HUP0300559A2

HUP0300559A2 - A trombopoietin receptort moduláló peptidek

Info

Publication number: HUP0300559A2
Application number: HU0300559A
Authority: HU
Inventors: Tatjana Naranda; Lennart Olsson
Original assignee: Pliva, Farmaceutska Industrija, Dionicko Drustvo
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2003-06-28
Also published as: ZA200208662B; EP1278849A2; BG107214A; AR030278A1; GEP20063763B; EP1149906A1; HUP0300559A3; PL358304A1; JP2003530867A; AU2001267366B9; IS6582A; CN1426467A; EA200201138A1; US20030181659A1; EE200200610A; CZ20023517A3; NO20025114D0; WO2001080873A3; WO2001080873A2; NO20025114L

Abstract

A találmány tárgyát új diagnosztikai és gyógyászati készítményekképezik, amik lehetővé teszik a trombocitopénia kezelését. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI példád

75.645/ZSO _c S.B.G.&K.

Η ^Β^θί Iroda

W02 Budapest, Andrássy út 113

Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099

A trombopoietin receptort moduláló peptidek

A jelen találmány tárgyát képezi egy oligopeptid, ami egy trombopoietin (TPO) receptort moduláló vegyület biológiai aktivitásával rendelkezik, valamint az oligopeptidet kódoló nukleotid szekvenciák, a nukleotid szekvenciákat tartalmazó vektorok, a vektorokat tartalmazó gazdasejtek, az oligopeptiddel reagáló ellenanyagok, az oligopeptideket tartalmazó gyógyászati és diagnosztikai készítmények, nukleotid szekvenciák, ellenanyagok és/vagy gazdasejtek, valamint módszerek a sejt genetikai módosítására, módszerek egy trombopoietin receptor (TPO-R) aktivitásának befolyásolására, és módszerek a további, trombopoietin receptort moduláló vegyületek keresésére.

A trombocitopénia egy széles körben elterjedt, súlyos, és életveszélyes betegség, ami előfordul mind primer hematológiai, mind indukált rendellenességként. A súlyos trombocitopéniában szenvedő betegeket a spontán vérömleny súlyos veszélye fenyegeti. Az indukált trombocitopéniát okozhatja például csontvelő transzfúzió, rák kemoterápia, besugárzás vagy allergiás reakciók. Az összes diagnosztizált rákbetegnek körülbelül 50 százaléka kap valamilyen formájú kemoterápiát, és kap vérlemezke transzfúziót. A trombocitopénia a kemoterápiát kapott betegeknek legalább 25 százalékát fenyegeti. Mivel a dózis-intenzív kemoterápia ismételt ciklusai kimerítik a vérlemezkéket, amik megakadá- 2 lyozzák a vérzést, és segítik a károsodott vérerek helyreállítását, a rák kemoterápiái kezeléseket gyakran meg kell szakítani, hogy lehetővé tegyék a vérlemezke szám helyreállását. Ha nem sikerül helyreállítani a vérlemezke számot, ez késlelteti és/vagy korlátozza a kemoterápia ezt követő ciklusait, csökkentve a sikeres kezelés lehetőségét.

A trombocitopénia kezelését elsődlegesen friss vérlemezke készítmények transzfúziójával hajtjuk végre, ami nagyon drága és nem olyan könnyen hozzáférhető gyógyszer, ami injekciózással vagy orális úton beadva képes a vérlemezkék számát a normális szintre növelni. Csak az Amerikai Egyesült Államok-ban minden évben körülbelül 8 millió egység vérlemezkét transzfundálnak betegekbe, hogy csökkentsék a súlyos vérzések kockázatát. A transzfúziók legalább 30 százaléka eredményez komplikációkat, általában lázas reakciókat, alkalmanként bakterémiát, graftversus-host betegséget, vagy akut tüdősérülést. Az ismételt vérlemezke transzfúzióra szoruló betegek 15-25 százalékában a vérlemezke válasz növekménye nem elégséges, a HLA alloimmunizáció miatt. Emellett a vérlemezke transzfúziók drágák. Pontosabban, a kemoterápiával indukált trombocitopéniát jelenleg vérlemezke transzfúzióval orvosolják, és/vagy a kemoterápia csökkentésével vagy késleltetésével, ameddig a vérlemezke szám nem kezd el növekedni. A transzfúziók azonban kockázatot jelenthetnek a betegeknek a vér által közvetített versek, azaz például a hepatitisz B és hepatitisz C, a HÍV fertőzések és a humán T-limfotróp vírus miatt, vagy az immunreakciók, azaz például a láz miatt. A

- 3 kemoterápiás dózisok csökkentése és a kezelés késleltetése vagy leállítása elvileg lehetővé teheti a rákos sejtek számára, hogy növekedjenek vagy elterjedjenek. Tehát sürgős szükség van hatékony gyógyszerek tervezésére a trombocitopénia kezeléséhez, amihez azonban annak molekuláris és biokémia okai részletes megismerésére van szükség.

A megakariociták csontvelőből származó sejtek, amik felelősek a vérben keringő vérlemezkék termeléséért. Bár a legtöbb fajban a csontvelő sejteknek csak egy kis részét teszik ki, azonban térfogatuk körülbelül tízszer nagyobb, mint a tipikus velősejteké. A megakariociták endomitózison esnek át, ennek során sejtmagjukat replikálják, de sejtjeik nem képesek osztódni, ezzel poliploid sejteket eredményeznek. A csökkent vérlemezkeszámra adott válaszként az endomitotikus sebesség megnő, magasabb ploiditású megakariociták keletkeznek, és a megakariociták száma körülbelül háromszorosára nő. Ezzel szemben, a megnőtt vérlemezkke számra adott válaszként az endomitotikus sebesség lecsökken, kisebb ploiditású megakariociták keletkeznek, és a megakariociták száma szignifikánsan csökken.

A pontos fiziológiás feedback mechanizmus, amivel a keringő vérlemezkék tömege szabályozza az endomitotikus sebességet és a csontvelő megakariociták számát, nem ismert. Azt gondolják, hogy ennek a feedback huroknak a befolyásolásában szerepet játszó keringő trombopoietikus faktor a TPO, egy glikoprotein, ami legalább két különböző formában fordul elő, amiknek a molekulasúlya 25 és 31 kDa, az N-terminálisuk

- 4 közös, és a vörös vérsejt termelődést szabályozza. A TPO-ról kimutatták, hogy a megakariocitopoiézis fő szabályozója, mind in vivo, mind in vitro. A TPO biológiai hatásait azzal iniciálja, hogy a c-mpl-hez kötődik (ezt a továbbiakban TPO-R-nek is nevezzük), ami a hematopoietin receptor szupercsalád tagja. Pontosabban, a TPO-ról kimutatták, hogy a trombpcitopéniával járó helyzetekben a fő humorális szabályozó. A TPO-ról számos vizsgálatban kimutatták, hogy a befogadó állatokban növeli a vérlemezke-számot, növeli a vérlemezkék méretét, és növeli az izotópok beépülését a vérlemezkékbe. Pontosabban, a TPO-ról azt gondolják, hogy számos különböző módon érinti a megakariocitopoiézist: 1) a megakariociták méretének és számának növekedését okozza; 2) a megakariocitákban megnöveli a DNS-tartalmat, poliploidia formájában; 3) növeli a megakariocita endomitózist; 4) a megakariociták érését eredményezi; és 5) növeli a prekurzor sejtek százalékát, kis acetilkolinészteráz-pozitív sejtek formájában és a csontvelőben.

Mivel a véralvadáshoz vérlemezkékre (trombocitákra) van szükség, és ha ezek száma nagyon alacsony, akkor a beteg annak súlyos kockázatának van kitéve, hogy meghal egy katasztrofikus vérömlenytől, a TPO potenciálisan használható a különböző hematológiai rendellenességek diagnosztizálásában és kezelésében, azaz például olyan betegségek kezelésében, amiket elsődlegesen a vérlemezke defektusok okoznak. Emellett a legfrissebb vizsgálatok biztosítanak alapot arra, hogy a TPO terápia hatékonyságát kiterjesszük a trombocitopénja kezelésére, főleg az

- 5 olyan trombocitopénia kezelésére, ami kemoterápia, besugárzásos kezelés, vagy csontvelő transzplantáció eredetű, rák vagy limfóma kezelése következtében [MacDonald: Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14, 8-21 (1992)].

A trombopoietint (TPO) kódoló gént klónozták és jellemezték (Kuter és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91, 11104-11108 (1994); Barley és mtsai: Cell 77, 1117-1124 (1994); Kaushansky és mtsai: Nature 369, 568-571 (1994); Wendling és mtsai: Nature 369 571-574 (1994); Savage és mtsai: Nature 369, 533-538 (1994)].

A rekombináns trombopoietin (a továbbiakban rTPO-nak is nevezzük) a mai napig előállított anyagok közűi az egyetlen specifikusan tervezett anyag, ami valószínűleg hatékony a trombocitopénia kezelésében. A trombocitopénia során vérlemezkeinduktorként hat. Kimutatták, hogy egyetlen kívülről bevitt rTPO dózis általában kötődik a vérlemezke-szám növekedéséhez. Néhány esetben képes növelni a megakariocita választ is, és ezzel trombotikus komplikációkat okozhat. Tehát azt gondolják, hogy bár a trombocitopénia nem idézi elő a vérlemezkék aggregációját jól ismert agonisták (trombin, kollagén) távollétében, de érzékenyíti a vérlemezkéket ezeknek az ágenseknek az aggregációs hatására. Az ilyen „priming”-et in vivo is dokumentálták. A trombocitopéniával kezelt állatokból származó vérlemezkéknek megnőtt az érzékenysége a vérlemezke aggregációt stimuláló anyagokra. Tehát a TPO súlyosbíthatja a trombogén állapotokat, és ennek kockázatát gondosan ki kell értékelni, mielőtt a TPO-t

- 6 beadjuk egy betegnek. Emellett az érett vérlemezkék eltávolítják a trombopoietint az oldatból, és a trombocitopéniás állatokban a plazma trombopoietin koncentrációja a vérlemezke transzfúzió után gyorsan leesik, és csak azután nő meg, ha a vérlemezkeszám újra visszaesik. Ennek a megfigyelésnek, azaz hogy a vérlemezkék képesek eltávolítani a trombopoietint a keringésből, legalább két klinikai következménye van: i) a vérlemezke transzfúziók tompíthatják a megakariociták kinyerését; ii) a trombopoietinnek a létező vérlemezkékhez való kötődése tompíthatja az endogén trombopoietinnek a mieloszuppresszív terápiára adott válaszát. Azonban, mivel a létező vérlemezkék továbbra is kötődnek a trombopoietinhez, a plazma trombopoietin koncentrációjának növekedése több napot késik, ameddig a trombocitopénia ennek útjában áll. Emellett, ha a rekombináns trombopoietint egyetlen PEG-gel konjugált egység formájában adjuk be, akkor a terápia néhány esetben kapcsolódik a trombocitopénia kifejlődéséhez és a neutralizáló ellenanyagokhoz.

Az rTPO mellett számos más rekombináns citokin (azaz például interleukin-1, interleukin-3, interleukin-6, interleukin-11, granulocita makrofág telepserkentő faktor, Steel faktor és a promegaprotein - interleukin-3 trombopoietin fúziós fehérje) rendelkezik közvetlen és közvetett stimuláló hatással a megakariotikus sejtvonalba tartozó in vivo és in vitro sejtekben. Azonban ezek közül az anyagok közül a legtöbbnek nincs előnyös hatása a vérlemezke-regenerálódásra a mieloszuppresszív terápia után, és váratlan toxikus hatásokkal rendelkezik. Ezzel szemben az inter

- 7 leukin-11 mind hatékonynak, mind viszonylag biztonságosnak mutatkozott. Az interleukin-11-et arra használják, hogy csökkentsék a vérlemezke transzfúzióra való igényt a kemoterápiát kapó rákos betegekben. Ha naponta szubkután adjuk be, akkor az interleukin-11 a vérlemezke-szám növekedését indukálja a rákos betegekben. A gyógyszernek azonban káros hatásai is vannak, főleg a plazma-térfogat növekedése miatt (atriális aritmiák, palpitáció (szívdobogás), perifériális ödéma, fejfájás, fulladás, anémia, izomfájdalom, testsúlynövekedés, anorexia, hányinger), és néhány rákos betegben megfigyelték ellenanyagok képződését is (a neutralizálónak minősítettek alatt). Úgy tűnik, hogy az interleukin- 11 csak olyan betegek esetében használható, akik súlyos, és a terápiát korlátozó trombocitopéniában szenvednek, vagy azoknál, akiknek korábban vérlemezke transzfúzióra volt szükségük. Nem javasolt, hogy a trombocitopénia enyhítésére rutinszerűen használjuk.

A humán rekombináns trombopoietin DNS szekvenciákat és az általuk kódolt peptid-szekvenciákat publikálták [Vígon és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 5640-5644 (1992)]. A rekombináns trombopoietin a hematopoietin növekedési faktor receptorcsalád egyik tagja, egy olyan családé, amit az extracelluláris dómén közös strukturális felépítése jellemez, beleértve négy konzerválódott cisztein-csoportot is az N-terminális részben.

A klónozott gének hozzáférhetősége a rekombináns trombopoietin esetében megkönnyíti ennek a fontos receptornak az ago

- 8 nistáinak a keresését. A rekombináns receptor fehérje hozzáférhetősége lehetővé teszi a receptor-ligandum kölcsönhatás tanulmányozását számos különböző random és félig-random peptid diverzitást generáló rendszerben.

A WO 99/42127 szabadalmi leírásban leírnak egy trombopoietin-receptor peptidet (a továbbiakban vad-típusú TPO-Rpnek nevezzük), ami 23 aminosavat tartalmaz, amik megfelelnek a humán TPO-Rp 444-466-os aminosavainak. Leírnak egy módszert, amivel befolyásolni lehet a TPO-R aktivitását, ha a TPO-Rp-t alkalmazzuk a receptorra. Azonban a trombocitopénia specifikus kezelését nem írják le.

Különböző szerzők leírják a TPO-R deléciós mutánsait, amik lehetővé teszik a struktúra-funkció kapcsolatok elemzését [Dorsch és mtsai: J. Exp. Med. 186, 1947-1955 (1997); Drachmán és Kaushansky: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 94, 2350-2355 (1997); Porteu és mtsai: Molecular & Cellular Biology 2473-2482 (1996); Takatoku és mtsai: Journal of Biological Chemistry 272, 7259-7263 (1997)].

Ismertek további trombopoietin receptor agonista peptidek is [Kimura és mtsai: Journal of Biochemistry 122, 1046-1051 (1997); Kimura és mtsai: Biochem. Mol. Biol. Int. 44, 1203-1209 (1998)], amikben egy 15 aminosavból álló peptid van egy random fágpeptid könyvtárból, ami stimulálja a trombopoietin dependens sejtek szaporodását, és az egér csontvelő sejtek megakariocitákká való differenciálódását. Cwirla és munkatársai leírnak egy 14 aminosavból álló trombopoietin receptor agonista peptidet, ami

- 9 stimulálja a humán csontvelő sejtekből származó megakariociták in vitro szaporodását és érését [Cwirla és mtsai: Science 276, 1696-1699 (1997)].

Nincs olyan publikáció, amiben leírnák, hogy a rekombináns trombopoietinnek vagy az agonista peptideknek ezek a deléciós mutánsai használhatók-e a trombopoietin utánzására, azzal a potenciállal, hogy stabil és gyógyászatilag elfogadható gyógyszerekké lehet fejleszteni őket.

Tehát a jelen találmányt aláhúzó technikai probléma az, hogy biztosítsunk egy hatékony vegyületet, ami jól használható a hematológiai rendellenességek, azaz például az idiopátiás és indukált trombocitopénia kezelésére, főleg a kemoterápiával, allergiás és besugárzással indukált trombocitopénia esetében, miközben nem toxikus és stabil.

A jelen találmány megoldja az említett problémát, oly módon, hogy egy izolált és tisztított oligopeptidet biztosít, ami egy TPO-R modulátor biológiai aktivitásával rendelkezik, pontosabban, ényegében, előnyösen 15-18 aminosavból áll, és általános képlete az alábbi:

Xi G T L E L X₂ P X₃ S R Y R L Q L X₄, amiben

Xi jelentése A R G vagy hiányzik,

X₂ jelentése R vagy A,

X₃ jelentése R vagy A, és

X₄ jelentése R A R, vagy hiányzik.

A jelen találmány egy különösen előnyben részesített megvalósítási módja szerint az oligopeptid lényegében tartalmazza

-10-illetve előnyösen azokból áll - az 1., 2., 3., 4., 5. vagy 6. számú szekvencia bármelyikét, amik teljes egészükben beépülnek a jelen találmány kitanításába.

A jelen találmány többek között azon a megfigyelésen alapul, hogy az előzőkben említett oligopeptidek modulálják a rekombináns trombopoietin aktivitását, pontosabban erősen kötődnek a rekombináns trombopoietinhez és aktiválják azt, valamint javítják az endogén trombopoietin felhasználását. Tehát a jelen találmány szerinti oligopeptidek legalább két különböző aktivitással rendelkeznek, nevezetesen a következőkkel: i) a rekombináns trombopoietin aktivitását moduláló aktivitás, például egy antagonista hatás, azaz például egy TPO-t utánzó hatás, vagy egy antagonista hatás, és ii) egy szinergisztikus hatás a trombopoietinnel együtt, különösen, ha mindkét vegyület szubmaximális koncentrációban van jelen. A szinergisztikus hatások különösen fontosak, mivel klinikai előnyöket biztosítanak azzal szemben, ha csak a trombopoietint használjuk.

Emellett a jelen találmány szerinti oligopeptidek nagy potenciált és hatékonyságot mutatnak, azaz a nM - μΜ tartományban aktívak. A jelen találmány szerinti oligopeptideket használhatjuk ömagukban, vagy a trombopoietinnel kombinálva. A trombopoietinnel ellentétben a jelen találmány szerinti oligopeptidek nem eredményezik a trombopoietin receptor elnyomását, és ezzel nem eredményezik a csökkent trombopoietin érzékenységet. Ezzel szemben az exogén trombopoietin beadása eredményezhet ilyen receptor-elnyomást, és ezáltal csökkenti az érzékenység

-11vagy a tolerancia indukálását. A jelen találmány szerinti oligopeptidek emellett nagyon szelektívek a trombopoietin receptorra, és például nem mutatnak keresztreaktivitást a szoros rokonságban álló eritropoietin receptorral.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek teljesen máshol kötődnek a trombopoietin receptorhoz, mint a trombopoietin. A jelen találmány szerinti oligopeptidek nem zavarják a trombopoietin megkötődését, hanem mindkét komponens képes ugyanahhoz a receptor-molekulához kötődni. Aktivitás szempontjából ezek a kötési tulajdonságok szinergisztikus akciót eredményeznek a trombopoietin és a jelen találmány szerinti oligopeptidek között, amit a sejt-szignál esszékben lehet megfigyelni, amikben a jelen találmány szerinti oligopeptid és a trombopoietin, ha csak önmagában, szubmaximális koncentrációban használjuk, akkor csak körülbelül 20%-át adja annak a maximális szignálnak amit a szubsztrát foszforilezésnél lehet mérni, de együtt, ugyanabban a koncentrációban maximális szignált adnak. A jelen találmány szerinti oligopeptidek visszafordítják a trombopoietin receptor elfojtását, ha csak trombopoietint adunk nagy koncentrációban. Ha a jelen találmány szerinti oligopeptideket nagy koncentrációjú trombopoietinhez adjuk, akkor ez a trombopoietin receptor szignál transzdukcióját eredményezi. A trombopoietin receptorhoz való specifikus kötődése révén a jelen találmány szerinti oligopeptidek képesek olyan receptor konformációt indukálni, ami előnyös a kötődéshez, és ezzel aktiválják a szubsztrátokat a szignál bioszintézis útban. Tehát a jelen találmány szerinti oligo

-12- .· j.

peptidek, amellett, hogy saját agonista hatásuk van a trombopoietin receptor szignál-bioszintézis útjára, ha együtt adjuk őket a természetes trombopoietin hormonnal, akkor ez kiszélesíti a trombopoietin aktivitását, szubmaximális koncentrációban szinergikusan hat a trombopoietinnel, és visszafordítja a „harang alakú” görbe hatást magas hormon koncentrációban.

A jelen találmányból az is kiderül, hogy a vad-típusú TPORp-nek olyan aktivitásai is vannak, amik jól használhatók arra, hogy specifikusan kezeljünk vele hematológiai rendellenességeket, főleg trombocitopéniát. Tehát úgy tűnik, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptidek, valamint a vad-típusú TPO-Rp különösen jól használható a diagnosztizálásban, és pontosabban a hematológiai rendellenességek kezelésében, például a vérlemezke rendellenességek által okozott betegségekben, és a trombocitopénia összes különböző típusában, akár önmagában, akár trombopoietinnel vagy vérlemezkékkel együtt. Kis méretük, és a gyógyászati készítményekben tanúsított nagy stabilitásuk miatt a jelen találmány szerinti oligopeptidek azért is előnyösek, mert többek között lehetővé teszik orális alkalmazásukat. Emellett in vivo is nagy stabilitást mutatnak.

Anélkül hogy bármilyen elmélethez ragaszkodnánk, úgy tűnik, mintha a jelen találmány szerinti oligopeptidek többek között modulálnák a trombopoietin receptor aktivitásokat is. Nevezetesen, a trombopoietin kötődése a receptor dimerizációját eredményezi, valamint az intracelluláris szignál bioszintézis utak aktiválását. Ennek az eseménynek a során a JAK kináz családok

(JAK2 és Tyk2) receptorhoz kötődő kinázainak specifikus foszforilezése, majd ezután a STAT5 transzkripciós faktor foszforilezése és dimerizációja játszódik le. Az aktivált STAT5 fehérje belép a sejtmagba, és kötődik a megcélzott gének promoter régiójához, ezzel stimulálva a sejt proliferizációt és fokozva a vérlemezkeszámot. Azonban, bár az előzőkben említett vad-típusú hatásmechanizmus érvényes lehet a jelen találmány szerinti oligopeptidek esetében is, az nem zárható ki, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptidek eltérő módon hatnak, azaz például a receptor monomerhez kapcsolódva, és ezzel utánozva a receptor második láncát, vagy a receptornak ahhoz a pontjához kötődnek, amihez a természetes trombopoietin nem kötődik. Valójában úgy tűnik, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptidek más helyen hatnak, mint a természetes trombopoietin.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a vad-típusú TPORp-nek egy Y14F szubsztitúciós mutánsa, azaz egy vad-típusú TPO-Rp amiben a TPO-Rp 14-es pozíciójában levő tirozint fenilalanin helyettesíti. Egy ilyen módosított peptid különösen értékesnek bizonyulhat például peptid degradációs vizsgálatok elvégzéséhez, mivel egy ilyen peptid specifikusan jódozható az N-terminálisán vagy a C-terminálisán.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek és a vad-típusú TPO-Rp jól használható a trombopoietin által előidézett betegségek megelőzésére és kezelésére, különösen a hematológiai rendellenességek, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vérlemezke rendellenességeket és az allergiás reak-14ciókból, kemoterápiából, besugárzásos kezelésből vagy csontvelő transzfúzióból származó trombocitopéniát, vagy az idiopátiás trombocitopéniát. így a jelen találmány tárgya továbbá eljárás az előzőkben említett rendellenesség kezelésére, amiben egy beteg olyan rendellenességben szenved, ami érzékeny egy TPO-R-t moduláló vegyülettel való kezelésre, pontosabban egy trombopoietin antagonistát kap, vagy azt adnak be neki, a jelen találmány szerinti oligopeptid és/vagy a vad-típusú TPO-Rp terápiásán hatékony dózisát vagy mennyiségét adva be.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a gyógyászati készítmények, amik egyet vagy többet tartalmaznak az itt ismertetett oligopeptidekből és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-ből, valamint tartalmaznak egy fiziológiásán elfogadható hordozót. Ezek a gyógyászati készítmények különböző kiszerelési formában lehetnek, azaz például orális dózisformájúak, inhalálható por formájúak, valamint oldatok és injekciózható, infundálható oldatok is lehetnek.

A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint egy ilyan készítmény és módszer tartalmazza a trombopoietin használatát a vad-típusú TPO-Rp-vel és/vagy a jelen találmány szerinti oligopeptidekkel kombinálva.

Az alábbi definíciókat azért adjuk meg, hogy illusztráljuk és definiáljuk a jelen találmány leírása során használt különböző szakkifejezések értelmét és érvényességi körét.

A „transzformáció” vagy „transzfekció” szakkifejezés azt jelenti, hogy egy gazdasejtet úgy kezelünk, hogy tartalmazza a

-15kívánt nukleinsav molekulát, beleértve vagy egy természetes TPO-Rp nukleotid szekvenciát, vagy egy olyan nukleotid szekvenciát, ami olyan, jelen találmány szerinti oligopeptideket kódol, amik eredetileg nem képezik a sejt részét, vagy a nukleinsav szekvenciák nem a természetes helyükön, kópiaszámban vagy orientációban vannak, a szakterületen jól ismert módszereket használva.

A „működés szempontjából kapcsolt” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy egy gén és legalább egy szabályozó-szekvencia értelmes vagy antiszensz expresszióhoz vannak összekapcsolva, oly módon, hogy lehetővé teszik a gén expresszióját, ha a megfelelő molekulák (azaz például transzkripciós aktivátor fehérjék) kötődnek a szabályozó-szekvenciához.

A „vektor” szakkifejezés egy rekombináns DNS konstrukciót jelent, ami lehet plazmid, vírus, vagy autonóm módon replikálódó szekvencia, fág vagy nukleotid szekvencia, lineáris vagy cirkuláris, egyláncú vagy kétláncú DNS vagy RNS, ami bármilyen forrásból származik, amiben számos nukleotid szekvenciát kapcsoltunk vagy rekombináltunk egy egyedi konstrukcióba, ami képes bejuttatni egy sejtbe egy promoter fragmenst és DNS szekvenciát egy kiválasztott géntermékhez, értelmes vagy antiszensz orientációban, egy megfelelő 3' nem-transzlálódó szekvenciával együtt.

A „plazmidok” olyan genetikai elemek, amik stabilan öröklődnek, anélkül hogy gazdasejtjük kromoszómájának részét képeznék. Lehetnek DNS-ből vagy RNS-ből, vagy lehetnek lineári

-16sak vagy cirkulárisak. A plazmidok olyan molekulákat kódolnak, amik biztosítják replikációjukat és stabil öröklődésüket a sejt replikációja során, és jelentős orvosi, mezőgazdasági és környezetvédelmi fontosságú termékeket kódolhatnak. Emellett kódolhatnak antibiotikum rezisztenciát biztosító géneket is. A plazmidokat széles körben használják a molekuláris biológiában, vektorként, hogy rekombináns géneket klónozzanak és expresszáljanak. Az itt ismertetett kiindulási plazmidok vagy kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, vagy bárki számára hozzáférhetők, vagy a hozzáférhető plazmidokból jól ismert, publikált eljárások rutinszerű alkalmazásával előállíthatok. Számos plazmid, és más, a jelen találmány szerint használható klónozó és expressziós vektor jól ismert, és könnyen beszerezhető a szakterületen jártas szakember számára. Emellett, a szakterületen jártas szakemberek könnyen konstruálhatnak bármilyen számú más plazmidot is, amik alkalmasak a jelen találmányban való alkalmazásra. Az ilyen plazmidok, és más vektorok tulajdonságai, konstrukciója és használata a jelen találmányban gyorsan nyilvánvaló a leírásból a szakterületen jártas szakember számára.

A „gazdasejt” szakkifejezés egy olyan sejtre utal, ami genetikailag módosítva van, egy kiméra, heterológ vagy autológ nukleinsav szekvencia bevitelével, illetve ennek utódai, amik még hordozzák ezt a szekvenciát. Az ilyen sejteket „transzgenikus sejteknek” is nevezik. Egy autológ nukleinsav szekvencia bejuttatása esetében a szekvencia a gazdasejtben nagyobb kópia

-17számban, más genetikai környezetben, vagy más orientációban lesz, mint amilyenben természetes körülmények között előfordul.

A „szilárd hordozó” szakkifejezés jelentése egy oldhatatlan hordozó, ami lehet biológiai természetű is, azaz például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egy sejt vagy egy bakteriofág részecske, vagy lehet szintetikus, azaz például anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, akrilamid származék, cellulóz, nylon, szilikát és mágnesezett részecskék, amikhez az oldható molekulák köthetők vagy kapcsolhatók.

Az „ellenanyag” szakkifejezés jelentése egy polipeptid, amit lényegében egy immunglobulin gén vagy immunglobulin gének kódolnak, vagy ezek fragmensei, ami specifikusan kötődik egy analizálandó molekulához, és felismeri azt (antigén). Az ismert immunglobulin gének közé tartoznak a kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epszilon és nu konstans régió gének, valamint végtelen sok immunglobulin variábilis régió gén. Az ellenanyagok léteznek például intakt immunglobulinokként, vagy számos különböző jól jellemzett fragmensként, amiket a különböző peptidázokkal való emésztéssel lehet előállítani. Az „ellenanyag” szakkifejezés vonatkozik módosított ellenanyagokra is (azaz például oligomer, redukált, oxidált és jelzett ellenanyagokra). Az „ellenanyag” szakkifejezés, amint a továbbiakban használjuk, vonatkozik ellenanyag fragmensekre is, amiket vagy teljes ellenanyagok módosításával, vagy rekombináns DNS módszerek használatával de novo szintetizálunk. Az „ellenanyag” szakkifejezés vonatkozik intakt molekulákra, valamint ezek fragmenseire is, azaz például

-18a Fab-ra, a F(ab')₂-re és az Fv-re, amik képesek kötődni az epitop determinánshoz. Ezek az ellenanyag fragmensek megtartanak valamennyit abból a képességükből, hogy szelektíve kötődnek az antigénjükhöz vagy receptorukhoz, és definíciójuk az alábbi:

1) Fab, egy ellenanyag molekula olyan fragmense, ami tartalmazza egy ellenanyag molekulának egy monovalens antigén-kötő fragmensét, és a teljes ellenanyag papainos emésztésével lehet előállítani, ezzel egy intakt könnyű láncot lehet előállítani, valamint egy nehéz lánc egy részét;

2) Fab', egy ellenanyag molekula olyan fragmense, amit úgy állíthatunk elő, hogy a teljes ellenanyagot pepszinnel kezeljük, majd redukáljuk, így kapunk egy érintetlen könnyű láncot és a nehéz lánc egy részét; egy ellenanyag molekulából két Fab' fragmenst kapunk;

3) (Fab')₂; az ellenanyagnak az a fragmense, amit úgy lehet megkapni, hogy a teljes ellenanyagot kezeljük pepszin enzimmel, de utána nincs redukció; a (Fab')₂ két Fab' fragmens dimerje, amit két diszulfid-híd tart össze;

4) Fv, amit úgy definiálnak, mint egy génsebészetileg módosított fragmenst, ami tartalmazza a könnyű lánc variábilis régióját és a nehéz lánc variábilis régióját, két láncban expresszálva; és

5) Egyláncú ellenanyag („SCA”), amit úgy definiálnak, mint egy génsebészetileg módosított molekulát, ami tartalmazza a könnyű lánc variábilis régióját, a nehéz lánc va

-19riábilis régióját, és ezeket egy megfelelő polipeptid linker kapcsolja össze egy genetikailag fuzionált egyláncú molekulává.

Ezeknek a fragmenseknek az előállítási módszerei a szakterületen ismertek [például: Harlow és mtsai: „Antibodies: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)].

Amint ebben a leírásban alkalmazzuk, az „epitop” szakkifejezés egy antigénen bármilyen antigén determinánst jelent, amihez az ellenanyag paratopja kötődik. Az epitop determinánsok általában tartalmazzák molekulák, azaz például aminosavak vagy cukor oldalláncok, kémiailag aktív sejtfelszíni csoportosulásait és általában specifikus háromdimenziós strukturális jellemzőik és specifikus töltés jellemzőik vannak.

A jelen találmány szerinti fehérjék elleni monoklonális ellenanyagokat, valamint ezek fragmenseit a szakterületen jártas szakember könnyen előállíthatja. A monoklonális ellenanyagok hibridóma technológiával való előállításának általános módszertana jól ismert. Sejtfúzióval, valamint más technikákkal, azaz például B-limfociták onkogén DNS-sel való közvetlen transzformációjával, vagy Epstein-Barr vírussal való transzfekcióval örökéletű ellenanyag-termelő sejtvonalak állíthatók elő [M. Scheier és mtsai: „Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling és mtsai: „Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981); Kennett és mtsai: „Monoclonal Antibodies” (1981); lásd még a 4,341,761; 5,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917;

-204,472,500; 4,491,632 és 4,493,890 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást. A számunkra érdekes fehérje, pontosabban a TPO-Rp, vagy a jelen találmány szerinti oligopeptidek, vagy ezek fragmensei ellen készített monoklonális ellenanyagok paneljei számos különböző tulajdonságuk alapján vizsgálhatók át; azaz az izotípus, az epitop, az affinitás, stb. alapján. Egy másik változat szerint a számunkra érdekes monoklonális ellenanyagokat kódoló gének a szakterületen ismert polimeráz láncreakciós technikával izolálhatok a hibridómákból, és a megfelelő vektorokban klónozhatok, valamint expresszáltathatók. A monoklonális ellenanyagok jól használhatók a tisztításban, az egyes fehérjéket - amik ellen irányulnak - használó immunaffinitási technikákat használva. A jelen találmány szerinti ellenanyagok, attól függetlenül, hogy poliklonálisak, vagy monoklonálisak, további használhatósággal is rendelkeznak, amennyiben használhatók reagensként az immunesszékben, radioimmunesszében, enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatban és hasonlókban. Emellett használhatók arra is, hogy kimutassuk és/vagy izoláljuk a jelen találmány szerinti oligopeptideket a sejtkivonatokból vagy sejtekből. Az ellenanyagokat használhatjuk például egy szövettenyészet alapú esszé létrehozására, hogy kimutassunk vagy módosítsunk új vegyületeket, amik módosítják a TPO-R aktivitását, például utánozzák a trombopoietin aktivitását.

A humanizált vagy kiméra ellenanyagok tartalmazhatnak két különböző fajból (azaz például humán konstans régióból és rágcsáló kötő régióból) származó részeket. A két különböző fajból

-21származó részeket vagy kémiailag, hagyományos technikákkal kapcsolhatjuk össze, vagy előállíthatok egyetlen fúziós fehérjeként, génsebészeti technikákat alkalmazva. A kiméra ellenanyag mindkét részének fehérjéit kódoló DNS expresszáltatható egyetlen fúziós fehérjeként.

Egy ellenanyag „specifikusan kötődik” vagy „specifikus immunreakcióba lép” egy fehérjével, ha az ellenanyag működik egy kötési reakcióban, ami meghatározza a fehérje jelenlétét fehérjék és más biológiai eredetű anyagok egy heterogén populációjában. Tehát a megnevezett immunesszé körülmények között a specifikált ellenanyagok preferenciálisan kötődnek egy adott fehérjéhez, és nem kötődnek szignifikáns mennyiségben más, a példában jelenlevő fehérjékhez. Egy fehérjéhez való specifikus kötődéshez ilyen körülmények között olyan ellenanyagra van szükség, amit egy bizonyos fehérjével szemben tanúsított specifitása alapján választunk ki. Számos különböző immunesszé formátum használható olyan ellenanyagok kiválasztására, amik specifikus immunreaktivitást mutatnak egy bizonyos fehérjével. Például a szilárd fázisú ELISA immunesszéket rutinszerűen használják olyan monoklonális ellenanyagok szelektálására, amik specifikus immunreaktivitást mutatnak egy fehérjével [lásd Harlow és mtsai: „Antibodies: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)], amely publikációban olyan immunesszé formákat és körülményeket írnak le, amik használhatók a specifikus immunreaktivitás meghatározására.

-22Az „immunesszé” szakkifejezés egy olyan esszére vonatkozik, ami egy ellenanyagot vagy egy antigént használ arra, hogy specifikusan kötődjön egy elemzendő anyaghoz, ami szintén lehet ellenanyag vagy antigén. Az immunesszét jellemzi továbbá egy adott ellenanyag specifikus kötési tulajdonságainak használata, hogy kimutassuk, izoláljuk, megcélozzuk és/vagy mennyiségileg meghatározzuk az elemzendő anyagot. Az ellenanyag és az antigén is jelezhető, hogy lehetővé tegyük a kimutatást.

A jelen találmány szövegösszefüggésében a „kezelés” szakkifejezés egy gyógyszer hatóanyag vagy gyógyszer profilaktikus és/vagy terápiás hatására, amit viszont úgy határozunk meg, mint olyan készítményt, ami tartalmaz egy gyógyászatilag vagy diagnosztikailag hatékony vegyületet legalább egy adalékanyaggal, azaz például hordozóval kombinálva.

Az „agonista” szakkifejezés egy olyan biológiailag aktív ligandumra vonatkozik, ami kötődik a komplementer, biológiailag aktív receptorához, és az utóbbit aktiválja, akár úgy, hogy kiváltsa a biológiai választ, akár úgy, hogy fokozza a receptor már létező, meglevő biológiai aktivitását. Egy trombopoietin agonista kötődik a trombopoietin receptorhoz (TPO-R). A trombopoietin agonista működhet trombopoietint utánzó anyagként is. Azonban a trombopoietin agonista aktiválhatja is, vagy hozzájárulhat a TPO-R aktiválásához, olyan kötési helyeket vagy mechanizmusokat használva, amik eltérnek a trombopoietinétől.

Az „antagonista” szakkifejezés egy olyan biológiailag aktív ligandumra vonatkozik, ami kötődik a komplementer biológiailag

-23aktív receptorhoz, és elnyomja, csökkenti vagy eltörli a TPO-R aktivitását, például olyan kötési helyekkel vagy mechanizmusokkal, amik eltérnek, vagy hasonlóak a trombopoietinéhez.

A „gyógyászatilag elfogadható sók” szakkifejezés az általánosan használt nem-toxikus alkálifémekre, alkáli földfémekre és ammóniumsókra vonatkozik, beleértve az ammonium-, bárium-, kalcium-, lítium-, magnézium-, kálium-, protamin cinksókat és nátrium-sókat, amiket a szakterületen ismert módszerekkel állítanak elő. A szakkifejezés vonatkozik nem-toxikus, azaz gyógyászatilag elfogadható savaddiciós sókra is, amiket általában úgy állítanak elő, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptideket egy megfelelő szerves vagy szervetlen savval, azaz például acetáttal, benzoáttal, biszulfáttal, boráttal, citráttal, fumaráttal, hidrobromiddal, hidrokloriddal, laktáttal, laureáttal, maleáttal, napszilát tal, oleáttal, oxaláttal, foszfáttal, szukcináttal, szulfáttal, tartaráttal, toziláttal, valeráttal, stb. reagáltatjuk.

A „gyógyászatilag elfogadható savaddiciós só” szakkifejezés olyan sókra vonatkozik, amik megtartják a szabad bázisok hatékonyságát és tulajdonságait, és emellett biológiailag vagy más szempontból nem előnytelenek, és szervetlen savakkal, azaz például hidrogénbromiddal, hidrogénkloriddal, salétromsavval, foszforsavval, kénsavval, valamint szerves savakkal, azaz például ecetsavval, benzoesawal, fahéjsavval, citromsavval, etánszulfonsawal, fumársawal, glikolsawal, maleinsawal, metánszulfonsawal, oxálsawal, propionsawal, p-toluol-szulfonsawal, piroszőlősawal, szalicil savval, borostyánkősavval, borkősavval, stb.

-24A „gyógyászatilag elfogadható észter” szakkifejezés olyan észterekre vonatkozik, amik az észterkötés hidrolízise után megtartják komponenseik, nevezetesen a karbonsav vagy az alkohol biológiai hatékonyságát és tulajdonságait, és biológiailag vagy másképpen nem előnytelenek. A jelen találmányban megfontoljuk azoknak a készítményeknek a használatát, amik egyszerre észterek, az előzőkben ismertetett módon, és ugyanakkor azok gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói is.

A jelen találmány szerinti sókat úgy kaphatjuk meg, hogy a szabad oligopeptidet vizes vagy vizes/alkoholos oldószerben vagy más megfelelő oldószerben feloldjuk egy megfelelő bázissal, majd izoláljuk a kapott, jelen találmány szerinti sót, az oldószer bepárlásával, vagy fagyasztással és liofilezéssel, vagy más oldószer, azaz például dietiléter, vizes és/vagy alkoholos oldatnak az oligopeptid oldathoz való hozzáadásával, beleértve az oldhatatlan nyers só elválasztását. A sóképzéshez általában egy, vagy maximum két mól bázist, azaz kationt, és egy mól szabad oligopeptidet használunk. Az alkáli oligopeptid sók készítéséhez előnyösen alkálifém karbonátokat vagy hidrogénkarbonátokat használunk. A készített peptidsók szabadon oldódnak vízben. Tehát a jelen találmány tárgya továbbá eljárás az oligopeptid sók előállítására.

A jelen találmány szövegösszefüggésében bázisnak tekintjük azt az anyagot, ami képes kationt képezni egy oldatban, főleg vizes és vizes/alkoholos oldatban.

-25A „gyógyászatilag elfogadható amid” szakkifejezés olyan amidokra vonatkozik, amik az amidkötés hidrolízise után megtartják komponenseik, nevezetesen a karbonsav vagy az amin biológiai hatékonyságát és tulajdonságait, és biológiailag vagy másképpen nem előnytelenek. Ezek az amidok tipikus esetbenben a megfelelő karbonsavból és egy aminból készülnek. A jelen találmányban megfontoljuk azoknak a készítményeknek a használatát, amik egyszerre amidok, az előzőkben ismertetett módon, és ugyanakkor azok gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói is.

A gyógyászatilag elfogadható észterek és amidok készítési technikáit ismertetik a szakirodalomban [March Advanced Organic Chemistry, 3. kiadás, 1152. oldal, John Wiley and Sons, New York (1985)]. Az elő-gyógyszerekként használható gyógyászatilag elfogadható észtereket és amidokat a szakirodalomban ismertetik [Bundgaard, H. (szerk.): Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)].

A „gyógyászatilag vagy terápiásán elfogadható hordozó” szakkifejezés egy olyan hordozó anyagra vonatkozik, ami nem zavarja az aktív adalékanyagok biológiai aktivitásának hatékonyságát, és nem toxikus a gazdaszervezetre vagy a betegre.

A „terápiásán vagy gyógyászatilag hatékony mennyiség” szakkifejezés a jelen találmány szerinti oligopeptidekre és készítményekre vonatkoztatva a készítményben levő oligopeptid olyan mennyiségére vonatkozik, ami elég ahhoz, hogy a kívánt biológiai eredményt indukálja. Az említett eredmény lehet a betegség

-26jeleinek, a tüneteknek vagy okainak enyhítése, vagy a biológiai rendszerek más kívánt megváltozása. A jelen találmányban az eredmény például egy különösen előnyben részesített megvalósítási mód szerint egy trombopoietint utánzó aktivitás, nevezetesen a trombocitopénia tünetek szelektív megelőzése, eltörlése és/vagy csökkentése, például a vérlemezke-számok növelése, és/vagy a vérlemezke-szám csökkenésének megakadályozása.

A jelen találmány szerinti oligopeptidekben az aminosav csoportokat a hagyományoknak megfelelően az alábbiak szerint rövidítjük: a fenilalanin jelzése Phe vagy F; a leucin jelzése Leu vagy L; az izoleucin jelzése He vagy I; a metionin jelzése Met vagy M; a valin jelzése Val vagy V; a szerin jelzése Ser vagy S; a prolin jelzése Pro vagy P; a treonin jelzése Thr vagy T; az alanin jelzése Alá vagy A; a tirozin jelzése Tyr vagy Y; a hisztidin jelzése His vagy H; a glutamin jelzése Gin vagy Q; az aszparagin jelzése Asn vagy N; a lizin jelzése Lys vagy K; az aszparaginsav jelzése Asp vagy D; a glutaminsav jelzése Glu vagy E; a cisztein jelzése Cys vagy C; a triptofán jelzése Trp vagy W; az arginin jelzése Arg vagy R; és a glcin jelzése Gly vagy G.

így például az A R G jelentése egy folyamatos szakasz, azaz egy tripeptid, ami alanint, arginint és glicint tartalmaz, míg a R A R jelentése arginin, alanin és arginin egybefüggő szakasza.

A jelen találmány nemcsak az 1-6. számú szekvenciavázlaton említett oligopeptidekre vonatkozik, hanem ezek biológiai ekvivalenseire is, azaz például az olyan anyagokra, amiknek eltér a struktúrájuk, de hasonló vagy összehasonlítható biológiai

-27hatást mutatnak, főleg ezek származékai, amiknek hasonló vagy összehasonlítható struktúrájuk és/vagy funkciójuk van, és TPOR modulátorként is működnek. Ezek a biológiai ekvivalensek, pontosabban származékok eltérhetnek a jelen találmány szerinti oligopeptidektől a hidrolízisre vagy proteolízisra való érzékenységük, és/vagy más biológiai tulajdonságaik alapján, azaz például a trombopoietin receptorhoz való megnövekedett affinitásuk alapján. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik továbbá a jelen találmány szerinti oligopeptidek gyógyászatilag elfogadható sói, amidjai vagy észterei.

Emellett, a csak természetes körülmények között előforduló aminosavakat tartalmazó oligopeptidek mellett a jelen találmány tárgyát peptidomimetikumok és peptid-analógok is képezik. A peptid-analógokat általánosan használják nem-peptid gyógyszerekként, amiknek a tulajdonságaik analógok a templát peptidével. A nem-peptid vegyületeknek ezt a típusát „peptid mimetikumoknak” vagy „peptidomimetikumoknak” nevezik. A peptid mimetikumokat, amik szerkezetileg hasonlóak a terápiásán használható peptidekhez, használhatjuk egy ekvivalens, vagy egy javított terápiás vagy profilaktikus tulajdonságokkal rendelkező molekula előállítására. A peptidomimetikumok általában szerkezetileg hasonlítanak egy paradigma polipeptidhez (azaz egy olyan polipeptidhez, ami biológiai vagy farmakológiai aktivitással rendelkezik), azaz természetben előforduló receptor-kötő polipeptidhez, de egy vagy több peptidkötésüket az alábbi csoportból választható kötéssel helyettesíthetjük: -CH2-NH-NH-, -C-CH2-S-,

-28-CH₂-CH₂-, CH-CH- (cisz és transz), -COCH2-, -CH(OH)-CH₂- és -CH2-SO-, a szakterületen jól ismert módszerekkel. Egy különösen előnyben részesített nem-peptid kötés a -CH₂-NH- kötés. Az ilyen peptidomimetikumoknak szignifikáns előnyeik lehetnek a különböző polipeptidekkel szemben, beleértve például a következőket: javított kémiai stabilitás, erősebb farmakológiai tulajdonságok (felezési idő, abszorpció, potenciál, hatékonyság, stb.), gazdaságosabb előállítás, megváltoztatott specificitás (azaz például a biológiai aktivitás széles spektruma), a csökkent antigenicitás, stb. A peptidomimetikumok jelölése általában magában foglalja egy vagy több jelzésnek a kovalens kötéssel való kapcsolását, közvetlenül, vagy egy karon, azaz például egy amidcsoporton keresztül a peptidomimetikumnak nem-interferáló pozícióihoz, amiket a mennyiség szerkezet-hatás adatok és/vagy a molekuláris modellezés alapján lehet megjósolni. Az ilyen, nem-interferáló pozíciók általában olyan pozíciók, amik nem alakítanak ki közvetlen kontaktusokat a makromolekulákkal, azaz például az immunglobulin szupercsalád molekulákkal, amikhez a peptidomimetikum kötődik, a terápiás hatás létrehozása céljából. A származékképzés, azaz például a peptidomimetikumok jelölése nem szabad hogy jelentősen zavarja a peptidomimetikum kívánt biológiai vagy farmakológiai aktivitását. A receptor-kötő peptid peptidomimetikumai általában nagy affinitással kötődnek a receptorhoz, és kimutatható biológiai aktivitással rendelkeznek, azaz egy vagy több, receptor által közvetített fenotípusos változás agonistái vagy antagonistái.

-29A jelen találmány szövegösszefüggésében egy vagy több Laminosav azonos típusú D-aminosawal való helyettesítése (azaz például D-lizin az L-lizin helyett) használható stabilabb peptidek előállítására.

Emellett a jelen találmány tárgyát olyan oligopeptidek képezik, amik a fenti általános képlettel azonosított konszenzus szekvenciát, vagy egy lényegében azonos konszenzus szekvencia-variációt tartalmaznak, amit a szakterületen ismert módszerrel lehet előállítani, például belső cisztein-csoportokat adva a molekulához, amik képesek intramolekuláris diszulfid-hidakat képezni, ezzel ciklizálva a peptidet.

A jelen találmány nemcsak az előzőkben említett peptidek linearizált formáira vonatkozik, hanem természetesen vonatkozik a ciklizált oligopeptidekre is, például az első és az utolsó aminosav közötti amidkötés révén ciklizált oligopeptidekre.

A „szintetikus vagy nem-természetes körülmények között előforduló aminosavak” szakkifejezés olyan aminosavakra vonatkozik, ami természetes körülmények között nem fordul elő in vivo, de ennek ellenére beépíthető a jelen találmány szerinti oligopeptidbe. Más, előnyben részesített szintetikus aminosav lehet olyan aminosav, amiben az aminocsoportot a karboxicsoporttól egynél több szénatom választja el, azaz lehet például β-alanin vagy γ-aminovajsav. A különösen előnyös szintetikus aminosavak közé tartoznak a természetes L-aminosavaknak megfelelő D-aminosavak, az L-l-naftilalanin, az L-2-naftilalanin, az L-ciklohexil-30alanin, L-2-amino-izovajsav, valamint a metionin szulfoxid és szulfon származékai.

A „kimutatható jelölés” olyan anyagokra utal, amik, ha kovalens kötéssel kapcsolódnak a jelen találmány szerinti oligopeptidekhez, oligopeptid mimetikumokhoz és/vagy ellenanyagokhoz, akkor lehetővé teszik az oligopeptid és az oligopeptid mimetikum in vivo kimutatását a rendszerben, például abban a páciensben, akibe az oligopeptidet vagy az oligopeptid mimetikumot beadták, vagy lehetővé teszi az in vitro kimutatást.

A megfelelő kimutatható jelölések jól ismertek a szakterületen, ide tartoznak például a radioaktív izotópok és a fluoreszcens jelölések (azaz például a fluoreszcein).

A kimutatható jelölés kovalens kötéssel való kapcsolását az oligopeptidhez vagy oligopeptid mimetikumhoz a szakterületen jól ismert módszerrel végezhetjük el. Ha például a ¹²⁵I radioaktív izotópot használjuk kimutatható jelölésként, akkor a ¹²⁵I kovalens kötéssel való kapcsolását az oligopeptidhez vagy az oligopeptid mimetikumhoz úgy érhetjük el, hogy az oligopeptidbe vagy az oligopeptid mimetikumba tirozin aminosavat építünk be, majd megjódozzuk az oligopeptidet. Emellett ³²P-t is beépíthetünk az oligopeptidbe vagy az oligopeptid mimetikumba foszfátcsoport formában, például a peptid vagy peptidomimetikum hidroxi-csoportján keresztül.

A jelen találmány szerinti oligopeptideket a szakterületen ismert hagyományos módszerekkel állíthatjuk elő, például standard szilárd fázisú technikák alkalmazásával. A standard mód

-31szerek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az exkluzív szilárd fázisú szintézis, a részleges szilárd fázisú szintézis módszerek, a fragmens kondenzáció, a klasszikus oldatban végzett szintézis, és a rekombináns DNS technológia. A jelen találmány szerinti oligopeptideket tehát előállíthatjuk közvetlenül, rekombináns DNS módszerekkel is [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], vagy fúziós fehérje formájában, például olyan fehérje formájában, ami egy specifikus kötő pár egyik tagja, ami lehetővé teszi a fúziós fehérje affinitás-reagensekkel való tisztítását, utána pedig proteolitikus hasítást végezve, általában egy olyan pontban, amit azért építettünk be, hogy megkapjuk a kívánt peptidet.

Az oligopeptideket meghosszabbíthatjuk, hogy megfelelő kötőhelyeket kapjunk, azaz például ciszteinnel vagy lizinnel, hogy fokozzuk a stabilitását, hogy kötődjön egy adott receptorhoz, hogy helyspecifikus hatást biztosítsunk, hogy egyszerűbb tisztítást biztosítsunk, hogy megváltoztassuk a fizikai jellemzőket (azaz például az oldhatóságot, a töltést, stb.), hogy stabilizáljuk a konformációt, stb. Az oligopeptideket kapcsolhatjuk nem-vad-típusú határoló régiókhoz fúziós fehérjékként, összekapcsolhatjuk kapcsoló csoportokkal vagy kovalens kötéssel összeköthetjük ciszteinen keresztül (diszulíid), vagy peptidkötésekkel. Az oligopeptid számos különböző bifunkciós ágensen keresztül kapcsolható, azaz például maleimidobenzoesavon, metilditioecetsavon, merkaptobenzoesavon, S-piridil ditiopropionáton, stb. ke

-32resztül. Az oligopeptideket kapcsolhatjuk egyetlen aminosavhoz is egy aminosavlánc C-terminálisán vagy N-terminálisán, vagy kapcsolhatjuk a belsejébe is. A jelen találmány szerinti oligopeptideket például kapcsolhatjuk kovalens kötéssel egy immunogén fehérjéhez, azaz például fúrókagyló hemocianinhoz, ovalbuminhoz, stb., hogy megkönnyítsük a szóban forgó oligopeptidek elleni ellenanyag termelődését.

A jelen találmány szerinti oligopeptideket expresszáltathatjuk más peptidekkel vagy fehérjékkel együtt, azaz például úgy, hogy egy lánc részét képezzék, akár annak belsejében, akár annak N-terminálisán vagy C-terminálisán. Az ilyen fúzionált oligopeptidet fúziós vagy konjugátum pepiidnek nevezik. Különböző poszt-expressziós módosításokat hajthatunk végre, beleértve a glikozilezéseket is. Ha például a megfelelő kódoló szekvenciákat használjuk, akkor biztosíthatunk farnezilezést vagy prenilezést, oly módon, hogy a szóban forgó peptid az egyik végén egy lipid csoporthoz kapcsolódik, és képes integrálódni egy lipid membránba, azaz például egy liposzómába. A jelen találmány szerinti oligopeptidek lehetnek pegilezve, aholis a polietilénoxi csoport hosszabb élettartamot biztosít a véráramban. A jelen találmány szerinti oligopeptidek kötődhetnek szérumfehérjéhez is, például albuminokhoz. Az oligopeptidek kombinálódhatnak fehérje-fúzióval, vagy egy másik fehérjével vagy fehérjéhez való asszociációval, azaz például az Fc vagy IgG izotípusúval, hogy fokozzuk a komplement kötődést, vagy egy toxinnal, azaz például ricinnel, abrinnal, diftéria toxinnal vagy hasonlókkal, főleg az A-lánccal.

-33- ♦ .8 μ • *·· w « ·* « ··* ·* *

Az oligopeptidek kötődhetnek ellenanyagokhoz, a helyspecifikus hatás érdekében. A jelen találmány tárgyát tehát konjugátum peptidek is képezik, amik például a jelen találmány szerinti oligopeptideket tartalmaznak.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek szolgálhatnak szerkezeti modellként a nem-peptid vegyületek számára, amiknek viszont hasonló a biológiai aktivitásuk. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy számos különböző technika található olyan vegyületek előállítására, amik azonos, vagy hasonló, kívánt biológiai aktivitással rendelkeznek, de előnyösebb az aktivitásuk mint a lead-vegyületé, az oldhatóság, a stabilitás és a hidrolízissel és proteolízissel szembeni érzékenység alapján. Az ilyen technikák közé tartozik a peptid gerincének helyettesítése egy foszfátokból, amidokból, karbonátokból, szulfonamidokból, szekunder aminokból és N-metilamino savakból álló gerinccel.

Tehát a jelen találmány tárgya továbbá a jelen találmány szerinti oligopeptidek előállítása rekombináns DNS technikákkal.

Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát az 1-7. számú szekvenciavázlaton megadott oligopeptideket kódoló nukleotid szekvenciák képezik, amik a genetikai kód degenerációja következtében több mint hat nukleotid szekvenciát eredményeznek. Természetesen a jelen találmány tárgyát képezik továbbá az előzőkben említett nukleotid szekvenciák, amik el vannak mutáltatva, például nukleotid addícióval, delécióval, inszercióval vagy inverzióval, mindaddig, amíg a kódolt polipeptid a jelen találmány szerinti kívánt TPO-R modulátor aktivitással rendelkezik.

«·-* '·* ««V

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a vektorok, amik az előzőkben említett nukleotid szekvenciákat tartalmazzák, és amiket hagyományos anyagokkal és technikákkal be lehet juttatni egy gazdasejt rendszerbe, és ott expresszáltatni lehet. DNS elemeknek, azaz például promotereknek, fokozóknak, poliadenilezési helyeknek, transzkripciós terminációs szignáloknak, stb. asszociálódniuk kell a nukleotid szekvenciákkal, hogy elősegítsék és szabályozzák az expressziót. A használt specifikus szabályozó elem függ az expresszióhoz kiválasztott gazdasejtrendszertől, és attól, hogy az oligopeptid szekréciójára vagy a konjugátum peptidre van szükségünk. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a vektor lehet bakteriális, virális, emlős vagy élesztő vektor, ami a különösen előnyben részesített megvalósítási módban tartalmazza az előzőkben azonosított 5' és/vagy 3' szabályozó elemeket, amik egy megfelelő gazdasejtben képesek szabályozni a nukleotid szekvencia expresszióját.

Különböző vektorok használhatók hordozóként arra, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptideket bejuttassuk és expresszáltassuk egy gazdasejtben. Az ilyen, különböző gazdasejt-típusokban használható vektor-típusok jól ismertek, és ide tartoznak például a következő emlős expressziós vektorok: pSG5 (Stratagene), p-RKl (Genetics Institute), p-SVK3 (Pharmacia), p-EUK-Cl (Clontech, Palo Alto, CA), pCDM (Invitrogen), pc DNAI (Invitrogen), és az alábbi bakteriális expressziós vektorok: pFLAG-1 (IBI), az összes pET rendszer-plazmid (Novagen), a pTrcHis (Invitrogen), a pGEX sorozat (Pharmacia) és a pKK 233-2

-35(Clontech, Palo Alto, CA). Ezek a vektorok fennmaradhatnak episzómák formájában a gazdasejtben, vagy megkönnyíthetik a jelen találmány szerinti nukleotid szekvenciák integrálódását a gazdasejt genomjába, vagy mindkét hatással rendelkeznek. A vektorok rendelkezhetnek más hasznos tulajdonságokkal is, azaz például olyan génekkel, amik lehetővé teszik azoknak a sejteknek a szelekcióját vagy kimutatását, amikbe sikeresen bejuttattuk őket.

A jelen találmány szerinti nukleotid szekvenciák expresszálására alkalmas gazdasejtek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a prokarióta és eukarióta gazdaszervezetek, azaz például a Bacillus subtilis, az Escherichia coli, az élesztő, a Xenopus laevis oociták, a rovarsejtek, a növénysejtek, és a különböző emlős sejt típusok, ideértve főleg az aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtek, a HeLa sejtek, az L-(tk-) sejtek, a primer sejtek, Cos 17 sejtek, a Cosl sejtek, bébihörcsög vesesejtek és a CV1 sejtek.

A glikozilezést biztosító gazdasejtek is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok az eljárások, amikkel egy sejtet genetikailag módosítani lehet, oly módon, hogy a sejtet az előzőkben említett vektorral transzfektáljuk. A transzfekciót végrehajthatjuk hagyományos módszerekkel is, azaz például biológiailag, fizikailag, kémiailag vagy elektromos árammal indukált transzfekcióval, különösen elektroporációval, sejtfúzióval, retrovirus vagy vírus által végzett géntranszferrel,

-36liposzómával végzett géntranszferrel, vagy részecske bombázással.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás nem-humán emlős állatok létrehozására, amik sejtjeikben képesek előállítani a jelen találmány szerinti oligopeptideket, azzal jellemezve, hogy a jelen találmány szerinti nukleotid szekvenciát bejuttatjuk egy nem-humán állatsejtbe, lényeges, hogy a 8-sejtes állapotnál nem később, előnyösen az egysejtes állapotban, amit azután megfelelő körülmények között szaporítunk, hogy egy felnőtt, differenciálódott állatot kapjunk. Egy ilyen állat tartalmazhat a csírasejtjeiben vagy szomatikus sejtjeiben, főleg a kromoszómájában egy jelen találmány szerinti nukleotid szekvenciát, ami képes expresszáltatni a jelen találmány szerinti oligopeptidet. A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az emlős sejt rágcsáló vagy főemlős sejt. Egy ilyen terápia lehetővé tesz különböző génterápiás módszereket, azaz például szomatikus génterápiát vagy csírasejt-vonal génterápiát.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a genetikailag módosított, különösen a transzgenikus állatok, főleg emlősök, főleg főemlősök és egerek és azok sejtjei. Ezek az állatok, amik legalább néhány sejtjükben például a jelen találmány szerinti nukleotid szekvenciák transzfektált értelmes vagy antiszensz konstrukcióját tartalmazzák, szabályozó elemek kontrollja alatt, amely konstrukciók jól használható kutatási és diagnosztikai célokra, mivel a TPO-R aktivitása módosítva van. A TPO-R módosítása a transzgenikus állatokban lehetséges például a jelen ta

-37lálmány szerinti értelmes vagy antiszensz nukleotid szekvenciák transzformációra való használatával, vagy ezeknek a nukleotid szekvenciáknak bármilyen módosításával, azaz például inverzióval, delécióval, inszercióval, addicióval, stb., ezzel a genetikailag manipulált állatokat létrehozva. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti vektorokat vagy oligonukleotidokat transzfektáljuk és integráljuk nem-humán emlős sejtek genomjába, hogy expresszáltassunk egy olyan oligopeptidet, ami képes befolyásolni a TPO-R aktivitását. A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti vektorokat vagy oligonukleotidokat transzfektáljuk és homológ rekombinációval inszertáljuk a genomba, pontosabban az endogén TPO-R génbe, ezzel olyan állatokat állítva elő, amik expresszáltatják a módosított TPO-R-t. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik továbbá a genetikailag módosított állatok, pontosabban azok a transzgenikus állatok, amik a vad-típusú állattal összehasonlítva módosított TPO-R funkciót mutatnak. Egy ilyen módosított funkció emlősben, pontosabban nem-humán emlős sejtekben a jelen találmány szerinti antiszensz vagy értelmes konstrukciók bejuttatásának lehet a következménye, amely konstrukciók tartalmazhatnak nukleotid szekvencia változásokat és/vagy annak lehet a következménye, hogy az endogén TPO-R nukleotid szekvenciáját manipuláltuk. Ezeknek a módosításoknak, azaz például a jelen találmány szerint tervezett TPO-R-t kódoló szekvencia további mutált vagy nem-értelmes vagy antiszensz kópiáinak, mutált inszercióknak, vagy az endogén gének

-38módosításainak következtében lehetséges az előzőkben említett célokra használható állatokat kapni. Tehát a jelen találmány tárgya egy nem-humán emlős sejt, vagy sejttenyészet, ami tartalmazza az előzőkben említett módosításokat.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy jelen találmány szerinti oligopeptid előállítási eljárása, azzal jellemezve, hogy egy sejtet a jelen találmány kitanításának megfelelő vektorral transzfektálunk, a sejtet egy tenyésztő táptalajban szaporítjuk, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik az oligopeptid expresszióját, majd hagyományos technikákkal kinyerjük az oligopeptidet a sejtből vagy a sejttenyészetből.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a poliklonális vagy monoklonális ellenanyagok, vagy azok fragmensei, amik specifikusan kötődnek a jelen találmány szerinti oligopeptidekhez. Ezeket az ellenanyagokat használhatjuk a jelen találmány szerinti oligopeptidek, azok strukturális analógjainak, vagy éppen a TPO-R-nek a kimutatására és izolálására. Abban az esetben, amikor az oligopeptidek vagy a TPO-R TPO-R-t vagy oligopeptidet tartalmazó forrásokban, azaz például sejtekben, vagy sejtrészekben, vagy sejtszervekben vannak jelen, akkor a kimutatás vagy izolálás előtt további manipulációkra lehet szükség, azaz például hagyományos módszerekre, amikkel a biológiai anyagot el lehet roncsolni, ilyen lehet például az enzimatikus sejtlízis.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan monoklonális vagy poliklonális ellenanyagok, amik specifikusan felis

-39merik az előzőkben említett ellenanyagokat, és kötődnek hozzájuk.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy immunesszé a jelen találmány szerinti oligopeptideknek az oligopeptideket tartalmazó keverékből való kimutatására és/vagy izolálására, azzal jellemezve, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagokat érintkezésbe hozzuk az eleggyel, és az oligopeptideket kimutatjuk, és/vagy izoláljuk. Vica versa, az immunesszé arra is használható, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptidek mint próbák használatával kimutassuk a jelen találmány szerinti ellenanyagokat.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek egyedülálló eszközként jól használhatók in vitro, a trombopoietin biológiai szerepének elemzésére, beleértve a trombopoietin termelésében és a receptor-kötési folyamatban szerepet játszó számos faktor kiértékelését. A jelen találmány szerinti oligopeptidek arra is jól használhatók, hogy más vegyületeket fejlesszünk ki, amik kötődnek a TPO-R-hez és aktiválják azt, mivel a jelen találmány szerinti oligopeptidek fontos információkat biztosítanak a szerkezet-hatás összefüggésére.

A jelen találmány szerinti oligopeptid jól használhatók még kompetitív kötőanyagokként olyan esszékben, amikkel további trombopoietin antagonistákat lehet keresni. A jelen találmány szerinti oligopeptidek módosítás nélkül használhatók, vagy módosíthatók, például úgy, hogy kovalens kötéssel vagy nem-kovalens kötéssel egy jelölő egységet kapcsolunk hozzájuk, ami

-40közvetlenül vagy közvetve kimutatható jelet biztosít. A közvetlen jelölést a következő jelölő csoportokkal lehet biztosítani: radioaktív jelölések, enzimek, azaz például peroxidáz és alkalikus fbszfatáz, fluoreszcens jelölések, amik képesek követni a fluoreszcencia intenzitásban, hullámhossz eltolódásban, vagy a fluoreszcencia polarizációjában bekövetkező változásokat. A közvetett jelöléshez tartozik egy komponens biotinilezése, amit az előzőkben említett jelölési csoportok egyikéhez kapcsolt avidinhez való kötődés követ. A vegyületek tartalmazhatnak kapcsoló karokat is, azokban az esetekben, amikben a vegyületeket egy szilárd hordozóhoz kell kapcsolni.

Azon képességük alapján, hogy a trombopoietin receptorhoz képesek kötődni, a jelen találmány szerinti oligopeptidek használhatók reagensként a trombopoietin receptorok kimutatására membránokon, sejtszerveken, kompartmenteken, élő sejteken, rögzített sejteken, biológiai folyadékokban, szöveti homogenizátumokban, tisztított, természetes biológiai anyagokban, nyers kivonatokban, stb. Ha például a jelen találmány szerinti oligopeptideket jelöljük, akkor azonosíthatjuk azokat a sejteket, amik a felszínükön TPO-R-t hordoznak. Emellett, azon képességük alapján, hogy megkötik a TPO-R-t, a jelen találmány szerinti oligopeptidek használhatók in situ festésben, FACS-ban (fluoreszcencia-aktivált sejt-osztályozó), Western blottban, ELISA-ban, stb. Emellett, azon képességük alapján, hogy megkötik a TPO-Rt, a jelen találmány szerinti oligopeptidek használhatók a TPO-R izolálási és tisztítási eljárásaiban, vagy a TPO-R-t a sejtfelszínen,

-41vagy permeabilizált sejtekben expresszáló sejtek izolálásában és tisztításában.

A jelen találmány tárgya továbbá a jelen találmány szerinti peptidek alkalmazása az előzőkben említett szűrővizsgálati és izolálási eljárásokban, ha hagyományos módszerekkel immobilizálva vannak, például egy szilárd hordozóhoz. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint, pontosabban a jelen találmány szerinti szűrővizsgálati esszében, az oligopeptid nem diffundáló módon kötődik egy oldhatatlan hordozóhoz, aminek izolált mintafogadó területei vannak, mint amilyen például egy mikrotiter lemez. Az oldhatatlan hordozók lehetnek bármilyen anyagból, amikhez az oligopeptid vagy a receptor hozzáköthető, valamint másképpen is kompatibilis a szűrővizsgálat általános módszerével. Az ilyen hordozók felszíne lehet szilárd vagy porózus, és bármilyen alakú. Az alkalmas hordozók közé tartoznak például a mikrotiter lemezek, a membránok és a gyöngyök. Ezek általában üvegből, műanyagból, azaz például polisztirolból, poliszacharidból, nylonból vagy nitrocellulózból készülnek.

Természetesen a jelen találmány tárgyát képezik az előzőkben említett izolálási és szűrővizsgálati módszerek, amikben az oligopeptideket és/vagy az ezek ellen az oligopeptidek ellen készült ellenanyagokat használjuk nagyteljesítményű szűrővizsgálati és/vagy izolálási eljárásokban, például oldatban, anélkül hogy immobilizált ágenseket használnánk.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek használhatók kereskedelmi forgalomba hozott reagensekként is, különböző orvosi

-42kutatási és diagnosztikai felhasználás céljára. Az ilyen felhasználások az alábbiak lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: 1) kalibrációs standardként való alkalmazás, a trombopoietin vagy potenciális trombopoietin agonisták aktivitásának mennyiségi meghatározására, különböző funkcionális esszékben; 2) arra való használat, hogy a trombopoietin-dependens sejtvonalak szaporodását és növekedését fenntartsuk, 3) a trombopoietin receptor szerkezeti elemzésében való alkalmazás, együtt-kristályosítással; 4) a trombopoietin szignál transzdukció/receptor aktiváció mechanizmusának vizsgálatában való alkalmazás; és 5) más kutatási és diagnosztikai alkalmazások, amikben a trombopoietin receptor előnyösen aktiválva van, és az ilyen aktiválást kényelmesen ismert mennyiségű trombopoietin, vagy trombopoietin agonista ellen lehet kalibrálni.

A jelen találmány szerinti oligopeptideket használhatjuk a megakariociták és őssejtjeik in vitro expanziójára, mind további citokinekkel, azaz például trombopoietinnel együtt, mind önmagukban. A kemoterápia és a besugárzás trombocitopéniát okoz, elpusztítva a megakariociták gyorsan osztódó, érettebb populációját. Azonban ezek a terápiás kezelések csökkenthetik az éretlen, mitotikusan kevésbé aktív megakariocita prekurzor sejtek számát és életképességét. Ennek megfelelően, a trombocitopéniának a jelen találmány szerinti oligopeptidekkel való enyhítése a jelen találmány egyik megvalósítási módjában javítható, olyan betegekre alkalmazva, akik befejezték a kemoterápiát vagy besugárzásos terápiát, ha a beteg saját sejtjeit használjuk, amikben in vitro te

-43nyésztéssel feldúsítottuk a megakariocitákat és az éretlen prekurzorokat.

A jelen találmány szerinti oligopeptideket és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-t és/vagy az ezekhez specifikusan kötődő ellenanyagokat beadhatjuk állatoknak is, beleértve az emlősöket, azaz például a rágcsálókat és főemlősöket, beleértve az embereket is, hogy modulálják, pontosabban in vivo aktiválják a TPO-R-t, és/vagy növeljék, vagy tartsák fenn a meglevő vérlemezke-számot. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik a trombopoietinhez kapcsolódó rendellenességek terápiás kezelésére szolgáló eljárások, amik abból állnak, hogy egy jelen találmány szerinti oligopeptidet olyan mennyiségben adunk be, hogy az in vivo befolyásolja a TPO-R hatását. Például a jelen találmány szerinti oligopeptidek és készítmények beadhatók, hogy számos különböző hematológiai rendellenességet kezeljünk, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vérlemezke rendellenességeket és a trombocitopéniát, különösen akkor, ha a csontvelő transzfúziókhoz, a besugárzásos terápiához és a kemoterápiához kapcsolódik. Egy ilyen beadás magában foglalhatja a trombopoietin alkalmazását.

Tehát a jelen találmány tárgyát képezik azok a módszerek is, amikkel befolyásolni, különösen fokozni vagy csökkenteni lehet a TPO-R aktivitását, amikben a jelen találmány szerinti oligopeptidet, vagy egy ehhez specifikusan kötődő ellenanyagot használunk a TPO-R-re, a trombopoietin jelenlétében vagy távollétében. Egy ilyen módszer lehet in vivo vagy in vitro módszer.

-44A jelen találmány szerinti oligopeptideket és készítményeket egy előnyben részesített megvalósítási mód szerint profilaktikusan adhatjuk be a kemoterápia, besugárzásos terápia vagy csontvelő transzplantáció előtt, vagy azzal egyidóben, illetve egy ilyen beavatkozás után is beadhatjuk.

Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a készítmények, amik aktív adalékanyagként legalább egyet tartalmaznak a jelen találmány szerinti oligopeptidekből és/vagy a TPO-Rp vad-típusú oligopeptidből, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóhoz vagy higítószerhez asszociálódva. A jelen találmány szerinti készítményeket beadhatjuk szisztémásán vagy topikálisan, pontosabban intravaszkulárisan, orálisan, pulmonárisan, parenterálisan, azaz például intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás vagy szubkután injekció formájában vagy inhalációval, például finom por formájában, transzdermálisan, nazálisán, vaginálisan, rektalisan vagy szublinguális úton, és olyan dózisformákban szerelhetők ki, amik megfelelnek az egyes beadási módoknak. A jelen találmány szerinti oligopeptideket és/vagy a TPO-Rp vad-típusú oligopeptideket használhatjuk az ilyen készítményekben, gyógyászatilag elfogadható só, savaddíciós só, észter, amid és/vagy szabad bázis formájában, előnyösen gyógyászatilag hatásos mennyiségben.

Az orális beadáshoz használható szilárd dózisformák közé tartoznak a kapszulák, a lingualettek (nyelv alá helyezendő tabletták), tabletták, pirulák, porok, liposzómák, tapaszok, időkésleltetéses bevonatok és a granulátumok. Az ilyen szilárd dózisfor

-45mákban az aktív adalékanyagot összekeverjük legalább egy inert, gyógyászatilag elfogadható hordozóval, azaz például laktózzal, szacharózzal vagy keményítővel. Az ilyen dózisformák tartalmazhatnak további, az inert higítószerektől eltérő adalékanyagokat is, azaz például sikosító anyagokat, például magnézium-sztearátot. A kapszulák, tabletták és pirulák esetében a dózisforma tartalmazhat térkitöltő anyagokat és/vagy puffereket is, valamint ízesítő anyagokat is. A tablettákat és a pirulákat emellett elláthatjuk még bélben oldódó bevonatokkal is.

Az orális beadáshoz használt folyékony dózisformák közé tartoznak a gyógyászatilag elfogadható emulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok, és az elixírek a szakterületen általánosan használt inert higítószereket tartalmaznak, azaz például vizet. Az ilyen inert higítószerek mellett a készítmények tartalmazhatnak adjuvánsokat is, azaz például sókat, az ozmotikus nyomás változtatására, pH-szabályozó vegyületeket, bőr-penetrációs vegyületeket, nedvesítő ágenseket, emulgeáló ágenseket és szuszpendáló ágenseket, valamint édesítő, ízesítő és illatosító ágenseket.

A jelen találmány szerinti, parenterális beadáshoz használt gyógyászati készítmények közé tartoznak a steril vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók vagy emulziók. A nem-vizes oldószerek vagy hordozók közé tartozik a propilénglikol, a polietilénglikol, a növényi olajak, azaz például az olívaolaj és a kukoricaolaj, zselatin, valamint az injekciózható szerves észterek, azaz például az etil-oleát. Az ilyen dózisformák tartalmazhatnak még

-46adjuvánsokat is, azaz konzerváló, nedvesítő, emulgeáló és diszpergáló ágenseket. Ezeket sterilezhetjűk például egy baktériumokat visszatartó pórusméretű szűrőn való szűréssel, vagy sterilizáló ágenseknek a készítménybe való bevitelével, a készítmények besugárzásával, vagy a készítmények megmelegítésével. Ezeket előállíthatjuk steril vízzel, vagy valamilyen más steril injekciózható közeggel, közvetlenül felhasználás előtt.

Az injekciózáshoz készített kiszerelési formák tartalmaznak egy fiziológiásán elfogadható közeget, azaz például vizet, sóoldatot, foszfáttal puffereit sóoldatot, vizes etanolt, vizes etilénglikolokat és hasonlókat. Az alkalmazható vízoldható konzerválószerek közé tartozik a nátriumbiszulfit, a nátriumtioszulfát, az aszkorbát, a benzalkónium-klorid, a klórbutanol, a thimerosal, a fenilhigany borát, a parabének, a benzilalkohol és a feniletanol. Ezek az ágensek egyedileg megválasztott mennyiségben lehetnek jelen, körülbelül 0,001-5 tömegszázalékban, előnyösen körülbelül 0,01-2 tömegszázalékban. Az alkalmazható, megfelelő vízoldható pufferelő ágensek közé tartoznak az alkáli- vagy alkáliföldfém karbonátok, a foszfátok, a hidrogénkarbonátok, cifrátok, borátok, acetátok, szukcinátok és hasonlók, azaz például nátriumfoszfát, citrát, borát, acetát, hidrogénkarbonát és karbonát. Az olyan adalékanyagokat, mint például a karboximetilcellulózt,, hordozóként használhatjuk, körülbelül 0,01-5 tömegszázalék mennyiségben. A kiszerelési forma változhat, a kiszerelési forma céljától, a receptor aktivitásának befolyásolására éppen alkalma-Μ··· · *

MW «>« ·« zott alkalmazási módtól, a szándékolt alkalmazási módtól, stb. függően.

A rektális vagy vaginális beadáshoz használt készítmények előnyösen kúpok, amik az aktív adalékanyag mellett tartalmazhatnak töltőanyagokat is, azaz például kakaóvajat, vagy kúpviaszt. A nazális vagy szublinguális beadáshoz használt készítményeket szintén a szakterületen jól ismert standard töltőanyagokkal állítjuk elő.

A jelen találmány szerinti oligopeptideket és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-t tartalmazó készítményeket beadhatjuk profilaktikus és/vagy terápiás kezelésekhez. A terápiás alkalmazásokban a készítményeket már egy előzőkben ismertetett betegségben szenvedő betegnek adjuk be, olyan mennyiségben, amivel gyógyítani, vagy legalább részlegesen leállítani lehet a betegség tüneteit és komplikációit, azaz terápiásán hatásos mennyiségben.

A profilaktikus alkalmazásokban, a jelen találmány szerinti oligopeptideket és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-t tartalmazó készítményeket olyan betegnek adjuk be, aki egy adott betegségre érzékeny, vagy más alapon a szóban forgó betegség kockázatának van kitéve. Az ilyen mennyiséget „profilaktikusan hatékony dózisnak” nevezzük. Ebben az alkalmazásban a pontos mennyiség ismét a beteg egészségi állapotától és testsúlyától függ.

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket beadhatjuk depó készítmény formájában is, azaz például egy lassan felszabaduló készítmény formájában. Egy ilyen lassan felsza-48• ««t * « • * · * baduló készítmény tartalmazhat oligopeptidet tartalmazó részecskéket egy mátrixban, ami készülhet például kollagénből.

A jelen találmány szerinti trombopoietin agonista azon mennyisége, ami a hatékony terápiához szükséges, számos különböző faktortól függ, beleértve a beadás módjait, a megcélzott pontot, a beteg fiziológiás állapotát, és a még párhuzamosan beadott gyógyszereket.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek és/vagy a vad-típusú TPO-Rp hatékony a trombopoietin által közvetített állapotok kezelésében, ha körülbelül 0,03-10 mg/(emlős testsúlykg) per nap dózistartományban pontosabban körülbelül 0,3-1 mg/kg dózistartományban adjuk be. Az alkalmazott specifikus dózist az éppen kezelt állapot, a beadás módja szabályozza, valamint a kezelőorvos megítélése, számos különböző faktor alapján, azaz például a beteg állapotának súlyossága, valamint kora és általános állapota alapján.

A jelen találmány szerinti oligopeptidet és/vagy vad-típusú TPO-Rp-t beadhatjuk önmagában, vagy trombopoietinnel együtt, az utóbbinak a dózisát valószínűleg 50-25%-kal csökkentve (a trombopoietin alkalmazás szokásos dózisával ellentétben), ami annak a következménye, hogy a jelen találmány szerinti oligopeptidek fokozzák a trombopoietin hatását.

A jelen találmány szerinti készítmény, előnyösen a jelen találmány szerinti vízoldható készítmény tartalmazhat továbbá egy vízoldható fehérjét is, ami a test-folyadékokba injekciózható, anélkül hogy lényeges farmakológiai aktivitást mutatna a jelen

-49találmány szerinti, egy egységdózisban használt koncentrációban (a továbbiakban ennek neve „vízoldható fehérje”). Mint olyan, a vízoldható fehérje előnyösen szérum-albumin, globulin, kollagén és/vagy zselatin. Ezt a fehérjét olyan mennyiségben adhatjuk be, amilyet általában használnak egy injekciózható gyógyászati készítményben. Tehát például a vízoldható fehérje és a jelen találmány szerinti oligopeptid közötti tömegarány körülbelül 0,0001:1 és 100:1 között változik, előnyösen körülbelül 0,001:1 aránytól körülbelül 10:1 arányig, vagy még előnyösebben körülbelül 0,01:1 aránytól körülbelül 1:1 arányig.

Folytatva, a jelen találmány tárgyát képezik továbbá az előzőkben említett oligopeptidek maguk is, valamint az ezeket tartalmazó készítmények, főleg szárított és/vagy tiszta formában, vagy vizes vagy vizes/alkoholos oldatban. A vízoldható készítményből, vagy a jelen találmány szerinti peptidsóból készített oldat pH-jának olyannak kell lennie, hogy az említett pH ne fejtsen ki semmilyen káros hatást a farmakológiailag aktív fehérje aktivitására, de az injekciózáshoz általánosan használt, elfogadott tartományban legyen, és emellett olyan legyen, hogy az említett pH se nagy változást ne okozzon az oldat viszkozitásában, se ne okozza csapadék képződését, vagy hasonló eseményt. Tehát az oldat pH-ja előnyösen körülbelül 4-7, előnyösen 5-6, de leginkább 5,3-5,5 között legyen.

Ha a jelen találmány szerinti vízoldható készítményt a beadáshoz vizes oldattá alakítjuk, akkor a gyógyászatilag aktív oligopeptidnek vagy annak sójának koncentrációja az említett oldat

-50ban előnyösen körülbelül 0,0000001-10 tömegszázalék, előnyösebben körülbelül 0,000001-5 tömegszázalék, vagy legelőnyösebben körülbelül 0,00001-1 tömegszázalék.

A jelen találmány szerinti készítmény előnyösen egységdózis formájú, ami tartalmazza a jelen találmány szerinti farmakológiailag aktív oligopeptidet, ha szükséges, akkor további adalékanyagokkal, azaz például az előzőkben említett vízoldható oligopeptiddel együtt. Tehát például az előzőkben említett két vagy három komponenst egy ampullába vagy fiolába tesszük, oly módon, hogy steril vízben vagy steril fiziológiás sóoldatban oldjuk vagy szuszpendáljuk. Ebben az esetben az előállítási eljárás tartalmazhatja azt is, hogy a farmakológiailag aktív oligopeptid só oldatát, valamint, ha szükséges, akkor az adalékanyagot összekeverjük, vagy az adalékanyagot por alakjában adjuk a farmakológiailag aktív oligopeptid sóhoz, vagy adekvát eljárások bármilyen más kombinációját használhatjuk. A dózisformát úgy is előállíthatjuk, hogy steril vizet vagy steril fiziológiás sóoldatot adunk liofilizátumhoz vagy vákuumban szárított porhoz, amiben a farmakológiailag aktív oligopeptid só, és szükség esetén az adalékanyag együtt megtalálható. Az egységdózis forma tartalmazhat egy vagy több hagyományos adalékanyagot is, azaz például pH-szabályozó ágenseket (azaz például glicint, sósavat, nátrium-hidroxidot), helyi érzéstelenítőt (azaz például xilokain hidrokloridot, klórbutanolt), izotonizáló ágenseket (azaz például nátrium-kloridot, mannitot, szorbitot) emulgeáló szereket, adszorpció inhibitorokat (azaz például Tween 60-at vagy 80-at), talkumot, kémé

- 51nyítőt, laktózt és tragantmézgát, magnézium-sztearátot, glicerint, propilénglikolt, konzerváló ágenseket, benzilalkoholt, metilhidroxi benzoátot és/vagy oleum arachid hidrogént. Ez az egységdózis tartalmazhat még gyógyászatilag elfogadható töltőanyagokat, azaz például polietilénglikol 400-at vagy dextránt.

A jelen találmány szerinti készítményt úgy állítjuk elő, hogy ezeket az adalékanyagokat egy hagyományos módszer szerint összekeverjük. A jelen találmány szerinti adalékanyagok összekeverésének az lehet a célja, hogy a farmakológiailag aktív oligopeptid aktivitását fenntartsuk, és az eljárás során minimalizáljuk a buborékképződést. Az adalékanyagokat egy tartályba tesszük (például egy palackba vagy hordóba), akár egyszerre, akár bármilyen sorrendben. A tartályban az atmoszférának például steril tiszta levegőnek vagy steril nitrogéngáznak kell lennie. A kapott oldatot azután átvihetjük kis fiolákba vagy ampullákba, és újra liofilezésnek vethetjük alá.

A jelen találmány szerinti készítmény liofilezett por formájának folyékony alakját biológiailag lebomló polimer, azaz például poli(tejsav-glikolsav) kopolimer, poli(hidroxivajsav), poli(hidroxivajsav-glikolsav) kopolimer, vagy ezek keveréke oldatában oldhatjuk vagy diszpergálhatjuk, majd formulázhatjuk, például filmmé, mikrokapszulákká (mikrogömbökké), vagy nanokapszulákká (nanogömbök), főleg lágy és kemény kapszulák formájában.

Emellett a foszfolipideket, koleszterint vagy ezek származékait tartalmazó liposzómákba kapszulázott jelen találmány sze

- 52rinti készítményeket tovább diszpergálhatjuk fiziológiás sóoldatban, vagy hyaluronsav oldatban, fiziológiás sóoldatban oldva.

Ezeket a lágy kapszulákat a jelen találmány szerinti készítmény folyékony formájával tölthetjük meg. A kemény kapszulát a jelen találmány szerinti készítmény liofilezett porával tölthetjük meg, vagy a jelen találmány szerinti készítmény liofilezett porát tablettákká préselhetjük rektális, vagy orális beadás céljából.

Természetesen a jelen találmányt szerinti készítmény előre betöltött fecskendőben is forgalomba hozhatjuk, önbeadás céljából.

A jelen találmány tárgya továbbá a jelen találmány szerinti oligopeptidek és a vad-típusú TPO-Rp, az ezeket az oligopeptideket kódoló nukleotid szekvencia, a jelen találmány szerinti vektor, a jelen találmány szerinti gazdasejt és/vagy a jelen találmány szerinti ellenanyag használata egy gyógyszer előállítására, hematológiai rendellenességek, különösen trombocitopénia diagnosztizálása vagy kezelése céljából.

Végezetül, a jelen találmány tárgyát diagnosztikai készítmények képezik, hematológiai rendellenességek, főleg trombocitopénia diagnosztizálására, amik a jelen találmány szerinti oligopeptidet, vagy a vad-típusú TPO-Rp-t, az ezeket az oligopeptideket kódoló nukleotid szekvenciát, a jelen találmány szerinti vektorokat, a jelen találmány szerinti gazdasejtet és/vagy a jelen találmány szerinti ellenanyagokat tartalmazzák, adott esetben egy elfogadható hordozóval együtt. A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti

- 53diagnosztikai készítményben használt, előzőkben említett ágenseket az előzőkben ismertetett módon jelölhetjük. Azaz, a jelen találmány szerinti jelzett oligopeptidek, jelzett nukleotid szekvenciák, jelzett sejtek és/vagy jelzett ellenanyagok használhatók arra, hogy specifikusan kimutassuk a TPO-R-hez kapcsolódó állapotokat, pontosabban rendellenességeket. Hasonlóképpen, és amint azt az előzőkben elmagyaráztuk, a jelzett ágens használható további gyógyszerjelöltek azonosítására és izolálására.

Bár az előzőkben a találmánynak csak az előnyben részesített megvalósítási módjait ismertettük specifikusan, az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány módosítható és variálható, anélkül hogy eltérnénk a jelen találmány szellemétől és oltalmi körétől. A jelen találmány további előnyben részesített megvalósítási módjait az igénypontokban soroljuk fel.

Az 1-7. számú szekvencia a jelen találmány szerinti oligopeptidek aminosav szekvenciáit reprezentálja.

A peptid hosszát az első és utolsó aminosav számával jellemezhetjük, a teljes hosszúságú (amit vad-típusúnak is neveznek) TPO-Rp fehérjeláncban levő pozíció alapján, amint az a WO 99/42127 számú szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációnak a TPO-Rp vad-típusú aminosav szekvenciára, és előállítási módjára vonatkozó részét teljes egészében beépítettük a jelen találmány leírásába. Az egyes aminosavakat a hagyományos nevezéktan alapján neveztük el, azaz az „R9A” jelentése az, hogy a vad-típusú TPO-Rp eredeti, 9-es pozíciójában levő arginin csoportot Alaninnal helyettesítjük.

- 54Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

1. ábra	A jelen találmány szerinti oligopeptidek hatása 180 mg/kg carboplatinnal kezelt egerekben
2. ábra	A jelen találmány szerinti oligopeptidek hatása 200 mg/kg carboplatinnal kezelt egerekben
3-6. ábra	A stabilitási vizsgálatok eredményei HPLC profilok formájában
(3. ábra:	0. nap, 30 nmol 1 mmol/l-es oldatból, amit száraz porból készítettünk
4a. ábra	2. nap, a minták 1 mmol/l-es oldat formájában tárolva
4B. ábra	2. nap, a minták száraz por formájában tárolva
5A. ábra	9. nap, a minták 1 mmol/l-es oldat formájában tárolva
5B. ábra	9. nap, a minták száraz por formájában tárolva
6A. ábra	14. nap, a minták 1 mmol/l-es oldat formájában tárolva
6B. ábra	14. nap, a minták száraz por formájában tárolva

1. Példa

A TPQ-Rp (vad-típusú, és jelen találmány szerinti oligopeptidek) hatása a carboplatinnal indukált trombocitopénia kezelésében: I

Módszerek:

Az in vivo kísérletekben használt modellt korábban már leírták [Akahori és mtsai: Stem Cells 14, 678-689 (1996); Akahori és mtsai: Br. J. Haematol. 94, 722-728 (1996); Shibuya és mtsai: Blood 91, 37-45 (1998); Andrews és mtsai: Stem Cells 14, 661677 (1996)]. A végrehajtott javításokat és módosításokat az alábbiakban ismertetjük.

Kezelési ütemterv

Mindegy vizsgálati csoportnak (PBS, TPO vagy TPO-Rp) napi egy dózist adunk be, intraperitoneális injekció formájában. A napi dózisok a 0. napon kezdődnek, és a kísérleti periódusban (10 nap) végig folytatódnak. A 0. és a 4. napon két intraperitoneális carboplatin injekciót (mindegyik 90 mg/kg, illetve a 11-es csoport esetében csak foszfáttal puffereit sóoldat) adunk be.

Vérvétel

A -0. (alap), 8., 11., 14. és 18. napon veszünk vért. A vért az egerek farkából vesszük (nyolchetes hím C67BL/6Y egér), majd kauterizációt végzünk. Minden egyes egérből 80 μΐ vért veszünk egy heparinizált vérvételi csőbe. A 80 μΐ vért azután 160

- 56μΐ sóoldattal keverjük össze, ami elég EDTA-t (0,225%) tartalmaz ahhoz, hogy biztosítsa az antikoagulációt.

A TPO-Rp hatását vizsgáljuk in vivo a 2. számú szekvenciával (TPO-Rp, 1-18, R9A, R11A) és a 4. számú szekvenciával (TPO-Rp, 4-18, R9A, R11A), a vad-típusú peptiddel összehasonlítva (TPO-Rp vad-típusú peptid, aminosav szekvenciája a következő: ARGGTLELRPRSRYRLQLRARLN), egerekben carboplatinnal indukált trombocitopénia esetében. Azért, hogy olyan modellel dolgozzunk, ami a lehető leginkáb hasonlít a klinikai helyzetekre, egy korábban ismertetett carboplatin modellt [Akahori és mtsai: Stem Cells 14, 678-689 (1996); Akahori és mtsai: Br. J. Haematol. 94, 722-728 (1996); Shibuya és mtsai: Blood 91, 37-45 (1998); Andrews és mtsai: Stem Cells 14, 661-677 (1996)] alaposan tanulmányoztunk, és megfelelő módon módosítottunk. Emellett az állatokból való vérvétel egy módszerét is alaposan tanulmányoztuk, azért, hogy olyan állatokkal dolgozzunk, amik a legnagyobb választ adják egy adott hatóanyagra, ugyanakkor viszont minimális stressz alatt vannak (lásd az előzőkben a Módszereket). Tehát a carboplatin dózisát 180 mg/kg-ra növeljük, és két intraperitoneális (i.p.) injekcióval adjuk be a 0. napon (fél dózis) és a 4. napon (2. fél dózis). A carboplatin súlyos trombocitopéniát indukál a nyolcadik napon.

A használt állatcsoportokat az I. táblázatban mutatjuk be.

I. Táblázat Kísérleti csoportok az „in vivo” vizsgálatokban
Csoport	Teljes dózis	Állatok
1	Carboplatin^a+TPO-Rp vad-típus 0,03 mg/kg/nap	8
2	Carboplatin^a+TPO-Rp vad-típus 0,30 mg/kg/nap	8
3	Carboplatin^a+TPO-Rp vad-típus 0,90 mg/kg/nap	8
4	Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú szekvencia 0,03 mg/kg/nap	8
5	Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú szekvencia 0,30 mg/kg/nap	8
6	Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú szekvencia 0,90 mg/kg/nap	8
7	Carboplatin^a+TPO-Rp 4. számú szekvencia 0,03 mg/kg/nap	8
8	Carboplatin^a+TPO-Rp 4. számú szekvencia 0,30 mg/kg/nap	8
9	Carboplatin^a+TPO-Rp 4. számú szekvencia 0,90 mg/kg/nap	8
10	Carboplatin^a + TPO 2,4 pg/kg/nap	8
11	Nincs carboplatin	8
12	Csak Carboplatin^a	12

^a 90 mg/kg Carboplatin, a 0. és 4. napon beadva

- 58Az 1. ábra a vérlemezke-szám erős csökkenését mutatja a carboplatinnal kezelt egerekben, és összefoglalja az előzőkben ismertetett különböző kísérleti csoportokkal kapott kísérleti eredményeket. Az eredményeket az egyes állatok alap-értékeihez viszonyítva százalékos változásban fejezzük ki. Az 1. ábra azt is mutatja, hogy a vad-típusú TPO-Rp peptid 300 pg/kg és 30 pg/kg dózisban szignifikánsan növeli a trombociták számát. Meg kell jegyeznünk, hogy ebben a nagyon magas carboplatin dózisban a trombopoietin a használt dózisban (2,4 pg/kg/nap), amivel korábban kaptunk eredményeket, nem volt képes megelőzni a vérlemezkék számának csökkenését. Az 1. ábra azt is mutatja, hogy a rövidített TPO-Rp peptidek, szekvenciájuk a 2. számú szekvenciavázlaton látható, azaz az 1-18-as csoportok, és az R9A, R11A erősen kivédte a carboplatin által indukált vérlemezke-szám csökkenést két dózisban: 300 pg/kg/nap és 30 pg/kg/nap dózisban. A két dózis által előidézett védő hatás egyformán figyelemre méltó; azonban a túlélési arány alapján (lásd az alábbiakban), az alacsonyabb, 30 pg/kg/nap dózis különösen szignifikáns, míg a 300 pg/kg/nap dózisnak összehasonlítható hatása van a TPO-Rp vad-típussal. A legmagasabb, 0,9 mg/kg/nap peptid-dózis nagyon alacsony hatást mutatott a vérlemezkék védelmében, ami valószínűleg a peptid-aggregációhoz rendelhető. Az 1. ábra azt is mutatja, hogy a TPO-Rp peptid legrövidebb verziója (4. számú szekvencia, 4-18-as csoportok, R9A-val, RllA-val) mutatott valamilyen hatást a carboplatinnal kezelt állatokban a vérlemezke szintekre. Egyik használt peptid

- 59nek, azaz a vad-típusú TPO-Rp-nek, a TPO-Rp 1-18-nak (R9A, R11A) és a TPO-Rp 4-18-nak (R9A, R11A) sincs szignifikáns hatása a vér többi komponenseire. Emellett egyik kezelés sem befolyásolta az állatok testsúlyát.

Fontos megvizsgálni a kezelt állatok túlélési arányát. A chinégyzet elemzéssel statisztikusan elemezve a legszignifikánsabb hatást, és így a legmagasabb túlélési arányt a TPO-Rp, 1-18 (R9A, R11A) pepiiddel lehetett megfigyelni. A vad-típusú peptiddel végzett kezelés esetében is statisztikailag szignifikáns túlélési arányt kaptunk.

Az előzőek mind világosan jelzik, hogy a TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A) peptid szignifikánsan helyreállítja a carboplatinnal indukált trombocitopéniát és 10-szeres javulást jelent a vegyület „in vivő” aktivitásában.

2. Példa

A TPO-Rp (vad-típusú, és a jelen találmány szerinti oligopeptidek) hatása a carboplatinnal indukál trombocitopénia kezelésére: II

Kezelési ütemterv

Mindegy vizsgálati csoportnak napi egy dózist adunk be, intraperitoneális injekció formájában. A napi dózisok a 0. napon kezdődnek, és a kísérleti periódusban (13 nap) végig folytatódtak Minimális dózist adtunk a jelzett napokon: 0 és 4; 0, 4 és 8; 0, 4, 8 és 12; a 8-14. napokon. Két 100 mg/kg-os intraperitoneális carboplatin injekciót adunk be a 0. és 4. napon.

- 60Vérvétel

A -0. (alap), 8., 11., 14. és 18. napon veszünk vért. A vért az egerek farkából vesszük (nyolchetes hím C67BL/6Y egér), majd kauterizációt végzünk. Minden egyes egérből 80 μΐ vért veszünk egy heparinizált vérvételi csőbe. A 80 μΐ vért azután 160 μΐ sóoldattal keverjük össze, ami elég EDTA-t (0,225%) tartalmaz ahhoz, hogy biztosítsa az antikoagulációt.

A carboplatin dózisát 200 mg/kg-ra növeltük, majd kumulatív dózisként két intraperitoneális (i.p.) injekcióval adjuk ne a 0. napon (fél dózis) és a 4. napon (második fél dózis). A carboplatin súlyos trombocitopéniát indukál all. napon.

A használt állatcsoportokat a II. táblázatban mutatjuk be.

II. Táblázat

Kísérleti csoportok az „in vivo” vizsgálatokban

Csoport Teljes dózis Kezelési ütemterv (nap)

Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú 0-13 szekvencia 0,30 mg/kg/nap

Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú 0 szekvencia 0,30 mg/kg/nap

Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú 0 és 4 szekvencia 0,30 mg/kg/nap

Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú 0, 4 és 8 szekvencia 0,30 mg/kg/nap

Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú 0, 4, 8 és 12 szekvencia 0,30 mg/kg/nap

II. Táblázat folytatása

Csoport	Teljes dózis	Kezelési ütemterv (nap)
6	Carboplatin^a+TPO-Rp 2. számú szekvencia 0,30 mg/kg/nap	8 és 14
7	Carboplatin^a + TPO 2,4 pg/kg/nap	0-13
8	Carboplatin^a + TPO 2,4 pg/kg/nap	0-13
9	Carboplatin^a + TPO 2,4 pg/kg/nap	0-14
10	Nincs carboplatin	-
11	Csak Carboplatin^a	0 és 4

^a 100 mg/kg Carboplatin, a 0. és 4. napon beadva

Eredmények:

A 2. ábrán összefoglaljuk a carboplatinnal kezelt egerekkel kapott eredményeket mindegyik kísérleti csoportban (RCN-01303 reprezentálja a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott oligopeptidet). Az eredményeket az egyes állatok alapértékeihez viszonyított százalékos változás alapján mutatjuk be.

A 2. ábra azt mutatja, hogy a peptid 300 pg/kg/nap dózisban növeli a trombociták számát. Meg kell jegyeznünk, hogy a carboplatin dózisát az 1. kísérlethez viszonyítva megnöveltük, azzal a céllal, hogy vizsgáljuk a vegyület potenciálját súlyos trombocitopéniában, ami egy nagyon általános klinikai helyzet. A 2,4 Pg/kg/nap koncentrációban használt TPO hormon - mint az 1. példában, 180 mg/kg carboplatin dózissal - ismét nem volt képes kivédeni a vérlemezke-szám csökkenését. Magasabb, 10

- 62μg/kg/nap dózisban a trombopoietin mutatott valamilyen hatást, aminek van statisztikai szignifikanciája. Azonban a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott oligopeptid védő hatása nagyobb, mint amit a trombopoietin okoz ebben a használt carboplatin modellben.

A 2. ábra mutatja az eredmények összefoglalását is, aholis a oligopeptid mennyisége csökkentésének lehetőségét mutatjuk be. Az oligopeptidet 0,3 mg/kg/nap koncentrációban csak a 0., 0 0. és 4., a 0., 4. és 8.; és a 0., 4., 8. és 12. napon adjuk be. Érdemes megjegyezni, hogy a 0. és 4. napon beadott peptid mennyisége elég volt ahhoz, hogy a carboplatinnal kezelt egerekben védelmet mutasson. A védelem statisztikailag szignifikáns szintjét figyeljük meg a 11. és 14. napon. Érdemes megjegyezni, hogy a minimális kezelést kapott csoportokban nagyon változó a válasz. Az ilyen helyzet nem szokatlan, mivel ismert, hogy az egyedek különbözőképpen reagálnak ugyanarra a kezelésre. Mindazonáltal van statisztikailag szignifikáns hatás, amit a 2. számú szekvenciavázlaton megadott oligopeptid okoz, csak a 0. és 4. napon adva. Ugyanígy, a 0., 4. és 8., valamint a 0., 4., 8. és 12. napon végzett beadás szignifikáns hatással volt a trombocitopéniára. Az ezzel a minimális dózissal megfigyelt hatás összehasonlítható az oligopeptid folyamatos beadása soréin (a 0-13. napon) megfigyelt hatással. A csökkent dózis ilyen lehetősége, ugyanazzal a terápiás hatással, nyilvánvalóan előnyös klinikailag.

A vad-típusú TPO-Rp-vel és a jelen találmány szerinti oligopeptidekkel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a peptid ha

- 63tásmechanizmusa eltér a természetes hormonétól. Úgy tűnik, hogy a trombopoietinnek nincs hatása olyan betegekre, akik először megkapták a kemoterápiát, majd néhány nappal később trombopoietinnel kezelték őket. Ennek megfelelően, az alábbi kísérletet hajtottuk végre.

Carboplatinnal kezelt állatok egy csoportja, melyek a kemoterápiás ágenst a 0. naptól kezdve kaptáik, a trombopoietint 10 pg/kg/nap dózisban kapjáik a 8-14. napon. Hasonlóképpen, egy másik csoportban a 2. számú szekvenciavázlaton megadott oligopeptidet adjuk 0,3 mg/kg/nap dózisban a 8-14. napon a carboplatinnal kezelt állatoknak, amiknek a kezelése a 0. napon indult. Az eredményeket a 2. ábrán adjuk meg. A trombopoietinnek nincs szignifikáins hatása a trombocitopéniára. Ezzel szemben, a TPO-Rp (2. számú szekvencia) előnyös hatással van a vérlemezke-szintre, annak ellenére, hogy a terápia megkezdése után adjuk be. A vérlemezke-szint statisztikailag szignifikáns növekedése az oligopeptiddel kezelt állatokban azt sugallja, hogy a védő hatása nemcsak akkor van meg, ha a terápia kezdetétől adjuk be. Ez a megfigyelés a jelen találmány szerinti oligopeptidnek nemcsak azt a képességét mutatja meg, hogy megakadályozza a carboplatin káros hatását, ha a terápia megkezdése utém adjuk be, hanem azt is jelzi, hogy az oligopeptidnek a hatásmechanizmusa eltér a trombopoietinétől. így mindkét hatás, azaz i) a kezelési ütemterv és ii) az eltérő hatásmechanizmus - jelentős előnyöket biztosít.

3. Példa

Az oligopeptid farmakokinetikája ex vivo

Módszerek:

A vad-típusú TPO-Rp, a TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A, 2. számú szekvencia) és a TPO-Rp 4-18 (R9A, R11A, 4. számú szekvencia) lebomlási profiljait vizsgáltuk humán szérumban (200 betegből összegyűjtött szérum) és patkány plazmában (50 állat összegyűjtött plazmája). Ahhoz, hogy ki tudjuk mutatni a lebomlást, ¹²⁵I-vel jelzett peptideket használunk (az Y114-en jelezve). Csak az intakt peptidet és a jelzett bomlásterméket mutatjuk ki HPLC elemzéssel. Ennek következtében az ilyen, különböző pontokban elvégzett elemzés világosan kimutatja, ha egy peptid bomlik. Az inkubálást 37 °C-on hajtjuk végre. A jelzett peptid koncentrációja ezekben a vizsgálatokban körülbelül 1 gmol/l.

Eredmények

A peptid egyesített patkány plazmában való bomlása eredményeit a III. táblázatban mutatjuk be. A TPO-Rp felezési ideje körülbelül 12 percnek adódott. A TPO-Rp 1-18 a 2. számú szekvenciával valamivel rövidebb, körülbelül 1,1 perces felezési időt mutat, míg az oligopeptid a 4. számú szekvenciával nagyon rövid, körülbelül 0,5 perces felezési időt ad patkány plazmában • · · ·

65- ·,«. .. ...

III. Táblázat

A peptidek ex vivo stabilitása 37 °C-on

A peptidek felezési ideje (perc)

Peptid	Egyesített patkány plazma	Egyesített humán szérum
TPO-Rp, vad-típus	12,1	1,9
TPO-Rp (1-18; R9A, R11A)	1,1	9,6
TPO-Rp (4-18; R9A, R11A)	0,5	4,9

A peptid egyesített humán szérumban való bomlási eredményeit is bemutatjuk a III. táblázatban. A patkány plazmával szemben a humán szérumban a TPO-Rp vad-típusú peptid felezési ideje körülbelül 1,9 perc. A TPO-Rp (4-18; R9A, RllA)-nak megnőtt a stabilitása, felezési ideje körülbelül 4,9 perc. Jelentősen hosszabb felezési időt kapunk az 1-18 (R9A, R11A) oligopeptiddel, ennek felezési ideje körülbelül 9,6 perc, ami a vad-típusú oligopeptidénél ötször jobb stabilitást jelent. Ez szignifikáns javulást jelent, mivel a legtöbb pepiidnek viszonylag rövid a felezési ideje, körülbelül 2-3 perc. Meg kell jegyeznünk, hogy a TPO-Rp 1-18 R9A, RI 1A in vivo aktivitása jobb mint a vad-típusú TPO-Rp-é, annak ellenére, hogy felezési ideje rövidebb patkány plazmában.

A TPO-Rp 1-18 R9A, R11A (3 mg/kg) in vivo bomlási vizsgálatai patkányokban intravénás bolus beadása után a vérben 7,3 perces felezési időt mutat.

4. Példa

Peptid stabilitás

Módszerek

A használt HPLC módszer a minta UV detektálásán alapul, fordított fázisú oszlop rendszerről (C8 MICROSORB MV oszlop, Rainin Instruments Company) való eluálás során. A két pufferrendszer 9,5% 5 mmol/1 trifluorecetsawal (A puffer) és 5% acetonitrillel (B puffer) kezdődik. A minta injekciózása után a B százalékát gyorsan 10%-ra növeljük, majd 10 perc alatt fokozatosan 35 %-ra csökkentjük. A minta eluálási periódusát egy rövid oszlop-mosás követi, aminek során a B puffer arányát 90%-ra növeljük.

Eredmények

A vad-típusú TPO-Rp, a TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A, 2. számú szekvencia) és a TPO-Rp 4-18 (R9A, R11A, 4. számú szekvencia) stabilitását HPLC elemzéssel vizsgáljuk, a három peptidet az alábbi három hőmérsékleten tárolva (~20 °C), 4 °C és -20 °C. A peptideket vagy 1 mg száraz porként, vagy 1 mmol/l-es vizes oldatban tároljuk, és egyik esetben sem adunk hozzá töltőanyagokat. A három említett peptid HPLC elúciós profiljának a 0. napon történő meghatározása után a HPLC elúciós profilt a második, kilencedik és tizennegyedik napon újra meghatározzuk.

A 3. ábra 30 nmol vad-típusú TPO-Rp és a rövidebb oligopeptidek HPLC elúciós profilját mutatja a vizsgádat kezdetén,

- 67amikor 1 mmol/l-es peptid-oldatokat készítünk a száraz porból. A 4. ábra mutatja az 1 mmol/l-es oldatként tárolt peptidek HPLC elúciós profilját a vizsgálat második napján (4A. ábra, vagy a száraz por esetében 4B. ábra). A peptid-stabilitási vizsgálat 9. napján, amint az az 5A. és 5B. ábrán látható, nincs változás a pepiid HPLC elúciós profiljában, jelezve ezzel, hogy nagy a peptidek stabilitása, ha szobahőmérsékleten, 4 °C-on vagy körülbelül 20 °C-on tároljuk őket. Megjegyzésre érdemes, hogy a peptid stabilitási vizsgálat 14. napján (6A. és 6B. ábra) a vad-típusú TPO-Rp és a két jelen találmány szerinti oligopeptid változatlan HPLC profilt mutat. A peptidbomlás jelei nem mutathatók ki, ha a peptideket 1 mmol/l-es oldat formájában tároljuk, vagy por formájában, szobahőmérsékleten, 4 °C-on vagy körülbelül 20 °C-on tároljuk őket. Ebből az a következtetés vonható le, hogy a TPORp és a jelen találmány szerinti oligopeptid két hétig tárolható 1 mmol/l-es oldat formájában vízben, vagy száraz porként, szobahőmérsékleten, 4 °C-on vagy körülbelül 20 °C-on, anélkül hogy a peptid bomlásának bármilyenjeiét tapasztalnánk.

A további vizsgálatok kimutatták, hogy a vad-típusú TPORp oligopeptid és a 2. számú szekvenciavázlatnak megfelelő peptid, 1 mmol/l-es oldat formájában vízben, sóoldatban vagy 0,1% humán albumint tartalmazó sóoldatban -20 °C-on, 4 °C-on és szobahőmérsékleten 1, 3 vagy 4 hétig tárolva a HPLC vizsgálatok szerint nem mutatja bomlás jelét.

5. Példa

A TPQ-Rp 1-18 R9A, R11A formulázása és gyártási eljárása 5A) Hordozó oldat

Adalékanyagok	v%	mg/ml 41iteres sarzs
Nátrium-acetát trihidrát, USP ।	0,136	1,361 5,444 g
10 mmol/1 (Ms: 136,08)
Víz injekciózáshoz, USP, q.s.	100	1 ml 4 liter
pH*		5,3 ± 0,2
* (10 mol/1 HC1, majd 1 mol/1 HC1	vagy 1	mol/1 NaOH oldat a pH
beállításához, ha szükséges
Mannit, USP	5,0	50 200 g

Gyártási eljárás:

1. 90% (3,6 liter) injekciózáshoz való vizet (WFI) teszünk egy megfelelő üvegedénybe

2. 5,444 g nátrium-acetát trihidrátot adunk a #-hez

3. A #2 pH-ját 10 mol/1 sósav (körülbelül 600 μΐ) és további 1 mol/1 sósav vagy nátrium-hidroxid oldattal, ha szükséges, akkor 5,3 ± 0,2-re állítjuk.

4. A #3-ban 200 g mannitot oldunk fel. Enyhe kevertetéssel addig kevertetjük, amíg teljesen feloldódik.

5. Elegendő mennyiségű WFI-t adunk #4-hez, annak térfogatát 4 literre feltöltve. Addig kevertetjük, amíg teljesen homogén lesz.

6. Aszeptikus körülmények között a #5 oldatot egy 0,2 mikronos membránon keresztül szűrjük egy steril tárolóedénybe.

7. Az oldatot (100 ml/ampulla) aszeptikusán töltjük 7 l-es típus üveg ampullába, a sterilizálási eljárás szerint elkészítve. Emellett két hasonlóképpen sterilezett ampullát (10 ml per ampulla) töltünk meg kiindulási és visszatartott mintaként. Ezt szürke Teflon butil záróval és alumínium pecséttel zárjuk le.

5B) Injekciózható oldat (1 mg/ml)

Adalékanyagok	v%	mg/ml	600 ml-es sarzs
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A (víz-	0,1	1	0,66 g*
mentes szabad bázis) por*
Hordozó (lásd 5A)	100	1 ml	600 ml

Megjegyzés: (az 5B-hez, 5C-hez és 5D-hez)

A TPO-Rp 1-18, R9A, RllA-t víztartalmú acetátsó alakjában biztosítjuk. A mennyiséget az alábbiak szerint számítjuk ki:

A peptid-por mennyisége (víztartalmú acetátsó) = a szabad bázis szükséges mennyisége %-os peptidtartalom * 90,7% peptidtartalom alapján

Gyártási eljárás

1. A hordozó oldatból pontos mennyiséget (600 ml) teszünk egy megfelelő üveg tárolóedénybe

2. Az oligopeptid porból pontos mennyiséget (0,66 g por) teszünk az edénybe, majd a # 1-ben oldjuk, jól összekeverjük.

3. A #2 oldat pH-ját megmérjük, majd szükség esetén 5,3 ± 0,2re állítjuk

4. A #3 oldatot egy 0,2 gm-es membránon (Millipore Durapore membrán, vagy annak ekvivalense) steril körülmények között sterilre szűrjük.

5. Az oldatot (75 ml/ampulla) aszeptikusán töltjük 7 l-es típus üveg ampullába, a sterilizálási eljárás szerint elkészítve. Emellett két hasonlóképpen sterilezett ampullát (10 ml per ampulla) töltünk meg kiindulási és visszatartott mintaként. Ezt szürke Teflon butil záróval és alumínium pecséttel zárjuk le.

5C) Injekciózható oldat (5 mg/ml)

Adalékanyagok	v%	mg/ml	600 ml-es sarzs
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A (víz-	0,5	1	3,3 g*
mentes szabad bázis) por*
Hordozó (lásd 5A)	100	1 ml	600 ml

Gyártási eljárás: lásd az 5B eljárást, azzal az eltéréssel, hogy a mennyiségeket a fenti táblázatnak megfelelően módosítjuk.

5D) Injekciózható oldat (9 mg/ml)

Adalékanyagok	v%	mg/ ml 600 ml-es sarzs
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A (víz-	0,9	1 6,45 g*
mentes szabad bázis) por*
Hordozó (lásd 5A)	100	1 ml 650 ml

- 71Gyártási eljárás: lásd az 5B eljárást, azzal az eltéréssel, hogy a mennyiségeket a fenti táblázatnak megfelelően módosítjuk.

6. Példa

Módszerek: in vitro jeladási vizsgálat

A sejtek kezelése:

TF-1 sejteket szaporítunk körülbelül 1^χ10⁶ sejt sűrűségig RPMI 1640 táptalajban, amit 1* penicillin/sztreptomicin-nel, 2 mmol/1 glutaminnal, 10% boíjúmagzat szérummal (Hyclone) és 1 ng/ml granulocita makrofág telepserkentő faktorral (GM-CSF) egészítünk ki, majd lecentrifugáljuk és 3% szérumot tartalmazó közegben szuszpendáljuk, ami viszont nem tartalmaz granulocita makrofág telepserkentő faktort. A sejteket 14-18 óra hosszat 37 °C-on éheztetjük (5% CO2-t tartalmazó atmoszféra), lecentrifugáljuk, és IxlO⁶ sejt/ml sűrűségben szérumot és granulocita makrofág telepserkentő faktort nem tartalmazó közegben reszuszpendáljuk. 2 ml sejtszuszpenziót 30 percig kezelünk trombopoietinnel (amint azt a kísérletben ismertetjük) 37 °C-on (5% CO2-t tartalmazó atmoszféra). 10 ml jéghideg sejtmosó puffért adunk hozzá minden egyes Falcon csőben, majd gyorsan lecentrifugáljuk (4 °C, 3000 per perc fordulatszám). A közeget óvatosan leszívjuk, majd a mosást kétszer megismételjük foszfáttal puffereit sóoldattal.

A következő lépéseket jégen hajtjuk végre. A közeget leszívjuk, és csövenként 0,6 ml 2^X lízis-puffert adunk hozzá. Pipettával felszívjuk, majd visszaeresztjük, majd Eppendorf csövekbe

- 72visszük át, ezeket körülbelül 30 percre jégbe tesszük, majd 10 percig 14000xg-vel centrifugáljuk. A felülúszót (lizátum) használjuk az immunprecipitációkban.

Immunprecipitációk: 20-40 μΐ GammaBind G Sepharose szuszpenziót használunk minden egyes immunprecipitációhoz. A protein G gyöngyöket Eppendorf csövekben többször mossuk 0,5x lízis pufferrel, majd immunprecipitációnként 1-4 pg PY-99 ellenanyagot (Santa Cruz.Biotechnology) adunk hozzá. A csöveket 2 óra hosszat szobahőmérsékleten forgatjuk a hossztengelyükre merőlegesen. A lizátumot hozzáadjuk, majd a csöveket tovább inkubáljuk éjszakán át 4 °C-on, a hossztengelyükre merőlegesen forgatva. A gyöngyöket háromszor mossuk 1* lízis pufferrel, majd egyszer mossuk 0,5 mol/1 TRIS-szel (pH=6,5). 50 pl SDS mintafelvivő puffért adunk hozzá, majd a mintákat három percig forraljuk, mielőtt a gélre visszük.

Western biot elemzés: mintánként körülbelül 10 pl-t futtatunk 8%-os poliakrilamid minigélen, PVDF membránra (Millipore) visszük át, 1 óra hosszat blokkoljuk blokkoló pufferben, majd aSTAT5 ellenanyaggal (Santa Cruz-Biotechnology) 1 óra hosszat 4 °C-on inkubáljuk, 1:1000 hígításban. A membránt mossuk, inkubáljuk megfelelő alkalikus foszfatázzal konjugált szekunder ellenanyaggal, l:2000-es hígításban szobahőmérsékleten, 2 óra hosszat. A PVDF membránt Blotto-val mossuk, majd NBT/BCIP-pel (Cappel) hívjuk elő.

- 73Eredmények:

Az értékeltük ki, hogy az oligopeptidek, amik a HPLC elemzés szerint a bomlás semmilyenjeiét nem mutatták, (lásd 4. példa), mennyire tartják meg biológiai aktivitásukat.

A jelen találmány szerinti oligopeptidek és a vad-típusú TPO-R aktivitását in vitro jelátviteli esszékkel vizsgáltuk. Az előzőkben azonosított standard eljárásokat használva TF-1 sejteket stimulálunk olyan peptid-mintákkal, amiken elvégeztük a HPLCelemzést. Mértük a foszforilezést, és ezzel a STAT5 (azaz a JAK2 kináz szubsztrátja, amit a TPO-R jelátvitel) aktiválását. A peptideket 3 pmol/l koncentrációban vizsgáltuk a stabilitási vizsgálat „18. napján” és 50 nmol/1 és 5 pmol/l koncentrációban a stabilitási vizsgálat „30. napján”. Minden peptidet háromszornégyszer értékelünk ki, független kísérletekben. Minden adatot összegyűjtünk, a Western biottokat beszkenneljük, és a STAT5 foszforilezés intenzitását mennyiségileg meghatározzuk.

Az összes kísérletből kapott adatot (átlag ± SEM) a IV-IX. táblázatban mutatjuk be (lásd az alábbiakban) (W: víz, S: sóoldat, H: 0,1% HSA). Az eredmények azt mutatják, hogy a peptidek aktivitásában mutatkozik valamennyi különbség, ha különböző körülmények között inkubáljuk őket. A stabilitási vizsgálat „18. napján” a TPO-Rp (1-18, R9A, R11A) peptid szignifikánsan lecsökkent aktivitást mutat, szobahőmérsékleten való tárolás után. Az aktivitás megmarad, ha a vegyületet 4 °C-on, vagy -20 °C-on tároljuk. Bár az aktivitás megőrződött, ha a peptidoldatot vízben vagy sóoldatban készítettük el, a vegyületek aktivitása sokkal

- 74jobban megőrződött 0,1% HSA hozzáadásával. Ezt a megfigyelést igazolják a stabilitási vizsgálat „30. napján” kapott eredmények. A 2. számú szekvenciavázlatnak megfelelő peptid 30 napig aktív marad, ha vízben oldjuk és -20 °C-on tároljuk. Ha sóoldatban, vagy sóoldat plusz 0,1% HSA-ban tároljuk, akkor az oldat mindkét hőmérsékleten (4 °C és -20 °C) aktív marad. Összehasonlításkánt: a stabilitási vizsgálat „30. napján” a vad-típusú TPO-Rp aktivitása szignifikánsan lecsökken, ha oldatban, vízben tároljuk, -20 °C-on.

Az előzőkben említett stabilitási vizsgálatokból kiderült, hogy a TPO-Rp (1-18. R9A, R11A, 2. számú szekvencia) meglehetősen stabil molekula, ha -20 °C-on bármilyen oldószerben tároljuk, és aktivitását egy hónapig megtartja. Érdekes módon, bár a peptidnek semmilyen bomlási formája nem volt megfigyelhető semmilyen oldatban vagy hőmérsékleten, az aktivitási esszéből valamennyi különbség kiderült.

7. Példa

A rövidített TPO-Rp oligopeptidek biológiai aktivitása

Módszerek:

Az 1-7. számú szekvenciavázlatnak megfelelő oligopeptideket szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő, majd ezt követően preparatív HPLC-vel 90-95%-ra tisztítjuk. Az oligopeptid azonosságát tömegspektroszkópiával és aminosav-elemzéssel vizsgáljuk. A jelzett molekulasúly a tömegspektroszkópiából származik

- 75(M+H⁺) (1. számú szekvencia: 2141; 2. számú szekvencia: 1971; 3. számú szekvencia: 1857; 4. számú szekvencia: 1687; 5. számú szekvencia: 2240; 6. számú szekvencia: 2069; 7. számú szekvencia: 2736; vad-típus: 2755).

A jelen találmány szerinti oligopeptidek dózis-hatás görbéjét meghatározzuk, és aktivitásukat a vad-típusú TPO-Rp-ével hasonlítjuk össze.

A peptid dózis-hatás aktivitását elsődlegesen in vitro jeladási esszékkel határoztuk meg. Mértük a foszforilezést, és ezzel a STAT5 (azaz a JAK2 kináz szubsztrátja, amit a TPO-R jelátvitel) aktiválását. Mindegyik oligopeptid aktivitását széles koncentráció-határok között határoztuk meg. A peptideket 0,3, 3, 10, és 30 nmol/1, valamint 0,1, 0,3, 3 és 30 pmol/l TPO-Rp koncentrációban vizsgáltuk. Az egyes kísérletekben a STAT5 foszforilezés mértékeként kapott oligopeptid aktivitást összehasonlítjuk a 10 ng/ml trombopoietin koncentrációval kapott aktivitással, egy olyan hormon koncentrációval, ami maximális aktiválást és jeladást biztosít a TPO-R-en keresztül Minden pepiidet háromszor-négyszer értékelünk ki, független kísérletekben. Minden adatot összegyűjtünk, a Western biottokat beszkenneljük, és a STAT5 foszforilezés intenzitását mennyiségileg meghatározzuk.

Eredmények:

Az egyes oligopeptidek aktivitását maximális aktivitásuk százalékaként közelítettük meg; azaz 100% aktivitást a STAT5 fe

- 76hérje foszforilezési értékéhez, amit 30 gmol/l oligopeptid koncentrációnál kaptunk.

Az eredmények világosan mutatják, hogy mindegyik oligopeptidnek annyi aktivitása maradt meg, ami összehasonlítható a vad-típusú TPO-Rp-ével. A X. táblázatban (lásd az alábbiakban) minden egyes vizsgált oligopeptid hozzávetőleges EC50 értékét foglaltuk össze.

Az oligopeptidek első csoportja (Al - L18, 1. és 2. számú szekvencia) nemcsak a vad-típusú TPO-Rp aktivitásával összehasonlítható aktivitást mutatott, hanem R9A, R11A formájában a potenciál javulását is mutatta (körülbelül EC50 10 nmol/1). Érdemes megjegyezni, hogy az oligopeptidnek ez a része létfontosságúnak bizonyult a TPO-Rp aktivitása szempontjából, amikor alanin-sétával és szerkezeti elemzéssel vizsgáltuk. Az aktivitás növekedhet, az oligopeptid struktúrájának, stabilitásának, vagy mindkettőnek a javulása miat.

A legrövidebb, 15 aminosavból álló oligopeptid (G4-L18, 3. és 4. számú szekvencia) mindkét formájában megtartotta a vadtípusú TPO-Rp-vel összehasonlítható aktivitását. Az oligopeptidek harmadik csoportja (G4-R21, 5. és 6. számú szekvencia) mindkét formájában a vad-típusú TPO-Rp-vel azonos aktivitást mutatott.

8. Példa 28-napos intravénás toxicitási vizsgálat a 2. számú szekvenciavázlatnak megfelelő peptiddel patkányokban

A 2. számú szekvenciavázlatnak megfelelő peptid lokális és szisztémás toxicitását vizsgáltuk ebben a 28-napos intravénás vizsgálatban, Crl:CD (SD)IGS BR patkányokban. A magas dózist kapó csoportnál a hatásokból való regenerálódást egy 28-napos regenerálódási periódus alapján becsültük meg. A pepiidet bolus intravénás injekciókkal adjuk be az oldalsó farokvénán keresztül, a három toxikológiai csoportnak (2., 3. és 4. csoport) és a három toxikokinetikus csoportnak (2A., 3A. és 4A. csoport), 5, 15 és 45 ^mg/kg/^naP dózisban, minimum 28 egymás utáni napon. Egy egyidejűleg indított hordozó csoport (1. csoport) 5% mannit oldatot, 10 mmol/1 nátrium-acetátot kapott egy összehasonlítható rendszerben. A hordozó és a 45 mg/kg/nap csoport 15 nőstényből és 15 hímből állt, az 5 mg/kg/nap és a 15 mg/kg/nap csoport 10 nőstényből és 10 hímből állt, míg a három toxikokinetikai csoport 9 nőstényből és 9 hímből állt. A dózis térfogata minden csoportban 5 ml/kg volt.

A kezelés előtt, közvetlenül a kezelés után, a kezelés után egy órával és a regenerálódási periódusban naponta egyszer a toxikológiai csoportba sorolt összes állatnál megfigyeltük a toxicitás klinikai tüneteit. Részletes fizikai vizsgálatokat végeztünk, és hetente feljegyeztük az egyes testsúlyokat és táplálékfogyasztást. A klinikai patológiai paramétereket (hematológia, szérumkémia és urinalízis) kiértékeltük kezelés megkezdése előtt, a kezelési

- 78periódus középső pontjában és a primer valamint regenerációs boncolásoknál. Az elővizsgálati periódusban és a tervezett boncolásoknál csontvelő keneteket készítettünk. Szérummintát vettünk az ellenanyag meghatározásokhoz a primer boncolásnál. Szemészeti vizsgálatokat végeztünk a kezelés megkezdése előtt, a vizsgálat harmadik hetében és a regenerálási periódusban, a vizsgálat hetedik hetében. Mindegyik állatot teljesen felboncoltuk. A kiválasztott szerveket lemértük a primer és a regenerációs boncolásoknál. A primer boncolásnál vett kiválasztott szöveteket mikroszkóposán megvizsgáltuk.

A plazma vizsgált komponense szintjének meghatározásához vérmintákat veszünk a 0., 6., 14., 20. és 27. napon, az állatok egy külön csoportjából, amiket a vizsgálat toxikokinetikai részéhez állítottunk össze.

A túlélést, a testsúlyokat, a táplálékfogyasztást, a klinikai patológiai paramétereket, a szervsúlyokat és a csontvelő citológiát nem érintette a peptiddel végzett kezelés. Nem voltak a peptidhez kapcsolható szemészeti, makroszkópos vagy mikroszkópos megfigyelések.

A 2. számú szekvenciának megfelelő peptidet a hím és nőstény állatok jól tolerálták a 28 nap során. A hím patkányok prosztata-súlya alapján a nem-megfígyelt hatás-szint (NOEL) nőstényekben 45 mg/kg/nap volt.

9. Példa

A 2. számú szekvenciának megfelelő peptid 28-napos intravénás toxicitási vizsgálata majmokban

A 2. számú szekvenciának megfelelő peptid lokális és szisztémás toxicitását jellemeztük ebben a 28-napos intravénás vizsgálatban Cynomolgus majmokban. A peptid-hatás reverzibilitását is megbecsültük egy 28-napos regenerálódási periódus után. A peptidet bolus intravénás injekciókkal adtuk be egy rózsavénán keresztül három csoportnak, 5, 15 és 30 mg/kg/nap dózisszinten, 28 egymást követő napon. A nőstény majmokat a terv szerint a hím majmok kezelésének megkezdése után egy nappal kezdtük kezelni. Egy hordozó kontroll csoport 5% mannit oldatot, 10 mmol/1 nátrium-acetátot kapott egy összehasonlítható kezelés során. A hordozó kontroll csoport és a 30 mg/kg/nap csoport 5 hímből és 5 nőstényből állt. Az 5 és 15 mg/kg/nap csoport három hímből és három nőstényből állt. A dózis térfogata mindegyik csoportban 5 ml/kg volt

Minden majmot a 8. példában ismertetett módon figyeltünk meg.

Vérmintákat vettünk három majom/szex/csoport-ból a 0., 7., 14., 21. és 27. napon a 2. számú szekvenciának megfelelő peptid koncentrációjának meghatározására, és a toxikokinetikai paraméterek kiszámítására.

Ebben a vizsgálatban nem voltak halálesetek. A klinikai jelek a legtöbb majomnál megjelentek a legtöbb dóziscsoportban, a peptid intravénás beadását követően. Az 5 mg/kg/nap peptidet

- 80kapott hímeknél nem voltak a vegyülethez kapcsolható klinikai tünetek.A 15 mg/kg/nap dózist kapott hímeknél arcpír (3/3) és nyáladzás (1/3) volt megfigyelhető. A 30 mg/kg/nap dózist kapott hímeknél arcpír (4/5), a testfelszín kipirosodása (3/5), nyáladzás (3/5), hányás (1/5) és csökkent izomtónus (1/5) volt megfigyelhető. Az 5 mg/kg/nap dózist kapott nőstényeknél arcpír volt megfigyelhető (2/3). A 15 mg/kg/nap dózist kapott nőstényeknél arcpír (3/3), a testfelszín kipirosodása (2/3) és nyáladzás (1/3) volt megfigyelhető. A 30 mg/kg/nap dózist kapott nőstényeknél arcpír (5/5), a testfelszín kipirosodása (4/5), nyáladzás (4/5), hányás (2/5) és csökkent izomtónus (1/5) volt megfigyelhető. Mindegyik klinikai tünet elmúlt, és a peptid beadása után egy órával már nem volt nyilvánvaló. A regenerációs periódus alatt egyik klinikai tünet sem fordult elő.

A testsúlyokat, a klinikai patológiai paramétereket (hematológia, szérumkémia és urinalízis), a fiziológiás paramétereket (testhőmérséklet, szívverés, vérnyomás és légzési gyakoriság), az elektrokardiográfiás kiértékelést és a szervsúlyokat nem érintette a peptiddel végzett kezelés. Nem voltak a vizsgált pepiidhez kapcsolható szemészeti, makroszlópos vagy mikroszkópos megfigyelések. Nem voltak nyilvánvaló különbségek a peptidekhez kapcsolható megfigyelésekben a hímek és a nőstények között.

A 2. számú szekvenciának megfelelő pepiidet jól tolerálták, amikor hím és nőstény majmoknak adtuk be 28 napig maximum 30 mg/kg/nap dózisban. A közvetlenül a dózis beadása után megfigyelhető arcpír alapján a nem-megfigyelt hatás-szint (NOEL)

- 81hímekben 5 mg/kg/nap volt. A nőstényekben NOEL nem volt megállapítható. Mivel a klinikai tünetek és az izomgyengeség (amit a vizsgálat 1. napján, csak 1/5 nősténynél és 1/5 hímnél lehetett megfigyelni) ideiglenes volt, és más, a vizsgált anyaghoz kapcsolódó hatások nem voltak megfigyelhetők, ennek alapján a nem-megfigyelt káros hatás-szint (NOAEL) majmokban 30 mg/kg volt mindkét nemnél.

10. Példa

A 2. számú szekvenciának megfelelő peptid hatása a hisztamin felszabadulására

A 2. számú szekvenciának megfelelő peptidnek a hisztamin felszabadulásra gyakorolt hatását vizsgáltuk in vitro perifériális vér mononukleáris sejtekben (PBMC).

Négy különböző alanyból származó PBMC-t vizsgáltunk. A leukocita szuszpenziókat a 2. számú szekvenciának megfelelő peptid különböző koncentrációival inkubáljuk, 3 pmol/l - 10 mmol/1 koncentrációban. Humán anti-IgE ellenanyagot illetve puffért használunk pozitív és negatív kontrollként. A felszabadult hisztamin mennyiségét ELISA-val határozzuk meg (IBL, katalógusszám RE 59221). Az esszé érzékenysége 2,4 ng/ml.

A 3 pmol/l - 10 mmol/1 koncentráció-tartományt úgy választottuk ki, hogy a peptid hisztamin felszabadító hatását kiértékeljük az intravénás injekció után kapott szinteken. Azaz a 30 mg/kg koncentráció közvetlenül az injekciózás után körülbelül 38 pmol/l-nak felel meg, feltételezve, hogy egy különbség sző

- 82vetre számítva a disztribúciós térfogat 400 ml. A peptidről ismert, hogy szabadon eloszlik az extracelluláris folyadékban. Tehát a peptid legmagasabb koncentrációja 10 mmol/l-nél körülbelül 100-szor magasabb, mint az extracelluláris folyadékban kapott legmagasabb koncentrációk.

A legmagasabb, 10 mmol/1 koncentrációban a peptid viszonylag csekély, de szignifikáns hisztamin felszabadulást eredményez (15 ng/ml). Ez az érték körülbelül lOx alacsonyabb, mint a pozitív kontrolié (anti-IgE). A peptid 3,3 mmol/1 vagy alacsonyabb koncentrációban nem volt hatással a hisztamin felszabadulására humán PBMC-ben. A tartomány tartalmazza az összes terápiás in vivo koncentrációt. In vitro csekély, de szignifikáns hisztamin felszabadulás volt megfigyelhető a legmagasabb, 10 mmol/1 peptid-koncentrációban. Ez a koncentráció szignifikánsan magasabb, mint bármilyen terápiás dózis.

11. Példa

A majmokból és patkányokból származó szérum-mintákat elemezzük, hogy kimutassuk az IgG jelenlétét Cynomolgus majmokban és patkányokban, amiket a 8. és 9. példában vizsgáltunk. A 32 majom szérum-minta és a 80 patkány szérumminta közül egyikből sem lehetett a 2. számú szekvenciának megfelelő peptid elleni ellenanyagokat kimutatni.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

- 83Szekvencialista <110> PLIVA, farmaceutska industry a, dionicko drustvo <120> Thrombopoietin Receptor Peptid <130> 14267 <140>

<141>

<160> 7 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 1

Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu 15 10 15

Gin Leu <210>2 <211> 18 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 2

Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu

10 15

Gin Leu

- 84<210>3 < 211> 15 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 3

Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gin Leu 15 10 15 <210>4 < 211> 15 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 4

Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu Gin Leu

10 15 < 210> 5 < 211> 18 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 5

Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gin Leu Arg

10 15

Ala Arg < 210> 6 < 211> 18 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 6

Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu Gin Leu Arg 15 10 15

Ala Arg < 210> 7 < 211> 23 < 212> fehérje < 213> Homo sapiens < 400> 7

Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Phe Arg Leu 15 10 15

Gin Leu Arg Ala Arg Leu Asn

Claims

- 86SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Oligopeptid, ami a TPO (trombopoietin) receptor modulátor aktivitásával rendelkezik, 15-18 aminosavból áll, általános képlete az alábbi:

X1GTLELX2PX3SRYRLQLX4, amiben

Xi jelentése A R G vagy hiányzik,

X2 jelentése R vagy A,

X3 jelentése R vagy A, és

X4 jelentése R A R, vagy hiányzik.
2. Az 1. igénypont szerinti oligopeptid, amit az 1-6. számú szekvenciavázlatok bármelyike által definált amino sav szekvenciák csoportjából választhatunk ki, vagy ezek biológiai ekvivalensei.
3. Oligopeptid, aminek az aminosav szekvenciáját a 7. számú szekvenciavázlaton adjuk meg.
4. Nukleotid szekvencia, ami az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidet kódolja.
5. Vektor, ami a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza.
6. Az 5. igénypont szerinti vektor, ami bakteriális, virális, emlős vagy élesztő vektor.
7. Az 5. vagy 6. igénypontok bármelyike szerinti vektor, ami 5' és/vagy 3' szabályozó elemeket tartalmaz, amik képesek vezérelni a nukleotid szekvencia expresszióját egy megfelelő gazdasejtben.
8. Gazdasejt, ami az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmazza, amely megfelelő körülmények között képes expresszálni az 1. vagy 2. oligopeptidet.
9. A 8. igénypont szerinti gazdasejt, ami emlős-, élesztővagy baktériumsejt.
10. Eljárás egy sejt genetikai módosítására, azzal jellemezve, hogy a sejtet egy, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektorral transzfektáljuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtet kémiailag vagy elektromos erőtérrel indukált transzfekcióval transzfektáljuk, pontosabban elektroporációval vagy sejtfúzióval, retrovirus vagy vírus által befolyásolt géntranszferrel, liposzóma által befolyásolt géntranszferrel vagy részecske bombázással.
12. Eljárás nem-humán emlősállat létrehozására, amely képes az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptid előállítására azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvenciát egy nem-humán állati sejtbe visszük be.
13. Nem-humán emlősállat, amely csírasejtjeiben és/vagy szomatikus sejtjeiben a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza, illetve a 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejtet tartalmazza.
14. A 13. igénypont szerinti nem-humán állat, ami lehet rágcsáló vagy főemlős.
15. Eljárás az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtet az 5-7. igénypontok

- 88bármelyike szerinti vektorral transzformálunk, a sejtet tenyésztő táptalajban tenyésztjük, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik az oligopeptid expresszióját, majd az oligopeptidet kinyerjük a sejtből vagy a tenyésztő táptalajból.
16. Ellenanyag, ami specifikusan kötődik az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidhez.
17. A 16. igénypont szerinti ellenanyag, ami lehet monoklonális ellenanyag vagy poliklonális ellenanyag, vagy annak fragmense.
18. Ellenanyag, ami specifikusan kötődik a 16. vagy 17. igénypont szerinti ellenanyaghoz.
19. Gyógyászati készítmény hematológiai rendellenességek, pontosabban trombocitopénia kezelésére, ami tartalmazza az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidet, a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvenciát, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektort, a 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejtet, vagy a 16., 17. vagy 18. igénypont szerinti ellenanyagot, adott esetben egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.
20. Diagnosztikai készítmény hematológiai rendellenességek, pontosabban trombocitopénia diagnosztizálására, ami tartalmazza az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidet, a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvenciát, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektort, a 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejtet, vagy a 16., 17. vagy 18. igénypont szerinti ellenanyagot, adott esetben egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.

- 89- .......^.. *^J
21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti gyógyászati vagy diagnosztikai készítmény, ami tartalmaz még trombopoietint.
22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati vagy diagnosztikai készítmény, aminek a kiszerelési formája lehet tabletta, pirula, kapszula, granulátum, kúp, por, tapasz, liposzóma, bevonat, oldat injekciózáshoz, infúzióhoz vagy orális beadáshoz, szirup, szuszpenzió, emulzió, permet, inhalátum, aeroszol, paszta, balzsam vagy lemosó.
23. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptid, a 4. igénypont szerinti nukleotid szekvencia, az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti vektor, a 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejt és/vagy a 16., 17. vagy 18. igénypont szerinti ellenanyag olyan gyógyszer előállítására, amivel hematológiai rendellenességek, pontosabban trombocitopénia diagnosztizálható vagy kezelhető.
24. A 23. igénypont szerinti alkalmazás, amiben a gyógyszer tartalmaz még trombopoietint is.
25. Eljárás a TPO-R (trombopoietin-receptor) aktivitásának modulálására, azzal jellemezve, hogy az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidet vagy a 16., 17. vagy 18. igénypont szerinti ellenanyagot alkalmazzuk a TPO-R-re, trombopoietin jelenlétében vagy távollétében.
26. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a modulálás az aktivitás csökkentését vagy növelését jelenti.
27. Eljárás hematológiai rendellenességek, pontosabban trombocitopénia diagnosztizálásában vagy kezelésében hatékony gyógyszer hatóanyagok keresésére, azzal jellemezve, hogy a po-

- 90Ο· ·· »*· ·*<

tenciális gyógyszer hatóanyagokat megvizsgáljuk, hogy képesek-e versengeni az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptiddel a TPO-R-hez való kötődésben, vagy az intracelluláris jeladási bioszintézis út aktiválásában.
28. Eljárás olyan rendellenességben szenvedő beteg kezelésére, aki érzékeny egy trombopoietin agonistával való kezelésre, azzal jellemezve, hogy a betegnek terápiásán hatásos dózist vagy mennyiséget adunk be az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidből és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-ből.
29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rendellenességek hematológiai rendellenességek vagy trombocitopénia, ami csontvelő transzfúzióból, besugárzásos kezelésből, kemoterápiából, allergiás reakciókból származik, vagy idiopátiás.
30. A 18. vagy 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy trombopoietin beadását is tartalmazza.
31. A vad-típusú TPO-Rp, a vad-típusú TPO-Rp-t kódoló nukleotid szekvencia, a nukleotid szekvenciát tartalmazó vektor, a vektort tartalmazó gazdasejt és/vagy a vad-típusú TPO-Rp-hez specifikusan kötődő ellenanyag alkalmazása hematológiai rendellenességek, különösen trombocitopénia kezelésére használható gyógyszer előállítására.
32. Eljárás TPO-R kimutatására vagy izolálására egy TPOR-t tartalmazó forrásból, azzal jellemezve, hogy az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti oligopeptidet alkalmazzuk a TPO-R-t tartalmazó forrásra, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik a

- 91TPO-R-nek az oligopeptidekhez való kapcsolódását és ezekből a TPO-R izolálását.
33. Immunesszé az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligopeptidek kimutatására és/vagy izolálására egy elegyből, amiben a 16. vagy 17. igénypont szerinti ellenanyagokat alkalmazzuk az elegyre, és az ellenanyagokhoz kötött oligopeptideket kimutatjuk és/vagy izoláljuk.

A meghatalmazott iíj. Szentpéteri Ádám

Ügyvivői Iroda <!62 BudapestAHdrássy út 113. 4614U00 Fax: 4614099 píulLmv