus, nyúleredetű poliklonális antitestet (Chemicon, katalógusszám: AB1909) alkalmazva.

EREDMÉNYEK

Transzgénikus egér

Összesen 805 embriót mikroinjektáltunk. Hatszázhuszonnégy (77,5%) embrió élte túl a mikroinjektálást, és 537-et transzferáltunk 20 álterhes, befogadó egérbe. Összesen 142 alapító („founder) egér született (a transzfektált embriók 26,4%-a) és ezeket a szigetelő szekvenciára speci fikus láncindítók alkalmazásával PCR-rel analizáltuk.

Összesen 15 transzgénikus alapító állatot azonosítottunk (10,5%, a mikroinjektált embriók 1,86%-a), amelyek közül hatot választottunk ki párzásra. E vonalakban az emberi dekorin, tejbe történő expresszióját az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat

Emberi dekorin expressziója a BC543 transzgént hordozó transzgénikus egerek által, a meghatározás Western blottal történt. N/A=nem elérhető.

Founder (ivar)	PCR-rel pozitívnak talált utód (csak nőstényeket analizáltunk)	Emberi dekorin szintje a tejben (mg/ml) Western blottal analizálva
14 (N)		0, 25
22 (N)	227	0, 1
36 (N)		1-1,5
62 (N)	215	2-4
73 (H)	152	N/A 5-10
102 (N)	269	0, 5 1-1, 5

Tejben expresszált dekorin glikoziláltsága

A dekorin magas szinten expresszálódott a BC543 transzgént hordozó transzgénikus egerek tejében. A hat vonalból négy 1 mg/ml-nél nagyobb koncentrációban expresszált. Az alacsonyabb szinten expresszáló vonalak

- 87 egyike (14. vonal) egyértelműen mozaikos volt, mivel a transzgén transzmisszióját az utódokban nem tapasztaltuk. A transzgénikus expresszált dekorin egyik meglepő tulajdonsága az volt, hogy SDS-PAGE-n viszonylag szorosan egymást követő sávokból (körülbelül 45-53 kd) álló formában vándorolt, míg az emlőseredetű sejtek tenyészetéből származó Dekorin körülbelül 60-120 kd méretű elkenődésként vándorol. A transzgénikusan expresszált dekorin e migrációs mintázata megfelel annak, hogy a molekula nem tartalmazza a glükózaminoglikán láncot.

Az emberi dekorin magas szinten (>1 mg/ml) expresszálódik a transzgénikus állatok tejében. A transzgénikus úton expresszált, emberi dekorin nem tartalmazza a glükózaminoglikán láncot. A transzgénikus úton expresszált, emberi dekorin e váratlan tulajdonsága igen hasznos, mivel a glükózaminoglikán lánc igen heterogén és akadályt jelent a terápiás rekombináns fehérje esetében szükséges egyenletes termelési jellemzők teljesítésére. Ezenfelül, terápiás viszonylatban a glükózaminoglikán lánc nem tűnik szükségesnek az emberi dekorin aktivitásához.

Transzgénikus kecskék generálása és jellemzése

Alapító (Fo) transzgénikus kecske előállítható valamilyen konstrukcióval (például, a kecske β-kazein génjének szabályozó elemeihez működőképesen kapcsolt emberi dekorin gént tartalmazó BC355 vektorral) mikroinjektált, megtermékenyített, kecskeeredetű pete transzferével. Az alábbi részekben leírt metodológia alkalmazható transzgénikus kecskék előállítására.

Kecskefajok és tenyészetek

Svájci eredetű kecskék, például Alpine, Saanen és Toggenburg tenyészetekből, alkalmasak a transzgénikus kecskék előállítására.

Az alább részekben röviden leírjuk a transzgénikus kecskék előállításához szükséges lépéseket. E lépések során a nőstény kecskékben ovulációt indukálunk, nemzőképes hímekkel pároztatjuk és megtermékenyített embriókat gyűjtünk. Miután összegyűjtöttük az embriókat, az egysejtes, megtermékenyített embrióból vett pronukleuszokat DNSkonstrukcióval mikroinjektáljuk. Egy donor nősténytől származó összes embriót együtt tartjuk és - ha lehetséges egyetlen befogadó nősténybe transzferáljuk.

Ovuláció indukálása kecskében

A donorokban a nemi ciklus időzítését a 0. napon beadott (s.c.) 6 mg norgestomet-et tartalmazó fülimplantátumokkal (Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS) szinkronizáltuk. Prosztaglandint adtunk be az első 7-9 nap után az endogén termelődő progeszteron leállítására. Az implantátum beültetése utáni 13. naptól kezdve három napon keresztül, összesen 18 mg, follikulust serkentő hormont (FSH, Schering Corp., Kenilworth, NJ) adtunk be (i.m.) napi kétszeri injekcióban. Az implantátumot a 14. napon eltávolítottuk. Az implantátum eltávolítása után 24 órával a donor állatokat, két napon keresztül, nemzőképes hímekkel néhányszor pároztattuk [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990)].

Embriógyűjtés

Az embriógyűjtésre irányuló sebészeti beavatkozás a megtermékenyítést követő második napon (vagy 72 órával az implantátum eltávolítása után) történt. A sebészeti beavatkozás előtt 36 órával az ovuláltatott állatoktól megvontuk a táplálékot és a vizet. A nőstény kecskéknek 0,8 mg/kg diazepamot adtunk be.

Valium® (i.v.), majd közvetlenül azután 5,0 mg/kg ketamin (Keteset) (i.v.) beadása után, a műtét alatt, endotracheális csövön keresztül 2,5% halotánt (2 1/min oxigénben) alkalmaztunk. Az szaporítószervet középtáji laparotómiás bemetszésen át exteriorizáltuk. Az indukált ovuláció eredményeinek értékelésére és a petefészek átmosásával begyűjthető embriók számának becslésére megszámoltuk a sárgatesteket, a 6 mm-nél nagyobb, fel nem szakadt folliculusokat, és a petefészekben lévő cisztákat. Az oviductus ostiumába kanült helyeztünk és 3.0 Prolennel végzet időszakos ligaturával helyben tartottuk. Egy 20-as tűt helyeztünk az uterusba, körülbelül 0,5 cm-re az uterotubalis becsatlakozástól. Tíz-tizenkét milliliter steril PBS-t öblítettünk át a kanülözött oviductuson és az átfolyó PBS-t Petri-csészébe gyűjtöttük. E procedúrát megismételtük az ellenkező oldalról is és a szaporítószervet visszahelyeztük a hasüregbe. A nyílás elzárása előtt, 10-20 ml steril sóoldatos glicerint töltöttünk a hasüregbe az összetapadások meggátlása céljából. A linea albát 2,0 Polidioxanonnal vagy Supramiddal készült egyszerű, megsza kitott varratokkal, a bőrt pedig steril sebkapcsokkal zártuk le.

Sztereomikroszkóp alatt, megtermékenyített kecskeeredetű petéket gyűjtöttünk a petevezeték átmosására alkalmazott PBS-ből és a petéket 10% borjúeredetű szérumalbumint (FBS, Sigma) tartalmazó, Ham-féle F12 tápoldattal (Sigma, St. Louis, MO) mostuk. Olyan esetekben, amikor a pronukleusz látható volt, az embriót azonnal mikroinjektáltuk. Ha a pronukleusz nem volt látható, az embriókat 10% FBS-t tartalmazó, Ham-féle F12 tápoldatba helyeztük és 37°C-on, párásított, gázkamrában (5% C0₂-ot tartalmazó levegőben) inkubáltuk addig, amíg a pronukleuszok láthatóvá nem váltak [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990) ] .

Mikroinjekciós eljárás

Egysejtes kecskeembriókat vájatos tárgylemezre, tápoldat-mikrocseppekbe helyeztünk olaj réteg alá. Két látható nukleuszt tartalmazó, megtermékenyített petéket lángon kihúzott, tartó mikropipettán immobilizáltuk Zeiss inverziós mikroszkóp (rögzített tartó, Nomarski optika) alatt. Pronukleuszt mikroinjektáltunk a kérdéses DNS-konstruciót, például, a kecske β-kazein génjének szabályozó elemeihez működőképesen kapcsolt emberi dekorin gént tartalmazó BC355 vektorral, tartalmazó injekciós pufferrel (Tris-EDTA) finom, üveg mikrotűn keresztül [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990) ].

Befogadó állatok előkészítése

Befogadó állatok nem ciklusának szinkronizálását 6 mg norgestömet—et tartalmazó fülimplantátumokkal (Syncromate— B) indukáltuk. Az implantátum beültetését követő 13. napon az állatoknak egyszeres, ovulációt nem indukáló, 400 NE PMSG-t (vemhes kanca szérumából származó gonadotropin, Sigma) tartalmazó, egyszeres injekcióval oltottuk. Befogadó nőstényeket vasectomián átesett hímekkel pároztattuk a nemi ciklus szinkronizálásának biztosítására [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 1195-1205 (1990)].

Ebriótranszfer

Egy donor nősténytől származó összes embriót együtt tartottuk és - ha lehetséges volt - egyetlen befogadó nősténybe transzferáltuk. A sebészeti eljárás a fenti, embriógyűjtésre alkalmazott eljárással azonos volt, kivéve azt, hogy a petevezetéket nem kanüláltuk, és az embriókat minimális mennyiségű, 10% FBS-t tartalmazó, Ham—féle F12 tápoldatban, üveg mikropipetta alkalmazásával, a fimbrián keresztül transzferáltuk a petevezető üregébe. Az ováriumban több mint 6-8 ovulációs pontot tartalmazó állatokat befogadásra alkalmatlannak ítéltük. A bemetszés lezárása és az operációt követő ellátás a donor állatok eseteben leírtak kai megegyezett [Selgrath és mtsai., Theriogenology, 11951205 (1990)].

Vemhesség és ellés nyomonkövetése

A vemhességet ultrahanggal határoztuk meg a párzás első napját követő 45 nap múlva. A 110. napon végzett második ultrahangos vizsgálattal igazoltuk a vemhesség tényét és megállapítottuk a magzati nyomást. A 130. napon a vemhes befogadó sutát tetanusz toxinnal és Clostridium C-vel és Dvel vakcináltuk, szeléniumot és E vitamint (Βο-Se) i.m., ivermectint pedig s.c. adtunk be. A 145. napon sutát tiszta bokszba vittük át és itt akklimatizálódni hagytuk a 147. napon indukált ellésig. Negyven milligramm PGF_2a-val (Lutalysate®, Upjohn Company, Kalmazoo, MI) ellést indukáltunk a 147. napon. Ezen injekciót két dózisban, egy 20 mgos dózisban és 4 óra múlva egy másik 20 mg-os dózisban adtuk be (i.m.). A 147. napon az első Lutalysate® injekciót követően a sutát napközben és este időszakos megfigyelés alatt tartottuk. Az megfigyeléseket 30 percenkéntire növeltük a második nap reggelétől kezdve. Az ellés az első injekció után 30-40 órával történt. Az ellés után a sutát megfejtük a kolosztrum összegyűjtésére és a placenta eltávozását is megvártuk.

Az F_o állatok transzgénikus természetének igazolása Bármelyik mozaikos transzgén elvesztésének elkerülésére, transzgénikus F_o állatokra történő szkrínelésre genomi DNS-t izoláltunk két különböző sejtvonalból. Mozaikos állatnak tekintettünk minden olyan kecskét, amelynek mindegyik sejtjében nem volt a transzgénnek legalább egy kópiája. Ezért, kétnapos F_o állat füléből szövetmintát (mesoderma) és emellett vérmintát is vettünk genomi DNS izolálása céljából [Lacy és mtsai., A laboratory manual, ] kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1986); Hermann és Frischauf, Methods Enzymol 152, 180-183 (1987)]. A DNS-mintákat emberi dekorin génre spéci fikus láncinditók alkalmazásával végzett polimerázláncreakcióval [Gould és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 1934-1938 (1989)] és emberi dekorinra készült véletlen láncindítású („random primed) cDNS-próbával [Feinberg és Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983)] végzett Southern blottal [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77, 5201-5205 (1980)] analizáltuk. Becsléseink szerint, az eszszé olyan érzékeny volt, hogy a szomatikus sejtek 10%-ban képes volt kimutatni a transzgén egy kópiáját.

Termelő nyáj előállítása és kiválasztása

A fent leírt eljárás alkalmazható transzgénikus alapító Fo kecskék, és más transzgénikus kecskék előállítására. A transzgénikus F_o alapító kecskéket, például, ha nőstények tenyészthetjük tejtermelésre, ha pedig hímek, akkor transzgénikus nőstény utódok nemzésére. Az ilyen transzgénikus alapító bakot pároztathatjuk nem transzgénikus nőstényekkel transzgénikus utódok előállítására .

Transzgén-átvitel és vonatkozó jellemzők

Kecske tenyészvonalban analizáltuk a kérdéses transzgén átvitelét fülből és vérből vett minták PCR-rel és Southern blottal végzett analízisével. Például, a alapító bak és a három transzgénikus utód Southern biot analízise szerint a generációk között nem mutatkozott átrendeződés vagy kópiaszámbeli változás. A Southern biotokat emberi dekorinból származó cDNS-próbákkal teszteltük. A biotokat Betascope 603 berendezésen analizáltuk és a kópiaszámot a transzgén és a kecskeeredetű, endogén β-kazeingén összehasonlításával határoztuk meg.

Az expressziós szint értékelése

A transzgénikus állatok tejében a transzgénikus fehérje expressziós szintjét enzimatikus esszékkel vagy Western blottal határoztuk meg.

A leírásban minden szabadalmi leírás és más hivatkozás a kitanítás részét képezi. Egyéb megvalósítási módok az alábbi igénypontok által meghatározott körbe esnek.

A szekvencialistában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása:

<210> 1 <223> szintetikusan előállított oligonukleotid <210> 2 <223> szintetikusan előállított oligonukleotid <210> 3 <223> PCR láncindító <210> 4 <223> PCR láncindító

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Transzgénikus úton előállított dekorinpreparátum.
2. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a dekorin emberi dekorin.
3. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a dekorin transzgénikus állatban előállított.
4. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a dekorin transzgénikus emlősben előállított.
5. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a dekorin transzgénikus tejtermelő állatban előállított.
6. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a dekorin transzgénikus kecskében előállított.
7. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a transzgénikus úton előállított dekorin nem tartalmaz glükózaminoglikán (GAG) láncot.
8. Az 1. igénypont szerinti preparátum, amelyben a transzgénikus úton előállított dekorint transzgénikus emlős emlőmirigyében állítjuk elő.
9. Transzgénikus úton előállított dekorinpreparátum, ahol a preparátumban a dekorinmolekuláknak kevesebb mint 30%-a tartalmaz GAG láncot.
10. Eljárás transzgénikus dekorinpreparátum előállítására azzal jellemezve, hogy az alábbiakat tartalmazza: dekorin expresszióját irányító transzgént tartalmazó, transzgénikus szervezetet állítunk elő;

expresszáltatjuk a transzgént;

és a szervezetből vagy a szervezet által előállított termékből kinyerjük a transzgénikus úton előállított dekorinpreparátumot.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy dekorinként emberi dekorint állítunk elő.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a dekorint transzgénikus állatban állítjuk elő.
13. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a dekorint transzgénikus emlősben állítjuk elő.
14. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a dekorint transzgénikus tejtermelő állatban állítjuk elő.
15. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a dekorint transzgénikus kecskében állítjuk elő.
16. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy transzgénikus úton előállított dekorinként GAG láncot nem tartalmazó dekorint állítunk elő.
17. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzgénikus úton előállított dekorint transzgénikus emlős emlőmirigyében állítjuk elő.
18. Eljárás transzgénikus emlősállat tejében lévő dekorint tartalmazó, transzgénikus preparátum előállítására azzal jellemezve, hogy:

tejet nyerünk ki olyan transzgénikus állatból, amelynek ivarsejtvonalába promóterszekvenciához működőképesen kapcsolt, dekorinfehérjét kódoló szekvencia lett bejuttatva, amely promóterszekvencia az emlőmirigy epitéliumsejtjeiben a fehérjét kódoló szekvencia expresszióját eredményezi, ezáltal a dekorin az emlős tejébe szekretálódva szolgáltatja a preparátumot.
19. Transzgénikus dekorint expresszáló transzgénikus szervezet, amelyből transzgénikus dekorinpreparátumot nyerhetünk .
20. Transzgénikus dekorint vagy transzgénikus dekorinpreparátumot és gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény.
21. Transzgénikus úton előállított, emberi dekorint és legalább egy táplálkozási összetevőt tartalmazó készítmény.
22. Eljárás dekorin beadására olyan alanynak, amelynek dekorinra van szüksége, azzal jellemezve, hogy az alanynak transzgénikus úton előállított dekorint vagy transzgénikus dekorinpreparátumot adunk be.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol az alany rákos megbetegedésben szenved.
24. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol az alany invazív bőrsérüléstől szenved.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Dr. Svingor Ádám szabadalmi ügyvivő