HUP0302052A2 - Az FVIIa vagy egy szöveti faktor antagonista használata génexpresszió, sejtvándorlás vagy kemotaxis szabályozására - Google Patents

Abstract

A jelen találmány tárgya az FVII és/vagy egy másik szöveti faktoragonista és/vagy az FVIIai és/vagy egy másik szöveti faktorantagonista használata olyan patológiás állapotok terápiás kezelésére,amelyek a sejtvándorláshoz kötődnek, vagy amelyeket a sejtvándorlásvagy a kemotaxis specifikus szabályozásával lehet kezelni. A találmánytárgyát képezi továbbá az FVII és/vagy egy másik szöveti faktoragonista és/vagy az FVIIai és/vagy egy másik szöveti faktorantagonista használata olyan patológiás állapotok terápiás kezelésére,amik egy sejtben legalább egy gén, például a Cyr61 gén expressziójánakszabályozásához kötődnek. Ó

Description

.közzétételi 1 :::· :::· ‘.-λ I 'PÉLDÁNY

73.989/SZE

Az FVIIa vagy egy szöveti faktor antagonista használata génexpresszió, sejtvándorlás vagy kemotaxis szabályozására

Az alábbiakban ismertetjük a VII-es koagulációs faktor (FVII), vagy egy szöveti faktor antagonista, mint például a szöveti faktort (TF) expresszáló sejtek inaktivált Vila koagulációs faktora (FVIIai), új sejtszabályozási aktivitását. A jelen találmány tárgya eljárás a sejtvándorlás vagy kemotaxis szabályozására, a sejtet FVIIa-val vagy más TF agonistával, vagy FVIIai-val vagy más TF antagonistaval érintkezésbe hozva, és meghatározva az említett sejt vándorlását. A jelen találmány tárgya továbbá az FVIIa vagy más TF agonista, vagy az FVIIai vagy más TF antagonista használata olyan gyógyszer készítésében, amit egy betegben a sejtvándorlás szabályozására lehet használni. Emellett a jelen találmány tárgya egy kezelési eljárás, valamint egy módszer, amivel ki lehet mutatni a vegyületek aktivitását, pontosabban olyan gyógyszerjelöltekét, amik kölcsönhatásba lépnek a sejtvándorlással.

A véralvadás külső bioszintézis útja akkor iniciálódik, amikor a plazmában FWIa keringő kötődik az integrálódott membránfehérjéhez, a szöveti faktorhoz (TF). A szöveti faktornak a véralvadásban játszott szerepét alaposan tanulmányozták. Az FVIIanak a véralvadási kaszkádban proteolítikus enzimként játszott szerepéről azt gondolták, hogy a szöveti faktort expresszáló sejtek extracelluláris külsejére korlátozódik. Az FVIIA intracelluláris aktivitására akkor céloztak először, amikor a szöveti faktor szekvenciája homológiát mutatott a citokin/interferon- vagy hematopoietikus receptor szupercsaláddal. A hematopoietikus receptorcsalád I-es alosztályába tartoznak a növekedési hormon, a prolaktin, az interleukin 1-7, a granulocita makrofág telepserkentő növekedési faktorok, az eritropoietin és a trombopoitin receptorai. A ΙΙ-es alosztályba tartoznak a szöveti faktor és az interferon-ct valamint az interferon-β receptorai.

A szöveti faktornak a receptorok ezen osztályával mutatott hasonlóságát tovább erősíti a kristálystruktúra megjelenési formája. A citokin receptorok ezen osztálya - amik közé tartoznak az interferon-α, -β és -γ, valamint az interleukin-10 receptorai jellemzője az, hogy aktiválásuk a receptorok, valamint az intracelluláris fehérjék egy alcsoportja gyors tirozin-foszforilezéséhez vezet. A kiindulási tirozin-foszforilezés után perceken belül aktiválódik a mitogénnel aktivált (Ser/Thr) kinázok sorozata (MAPK). Ezek a kinázok számos párhuzamos jeladó bioszintézis útba rendeződnek. Az FVIIa feltételezett intracelluláris jeladó kapacitásának alapos tanulmányozása megmutatta, hogy az intracelluláris szabad kalcium (Ca²⁺) mobilizálását indukálja a J82 humán húgyhólyag karcinóma sejtvonalban, ami konstitutíve expresszálja a szöveti faktort, valamint a köldökvéna endoteliális sejtjeiben, amiket interleukin-1-gyei előkezeltek, hogy a szöveti faktort expresszálják, de nem képesek az intracelluláris tirozin kinázok semmilyen citokin-szerú aktiválására. Következésképpen, az FVIIa-ról azt gondolják, hogy szöveti faktortól függő mó dón indukálja az intracelluláris Ca²⁺ mobilizálását, a foszfolipáz C aktiválásán keresztül. Az a mechanizmus, amivel az FVIIa aktiválja a foszfolipáz c-t, nem ismert, de a tirozin kináz aktiválást specifikusan kizárták.

A különböző laboratóriumokból származó jelentések azt mutatják, hogy a szöveti faktor befolyásolhatja a koagulációtól eltérő, biológiai funkciók egy sorozatát, azaz például az angiogenezist, embrió vaszkularizációt és tumor áttétet. Jelenleg azonban nem világos, hogy a szöveti faktor miként járul hozzá ezekhez a biológiai folyamatokhoz. A szöveti faktor extracelluláris doménje két fibronektin-III-as típusú modulból áll, ugyanúgy, mint a ΙΙ-es osztályú citokin receptor tipikus osztályában az extracelluláris dómén, ami felveti annak lehetőségét, hogy a szöveti faktor szerepet játszhat a jelátvitelben, a citokin receptor primer funkciójában. Azonban a szöveti faktornak egy nagyon rövid citoplazmatikus doménje van (csak 21 aminosavat tartalmaz), és hiányoznak belőle a membránközeli motívumok, amik befolyásolják a nem-receptor Janus kinázok (Jak-ok) kötődését, amik lényegesek a citokin receptor jeladáshoz. Mindazonáltal számos biokémiai felfedezés sugallja, hogy a szöveti faktornak jelátadási funkciója van. A humán szöveti faktor fehérje szekvencia elemzéséből kiderült, hogy van egy feltételezett foszforilezési hely a citoplazmatikus doménben, ami konzerválódott az egér, patkány és nyúl szöveti faktorban. A szöveti faktor citoplazmatikus farkában levő specifikus szerincsoportok a sejtekben foszforilezve vannak, a protein kináz C aktivátorral való stimulálás után. A humán szöveti faktor citoplazmatikus farok in vitro több pontban foszforilezödik, ha az U87-MG sejtek lizátumával inkubáljuk. A szöveti faktor citoplazmatikus doménjének a jelátadásban játszott potenciális szerepét is kimutatták olyan vizsgálatokban, amikben kimutatták, hogy a szöveti faktor prometasztatikus funkciója kritikusan függ a szöveti faktor citoplazmatikus doménjétől. Emellett a szöveti faktor citoplazmatikus doménjéröl kimutatták, hogy kölcsönhatásba lép a 280 aktinkötö fehérjével (ABP-280), és az ABP-280-nak a szöveti faktor által befolyásolt tapadási kontaktusokhoz való gyűjtése alátámasztja a sejt megtapadását és vándorlását.

Azonban a szöveti faktorról kimutatták, hogy részt vesz bizonyos típusú jelátadásban, egy extracelluláris jeladásban proteolítikus mechanizmussal kofaktorként szolgálva az FVIIa fiziológiás ligandumához. Például az FVIIa-nak a sejtfelszínhez való kötődésénél a szöveti faktorról kimutatták, hogy intracelluláris Ca²⁺ oszcillációkat indukál számos szöveti faktort expresszáló sejtben, monocitákban a tirozin ideiglenes foszforilezését indukálja, a MAP kináz aktiválását indukálja, fibroblasztokban a génexpresszió megváltozását indukálja, és tumorsejtekben az urokináz receptor fokozott expresszióját indukálja. A katalitikusán inaktív FVIIa (FVIIai) az előző jelátviteli válaszok közül számosat nem képes indukálni, a Ca²⁺ oszcillációktól a MAP kináz aktiváláson át a gén redukcióig, és úgy tűnik, hogy az FVIIa katalitikus aktivitására lehet szükség legalább néhány TFFVIIa által közvetített jelátvitelben. Jelenleg nem sokat tudunk azokról a jelátviteli bioszintézis utakról, amiket a proteolítikusan aktív FVIIa indukál, és arról sem, hogy ezek az FVIIa által generált jelek miképpen járulnak hozzá az angiogenezishez és a tumor áttétekhez.

Ahhoz, hogy az FVIIa által indukált válasz mögött álló transzkripció időbeli programozását tanulmányozzuk, egy cDNS mikrotömbben vizsgáltuk a humán fibroblasztoknak az FVIIa-ra adott válaszát. Az adatokból kiderült, hogy a fibroblasztokban számos gén celluláris expressziója kimutathatóan megváltozott az FVIIa-val való érintkezés hatására. Az egyik ilyen gén a Cyról, egy növekedési faktorral indukálható intermedier korai gén, aminek a termékéről kimutatták, hogy elősegíti a sejttapadást, erősíti a növekedési faktor által indukált DNS szintézist, és stimulálja a sejtvándorlást a fibroblasztokban és az endoteliális sejtekben.

A jelen találmány tárgya az FVIIa és/vagy az FVIIa és/vagy más szöveti faktor antagonista és/vagy az FVIIai és/vagy más szöveti faktor antagonista használata olyan patológiás állapotok kezelésében, amik kapcsolatban állnak a sejtvándorlással, vagy amiket a sejtvándorlás vagy a kemotaxis specifikus szabályozásával kezelnek.

A jelen találmány tárgya továbbá az FVIIa és/vagy az FVIIa és/vagy más szöveti faktor antagonista és/vagy az FVIIai és/vagy más szöveti faktor antagonista használata olyan patológiás állapotok kezelésében, amik egy sejtben legalább egy gén, azaz pél dául a Cyrló gén expressziója szabályozásával állhatnak kapcsolatban.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a sejtvándorlás indukálására vagy fokozására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza azt a lépést, amiben az említett sejtet egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.

Az egyik megvalósítási mód szerint a szöveti faktor antagonista az FVII vagy az FVIIa.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a sejtvándorlás csökkentésére vagy gátlására, azzal jellemezve, hogy tartalmazza azt a lépést, amiben az említett sejtet egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.

Az egyik megvalósítási mód szerint a szöveti faktor antagonista módosított FVII.

Az egyik megvalósítási mód szerint a sejt egy szöveti faktort expresszáló humán sejt, beleértve a fibroblasztokat, a simaizom sejteket, a tumorsejteket, a hematopoietikus sejteket és az epiteliális sejteket.

Az egyik megvalósítási mód szerint a módosított VII-es faktort azok közül a VII-es faktorok közül választjuk ki, amiket Danzil-Phe-Pro-Arg klórmetil ketonnal, Danzil-Glu-Glu-Arg klórmetil ketonnal, Danzil-Phe-Phe-Arg klórmetil ketonnal, Phe-PheArg klórmetil ketonnal, Danzil-D-Phe-Pro-Arg klórmetil ketonnal, Danzil-D-Glu-Gly-Arg klórmetil ketonnal, Danzil-D-Phe-Phe-Arg klórmetil ketonnal és D-Phe-Phe-Arg klórmetil ketonnal módo sítottunk.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás sebgyógyulás indukálására vagy erősítésére egy betegben, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy gyógyászatilag elfogadható készítményből, ami Vila faktort, vagy VII faktort, vagy más szöveti faktor antagonistát, vagy ezek kombinációját tartalmazza.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a sejtvándorlás, invázió, sejtvándorlással indukált sejtszaporodás vagy angiogenezis gátlására vagy csökkentésére egy betegben, aki nem-kívánt sejtvándorlással, invázióval, sejtvándorlással indukált sejtszaporodással vagy angiogenezissel kapcsolatban betegségben vagy állapotban szenved, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy gyógyászati készítményből, ami egy szöveti faktor antagonistát tartalmaz.

Az egyik megvalósítási mód szerint a betegség vagy állapot primer tumornövekedés, tumor invázió vagy áttét.

A jelen találmány tárgya továbbá a szöveti faktor használata olyan gyógyszer előállításában, amit a sejtvándorlás indukálására vagy fokozására használunk.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás legalább egy gén expressziójának szabályozására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy a sejtet vagy egy szöveti faktor agonistával hozzuk érintkezésbe, vagy az említett sejtet szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.

Az egyik megvalósítási mód szerint a gén a CCB géncsaládba tartozik.

Egy másik megvalósítási mód szerint a gént az alábbi csoportból választhatjuk ki: Cyrl6, CTFG, dopamin D2 receptor, EST Incyte PD 395116 vagy P2U nukleotid receptor.

Az egyik megvalósítási mód szerint a gén a Cyrlő gén.

Az egyik megvalósítási mód szerint a szabályozás az expresszió indukciója vagy fokozása. Egy másik megvalósítási mód szerint a szabályozás az expresszió csökkentése vagy gátlása.

Az egyik megvalósítási mód szerint az FVII vagy az FVIIa vagy más szöveti faktor agonista génexpressziót indukál vagy fokoz, és a módosított FVII vagy más szöveti faktor antagonista génexpressziót csökkent vagy gátol, például akkor, ha a gén a CCN géncsaládba tartozó gén, vagy a gént az alábbi csoportból választhatjuk ki: Cyrló, CTFG, dopamin D2 receptor, EST Incyte PD 395116 vagy P2U nukleotid receptor.

Az egyik megvalósítási mód szerint az FVII vagy az FVIIa vagy egy másik szöveti faktor agonista csökkenti vagy gátolja a génexpressziót, és a módosított FVII vagy más szöveti faktor antagonista indukálja vagy fokozza a génexpressziót, például amikor a gén az ESTIncyte PD 674714.

A kezelhető kóros állapotok patológiás állapotok, azaz például atheroszklerózis, tumor depozíció, tumornövekedés, tumor invázió, áttét vagy angiogenezis. Más kezelhető állapot például a sebek gyógyulása, beleértve az érfalak regenerálódását, és az égések, vagy a gyulladás kezelését, vagy a sejtvándorlás szabályozását in vitro, azaz például szövet növekedését.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a mellékelt ábrákat.

1A. és IB. ábra: A szöveti faktor fibroblasztokban való expressziójának áramlási citometriás elemzése (1A). A sejteket vagy rágcsáló monoklonális fluoreszcein-izitiocianáttal (FITC) konjugált egér anti IgG ellenanyaggal festjük (kitöltetlen terület), amit negatív kontrollként használunk, vagy egy monoklonális fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált anti-szöveti faktor ellenanyaggal (kitöltött terület) festjük. Az 1B. ábra mutatja a fibroblasztok prokoaguláns aktivitását. A szöveti faktor expressziót mutató fibroblasztok a PCA tízszeres növekedését generálják, a szöveti faktort nem expresszáló monocitákkal összehasonlítva.

2A. ábra: Az FVIIa és az FFR-WIIa hatása egy PDGF-BBvel indukált kemotaxisra humán fibroblasztokban. ' mutatja a fibroblasztok vándorlását a PDGF-BB koncentrációja esetében. A 100 nM FVIIa-val ([) vagy 100 nM FFR-VIIa-val ([) inkubált fibroblasztok a PDGF-BB különböző koncentrációi felé vándorolnak. Az eredmények három különböző kísérlet átlagai és SEM-ei. A 0,05-nél kisebb P értékeket tekintjük statisztikailag szignifikánsnak (Student féle t teszt).

2A-D. ábra: Az FVIIa vagy az FFR-FVIIa befolyása a PDGFBB-vei indukált kemotaxisra fibroblasztokban. ' mutatja a fibroblasztok vándorlását a PDGF-BB különböző koncentrációihoz. A sejteket 12,5 (A), 25 (B), 50 (C) és 100 (D) nM FVIIa-val ([) vagy FFR-VIIa-val (!) inkubáljuk, majd Boyden kamrában vizsgáljuk a PDGF-BB különböző koncentrációi felé. Az eredmények három különböző kísérlet átlagai és SEM-ei. *=p<0,05, **=p<0,01 és***=p<0,001 Student t teszt.

4A. ábra: Három szöveti faktor elleni monoklonális ellenanyag keveréke blokkolja az FVIIa és az FFRVIIa hatásait a fibroblasztokban PDGF-BB-vel indukált kemotaxisra. ' mutatja a fibroblasztok vándorlását a PDGF-BB felé szöveti faktor ellenanyagok nélkül; [ szöveti faktor ellenanyagokkal és 100 nM FVIIaval elóinkubált fibroblasztok, és ([) szöveti faktor ellenanyagokkal és 100 nM FFR-FVIIa-val elóinkubált fibroblasztok. Az eredmények három különböző kísérlet átlagai és SEM-ei.

5A és 5B. ábra: Az FXa hatása a PDGF-BB-re FVIIa-val indukált kemotaktikus válaszra. A fibroblasztokat 200 nM TAP-vei (5A. ábra) ('), vagy 0,2-2 μπι TAP-vel (5B. ábra) ('), majd 100 nM FVIIa-val ([) inkubáltuk elő. TAP a teljes kísérlet során jelen volt. A kemotaxist különböző koncentrációjú PDGF-BB-vel (5A) vagy 0,1 ng/ml PDGF-BB-vel (5B. ábra) indukáltuk. Az eredmények két különböző kísérlet átlagai és SD-i.

6A. ábra: A trombin hatása a PDGF-BB-re FVIIa-val indukált kemotaktikus válaszra. A fibroblasztokat 5 E/ml (végkoncentráció) hirudinnal előinkubáltuk, majd 100 nM FVIIa-val. Hirudin a kísérlet során végig jelen volt. A kemotaxist különböző koncentrációjú PDGF-BB-vel inkubáltuk. ' mutatja a csak Hirudinnal inkubált sejteket, és Γ mutatja a Hirudinnal és FVIIaval inkubált sejteket. Az eredmények két különböző kísérlet átlagai és SD-i.

7A. ábra: A PI3‘ kináz hatása a kemotaxisra FVIIa-val inkubált fibroblasztokban. A sejteket különböző koncentrációjú LY294002-vel 30 percig 37°C-on előinkubáljuk, majd 100 nM

FVIIa-val ([) vagy FVIIa nélkül( ')· Az inhibitor az egész kemotaxis vizsgálatban jelen volt. A kemotaxist 0,1 ng/ml PDGF-BB-vel indukáltuk. Az eredmények két külön kísérlet átlagai és SD-i.

8A. és 8B. ábra: A PLC gátlás hatása a kemotaxisra FVIIaval inkubált fibroblasztokban. A sejteket 30 percig 37°C-on különböző koncentrációjú U73122-vel (aktív PLC inhibitor) (8A), vagy U73343-mal (természetes kontroll) (8B) inkubáljuk, mielőtt 100 nM FVIIa-val vagy anélkül inkubáljuk, majd Boyden kamrában vizsgáljuk, 0,1 ng/ml PDGF-BB koncentráció gradiensen. Az ágensek a kísérlet során végig jelen voltak. ' mutatja a sejteket csak U37122-vel vagy U73343-mal. [mutatja a sejteket U73122-vel vagy U73343-mal és FVIIa-val. Az eredmények két külön kísérlet átlaga és SD-je.

9. ábra: Inozitol triszfoszfát (IP₃) felszabadulása csak FVIIaval, FFR-FVIIa-val, valamint PDGF-BB-vel kombinálva stimulált fibroblasztokból. A sejteket éjszakán át mio [³H] inozittal jelezzük, 100 nM FVIIa-val vagy FFR-VIIa-val, vagy ezek nélkül inkubáltuk, 10 ng/ml vagy 100 ng/ml PDGF-BB jelenlétében vagy távollétében. A sejtekben azután vizsgáljuk az IP₃ felszabadulását. Az üres oszlopok mutatják az FVIIa vagy FFRVlla nélkül inkubált sejteket (kontroll), a csíkozott oszlopok mutatják az FFR-FVIIa-val inkubált sejteket, és a fekete oszlopok mutatják az FVIIa-val inkubált sejteket.

10. ábra: A PLC-γΙ tirozin foszforilezése csak PDGF-BB-re (kontroll), FVIIa-ra, vagy FFR-FVIIa - PDGF-BB kombinációra adott válaszként. A sejteket 1 óra hosszat 100 nM FVIIa-val vagy

FFR-FVIIa-val inkubáljuk, majd a jelzett koncentrációkban PDGF-BB-vel vagy anélkül. A sejteket lizáltatjuk, és a PLC-yl tirozin foszforilezettségét a módszerekben ismertetett eljárással kimutatjuk.

1. ábra: Northern biot elemzés, ami igazolja a cDNS mikrotömbbel kapott adatokat. Tíz gramm össz-RNS-t (ugyanabból az RNS mintából, mint amit poli(A) RNS izolálásához használtunk, hogy próbát generáljunk a cDNS mikrotömb hibridizálásához) használunk a Northern biot elemzéshez, és ³²P-vel jelzett Cyr61-et (ez egy részleges eDNS, a Genomic Systems-től) használunk próbaként.

B panel: a hibridizációs szignálokat mennyiségileg

Phosphorimager-rel (Molecular Dynamics) határozzuk meg.

2. és 2B. ábra: A Cyr61 Vila faktorral indukált időfüggő expressziója. WI-38 sejtek nyugalomban levő egysejtrétegét különböző ideig 5 g/ml Vila faktorral (2A), vagy PDGF-BB-vel (10 ng/ml) kezeljük. 10 g össz-RNS-t használunk Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61-et használunk próbaként. A megfelelő blot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

3. ábra: : A Cyr61 VHa faktorral indukált dózisfüggő expressziója. WI-38 sejtek nyugalomban levő egysejtrétegét különböző dózisú Vila faktorral (0, 0,1, 0,5, 2,0 és 5,0 pg/ml) kezeljük 45 percig. 10 g össz-RNS-t használunk Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61-et használunk próbaként. A megfelelő blot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

4. ábra: A Vila faktor katalitikus aktivitása is kell a Cyröl indukált expressziójához. WI-38 sejtek nyugalomban levő egysejtrétegét kontroll szérummentes közeggel vagy 5 g/ml Vila faktort tartalmazó szérummentes közeggel, vagy 5 g/ml aktív-helyen inaktivált Vila faktorral (Vllai) kezeljük 45 percig. 10 g össz-RNSt használunk Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61-et használunk próbaként. A megfelelő blot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

5. ábra. A Cyről VHa faktorral indukált expresszióját nem törlik el az Xa és a trombin specifikus inhibitorok. WI-38 sejtek nyugalomban levő egy sejtrétegét kontroll szérummentes közeggel vagy 5 g/ml Vila faktort tartalmazó szérummentes közeggel (5 g/ml; 100 nM) kezeljük 45 percig. A sejteket 30 percig 200 nM rekombináns TAP-vel (3-as sáv) vagy hirudinnal (4-es sáv) előinkubáljuk, mielőtt 45 percig reagáltatjuk a Vila faktorral. 10 g össz-RNS-t használunk Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61-et használunk próbaként. A megfelelő biot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

6. ábra: Aktinomicin-D és cikloheximid hatása a Vila faktorral indukált Cyről egyensúlyi mRNS szintekre. WI-38 sejtek nyugalomban levő egy sejtrétegét 30 percig kontroll hordozóval, 10 g/ml aktinomicin D-vel (10 g/ml) vagy cikoheximiddel (10 g/ml) előinkubáljuk, mielőtt a sejteket 45 percig 5 g/ml Vila faktorral reagáltatjuk. A megfelelő blot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

7. ábra: A Vila faktor a CTGF expresszióját indukálja. WI38 sejtek nyugalomban levő egysejtrétegét különböző ideig 5 g/ml Vila faktorral kezeljük. 10 g össz-RNS-t használunk Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61-et használunk próbaként. A megfelelő blot 28S riboszómális RNS etídiumbromidos festését az alsó panelben mutatjuk be RNS felvivő kontrollként.

A jelen találmány tárgya az FVII, vagy az FVIIa vagy más szöveti faktor agonista használata egy gyógyászati készítmény gyártására, amivel a sejtek vándorlását indukálni vagy fokozni lehet.

A jelen találmány tárgya továbbá az FVII, vagy az FVIIa vagy más szöveti faktor agonista használata egy gyógyászati készítmény gyártására, amivel a sebgyógyulást vagy az angiogenezist indukálni vagy fokozni lehet.

A jelen találmány tárgya továbbá az FVIIai vagy más szöveti faktor antagonista használata egy gyógyászati készítmény gyártására, amivel a sejtek vándorlását indukálni vagy fokozni lehet.

Az egyik megvalósítási mód tárgya a sejtvándorlás.

A jelen találmány tárgya továbbá az FVIIai vagy más szöveti faktor antagonista használata egy gyógyászati készítmény gyár tására, amivel az angiogenezist, áttéteket, a tumornövekedést vagy a tumor invázióját meg lehet előzni, vagy gátolni lehet.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a sejtvándorlás indukálására vagy fokozására egy betegben, ami abból áll, hogy az említett betegnek az FVII-ből, vagy az FVIIa-ból vagy más szöveti faktor agonistából hatásos mennyiséget adunk be.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a sejtvándorlás gátlására vagy megelőzésére egy betegben, ami abból áll, hogy az említett betegnek az FVIIa-ból vagy más szöveti faktor antagonistából hatásos mennyiséget adunk be.

Az egyik megvalósítási mód szerint a hatásos mennyiség napi dózisa körülbelül 5 pg/ kg/nap-tói körülbelül 500 μ g/kg/nap-ig terjed.

A jelen találmány egy további megvalósítási módja szerint a szöveti faktor antagonista egy módosított FVIIa-t, például FFRFVIIa-t tartalmaz.

A jelen találmány tárgya továbbá az FVII és/vagy az FVIIa aktivitásának mechanizmusa, ami a sejtvándorlás stimulálásához kapcsolódik. Egy ilyen mechanizmus lehet az alapja az FVII és/vagy az FVIIa részvételének azokban a patológiás állapotokban, amikben a szöveti faktort expresszáló sejtek, mint például az endoteliális sejtek, epiteliális sejtek, fibroblasztok, simaizom sejtek és monociták/makrofágok vesznek részt. A találmány tárgyát képezi továbbá annak az alapja, hogy miként lehet olyan specifikus célpontokat azonosítani, amik jól használhatók a terápiás beavatkozásra.

Tehát a jelen találmány tárgya az FVII és/vagy az FVIIa használata olyan patológiás állapotok terápiás kezelésében, amik a sejtvándorláshoz kapcsolódnak, vagy amiket a sejtvándorlás specifikus szabályozásával lehet kezelni.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyszerjelöltek kimutatására, amik szabályozzák a sejtvándorlást, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

a) tenyésztjük a szöveti faktort expresszáló sejteket;

b) mérjük a sejt vándorlását;

c) a sejtet egy gyógyszerjelölttel inkubáljuk, és

d) mérjük az inkubált sejt vándorlását, és meghatározunk minden, a b) lépésben mért vándorláshoz viszonyított változást a vándorlás szintjében, és az ilyen változás azt jelzi, hogy az említett sejtben biológiailag aktív gyógyszerjelölt van.

A vér komponensei, amik részt vesznak abban a folyamatban, amit koagulációs „kaszkádnak” neveznek, proenzimek vagy zimogének, enzimatikusan inaktív fehérjék, amik proteolítikus enzimekké alakít egy aktivátor működése, ami maga is egy aktivált véralvadási faktor. Azokat a koagulációs faktorokat, amik ilyen konverzión mentek át, általában „aktív faktoroknak” nevezik, és a koagulációs faktor nevéhez hozzátett „a” betűvel jelölik (azaz például Vila faktor).

A „cink-kelátor” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint egy olyan vegyület, ami kötődik a Vila faktorhoz és a Vila faktorban a kalcium-ionok cink-ionokkal való helyettesítését indu kálja, ezzel gátolva a Vila faktor vagy a szöveti faktor-Vila faktor komplex (TF-VIIa) aktivitását.

A jelen találmánynak megfelelő szöveti faktor antagonista lehet egy cinket kelátba kötő vegyület, azaz például egy dihidroxamát vagy egy dihidrazid, amikben a hidroxamát vagy hidrazid csoportok úgy helyezkednek el egymáshoz viszonyítva, hogy képesek egy cinkiont kelátba vinni. A cinket kelátba kötő vegyület az FVIIa-val kombinálva hat. A Zn²⁺ ionok gátló hatásukat a Ca²⁺ ionok stimuláló hatásával versengve fejtik ki. Az várható, hogy a Zn²⁺ ionok az FVIIa egy vagy több kalciumot kötő pontjáról kiszorítják a Ca²⁺ ionokat. A cinket kelátba kötő vegyületek, azaz például a hidroxamátok és hidrazidok képesek a cinkionoknak a kalcium-ionokkal versengve való kötődése erőteljes támogatóiként hatni. Tehát specifikus vegyületek potenciálják a Vila faktor/szöveti faktor komplex aktivitásának cinkkel való gátlását. A Vila faktor aktivitása a szöveti faktorral komplexben egy olyan mechanizmussal gátolható, amiben egy cink-kelátor kötődik a Vila faktorhoz, és megkönnyíti a Ca²⁺ Zn²⁺-szal való helyettesítését. Ezzel a hatással a kelátor moduláló hatást fejt ki a szöveti faktorra a szabad Ca²⁺ és Zn²⁺ ionok normális vérkoncentrációi mellett.

Az „FVII” vagy „FVII faktor” szakkifejezés jelentése „egyláncü” (zimogén) VII-es koagulációs faktor. A „Vila faktor” vagy „FVIIa” szakkifejezés jelentése „kétláncú” aktivált VII-es koagulációs faktor, ami specifikus hasítással el van hasítva az Argl52Ile 153-as peptidkötésnél. Az FVII és az FVIIa vérből tisztítható, vagy rekombináns módszerekkel állítható elő. Az nyilvánvaló, hogy az itt ismertetett módszerek gyakorlata független attól, hogy a tisztított Vila faktor honnan származik, ezért a jelen találmányban megfontoljuk bármilyen, itt használható VII faktor vagy FVIIa készítmény használatát. A humán FVIIa-t használatát részesítjük előnyben. Az FVII vagy az FVIIa szándékaink szerint lehet bármilyen FVII variáns, amiben egy vagy több aminosav csoportot helyettesítettünk.

A „módosított VII-es faktor”, „inaktivált FVII”, vagy „FVIIai” szakkifejezés szándékaink szerint olyan FVIIa-t jelent, aminek a katalitikus centrumában legalább egy módosítás van, amely módosítás lényegesen gátolja a módosított FVIIa-nak azt a képességét, hogy aktiválja az FX-et vagy FIX-et. A szakkifejezések egymás helyett is használhatók. Ilyen módosítások közé tartozik az aminosav helyettesítés (vagy csere) a katalitikus triád csoportok (Ser344, Aspl42 és Hisl93) közül egyben vagy többen, és ide tartozik a katalitikus triád csoport csoportok módosítása szerin proteáz inhibitorokkal, azaz például szerves foszfor vegyületekkel, szulfanilíluoriddal, peptid halometil ketonnal vagy azapeptiddel. Az FFR-FVIIa egy FVIIai származék egyik példája, amit úgy kaptunk meg, hogy az FVIIa aktív centrumát az irreverzibilis inhibitorral, a D-fenilalanin-L-fenilalanin-L-arginin klórmetil ketonnal (FFR cmk) blokkoljuk. Más megfelelő FVIIai származék például az inaktivált FVIIa, amit úgy kapunk meg, hogy az aktív centrumot L-fenilalanin-L-fenilalanin-L-arginin klórmetil ketonnal, danzil-L-fenilalanin-L-fenilalanin-L-arginin klórmetil ketonnal, vagy danzil-D-fenilalanin-L-fenilalanin-Larginin klórmetil ketonnal blokkoljuk. Az FFR-FVIIa-t (FFR cmkval inaktivált FVIIa) részesítjük előnyben.

A „fehérjekináz” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint egy olyan enzim, ami képes foszforilezni a szerint és/vagy a treonint, és/vagy a tirozint, peptidekben és/vagy fehérjékben.

A «gyógyszerjelölt” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint bármilyen minta, aminek biológiai funkciója van, vagy biológiai hatást fejt ki egy celluláris rendszerben. A minta lehet egy biológiai anyagból vett minta, azaz például mikrobiális vagy növényi kivonat, vagy lehet egy olyan minta, ami egy szerves szintézissel vagy genetikai technikákkal előállított vegyületet, vagy vegyületek keverékét tartalmazza.

A „szöveti faktor agonista” szakkifejezés olyan vegyületekre vonatkozik, amik az alábbiakat indukálják:

a) jelátvitel a szöveti faktorhoz (azaz például FVIIa) való közvetlen kötődéssel,

b) az MAPK kaszkád stimulálása

c) az MAPK gátlás megszüntetése (azaz például PTPáz inhibitorok), amely agonisták az előzőkben definiált gyógyszerjelöltek.

A „szöveti faktor antagonista” szakkifejezés a következőkre vonatkozik:

a) olyan reagensek, amik az FVIIa-val versengenek a szöveti faktorhoz való kötődésért, transzmisszió nélkül, azaz például FVIIai,

b) olyan reagensek, amik kötődnek az FVIIa-hoz, és megakadályozzák a szöveti faktorhoz való kötődést, azaz például a Zn hidroxamát,

c) olyan reagensek, amik gátolják a jelátvitelt, az MAPK kaszkád tagjainak zavarásával,

d) olyan reagensek, amik kötődnek az FVIIa/szöveti faktorhoz és gátolják a transzmissziót,

e) olyan reagensek, amik kötődnek az FVIIa/szöveti faktor/FX-hez és gátolják a transzmissziót,

f) olyan reagensek, amik blokkolják a humán X-es faktor aktiválását, amiket a humán szöveti faktor/Vila komplex katalizál, amely antagonisták az előző definíciónak megfelelően gyógyszerjelöltek.

A „farmakológiai célpontok” szakkifejezés szándékaink szerint egy olyan fehérjét jelöl, ami képes megváltoztatni a szöveti faktort expresszáló sejtek vándorlását.

A „riporter gén” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint egy olyan DNS konstrukció, ami, ha átíródik, kimutatható fehérjét termel.

Az „SRE promoter elem” szakkifejezés jelentése egy olyan DNS szekvencia, ami a jelen találmány szerinti szérumban levő komponensek által indukált transzkripciós faktorhoz kötődik.

A „szöveti faktort expresszáló sejt” szakkifejezés jelentése bármilyen, szöveti faktort expresszáló emlős sejt.

A „fehérje foszforiláció” szakkifejezés jelentése szándékaink szerint a szerin és/vagy treonin és/vagy tirozin foszforilezését jelenti peptidekben és/vagy fehérjékben.

A sejtvándorlás modulálását vagy szabályozását úgy definiáljuk, mint az FVIIa vagy más szöveti faktor agonista, vagy FVIIai vagy más szöveti faktor antagonista kapacitását arra, hogy 1) vagy fokozza vagy csökkentse az éppen folyó, normális vagy abnormális sejtvándorlást, 2) normáli sejtvándorlást iniciáljon, és 3) abnormális sejtvándorlást iniciáljon.

Ebben a szövegösszefüggésben a „kezelés” szakkifejezés jelentése lehet egy káros állapot megelőzése, valamint egy már meglevő állapot szabályozása, azzal a céllal, hogy gátoljuk vagy minimalizáljuk az állapotot. Az FVIIa vagy más szöveti faktor agonista, vagy az FVIIai vagy más szöveti faktor antagonista beadása tehát a „kezelés” szakkifejezéssel írható le.

Ebben a szövegösszefüggésben az „egy egység” szakkifejezés a definíció szerint a VII-es faktor 1 ml normál plazmában levő olyan mennyisége, ami körülbelül 0,5 pg fehérjének felel meg. Aktiválás után 50 egység körülbelül 1 pg fehérjének felel meg.

Ebben a szövegösszefüggésben a „páciens” szakkifejezés jelentése bármilyen állat általában, főleg emlős, azaz például ember. Az „alany” szakkifejezést a „páciens” szakkifejezéssel egymás helyettesítésére használjuk.

Rövidítések

TF szöveti faktor

FVII a VII-es faktor egyláncú, nem-aktivált formájában

FVIIa a VII-es faktor aktivált formájában

RFVIIa a rekombináns VII-es faktor aktivált formájában FVIIai módosított (inaktivált) VII-es faktor

FFR-FVIIai D-Phe-L-Phe-L-Arg klórmetil ketonnal való reakcióval inaktivált VII-es faktor

A szöveti faktor (TF) az FVIIa faktor (FVIIa) celluláris receptora, és a komplex a fő iniciátora a véralvadásnak. Tanulmányoztuk az FVIIa szöveti faktorhoz való kötődésének hatásait a nagymennyiségű szöveti faktort expresszáló humán fibroblasztok sejtvándorlására és jelátadására. Az FVIIa-val inkubált fibroblasztok körülbelül százszor kisebb koncentrációban vándoroltak a PDGF-BB koncentráció-gradiense felé, mint az FVIIa-val nem ligáit fibroblasztok. Az anti-szöveti faktor ellenanyagok gátolták az FVIIa/szöveti faktor által indukált kemotaxis növekedését. Emellett a PDGF-BB által indukált kemotaxis kifejezett szuppressziója volt megfigyelhető az aktív hely-gátolt FVIIa-val (FFR-FVIIa). Azt a lehetőséget kizártuk, hogy a hiperkemotaxist az FXa és a trombin aktivitás feltételezett generálása indukálja.

Az FVIIa ugyanolyan mértékben indukálta az inozit-1,4,5triszfoszfát termelődését, mint a PDGF-BB; az FVIIa és a PDGFBB hatásai additívek voltak. Az FFR-Vila az inozit-1,4,5-triszfoszfát semmilyen felszabadulását nem indukálja. A PDGF-BB-re és az FVIIa-ra adott celluláris vándorlási választ teljesen blokkolja egy PLC inhibitor, sugallva ezzel, hogy a PLC aktiválása fontos a válaszhoz. Tehát az FVIIa-nak a szöveti faktorhoz való kötődése független lehet a koagulációtól, befolyásolja a celluláris válaszokat, azaz például a kemotaxist, és az FVIIa katalitikus aktivitás szükséges.

A szöveti faktorról azt gondolják, hogy funkciójuk van a tumor áttétekben, de ennek mechanizmusa még nem ismert. Azonban Ott és munkatársai nemrég az aktin-kötő protein 280 at (ABP-280) azonosították, mint a szöveti faktor citoplazmatikus doménjét, ami egy olyan molekuláris bioszintézis utat biztosít, amivel a szöveti faktor segítheti a tumorsejtek áttét-képzését. Az FVIIa/szöveti faktor által csökkentett molekuláris szignálok és biológiai funkciók azonban még nem ismertek eléggé.

A humán fibroblasztokban a szöveti faktor konstitutíve expresszálódik. Ezek a sejtek a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) receptorait is expresszálják. A PDGF a megcélzott sejtekben mitogenitást, az aktin reorganizációját és irányított sejtvándorlást (kemotaxis) indukál. Korábban kimutattuk, hogy a PDGF-BB a humán fibroblasztok egy hatékony kemotaktikus faktora, és a kemotaktikus választ a β-receptor osztály befolyásolja. Ezért ezeket a sejteket választottuk ki arra, hogy tanulmányozzuk az FVIIa-nak a szöveti faktorhoz való kötődése által indukált, feltételezett szignál-transzdukciót.

Az alábbiakban először mutatjuk ki, hogy világos kapcsolat van az FVIIa szöveti faktorhoz való kötődése által indukált jeladás és a növekedési faktorra adott celluláris válasz között. Olyan adatokat mutatunk be, amik szerint a humán fibro blasztokban az FVIIa/szöveti faktor komplex a PDGF-BB-re adott hiperkemotaktikus válaszhoz vezet. Emellett az aktív pontban gátolt FVIIa (FFR-FVIIa) dózisfüggő módon szuppresszálja a PDGF-BB felé való irányított vándorlást. A PLC és a foszfatidilinozit 3'-kináz (PI3' kináz) specifikus inhibitorainak használatával azt is kimutattuk, hogy az FVIIa/szöveti faktor jeladással a PDGF-BB felé indukált hiperkemotaktikus válasz függ a foszfolipáz C (PLC) aktivitásától, de független a PI3' kináztól. Az FVIIa és a PDGF-BB inozit-l,4,5-triszfoszfát (IP₃) termelődését additív módon indukálja, ami a PLC aktiválása után felszabadult szekunder messengerek egyike.

A szöveti faktor konstitutíve expresszálódik számos extravaszkuláris sejt, azaz például vaszkuláris adventitia-ban a sztróma fibroblasztok, a máj, a lép és a vese fonalas kapszulái plazma-membránján. Tehát a szöveti faktor expresszióját olyan helyeken találjuk meg, amik fizikailag el vannak választva a keringő vértől, és hemosztatikus burkot biztosítanak. Ennek a határnak a sérüléséről azt gondolják, hogy a szervezetet megvédik a vérzéssel szemben. A szöveti faktor azonban számos különböző ágenssel -beleértve a citokineket és növekedési faktorokat - indukálható monocitákban/makrofágokban, vaszkuláris simaizomsejtekben, endoteliális sejtekben és számos különböző tumorsejtben. A transzkripciós szinten való indukció a stimulálás után gyorsan fellép, ami a szöveti faktort a növekedéshez kapcsolódó közvetlen korai génként azonosítja.

Ebben a tanulmányban vizsgáltuk a szöveti faktor mint jeladó receptor szerepét. Kimutattuk, hogy a humán fibroblasztok, amikben a szöveti faktor konstitutíve expresszálódik az FVIIa ligandum-kötödésére, a PDGF-BB rendkívül alacsony koncentrációi felé vándorolnak. A szöveti faktor/FVIIa önmagában nem indukál fokozott spontán vándorlást, azaz random vándorlást. Tehát az FVIIa/szöveti faktor és a PDGF-BB növekedési faktor által adott intracelluláris jeladás szükséges a motilitási válasz eléréséhez. Nemcsak a szöveti faktorhoz való kötődés, hanem a szöveti faktor/FVIIa katalitikus aktivitása is kötelező, mivel az aktív pontjában gátolt FVIIa nem mutat fokozott vándorlási választ. Emellett a gátló monoklonális ellenanyagok megakadályozzák az FVIIa-ra adott kemotaktikus választ. Azt is kizártuk, hogy az indirekt jeladás az FXa vagy a trombin miatt fordul elő, mivel a TAP és a Hirudin nincs hatással az FVIIa/szöveti faktorral indukált kemotaxisra. Ehelyett azt találtuk, hogy az FFR-FVIIa növekvő koncentrációja aktívan gátolja a PDGF-BB által indukált kemotaxist. Az FFR-FVIIa-val inkubált fibroblasztok teljesen normális random vándorlást mutatnak. Az FFR-FVIIa-nak a PDGFBB által indukált kemotaxisra gyakorolt gátló hatása nem figyelhető meg anti-szöveti faktor ellenanyagok kombinációjának jelenlétében, ezzel kizárva annak a lehetőségét, hogy az FFRFVIIa toxikus. Ezek az eredmények inkább azt sugallják, hogy a PDGF β-receptorokat és szöveti faktort expresszáló sejtekben az FVIIa/szöveti faktor komplex fontos a PDGF-BB kemotaktikus válaszában.

A mi megfigyelésünk, hogy az FVIIa fokozza az IP₃ termelődést, és az FVIIa/szöveti faktor által indukált Ca²⁺ oszcillációk, különösen az MCDK sejtekben, erősen alátámasztják azt, hogy a PLC-t számos sejtben az FVIIa/szöveti faktor aktiválja. Emellett, a humán fibroblasztokban az FVIIa/szöveti faktor által PDGF-BB ellen indukált hiperkemotaktikus választ egy PLC inhibitor dózisfüggő módon gátolja. Korábban találtunk egy hasonló PDGF-BB elleni hiperkemotaktikus választ a PDGF-BB receptor mutáns Y934F sejtekben, ami a PLC-γΙ fokozott foszforilációját és aktiválását mutatja. Ezekben a sejtekben a PLC-γΙ fokozott foszforilezése a vad-típusú PDGF β-t expresszáló sejtekkel összehasonlítva korrelációt mutat az IP₃ háromszor magasabb termelési szintjével. Az FVIIa/szóban forgó és a PDGF-BB kombinációja humán fibroblasztokban az IP₃ termelés körülbelül kétszeres növekedését okozza. Az FVIIa/szöveti faktor által indukált IP₃ termelés azonban nem korrelál a PLC-γΙ foszforilezésével. A PLCγ2 FVIIa/szöveti faktor által indukált tirozin foszforilezése nem zárható ki, de valószínűtlennek tűnik, mivel a PLC-y2 expressziója nagyon alacsony humán fibroblasztokban. Emellett a szöveti faktor intracelluláris része nem rendelkezik belső fehérjekináz aktivitással. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az FVIIa/szöveti faktor a β és/vagy δ PLC izozimek aktiválását indukálja. Az IP₃ felszabadulási vizsgálatban a sejttenyésztö közeget 0,1% FBS-sel egészítjük ki, ami csak körülbelül 0,1 nM FXa-t tartalmaz. Azt találtuk, hogy több mint 20 nM FXa koncentráció szükséges az IP₃ termeléshez. Azt a mechanizmust még meg kell találni, amivel a β vagy δ PLC izozimek aktiválódnak. Az a véleményünk, hogy az aktiválás magában foglalja a szöveti faktor és egy membránhoz kapcsolódó fehérje kooperációját.

Újabban azonosították a szöveti faktor és a citoszkeleton közötti kapcsolatot. Kimutatták a szöveti faktor citoplazmatikus doménje és az ABP 280 aktinfonal-kötő fehérje közötti molekuláris kölcsönhatást. Emellett a szöveti faktorról kiderült, hogy szoros kontaktusban van az aktinnal és az aktinfonalat kötő fehérjékkel, azaz például az α-aktininnel és az ABP280-nal a terjedő epiteliális sejtek lamellipodia és fodros membrán területein. Az ABP280, ami a fiiamin alcsalád tagja, szükséges a lamellipodia normális működéséhez, és ezért nagyon fontos a sejtek motilitása szempontjából. A PI3' kináz és a PLC izozimek a kemotaktikus válaszokban, azaz például az aktinkötő fehérjék mobilizálásában játszanak szerepet. A korábbi vizsgálatokban megfigyeltük, hogy a PI3'-kináz bioszintézis útban a PDGF-β receptor által indukált kemotaxis kevésbé fontosnak tűnik azokban a sejtekben, amikben a PLC-yl túlexpresszálódik és megnő az aktivitása. Ez az eset azoknál a sejteknél is, amikben az FVIIa kötődik a szöveti faktorhoz. Ez azt jelzi, hogy a PI3'-kináz és a a PLC izozimek aktiválásának nagyságrendje határozza meg, hogy ezek közül a bioszintézis utak közül melyik dominál. A fentieket összegezve adataink azt mutatják, hogy a sejtvándorlás egy fontos morfogenikus funkció, amit az FVIIa/szöveti faktor jelátvitel indukál.

A kemotaxis döntő szerepet játszik a sebgyógyulásban, az angiogenezisben és az áttétekben. Ezekben a folyamatokban számos különböző sejt expresszál szöveti faktort, valamint PDGF-et és PDGF receptorokat. A resztenózis az egyik legfontosabb komplikáció, ami az elzáródott artériák esetében végzett beavatkozást követi. A PDGF szerepet játszik az érfalaknak a mechanikai sérülésekre adott válaszában (neointima képződés), befolyásolva a simaizomsejtek és a fibroblasztok vándorlását és szaporodását. Első ízben mi mutattuk ki, hogy az FVIIa kötődése a szöveti faktort expresszáló sejtekhez megnövekedett kemotaktikus választ eredményez PDGF-re, ami független a koagulációtól.

Jelenleg nem sokat tudunk azokról a jelátviteli bioszintézis utakról, amiket a proteolítikusan aktív Vila indukál, és arról, hogy ezek a Vila által generált jelek miképpen járulnak hozzá a celluláris folyamatokhoz. Az egyik lehetőség, hogy az FVIIa képes indukálni a növekedés-szabályozók expresszióját, amik a celluláris folyamatok indukálásában downstream hatnak. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára ebben a tanulmányban vizsgáljuk a Vlla-val való érintkezés hatására a humán fibroblasztok transzkripciós programjában keletkező változásokat, egy cDNS mikrotömb használatával, ami több mint 8000 egyedi humán gént tartalmaz. Fibroblasztokat választottunk, mivel ezek a sejtek normális körülmények között találkoznak szérummal, ami növekedési faktorokat és aktivált véralvadási faktorokat tartalma^ fizikai sérülés (azaz például műtét) és patofiziológiás körülmények között. A génexpresszió szérumra adott időbeli programja azt sugallja, hogy a fibroblasztok úgy vannak programozva, hogy a szérummal való hirtelen érintkezést ne mitogén stimulációként interpretálják, hanem specifikus fiziológiás jelként. A szérumra és növekedési faktorokra adott transzkripciós aktiválás jellemzése azt is sugallja, hogy a fibroblasztok aktív résztvevői a különböző sejtek közötti információcserének, amik együttesen szabályozzák a gyulladást, angiogenezist és sebgyógyulást.

A Vlla-val 90 percig érintkezésbe hozott fibroblasztokból izolált mRNS cDNS mikrotömb elemzése a Cyról erősödését mutatja. A Northern biot elemzés igazolja a Cyról Vlla-val indukált expresszióját fibroblasztokban. Bár nem olyan erőteljesen, mint a fibroblasztokban, a Vila fokozza a Cyról expresszióját ér simaizomsejtekben is. A Cyról expresszió indukciója függ az FVIIa katalitikus aktivitásától, mivel az FVIIai nem képes a Cyról expresszióját indukálni. Bár a Xa faktor és a trombin is képes a Cyról expresszióját indukálni (nem közölt adatok), ezek a vegyületek nem játszanak szerepet a Cyról FVIIa által indukál expresszióban. Nem találtunk bizonyítékot arra, hogy kísérleti rendszerünkben a Xa és a trombin nyomai generálódtak. Emellett a Xa faktornak és a trombin specifikus inhibitorának nincs szignifikáns hatása a Cyról FVIIa-val indukált expressziójára.

A Cyról egy közvetlen-korai gén, ami fibroblasztokban transzkripciósán aktiválódik a szérum növekedési faktorok hatására. Szekretálódó, 40 kDa-os, ciszteinben gazdag és heparinkötő fehérjét kódol, ami az extracelluláris mátrixszal és a sejtfelszínnel asszociálódik. A Cyról a konzerválódott és moduláris fehérjék előbukkanó géncsaládjának egyik tagja, amiket egy N-terminális szekréciós szignál jelenléte jellemez, amit négy moduláris strukturális dómén és 38 ciszteincsoport követ, amik nagymértékben konzerválódtak a család tagjai között. A fehérjecsalád most 6 külön tagból áll, beleértve a Cyr61-et, a kötőszöveti növekedési faktort (CFGF), és egy madár protoonkofehérjét, a Nov (ezért CCN családnak nevezzük) [a CCN család további leírása megtalálható a szakirodalomban; Lau és mtsai: Exp. Cell Res. 248, 44-57 (1999)]. A Cyr61 fehérjéről kimutattuk, hogy (i) elősegíti az endoteliális sejteknek a fibronektinhez hasonló módon történő megtapadását és elterjedését, (ii) fokozza a bFGF és a PDGF hatását a DNS fibroblasztokban és endoteliális sejtekben való szintézisére, (iii) elősegíti a sejtvándorlást mind a fibroblasztokban, mind az endoteliális sejtekben. A legfrissebb vizsgálatok azt mutatják, hogy a Cyról az integrin α_γβ3 ligandumaként hat, ami egy olyan tapadási receptor, amiről ismert, hogy szerepet játszik abban a jeladásban, ami számos celluláris folyamatot szabályoz, beleértve az angiogenezist és a tumor áttéteket. A tisztított Cyről fehérjéről kimutattuk, hogy tenyészetben egy a_Yp3-dependens bioszintézis úton keresztül stimulálja a hűméin mikrovaszkuláris endoteliális sejtek irányított vándorlását, és patkány szaruhártyában neovaszkularizációt indukál. Emellett a Cyről tumorsejtekben való expressziója elősegíti a tumornövekedést és a vaszkularizációt.

Ezeknek az adatoknak az alapján, amik azt mutatják, hogy az FVIIa fibroblasztokban indukálja a Cyr61 expresszióját, az a véleményünk, hogy az FVIIa által indukált Cyről felelős, az integrin α_γβ3-οη keresztül, az FVIIa által befolyásolt sejtvándorlásért és tumor áttétért. Tehát a Cyr61 köti az FVIIa-szöveti faktor proteolítikus szignált az integrin-heladó bioszintézis úthoz. A megfigyelések, hogy a Vila katalitikus aktivitására van szükség a simaizomsejtek és a tumorsejtek vándorlásához, és a tumor áttéthez, összhangban vannak más megfigyeléssel, hogy az FVIIa katalitikus aktivitására van szükség a Cyr61 indukciójához.

A Cyr61 mellett a Vila más szabályozó anyagokat is indukálhat, amik képesek befolyásolni az FVIIa által indukált biológiai válaszokat. Hasnyálmirigyrák sejtekben az FVIIa-nak a sejtfelszíni szöveti faktorhoz való kötődéséről kimutattuk, hogy szelektíve túlexpresszálja az uPAR gént. Korábban differenciáldisplay technikával kimutattuk, hogy az FVIIa-val érintkező fibroblasztokban a poli(A) polimeráz gén transzkripciója felerősödik. Bár érdekes lenne megtudni, hogy vajon a cDNS mikrotömb szintén mutatja-e a PAP differenciál-expresszióját, a szúrő nem tartalmazta a PAP cDNS-t. A Cyról mellett a mi cDNS mikrotömbünk négy más gén differenciál-expresszióját is mutatja (lásd az eredményeket), de a differenciál-expressziós arány nagyon közel volt az átmenet szignifikanciájához. Mivel a korábbi kísérletekben Northern biot elemzéssel nem tudtuk igazolni diffe renciál-expressziójukat, valamint azért, mert nincsenek releváns szuggesztív adatok ezeknek a géntermékeknek arra a képességére, hogy befolyásolják az FVIIa által indukált biológiai válaszokat, nem elemeztük tovább az expressziójukat. Azonban, mivel a CTGF struktúrális rokonságban van a Cyr61 molekulával, és ugyanolyan biológiai válaszokat vált ki, mint a Cyr61, vizsgáltuk a CTGF expresszióját, bár a cDNS mikrotömbben a CTGF expressziója az FVIIa-val kezelt mintában, a kontroll mintában mérthez viszonyítva 1,8-szoros (a 2 egy konzervatív becslés szerint a reális nagyságrend ebben a vizsgálatban). Az adatokból kiderült, hogy az FVIIa is indukálja a CTGF expresszióját, és a CTGF Vlla-val történő expressziójának kinetikája hasonló a Cyr61-éhez.

Bár a CTGF a Cyr67-hez nagyon hasonlóan viselkedik, halvány különbségek vannak köztük. Például (a) a CTGF-ről kimutatták, hogy önmagában mitogén, míg a Cz/r6J-nek nincs saját mitogén aktivitása, viszont erősíti a növekedési faktor által indukált DNS szintézist, (b) A Cyr61 stimulálja a kemotaxist, míg a a CTGF mind a kemotaxist, mind a kemokinézist indukálja, (c) bár mind a Cyről, mind a CTGF ECM-hez kapcsolódó jeladó molekula, a CTGF-ről kimutatták, hogy a tenyésztő közegbe szekretálódik. Tehát lehetséges, hogy az FVIIa a celluláris funkciókat lokálisan szabályozza a Cyr61-en keresztül, míg helyétől távol hat a CTGF szekrécióján keresztül.

Azt a kezelési tartományt, amivel bármilyen beteget FVIIaval vagy bármilyen szöveti faktor agonistával, vagy FVIIai-val vagy bármilyen szöveti faktor antagonistával kezelünk, az előzőkben ismertetett módon, a szakterületen jártas szakembernek kell meghatároznia. A terápia során beadandó napi dózist a kezelőorvos határozhatja meg, és ez függ az éppen használt vegyülettöl, a beadás módjától, valamint a beteg testsúlyától és állapotától. A napi dózisnak megfelelő hatékony mennyiség körülbelül 5 μ g/kg/nap-tól körülbelül 500 pg/kg/nap-ig terjed, előnyösen körülbelül 10 pg/kg/nap-tól 300 pg/kg/nap-ig, még előnyösebben körülbelül 15 pg/kg/nap-tól 200 pg/kg/nap-ig, legelőnyösebben körülbelül 20 pg/kg/nap-tól 100 pg/kg/nap-ig terjed.

Az FVIIa-t vagy más szöveti faktor agonistát, vagy az FVIIait, vagy más szöveti faktor antagonistát egyetlen dózisban lehet beadni, de beadható több dózisban is, előnyösen 4-6-12 órás intervallumokban, a beadott dózistól és a beteg állapotától függően.

Az FVIIa-t vagy más szöveti faktor agonistát, vagy az FVIIait, vagy más szöveti faktor antagonistát beadhatjuk intravénásán, vagy beadhatjuk folyamatos vagy lüktető infúzióval, vagy beadhatjuk közvetlenül a megfelelő pontba, azaz például közvetlenül egy tumorba injekciózhatjuk. A FVIIa-t vagy más szöveti faktor agonistát, vagy az FVIIai-t, vagy más szöveti faktor antagonistát előnyösen intravénás injekciókkal adjuk be, körülbelül 100100,000 egység per testsúly mennyiségben, előnyösen körülbelül 250-25,000 egység per testsúly mennyiségben, ami körülbelül 5500 pg/kg-nak felel meg, ami egy olyan dózis, amit 24 óránként 2-4-szer lehet megismételni.

A gyógyászati készítmények készítésének hagyományos technikáit, amiket a jelen találmány szerint használhatunk a szakirodalomban ismertetik [Remington’s Pharmaceutical Sciences (1985)].

A jelen találmány szerint használt készítményeket a szakterületen jártas szakember számára per se ismert módszerekkel állítjuk elő.

Röviden, a jelen találmány szerint használható gyógyászati készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az FVII-et, az FVIIa-t vagy más szöveti faktor agonistát vagy az FVIIai-t vagy más szöveti faktor antagonistát, előnyösen tisztított formában összekeverjük megfelelő adjuvánsokkal, valamint egy megfelelő hordozóval vagy hígító szerrel. A megfelelő, fiziológiásán elfogadható hordozók vagy higítószerek közé tartozik a steril víz és a sóoldat. A megfelelő adjuvánsok közé tartozik ebből a szempontból a kalcium, a fehérjék (azaz például az albuminok), vagy más inert peptidek (azaz például a glicilglicin), vagy az aminosavak (azaz például a glicin vagy a hisztidin), hogy stabilizáljuk a tisztított Vila faktort. Fiziológiásán elfogadható adjuvánsok lehetnek a nem-redukáló cukrok, a polialkoholok (azaz például a szorbit, mannit vagy glicerin), a poliszacharidok, azaz például az alacsony molekulasúlyú dextrinek, detergensek (azaz például a poliszorbát) és az antioxidánsok (azaz például a biszulfit és az aszkorbát). Az adjuvánsok általában körülbelül 0,001-4 tömeg/térfogat %-ban vannak jelen. A gyógyászati készítmények tartalmazhatnak proteáz inhibitorokat, azaz például aprotinint, és konzerváló ágenseket.

A készítményeket sterilezhetjük, például egy baktériumokat visszatartó szűrőn keresztül, vagy sterilező ágenseket téve a készítménybe, a készítményeket besugározva, vagy melegítve a készítményeket. Előállíthatjuk steril szilárd készítmények formájában, amiket előzőleg, vagy közvetlenül a felhasználás előtt steril vízben lehet feloldani, vagy valamilyen más steril közegben, ami injekciózásra alkalmas.

A jelen találmány tárgyát különböző dolgok képezik:

Eljárás legalább egy gén expressziójának szabályozására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

a) az említett sejtet Vila faktorral, vagy egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe,

b) meghatározzuk az említett gén expresszióját az említett sejtben.

Az előző eljárásban az említett sejt szöveti faktort expresszáló humán vaszkuláris sejt, beleértve a fibroblasztokat és a simaizomsejteket.

Eljárás, aminek során az említett gént az alábbi csoportból választjuk ki: Cyr61, CTFG, dopamin D2 receptor, EST Incyte PD 395116 vagy P2U nukleotid receptor.

Eljárás, amiben az említett szöveti faktor antagonista módosított Vila faktor, ami Vllai faktor néven is ismert.

Eljárás, amiben az említett gén expresszióját fokozzuk.

Eljárás, amiben az említett gén expresszióját gátoljuk vagy minimalizáljuk.

Eljárás az említett gén expressziójának fokozására, azzal jellemezve, hogy az említett sejtet a Vila faktorral hozzuk érintkezésbe.

Eljárás, amiben az említett gén az EST PD674714.

Eljárás a sejtvándorlás szabályozására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

a) az említett sejtet Vila faktorral, vagy egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe,

b) meghatározzuk az említett sejt vándorlását.

Eljárás, amiben az említett sejt egy szöveti faktort expresszáló humán sejt, beleértve a fibroblasztokat, simaizomsejteket, tumorsejteket, hematopoietikus sejteket és epiteliális sejteket.

Eljárás, amiben a szöveti faktor antagonista a Vllai néven ismert módosított Vila faktor.

Eljárás, amiben a módosított VII faktort az alábbiak közül választjuk ki: Danzil-Phe-Pro-Arg klórmetil keton, Danzil-GluGlu-Arg klórmetil keton, Danzil-Phe-Phe-Arg klórmetil keton, és Phe-Phe-Arg klórmetil keton.

Eljárás a sejtvándorlás fokozására, azzal jellemezve, hogy a sejtet FVIIa-val vagy egy szöveti faktor agonistával hozzuk érintkezésbe.

Eljárás a sejtvándorlás csökkentésére vagy gátlására, azzal jellemezve, hogy a sejtet egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.

Eljárás sebgyógyulás indukálására vagy erősítésére betegben, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy VIIa-t vagy szöveti faktor agonistát tartalmazó gyógyászati készítményből.

Eljárás tumorsejtek invázióképességének gátlására, azzal jellemezve, hogy az említett sejteket egy szöveti faktor antagonista hatékony mennyiségével hozzuk érintkezésbe.

Eljárás a sejtvándorlás, invázió, vándorlással indukált sejtszaporodás vagy angiogenezis gátlására egy olyan betegben, aki olyan betegségben vagy állapotban szenved, ami kapcsolatban van nemkívánt sejtvándorlással, invázióval, vándorlással indukált sejtszaporodással vagy angiogenezissel, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy gyógyászati készítményből, ami szöveti faktor antagonistát tartalmaz.

Eljárás, amiben a betegség vagy állapot primer tumornövekedés, tumor invázió vagy áttét.

Eljárás, amiben a szöveti faktor antagonista FVIIai néven ismert módosított VII faktor.

Vila faktor vagy egy szöveti faktor antagonista használata sejtvándorlást szabályozó gyógyszer gyártására.

Felhasználás, amiben a Vila faktort a sejtvándorlást erősítő gyógyszer gyártására használunk.

Felhasználás, amiben egy szöveti faktor antagonistát olyan gyógyszer előállítására használunk, amivel a sejtvándorlást lehet csökkenteni vagy gátolni.

Eljárás, amiben a szöveti faktor antagonista a Vllai néven ismert módosított Vila faktor.

Felhasználás, amiben a módosított VII faktort az alábbi csoportból választjuk ki: Danzil-Phe-Pro-Arg klórmetil keton, DanzilGlu-Gly-Arg klórmetil keton, Danzil-Phe-Phe-Arg klórmetil keton, és Phe-Phe-Arg klórmetil keton.

A jelen találmányt az alábbi példákkal tovább illusztráljuk, amik szándékaink szerint nem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét. Az előző leírásban és az alábbi példákban ismertetett tulajdonságok, külön-külön, vagy bármilyen kombinációjukban alapanyagai lehetnek a jelen találmány külön formában való realizáláséinak.

Példák

1. Példa

Az FVII előállítása

A jelen találmányban jól használható tisztított humán Vila faktort előnyösen rekombináns DNS technikával állítjuk elő [Hagen és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 2412-2416 (1986); 200.421 számú európai szabadalmi bejelentés (ZymoGenetics). A rekombináns technikával előállított Vila faktor lehet autentikus Vila faktor, vagy egy többé-kevésbé módosított Vila faktor, azzal a feltétellel, hogy az ilyen Vila faktornak lényegében ugyanaz a biológiai aktivitása a véralvadásra, mint az autentikus Vila faktornak. Az ilyen módosított Vila faktor úgy állítható elő, hogy módosítjuk a VII fák tort kódoló nukleotid szekvenciát, vagy úgy, hogy módosítjuk az aminosav kodonokat, vagy úgy, hogy ismert módszerekkel, azaz például helyspecifikus mutagenezissel néhány aminosav kodont eltávolítunk a természetes FVII-et kódoló nukleinsavból.

A Vila faktort a szakirodalomban ismertetett módszerekkel állíthatjuk elő [Broze és Majerus: Journal of Biological Chemistry 255(4), 1242-1247 (1980); Hedner és Kisiel: J. Clinic. Invest. 71, 1836-1841 (1983)]. Ezekkel a módszerekkel a tisztított VII-es faktort más koagulációs faktorok kimutatható nyoma nélkül lehet előállítani. Még ennél is tisztább VII-es faktort ügy kaphatunk, ha egy további gélszúrési lépést iktatunk be végső tisztítási lépésként. A VII-es faktort azután ismert módszerekkel, azaz például számos különböző plazmafehérjével, azaz például a Xlla, IXa vagy Xa faktorral aktivált FVIIa-vá alakítjuk. Egy másik változat szerint, amint azt Bjoern és munkatársai leírták [Bjoern és mtsai: Research Disclosure, 269, 564-565 (1986. szeptember)], a VII-es faktor úgy aktiválható, hogy egy ioncserélő kromatográfiás oszlopon, azaz például MonoQ® oszlopon vagy hasonlón (Pharmacia Fine Chemicals) bocsátjuk át.

2. Példa

Az FVIIai készítése

A jelen találmányban használható módosított VII-es faktort a szabadalmi irodalmi hivatkozásokban ismertetett módon lehet előállítani (92/15686, 9627631, 96/12800 és 97/47651 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés, ZymoGenetics/Novo Nordisk).

3. Példa

Az FVIIa és az FFR-VIIa hatásai a fibroblasztok PDGF-BB-re adott kemotaktikus válaszára

Az aktív szöveti faktort expresszáló fibroblasztokat (1A. és 1B. ábra) 100 nM FVIIa-val inkubáljuk, majd a módosított Boyden kamra felső részébe oltjuk be; míg a 10% FBS-t és különböző koncentrációjú PDGF-BB-t tartalmazó közeget a 150 pmes szúró alá adjuk. A sejtek vándorlását olyan körülmények között, amikor a szűrő alatti közeg 10% FBS-t tartalmaz PDGFBB nélkül, használjuk a random vándorlás mértékeként, és ezt számítjuk 100%-os vándorlásnak. Szignifikáns vándorlási választ jegyeztünk fel 0,01 ng/ml PDGF-BB koncentrációnál FVIIa-val stimulált sejteknél, szemben azzal, amit 1,0 ng/ml PDGF-BB-vel kaptunk FVIIa-val nem ligáit sejteknél, azaz százszoros koncentráció-különbségnél (2A. ábra). 0,01-0,1 ng/ml PDGF-BB koncentrációnál az FVIIa-ra adott vándorlási válasz dózisfüggően változik, 25 nM-nál kezdődően és a maximális hatást 50-100 nM FVIIa-nál érve el (3A-D. ábra). Az FVIIa-val való aktiválás után nem figyelhető meg a random vándorlás erősödése. Annak vizsgálatára, hogy a proteolítikusan aktív FVIIa feltétlenül szükségese a PDGF-BB-ra adott hiperkemotaktikus válaszhoz, a fibroblasztokat is 100 nM FFR-VIIa-val inkubáljuk, és az előzővel azonos módon vizsgáljuk Boyden kamrában (2A. ábra). Az FFRVlla-val nem volt megfigyelhető fokozott kemotaxis a PDGF-BB alacsony koncentrációinál. Ezzel szemben a 10-50 ng/ml PDGF41

BB-vel indukált kemotaxis kifejezett szuppressziója következett be 100 nM FFR-FVIIa-val (2A. és 3A-D. ábra). Ha a fibroblasztokat három különböző szöveti faktor ellenanyag keverékével, majd FVIIa-val vagy FFR-FVIIa-val előinkubáljuk, a PDGF-BB-re adott vándorlási válasz azonos volt a fibroblasztoknak azzal a válaszával, amit a szöveti faktorhoz kötött ligán dum nélkül adtak (4A. ábra). Egy irreleváns monoklonális IgG ellenanyag se az FVIIa által indukált hiperkemotaxist, se az FFRFVIIa-val indukált vándorlási választ nem gátolja meg (nem közölt adatok). Az IgG ellenanyagok vagy a CTLA-4 szöveti faktor ellenanyag jelenléte nem változtatta meg a fibroblasztok random vándorlását (nem közölt adatok).

4. Példa

A hiperkemotaktikus választ nem befolyásolja az FXa vagy a trombin

Mivel a PDGF-BB-ra adott hiperkemotaktikus válaszhoz vezető, FVIIa által indukált jelátvitel függ az FVIIa katalitikus aktivitásától, fontos volt annak meghatározása, hogy a jelátvitel közvetlenül történt-e, vagy az Fca-n vagy a trombinon keresztül, az FVIIa/szöveti faktor komplexszel generálva. Az FVIIa/szöveti faktor által transzdukált fokozott vándorlási választ nem blokkolja 0,2-10 μΜ kullancs antikoaguláns peptid (TAP), ami specifikusan blokkolja az FXa aktív pontját, és megakadályozza a trombin-képződéshez vezető koagulációs kaszkád további aktiválását (5A. és 5B. ábra). Sem 5 E/ml Hirudinnak sem a trombin egy specifikus inhibitorának a hozzáadása nincs semmilyen hatással az FVIIa/szöveti faktor által indukált hiperkemotaxisra (6A. ábra). A TAP és a hirudin nem befolyásolta a fibroblaszt PDGF-re adott válaszként való vándorlását, az FVIIa ligandum jelenléte nélkül (5A., 5B., 6B. ábra). Ezért tehát valószínűtlen, hogy az FVIIa-nak a kemotaxisra gyakorolt hatása az FX vagy a trombin aktiválásán keresztül befolyásolódik.

5. Példa

A PDGF-BB-re adott hinerkemotaktikus választ a PLC-dependens bioszintézis utak befolyásolják, de független a PI3' kináztól

A PI3' kináz aktiválásáról nemrég igazolták, hogy fontos a PDGF β-receptor által indukált kemotaxishoz. Ezért vizsgáltuk, hogy a LY294002, egy specifikus PI3' kináz inhibitor, képes-e blokkolni az FVIIa/szöveti faktor jelátvitel által indukált kemotaktikus választ. A fibroblasztokat a jelzett koncentrációkban 30 percig LY294002-vel előkezeljük, majd 100 nM FVIIa-t adunk hozzá, és az előzőkben ismertetett módon Boyden kamrában vizsgáljuk. A PDGF-BB koncentrációját a vizsgálat során állandó, 0,1 ng/ml szinten tartjuk, azaz egy nagyon alacsony koncentráció-szinten, aminél az FVIIa/ szöveti faktor szignifikáns kemotaktikus választ indukál. Az LY294002 a kísérlet teljes időtartama alatt jelen van. A 7A. ábrán láthatjuk, hogy a PDGF-BB-re adott, az FVIIa-szöveti faktor jelátvitel által befolyásolt vándorlási választ nem érinti a PI3' kináz gátlása.

Annak vizsgálatára, hogy az FVIIa/szöveti faktor által indukált kemotaktikus válasz magában foglalja-e a foszfatidil-inozit specifikus foszfolipáz C (PLC) aktiválását, a fibroblasztokat 30 percig 37 °C-on különböző koncentrációjú U73122-vel, egy specifikus PLC inhibitorral előinkubáljuk, majd 100 nM FVIIa-t adunk hozzá; a sejteket a kemotaxis esszéhez az inhibitor jelenlétében pihentetjük. Negatív kontrollként egy közeli analógot, az U73343at használjuk, aminek nincsen hatása a PLC-re. A PDGF-BB koncentrációját ebben a kísérletben is állandó 0,1 ng/ml-es szinten tartjuk. Ha a sejteket az aktív PLC-inhibítorral, az U73122-vel előkezeljük, akkor ez dózisfüggö módon gátolja a 0,1 ng/ml PDGF-BB-re adott hiperkemotaktikus választ, a teljes gátlás 1 μΜ-nál lép fel (8A. és 8B. ábra). A kemotaxisra semmilyen hatást nem figyelhettünk meg, amikor az inaktív U73343 analógot használtuk.

6. Példa

Az FVIIa indukálja a PLC aktiválását

Ahhoz, hogy tovább vizsgáljuk a PLC aktivitásának a hiperkemotaktikus válaszban való fontosságát, elemeztük az FVIIa/ szöveti faktor közvetlen hatásait is a fibroblasztokban levő PLC aktivitására. A PLC aktiválása két szekunder messenger, az inozit-l,4,5-triszfoszfát (IP3) és a diacilglicerin termelődését eredményezi. A fibroblasztokat éjszakán át mio [³H]inozittaI inkubáljuk, majd 60 percig 100 nM FVIIa-val vagy FFR-FVIIa-val, utána pedig a jelzett koncentrációjú PDGF-BB-vel, vagy anélkül inkubáljuk. Ha 60 percig csak 100 nM FVIIa-val inkubáljuk, akkor ez ugyanolyan szintű IP3 felszabadulást eredményez a fibroblasztokban, mint amit 10 ng/ml és 100 ng/ml PDGF-BB önmagában eredményez (9. ábra). Emellett 100 nM FVIIa és 10 ng/ml vagy 100 ng/ml PDGF-BB kombinációja megkettőzi az IP3 felszabadulást. Az aktív pontjában gátolt FVIIa nem indukálja az IP3 felszabadulását. Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy a PLC az FVIIa-nak a szöveti faktorhoz való kötődésével aktiválódik.

7. Példa

A PLC-γΙ foszforileződését nem fokozza a szöveti faktor/Vila jelátvitel a fibroblasztokban

Ahhoz, hogy meghatározzuk, hogy a PLC-γ 1 izoforma, amit néhány tirozin kináz receptor aktivál, felelős-e az FVIIa/szöveti faktor által indukált megnőtt PLC aktivitásért, vizsgáljuk a PLC-γ 1 tirozin-foszforileződését. A fibroblasztokat egy óra hosszat 100 nM FVIIa vagy FFR-FVIIa jelenlétében inkubáljuk, majd 0, 2, 10 vagy 100 ng/ml PDGF-BB-vel stimuláljuk. Ötperces inkubálás után a sejteket lizáltatjuk és a PLC-γ 1-et immunprecipitáljuk, SDS-PAGE-val elválasztjuk, majd anti-foszfotirozin ellenanyagokkal immunblottoljuk. Míg a PLC-γ 1 tirozin-foszforileződésében szignifikáns növekedést jegyezhettünk fel a PDGF-BB növekvő koncentrációjával, ha csak FVIIa-t adunk a fibroblasztokhoz, akkor az nem indukálja a PLC-γ 1 tirozin-foszforileződését (10. ábra). Emellett a különböző koncentrációjú FVIIa és PDGF45

BB kombinációja nem indukál semmilyen további foszforileződést, a csak a PDGF-BB-vel végzett stimulálással összehasonlítva (10. ábra). Az FFR-FVIIa-nak nincs hatása a PLC-yl foszforileződésére (10. ábra). Tehát a PLC-nek a PLC-γΙ-tói eltérő izoformái felelősek a megnőtt PLC aktivitásért az FVIIa stimulálás után.

8. Példa

Módszerek

Sejttenyészetek.

Humán fityma fibroblasztokat (AG1518 és AG1523) szaporítunk egybenövésig 10% borjúmagzat szérummal (FBS) kiegészített Eagle MM táptalajban. Felhasználás előtt a sejteket tripszinezéssel választjuk le (2,5 mg/ml, 10 perc, 37 °C), Hank féle kiegyensúlyozott sóoldatban mossuk, majd 10% borjúmagzat szérummal (FBS) kiegészített Eagle MM táptalajban vagy 0,1% borjúmagzat szérummal kiegészített Ham táptalajban reszuszpendáljuk.

Fehérjék.

A humán FVIIa-t (Novo Nordisk A/S, Gentofte, Dánia) az ismertetett módon²⁹ expresszáljuk és tisztítjuk. Az FFR-FVIIa-t (Novo Nordisk) úgy állítjuk elő, hogy az FVIIa-1 az aktív pontjában D-Phe-L-Phe-L-Arg klórmetil-ketonnal blokkoljuk. A rekombináns kullancs antikoaguláns peptidet Dr. P. Vlasuk-tól (Corvas, San Diego, CA) kaptuk. A hirudint a Sigma-tól vásároltuk. A

LY294002-t, az U73122-t és az U73343-at a Biomol-tól vásároltuk (Plymouth Meeting, PA). A TF8-5G9, TF9-5B7 és MTFH-1 anti-szöveti faktor ellenanyagokat [Morrissey, J.H., Fair, D.S., Edgington, T.S.: Monoclonal antibody analysis of purified and cell-associated tisszue factor, Tromb. Res. 52, 247-261 (1988)] Dr. James H. Morrissey-tői kaptuk (Oklahoma Medical Research Foundation). A PY99 foszfotirozin ellenanyag Santa Cruz-ból (Kalifornia) származik.

Áramlási citometria.

A szöveti faktor sejtfelszíni expresszióját immunfluoreszcenciával elemezzük, áramlási citométert használva (Coulter Epics XL-MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, Coulter Electronics, USA). A berendezést naponta kalibráljuk Immuno-Check™ vagy Flow Check™ kalibráló gyöngyökkel (Coulter). Az indirekt immunfluoreszcencia kísérletekhez AG 1518 vagy AG 1523 fibroblasztokat kétszer mossuk 0,1% szarvasmarha szérum-albumint tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal, majd 30 percig jégen inkubáljuk fluoreszcein-izotiocianáttal jelzett anti-humán szöveti faktor monoklonális ellenanyaggal (4508CJ, American Diagnostica, Greenwich, Ct. USA). Az anti-Aspergillus niger glükózoxidáz monoklonális IgG-t (Dakopatts) használjuk negatív kontrollként. Az átlagos csatorna fluoreszcencia intenzitást és a pozitív sejtek százalékát minden mintánál meghatározzuk.

A szöveti faktor aktivitásának meghatározása.

A szöveti faktor prokoaguláns aktivitását Lindmark és munkatársai leírása szerint határozzuk meg [Lindmark, E., Tenno, T., Chen, J., Siegbahn, A.: „IL-10 inhibits LPS-induced humán monocyte tissue factor expression in whole blood” Br. J. Haematol. 102, 597-604 (1998)]. Röviden, 0,2^10⁵ AG1518 vagy AG 1523 fibroblasztot tartalmazó alikvot részeket kétszer mosunk foszfáttal puffereit sóoldattal, majd 96-lukas mikrotiter lemez (Nunc, Roskilde, Dánia) lukaiba tesszük. A prokoaguláns aktivitást kétlépéses amidolitikus esszében mérjük, amiben egy kromogén szubsztrátot, az S-2222-t (Chromogenix, Mölndal, Svédország) hasítunk FXa-val, amit viszont FX-ból aktiválunk a szöveti faktor/FVIIa komplexszel. Egy reakcióelegyet adunk a lukakhoz, ami végkoncentrációban 0,6 mM S-2222-t, 2 mM CaCh-t és végkoncentrációban 1 E/ml FVII valamint 1,2 E/ml FX koagulációs faktorokat (a Prothromplex-T™ TIM-ből; Baxter, Bécs, Ausztria) tartalmaz, majd a 30 percig 37 °C-on végzett inkubálás után a 405 nm-en mérhető változásokat meghatározzuk. A méréseket három párhuzamosban végezzük.

Kemotaxis esszé.

A fibroblasztok vándorlási válaszát egy módosított Boyden kamrában a vezérfront technikával határozzuk meg, a korábban ismertetett módon [Siegbahn, A., Hanimacher, A., Westermark, B., Heldin, C-H.: „Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes” J. Clinic. Invest. 85, 916-920 (1990); Nistér, M., Hammacher, A., Mellström, K., Siegbahn, A., Rönnstradt, L., Westermark, B., Heldin, C-H.: „A glioma-derived PDGF A chain homodimer has different functional activities from a PDGF AB heterodimer purified from human platelets” Cell 52, 791-799 (1988)]. Mikropórusos szűröket (a pórusméret 8 pm) borítunk be szobahőmérsékleten éjszakán át 1-es típusú kollagén oldattal. A szűrőket közvetlenül a felhasználás előtt 30 percig levegőn légszárazra szárítjuk. AG1523 humán fityma fibroblasztokat egybenövésig szaporítunk 10% FBS-sel kiegészített Eagle féle MM táptalajban. A sejteket tripszinezéssel választjuk le (2,5 mg/ml, 10 perc, 37 °C-on), majd 10% FBS-sel kiegészített Eagle féle MM táptalajban szuszpendáljuk. A fibroblasztokat 10 percig FVIIa-val vagy FFR-FVIIa-val, vagy ezek nélkül inkubáljuk. A Boyden kamrában a sejtszuszpenzióból 100 mikrolitert (2*10⁵ sejt/ml) adunk a szűrő fölé. A PDGF-BB-t az esszé-közegében (10% FBS-sel kiegészített Eagle féle MM táptalaj) hígítjuk, majd a kamrában a szűrő alatti részbe adjuk be. A sejteket 6 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk nedvesített atmoszférájú kamrában, ami 95% levegő/5% CO2 összetételű atmoszférát tartalmaz. A kísérlet teljes időtartama alatt jelen van az FVIIa vagy az FFRFVIIa. A szűrőket eltávolítjuk, etanolban fixáljuk, Mayer's Hemalun-ban festjük, majd tárgylemezre tesszük. A vándorlást azzal a távolsággal mérjük, amit a két legtovább vándorló fibroblaszt sejtmagja tett meg 12,4*24-szeres nagyítás mellett egy fókuszban levő látómezőben. Az egyes szűrők esetében a vándorlási távolságot úgy számítjuk ki, hogy a szűrő három legkevésbé eltérő részében tett leolvasások átlagát vesszük. A kísérleteket 24 külön szűrővel hajtjuk végre a kemoattraktáns minden koncentrációjában. Mindegyik kísérleti felállításban a fibroblasztoknak a vizsgáló közeg felé tett vándorlása szolgál kontrollként.

Azokban az esetekben, amelyekben anti-szöveti faktor ellenanyagokat, vagy a TAP és a Hirudin koagulációs faktorok inhibitorait használjuk, a sejteket ezekkel az ágensekkel 10 percig előinkubáljuk, majd FVIIa-vagy FFFR-FVIIa-val, vagy ezek nélkül inkubáljuk, mielőtt elvégezzük a kemotaxis esszét. Az ellenanyagok, a TAP vagy a Hirudin is a kísérlet teljes időtartama alatt jelen van. Azokban a kísérletekben, amelyekben a különböző inhibitorok, az LY294002, U73122 vagy U73343 vándorlási válaszaira gyakorolt hatást vizsgáljuk, a sejteket 30 percig előinkubáljuk az inhibitorokkal a jelzett koncentrációkban, és az inhibitorok is a kísérlet teljes időtartama alatt jelen vannak.

Az inozit triszfoszfát (IP3) felszabadulási esszé.

AG1518 humán fibroblasztok félig összenőtt tenyészeteit tartalmazó hatlukas lemezeket inkubálunk éjszakán át (körülbelül 20 óra hosszat) 2 pCi mio[³H]inozittal (Amersham), 2 ml Ham féle F12-ben, ami 0,1% FBS-t tartalmaz. A közeget 0,1% FBS-t (2 mM CaCh-t tartalmaz) és 20 mM LiCl-t tartalmazó Ham féle FI 2re változtattuk, majd a sejteket 15 percig 37 °C-on szaporítjuk. A sejteket azután 100 nM FVIIa vagy 100 nM FFR-FVIIa jelenlétében vagy távollétében inkubáljuk egy óra hosszat. PDGF-BB-t (Ο, 10 vagy 100 ng/ml) adunk hozzá, majd 10 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az IP3 esszét a korábban Eriksson és munkatársai által ismertetett módon hajtjuk végre [Eriksson, A., Nanberg, E., Rönnstrand, L., Engström, U., Hellman, U., Rupp, E., Carpenter, G., Heldin, C_H., Claesson-Welsh, L.: Demonstration of functionally different interactions betweenn phospholipase C-y and the two types of platelet-derived growth factor receptors”, Journal of Biological Chemistry 270, 7773-7781 (1995)].

Esszé agonista-indukált PLC-γΙ foszforilezésre.

AG1518 közel összenőtt tenyészetét éjszakán át (körülbelül 20 óra hosszat), 0,1% FBS-t tartalmazó közegben széruméheztetésnek vetjük alá, majd egy óra hosszat 100 nM FVIIa vagy FFR-FVIIa jelenlétében vagy távollétében inkubáljuk, majd 5 percig 37 °C-on inkubáljuk 0, 2, 100 vagy 100 ng/ml PDGF-BBvel. A sejteket lizáltatjuk, majd a PLC-yl-et kicsapjuk, lényegében a korábban ismertetett módon [Hansen, K., Johnell, M., Siegbahn, A., Rorsman, C., Engström, U., Wernstedt, C.m Heldin, C-H., Rönnstradt, L.: „Mutation of a Src phosphorylations site in the PDGF β-receptor leads to increased PDGF-stimulated chemotaxis but decreased mitogenesis”, EMBO Journal 15, 5299-5313 (1996)], anti-PLC-yl antiszérummal, amit úgy állítunk elő, hogy nyulakat a szarvasmarha PLC-yl Cterminálisának megfelelő peptiddel immunizálunk [Artega, C., Johnson, M.D., Todderud, G., Coffey, R.J., Carpenter, G., Page, D.L.: „Elevated content of the tyrosine kinase substrate phospholipase C-γΙ in primary human breast carcinomas”, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 10435-10439 (1991)]. A mintákat SDS-PAGE-val választjuk el, majd a PY99 foszfotirozin ellenanyaggal immunblottoljuk.

Statisztikai elemzés.

Az adatokat a Statistica TM for Windows csomaggal elemezzük (StatSoft, Tulsa, Okla. USA). A független mintákra Student féle t-tesztet használunk, hogy meghatározzuk a különböző adatcsoportok közötti statisztikai szignifikanciát. A <0,05 P értékeket tekintjük statisztikailag szignifikánsnak.

Fehérjék.

Rekombináns humán VIIa-t [a Novo Nordisk (Gentofte, Dánia) ajándéka steril vízben oldjuk 1-1,3 mg/ml koncentrációban. A Vila törzsoldatokat limulus amebocyte lizátummal (Bio Whittaker) megvizsgáltuk, hogy tartalmaznak-e endotoxin nyomokat, de semmit nem tudtunk kimutatni (kimutatási határ 30 pg). A rekombináns kullancs antikoaguláns fehérjét Dr. P. Vlasuk-tól (Corvas, San Diego, CA) kaptuk. A hirudint a Sigmatól (St. Louis, MO), vagy a Calbiochem-től vásároltuk (San Diego, CA). A tisztított humán Xa faktort és a trombint az Enzyme Research Laboratories-tól (Southbend, IN) kaptuk.

cDNS mikrotömb.

WI-38 sejteket 80%-os összenövésig tenyésztjük, majd 24 órára megfosztjuk a szérumtól, hogy az előzőkben ismertetett módon nyugvó állapotba kerüljenek. A tenyésztő közeget friss szérummentes DMEM-mel helyettesítjük (5 mM CaCl₂-vel kiegészítve), majd 2 óra hosszat tenyésztő inkubátorban hagyjuk stabilizálódni. Ezután a sejteket 90 percig 5 pg/ml tisztított rekombináns Vlla-val kezeljük. A 90 perces kezelés végén össz-RNS-t izolálunk a kezeletlen (kontroll) és Vlla-val kezelt sejtekből, TRIZOL (Gibco BRL) használatával. Poli(A) RNS-t Oligo Tex mRNS izoláló oszlopon való kétszeri átbocsátással tisztítjuk, a gyártó (QIAGEN) technikai bulletinjében ismertetett módon. A kontroll és a Vlla-val kezelt sejtekből 800 ng erősen tisztított poli(A) RNS-t viszünk cDNS mikrotömb elemzésre (Human UniGEM V microarray, Genome Systems Inc., St. Louis, MO).

Northern blot elemzés.

TRIZOL reagenssel össz-RNS-t izolálunk nyugvó egysejtréteges WI-38 sejtekből, amiket Vlla-val és más, az eredményeknél közölt anyagokkal hoztunk érintkezésbe. A Northern biot elemzést standard eljárással hajtottuk végre. Röviden, 10 pg össz-RNS-t gélelektroforézissel méret szerint frakcionálunk, 1% agaróz/6% formaldehid géleken, majd nitrocellulóz membránra visszük kapilláris blott módszerrel. A Northern biottokat 42 °C-on előhibridizáljuk egy 50% formamid, 5*SSC, 50 mM TRIS-HC1 pH=7,5, 0,1% nátrium-pirofoszfát, 1% SDS, 1% polivinil-pirrolidon, 1% Ficoll, 25 mM EDTA, 100 pg/ml denaturált lazacsperma DNS és 1% BSA összetételű oldattal, majd ³²P-vel jelzett Cyről cDNS próbával (106 cpm/ml) hibridizáltatjuk. A hibridizált membránokat vagy Dupont NEF vagy Fuji RX röntgenfilmre exponáljuk. Mennyiségi kiértékelés céljából a membránokat foszfor ernyőre exponáljuk 1-4 óra hosszat, majd az exponált szűrőket egy Phosphorimager-ben (Molecular Dynamics) elemezzük, „Image-quant” szoftver használatával. Az átlagértékek megkapásához a különböző kísérletekből kapott egységeket (beütésszámok) egy belső kontrollra (a kontrollal kezelt mintában levő beütésszám) normalizáljuk.

Kromogén esszé.

A WI-38 sejteket 96-lukas tenyésztő lemezen tenyésztjük, majd az előzőkben ismertetett módon pihentetjük. A sejtek mosása után 5 gg/ml FVIIa-t 1,00 pg kalciumot tartalmazó pufferben adjuk a sejteket tartalmazó tenyésztő lukakhoz, vagy a pufferrel borított lukakhoz (nincsenek sejtek). 30 perces inkubálás után trombint, és a Xa faktor kromogén szubsztrátjából 25 pg-ot, azaz Chromozym X-et és Chromozym TH-t adunk a lukakhoz. Háromórás szín-előhívás után a lemezt mikrotiter lemezolvasóval leolvassuk. Kontrollként a sejteket a Xa faktor nyomnyi koncentrációjával (50-0,1 ng/ml) vagy trombinnal (0, ΙΟ,002 E/ml) inkubáljuk. Nincs különbség a 450 nm-es elnyelésben, ha a VIIa-t a sejtekhez adjuk, vagy ha a VIIa-t sejteket nem tartalmazó lukakhoz adjuk. A leolvasott érték kisebb, mint az az érték, amit akkor kapunk, ha a Xa faktor vagy trombin legalacsonyabb koncentrációját használjuk, és ez reprezentálja a Vila kromogén aktivitását.

9. Példa cDNS mikrotömb.

A nyugvó fibroblasztokat 90 percig kontroll szérummentes közeggel hoztuk érintkezésbe, vagy 5 gg/ml Vlla-val kiegészített szérummentes közeggel (három T-75 palack minden egyes kezeléshez). A kezelés után össz-RNS-t nyerünk ki, és poli(A) RNS-t izolálunk. Hatszáz ng mRNS-t jelzünk vagy Cyr vagy Cy5 fluoreszcenciával, majd UniGem Human V chiphez hibridizáljuk, ami 8000 igazolt szekvenciájú EST-t tartalmaz, amik 5000 ismert humán gént reprezentálnak (a szolgáltatást a Genom System Inc.től pénzért vettük igénybe). A kontroll lemezt, amiben a referencia cDNS-t beletesszük a próbát generáló reakcióelegybe, hogy mérjük az érzékenységet, és monitorozzuk a reverz transzkripciós reakciót, tisztítást, meghatározzuk a hibridizáció hatékonyságát, és az esszé minősége és teljesítőképessége átfogó képe a hibridizációs eljárás sikerességének. A kísérleti adatok globális elemzése minimális különbségeket mutat a kontroll és a VII-tel kezelt minta hibridizációs szignáljaiban. Csak kisszámú gén mutatott közepes differenciál expressziót. 5 gén működésének erősödését figyeltük meg (3,5-2-szer nagyobb a Vila kezelésben), míg egy génnek a működése csökkent a Vila kezelés hatására (2,4-szer alacsonyabb) ( ± 2 egy konzervatív becslés a valós arányok minimális nagyságrendjének meghatározásához). A 3,5-ször erősebben működő gén azonosságát nem adhatjuk meg a tulajdonjogok miatt. Más, a Vila-által erősített működésű gén a Cyról (2,5-szeres), a dopamin D2 receptor (2,2-szeres), az EST

Incyte PD 395116 (kétszeres), és a P2U nukleotid receptor (kétszeres). Érdekes megjegyezni, hogy a CTGF működése, ami a Cyról családba tartozó gén, 1,8-szor magasabb a Vlla-val kezelt sejtekben mint a kontroll sejtekben. A csökkentett működésű transzkriptum a Vlla-val kezelt sejtben az EST PD674714. A további elemzéshez a Cyr61-et választottuk ki.

10. Példa

A Cyról differenciál-expressziójának igazolása.

Ahhoz, hogy a mikrotömbbel kapott adatokat validáljuk, a kontroll és Vlla-val kezelt sejtekből kinyertük az RNS mintákat (ugyanazok az RNS minták, amiket a poli(A) RNS előállításához használtunk, a mikrotömbhöz használt próba generálásához) a Northern biot elemzéshez, és radioaktív izotóppal jelzett Cyr61 cDNS-sel mint próbával vizsgáltuk át. Az adatok azt mutatják, hogy a Cyr61 próba egyetlen, körülbelül 2,0 kilobázis méretű RNS transzkriptumhoz hibridizálódik, amit a kontroll, és a Vllaval kezelt sejtekből izoláltunk. Azonban a hibridizációs szignál intenzitása sokkal magasabb a Vlla-val kezelt sejtekből izolált RNS-ben (1. ábra). A hibridizációs szignál mennyiségi kiértékeléséből kiderült, hogy a Cyr61 expressziója 2,8-szor magasabb a Vlla-val érintkező sejtekben mint a kontroll kezelt sejtekben.

11. Példa

A Cyról Vlla-val indukált expressziójának kinetikája.

Ahhoz, hogy meghatározzuk a Cyről expresszió kinetikáját, nyugvó fibroblasztokat kezelünk különböző ideig 5 pg/ml Vllaval. Össz-RNS-t extrahálunk, majd Northern biot elemzéshez készítjük el. Amint az a 2. ábrán látható, a Cyről expressziója időfüggő módon nőtt meg Vlla-val kezelt sejtekben. Az expresszió a csúcsértékét körülbelül 45 percnél érte el, majd 2-3 óra alatt az alapszintre csökkent vissza. Mivel leírták, hogy egér fibroblasztokban a Cyről expressziója szérummal és növekedési faktorral való stimulálás után több óra hosszat (egész 8-10 óra hosszat) fennmarad, mielőtt a csökkenés fellép, vizsgáltuk a szérum és a PDGF hatását a Cyről expresszió kinetikájára pihenő humán WI-38 fibroblasztokban. Amint az a 2B. ábrán látható, a Cyről csak ideiglenesen expresszálódik PDGF-fel való stimulálás hatására, és a stimulálás alkalmazása után 2 órával teljesen represszálódik. Hasonló adatokat kaptunk a Cyről szérummal indukált expressziójára (nem közölt adatok).

12. Példa

A Cyről Vila-faktor dózisától függő expressziója.

Ahhoz, hogy meghatározzuk a Vila dózisfüggését, pihenő fibroblasztokat 45 percig kezelünk különböző dózisú FVIIa-val (0,1-5 mg/ml), majd a sejtekből izolált össz-RNS mintát Northern biot elemzésnek vetjük alá. Amint az a 3. ábrán látható, a fibroblasztoknak már 0,1 μg/ml FVIIa-val való kezelése elég ahhoz, hogy indukálja a Cyről expresszióját, és az FVIIa 0,5 pg/ml (10 nM) plazma-koncentrációja a maximálishoz közeli, feltűnő választ eredményez.

13. Példa

Az FVIIa faktor katalitikus aktivitására van szükség a Cyr61 indukciójához.

Annak vizsgálatára, hogy a Vila katalitikus aktivitására szükség van-e a Cyröl indukálásához, a WI-38 sejteket 45 percig Vlla-val és aktív pontjában gátolt FVIIa-val (FVIIai) kezeljük, majd a Cyről expresszióját Northern biot elemzéssel értékeljük ki. Amint az a 4. ábrán látható, az FVIIai nem volt képes a Cyr61 expresszióját indukálni, ami arra utal, hogy az FVIIa proteolítikus aktivitására szükség van. Ebben az összfüggésben fontos lehet, hogy arra rámutassunk, hogy az FVIIai-ról kimutattuk, hogy ugyanolyan, vagy nagyobb affinitással kötődik a sejtfelszíni szöveti faktorhoz mint az FVIIa. Valószínűtlen, hogy a Cyröl Vila által indukált expressziója a kísérleteinkben downstream szabályozó faktorok, azaz FXa és trombin generálódásának eredménye. Érzékeny kromogén vizsgálatok alkalmazásával nem találtunk bizonyítékot arra, hogy Xa faktor és trombin keletkezik a mi kísérleti rendszerünkben (a kimutatás érzékenysége 10 pg). Emellett, a Xa faktor és a trombin specifikus inhibitorai, azaz a kullancs antikoaguláns fehérje és a hirudin, nem voltak képesek eltörölni a Cyr61 Vila által indukált expresszióját (5. ábra).

14. Példa

Transzkripciós mechanizmus szerepe a Cyr61 mRNS állandó szintjeinek Vlla-val val indukálásában.

Annak vizsgálatára, hogy a transzkripció szerepet játszik-e a Cyr61 mRNS állandó szintjének Vila által befolyásolt növekedésében, pihenő sejteket inkubálunk 30 percig 10 pg/ml aktinomicin-D-vel, mielőtt Vila faktorral inkubáljuk 45 percig. Amint az a 6. ábrán látható, az aktinomicin-D gátolja a Vila stimulátor hatását. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a Cyr61 indukálásában transzkripciós mechanizmus játszik szerepet.

Annak vizsgálatára, hogy de novo fehérje szintézisre szükség van-e a Cyr61 mRNS Vlla-val való indukálásához, WI-38 sejteket előkezelünk a cikloheximid fehérjeszintézis inhibitorral, mielőtt a sejteket 45 percig Vila faktorral hozzuk érintkezésbe. Amint az a 6. ábrán látható, a Vila stimuláló hatását nem blokkolja a cikloheximid. Tény, hogy a cikloheximid jelentősen növeli a Vllaval indukált Cyr61 mRNS állandó szintjét.

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás sejtvándorlás indukálására vagy fokozására, azzal jellemezve, hogy az említett sejtet egy szöveti faktor agonistával hozzuk érintkezésbe.
2. 2. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti faktor agonista FVII vagy FVIIa.
3. 3. Eljárás sejtvándorlás csökkentésére vagy gátlására, azzal jellemezve, hogy az említett sejtet egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti faktor antagonista módosított FVII.
5. 5. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejt egy humán sejt, ami szöveti faktort expresszál, beleértve a fibroblasztokat, simaizom sejteket, tumorsejteket, hematopoietikus sejteket, monocitákat, makrofágokat és epiteliális sejteket.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett sejt még expresszál PDGF-et és PDGF receptorokat, főleg PDGF β-receptorokat.
7. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított VII faktort az alábbi csoportból választjuk ki: Danzil-Phe-Phe-Arg klórmetil keton, Phe-Phe-Arg klórmetil keton, Danzil-D-Phe-Pro-Arg klórmetil keton, D-Phe-Phe-Arg klórmetil keton.
8. 8. Eljárás sebgyógyulás indukálására vagy fokozására egy betegben, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy gyógyászati készítményből, ami Vila faktort, vagy VII faktort vagy más szöveti faktor agonistát tartalmaz.
9. 9. Eljárás a sejtvándorlás, invázió, sejtvándorlással indukált sejtszaporodás vagy angiogenezis gátlására vagy csökkentésére egy betegben, aki nem-kívánt sejtvándorlással, invázióval, sejtvándorlással indukált sejtszaporodással vagy angiogenezissel kapcsolatban álló betegségben vagy állapotban szenved, azzal jellemezve, hogy az említett betegnek hatékony mennyiséget adunk be egy gyógyászati készítményből, ami egy szöveti faktor antagonistát tartalmaz.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a betegség vagy állapot egy primer tumornövekedés, tumor invázió vagy áttét.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti faktor antagonista módosított VII-es faktor.
12. 12. Egy szöveti faktor agonista alkalmazása olyan gyógyszer gyártására, amivel a sejtvándorlást indukálni vagy fokozni lehet.
13. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, amiben a szöveti faktor agonista FVII vagy FVIIa vagy azok kombinációja.
14. 14. Egy szöveti faktor antagonista alkalmazása olyan gyógyszer gyártására, amivel a sejtvándorlást csökkenteni vagy gátolni lehet.
15. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, amiben a szöveti faktor antagonista módosított VII-es faktor.
16. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, amiben a módosított VII-es faktort azok közül a VII-es faktorok közül választjuk ki, amiket az alábbi csoportba tartozó csoportokkal módosítottunk: Danzil-Phe-Phe-Arg klórmetil keton, Phe-Phe-Arg klórmetil keton, Danzil-D-Phe-Pro-Arg klórmetil keton és D-Phe-Phe-Arg klórmetil keton.
17. 17. Eljárás legalább egy gén expressziójának szabályozására egy sejtben, azzal jellemezve, hogy az említett sejtet vagy egy szöveti faktor agonistával, vagy egy szöveti faktor antagonistával hozzuk érintkezésbe.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti faktor agonista FVII vagy FVIIa.
19. 19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti faktor antagonista módosított FVII.
20. 20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gén a CCN géncsaládba tartozó gén.
21. 21. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gént az alábbi csoportból választjuk ki: Cyrlő, CTFG, dopamin D2 receptor, EST Incyte PD 395116 vagy P2U nukleotid receptor.

    A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gén a Cyról gén.

    ifj. Szentpéteri Ádám \ ¹ szabadalmi ügyvivő '

    S.B.G.1& zabadalmKÜgyíTvöi

    H-10_______{____}______

    Telefon: 461-1000 Fax: 461-10

    113