HUP0301766A2

HUP0301766A2 - Latens antitrombin III előállítása

Info

Publication number: HUP0301766A2
Application number: HU0301766A
Authority: HU
Inventors: Göran Karlsson
Original assignee: Octapharma Ag.
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2003-08-28
Also published as: MXPA03004030A; EE200300218A; RU2003117016A; BR0115188A; WO2002038610A1; IL155539A0; HUP0301766A3; KR20030057545A; JP2004522707A; AU2002214468A1; EP1332159A1; CA2428055A1; NO20032048L; NO20032048D0; CZ20031277A3; PL360410A1

Abstract

Eljárás latens antitrombin III előállítására, azzal jellemezve, hogy anatív antitrombin III-at szulfátionokat és Good-féle ikerionospufferekből választott puffert tartalmazó oldatban inkubálják. Ó

Description

o pf-C ^ΓΛΖ2ϋΠίΤΕ1Ι

S. B. G. & K.

76.740/SZE

Szabadalmi Ügyvivői Iroda H-1062 Budapest. Ándrassy út 113. Iblefon: 461-1000, Fax: 461-1099

Latens antitrombin III előállítása

A jelen találmány a latens antitrombin III előállításával foglalkozik.

Az antitrombin III (AT) egy glikoprotein, melynek teljes molekulatömege 58,1 kDa [Lebing és mtsai: Vox Sang. 67, 117-124 (1994)], mely a koagulációs kaszkádban a szerin proteázokat gátolja, és így a véralvadás szabályozásában fő szerepet játszik. Az antitrombin XII a faktor IXa, Xa, XI és Xlla inhibitora, valamint a trombin gátlója. így az AT a vérrögképződés kialakulását a véralvadási folyamatsor különböző fázisaiban szabályozza. Az AT tartalom kis csökkenése a vérben a tromboembólia növekvő kockázatával jár. A tromboembóliás betegségek megelőzésére és kezelésére AT koncentrátumokat adnak be azoknak a betegeknek, akik szervezett vagy öröklött antitrombin hiányban szenvednek. Továbbá beszámoltak arról, hogy az emberi szervezetben az AT-nek számos szerepe van, például az angiogenézisben és a gyulladásos válaszokban. Ezen fiziológiai folyamatokban az AT részvétele nem teljes mértékben tisztázott.

Az antitrombin III azon formája közismert, melyet először Wardell és munkatársai jellemeztek [Wardell és mtsai: Biochemistry, 36, 13133-13142, 1997)], ez a latens forma (L-AT). Az L-AT-ról és az elasztázzal szelektíven hasított változatáról kimutatták, hogy erős antiangiogenikus aktivitással rendelkezik, és az egerekben a tumornövekedést is szupresszálja, melyeket szubkután humán neuroblasztóma sejtvonallal injektáltak [O'Reilly és mtsai: Science, 285, 1926-1928(1999), és WO

00/20026 számú szabadalmi bejelentés]. így az L-AT-t potenciális humán rákgyógyszernek kell tekinteni. Bár a gyógyszer ezen potenciálját klinikailag még nem vizsgálták.

Az AT tisztítása tisztított heparin affinitás kromatográfiával történik, amit a szilárd fázishoz kötnek, ahogy azt a szakirodalomban leírták. A szakirodalomban a humán AT tisztítását heparin Sepharose használatával is leírták [Miller-Andersson és mtsai: Thrombosis Research, 5, 439-452(1974)]. Ez a kromatográfiás rendszer az AT és a L-AT elkülönítésében is hasznos, ahol az AT-hoz képest az L-AT heparin affinitása kisebb, ami lehetővé teszi, hogy a két komponens elváljon, ahogy azt a szakirodalomban leírták [Chang és Harper: Thrombosis and Haemostasis, 77, 323-328(1997)]. A hidrofób kölcsönhatású kromatográfiát szintén felhasználták a natív és a latens formájú AT-k elkülönítésére [Karlsson és Winge: Protein Expr. Purif., 21, 749-755 (2001)].

Az AT latens formájának indukálását a szakirodalomban nemrégiben leírták [Wardell és mtsai: Biochemistry, 36, 1313313142, 1997)], akik az AT 0,25 M citráttal történő inkubáláskor 50-60 % L-AT-t nyertek, (7,0 mM trisz-HCl, pH = 7,4, 15 óra 60 °C-on).

A natív antitrombin III inkubálása 60 °C-on, táptalajban vagy csak pufferben, gyakran polimerizált aggregált fehérje kialakulásához vezetett. Az ilyen aggregátumok a latens antitrombin III magas kitermelését rontják, és a lehetőségekhez képest ezt, amennyire lehet, el kell kerülni.

így a jelen találmány egyik tárgya a latens antitrombin III (L-AT) előállítási folyamatának biztosítása egy olyan natív anti trombin III (AT) oldatból, mely a kívánt terméket nagyobb mértékben biztosítja, mint a szakirodalomban eddig leírtak.

A jelen találmány egy további tárgya az AT formából az L-AT forma előállítási folyamatának biztosítása, amelyben az AT polimerek aggregátumainak termelését minimális szinten tartjuk.

A jelen találmány egy további tárgya az ilyen AT - L-AT átalakulás folyamatának biztosítása, melyben általánosan rendelkezésre álló reagenseket és pufferoldatokat használunk, és ami in vitro megvalósítható.

A jelen találmány még egy további tárgya az AT-ből az L-AT előállítási folyamatának biztosítása, mely az L-AT ipari termeléséhez méretnövelést foglal magában.

A találmány fentiekben említett és további tárgyai az igénypontokban meghatározott folyamatoknak megfelelnek. így olyan folyamatot biztosít, mely a natív antitrombin III oldat inkubálását foglalja magában szulfátionok és puffer jelenlétében, mely utóbbit a Good-féle ikerionos pufferek közül választunk ki. Meglepetésünkre azt találtuk, hogy ezek az inkubációs körülmények olyan kitermelést annak, ami az eddigi szakirodalomban leírt eljárásokkal kapott kitermeléseknél lényegesen nagyobb (különösen Wardell és munkatársai által használt citrátos körülményekhez viszonyítva), miközben a lehetséges aggregálódási probléma elkerülhetővé vált.

Ezek után röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1. ábra az antitrombin heparin affinitás kromatográfiáját mutatja be, melynél nátrium-klorid gradienst használtunk (0-2 M, 5-60 perc). A fehérje injektált mennyisége az A-B minták esetében 100 pg, míg a C-D mintáknál 250 pg. Az összes mintát 1 óráig 60 °C-on inkubáltuk, kivéve az AT A jelű referencia mintát, melyet hővel nem kezeltünk (a 7. minta a példában). A B mintát (6. minta a példában) Wardell szerint 0,5 M-os citrátban inkubáltuk. A C mintát (2. minta a példában) és a D mintát (1. minta a példában) 5 mM HEPES-ben inkubáltuk, (pH = 7,4), amit 0,9 és 0,8 M ammonium-szulfáttal egészítettünk ki. Az alacsony affinitású heparin kötőcsúcs integrálása, 22 perces eluálása az E, C és D minták esetében 44 %-os, 71 %-os, illetőleg 89 %-os integrált területet adott. A natív AT-t a 39. percben eluáltuk.

A 2. ábra az antitrombin minták natív elektroforézisét mutatja be, melyhez homogén gélként 12,5 % poliakrilamidot alkalmaztunk. A minta mennyisége csíkonként 0,5 pg fehérje, és a géleket futtatás után ezüsttel festettük. Az összes mintát, kivéve a 7. csíkot, 16 óráig 60 °C-on inkubáltuk.

1. csík: 5 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH =7,4

2. csík: 5 mM HEPES, 0,9 M ammónium-szulfát, pH =7,4

3. csík: 5 mM HEPES, 1,1 M ammónium-szulfát, pH =7,4

4. csík: 5 mM HEPES, 1,4 M ammónium-szulfát, pH =7,4

5. csík: 5 mM HEPES, 2,0 M ammónium-szulfát, pH =7,4

6. csík: 10 mM trisz/HCl, 0,5 M trinátrium-citrát, pH = 7,4 (Wardell és mtsai. szerint, 1977)

7. csík: referencia AT minta, nem hőkezelt csík: 25 mM nátrium-foszfát, 100 mM nátrium-klorid, pH = 7,4

9. csík: 25 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH =7,4

10. csík: 5 mM HEPES, 0,5 M ammónium-szulfát, pH =7,4

11. csík: 5 mM HEPES, 2,0 M ammónium-szulfát, pH =7,4

12. csík: 5 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH =7,0

Az összes csík megfeleld az alábbi példákban megadott számoknak. A jelen találmány a latens antitrombin III (amit L5

AT-vel jelölünk) előállításához biztosít eljárást, a natív formában lévő antitrombin III oldatból (amit AT-vel jelölünk) kiindulva. Az AT a vér plazmából heparin-Sepharose kromatográfiával kinyerhető, ahogy azt a szakirodalomban leírták. A találmány szerint az AT-t ezek után szulfátionok és puffer jelenlétében inkubáljuk. Az inkubációs hőmérséklet és az inkubáció időtartama a szakirodalomban jártas szakemberek számára könnyen meghatározható, de a normális pasztőrözési körülmények, mint például körülbelül 60 °C-on 16 óráig, megfigyelésünk alapján jól alkalmazhatók.

A szulfátionokat előnyösen szulfátsó formában biztosítjuk. Ehhez az alkáli fém szulfátot, az alkáli földfém szulfátot vagy az ammonium-szulfátot előnyben részesítjük. Különösen előnyben részesítjük az ammónium-szulfátot. A szulfátionok megfelelő koncentrációja a jelen találmány szerinti folyamatban 0,5-2,0 M tartományban található, előnyösen 0,7-1 M, a 0,8 és 0,9 M közötti koncentrációkat különösen előnyben részesítjük.

Az inkubációs elegy másik komponense a puffer, ezt a Good-féle kettősion pufferek közül választjuk ki [Good és mtsai: Hiochemistry, 5, 467-477(1965)]. A folyamat részére a jelen találmány gyakorlatában használt kettősionok szükségtelen kísérletezés nélkül meghatározható, figyelembe véve, hogy a puffernek a következő feltételek legtöbbjét vagy mindegyikét biztosítania kell: a pH értékének körülbelül 6 és 9 között kell lennie; a maximális vízben való oldékonyságának és a minimális más oldószerben megmutatkozó oldékonyságának, a minimális sóhatáshoz, az alkalmazott kísérleti körülmények között stabilnak kell lennie; és a látható vagy az ultraibolya tartományban fényt nem szabad abszorbeálnia (így a spektroszkópiás mérésekben interferencia nem lép fel). A Good-féle ikerionos pufferek, beleértve a HEPES, MES és PIPES puffereket, tipikusan megfelelnek a megadott jellemvonásoknak. A jelen találmány szerinti folyamatban a HEPES használatát különösen előnyben részesítjük. A széles körben használt trisz puffer a jelen találmány szándékainak nem felel meg. Az előnyben részesített puffer koncentrációk bizonyos mértékben függ a megválasztott puffertől, de tipikusan 1-25 mM tartományban található, előnyösebben 2,5-10 mM, még előnyösebben 1-6 mM.

Ahogy azt a fentiekben jeleztük az inkubációs reakció pHjának 6 és 9 között kell lennie, előnyösen 7-8 között, előnyösebben 7,4 és 7,6 között.

A fentiekben körvonalazott AT inkubációt követően az L-AT elválasztása a megmaradó AT-től előnyösen heparin affinitás kromatográfiával történik. Az L-AT kötőaktivitása a heparinhoz kisebb mint az AT affinitása, így lényegesen gyorsabban eluálódik és a két antitrombin forma könnyű elválasztása lehetővé válik.

Az így kapott L-AT készítményt a kórokozók, különösen a vírusok és a prionok, eltávolítása érdekében, inaktivációs kezelésnek vetjük alá. Ez a szakirodalomban leírt számos inaktivációs vagy eltávolítás! eljárással végrehajtható, vagy az ilyen módszerek kombinálásával. Az ilyen eljárások példái a következők: kémiai inaktiválás, hőinaktiválás, fényinaktiválás, mikrohullámú inaktiválás és nano-filtrációs eltávolítás. A szűrési folyamat végzése előnyös az un. dead-end filtrációs eljárással [WO 96/00237 számú szabadalmi bejelentés], vagy más folyamatok kombinálásával. A kórokozók eltávolítása és inaktiválása akkor hajtható végre, amikor az antitrombin III molekulák natív állapotban vannak, az L-AT átalakulásuk előtt.

A jelen találmány a további, nem korlátozó jellegű, példákon keresztül mutatjuk be.

Példa

Az AT laboratóriumi mintáját - 95 %-os tisztasággal- vásároltuk (Plasma Products, Pharmacia, Stockholm, Sweden). Ezt a mintát a szakirodalomban ismert eljárással állították elő [MillerAndersson és mtsai: supra] és ezt a latens formájú antitrombin indukálásához használtuk fel.

Az L-AT előállítása:

Az AT laboratóriumi mintáját a következő oldatokba helyeztük:

1. minta: 5 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH = 7,4

2. minta: 5 mM HEPES, 0,9 M ammónium-szulfát, pH = 7,4

3. minta: 5 mM HEPES, 1,1 M ammónium-szulfát, pH = 7,4

4. minta: 5 mM HEPES, 1,4 M ammónium-szulfát, pH = 7,4

5. minta: 5 mM HEPES, 2,0 M ammónium-szulfát, pH = 7,4

6. minta: 10 mmol trisz/HCl, 0,5 M trinátrium-citrát, pH = 7,4 (Wardell és mtsai., 1997)

7-8. minta: 25 mM nátrium-foszfát, 100 mM nátrium-klorid, pH = 7,4

9. minta: 25 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH = 7,4 10. minta: 5 mM HEPES, 0,5 M ammónium-szulfát, pH= 7,4

11. minta: 5 mM HEPES, 2,0 M ammónium-szulfát, pH= 7,4

12. minta: 5 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH= 7,0

13. minta: 5 mM HEPES, 0,8 M ammónium-szulfát, pH= 7,8

A fentiekben felsorolt összes puffer pH-ját a kívánt értékre szobahőmérsékleten állítottuk be. A 6. mintát 1 M HCl-lel állítot tűk be, míg a többi mintánál a pH beállításához 1 M nátriumhidroxidot használtunk.

Az AT-t 6 mg/ml végkoncentrációnál üvegcsövekben 1 óráig 60 °C-on oldatokban inkubáltuk (1-13. minták), kivéve a 7. mintánál, melyet hűtőszekrényben körülbelül 8 °C-on tároltunk, és egy olyan oldatba helyeztük, mely 50 mM trisz/HCl-t, 50 mM nátrium-kloridot tartalmazott, pH = 7,4, felhasználva kis gélszúrő oszlopokat (NAP-5 Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).

Az L-AT képződését a mintákban heparin affinitás kromatográfiával analizáltuk, és az aggregátumok jelenlétét natív elektroforézissel vizsgálatuk.

A heparin affinitáskromatográfia

Ez az eljárás a Chang és Harper leíráson alapul [Chang és Harper: supra]. A HPLC-t TSK Heparin® oszloppal szereltük fel (Toaohaas, Stuttgart, Germany, 7.5 i.d. x 75 mm, 10 gm, 1000 Angstrom). Az eluáló pufferek a következők: 20 mM trisz/HCl puffer, pH = 7,4 (A puffer) és 2 M nátrium-klorid 20 mM trisz/HCl-ben, pH = 7,4 (B puffer). A lineáris gradienst 0-5 percig 0 % B, 5-60 percig 100 % B, 60-90 percig 0 % B pufferekkel alakítottuk ki. Az áramlási sebesség 0,4 ml/perc volt, és a kimutatást az abszorbancia 280 nm-en történő mérésével végeztük.

Natív poliakrilamid gélelektroforézis

Az elektroforézist 12,5 % homogén poliakrilamidon (Phast® gél, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) végeztük, felhasználva az ajánlott futtatási paramétereket. 0,5 gg fehérjét 1 gl-ben vittünk fel minden egyes csíknál. A diamino-ezüst festést a gyártó utasításainak megfelelően végeztük (Pharmacia & Upjohn (Phast System™, Technical Note No 2), kétdimenziós elektroforézis PhastGel™ szeparációs közeggel végeztük (Pharmacia LKH Hiotechnology AB, Uppsala, Sweden), azzal a különbséggel, hogy egy kissé erősebb rögzítő oldatot készítettünk, mely 50 % etanolt, 10 % ecetsavat és 40 % vizet tartalmazott.

Az antitrombin aktivitás mérése

A 2. mintát (inkubálás 0,9 M ammonium-szulfátban) az AT biológiai aktivitására nézve trombin kromatogén peptid szubsztráttal (S-2238) (Chromagenix, Molndal, Sweden) analizáltuk, a szakirodalomban leírtaknak megfelelően [Scand J. Haematol., 37, 427-436 (1983)]. A vizsgálati oldat trombint, heparint, kromogén szubsztrátot és a mintát tartalmazta, és az inkubáció hatására kialakuló válasz változását 405 nm-en rögzítettük.

Eredmények

A heparin affinitás kromatográfiával a natív AT a 39. percben jött le, (körülbelül 0,9 M nátrium-klorid) és a fő latens csúcs a 22. percben (körülbelül 0,3 M nátrium-klorid) (1A-1B. ábrák). Az alacsony heparinkötő csúcs integrálása arra utalt, hogy a kitermelés a Wardell-féle módszerrel (6. minta) 44 % (1B. ábra), míg 0,9 és 0,8 M ammónium-szulfáttal végzett inkubációval (2. ill. 1. minták) 71 % illetőleg 89 % (1C-1D. ábra). Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a képződött L-AT százaléka csökkent az ammónium-szufát/HEPES növekvő koncentrációival, vagy a magasabb pH értékkel.

Az AT natív elektroforézise nagymennyiségű aggregátum kialakulásához vezetett 60 °C-on a foszfát/NaCl-ben (8. minta), és csak a fehérje kis része maradt monomer formában (2. ábra, 8. csík). A Wardell szerint inkubált AT (2. ábra, 8. csík), valamint a nem inkubált AT (2. ábra, 7. csík) nem adott aggregátumokat. A 0,5 M ammónium-szulfátban történő inkubálás (10. minta) erős aggregálódást indukált (2. ábra, 10. csík), míg a 0,6 Μ (1. minta) csak kevés aggregátum kialakulást okozott (2. ábra, 1. csík). Az ammonium-szulfát 0,9-2,0 M koncentráció tartományban (2-5. minták) látható aggregátumokat nem adtak (2. ábra, 2-5. csík). A pH = 7,0 értéken sok aggregátumot figyeltünk meg (2. ábra, 12. csík), míg a pH = 7,5 értéken kisebb mennyiségű aggregátumot kaptunk (az adatokat nem mutattuk be).

A 2. minta antitrombin aktivitása (0,9 M ammónium-szulfát) az eredeti specifikus aktivitáshoz képest 34 %-ra csökkent; ez egybevethető a magas aktivitású heparinkötő AT 29 %-os kitermelésével, amit a minta affinitás kromatográfiájával kaptunk (1. táblázat).

1. Táblázat

A heparin affinitás kromatográfia

A L-AT képződése különböző minta pufferekben miután 16 óráig 60 °C-on inkubáltuk:

Inkubációs oldat Mintaszám¹ Az AT %-a alacsony heparin affinitással mmol trisz/HCl, 0,5 M citrát, pH = 6 44*

7,4 (Wardell)

5 mM Hepes, 0,5 M	ammonium- 10	99
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 0,8 M	ammonium- 1	89
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 0,9 M	ammonium- 2	71*
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 1,1 M	ammonium- 3	56*
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 1,4 M	ammonium- 4	49*
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 2,0 M	ammonium- 5	48*
szulfát, pH = 7,4 25 mM Hepes, 0,8 M	ammonium- 9	70
szulfát, pH = 7,4 5 mM Hepes, 0,8 M	ammonium- 12	99
szulfát, pH = 7,0 5 mM Hepes, 0,8 M	ammonium- 13	65

szulfát, pH = 7,8 ¹ a példa szerint * nincs látható aggregátum, amikor natív elektroforézissel vizsgáljuk (lásd 2. ábrát)

A kísérletekből származó következtetések

Az AT inkubálása 5 mM HEPES-ben, pH = 7,4-en, mely 0,8 vagy 0,9 M ammónium-szulfátot tartalmazott, 60 θθ-οη 16 óráig a latens formába (L-AT) körülbelül 85-90 % és 70-75 % AT átalakítást eredményezett. A natív elektroforézis 0,8 M ammóniumszulfátban kevés aggregátumot mutatott, és 0,9 M-ban pedig lát12 .L <*· λ”· ható aggregátumot nem találtunk. A tisztítási folyamatban az ilyen kis mennyiségű aggregátum gélszűréssel vagy hasonló technikákkal könnyen eltávolítható.

Az optimális AT-L-AT átalakulás 0,8-0,9 M ammóniumszulfáttal érhető el. Az átalakítás szintén jó eredménnyel végezhető 0,7 és 1 M között, és kevésbé jól 0,5 és 2,0 M között. Az LAT kialakulásához a 0,5-2,0 M ammonium-szulfát használatát, előnyösen a 0,8-0,9 M használatát, 25 mM felső határú HEPESszel, előnyösen nem több mint 10 mM-lal, közel pH = 7,4-en találtuk a legjobbnak.

A keletkezett L-AT százaléka az ammonium-szulfát/HEPES koncentráció növekedésével vagy a nagyobb pH értékkel csökken. Továbbá az aggregátum képződés megakadályozásán kívül, alacsony ammonium-szulfát koncentráció vagy túl alacsony pH al-kalmazása nem szükséges.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás latens antitrombin III előállítására, azzal jellemezve, hogy a natív antitrombin III-at szulfátionokat és Good-féle ikerionos pufferekből választott puffért tartalmazó oldatban inkubáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szulfátionokat a következők közül választjuk ki: ammonium-szulfát, alkáli fém szulfátok és alkáli földfém szulfátok.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szulfátsó az ammónium-szulfát.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szulfátion koncentráció 0,5-2,0 M tartományba esik.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó szulfátion koncentráció 0,7-1 M-ig terjed.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szulfátion koncentráció 0,8-0,9 M.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó puffer HEPES puffért tartalmaz.
8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó puffer koncentrációja 1-25 mM.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a puffer koncentrációja 2,5-10 mM.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a puffer koncentrációja 4-5 mM.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-érték 6-9-ig terjed.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-érték 7-8.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-érték 7,4 - 7,6.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fentieken kívül a kórokozók, főleg vírusok és prionok, inaktiválási vagy eltávolítás! kezelését is magában foglalja.
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a natív antitrombin III-at a kórokozók, különösen vírusok és prionok, inaktiválása vagy eltávolítása érdekében kezelték.
16. A 14. vagy a 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó kezelés a következőket vagy azok kombinációit foglalhatja magában: kémiai inaktiválás, hőinaktiválás, fényinaktiválás, mikrohullámú inaktiválás, nanofiltrációs eltávolítás.

nÁdám szabadalmi ügyvivő í S.B.G. & K. Szabadalmi Ügyvivői Iroda tagja

H-1062 Budapest, Andrássy út 113 'lelefon: 461-1000 Fax: 461-1099 '