HUP0204341A2 - Új, gyökérpreferáló promoterelemek és alkalmazásuk - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát nukleotidszekvenciák expressziójának egy növénybenvaló szabályozására szolgáló készítmények és eljárások képezik. Akészítmények új, gyökérpreferáló promoterelemek nukleotidszekvenciáités a promoterelemekből álló promotereket tartalmaznak. Eljárásokatbiztosítanak továbbá egy nukleotidszekvencia kifejeztetésére egynövényben a találmány szerinti promoter-szekvenciák alkalmazásával. Azeljárások magukban foglalják egy növényi sejt transzformálását egytranszformációs vektorral, amely egy nukleotid-szekvenciát tartalmazműködőképes módon összekapcsolva a találmány szerinti növényipromoterek egyikével, majd egy stabilan transzformált növényregenerálását a transzformált növényi sejtből. Ó

Description

K. ‘'M¹' :. ’·* ·?5:<Χ6υ'ΒΕ

Szabadalmi Ügyvivői Iroda .1.

H-1062 Budapest, Ándrássy út 113.

Telefon: 461-1000, Fax: 4Ó1-1099

Új, gyökérpreferáló promoter-elemek és alkalmazásuk

A találmány tárgyát a növényi molekuláris biológia területén különösen a génkifejeződés szabályozása képezi.

A DNS-szekvenciák kifejeződése egy növényben egy működőképes módon hozzájuk kapcsolódó promotertől függ, amely funkcióképes az adott növényben. A promoter megválasztása határozza meg, hogy a DNS-szekvencia mikor és hol fejeződjön ki a szervezeten belül, így tehát abban az esetben, ha folytonos expressziót kívánunk egy növény összes sejtjében, egy konstitutív promotert használunk. Ezzel szemben ha a gén kifejeződését egy stimulustól kívánjuk függővé tenni, az indukálható promoterok lesznek a kiválasztott szabályozó elemek. Ha az expresszió fellépése meghatározott szervekben vagy szövetekben kívánatos, akkor szövetpreferáló promoterokat használunk. A promoter-mag mellett regulátor szekvenciák vagy promoter-elemek is lehetnek jelen a promoter-magtól felfelé és/vagy lefelé a transzformációs vektorok expressziós szerkezetében, hogy biztosítsák az adott nukleotid-szekvenciák különböző szintű kifejeződését egy transzgén növényben.

Gyakran kívánatos, hogy egy DNS-szekvencia szövetpreferáló módon fejeződjön ki egy növény bizonyos szövetében vagy szerveiben. így például fokozott ellenállóképességet biztosíthatunk egy növénynek a talajból vagy levegőből támadó kórokozókkal szemben, ha úgy módosítjuk a genomját, hogy az egy szövetpreferáló promoterral működőképes módón összekapcsolt kórokozó—rezisztencia gént tartalmazzon, ami a kívánt növényi szövetben fejeződik ki. Másrészt kívánatos lehet egy natív DNS-szekvencia kifejeződésé2 nek gátlása is egy növényi szövetben, hogy egy kívánt fenotípust érjünk el.

Számos laboratóriumban azonosítottak olyan promoterokat és megfelelő, DNS-hez kötődő fehérjéket, amelyek speciális szövetekre korlátozódnak növényekben (Weising et al., Z. Natuforsch C4_6, 1; Oeda et al., EMBO J. 10, 1973; Takatsuji et al. , EMBO J. 11, 241; Yanagisawa et al., Plant Mol. Biol. 19, 545; Zhou et al., J. Biol. Chem. 267, 23515; Consonni et al., Plant J. 3, 335; Foley et al., Plant J. _3, 669; Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9586) . Valószínű, hogy nagy számú DNS-kötő faktor jelenléte specifikus szövetekre korlátozódik, illetve csak meghatározott környezeti feltételek között vagy fejlődési állapotban jelenik meg. A szakemberek fontosnak tekintik olyan transzkripciós szabályozó egységek kifejlesztését, amelyek a gén kifejeződését a növény bizonyos szöveteire korlátozzák, és ezt a lehetőséget mezőgazdaságilag is jelentősnek tartják.

Ezidaig a genkifejezódes szabályozását a növények gyökereiben nem tanulmányozták intenzíven annak ellenére, hogy a gyökér— zet fontos szerepet játszik a növény fejlődésében. Ez bizonyos fokig annak tulajdonítható, hogy hiányoznák a könnyen hozzáférhető ismeretek a gyökérspecifikus biokémiai folyamatokról, amelyek génjeit klónozni, vizsgálni és módosítani lehetne. A növények genetikai módosítása génmanipulációs technikákkal és ezáltal hasznos tulajdonságokkal bíró növények létrehozása a különböző promoterok elérhetőségét feltételezi. Egy promoter—készlet lehetőséget adna arra, hogy a kutatók rekombináns DNS-molekulákat szerkesszenek, amelyek a kívánt mértékben és sejtekben fe

75.161/BE _: .··. .: :......:

• ·· ·«···· · · jeződnének ki. Ennél fogva a szövetpreferáló promoterok gyűjteménye lehetővé tenné, hogy új tulajdonságokat fejeztessünk ki a kívánt szövetben.

Még nincs leírva olyan promoter—elem, amely specifikusan gyökérpreferáló expressziót szabályoz. Ismertettek ugyan rövid elemeket, amelyek közreműködnek a gyökérpreferáló expresszióban, azonban nem azonosították még azokat a speciális szekvenciákat, amelyek a gyökérspecifikus génkifejeződésért felelősek [Lám et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7890 (1989); Oliphant et al., Mol. Cell. Bioi. 9, 2944-2949 (1989); Niu és Guiltinan, Nucl. Acids Res. 22, 4969-4970 (1994); Oeda et al., EMBO J. 10, 1973; Catron et al., Mol. Cell. Biol. 13, 2354-2365 (1993)].

tehat növények genetikai módosításához olyan eljárásokra és készítményekre van szükség, amelyekkel azonosíthatók, izolálhatok és jellemezhetők azok a promoterok és promoter-elemek, amelyek szabályozó területekként szolgálhatnak adott nukleotid-szekvenciák gyökérpreferáló kifejeződéséhez.

Találmányunk tárgyát nukleotid-szekvenciák expresszióját egy növényben szabályozó készítmények és eljárások képezik. A készítmények új, szövetpreferáló, különösen gyökérpreferáló promoter—elemek (RPE-k) nukleotid—szekvenciáit és a promoter—elemekből álló transzkripciós szabályozó egységeket tartalmaznak. Pontosabban találmányunk olyan növényi promoterokat biztosít, amelyek egy vagy több olyan RPE-t tartalmaznak, amelyek fokozzák vagy elnyomják a promoter által vezérelt expressziót.

Találmányunk eljárásokat is biztosít szövetpreferáló növényi promoter-elemek azonosítására és izolálására.

75.161/BE

Ugyancsak eljárásokat biztosítunk egy nukleotid-szekvencia kifejeztetésére egy növényben a találmány szerinti promoter-szekvenciák alkalmazásával. Az eljárások magukban foglalják egy növényi sejt transzformálását egy transzformációs vektorral, amely egy nukleotid-szekvenciát tartalmaz működőképes módon összekapcsolva a találmány szerinti növényi promoterok egyikével, majd egy stabilan transzformált növény regenerálását a transzformált növényi sejtből. Ezen a módon ellenőrizhető az expresszió szintje egy növényi sejtben, szervben, szövetben vagy magban.

Találmányunk olyan transzformált növényeket, magvakat és növényi sejteket is biztosít, amelyek a transzkripciós szabályozó egységeket és promoter-elemeket tartalmazzák.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra. A „Random Oligonucleotide Library-ból (ROL) kiválasztott oligonukleotid-szekvenciák.

2. ábra. A CRC expressziója gyökerekben a kiválasztott ROL-szekvenciákat tartalmazó szerkezetek hatására (3 napos kukoricagyökér; az adatok három kísérlet átlagai)

3. ábra. A CRC expressziója gyökerekben a kiválasztott ROL-szekvenciákat tartalmazó szerkezetek hatására (3 napos kukoricagyökér; az adatok három kísérlet átlagai)

A találmány szerinti készítmények új, szövetpreferáló, különösen gyökérpreferáló promoter-elemek (RPE-k) nukleotid-szekvenciái és növényi promoterok, amelyek a promoter-elemeket tartalmazzák. A találmány szerinti promoter-elemek egy promoterral vagy transzkripciós szabályozó területtel kombinálva arra használhatók, hogy irányítsak az expressziót adott szövetekben és

75.161/BE ⁵ : Ο ·: :*/ • «· ····· ·· módosítsák egy működőképes módon hozzájuk kapcsolt nukleotidszekvencia transzkripciójának szintjét, azaz a promoter-elemek alkalmasak egy működőképes módon hozzájuk kapcsolt szekvencia kifejeződésének fokozására vagy elnyomásra.

Találmányunkban a „növény fogalom alatt a következőket értjük: teljes növények és utódaik; növényi sejtek; növények részei vagy szervei, mint például csíra (embrió), pollen, magház, mag, virág, magbél, címer, kalász, hüvely, szár, törzs, gyökér, gyökércsúcs, portok, kukoricahaj. A „növényi sejt fogalom alatt, korlátozás nélkül, az alábbiakból nyerhető vagy azokban található sejteket értjük: magvak, szuszpenziós-tenyészetek, embriók, merisztémak (szaporodó szövetek), kalluszok, levelek, gyökerek, hajtások, gametangiumok, sporangiumok, pollen és mikrospórák. A növényi sejtekhez értjük a módosított sejteket, például a protoplasztokat, amiket az említett szövetekből nyertünk. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható növények köre általában olyan széles, mint a transzformációs technikákkal hozzáférhető magasabbrendű növényeké, ide értve mind az egyszikű, mind a kétszikű növényeket. Különösen előnyös növény a Zea mays.

A „szövetpreferáló kifejezés alatt azt értjük, hogy a növényi promoter által irányított expresszió mértéke fokozott vagy csökkent egy adott növényi sejtben vagy szövetben másféle sejtekhez vagy szövetekhez képest.

A „gyökérpreferáló kifejezés alatt azt értjük, hogy a növényi promoter által irányított expresszió mértéke fokozott vagy csökken a gyökérsejtekben vagy -szövetekben egy vagy több, a gyökérétől eltérő sejtekhez vagy szövetekhez képest. Gyökérszöve

75.161/BE : .: :·/· ···:

• ·· ······ ·· teken értjük - nem korlátozó módon - a következők legalább egyikét: gyökérsüveg, csúcsmerisztéma, protoderma, alapmerisztéma, prokambium, endodermisz, kéreg, vaszkuláris kéreg, bőrszövet és hasonlók. A gyökerek lehetnek fő-, oldal- és járulékos gyökerek.

A „gyökérpreferáló promoter-elem vagy „RPE kifejezés alatt egy olyan promoter-elemet értünk, amely gyökérpreferáló módon fokozza vagy elnyomja egy promoter által működtetett gén kifejeződését egy növényi sejtben.

A „promoter vagy „transzkripciós kezdő terület kifejezés alatt a DNS egy szabályozó (regulátor) területét értjük, ami rendszerint tartalmaz egy TATA boxot, amely képes az RNS-polimeráz-II irányítása útján megindítani az RNS-szintézist egy adott kódoló szekvencia transzkripciós kiindulási pontjánál. Egy promoter tartalmazhat még más felismerő szekvenciákat is általában a TATA boxtól felfelé vagy 5'-irányban, amelyeket „promoter-elemek-nek nevezünk, és szerepük szerint befolyásolják a promotermag által működtetett expressziót. A TATA boxtól felfelé vagy 5'-irányban elhelyezkedő promoter-elemeket felső promoter-elemeknek is nevezik. Találmányunk különös megvalósításaiban a találmány szerinti promoter-elemek a TATA boxtól felfelé vagy 5'irányban helyezkednek el. Találmányunkhoz tartoznak azonban azok a növényi promoter-konfigurációk is, amelyekben a .promoter-elemek a TATA boxtól lefelé vagy 3'-irányban helyezkednek el.

A „transzkripciós szabályozó (regulátor) egység kifejezés alatt egy promotert értünk, amely egy vagy több promoter-elemet tartalmaz.

A „promoter-mag kifejezés alatt egy olyan promotert értünk,

75.161/BE amely a TATA boxon és a transzkripció indítóhelyén kívül nem tartalmaz más promoter-elemeket.

A találmány szerinti, RPE-ket tartalmazó transzkripciós szabályozó egységek - ha működőképes módon egy adott nukleotidszekvenciához vannak kapcsolva és egy transzkripciós vektorba vannak illetve - szabályozzák a kapcsolt nukleotid-szekvencia gyökérpreferáló expresszióját egy olyan növény sejtjeiben, amely stabilan transzformálva van ezzel a vektorral. Ennek megfelelően a kapcsolt szekvencia expressziója fokozódik vagy csökken a gyökér sejtjeiben vagy szöveteiben egy vagy több, a gyökérétől eltérő sejthez vagy szövethez képest, illetve transzformálatlan sejtekhez vagy szövetekhez képest.

Bár a kapcsolt nukleotid-szekvencia heterológ a promoterelem szekvenciájához képest, a gazdanövényhez képest lehet saját (natív) vagy idegen. Találmányunk magában foglalja a natív kódoló szekvenciák, különösen a kórokozó-rezisztens fenotípussal kapcsolatos kódoló szekvenciák kifejeztetését is, ha azok egy találmány szerinti promoterhoz vannak kapcsolva. A promoterelemek alkalmazása a natív kódoló szekvenciák kifejeztetésére megváltoztatja a transzformált növény vagy növényi sejt fenotípusát.

A találmány szerinti promoter-elemek bármely promoterral, különösen növényi promoterral használhatók. A „növényi promoter kifejezés alatt egy olyan promoter! értünk, amely képes expressziót működtetni egy növényi sejtben.

Egy promoterral kapcsolatban a „natív szó azt jelenti, hogy a promoter egy olyan sejtben képes az expresszió műdödtetésére

75.161/BE amelyben a promoter nukleotid-szekvenciája természettől fogva megtalálható.

Egy promoterral vagy transzkripciós kezdő területtel kapcsolatban a „szintetikus szó azt jelenti, hogy a promoter egy olyan sejtben képes az expresszió működtetésére, amelyben a promoter nukleotid-szekvenciája természetes körülmények között nem fordul elő. A szintetikus promoter egyetlen sejtből sem izolálható, hacsak előzőleg be nem lett juttatva a sejtbe vagy annak egyik felmenőjébe.

Találmányunk magában foglalja azokat az izolált és lényegében megtisztított nukleinsav-készítményeket, amelyek a promoterelemek és a promoter-elemeket tartalmazó transzkripciós szabályozó egységek új kombinációit tartalmazzák. Az RPE nukleotidszekvenciák közé tartoznak különösen a következők: RPE15 (1. számú szekvenciavázlat; SEQ ID NO:1), RPE14 (2. számú szekvenciavázlat), RPE19 (3. számú szekvenciavázlat), RPE29 (4. számú szekvenciavázlat), RPE60 (5. számú szekvenciavázlat), RPE2 (6. számú szekvenciavázlat), RPE39 (7. számú szekvenciavázlat) és RPE61 (8. számú szekvenciavázlat). Egy „izolált vagy „tisztított nukleinsav-molekula vagy annak egy biológiailag aktív része lényegében mentes minden más sejtanyagtól vagy tápközegtől, ha rekombináns technikával lett előállítva, vagy lényegében mentes minden kémiai kiindulási anyagtól vagy más vegyszerektől, ha kémiai úton lett szintetizálva.

A találmány szerinti promoter-elemek az expresszió fokozóiként vagy elnyomóiként működhetnek. Ez azt jelenti, hogy a találmány szerinti promoter-elemek képesek fokozni vagy elnyomni

75.161/BE azon nukleotid-szekvenciák expresszióját, amelyek működőképes módon vannak ahhoz a növényi promoterhoz kapcsolva, amely a promoter-elemeket tartalmazza. A hatás módja az adott promoter, az adott szerkezet és a gazdasejt megválasztásától függ.

A „fokozok (enhancers) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek fokozzák vagy serkentik a promoter-terület által szabályozott expressziót. Ez a serkentés vagy fokozás úgy mérhető meg, hogy összevetjük a feltételezett fokozót tartalmazó minta-promoter által működtetett expresszió mértékét egy kontroll promoter hatásával, amely nem tartalmazza a feltételezett fokozót. A növények számára alkalmas fokozó elemek ismertek a szakterületen; ilyen például az SV40 fokozó területe, a 35S fokozó elem, és a hasonlók. A fokozóként működő RPE-kre találmány szerinti példaként említjük a következőket: RPE14 (2. számú szekvenciavázlat), RPE19 (3. számú szekvenciavázlat), RPE29 (4. számú szekvenciavázlat), RPE60 (5. számú szekvenciavázlat), RPE2 (6. számú szekvenciavázlat) és az RPE61 (8. számú szekvenciavázlat); leírásuk a 3. példában olvasható.

Az „elnyomók (supressors) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek elnyomják vagy csökkentik a promoter-terület által szabályozott expressziót. Az elnyomók azok a DNS-helyek, amelyeken keresztül a transzkripciót represszáló fehérjék (represszorok) kifejtik hatásukat. A szupresszorok úgy fejtik ki expressziót csökkentő hatásukat, hogy átfedik a transzkripció kezdőhelyét vagy a transzkripció aktivátor-helyeit, vagy úgy, hogy elhelyezkedésüktől távoli helyre közvetítik az elnyomó hatást. A találmány szerinti RPE-k közül szupresszor hatású az RPE15 (1. számú

75.161/BE szekvenciavázlat) és az RPE39 (7. számú szekvenciavázlat).

Találmányunk magában foglal multimer RPE-ket is. A „multimer RPE fogalom alatt egy olyan promoter-elemet értünk, amely egy találmány szerinti RPE egy első másolatát, vagy annak egy fragmentumát vagy variánsát tartalmazza egy találmány szerinti RPE legalább egy második másolatával vagy annak egy fragmentumával vagy variánsával együtt. Találmányunkhoz tartoznak továbbá a multimer RPE-ket tartalmazó promoterok is. A multimer RPE-k közé tartoznak — nem kizárólag — azok, amelyek egy vagy több másolatot tartalmaznak legalább két különböző RPE-ből; és ezek fragmentumainak és variánsainak bármilyen kombinációja. Találmányunk szempontjából minden egyedi RPE antiszensz irányultságú is lehet. Az „irányultság (orientáció) alatt azt értjük, hogy egy folytonos szálban elhelyezkedő promoter-elem lehet 5' —> 3' (szensz) vagy 3' -> 5' (antiszensz) irányú a szálban elhelyezkedő többi promoter-elemhez és/vagy TATA boxhoz képest.

Találmányunk magában foglalja azokat a multimer RPE-ket is, amelyekben a találmány szerinti, egyedi promoter-elemek elválasztó (spacer) szekvenciákkal vannak elkülönítve és/vagy elhatárolva egymástól. A „spacer szekvencia kifejezés alatt egy olyan nukleotid-szekvenciát értünk, ami egy multimer RPE-ben van jelen, de nem egy promoter-elem szekvencia. Találmányunkhoz tartoznak azok a multimer RPE—k is, amelyek az egyedi promoter—elemeket folytonos multimerekként tartalmazzák, azaz nincsenek bennük elválasztó szekvenciák; azok a multimer RPE-k, amelyekben egy vagy több elem spacer-szekvenciákkal el van választva egymástól; és azok a multimer RPE-k, amelyekben a spacer-szekven

75.161/BE ciák különböznek a találmány szerinti elválasztó szekvenciáktól.

Az RPE-k bármely adott promoterhoz lehetnek működőképes módon kapcsolva. Bár ez nem jelent korlátozást, előnyös lehet a promoter-magok használata. A promoterok, különösen a szóban forgó promoter-magok bármilyen forrásból származhatnak.

A konstitutív promoterok közé tartozik az Rsyn7 (US 6,072,050), a CaMV 35S promoter-mag [Odell et al., Nature 313, 810-812 (1985)], a rizs aktin promotere [McElroy et al., Plant Cell 2, 163-171 (1990)], az ubikvitin-promoter [Christensen et a2., Plant Mol. Biol. 12, 619-632 (1989); Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18, 675-689 (1992)], a pEMU [Last et al., Theor. Appl. Genet. 81, 581-588 (1991)] a MAS [Velten et al., EMBO J. 2723-2730 (1984)], az ALS promoter (US 5,659,026) és a hasonlók. További konstitutív promoterok vannak leírva az US 5,608,149, 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,699,680, 5,268,463 és 5,608142 számú szabadalmi iratokban.

A találmány szerinti, izolált RPE-szekvenciák és az RPE-ket tartalmazó növényi promoter-szekvenciák módosíthatók, hogy az adott nukleotid-szekvencia változó mértékű kifejeződését biztosítsák. így például használható a teljes promoter-területnél kisebb darab, amivel visszafogható a promoter expressziót működtető hatása. Tudott dolog azonban, hogy a mRNS-kifejeződés mértéke csökkenthető a promoter-szekvenciák részeinek kivágásával. Hasonlóképpen megváltoztatható az expresszió általános természete is.

A találmány szerinti promoter-elem szekvenciák és növényi promoter-szekvenciák módosítása biztosítani tudja a változó mértékű expressziót. Általában egy „gyenge promoter alacsony szin

75.161/BE ten működteti a kódoló szekvencia kifejeződését. Az „alacsony szint azt jelenti, hogy a transzkriptumok aránya körülbelül 1/10 000-től körülbelül 1/100 000-ig vagy körülbelül 1/500 000ig terjed. Ezzel szemben egy erős promoter magas szinten működteti a kódoló szekvencia kifejeződését, azaz a transzkriptumok aránya körülbelül 1/10-től körülbelül 1/100-ig vagy körülbelül 1/1000-ig terjed.

A találmány szerinti növényi promoterok nukleotid-szekvenciái tartalmazhatják az 1 - 8. szekvenciavázlatokban bemutatott szekvenciákat, vagy bármely olyan szekvenciát, amely lényegi azonosságot mutat az említett szekvenciákkal. A „lényegi azonosság kifejezés alatt azt értjük, hogy egy szekvencia lényegi funkcionális és szerkezeti egyenértékűséget mutat az említett szekvenciákkal. A lényegileg azonos szekvenciák közötti bármely funkcionális vagy szerkezeti különbség nem befolyásolja a szekvenciák azon képességét, hogy a találmány szerinti módon, promoterként működjenek. így tehát a találmány szerinti növényi pro— moterok egy működőképes módon hozzájuk kapcsolt nukleotid-szekvencia gyökérpreferáló kifejeződését fokozott vagy elnyomott szinten működtethetik. Két RPE-szekvenciát akkor tartunk lényegileg azonosnak, ha szekvenciájuk legalább körülbelül 80 %-ban, előnyösen legalább körülbelül 85 %-ban, előnyösebben legalább körülbelül 90 %-ban, még előnyösebben legalább körülbelül 95 %ban és legelőnyösebben legalább körülbelül 98 %-ban azonos.

Az itt bemutatott RPE nukleotid-szekvenciák fragmentumai és variánsai szintén találmányunkhoz tartoznak csakúgy, mint azok a promoterok, amelyek a találmány szerinti RPE-k biológiailag ak

75.161/BE tiv fragmentumait tartalmazzák. A „fragmentum fogalom alatt a promoter-elem nukleotid-szekvenciáinak egy olyan részét értjük, amely rövidebb, mint a teljes hosszúságú promoter-elem szekvencia. Egy nukleotid-szekvencia fragmentumai megőrizhetik biológiai aktivitásukat, és így fokozhatják vagy elnyomhatják egy nukleotid-szekvencia expresszióját, amely működőképes módon van egy promoterhoz kapcsolva, amely a promoter-elem fragmentumot tartalmazza. Másrészt egy nukleotid-szekvencia azon fragmentumai, amelyek alkalmasak hibridizációs próbáknak vagy PCR-primereknek, általában nem őrzik meg biológiai aktivitásukat. így tehát egy nukleotid-szekvencia fragmentumai legalább körülbelül 15, 20 vagy 25 nukleotidtól a teljes találmány szerinti nukleotid-szekvencia hosszáig terjedő hosszúságúak lehetnek.

A találmány szerinti promoter-elem fragmentumot tartalmazó promoter egy biológiailag aktív része úgy is előállítható, hogy szintetizálunk egy promotert, amely az RPE-szekvenciák egyikének egy részét tartalmazza, és meghatározzuk a fragmentum aktivitását.

Találmányunk magában foglalja az RPE-k és az RPE-ket tartalmazó növényi promoterok variánsait is. A „variánsok fogalom alatt lényegileg azonos szekvenciákat értünk. A promoter-elem szekvenciák természetben előforduló variánsai azonosíthatók és/vagy izolálhatok a jól ismert molekuláris biológiai technikákkal, mint amilyenek például a PCR és a hibridizálás, amelyeket később ismertetünk. Találmányunk magában foglalja a találmány szerinti RPE-k és növényi promoter-szekvenciák azon variánsait is, amelyekben a találmány szerinti promoter-elemek az ilyen elemek természetes variánsaival vannak helyettesítve.

75.161/BE

A variánsok közé tartoznak szintetikus eredetű nukleotidszekvenciák is, amelyeket helyre irányított mutagenezissel vagy automatizált oligonukleotid-szintézissel állítottak elő. A mutagenezis és a nukleotid-szekvenciák megváltoztatásának módszerei jól ismertek a szakterületen. Általában a találmány szerinti RPE nukleotid-szekvenciák variánsai legalább 80 %-os, előnyösen 85, 90, 95 vagy akár 98 %-os szekvencia-azonosságot mutatnak a találmány szerinti RPE nukleotid-szekvenciákkal.

A promoter-elem szekvenciák biológiailag aktív változatainak meg kell tartaniuk promoter regulátor aktivitásukat, és így fokozni vagy elnyomni egy olyan nukleotid-szekvencia kifejeződését, amely működőképes módon van összekapcsolva egy, a promoterelemet tartalmazó transzkripciós szabályozó egységgel. A promoter aktivitása Northern-blot analízissel mérhető [Sambrook et al. , „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989]; az idézett művet referenciaként tartjuk számon. A fehérje kifejeződése - ami a promoter aktivitását jelzi — az adott promoterhoz működőképes módon kapcsolt kódoló szekvencia által kódolt fehérje aktivitásának mérésén keresztül határozható meg; az ilyen fehérjék közé tartozik — nem kizárólag — a β-glukuronidáz [GUS; Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387 (1987)], a zöld fluoreszkáló fehérje [GÉP; Chalfie et al., Science 263, 802 (1994)], a luciferáz [Riggs et al., Nucleic Acids Res. 15, 8115 (1987); Luehrsen et al., Methods Enzymol. 216, 397-414 (1992)], és az antocián-termelésért felelős kukorica-gének fehérjéi [Ludwig et al., Science 247, 449 (1990)].

75.161/BE

Találmányunkhoz tartoznak azok a nukleotid-szekvenciák is, amelyek szigorú körülmények között hibridizálódnak a találmány szerinti promoter-szekvenciákkal, és fokozzák vagy elnyomják azon nukleotid-szekvenciák kifejeződését, amelyek működőképes módon vannak egy, a promoter-elemet tartalmazó transzkripciós szabályozó egységhez kapcsolva. A hibridizálás módszerei ismertek a szakterületen, és olyan kézikönyvekben vannak leírva, mint a „Molecular Cloning; A Laboratory Manual [Sambrook et al., (eds.), 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989], „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications [Innis et al., (eds.), Academic Press, New York, 1990], „PCR Strategies [Innis és Gelfand (eds.), Academic Press, New York, 1995], vagy „PCR Methods Manual [Innis és Gelfand (eds.), Academic Press, New York, 1990].

A „szigorú feltételek vagy „szigorú hibridizációs feltételek kifejezések olyan körülményeket jelentenek, amelyek között egy „próba kimutathatóan nagyobb (a hátteret legalább kétszeresen meghaladó) mértékben hibridizálódik a célszekvenciájával, mint más szekvenciákkal. A szigorú feltételek szekvenciafüggőek és különböző körülmények között különbözőek lehetnek. A hibridizálás és/vagy a mosás szigorúságának változtatásával felismerhetők azok a célszekvenciák is, amelyek 100 %-ban komplementerek a próbával (homológia-vizsgálat) . Másrészt a szigorúság feltételei úgy is beállíthatok, hogy a kisebb hasonlósági fokú szekvenciák összekeveredve kimutathatók legyenek (heterológia-próba). A próba általában rövidebb, mint 1000 nukleotid, előnyösen nem éri el az 500 nukleotid hosszúságot.

75.161/BE

A szigorú feltételek tipikusan olyanok, hogy a sókoncentráció kisebb, mint körülbelül 1,5 mól/1 nátriumion, tipikusan körülbelül 0,01-1,0 mól/1 nátriumion (vagy másféle só) 7,0-8,3 pH között, és a hőmérséklet legalább körülbelül 30 °C a rövid próbák (azaz a 10-50 nukleotid hosszúságúak), és legalább körülbelül 60 °C a hosszabb próbák (azaz az 50 nukleotidnál hosszabbak) számára. A szigorú feltételek létrehozhatók destabilizáló reagensek, például formamid hozzáadásával is. Példaszerűen alacsony szigorúságú feltételeket biztosít egy pufferoldat 30-35 % formamiddal, 1 mól/1 nátrium-kloriddal és 1 % SDS-tal (nátrium-dodecilszulfát) 37 °C-on, és a mosás 1X-2X SSC-vel 50-55 °C-on (20X SSC = 3,0 mól/1 nátrium-klorid + 0,3 mól/1 trinátrium-citrát). Közepes szigorúságú feltételt biztosít a hibridizáció 40-45 % formamid, 1 mól/1 nátrium-klorid és 1 % SDS jelenlétében, 37 °Con, és a mosás O,5X-1X SSC-vel 55-60 °C-on. Erősen szigorú feltételek az 50 % formamid, 1 mól/1 nátrium-klorid és 1 % SDS 37 C-on, és a mosás 0,lX SSC-vel 60-65 °C-on. A hibridizálás időtartama általában rövidebb, mint körülbelül 24 óra, rendszerint körülbelül 4-12 óra.

A specificitás tipikusan a hibridizálódás utáni mosás függvénye; a kritikus tényezők a mosóoldat ionerőssége és hőmérséklete. A DNS/DNS hibridek esetében a T_m jól megközelíthető Meinkoth és Wahl egyenletével [Anal. Biochem. 138, 267-284 (1984)], ami szerint

I'm ⁼ 81,5 C + 16,6(logM) + 0,41(%GC) - 0,61(% formamid) - 500/L ahol M az egyértékű kationok molaritása, %GC a guanozin és citozin nukleotidok aránya a DNS-ben, % formamid a formamid aránya

75.161/BE a hibridizáló oldatban, és L a hibrid hossza bázispárokban mérve. A T_m az a hőmérséklet (adott ionerősségen és pH-η), amelyen egy komplementer célszekvencia 50 %-a hibridizálódik a tökéletesen hozzáillő próbával. A kevertség minden 1 %-os fokozódásával a T_m körülbelül 1 °C-kal csökken; így tehát a T_m, a hibridizálás és/vagy a mosás körülményei úgy állíthatók be, hogy a kívánt azonosságú szekvenciák hibridizálódjanak. így például ha >90%-os azonosságú szekvenciákat keresünk, akkor a T_m 10°C-kal csökkenthető. A szigorú feltételeket általában úgy választjuk meg, hogy a hőmérséklet körülbelül 5°C-kal alacsonyabb legyen az adott szekvencia és komplementere olvadási hőmérsékleténél az adott ionerősség és pH mellett. Az igen szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 1, 2, 3 vagy 4°C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük; a kis mértékben szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 6, 7, 8, 9 vagy 10°C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük; a kis mértékben szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 11, 12, 13, 14, 15 vagy 20°C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük. A fenti egyenletet használva a szakemberek meghatározhatják a hibridizálás és mosás körülményeit. Ha a kevertség kívánt foka miatt a T_m alacsonyabb lenne, mint 45°C (vizes oldatban) vagy mint 32°C (formamidos oldatban) akkor előnyös az SSC koncentrációját úgy megemelni, hogy magasabb hőmérsékletet használhassunk. A nukleinsavak hibridizálásához kimerítő útmutatást találunk Tijssen: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes című kézikönyvében, valamint Ausubel és munkatár

75.161/BE sai, illetve Sambrook és munkatársai már idézett műveiben.

így tehát találmányunkhoz tartoznak azok a szekvenciák is, amelyek legalább körülbelül 80 %-ban homológok a találmány szerinti szekvenciákkal, és promoter vagy fokozó aktivitásuk van.

A szekvenciák egyezősége mértékének meghatározására szolgáló, egyeztető módszerek jól ismertek a szakterületen. A százalékban kifejezett azonosság bármely két szekvencia között egy matematikai algoritmus alkalmazásával határozható meg. Az ilyen algoritmusokra nem korlátozó példaként említjük Myers és Miller algoritmusát [CABIOS 4, 11-17 (1988)], Smith és munkatársai lokális homológiát kereső algoritmusát [Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)], Needleman és Wunsch homológia-egyeztető algoritmusát [J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)], Pearson és Lipman hasonlóságkereső módszerét [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)], vagy Kariin és Altschul algoritmusát [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264 (1990)], amit később szerzői módosítottak [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877 (1993)].

Az említett matematikai algoritmusok számitógépes alkalmazásai használhatók szekvenciák összehasonlítására a szekvenciaazonosság meghatározása céljából. Az ilyen alkalmazások közé tartozik például a CLUSTAL a PC/Gene programban (Intelligenetics, Mountain View, Ca.), az ALIGN program (2.0 verzió), vagy a GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA és TFASTA programok a Wisconsin Genetics Software Package 8. verziójában (GCG, Madison, Wi.). Az egyeztetés a programmok alapbeállítási paramétereivel végezhető. A CLUSTAL programot többen is jól leírták [Higgins et al., Gene T3, 237-244 (1988); CABIOS 5, 151-153 (1989); Corpet et al.,

75.161/BE

Nucl. Acids Res. 16, 10881-90 (1988); Huang et al., Computer Appl. Biosci. 8), 155-165 (1992) és Pearson et al., Methods in Mol. Biol. 24, 307-331 (1994)]. Az ALIGN programra Myers és Miller algoritmusán alapul. Aminosav-szekvenciák összehasonlításakor az ALIGN a PAM120 súlymaradvány-táblázatot használja; a résért 4, a rés hosszáért 12 büntetőpontot ad. A BLAST programcsaládot Altschul et al., dolgozták ki [J. Mól. Bioi. 215, 403 (1990)] Kariin és Altschul algoritmusa alapján). A nukleotidok keresését a BLASTN végzi (találat = 100, szóhossz = 12) , hogy megtalálja egy találmány szerinti fehérjét kódoló nukleinsavszekvencia homológjait; a BLASTX olyan aminosav-szekvenciákat keres, amelyek egy találmány szerinti fehérje vagy polipeptid homológjai (találat = 50, szóhossz = 3) . Hézagos illesztés céljára a Gapped BLAST (a BLAST 2.0 verzióban) használható, míg a molekulák közötti távoli rokonság felfedésére a PSI-BLAST alkalmas [Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402 (1997)]. Ha a BLAST-ot, Gapped BLAST-ot vagy PSI-BLAST-ot használjuk, akkor a paraméterek alapbeállításait alkalmazhatjuk (például a BLATN-t a nukleotid-szekvenciákhoz, a BLASTX-et a fehérjékhez). A BLAST szoftver nyilvánosan hozzáférhető a National Center for Biotechnology Information honlapján át (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Az egyeztetés kézzel is elvégezhető.

Találmányunkban a nukleotid- vagy fehérje-szekvenciák összehasonlítását a találmány szerinti szekvenciákkal a százalékos azonossági fok meghatározása érdekében előnyösen a BLASTN programmal (BLAST 2.0 vagy későbbi verzió) végezzük alapbeállítási paraméterekkel, vagy bármely, ezzel egyenértékű programmot hasz75.161/BE : . .: ···:

• *· ······ ·· nálunk. „Egyenértékű bármely olyan szekvencia-összehasonlító programm, amely bármely két szekvencia között ugyanolyan nukleotid- vagy aminosav-egyezéseket talál és ugyanolyan fokú szekvencia-azonosságot határoz meg, mint az előnyös programm.

A „szekvencia-azonosság vagy „azonosság fogalmak alatt két nukleotid-szekvencia esetében azt értjük, hogy a csoportok a két szekvenciában azonosak, ha maximális megfelelőséggel illesztjük azokat egymáshoz egy meghatározott összehasonlító ablakban.

A „lényegi azonosság polinukleotid-szekvenciák esetében azt jelenti, hogy egy polinukleotid egy olyan szekvenciát tartalmaz, amelynek szekvencia—azonossága legalább 80 %—os, előnyösen legalább 85 %-os, előnyösebben legalább 90 %-os, még előnyösebben legalább 95 %-os és legelőnyösebben legalább 98 %-os egy találmány szerinti szekvenciához hasonlítva a fent leírt összehasonlító programok valamelyikével, standard vagy alapbeállítási paramétereket használva.

Nukleotid-szekvenciák lényegi azonosságát az is jelzi, ha két molekula hibridizálódik egymással szigorú körülmények között. A szigorú körülményeket általában úgy választjuk meg, hogy a hőmérséklet körülbelül 5 C—kai alacsonyabb legyen, mint az adott szekvencia olvadáspontja (T_m) meghatározott ionerősség és pH mellett. Azonban a szigorú körülmények megengedik, hogy a hőmérséklet körülbelül 1-20 °C között legyen a szigorúság kívánt fokától függően.

Találmányunk eljárásokat biztosít szövetpreferáló növényi promoter-elemek azonosításához és izolálásához, amelyek közé tartoznak - nem kizárólag - a gyökérpreferáló promoter-elemek

75.161/BE is. A találmány szerinti azonosító és izoláló eljárásokkal random oligonukleotid könyvtárak (ROL) hozhatók létre, az oligonukleotidok az adott növény sejtmag-fehérjéinek nyers kivonataival kötődhetnek, a kötődött komplexek az elektroforetikus mobilitás megváltozásának vizsgálatával (EMSA) elválaszthatók és izolálhatok, a megkötött és meghatározott elektroforetikus mobilitást mutató oligonukleotidok sokszorozhatok, a megkötés — elválasztás - izolálás — sokszorozás ciklusa megismételhető, végül az egymást követő ciklusokban keletkező kötődési komplex mennyisége összehasonlítható egy adott elektroforetikus mobilitási értékzónával. Ha az adott értékzónában fokozódó komplexképzést figyelhetünk meg az egymást követő ciklusokban, akkor úgy értékeljük, hogy az az értékzóna tartalmazza a keresett, szövetpreferáló promotert. Ebből a feldúsított populációból klónozással egyedi oligonukleotidokat izolálhatunk, működőképes módon egy promoterhoz kapcsolhatjuk azokat, és meghatározhatjuk, hogy fokozzák vagy elnyomják-e a promoter által vezérelt expressziót. Azokat az oligonukleotidokat, amelyek szövetpreferáló módon képesek az expresszió fokozására vagy elnyomására, szövetpreferáló promoterokként azonosítjuk és meghatározzuk szekvenciájukat.

A szövetspecifikus promoter-elemek promoter-szekvenciákból történő azonosításának és izolálásának ismert módszerei általában munkaigényesek. Az ilyen módszerek rendszerint azzal kezdődnek, hogy azonosítjuk azokat a géneket, amelyek különböző módon vannak szabályozva például a különböző vagy szubsztraktív cDNSkönyvtárakban szűrővizsgálati eljárásokkal vagy PCR-ra alapozott különbözőségi vizsgálattal [Liang és Pardee, Science 257, 96775.161/BE

971 (1992); Sharma és Davis, Plant Mol. Biol. 29, 91-98 (1995)]. Ezek a módszerek tipikusan azt az utat követik, hogy a kívánt cDNS-nek megfelelő, genomiális 5' határoló szekvenciákat klónozzák, majd a határoló szekvenciákat kimerítően feltárják transzhatású faktorokkal vagy funkcionális expressziós vizsgálatokkal.

Egy másik, ismert eljárással az ismert transz-hatású faktorok DNS-kötőhelyeit határozzuk meg reiterativ kötődéssel dúsító módszerrel, random oligonukleotid könyvtárakból [Catron et al., Mol. Cell. Bioi. 13, 2354-2365 (1993); Ko és Engel, Mol. Cell. Biol. 13, 4969-4970 (1994); Norby et al., Nucl. Acids Res. 20, 6317-6321 (1992); Oliphant et al., Mol. Cell. Biol, _9, 2944-2949 (1989)].

Ezek a megközelítések a tisztított DNS-kötő faktorok vagy a DNS-kötő faktorokra irányított antitestek hozzáférhetőségétől függenek. Nallur és munkatársai (1996) leírtak egy multiplex szelekciós technikát, amellyel feldúsíthatok a transzkripciós faktor kötőhelyek egy ROL-ban, nyers sejtmag-kivonatokat használva. A WO 97/44448 számú szabadalmi iratban leírják ROL-ok és sejtmagkivonatok alkalmazását promoter-elemek szövetspecifikus könyvtárainak létrehozására azáltal, hogy az előnyös szövetből származó kivonathoz kötődő, ugyanakkor a más szövetből származóhoz nem kötődő elemeket válogatják ki. Mások hatalmas párhuzamos vizsgálatokat indítottak teljes genomok szekvenálásával, hogy azonosítsák azokat a cisz-elemeket, amelyek közösek a koordináltan szabályozott génekben [Roth et al., Nature Biotech. 16, 939-945 (1998)].

A találmány szerinti izoláló és azonosító eljárások nem függenek genomiális szekvenciáktól, előzetes ismeretektől adott 75.161/BE transz-hatású faktorokról, vagy tisztított DNS-kötő faktorok vagy DNS-kötő faktorokra irányuló antitestek hozzáférhetőségétől. Továbbá, mivel a szekvenciák adott populációi feldúsulnak az izolálás és azonosítás folyamán, az azt követő klónozás és expressziós analízis sokkal kevésbé lesz munkaigényes.

A találmány szerinti RPE-k és promoterok nukleotid-szekvenciái, valamint azok variánsai és fragmentumai alkalmasak bármely növény genetikai módosítására, ha működőképes módon vannak egy nukleotid-szekvenciához kapcsolva, amelynek expresszióját szabályozva elérhető a kívánt fenotípusos válasz. A „működőképes módon kifejezés arra vonatkozik, hogy az adott nukleotid-szekvencia a transzkripciója vagy transzlációja a promoter-szekvencia hatása alatt zajlik. Erre a célra a találmány szerinti promoterok nukleotid-szekvenciáit expressziós keretekben biztosítjuk az adott nukleotid-szekvenciával együtt az adott növényben való kifejeztetés számára.

Az ilyen nukleotid-szerkezetek vagy expressziós keretek egy transzkripciós kezdő területet tartalmazhatnak egy promoterelemmel kombinálva, amely működőképes módon van ahhoz a nukleotid-szekvenciához kapcsolva, aminek kifejeződését a találmány szerinti promoter szabályozza. Egy ilyen szerkezet a restrikciós helyek sokaságát tartalmazhatja a szóban forgó szekvencia beillesztése céljából a regulátor-területek transzkripciót szabályozó hatása alá. Az expressziós keret adott esetben szelektálható markergéneket is tartalmazhat.

Az expressziós keret a transzkripció 5' -> 3' irányában tartalmaz egy transzkripciós és transzlációs kezdő területet, egy

75.161/BE vagy több promoter-elemet, egy szóban forgó DNS-szekvenciát, és egy transzkripciós és transzlációs terminátor területet, amelyek működőképesek egy növényben. A terminátor-terület lehet natív a transzkripciós kezdő területhez képest, amely egy vagy több találmány szerinti promoter nukleotid-szekvenciát tartalmaz, lehet natív a szóban forgó DNS-szekvenciához képest, vagy származhat idegen forrásból. Kényelmesen használható terminátor területek nyerhetők az A. tumefaciens Ti-plazmidjából; ilyenek az oktopinszintetáz és a nopalin-szintetáz gének terminátor területei [Guerineau et al. , Mol. Gen. Genet. 262, 141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64, 671-674 (1991); Sanfacon et al., Genes. Dev. 5, 141-149 (1991); Mogen et al., Plant Cell 2, 1261-1272 (1990); Munroe et al., Gene 91, 151-158 (1990); Ballas et al., Nucl. Acids Res. 17, 7891-7903 (1989); Joshi et al., Nucl. Acids Res. 15, 9627-9639 (1987)].

Az expressziós keret tartalmazza a találmány szerinti transzkripciós szabályozó egységet működőképes módon egy nukleotid-szekvenciához kapcsolva, amely ugyancsak tartalmazhatja még legalább egy további gén nukleotid-szekvenciáját a szervezet kotranszformációja céljából. Más megoldásként a további szekvenciáik) egy másik expressziós keretben is bejuttathatok.

Ahol az a megfelelő, ott azok a nukleotid-szekvenciák, amelyek expressziója a találmány szerinti promoter szekvenciák szabályozó hatása alatt működik, és bárhány további nukleotid-szekvencia optimalizálható(k) a növényben való fokozott kifejeződés érdekében. így tehát a gének a növények által előnyben részesített kodonok felhasználásával szintetizálhatok. A növényekben

75.161/BE előnyös gének szintézisének módszerei rendelkezésünkre állnak [US 5,380,831 és 5,463,391 számú szabadalmi iratok, valamint Murray et al., Nucl. Acids Res. 17, 477-498 (1989); a hivatkozott közleményeket referenciaként tarjuk számon].

Ismertek másféle szekvencia-módosítások is, amelyekkel egy gén expressziója fokozható egy gazdasejtben. Ezek közé tartozik a gén kifejeződését megnehezítő, jól ismert szekvenciák eltávolítása: ilyenek a hamis poliadenilációs szekvenciák, az exonintron tapadási helyek, a transzpozon-szerű ismétlések és a többi, jól ismert szekvencia, amelyek káros hatásúak egy gén kifejeződésre. A szekvencia G/C aránya is beállítható az adott gazdasejtnek megfelelő átlagértékre, ami a sejt ismert génjeiből számítható ki. Ha lehetséges, a szekvenciát úgy módosítjuk, hogy elkerüljük a másodlagos „hajtű mRNS-szerkezetek keletkezését.

Az expressziós keret adott esetben tartalmazhat 5' vezető szekvenciákat is a szerkezetében. Az ilyen vezető szekvenciák fokozhatják a transzlációt. Az ismert transzláció-vezetők közé tartoznak a következők: picornavírus vezetők, például az EMCV vezető [enkefalo-miokarditisz 5' nem kódoló terület; Elroy-Stein et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6126-6130 (1989)], potyvírus vezetők, például a TEV (dohány karcolatos vírus) vagy a MDMV (kukorica törpe mozaik vírus) vezető [Allison et al., Virology 154, 9-20 (1986)], a humán immunglobulin nehézlánc-kötő fehérje [BiP; Macejak et al., Nature 353, 90-94 (1991)], a lucernamozaik vírus köpenyfehérje mRNS-ének nem lefordított vezetője [AMV RNA4; Jobbling et al., Nature 325, 622-625 (1987)], a dohánymozaik vírus vezetője [TMV; Gallie et al., in „Molecular 75.161/BE

Biology of RNA, pp.237,256; Cech (ed.), Liss, New York, 1989], és a kukorica klorotikus foltosság virus vezetője [MCMV; Lömmel et al., Virology 81, 382-385 (1991)]. A fentiekről lásd még Della-Cioppa és munkatársai közleményét [Plant Physiol. 84, 965968 (1987)]. A transzláció fokozására más, ismert módszerek, például intronok alkalmazása és hasonlók is használhatók.

Az expressziós keret elkészítése során a különböző DNS-fragmentumok manipulálhatók például úgy, hogy a szekvenciák a megfelelő irányultságúak és a megfelelő leolvasási keretben legyenek. A manipulációk közé tartozik adapterek vagy linkerek alkalmazása a DNS-fragmentumok egyesítéséhez, vagy más műveletek, például kényelmesen használható restrikciós helyek biztosítása, felesleges DNS-szakaszok és restrikciós helyek eltávolítása, és a többi. Erre a célra in vitro mutagenezis, primer javítás, restrikció, összeolvasztás és reszubsztitúciók, például áthelyezések és átfordítások alkalmazhatók.

A promoterok felhasználhatók riportergének vagy szelektálható markergének működtetésére is. Az alkalmas riportergénekre példákat találhatunk Jefferson és munkatársai kézikönyvében („Plánt Molecular Biology Manual, pp.1-33; eds.: Gelvin et al., Kluwer Academic Publishers, 1999), illetve az alábbi közleményekben: DeWet et al., Mol. Cell. Biol. 7, 725-733 (1987); Goff et al., EMBO J. 9, 2517-2522 (1990); Kain et al., BioTechniques 19, 650-655 (1995); és Chiu et al., Current Biol. 6, 325-330 (1996).

A transzformált sejtek vagy szövetek szelektálásához alkalmas jelzőgének közé antibiotikum- vagy herbicid-rezisztencia gének tartoznak. A megfelelő, szelektálható jelzőgének közé tarto75.161/BE zik — nem kizárólag — a kloramfenikollal [Herrera-Estrella et al. , EMBO J. 2, 987-992 (19983)], a metotrexáttal [Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213 (1983); Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16, 807-820 (1991)], a higromicinnel [Waldron et al., Plant. Mol. Biol. 5, 103-108 (1985); Zhijian et al., Plant Sci. 108, 219-227 (1995)], a sztreptomicinnel [Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210, 86-91 (1987)], a szpektinomicinnel [BretagneSagnard et al., Transgenic Res. 5, 131-137 (1996)], a bleomicinnel [Hille et al., Plant Mol. Biol. Ί_, 171-176 (1990)], a szulfonamidokkal [Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15, 127-136 (1990)], a bromoxinillel [Stalker et al., Science 242, 419-423 (1988)], a glifozáttal [Shaw et al., Science 233, 478-481 (1986)], vagy a f oszinotricinnel [DeBlock et al., EMBO J. 6, 2513-2518 (1987)] szembeni rezisztencia génjei.

További gének, amelyek eszközként szolgálhatnak a transzgén események nyomon követéséhez, de nem szükséges, hogy a végtermékben is jelen legyenek, nem korlátozó módon a következők: βglukuronidáz [GUS; Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387 (1987)], a zöld fluoreszkáló fehérje [GFP; Chalfie et al., Science 2 63, 802 (1994)], a luciferáz [Riggs et al., Nucleic Acids Res. 15, 8115 (1987); Luehrsen et al., Methods Enzymol. 216, 397-414 (1992)], és az antocián-termelésért felelős kukorica-gének fehérjéi [Ludwig et al., Science 247, 449 (1990)].

Az expressziós keret, amely a találmány szerinti, transzkripciót szabályozó egységet tartalmazza működőképes módon egy szóban forgó nukleotid-szekvenciához kapcsolva, bármely növény transzformálására használható. Ezen az úton genetikailag módosi75.161/BE tott növények, növényi sejtek, szövetek, magvak és hasonlók hozhatók létre. A transzformáció, valamint a nukleotid-szekvenciák növényekbe juttatásának módja a megcélzott növény vagy növényi sejt típusától (például egy- vagy kétszikű) függhet. A nukleotid-szekvenciák növényi sejtekbe juttatására, majd azt követően a növény genomjába való beépítésére alkalmas módszerek közé tartozik a mikroinjektálás [Crossway et al., Biotechniques 4, 320334 (1986)], az elektroporáció [Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602-5606 (1986], az Agrobacterium-mal közvetített transzformáció (US 5,563,055), a közvetlen géntranszfer [Paszkowszki et al., EMBO J. 3_, 2717-2722 (1984)], és a ballisztikus részecskegyorsítás [US 4,945,050; Tomes et al. , in „Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods; Gamborg és Phillips (eds.), Springer Verlag, Berlin, 1995; McCabe et al., Biotechnology 6, 923-926 (1988)]. A témával kapcsolatban lásd még Weissinger és munkatársai [Annu. Rev. Genet. 22, 421-477 (1988)], Sanford és munkatársai [Particulate Science and Technology 5, 27-37 (1987), hagyma], Christou és munkatársai [Plant Physiol. 87 , 671-674 (1988), szója], McCabe és munkatársai

[Bio/Technology 6, 923-926 (1988), szója], Finer és McMullen [In Vitro Cell Dev. Biol. 27P, 175-182 (1991), szója], Singh és munkatársai [Theor. Appl. Genet. 96, 319-324 (1998), szója], Datta és munkatársai [Biotechnology 8_, 736-740 (1990), rizs], Klein és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309 (1988), kukorica], Klein és munkatársai [Biotechnology 6, 559-563 (1988), kukorica], US 5,240,855, 5,322,783 és 5,324,646 számú szabadalmi iratok, Klein és munkatársai [Plant Physiol. 91, 440

75.161/BE

444 (1988), kukorica], Fromm és munkatársai [Biotechnology 8^, 833-839 (1990), kukorica], Hooykaas-VanSlogteren és munkatársai [Nature 311, 763-764 (1984)], Bytebier és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5345-5349 (1987), liliomfélék], De Wet és munkatársai [in „The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, pp. 197-209 (pollen), Chapman et al., (eds.), Longman, New York, 1985] , Kaeppler és munkatársai [Plant Cell Reports 9, 415-418 (1990) és Theor. Appl. Genet. 84, 560-566 (1992), habveréssel segített transzformáció], D'Halluin és munkatársai [Plant Cell 4_, 1495-1505 (1992), elektroporáció] , Li és munkatársai [Plant Cell Reports 12, 250-255 (1993), rizs], Christou és Ford [Annals of Botany 75, 407-413 (1995), rizs] és Osjoda és munkatársai [Nature Biotechnology 14, 745-750 (1996), kukorica Agrobacterium tumefaciens-en át] közleményeit, amelyeket referenciaként tartunk számon.

Bizonyos előnyös megvalósításokban a vektorok előnyös kifejeződést biztosítanak. Az ilyen előnyös kifejeződés indukálható expresszió lehet, vagy átmenetileg korlátozott vagy visszaszorított lehet bizonyos sejttípusokban, vagy a kettő kombinációja lehet. Az indukálható vektorok közül különösen előnyösek azok, amelyeket a könnyen módosítható környezeti tényezők, így a hőmérséklet vagy a tápanyag-adalékok indukálnak. A találmányunk ezen szempontjából alkalmas vektorok, köztük a prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekben használható, konstitutív és indukálható vektorok jól ismertek, és a szakemberek rutinszerűen alkalmazzák azokat. Az ilyen vektorok közé tartoznak többek között a kromoszomális, az episzomális és a víruseredetű vektorok, pél

75.161/BE dául a bakteriális plazmidokból, bakteriofágokból, transzpozonokból, élesztő-episzómákból, inszerciós elemekből, élesztők kromoszomális elemeiből; vírusokból, például baculovírusokból, papovavírusokból (például SV40), vacciniavírusokból, adenovírusokból, baromiihimlő-vírusokból, álveszettség-vírusokból és retrovírusokból, valamint az ezek kombinációiból származó vírusok éppúgy, mint a plazmidok és bakteriofágok genetikai elemeiből származók, mint amilyenek az Agrrobacterium-közvetítésű transzformációkhoz használt kozmidok, fagemidek és kettős vektorok. A fentiek mindegyike felhasználható expresszió létrehozásához találmányunk ezen szempontja szerint.

A transzformált sejtekből növények nevelhetők fel szokványosnak tekinthető módszerekkel [lásd például McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81-84 (1996)]. A felnevelt növények ezután megtermékenyíthetők ugyanabból vagy más transzformált klónból származó virágporral, és az így kapott hibridekben azonosítható a kívánt fenotípusos tulajdonság konstitutív kifejeződése. Két vagy több nemzedéket lehet felnevelni, hogy meggyőződhessünk a kívánt fenotípusos tulajdonság konstitutív kifejeződésének állandósulásáról és örökletessé válásáról, azaz a magvakkal való átvihetőségéről egyik nemzedékből a másikba.

A találmány szerinti eljárások bármely növényfaj transzformálására alkalmasak, mint amilyenek a kukorica (Zea mays), a káposzta-fajok (Brassica napus, B. rapa. B juncea), különösen azok a Brassica-fajok, amelyek magvai ólajforrásként használhatók, a lucerna (Medicago sativa) , a rizs (Oryza sativa), a rozs (Secale cereale), a cirok (Sorghum bicolor, S. vulgare) , a gyöngyköles

75.161/BE (Pennisetum glaucum), a köles (Panicum miliaceum), az olasz muhar (Setaria italica), az ujjas muhar (Eleusine coracana) , a napraforgó (Helianthus annuus), az olajözön (Carthamus tinctorius), a búza (Triticum aestivum) , a szója (Glycine max), a dohány (Nicotians tabscum), a burgonya (Solanum tuberosum), a földimogyoró (Arachis hypogaea), a gyapot (Gossypium barbadense, G. hirsutum), az édesburgonya (Ipomoea batatas), a tápióka (Manihot esculents), a kávé (Coffes spp.), a kókusz (Cocos nucifera), az ananász (Ananas comosus), a citruszok (Citrus spp.), a kakaó (Theobroma cacao), a tea (Camellia sinensis), a banán (Musa spp.), az avokádó (Persea americana) , a füge (Ficus carica), a guava (Psidium guajava) , a mangó (Mangifera indica), az olajfa (Olea europaea) , a papaja (Carica papaya), a keshu (Anacardium occidentale), a Macadamia integrifolia, a mandula (Prunus amygdalus), a cukorrépa (Beta vulgaris), a cukornád (Saccharum spp.), a zab, az árpa, zöldségnövények, dísznövények és tűlevelűek; a felsorolás nem kizáró jellegű.

A zöldségnövények közé tartozik a paradicsom (Lycopersicon esculentum), a saláta (Lactuca sativa), a zöldbab (Phaseolus vulgaris), a limabab (Phaseolus limensis), a borsó (Pisum sativum) és a Cucumis nemzetség fajai (C. sativus, C. cantalupensis, C. meló). A dísznövények közé tartozik az azálea (Rhododendron spp.), a hortenzia (Hydrangea macrophylla) , a mályvarózsa (Hybiscus rosanensis) , a rózsa (Rosa spp.), a tulipán (Tulipa spp.), a nárcisz (Narcissus spp.), a petúnia (Petunia hybrids), a szekfű (Dianthus caryiphyllus) , a mikulásvirág (Euphorbia pulcherrima) és a krizantém. A találmányunk gyakorlatában alkal75.161/BE mazható tűlevelűek közé tartozik a Pinus tadea, P. elliotii, P. ponderosa, P. contorta és P. radiata, a Pseudotsuga menziesii, a Tsuga canadensis, a Picea glanca, a Sequoia sempervirens, az Abies amabilis és az A. balsamea, a Thuja plicata és a Chamaecyparis nootkatensis. A találmány szerinti növények előnyösen haszonnövények (például kukorica, lucerna, napraforgó, Brassicafajok, szója, gyapot, olajözön, földimogyoró, cirok, búza, köles, dohány, és a többi), előnyösebben kukorica és szója, még előnyösenebben kukorica.

Különösen fontosak a gabonafélék, az olajos magvúak és a hüvelyesek. A gabonamagvak közül fontos a kukorica, búza, árpa, rizs, cirok, rozs, és a többi. Az olajos magvúak közé tartozik a gyapot, szója, olajözön, napraforgó, repce, kukorica, lucerna, olajpálma, kókusz, és a többi. A hüvelyesek közé tartoznak a babok és borsók. A babok közé tartozik a guárbab, szentjánoskenyér, görögszéna, szója, a veteménybabok, tehénborsó, mungóbab, limabab, lóbab, a lencsék, csicseriborsó, és a többi.

A találmány szerinti promoter-szekvenciák és eljárások alkalmasak egy adott nukleotid-szekvencia kifejeződésének szabályozására egy gazdanövényben, szövetpreferáló, pontosabban gyökérpreferáló módon. Ennek megfelelően a találmány szerinti promoterhoz működőképes módon kapcsolt nukleotid-szekvencia egy érdeklődésre számot tartó fehérjét kódoló struktúrgén lehet. Az ilyen génekre nem korlátozó példaként említjük az abiotikus stresszhatásokkal (szárazság, hőmérséklet, sótartalom), a mérgekkel (peszticidek, herbicidek), vagy a biotikus sztresszhatásokkal (gombák, vírusok, baktériumok, rovarok, fonálférgek, il

75.161/BE letve az ilyen szervezetekkel kapcsolatos betegségek) szembeni ellenálló képességgel kapcsolatos fehérjéket kódoló géneket.

Más megoldásként a találmány szerinti promoterokhoz működőképes módon hozzákapcsolt nukleotid-szekvencia a megcélzott gén antiszensz szekvenciája is lehet. így tehát olyan szekvenciák is szerkeszthetők, amelyek a megcélzott gén mRNS-ével komplementerek és azzal hibridizálódnak. Az antiszensz szekvenciák módosíthatók addig a határig, amíg hibridizálódásra képesek és megzavarhatják a megfelelő mRNS expresszióját. Ezen a módon azok az antiszensz szerkezetek használhatók, amelyek szekvencia-hasonlóságának mértéke 70 %, előnyösen 80 %, és előnyösebben 85 % a szensz szekvenciához képest. Ráadásul az antiszensz nukleotidszekvenciák részei is használhatók a megcélzott gén kifejeződésének megszakítására. Általában legalább 50, 100, 200 vagy több nukleotidból álló szekvenciákat használunk. Ha egy sejtbe juttatjuk, az antiszensz DNS-szekvencia expressziója meg fogja akadályozni a célbavett gén nukleotid-szekvenciájának normális kifejeződését. Ezen a módon gátolható a megcélzott gén natív fehérjéjének termelődése és elérhető egy kívánt, fenotípusos válasz. így tehát az antiszensz szekvenciához kapcsolt promoter csökkenteni vagy gátolni fogja egy natív fehérje expresszióját a növényben.

Találmányunk egy előnyös megvalósításában a gyökérpreferáló promoterokat és/vagy promoter-elemeket használjuk arra, hogy fokozzák vagy elnyomják olyan nukleotid-szekvenciák expresszióját, amelyek a gyökerek számára mezőgazdaságilag fontos tulajdonságokat biztosító fehérjéket kódolnak, vagy amelyek olyan gyökérfe

75.161/BE hérjéket kódolnak, amelyek mezőgazdaságilag fontos tulajdonságokat befolyásolnak a gyökértől eltérő szövetekben.

Felismertük, hogy a találmány szerinti eljárásokkal azonosított és izolált, szövetpreferáló promoter-elemek felhasználhatók mezőgazdaságilag fontos tulajdonságok kifejeződésének szövetpreferáló módon történő fokozására vagy elnyomására.

A következő példákat találmányunk bemutatására szánjuk, és nem annak korlátozására.

1. példa:

RPE-k izolálása és azonosítása

Random oligonukleotid könyvtár (ROL) tervezése és készítése

Egy ROL-t tervezünk és készítünk, amelyben randomizált szekvenciák körülbelül 30 nukleotidja van. A ROL komplexitása körülbelül l,15e + 18 egyedi molekula. Két meggondolást vettünk figyelembe a ROL tervezésekor. Először is a transzkripció szabályozottságát különböző transzkripciós komplexeken, így többszörös transzkripciós faktorokon, koaktivátorokon vagy más társult faktorok keresztül tudjuk meghatározni. A ROL hosszú random szekvenciája (körülbelül 30 nukleotid) lehetővé teszi a komplexképző szekvenciák kiválasztását a többszörös faktorok segítségével. Másodszor, a promoter-elemek különböző pontokon helyezkedhetnek el a random szekvencia mentén. Ennél fogva a promoterelemek elhelyezkedése a promoter funkcionális analízisével vizsgálható. Ráadásul az elválasztó szekvenciákat, amelyek a ROL randomizált szekvenciáit határolják, szintén gondosan megtervezzük, hogy ne tartalmazzanak transzkripciós faktor kötőhelyeket. 75.161/BE

A ROL és a határoló primerek, amelyeket a ROL sokszorozásához használunk, szerkezete a következő:

nl9813 5'TGAGATCTGGATCCGTTC(N)30GTCCTACGAATTCAGCTG3' nl9808 5'TGAGATCTGGATCCGTTC3^r ni9811 5'CAGCTGAATTCGTAGGAC3'

Az nl9813 (9. számú szekvenciavázlat) a ROL egyes oligonukleotidjainak alapszerkezete, ahol „(N) a random oligonukleotid szekvencia pozícióját jelzi az 5' és 3' határoló szekvenciákhoz képest (lásd az 1. ábrát is). A ROL (nl9813)-at összeolvasztjuk egy primerrel (n!9811) és egy Klenow-enzimmel jelöljük a-P³²-dCTP jelenlétében, standard módszerrel. A jelölt próbát ezután gélen megtisztítjuk, mielőtt felhasználnánk DNS-kötő reakciókban a kukorica sejtmag-fehérjéivel.

Az nl9808 és nl9811 jelzésű primer párokat — amelyek rendre egy BamHI és EcoRl restrikciós helyet tartalmaznak klónozás céljára - használjuk a ROL PCR-s szokszorozásához.

Kukorica sejtmag-fehérjék preparálása

A kukorica sejtmag-kivonatot Green és munkatársai nyomán („Plant Molecular Biology Manual Bll, 1-22; ed.: Gelvin et al. , Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1988) készítjük el. Röviden, az A63 beltenyésztett kukoricavonal magvait 24 °C-on, sötétben csíráztatjuk. A 4 napos csíranövények gyökereit összegyűjtjük és négyszeres térfogatú homogenizáló puffért (HB; 25 mM HEPES/KOH, pH=7,6; 10 mM magnézium-klorid, 0,3 M szacharóz, 0,5 Triton X-100, 5 mM β-merkapto-etanol, 1 mM PMSF) adunk hozzájuk. A szöveteket apró darabokra vágjuk egy kereskedelmi Waring aprítóval, alacsony fordulatszámon használva 10 s-ig, majd péppé

75.161/BE őröljük dörzsmozsárban. A homogenizált szövetet két réteg Miracloth-on (Cal-Biochem) és egy réteg 70 pm-es nejlonhálón át megszűrjük. Az extraktumot 15 percen át centrifugáljuk (Sorval GSA rotor, 4500 f/perc). A sejtmag-üledéket egy ecsettel finoman felszuszpendáljuk HB-ben, és újra centrifugáljuk a fenti módon. Ezt a lépést még egyszer megismételjük. Az utolsó centrifugálás után a sejtmagokat a sejtmagoldó pufferben felszuszpendáljuk (15 mM HEPES/KOH, pH=7,6; 110 mM kálium-klorid, 5 mM magnézium-klorid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 pg/l leupeptin, 2 pg/ml aprotinin, 1 pg/ml pepsztatin-A). Az elegyhez nátrium-kloridot adunk apránként, 0,5 M végkoncentrációig. A sejtmag-fehérjéket úgy extraháljuk, hogy a nátrium-kloridos elegyet jégfürdőben, finoman rázzuk 40 percen át. Ezután az extraktumot 30 percig centrifugáljuk (Sorval SS34 rotor, 16000 f/perc). A felülúszót folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -80 °C-on tároljuk. A fagyasztott sejtmag-kivonatokat jégen olvasztjuk fel, majd keverés közben, lassan ammónium-szulfátot adunk hozzá 0,35 mg/ml végkoncentrációig. A kicsapódott sejtmag-fehérjéket lecentrifugáljuk (Sorval SS34 rotor, 16000 f/perc, 30 perc). Az üledéket sejtmag-extraháló pufferben (NEB; 25 mM HEPES/KOH, pH=7,6; 40 mM kálium-klorid, 0,1 mM EDTA, 10 % glicerin, 5 mM β-merkapto-etanol; benne 1 mM PMSF, 5 pg/ml antipain, 5 pg/ml leupeptin és 5 pg/ml aprotinin) felszuszpendáljuk és 6 órán át dializáljuk NEB-rel szemben, amely 0,1 mM PMSF-t tartalmaz. A dializált sejtmag-kivonatot alikvotokra osztjuk és -80 °C-on tároljuk a felhasználásig.

DNS-kötődési reakciók és szelekciós eljárás

A DNS-kötődési reakciókhoz 1-5 pg sejtmag-kivonatot haszná

75.161/BE lünk NEB-ben, amit jégfürdőben inkubálunk 5-20 percen át a jelölt ROL oligonukleotiddal 1 μρ poli(dl-dC) és 0,7 gg, a ROL határoló szekvenciájához csatolt két primer-pár jelenlétében.

A primer-párok az alábbiak:

balról: nl99808 (lásd előbb) és nl9809 (GAACGGATCCAGATCTCA), jobbról: nl9811 (lásd előbb) és nl9810 (GTCCTACGAATTCAGCTG).

A kötődési reakciókat poliakrilamid gélen végezzük egy standard EMSA-leirás szerint [McKendree et al., Plant Cell 2, 207214 (1990)]. A kötött frakcióknak megfelelő gélterületet 10 sávra osztjuk. Az egyes sávokból kioldjuk a DNS-t, PCR-val sokszorozzuk az nl9808 (10. számú szekvenciavázlat) és az nl9811 (11. számú szekvenciavázlat) primereket használva a-P³²-dCTP jelenlétében, és gélen megtisztítjuk. Az így kapott, jelölt DNS-párokat három gyűjtőben egyesítjük, amelyek megfelelnek a nagy, közepes és kis molekulatömegű sávoknak. A próbák három gyűjteményét külön használjuk fel a szelekciós eljárás következő fordulóiban. Hat szelekciós fordulót végzünk a ROL-on a kukoricagyökér sejtmag-kivonatával.

A 3. gélsávban (a közepes molekulatömegű gyűjtemény része) egy specifikus DNS-kötődési komplex mutatható ki. Az EMSA azt jelezte, hogy e specifikus komplex kapcsolódó szekvenciái progresszíven feldúsultak a szelekciós eljárás során.

Kiválasztott ROL oligonukleotidok klónozása és szekvenálása

A szelektálás hat fordulója után a 3. gélsávból kiválasztott oligonukleotidokat expressziós analízis-vektorokba klónozzuk, felhasználva ehhez a SynCorell promoter-magot vagy az Rsyn7 ubikvitin-promotermagot és a CRC aktivátort riporter-rendszerként

75.161/BE (leírva az US 6,072,050 számú szabadalmi iratban, amit referenciaként tekintünk). Tizenkilenc kiónt nyertünk ki és szekvenáltunk. A szekvenciák egyeztetése azt jelzi, hogy a szekvenciák két osztálya van jelen körülbelül azonos arányban a kiválasztott gyűjteményben. Az első osztályba tartozó DNS-szekvenciák csaknem azonosak. A második osztály DNS-szekvenciáiban egy nagyobb motívum (ACGGTAAA) van jelen (lásd az 1. ábrát).

2. példa:

In vitro kötődési vizsgálat a kiválasztott oligonukleot-i dnlrlra Ί

Annak eldöntéséhez, hogy a klónozott szekvenciák valódi kötőhelyek-e a megfigyelt komplexekben, valamint a kiválasztott szekvenciák közötti relatív affinitás meghatározásához a 19 klónozott szekvenciát jelöljük és megvizsgáljuk kötődésüket a gyökér sejtmag-fehérjéihez. Az EMSA vagy sáveltolódási vizsgálatokat alapjaiban a WO 97/44448 szabadalmi irat leírása szerint végezzük. Az eredmények azt mutatták, hogy mind a 19 kiválasztott oligonukleotid erősebben kötődik a gyökér sejtmag-fehérjéihez, mint a ROL-ból véletlenszerűen kiválasztott szekvenciák. Az I. osztály szekvenciái mind erős affinitással kötődnek, míg a II. osztály szekvenciáinak affinitása változó (1. ábra). A nagy affinitást az a tény jelzi, hogy több DNS-t kötnek meg a sejtmagkivonat fehérjéi a gélmobilitás eltolódásával mérve. A kis affinitásra az a tény utal, hogy kevesebb DNS kötődik meg, a kötött frakció mennyisége kisebb, mint a nagy affinitású kötés esetében .

75.161/BE

3. példa:

A kiválasztott oligonukleotidok megjelenésének vizsgálata

A kiválasztott DNS-szekvenciák funkcióképességét az in vivo promoter-aktivitásukon keresztül vizsgáljuk. A vizsgálathoz egy szekvenciát választottunk az I. és nyolcat a II. osztályból, és a megjelenés vizsgálatát részecske-bombázásos módszerrel végezzük. Röviden, a W22 R-g Stadler vonal csíranövényeit bombázzuk 3 gg kísérleti plazmiddal (ROL olidonukleotid::SynCore::AdhII::CRC: :PinII), 3 gg riporter-plazmiddal (BzlL::LUC) és 1 gg belső standarddal (Ubi-Ubi::GUS) [US 6,072,050; Tomes et al., „Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, pp. 197-213; eds. : Gamborg és Phillips, 1995]. Húsz órás, sötétben végzett inkubálás után a gyökerekből nyers fehérje-kivonatokat készítünk. A szövetkivonatokból 20 μΐ-t használunk a LUC és 2 μΐ-t a GUS aktivitás méréséhez. A promoter-aktivitást a LUC/GUS aktivitások arányaként adjuk meg. A megjelenés vizsgálata arra utal, hogy a II. osztály minden szekvenciája képes aktiválni valamilyen mértékig a riportergén kifejeződését a gyökerekben. Általában a sejtmag-fehérjékhez való kötődés affinitása pozitív korrelációt mutat a promoter-aktivitással, kivéve az I. osztály szekvenciáit (lásd az 1. és 2. ábrákat). A megjelenés vizsgálata azt is kimutatta, hogy a kiválasztott szekvenciák nem fokozták a riportergén expresszióját a gyökerekben a kontrolihoz képest (3. ábra).

A fenti vizsgálatokra alapozva a 2., 3., 4., 5., 6. és 8. szekvenciavázlatokon szereplő promoter-elemeket a gyökérben zajló expresszió fokozóinak, míg az 1. és 7. szekvenciavázlatokon

75.161/BE szereplőket a gyökérben zajló expresszió szupresszorainak választottuk ki.

Az izolált promoter-elemek a nyilvános adatbázisok szekvenciái közül eggyel sem azonosak. A CGGTAA szekvencia jelen van a rizs PhyA promoterában [Dehesh et al., Science 250, 1397-1399 (1990)]. Az általunk leírt promoter-elemek gyökérpreferáló génkifejeződést valósíthatnak meg. A gyökérpreferáló promoter—elemet az 1-8. számú szekvenciavázlatokban mutatjuk be.

4. példa:

Transzgén kukorica transzformálása és regenerálása

A találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó vektort használjuk embriogén kukorica-kallusz transzformálására részecske-bombázással (Tomes et al., id. mű). Az eljárás röviden: embriogén, éretlen embriókat bombázunk a DNS-plazmidokat hordozó wolframszemcsékkel, majd a transzformált szövetekből transzgén kukoricanövényeket regenerálunk. A plazmidok egy szelektálható jelzőgént és egy adott struktúrgént tartalmaznak.

A szemcsék előkészítése

Tizenöt mg wolframszemcsét (General Electric, átmérőjük 0,5-1,8 pm, előnyösen 1-1,8 pm és legelőnyösebben 1 pm) teszünk 2 ml tömény salétromsavba. A szuszpenziót ultrahanggal kezeljük 0°C-on, 20 percen át (Branson Sonifier, Model 450, 40%-os teljesítmény, folyamatos üzemmód). Ezután a szemcséket centrifugálással leülepítjük (Biofuge, 10000 f/perc) 1 perc alatt, és a felülúszót eltávolítjuk. Az üledékhez 2 ml steril desztillált vizet adunk, majd rövid szonikálás után újra leülepítjük. Az öblítést és ülepítést

75.161/BE még kétszer elvégezzük steril desztillált vízzel, majd végül' a szemcséket 2 ml steril desztvízben felszuszpendáljuk, a szuszpenziót 250 μΐ-es alikvotokra osztjuk és fagyasztva tároljuk.

A plazmid-DNS felvitele a szemcsékre

A tárolt wolframszemcséket röviden kezeljük ultrahanggal, majd a szuszpenzióból 50 μΐ-t mérünk egy mikrocentrifugacsőbe. Az összes vektor cisz, azaz a szelektálható jelzőgén és az érdeklődésre számot tartó gén ugyanabban a plazmidban van. Ezekkel a vektorokkal egyenként vagy kombinációban transzformálunk.

A plazmid-DNS-t 0,1-10 μg/10 μΐ koncentrációban adjuk a szemcsékhez, és az elegyet röviden kezeljük ultrahanggal. Előnyösen 10 pg összes DNS-t (1 μg/μl TE pufferben) használunk. Az elegyhez 50 μΐ 2,5 M, steril kalcium-klorid-oldatot adunk, majd röviden kezeljük ultrahanggal és keverővei. Ezután 20 μΐ 0,1 M, steril spermidin-oldatot adunk hozzá, majd újra szonikáljuk és keverjük. Az elegyet szobahőmérsékleten inkubáljuk 20 percen át, miközben többször röviden szonikáljuk, majd lecentrifugáljuk és a felülúszót eltávolítjuk. Az üledékhez 250 μΐ vízmentes etanolt adunk és újra röviden szonikáljuk. A szuszpenziót leülepítjük, a felülúszót eltávolítjuk, és az üledékhez 60 ml vízmentes etanolt adunk. A szuszpenziót röviden kezeljük ultrahanggal, mielőtt a DNS-sel bevont szemcséket felvisszük a makrohordozóra.

A szövet előkészítése

A „High Type II kukoricahibrid éretlen embrióit használjuk célszövetnek a részecskebombázásos transzformációhoz. Ez a genotípus két tisztán tenyésztett genetikai vonal hibridje, aminek A és B szülői két ismert beltenyésztett vonal (A188 és B73)

75.161/BE keresztezéséből származnak. Mindkét szülőt azért választottuk, mert erősen hajlamosak a szomatikus embriogenezisre [Armstrong et al., Maize Genetics Coop. News 65, 92 (1991)].

Az Fi növények csöveit ön- vagy szomszédbeporzással megtermékenyítjük, majd az embriókat aszeptikusán kimetsszük a fejlődő szemekből, amikor a szkutellum (sziklevél-kezdemény) kezdi elveszíteni átlátszóságát. Ez körülbelül a beporzás utáni 9—13. napon, leggyakrabban körülbelül a 10. napon szokott bekövetkezni a termesztési körülményektől függően. Az embriók ekkor körülbelül 0,75-1,5 mm hosszúak. A csövek felületét 20-50 %-os Clorox-oldattal sterilezzük 30 percen át, majd háromszor leöblítjük steril desztillált vízzel.

Az éretlen embriókat a szkutellummal felfelé embriogén indukáló táptalajon tenyésztjük, amely N6 alap-sókeveréket, Eriksson-féle vitaminkeveréket, 0,5 mg/ml tiamin-hidrokloridot, 30 g/1 szacharózt, 2,88 g/1 L-prolint, 1 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, 2 g/1 Gelrite-t és 8,5 mg/1 ezüst-nitrátot tartalmaz [Chu et al., Sci. Sin. 18, 659 (1975); Eriksson, Physiol. Plant. 18, 18, 976 (1965)]. A táptalajt autoklávban sterilezzük (121 °C, 15 perc), majd 100x25 nun-es Petri-csészékbe osztjuk szét. Az ezüst-nitrátot szűréssel sterilezzük és az autoklávozás után keverjük a táptalajhoz. A szöveteket teljes sötétségben, 28 °C-on tenyésztjük. Körülbelül 3-7 nap, leggyakrabban körülbelül 4 nap múlva az embriók szkutelluma az eredeti méret körülbelül kétszeresére duzzad, és a felszínén megjelenő kitüremkedések jelzik az embriogén szövet szaporodásának megindulását. Az embriogén válasz gyakorisága elérheti a 100 %-ot is, de általában körülbelül 80 %.

75.161/BE

Amikor az embriogén válasz megjelent, az embriókat áttesszük a módosított indukciós táptalajra, ami 120 g/1 szacharózt tartalmaz. A embriókat a csíratengellyel, azaz az embriogén szövettel felfelé helyezzük el a táptalajon. Egy Petri-csészére 10 embriót teszünk úgy elhelyezve, hogy a csésze közepén egy körülbelül 2 cm átmérőjű kört foglaljanak el. Az embriókat 3-16 órán, előnyösen 4 órán át, teljes sötétségben és 28 °C-on tartjuk ezen a táptalajon, mielőtt bombáznánk a szelektálható makergén(eke)t és a strukturgén(eke)t tartalmazó plazmid-DNS-sel bevont szemcsékkel .

Az embriók bombázásához a DNS-sel bevont szemcséket egy DuPont PDS-1000 szemcsegyorsító készülékkel gyorsítjuk fel. A szemcse-DNS szuszpenziót röviden szonikáljuk, majd 10 μΐ-t mérünk a makrohordozóra, és az etanolt hagyjuk elpárologni. A makrohordozót egy rozsdamentes megállító hálóra lőjük egy polimer hártya (szakadókorong) átszakításával. A hártyát nagy nyomású héliumgáz szakítja át. A szemcsék gyorsulását a szakadókorongot átszakító nyomás határozza meg. Az alkalmazott nyomás 1376-12384 kPa (200-1800 psi) , előnyösen 4472—7568 kPa (650—1300 psi) és legelőnyösebben körülbelül 6192 kPa (900 psi) Az átszakadás! nyomás a korongok többszörözésével állítható be.

Az embriókat tartalmazó csészét tartó polcot 5,1 cm-re teszszük a makrohordozó tartólapja alá. Az éretlen embriók bombázásához egy szakadókorongot és egy makrohordozót (a megszáradt szemcse-DNS agglomerátummal) teszünk a készülékbe. A héliumgázt a készülékbe vezetjük és 1376 kPa—lal (200 psi) a korong átszakadás! nyomása fölé állítjuk be. A Petri-csészéket a céltárgy

75.161/BE embriókkal a vákuumkamrába tesszük és a felgyorsított részecskék útjába igazítjuk. A kamrában előnyösen 94,9 kPa (28 mmHg) vákuumot létesítünk. A készülék működtetése után a vákuumot megszüntetjük, és a Petri-csészét kivesszük.

A bombázott embriókat az ozmotikusán beállított táptalajon hagyjuk 1-4 napon át. Ezután átrakjuk a szelekciós táptalajra, amely N6 alap-sókeveréket, Eriksson-féle vitaminkeveréket, 0,5 mg/1 tiamin-hidrokloridot, 30 g/1 szacharózt, 1 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, 2 g/1 Gelrite-t, 0,85 mg/1 ezüst-nitrátot és 3 ml/1 bialafoszt (Herbiace, Meiji) tartalmaz. A bialafoszt szűréssel sterilezzük. Az embriókat 10-14 naponta friss szelekciós táptalajra rakjuk át. Körülbelül 7 hét múlva a feltehetőleg mind a markergénnel, mind a struktúrgénnel transzformált embriogén szövet a bombázott embriók körülbelül 7 %-ában fejlődik ki. A feltehetőleg transzgén szöveteket leválasztjuk, és az egyes embriókról származókat önálló eseményként tekintve, elkülönítve neveljük tovább. Két klóntenyésztési ciklust folytatunk le úgy, hogy az organizált embriogén szövet legkisebb egybefüggő fragmentumait vizuálisan válogatjuk ki.

Minden transzformációs eseményből szövetmintát veszünk és feldolgozzuk a DNS-vizsgálathoz. A DNS-t egy restrikciós endonukleázzal feldaraboljuk és olyan primer-szekvenciákkal (próbákkal) vizsgáljuk, amelyeket egy gyökérpreferáló promoter-elem legalább egy részével való átfedésre terveztünk. A sokszorozható szekvenciákat tartalmazó embriogén szöveteket választottuk ki a növények regenerálása céljára.

A transzgén növények regenerálásához az embriogén szövetet

75.161/BE egy olyan táptalajon tenyésztjük, amely MS-sókat és vitaminokat [Murashige és Skoog, Physiol. Plant. 15, 473 (1962)], 100 mg/1 mioinozitolt, 60 g/1 szacharózt, 3 g/1 Gelrite-t, 0,5 mg/1 zeatint, 1 mg/1 indol-3-ecetsavat, 6,4 ng/1 cisz-transz-abszcizinsavat és 3 mg/1 bialafoszt tartalmaz 100x25 mm-es Petri-csészékben, 28 °C hőmérsékleten, sötétben inkubálva mindaddig, amíg jól formált, érett szomatikus embriók megjelenését nem észleljük. Ez körülbelül 14 napot vesz igénybe. A jól formált szomatikus embriók általában átlátszatlanok és krémszínűek, valamint azonosítható szkutellumot és sziklevél-hüvelyt (koleoptil) tartalmaznak. Az embriókat egyedenként tenyésztjük tovább egy hajtató táptalajon, amely MS-sókat és vitaminokat, 100 mg/1 mioinozitolt, 40 g/1 szacharózt és 1,5 g/1 Gelrite-t tartalmaz 100x25 mm-es Petri-csészékben, 16:8 fény/sötét periódussal inkubálva; a megvilágítást hideg-fehér fénycsövekkel (40 mEinstein/m²s) végezzük. Hét nap alatt a szomatikus embriók kihajtanak, és jól kialakult hajtásuk és gyökerük lesz. Ezután az egyes növényeket 125x25 mm-es üvegcsövekben, hajtató táptalajon neveljük tovább a fenti megvilágítás mellett. Újabb körülbelül 7 nap után a már jól kifejlett növénykéket kerti földbe ültetjük át, edzzük, majd üvegházi földkeverékbe cserepezzük és üvegházban neveljük az ivarérésig. A regenerált, transzgén növényeket egy elit beltenyésztett vonalról porozzuk be.

Agrobacterivm-közve ti tésú transzforrná 7á.<?

A részecskebombázás előnyös alternatívájaként a növények Agrobacterium közvetítésével is transzformálhatok. Ha ezt a módszert választjuk, akkor Zhao eljárását alkalmazzuk (WO 98/32326

75.161/BE számú szabadalmi irat, amelyet referenciaként tartunk számon). Röviden, éretlen embriókat izolálunk kukoricáról és érintkeztetjük azokat egy Agrobacterium-szuszpenzióval (1. lépés: a fertőzés) . Ebben a lépésben az éretlen embriókat előnyösen bemerítjük egy Agrobacteri um-szuszpenzióba a fertőzés megindításához. Ezután az embriókat egy ideig együtt tenyésztjük az Agrobacteriummal (2. lépés: a közös tenyésztés). Előnyösen az éretlen embriókat egy szilárd táptalajon tenyésztjük a fertőzés lépése után. Ezt adott esetben egy „pihentető lépés követi, amikor az embriókat legalább egy olyan antibiotikum jelenlétében inkubáljuk, amely(ek) gátolják az Agrobacterium szaporodását, de még nincs jelen egy szelektáló anyag a transzformálódott növények kiválasztásához (3. lépés: a pihentetés). Az érett embriókat előnyösen egy antibiotikumot igen, de szelektáló anyagot nem tartalmazó, szilárd táptalajon neveljük az Agrobacterium eltávolítása és a fertőzött sejtek nyugalmi állapotba juttatása érdekében. Ezután a fertőzött embriókat egy szelektáló anyagot tartalmazó táptalajon neveljük és a növekedésnek indult kalluszokat izoláljuk (4. lépés: a szelekció). Előnyösen, az éretlen embriókat egy szelektáló anyagot tartalmazó táptalajon neveljük, amely a transzformált sejtek szelektív szaporodását eredményezi. Ezután a kalluszokat növényekké regeneráljuk (5. lépés: a regenerálás), azaz a szelektáló táptalajon növekedett kalluszokat szilárd táptalajon növényekké neveljük fel.

A regenerálódott növényeket megfigyeljük, és a szóban forgó gén aktivitását kiértékeljük.

75.161/BE

A leírásban idézett összes közlemény és szabadalmi irat azt a szakmai szintet jelzi, amelyen találmányunk is elhelyezkedik. Az azokban idézett összes közleményt és szabadalmi iratot éppúgy referenciaként tartjuk számon, mintha ezt a tényt velük kapcsolatban egyedileg közöltük volna.

Noha találmányunkat részletesen leírtuk és az érthetőség kedvéért példákkal is illusztráltuk, nyilvánvaló, hogy a mellékelt igénypontokban körülhatárolt oltalmi körön belül bizonyos változtatások és módosítások végezhetők azon.

75.161/BE (SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)

SEQUENCE LISTING <110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> Novel Root-Preferred Promoter Elements and Methods of Use <130> 1166-PCT <140> PCT/US01/02011 <141> 2001-01-19 <150> US 60/177,473 <151> 2000-01-21 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 1 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt cagctg <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 2 tgagatctgg atccgttcga caaaacggta aaaaagcggt agattaccgt cctacgaatt cagctg

75.161/BE <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 3 tgagatctgg atccgttcga caaaacggta aaactaaagg taactgacgt cctacgaatt 60 cagctg <210> 4 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 4 tgagatctgg atccgttcat tgtacagcgg taaaaatcgg gagtctgtcc tacgaattca 60 gctg <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 5 tgagatctgg atccgttcat gcggtaaata agtccatcgg aacgtgtgtc ctacgaattc 60 agctg <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 6 tgagatctgg atccgttcgg taaaaatgag caggggatcg aaatgtccta cgaattcagc 60 tg

75.161/BE <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 7 tgagatctgg atccgttcaa acagtgaaat ggggcacggt agaactagtc ctacgaattc 60 agctg <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> random oligonucleotide <400> 8 tgagatctgg atccgttcag aatagaaaga ggacggttaa aaactagtcc tacgaattca 60 gctg <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 9 tgagatctgg atccgttcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt cctacgaatt 60 cagctg <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer with BamHI site <400> 10

75.161/BE tgagatctgg atccgttc

<210>	11
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Artificial	Sequence
<220>
<223>	primer with	EcoRi site
<400>	11

cagctgaatt cgtaggac

<210>	12
<211>	18
<212>	DNA
<220>
<223>	primer
<400>	12

gaacggatcc agatetea <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> primer <400> 13 gtcctacgaa ttcagctg <210> 14 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 14 tgagatctgg atccgttcga gcagtaaaag taagaaaggc ccgtttcgtc etaegaatte 60 agetg 65 <210> 15 <211> 66 <212> DNA

75.161/BE <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 15 tgagatctgg aaccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 16 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 16 tgagatctgg attcgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 17 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 18 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg 66

75.161/BE <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 19 tgagatctgg atcngttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 20 tgagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa gaattactgt cctacgaatt 60 cagctg <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 21 ngagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagcaa aaattaccgt cctacgaatt 60 cagctg <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

75.161/BE <223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 22 ngagatctgg atccgttcgg ggaagggaag gtgaaagtaa gaattaccgt cctacgaatc cagctg <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 23 tgagatctgg atccgttcgg agaagggaag gtgaaggcag gaaataccgt cctacgaatt cagctg <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> synthetic sequences flanking a random oligonucleotide <400> 24 tgagatctgg atccgttcga caaaacggta aaaaagcggt agattaccgt cctacgaatt cagctg

75.161/BE

Claims (23)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Növényi promoter, amely legalább egy szövetpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz, amely elemet az alábbiak szerint azonosítunk :

   a) elkészítünk egy első keveréket olyan oligonukleotidokból, amelyek mindegyike tartalmaz egy 5' határoló szekvenciát, egy középső random szekvenciát és egy 3' határoló szekvenciát;

   b) az említett első keveréket érintkeztetjük egy második, egy előnyös növényi szövetből származó sejtmag-fehérjéket tartalmazó keverékkel olyan körülmények között, amelyek elősegítik kötődési komplexek képződését az említett oligonukleotidok és az említett fehérjék között;

   c) az említett komplexeket elektroforézissel elválasztjuk egymástól;

   d) az elválasztott komplexeket elektroforetikus mobilitásuk alapján csoportosítva izoláljuk;

   e) az izolált komplexek oligonukleotidjait polimeráz láncreakcióval sokszorozzuk az említett határoló szekvenciákhoz választott primereket használva;

   f) az e) lépésben keletkező oligonukleotidokból egy első keveréket készítünk, amit az a) lépés megismétlésére használunk;

   g) ab)- e) lépések megismétlésével legalább egy második ciklust hajtunk végre az f) lépésben keletkezett oligonukleotidokkal;

   75.161/BE

   h) meghatározzuk az elektroforetikus mobilitás bizonyos értékhatárait és az értékhatárok közötti mobilitásé komplexek mennyiségének változásait a g) lépés szerinti ciklusokban;

   i) izoláljuk az oligonukleotidokat azon komplexekből, amelyek mennyisége növekszik a h) lépés szerint;

   j) az i) lépés szerint nyert, egyedi oligonukleotidokat működőképes módon összekapcsoljuk egy olyan promoterral, ami expressziót működtet egy növényi sejtben, és az említett promotert működőképes módon összekapcsoljuk egy kódoló szekvenciával egy expressziós keretben;

   k) kiértékeljük az említett kódoló szekvencia szövetpreferáló kifejeződését; és

   1) a k) lépésben szövetpreferáló expressziót mutató oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti promoter, amelyben az említett szövetpreferáló promoter-elem egy gyökérpreferáló promoter-elem.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti növényi promoter, amely legalább egy szintetikus gyökérpreferáló promoter-elemet tartalmaz, ami fokozza az említett promoterhoz működőképes módon kapcsolt kódoló szekvencia kifejeződését.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti növényi promoter, amely legalább egy szintetikus gyökérpreferáló promoter-elemet tartalmaz, ami elnyomja az említett promoterhoz működőképes módon kapcsolt kódoló szekvencia kifejeződését.
5. 5. Növényi promoter, amely legalább egy gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz, ami egy nukleotid-szekvenciát tartal75.161/BE ⁵⁷ : ·*.:· ·: Γ.Γ • ·· ·····» ·♦ máz az alábbi csoportokból kiválasztva:

   a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

   b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú körülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

   c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tartozó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
6. 6. Kiírtéra gén, amely egy 5. igénypont szerinti promoter! tartalmaz működőképes módon egy megadott kódoló szekvenciához kapcsolva .
7. 7. Expressziós keret, amely a 6. igénypont szerinti kiméra gént tartalmazza.
8. 8. Transzformációs vektor, amely a 7. igénypont szerinti expressziós keretet tartalmazza.
9. 9. Transzformált növény, amelynek genomjába stabilan beépült a 8. igénypont szerinti transzformációs vektor.
10. 10. Növényi promoter, amely legalább egy multimer gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz, ami legalább két gyökérpreferáló promoter-elemet tartalmaz, amelyek egy-egy nukleotidszekvenciát tartalmaznak az alábbi csoportokból kiválasztva:

    a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

    b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú körülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

    75.161/BE

    c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tartozó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
11. 11. Növényi promoter, amely legalább egy gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz, ami fokozza egy, az említett promoterral működőképes módon összekapcsolt kódoló szekvencia kifejeződését, ahol az említett elem egy nukleotid-szekvenciát tartalmaz az alábbi csoportokból kiválasztva:

    a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

    b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú körülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

    c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tartozó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
12. 12. Növényi promoter, amely legalább egy gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz, ami elnyomja egy, az említett promoterral működőképes módon összekapcsolt kódoló szekvencia kifejeződését, ahol az említett elem egy nukleotid-szekvenciát tartalmaz az alábbi csoportokból kiválasztva:

    a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

    b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú kö-

    75.161/BE rülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

    c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tartozó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
13. 13. Transzformált növény vagy annak részei, amelynek genomjába stabilan be van épülve egy DNS-szerkezet, amely egy növényi promotert tartalmaz működőképes módon összekapcsolva egy kódoló szekvenciával, ahol az említett promoter legalább egy szintetikus, gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz.
14. 14. A 13. igénypont szerinti növény vagy részei, ahol az említett elem egy nukleotid-szekvenciát tartalmaz az alábbi csoportokból kiválasztva:

    a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

    b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú körülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

    c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tartozó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
15. 15. A 13. igénypont szerinti növény vagy részei, ahol az említett növény egy kétszikű.
16. 16. A 13. igénypont szerinti növény vagy részei, ahol az említett növény egy egyszikű.

    75.161/BE
17. 17. A 16. igénypont szerinti növény vagy részei, ahol az említett egyszikű a kukorica.
18. 18. A 13. igénypont szerinti növény, ahol az említett növény egy DNS kódoló szekvenciát fejez ki, amely működőképes módon van összekapcsolva az említett promoterral.
19. 19. Transzformált növényi sejt, amelynek genomjába stabilan be van épülve egy DNS-szerkezet, amely egy növényi promotert tartalmaz működőképes módon összekapcsolva egy kódoló szekvenciával, ahol az említett promoter legalább egy szintetikus, gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz.
20. 20. Eljárás egy kódoló nukleotid-szekvencia gyökérpreferáló kifej eztetésére egy növényben, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás magában foglalja egy növényi sejt transzformálását egy transzformációs vektorral, amely egy expressziós keretet tartalmaz, ami egy növényi promotert tartalmaz működőképes módon öszszekapcsolva az említett kódoló nukleotid-szekvenciával, ahol az említett növényi promoter legalább egy szintetikus, gyökérpreferáló növényi promoter-elemet tartalmaz.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett elem egy nukleotid-szekvenciát tartalmaz az alábbi csoportokból kiválasztva:

    a) az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. számú szekvenciavázlatokban megadottak nukleotid-szekvenciák;

    b) az a) csoport nukleotid-szekvenciáival szigorú körülmények között hibridizálódó nukleotid-szekvenciák; és

    c) olyan nukleotid-szekvenciák, amelyek legalább 7 egymást követő nukleotidot tartalmaznak egy a) csoportba tarto

    75.161/BE zó oligonukleotidból, amely egymást követő nukleotidok rendelkeznek az a) csoportba tartozó oligonukleotid funkciójával .
22. 22. Eljárás szövetpreferáló promoter-elemek azonosítására és izolálására, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás az alábbi lépéseket foglalja magában:

    a) elkészítünk egy első keveréket olyan oligonukleotidokból, amelyek mindegyike tartalmaz egy 5' határoló szekvenciát, egy középső random szekvenciát és egy 3' határoló szekvenciát;

    b) az említett első keveréket érintkeztetjük egy második, egy előnyös növényi szövetből származó sejtmag-fehérjéket tartalmazó keverékkel olyan körülmények között, amelyek elősegítik kötődési komplexek képződését az említett oligonukleotidok és az említett fehérjék között;

    c) az említett komplexeket elektroforézissel elválasztjuk egymástól;

    d) az elválasztott komplexeket elektroforetikus mobilitásuk alapján csoportosítva izoláljuk;

    e) az izolált komplexek oligonukleotidjait polimeráz láncreakcióval sokszorozzuk az említett határoló szekvenciákhoz választott primereket használva;

    f) az e) lépésben keletkező oligonukleotidokból egy első keveréket készítünk, amit az a) lépés megismétlésére használunk;

    g) ab) — e) lépések megismétlésével legalább egy második ciklust hajtunk végre az f) lépésben keletkezett oligo-

    75.161/BE nukleotidokkal;

    h) meghatározzuk az elektroforetikus mobilitás bizonyos értékhatárait és az értékhatárok közötti mobilitású komplexek mennyiségének változásait a g) lépés szerinti ciklusokban;

    i) klónozással izoláljuk az egyedi oligonukleotidokat azon komplexekből, amelyek mennyisége növekszik a h) lépés szerint;

    j) az i) lépéssel egyidőben vagy külön lépésként az i) lépés szerint nyert, egyedi oligonukleotidokat működőképes módon összekapcsoljuk egy olyan promoterral, ami expressziót működtet egy növényi sejtben, és az említett promotert működőképes módon összekapcsoljuk egy kódoló szekvenciával egy expressziós keretben;

    k) kiértékeljük az említett kódoló szekvencia szövetpreferáló kifejeződését; és

    1) a k) lépésben szövetpreferáló expressziót mutató oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magában foglalja még a kötődési affinitás kiértékelését is egy i) lépés szerinti, izolált és egyedileg klónozott oligonukleotid és egy b) lépés szerinti, előnyös növényi szövet sejtmag-fehérjéi között.

    / A meghatalmazott:

    ' f/ i! _A / /