HUP0003564A2 - Protein kinázok és alkalmazásuk - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát kalciumfüggő protein kinázokat kódolónukleinsavmolekulák képezik, továbbá a nukleinsavmolekulák általkódolt polipeptidek, valamint a nukleinsavmolekulákat expresszálótranszgenikus növények. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárásokis növények kártevőkkel szembeni ellenálló képességénekmegváltoztatására. A találmány szerinti megoldás alkalmas kártevőkkelszemben fokozottan ellenálló transzgenikus haszonnövényekelőállítására. Ó

Description

Képviselő :

Danubia

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

Protein kinázok és alkalmazásaik

A találmány tárgyát kalcium-függő protein kinázokat kódoló nukleinsavak képezik, továbbá a nukleinsavak által kódolt polipeptidek, valamint a nukleinsavakat expresszáló transzgenikus növények.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások is, növények kártevőkkel szembeni ellenálló képességének megváltoztatására .

A találmány szerinti megoldás alkalmas kártevőkkel szemben fokozottan ellenálló transzgenikus haszonnövények előállítására.

Növényekben a gomba-, baktérium- és víruspatogének okozta betegségekkel szembeni rezisztencia egy növényi válasszal asszociálódik, amit hiperérzékenységi válasznak (hypersensitivity response, HR) nevezünk. A HR-ben, a növénynek azon a helyén, ahol a potenciális fitopatogének támadnak, lokalizált sejthalál történik, és feltételezhető, hogy ez a lokalizált növényi sejthalál tartalmazza a behatoló mikroorganizmusokat vagy vírusokat, ezáltal védve a növény többi részét. Más növényi védelmi válaszok is elkép

Aktaszámunk: 89406-2444F/PÁ zelhetőek, pl. a phytoalexinek termelődése, olyan lítikus enzimek képződése, amelyek képesek elhárítani a patogének behatolását, valamint a sejtfal olyan módosulása, amely a sejtfalat megerősíti a fizikai és/vagy enzimatikus támadás ellen.

A növényi HR phytoalexin termelést is magában foglalhat a támadó mikroorganizmusok elleni válasz részeként. Például a dohány (Nicotiana tabacum) a mikrobiális behatolások ellen (pl. a Pseudomonas lachrimans) szeszkviterpéneket termel.

Számos vegyület szolgálhat a növényi phytoalexin szintézis elicitoraként. Ezek lehetnek pl. egy vagy több toxikus ion, pl. higanyion, más kémiailag meghatározott összetételű anyagok, metabolikus inhibitorok, sejtfal-glikánok, bizonyos glikoproteinek, enzimek, gomba-spórák, kitozánok, némely zsírsav, és növényi sejtfalból származó bizonyos oligoszacharidok. Lásd pl. Sequeira, L. Annu. Rév. Microbiol. 37 51 (1983), valamint az itt található irodalmi hivatkozások. Bizonyos Phytophtora fajok sejtfal fragmentjei, és a Trichoderma viride celluláza kiválthatja a HR-t, míg az Aspergillus japonicum pektoliáza hatástalan. Más növényi patogének vagy azokkal összefüggő avirulens törzsek támadása szintén kiválthatja a HR-t.

Az elicitinek olyan proteinek, amelyeket növényi patogének és potenciális növényi patogének termelnek. Az elicitin indukálhatja a növényekben a HR-t. Általában, de nem szükségképpen lokalizált sejthalál az elicitin-indukált válasz eredménye a fertőzött (vagy fertőzésnek kitett) nö vényi szövetben. Ezek a válaszok szabályozzák a destruktív fertőzéssel szembeni teljes vagy részleges rezisztenciát a támadó, potenciális növényi patogén mikroorganizmus esetében. A Phytophthora parasitica egy elicitinjének aminosav és kódoló nukleinsav szekvenciáját már leközölték. Kamoun et al. Mol. Plant Microbe Interactions 6 573 (1993).

Növényi patogén vírusok, beleértve, de nem kizárólagosan, a dohány-mozaikvírust (Tobacco Mosaic Virus; TMV) is indukálják a HR-t a fertőzött növényekben. A növényeket fertőzni képes baktériumok szintén indukálják a HR-t és ezen keresztül a betegséggel szembeni rezisztenciát; tipikusan HR-t előidéző baktériumok például a Xanthomonas spp és a Pseudomonas syringae. Növényi patogén gombák általában nem indukálnak HR-t a gazdanövénybe történő behatolást követően, így például a Phytophthora parasitica és a Peronospora tabaci a gazda dohány növény esetében, de indukálhat HR-t, ha nem gazdanövénybe történik a behatolás.

A betegséggel szembeni rezisztencia expressziójában szerepet játszó szignáltranszdukciós mechanizmusokat már vizsgálták, és bizonyos genetikai és biokémiai jellemzőit körvonalazták. Lásd: pl. Staskawicz, B. et al. Science 268 661 (1995). Azonban a szignál-transzdukciós anyagcsere utak számos aspektusa valamint sok specifikus komponensnek a szerepe még nincs megfelelően tisztázva.

A technika állása szerint régóta fennálló igény van olyan módszerek iránt, amelyek védik a növényeket, különösen a gabonaféléket a növényi patogénekkel szembeni fertőzéstől. A gazdasági és környezeti gondok szempontjából kü lönösen fontos a biológiai vagy „természetes módszerek alkalmazása szemben azokkal a módszerekkel, amelyek a gabonaféléknél kemikáliák alkalmazását részesítik előnyben. A technika állása szerint még egy olyan további igény is megfogalmazódik, hogy polinukleotidszekvenciákat alkalmazzanak a növények betegség elleni rezisztenciájának fokozására és/vagy továbbfejlesztésére.

A találmány szerinti nukleinsavak új kalcium-függő protein kináz (CDPK) géneken és az ezeknek megfelelő proteineken alapulnak. Az új CDPK-gének expressziójának az indukciója meglepően gyors, azaz az ilyen gének mRNS-transzkripciója már 30 perccel a növényi védekezési válaszoknak az elicitor által szabályozott indukcióját követően megfigyelhető. így a találmány szerinti gének azok közé a gének közé tartoznak, amelyek a behatoló növényi patogént jelző szignálokra adott válaszként gyorsabban indukálódnak.

A találmány szerinti izolált polinukleotid kifejezés magában foglalja az 1. azonosítószámú nukleotidszekvenciát és annak komplementerét, valamint az 1. azonosítószámú szekvencia RNS analógját és annak komplementerét. Egy ilyen polinukleotid a fentinek nukleinsavfragmentje is lehet, amelynek hosszúsága legalább 20 nukleotid és amely szigorú (stringent) körülmények között hibridizálódik ahhoz a DNS-genomhoz, amely a 3. ábrán látható polipeptidet kódolja. A polinukleotid például a következő 2. ábrán látható nukleotidokat foglalhatja magában: az 1-170. nukleotid tartományt, a 160-560. nukleotid tartományt vagy a 550-920. nukleotid tartományt.

A találmány szerinti nukleinsav-konstrukció tartalmaz egy találmány szerinti polinukleotidot. Egy ilyen konstrukcióban egy találmány szerinti polinukleotid funkcionálisan kapcsolódhat egy vagy több olyan elemhez, amely a polinukleotid transzkripcióját reguláija, például egy olyan reguláié elemhez, amely egy növényi patogén hatására válaszképpen indukálódik; amint azt már korábban leírtuk ilyen patogének lehetnek gombák (pl. Phytophthora), baktériumok (pl. Pseudomonas) vagy vírusok (pl. Tobacco Mosaic Virus). A találmány egy másik megvalósítási módjában az ilyen jellegű indukciót egy elicitor közvetíti (pl. egy gomba-vagy bakteriális elicitor).

A találmány további megvalósítási módjai transzgenikus növényi sejtek, növényi szövetek, valamint olyan növények, amelyeket genetikailag úgy terveztünk, hogy találmány szerint polinukleotidot tartalmazzanak és expresszáljanak, például egy kódoló szekvenciát vagy egy antiszensz szekvenciát. A konstrukció továbbá magában foglalhat még a polínukleotidhoz funkcionálisan kapcsolódó regulációs elemet, például egy indukálható regulációs elemet. A növény lehet kétszikű növény, pl. a Solenaceae család egy tagja, mint például a Nicotiana tabacum, de lehet egyszikű növény is, nyitvatermő vagy tűlevelű.

A találmány tárgyát képezik transzgenikus növények is, melyek olyan polinukleotidot tartalmaznak, amely egy kb. 250 - kb. 550 aminosav hosszúságú polipeptidet expreszszál. A polipeptid egy olyan aminosav-szekvenciát tártál máz, amely lényegében azonos a 3. ábrán látható aminosavszekvenciával.

A találmány tárgyát képezi egy polinukleotid felhasználásán alapuló eljárás is. A módszer magában foglalja azt a lépést, amelynek során fent tárgyalt polinukleotid hibridizálódik egy növényből származó DNS-hez vagy RNS-hez. A módszer továbbá magában foglalja a növényi DNS vagy RNS egy szegmensének azonosítási lépéseit, amely kb. 70% vagy nagyobb szekvencia azonosságot mutat a polinukleotiddal, valamint tartalmazza a DNS vagy RNS legalább egy részének klónozásos lépését. A klónozott rész tartalmazhat további olyan DNS-t, amely szomszédos azon szegmenssel, amely 70% vagy nagyobb szekvencia azonosságot mutat.

Egy másik szempont szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás, amely alkalmas növények betegséggel szembeni rezisztenciájának megváltoztatására. A módszer magában foglalja egy találmány szerinti polipeptid bevitelét egy növényi sejtbe; és egy olyan növényt hoz létre, amely a növényi sejtből származó találmány szerinti polinukleotidot tartalmazza. A polinukleotid expressziója megváltoztatja a növényben a betegséggel szembeni rezisztenciát. Például a nukleinsav-konstrukció még tartalmazhat egy indukálható regulációs elemet, amely funkcionálisan a polinukleotidhoz kapcsolódik, és az expressziót a regulációs elem indukálhatja azáltal, hogy a növényre egy elicitor vagy növényi patogén gyakorol hatást.

Egy másik szempontból a találmány tárgyát képezi egy 250-500 aminosav hosszúságú izolált polipeptid, amely lé nyegében azonos aminosav-szekvenciával rendelkezik azzal, ami a 3. ábrán látható.

Egy indukálható regulációs elem egy olyan DNS-szekvenciának tekinthető, amely annak a polinukleotid expressziónak a regulációjára hat, amely funkcionálisan kapcsolódik ehhez a regulációs elemhez. Például egy CDPK-géntermék, amely egy növényi védelmi válasszal asszociálódik (pl. hiperszenzitiv válasszal), funkcionálisan kapcsolódhat egy a fejlődés során reguláit regulációs elemmel. Ebbe a kifejezésbe bele kell érteni olyan regulációs elemeket is, amelyek elegendőek ahhoz, hogy a betegséghez asszociált külső szignálok vagy hatóanyagok hatására bekövetkező génexpresziót indukálhatóvá tegyék (pl. az itt leírtak szerinti patogén- vagy elicitor-indukált szignálok vagy ágensek). A kifejezésbe bele kell érteni továbbá azokat a regulációs elemeket is, amelyek közvetlenül egy új CDPK-gén mellett találhatóak és hozzájárulnak egy ilyen új gén transzkripciójának gyors indukciójához. Általában véve, de nem kizárólag, a védekezési válaszért felelős regulációs elemek a gén kódoló régiójának 5'-végén helyezkednek el.

A „szövet-specifikus kifejezés azt jelenti, hogy egy géntermék (pl. mRNS vagy polipeptid) expressziója jobban fokozódik az egyik szövetben (pl. xylem szövet), mint a másikban (pl. phloem). A „sejt-specifikus kifejezés azt jelenti, hogy egy géntermék (pl. mRNS vagy polipeptid) expressziója jobban fokozódik az egyik sejtben (pl. parenchima sejt), mint a másikban (pl. epidermális sejt).

- 8 - ···' ’ · ·-·· * „Patogénnek nevezünk egy organizmust, amely egy élő növényi szövet sejtjének fertőzése, illetve a sejttel történő kapcsolódás következtében betegséget hoz létre. „Elicitornak nevezünk bármilyen molekulát, amely növényi védekezési választ képes kiváltani. Elicitorok lehetnek, a teljesség igénye nélkül, a következő anyagok: egy vagy több toxikus ion, pl. higanyion, más kémiailag meghatározott összetételű anyagok (kompozíciók), metabolikus inhibitorok, sejtfalglikánok, bizonyos glikoproteinek, bizonyos enzimek, gomba-spórák, kitozánok, bizonyos zsírsavak, és növényi sejtfalból származó bizonyos oligoszacharidok, valamint elicitenek (pl. harpin, cryptogein és parasiticein).

Funkcionálisan „kapcsolt azt jelenti, hogy két polinukleotid olyképpen van kapcsolatban, hogy lehetővé tegye a két polinukleotid számára egy kívánt funkcionális aktivitás megvalósulását, például azt, hogy egy indukálható regulációs szekvencia és egy kóding szekvencia kapcsolódásának hatására a megfelelő indukáló molekulák jelenlétében létrejöjjön a génexpresszió.

Hacsak másképpen nem határozzuk meg, az itt használt összes technikai és tudományos kifejezés ugyanabban a jelentésben használatos, ahogy az a találmányhoz tartozó szakterületen járatos szakemberek számára általánosan elfogadott. Bár az ismertetettekhez hasonló vagy azokkal ekvivalens anyagok és módszerek alkalmazhatók találmány megvalósítására és tesztelésére, a találmány szerinti megoldást az alábbiakban alkalmas módszereken és anyagokon keresztül kívánjuk szemléltetni az alábbiakban. Az itt említett ősz

- 9 - .1.· . --· · szes közlemény, szabadalmi bejelentés, szabadalom és hivatkozás teljes.terjedelmében a kitanítás részeként tekinten dő. Vitás esetben a jelen leírás tartalma - a meghatározásokat is beleértve — az irányadó. Továbbá az alább bemuta tott anyagok, eljárások és példák kizárólag a találmány jobb megértését szolgálják, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

A találmány további jellegzetességei és előnyei nyilvánvalóak lesznek megvalósítási módok következő leírásából, valamint az igénypontokból.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a FokinB és RecalIV primerek nukleotidszekvenciájának bemutatása.

A 2. ábra egy részleges cDNS-klón DNS-szekvenciájának (1. azonosítószámú szekvencia) a bemutatása. A cDNS-klónt tobacco cultivar KY14 explantátum sejt-szuszpenziós tenyészetéből izoláltuk a növekedés elindulása után elicitin parasiticein jelenlétében.

3. ábra: a DNS-szekvenciából (2. ábra) származtatható aminosav-szekvencia, a standard egy betűs aminosav kódot alkalmazva.

4. ábra: a 3. ábrán látható aminosav-szekvencia összehasonlítása a szójabab CDPK aminosav-szekvenciával.

A találmány tárgyát izolált polinukleotidok (nukleinsavak) képezik, amelyek növényi sejtekben indukálódnak válaszképpen egy potenciális növényi patogén behatolására és/vagy elicitor illetve elicitort utánzó kémiai szignállal történő kezelésre. Az ilyen nukleinsavak tipikusan kalcium, függő protein kináz polipeptidet (calcium dependent protein kinase; CDPK) vagy CDPK-val kapcsolatos polipeptidet kódolnak. A találmány szerinti polinukleotidok indukciója időben megfelel a növényi-védelmi válasz gének indukálódásának, míg úgy látszik más CDPK-gének kevésbé gyorsan indukálódnak. A génexpresszió indukciója ilyen újabb gének esetében gyorsabb, mint azoknál a géneknél, amelyek a növényekben fejlődésileg szabályozott folyamatban vesznek részt, pl. olyan fejlődésileg szabályozott folyamat, mint a virág fejlődése. A találmány szerinti CDPK-gének indukciója is gyorsabb, mint azon géneké, amelyek az abiotikus stressz válaszban vesznek részt, ilyen például a só- vagy a víz stressz.

A találmány szerinti polinukleotidok RNS vagy DNS-formájúak, beleértve a cDNS-t, a szintetikus DNS-t és a genomiális DNS-t is. A DNS lehet kétszálú vagy egyszálú, és ha egyszálú, akkor lehet a kódoló, illetve nem kódoló szál, az 1. azonosítószámú szekvencia RNS analógja lehet például mRNS vagy a ribo- és dezoxiribonukleotidoknak egy kombinációja.

A találmány szerinti polinukleotidok olyan polipeptideket kódolnak, melyek aminosav-szekvenciája lényegében hasonló vagy megegyező a 3. ábrán látható polipeptidével. A találmány némely megvalósításában egy polinukleotid az 1. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott nukleinsavnak egy variánsa lehet, azaz eltérő nukleotidszekvenciával rendelkezhet, amely a genetikus kód degenerációja következtében ugyanazt az aminosav-szekvenciát kódolja, mint a 3. ábrán lévő polipeptidé.

A találmány szerinti polipeptidek további nukleinsav szekvenciákat is tartalmazhatnak. Például egy nukleinsavfragmentum, amely egy szekréciós vagy leader aminosavszekvenciát kódol, azonos leolvasási fázisban (in frame) kapcsolódhat egy olyan polipeptidnek az aminoterminális végéhez, amelynek aminosav-szekvenciája a 3. ábrán látható polipeptid aminosav-szekvenciáját tartalmazza. A technika jelenlegi állása szerint más nukleinsavfragmentumok is ismeretesek, amelyek olyan aminosav-szekvenciákat kódolnak, amelyek jelen feltárás alapján alkalmasak arra, hogy CDPK polipeptid azonos leolvasási fázisban kapcsolódjanak. Lásd pl. U.S. 5,629,193. Egy polinukleotid tartalmazhat még egy vagy több regulációs elemet, amely funkcionálisan az itt közölt CDPK polinukleotidhoz kapcsolódik.

A találmány tárgyát képezik olyan polinukleotidok is, amelyek jelen feltárás szerint szelektíven hibridizálódnak egy CDPK polinukleotidszekvenciához. A hibridizáció magában foglalhat Southern-analizist (Southern blotting), egy olyan eljárást, amely által DNS-szekvenciák jelenléte egy vizsgálandó nukleinsav keverékben azonosítható egy jelölt oligonukleotidhoz vagy jelölt DNS-fragmentum próbához történő hbridizációval. A Southern-analízis tipikusan magában foglalja az emésztett DNS elektroforézissel történő elválasztását agaróz gélen, a DNS denaturálását az elektroforetikus elválasztást követően, és a DNS átvitelét nitrocellulóz, nylon vagy más megfelelő membrán-hordozóra rádióakti vitással jelölt, biotinilált vagy enzim-jelölt próbával történő analízisre, a következő hivatkozás alapján: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Sections 9.379.52, second edition, Cold Spring Harbour Laboratory, Plainview, NY.

Egy polinukleotid hibridizálódhat az itt közölt polinukleotidhoz közepesen szigorú (moderate stringency) vagy nagyon szigorú (high stringency) feltételek mellett. Nagyon szigorú feltételeket használunk azon nukleinsavak azonosítására, amelyek a próbához viszonyítva nagy fokú homológiával vagy szekvencia azonossággal rendelkeznek. A nagyon szigorú feltétel azt jelentheti, hogy denaturáló ágenst, például formamidot alkalmazunk a hibridizáció során, azaz, 50%formamidot 0.1% marhaszérum-albumint/O.1% Ficollt/0,1% polivinil-pirrolidint/50mM nátrium-foszfát puffért pH 6.5/750mM NaCl-ot és 75mM nátrium-citrátot 42°Con. Egy másik példában 50% formamidot alkalmazunk 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M nátrium-citrát) , 50 mM nátrium-foszfát (pH 6.8), 0.1% nátrium-pirofoszfát, 5xDenhardt oldat, ultrahanggal kezelt lazacsperma-DNS (50pg/ml), 0.1% SDS, és 10% dextrán-szulfát jelenlétében 42°C-on, 0.2xSSC és 0.1% SDS-sel történő mosással. Alternatív módon alacsony ionerősséget és magas hőmérsékletet is alkalmazhatunk a mosás során, például 0.015 M NaCl/0.0015 M nátrium-citrát (O.lxSSC); 0.1% nátrium-lauril-szulfát (SDS) 65°C-on.

Közepesen szigorú feltételek olyan hibridizációs feltételek, amelyeket akkor használunk, amikor a próbához képest kisebb homológiájú vagy azonosságú nukleinsavakat azonosí tünk, kisebbet, mint azon nukleinsavak esetében, amelyeknél nagyon szigorú feltételeket alkalmazunk. A hibridizációs membrán mosása esetében a közepesen szigorú feltételek magasabb ionerősségű és/vagy alacsonyabb hőmérsékletű mosást jelentenek, összehasonlítva a nagyon szigorú hibridizációnál használt ionerősséggel és hőmérséklettel. Például a 0.060 M NaCl/0.0060M nátrium-citrát (4xSSC) és 0.1% nátrium-lauril-szulfát (SDS) összetételű mosó oldattal 50°C-on, végezzük el a mosást, majd ezt követően a végső mosást egy lxSSC-t tartalmazó mosó oldattal 65°C-on. Alternatív módon a hibridizációs mosás IxSSC-ben 37°-on is történhet.

Hibridizáció végrehajtható Northern-analízis (Northern biotolás) esetében is; ez egy olyan módszer, amely a próbával hibridizáló RNS azonosítására alkalmas. A próba radioizotóppal, pl. P³²-vel, biotinilálással vagy egy enzimmel van jelölve. Az analizálandó RNS agaróz vagy poliakrilamid gélen elektroforézis segítségével elválasztható, nitrocellulóz, nylon vagy más alkalmas membránra átvihető és a technika jelenlegi állása szerint jól ismert standard módszerek szerint a próbával hibridizálható (Sambrook et al. 7.39-7.52, mint fent).

Általános szempont, hogy legalább 20 nukleotid hosszúságú próbát használjunk, de még jobb, ha legalább 50 vagy még inkább, ha legalább 100 nukleotid hosszúságú. Amennyiben egy viszonylagosan rövid próbát használunk, a próba nukleotidszekvenciája elkerüli azokat a régiókat, amelyek konzerváltak a növényi CDPK-géneken belül (protein kináz doméneket és a kalciumot-megkötő doméneket) és így még job ban elkülöníthetőek a találmány szerinti a gyorsan indukálódó CDPK-gének a lassabban indukálódó CDPK-génektől, a konstitutív CDPK-génektől vagy az alacsony szintű konstitutív CDPK-génektől. Mindazonáltal az ilyen konzervált régiókat tartalmazó próbák a továbbiakban felhasználhatóak, feltéve, hogy elegendő nem-konzervált régió van jelen azokban a próbákban, amelyek jelen kitanítás szerint specifikusabbak az új polinukleotidokra.

Egy találmány szerinti polinukleotid az 1. azonosítószámú szekvenciához viszonyítva legalább 70% szekvencia azonossággal rendelkezik, előnyösen 80% szekvencia azonossággal vagy még előnyösebben 90% szekvencia azonossággal. A szekvencia azonosság meghatározható például komputer program segítségével, amelyet úgy terveztek, hogy egyszeres vagy többszörös szekvencia illesztést is lehetővé tegyen. Azok a polinukleotidok képezik tárgyát ennek a találmánynak, amelyek mintegy legalább 70%-os nukleotidszekvencia azonossággal rendelkeznek az 1. azonosítószámú szekvenciához képest, és amelyek közepesen szigorú körülmények között végrehajtott hibridizációval azonosíthatóak. Azok a polinukleotidok, amelyek mintegy legalább 80%-os nukleotidszekvencia azonossággal rendelkeznek, vagy amelyek mintegy legalább 90%-os nukleotidszekvencia azonossággal rendelkeznek, vagy amelyek mintegy legalább 95%-os nukleotidszekvencia azonossággal rendelkeznek az 1. azonosítószámú szekvenciához képest, nagyon szigorú körülmények között végrehajtott hibridizációval azonosíthatóak.

A találmány szerinti polinukleotidokat kémiai szintézissel, növényi genomiális DNS-ből történő izolálással és klónozással vagy a technika jelenlegi állása alapján ismert más eszközök felhasználásával állíthatjuk elő, beleértve a DNS-sokszorozás (polymerase chain reaction, PCR) módszerének az alkalmazását, melyet az 1. azonosítószámú szekvencia részleteinek megfelelő oligonukleotidok felhasználásával hajtunk végre. A PCR egy olyan eljárást vagy technikát jelöl, amelyben a célnukleinsavat hasonló módon sokszorozzuk meg, mint ahogy azt a 4,683,195 számú USA-beli szabadalomban, illetve az eljárás itt leírt későbbi módosításaiban le van leírva, és amelyet a leírás részeként kell tekinteni. Általában a kérdéses régió végén vagy azon túl található szekvenciáról nyert információ alapján tervezzük meg az oligonukleotid primereket, amelyek szekvenciájukat tekintve azonosak vagy hasonlóak a megsokszorozandó templát ellenkező száljának a szekvenciájával. A PCR alkalmazható specifikus RNS szekvenciák, a teljes genomiális DNS-ből kiválasztott specifikus DNS-szekvenciák, és a teljes celluláris RNS-ről átírt cDNS-ek, valamint bakteriofág és plazmid szekvenciák és hasonlók megsokszorozására. Alternatív módon, megfontolható, hogy egy cDNS-könyvtárat (expressziós vektorban) vizsgáljunk végig CDPK specifikus antitest felhasználásával, amelyet a 3. ábrán látható CDPK szekvencia hidrofil régiójából kiválasztott peptid szekvencia(k) felhasználásával készítünk a technika jelenlegi állása szerinti technológia alkalmazásával. A találmány szerinti polinukleotidok analógjai lényegében az összes növényben megta lálhatóak, többek között a Leguminaceae (azaz szójabab), a Solanaceae (azaz N. tabacum) , a Brassicaceae (azaz Arabidopsis thaliana} és a Graminaceae (azaz Zea mays} családok tagjaiban. A találmány szerinti polinukleotidokat a Solanaceae család tagjaiból nyertük ki.

A találmány egyes megvalósítási módjai esetén, a találmány szerinti polinukleotidokat nukleotidszekvencia homológra alapján izoláljuk és azonosítjuk egy növényből, valamint azon az alapon, hogy az elicitor vagy patogén kezelést követően az expresszió gyors indukciója következik be. Például DNS:DNS hibridizáció az itt bemutatott polinukleotiddal közepes vagy nagyon szigorú feltételek mellett lehetővé teszi más növényi fajokból származó megfelelő gének azonosítását. Egy célnukleinsav (például cDNS) alkalmazása, amelyet egy szövetből röviddel a védelmi válasz indukcióját követően preparáltunk megkönnyíti az itt bemutatott új polinukleotid izolálását, mivel az ilyen polinukleotidok tipikusan gyorsabban indukálódnak, mint más CDPK-gének.

A találmány szerinti nukleinsav-konstrukciók magukban foglalnak egy találmány szerinti polinukleotidot, amely általában kapcsolódik egy másik, tőle különböző polinukleotidhoz kapcsolódik. Például egy teljes hosszúságú CDPK kódoló szekvencia a leolvasási kereten belül funkcionálisan kapcsolódik egy olyan nukleinsavfragmentumhoz, amely egy leader szekvenciát, szekréciós szekvenciát vagy más olyan addicionális aminosav-szekvenciát kódol, amely hasznosan kapcsolódik egy polipeptidhez vagy peptidfragmentumhoz.

Bizonyos megvalósítási módokban a találmány szerinti polinukleotidot is tartalmazó nukleinsav-konstrukcióban a polinukleotid legalább egy alkalmas regulátor szekvenciához funkcionálisan kapcsolódik vagy szensz vagy antiszensz orientációban. Maguk a regulátor szekvenciák tipikusan nem kódolnak génterméket. Ehelyett a regulátor szekvenciák a kódoló szekvencia expressziós szintjére hatnak. A regulátor szekvencia példái a technika jelenlegi állása alapján jól ismertek, amennyiben megszorítások nélkül tartalmaznak minimális promótereket, valamint olyan gének promótereit, amelyek az elicitorra adott válaszra indukálódnak. A találmány szerinti polinukleotidok regulátor szekvenciáit a szakember könnyen képes izolálni és alkalmazni a találmány szerinti konstrukciókban. Alkalmas regulátor szekvenciák más példái enhancereket vagy enhancerekhez hasonló elemeket, intronokat, 3' nem-kódoló régiókat, mint pl. a poliA szekvencia, valamint az itt már tárgyalt más regulátor szekvenciákat tartalmaznak. Az ilyen kiméra gének preparálásához szükséges molekuláris biológiai módszerek jói ismertek a technika jelenlegi állása szerint.

A találmány szerinti polipeptidek mintegy 250-550 aminosavat tartalmaznak, azaz 300-508 aminosavat tartalmaznak vagy 308-500 aminosavat tartalmaznak. A találmány szerinti polipeptidek tipikusan tartalmaznak protein kináz és kalcium kötőhely doméneket. Az ilyen domének például a 3. ábra szerinti 2-7., 42-49., 191-202., 227-238., 264-274. és 297

307. aminosavakat tartalmazhatják.

A polipeptid aminosav-szekvenciája a 3. ábra származtatott aminosav-szekvenciáját tartalmazhatja. Egy másik megvalósítási mód esetén a találmány szerinti polipeptid olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely lényegében azonos a 3. ábrán látható aminosav-szekvenciával, azaz mintegy 80% vagy nagyobb szekvencia azonossággal rendelkezik, vagy mintegy 95% vagy nagyobb szekvencia azonossággal. Általában konzervatív aminosav-helyettesitések vagy hasonló aminosavak helyettesítései tolerálhatóak anélkül, hogy a protein funkciót befolyásolnák. Hasonlóak azok az aminosavak, amelyek méret és/vagy töltés sajátosságaikban hasonlóak. Például izoleucin és valin hasonló aminosavak. Az aminosavak közötti hasonlóságot a technika állása szerint különböző módokon állapították meg. Például Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 Suppl. 3, pp345352, az aminosavak helyettesítésére nézve egy gyakorisági táblázatot közölnek, amely az aminosav hasonlóság mértékeként is alkalmazható. A protein kináz és kalcium kötőhely domének megváltoztathatóak konzervatív helyettesítések útján, de általában az aminosav-szekvenciában történő változtatások nélkül alkalmazzuk őket.

Egy „izolált polipeptid más módon és más környezetben expresszálódik és termelődik, mint természetes körülmények között. Például egy polipeptidet akkor izolálunk, amikor egy baktériumban vagy egy gombában termelődik és expresszálódik. Hasonlóképpen egy polipeptidet akkor izolálunk, amikor egy azt kódoló gén funkcionálisan kapcsolódik egy kiméra regulációs elemhez és egy olyan szövetben vagy fajban történik az expresszió, ahol a polipeptid természetes körülmények között nem expresszálódik. Továbbá egy polipeptidet akkor izolálunk, amikor egy azt kódoló gén funkcionálisan kapcsolódik egy kiméra regulációs elemhez és egy olyan szövetben, történik az expresszió, ahol a polipeptid természetes körülmények között is expresszálódik, de az expresszió magasabb szinten megy végbe. A találmány szerinti polipeptideket standard tisztítási módszerekkel izolálhatjuk és így mintegy 80% vagy nagyobb, vagy mintegy 90% vagy nagyobb, vagy mintegy 95% vagy nagyobb tisztaságban nyerhetjük ki.

Bizonyos megvalósítási módokban a találmány szerinti polipeptidek olyan polipeptidek analógjai vagy variánsai, melyek a 3. ábrának a származtatott aminosav-szekvenciáját tartalmazzák. Ilyen analógok vagy variánsok lehetnek például a természetben előforduló alléi variánsok, a természetben elő nem forduló alléi variánsok, a deléciós variánsok, és az inszerciós variánsok, amelyek lényegében nem változtatják meg a polipeptid funkcióját.

A találmány szerinti polipeptidek tartalmazhatják a 3. ábra szerinti szekvenciát, valamint a határos aminoterminális és karboxiterminális szekvenciákat, melyeket ugyanaz a gén kódol, mint az 1. azonosítószámú szekvencia nukleotidszekvenciáját. Alternatív módon egy kiméra polipeptid képződhet egy olyan génből, amely a leolvasási kereten belül kapcsolja egy első CDPK-gén 5'régiójából származó nukleotidokat egy második CDPK-gén 3' régiójából származó nukleotidokhoz, ezáltal létrehozva egy olyan kiméra nukleoti

- 20 - --·· · dot, amely a kiméra polipeptidet kódolja. Egy kiméra CDPK polipeptid jellemző példája egy olyan polinukleotid által expresszált polipeptid, amely egy szójabab CDPK-gén aminoterminális régiójából 1-156-ig kódolja az aminosavakat (4. ábra), amelyet a 3. ábrán lévő aminosav-szekvencia követ, és végül ugyanannak a szójabab CDPK-génnek karboxi-terminális régiójából a 465-508-ig tartó aminosavakkal zárul, mindez egyetlen leolvasási kereten belül elrendezve.

A találmány szerinti transzgenikus növények találmány szerinti nukleinsav-konstrukciót tartalmaznak. Egy ilyen konstrukciót beviszünk egy növényi sejtbe és legalább egy transzgenikus növényt nyerünk. Egy transzgenikus növény által termelt magokat felnöveszthetjük és önmegporzással megtermékenyíthetjük (vagy keresztezzük és megtermékenyítjük) azért, hogy olyan növényt nyerjünk, amely a konstrukcióra nézve homozigóta. A magokat úgy analizálhatjuk, hogy azonosítjuk azokat a homozigótákat, amelyek a konstrukciótól elvárt expresszióval rendelkeznek. Transzgenikus növényeket be lehet léptetni egy termesztési programba, például úgy, hogy növeljük a mag mennyiségét, annak érdekében, hogy bejuttassuk az új konstrukciókat más vonalakba vagy fajokba vagy azért, hogy tovább szelektáljunk más kívánatos tulajdonságokat. Alternatív módon, transzgenikus növényeket lehet nyerni azáltal, hogy a transzformált növényi sejteket vegetatív úton tenyésztjük azon fajok esetében, amelyeknél ezek a módszerek alkalmazhatóak.

A leírásban használt értelemben a transzgenikus növény kifejezés vonatkozik a kiindulási transzgenikus növény utódjára is. Az utód kifejezés magában foglalja egy speciális növény vagy növényi vonal leszármazottait, azaz magokat, amelyek egy adott növényen fejlődnek. Egy adott növény utódaihoz soroljuk az Fi, F₂, F₃ és az azt követő generációjú növényeken képződő magokat is, és azokat a magokat is, amelyek a BCi, BC₂, BC₃, és az azt követő generációjú növényeken képződtek.

Bizonyos megvalósítási módokban a transzgenikus növény egy találmány szerinti polinukleotidot magában foglaló konstrukciót tartalmaz, amely funkcionálisan „szensz orientációban kapcsolódik egy alkalmas regulációs elemhez, úgy hogy egy „szensz mRNS képződik. Ha szükséges, szelekciós markert is lehet bevinni a konstrukcióba azért, hogy megkönnyítsük a transzformált sejtek vagy szövetek azonosítását .

Az új CDPK-gének gátlása a növényekben szintén hasznos lehet. Például a magtermés aratását közvetlenül megelőzően a CDPK-génexpresszió gátlása lehetővé teheti a növényi patogének számára, hogy könnyebben megtámadják a növényi vegetatív szöveteket, és ezáltal csökkentsék a magok begyűjtését zavaró a növényi biomassza mennyiségét. A CDPKgénexpresszió szabályozott gátlása végbevihető olyképpen, hogy a találmány szerinti polipeptideket antiszensz orientációban funkcionálisan egy alkalmas indukálható regulációs szekvenciához kapcsoljuk. Lásd pl. U.S. 5,453,566. Koszuppresszióval ugyanez a hatás elérhető, azaz egy új CDPK-gén teljes vagy részleges kódoló szekvenciájának a szensz irányban történő expressziója szuppresszálhatja a megfelelő endogén CDPK-géneket. Lásd pl. WO 94/11516.

Bizonyos megvalósítási módokban egy nukleinsav-konstrukció találmány szerinti polinukleotidot tartalmaz, amely funkcionálisan egy minimális promóterhez kapcsolódik. Egy ilyen konstrukció, amikor bevisszük és expresszáltatjuk egy növényben, a polinukleotid konstitutív expressziójának alacsony szintjén működik, és a növényben egy fokozott védekezési választ eredményez. Egy minimális promoter tartalmazza az RNS polimeráz kötődéséhez, valamint a transzkripció iniciációjához szükséges DNS-szekvencia szignálokat. Általában a minimális promoter által irányított transzkripció alacsony szintű és sem pozitív, sem negatív módon nem reagál a környezeti és fejlődési szignálokra a növényen belül. Egy példaként szolgáló minimális promoter, amely a növényben történő felhasználásra alkalmas, a lerövidített CaMV 35S promoter, amely a 35S transzkripciós egységnek a 90-től +8-ig tartó régióját tartalmazza.

A transzkripciós regulációs szekvenciákat arra a célra is fel lehet használni, hogy a génexpressziót szuszpenziós kultúrában szabályozzuk. Például az EAS4 promoter, amely tartalmazza a transzkripciós iniciációs szignálokat, az indukálható transzkripciós regulációs elemet és a transzkripciót fokozó elemet, felhasználható arra, hogy közvetíti transzgenikus növényekben és szuszpenziós kultúrákban a feltárt kódoló szekvenciának az indukálható expresszióját. Lásd U.S. Serial No. 08/577,483. Amikor ez indokolt, a kérdéses kódoló szekvenciát elicitorral vagy más indukáló szignállal indukáljuk.

A találmány megvalósítása során felhasznált transzgenikus módszerek magukban foglalják, korlátozás nélkül, az Agrobacterium által közvetített transzformációt, elektroporációt, és a részecske belövéses (particle gun) transzformációt. A transzformációs módszerek szemléltető példáit írják le az U.S. 5,204,253-ban (particle gun) és az US 5, 188,958-ban (Agrobactéri urn) . Az Agrobacterium spp. Ti és Ri plazmidjai esetében alkalmazott transzformációs módszerek tipikusan bináris típusú vektorokat alkalmaztak. Walkerpeach, C. et al. In Plant Molecular Biology Manual, S. Gelvin and R. Schilperoort, eds., Kluwer Dordrecht, 01:1-19 (1994)

Bizonyos megvalósítási módokban egy indukálható transzkripciós regulációs szekvencia növényekben funkcionális promoter szekvenciával párosulhat, amelyek mindegyike funkcionálisan kötődik egy találmány szerinti polinukleotidhoz. Amikor egy ilyen regulációs elem egy promóterhez kapcsolódik egy rövidített (vagy minimális) promótert használunk, például a karfiol-mozaikvírus (Cauliflower Mosaic Virus; CaMV) rövidített 35S promóterét. Más konstitutív promóterek rövidített verzióját szintén felhasználhatjuk, pl. A. tumefaciens T-DNS-gének, olyanok, mint nos, öcs, és más és növényi vírus gének, mint pl. CaMV 19S gén.

A technika állása szerint jól ismertek azok a módszerek, amelyek szerint DNS bejuttatható egy- és kétszikű növényekbe, éppúgy, mint azok a módszerek, amelyek a növényi szövetek tenyésztésével és regenerációjával foglalkoznak. Sikeresen transzformált és regenerált egyszikűek lehetnek búza, kukorica, rozs, rizs, aszparágusz. Lásd pl. U.S 5,484,956 és 5,550,318. Transzgenikus rezgő nyárfa szövetet preparáltunk, és a transzgenikus növényt regeneráltuk. Nyárfát is transzformáltunk. A nyitvatermő növények transzformálására, regenerálására és manipulálására irányuló módszerek rendelkezésre állnak. Lásd pl. 5,122,466 sz. USAbeli szabadalom és 5,041,382 sz. USA-beli szabadalom.

A találmány szerint egy módszer magában foglalja egy nukleinsav-konstrukció bevitelét egy növényi sejtbe és egy növény létrejöttét egy ilyen transzformált sejtből. A konstrukcióban jelenlévő polinukleotid expressziója megváltoztatja a növény fenotipusát a betegséggel szembeni rezisztenciára, azaz egy új fenotipus jön létre a növény betegséggel szembeni rezisztenciájára vagy a már létező fenotipus a betegséggel szembeni rezisztenciára megerősödik.

A betegséggel szembeni rezisztencia fenotipusa a transzgenikus növényben magában foglalja a gazda-védekező (host-defensive) válaszok szintjét és időzítését. A betegséggel szembeni rezisztencia megváltozására irányuló vizsgálatokban tipikusan egy olyan vegyületet alkalmazunk, amely rendszerint defenzív választ hoz elő egy transzgenikus növényből, és párhuzamosan ugyanezt a vegyületet egy kontroll növényre is alkalmazzuk. A kontroll növényeket tipikusan ugyanabból a szülői vonalból választjuk, mint amelyikbe az új nukleinsav-konstrukciót bevisszük, akkor mondjuk, hogy egy betegséggel szembeni rezisztencia fokozódása vagy egy növényre történő áttevődése egy találmány szerinti polinukleotid által kiváltott expressziónak tulajdonítható, ha a transzgenikus növényben magasabb szintű rezisztencia jelentkezik, mint a kontroll növényben. A betegséggel szembeni rezisztencia mérhető egy speciális patogénre vonatkoztatva, pl. egy Phithophtora spp.-re vonatkoztatva. A betegséggel szembeni rezisztencia számos patogén vonatkozásában szintén mérhető, hogy azonosítsunk egy fokozott szisztémás védelmi választ.

Ahol transzgenikus növényeket indukálunk egy CDPK kódoló szekvenciának az expressziója érdekében, amely szekvencia funkcionálisan kötődik egy elicitor közvetített regulációs elemhez, az elicitornak tipikusan be kell hatolnia a növény-kéreg alá, hogy induktív hatás jelentkezzen. A növényi szövetet megsérthetjük annak érdekében, hogy az elicitornak a növényi szövetbe történő felvételét megkönnyítsük vagy lehetővé tegyük. Az expresszió indukálása érdekében az indukáló anyagoknak egy széles választékát használhatjuk fel beleértve elicitorokat és más kémiai szignálokat, például az etilén és metil-jazmonát kombinációját.

A találmány szerinti polinukleotidot alkalmazó eljárás magában foglal egy olyan lépést, amely a polinukleotidnak egy növényből származó DNS-hez vagy RNS-hez történő hibridizációjára vonatkozik. A hibridizáció végrehajtható a fentiekben már leírtak szerint. A módszer a továbbiakban még magában foglalja a növényi DNS vagy RNS egy olyan szegmensének azonosítási lépését, amely a polinukleotiddal jelentős fokú szekvencia azonosságot mutat, azaz 70% szekvencia azonosságot, de még inkább 80% szekvencia azonosságot, 90% szekvencia azonosságot vagy 95% szekvencia azonosságot. A szegmenst azonosíthatjuk a DNS vagy RNS elektroforetikus elválasztásával és jelzett polinukleotid felhasználásával, amely a homológ szegmens pozíciójában egy látható csík megjelenését eredményezi. Szegmensek létrehozhatóak például fizikai nyírással vagy restrikciós endonukleáz emésztés segítségével. Egy szegmens 100 bp (nukleotid) hosszúságú is lehet, de egy tipikus szegmens legalább 1000 bp vagy lehet lOOOObp vagy még annál is nagyobb.

Egy ilyen módszer magában foglalja a DNS vagy RNS szegmens legalább egy részének klónozásos lépését, beleértve, de nem kizárólagosan, a homológ szegmenssel szomszédos DNSt is. Egy ilyen szomszédos DNS-darab tartalmazhat promótereket, enhanszereket, transzkripciós regulációs elemeket és poliA-szekvenciákat. Ez a szomszédos DNS a homológ szekvenciának akár 5', akár a 3'-végén lehet, és a kódoló szekvencián túl 300, 600 vagy 1000 bp hosszúságú DNS-t tartalmaz, mivel a regulációs elemek ezen a távolságon belül találhatóak.

Promóterek és más, elicitorra vagy patogénekre reagáló regulációs elemek, amelyek szomszédosak találmány szerinti új polinukleotidokkal, rendkívül hasznosak, mivel az ilyen elemek a patogénnel vagy elicitorral történő kezelést követően a génexpressziónak nagyon gyors indukcióját eredményezik. Az ilyen regulációs elemek funkcionálisan kötődnek a hasznos génekhez annak érdekében, hogy lehetővé tegyék a kívánt vegyületek gyors képződését. Például ilyen regulációs elemeket lehet használni, hogy meghajtsuk azoknak a géneknek az expresszióját, amelyek antitesteket, véralvadási faktorokat, antigén peptideket, virális replikázokat vagy virális köpeny-proteineket, és a másodlagos metabolitszintézisben résztvevő enzimeket (ilyen pl. az isoprenoid bioszintézis) kódolják. Lásd pl. U.S. 5,612,487; U.S. Patent 5,484,719; és U.S. Ser. No. 08/577,483, benyújtva 1995. December 22 .

Egy elicitort vagy patogén-reszponziv elemet tartalmazó kiméra gén egy növénybe történő bevitelét követően a kiméra géntermék expressziója egy megfelelő patogénnel vagy elicitorral indukálható. A kívánt génterméknek (vagy enzimatikus végtermékének) termelődése gyorsan bekövetkezik, és a kívánt terméket csak ezután kaphatjuk meg.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a következő példákon keresztül szemléltetjük. A példák nem korlátozzó értelemben kerülnek bemutatásra.

A következő példák számos olyan eljárást alkalmaznak, amelyek jól ismertek és hozzáférhetőek azok számára, akik járatosak a technika állása szerinti molekuláris biológiában, a rekombináns DNS-nek növényi szövetben történő kezelésében, valamint transzgenikus növények termesztésében és regenerálásában. Az enzimeket kereskedelmi forrásokból kaptuk, és az eladó ajánlásai alapján vagy más, a technika állása szerint jól ismert változatban használtuk. A reagensek, pufferek, és termesztési feltételek jól ismertek a technika jelenlegi állása szerint. Rövidítések, és elnevezések, ahol ezeket alkalmaztuk, standardnak tekinthetők ezen a szakterületen, és általánosan használatosak olyan szakmai folyóiratokban, amelyeket itt is idézünk.

1. példa

Dohány CDPK cDNS klónozása

Az elicitor parasiticeint a Phytophthora parAl gén E. coli sejtekben történő expressziója által készítettük el és a génterméket a periplazmikus térből izoláltuk.

A Phytophthora Race 0 genomikus DNS-ét micéliumból izoláltuk lényegében a következő irodalmi hivatkozás szerint: Xu J. et al. Trends in Genetics 10 226 (1994). A DNSt nyírásnak vetettük alá, majd templátként használtuk a parAl gén PCR-amplifikációjánál a parAl szekvenciára tervezett primerekkel a következő irodalmi hivatkozás szerint: Kamoun, S., et al. Mol. Plant-Microbe Interact. 6__573 (1993). A parAl PCR terméket pBluescript-be (Stratagene, San Diego, CA) klónoztuk és a termék szekvenciáját a dideoxinukleotid lánc-lezárásos módszer alkalmazásával kettős-szálú DNS-szekvenálással határoztuk meg.

A pBluescript-ben levő parAl inszertet PCR módszerrel amplifikáltuk olyan primerek alkalmazásával, amelyek egy Nterminális „hisztidin-cimkét és egy protein kináz helyet hoztak létre a gén 5’ végén. A PCR terméket ligáltuk a pET28b (Novagen, Madison, WI) expressziós vektorba és a parAl fúzió DNS-szekvenciájának igazolása után a pET28b konstrukciót E. coli BL21-be transzformáltuk.

xA parAl fúziót tartalmazó BL 21 tenyészetet kanamycin jelenlétében felnövesztettük 37°C-on 0.3 OD_S00 sejtkoncentrációig. IPTG-t (ImM) adtunk és a tenyészetet 5 órán ke resztül 27°C-on inkubáltuk.

A periplazmikus proteineket ozmotikus sokkal preparáltuk a következő irodalmi hivatkozásban leírtaknak megfelelően: Ausubel, F, et al. In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, (1989) . A sejteket (1.5 ml) centrifugálással szüreteltük, felszuszpendáltuk a következő oldatban: 500 μΐ 50mM Tris -HC1, pH 8.0, 20% szacharóz, ImM EDTA és rázatással inkubáltuk szobahőmérsékleten 10 percig. Centrifugálást követően a csapadékot 200 μΐ hideg magnézium szulfátban (5mM) szuszpendáltuk és rázatva inkubáltuk 10 percen keresztül 4°C-on. A keveréket ezután ismét centrifugáltuk és a kapott felülúszót (amely a periplazmikus proteineket is tartalmazza) Ni⁺⁺ oszlopra vittük. A parAl extraktum protein koncentrációját Bradford-módszerrel határoztuk meg.

Nicotiana tabacum L. cv. KY14 sejt szuszpenziós tenyészetét a gyors növekedés fázisában 2μg/ml végkoncentrációban parasiticeinnel kezeltük, azért hogy a stresszválaszgéneket indukáljuk. Parallel szuszpenziós sejt tenyészet, amely nem volt kezelve parasiticeinnel, szolgált kontrolként. A sejteket óvatos vákuum-szűréssel 0, 30, 60 és 120 perccel az elicitor hozzáadását követően gyűjtöttük össze.

Össz-RNS-t izoláltunk kezelt és nem kezelt dohány sejtekből, és templátként használtuk a „targeted differential display reverse transcriptase PCR (TDDRT-PCR) során. A cDNS első szálát egy „cDNA cycle kit (Invitrogen, San Diego, CA) segítségével hoztuk létre. A cDNS-nek ezt az első szálát használtuk templátként a PCR során. A PCR reakciót következő hivatkozás alapján végeztük el: PCR

Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis M. et al., eds. Academic Press Inc., San Diego, CA (1990), kivéve, hogy a hibridizációs („annealing) hőmérséklet 58 °C volt. A PCR primerek Fokin B (gttgactccctaccctctt) és RecalIV (ggtacttaggaagtgttacggg) voltak. Lásd 1. ábra. A PCR termékeket agarose gélen (1% w/v) történő elktroforézissel választottuk széjjel, és a 800 bp-nál nagyobb termékeket a 60 percig kezelt tenyészetből DE-81 (Whatman) papírra történő elektroelucióval tisztítottuk. A tisztított PCR termékek végeit Klenow polimeráz segítségével feltöltöttük, a pBluescript EcoRV helyére ligáltuk és E. coli TBl-be transzformáltuk.

Ampicillin rezisztens TB1 kolóniákat vizsgáltunk pBluescript-be inszertált 800 bp-nál nagyobb DNS-fragmentumok jelenlétére. Egy ilyen inszert szekvenciáját dideoxinukleotid lánc-lezárásos módszerrel határoztuk meg (Sanger et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 8073) Sequenase kittel (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) vagy egy fluoreszcencián alapuló automatikus rendszerrel (Applied Biosystem, Foster City, CA) . A vektorban levő inszert szekvenciáját mindkét szálon meghatároztuk. Azt a plazmidot, amely ezt az inszertet tartalmazza pCDPK-1 plazmádnak neveztük el.

A pCDPK-l-ben levő inszert nukleotidszekvenciáját mutatja a 2. ábra, és az inszert származtatott aminosav-szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. A származtatott aminosavszekvenciát összehasonlítottuk az EMBL GenBank-ban és a Swiss Prot adatbázisban található növényi gének aminosav szekvenciájával. Homológiát találtunk a növényi CDPK polipeptidekre, beleértve a Glycine max-ból, az Arabidopsis thaliana-ból, a Vigna radiata-ból, a Zea mays-ből és a Cucurbita pepo-ból származó polipeptideket is.

A BLASTP programot és a BLOSUM62 értékelő mátrixot használva a polipeptid aminoterminális részén a szerin/treonin protein kináz doménekre két homológ régiót, a polipeptid karboxiterminális részén a Ca⁺⁺ kötő doménekre pedig négy homológ régiót azonosítottunk. A 4. ábra egy összehasonlítást mutat a 3. ábrán látható aminosav-szekvencia és a szójabab CDPK aminosav-szekvencia között (Genbank Accession No: M64987) A dohány kalcium kötő helyének aminosav-szekvenciája hasonló volt a szójabab CDPK-ban található megfelelő helyek aminosav-szekvenciájával. Azonban a szekvencia más részein szignifikáns különbséget találtunk. Az összehasonlítás azt mutatta, hogy mintegy 78% szekvencia azonosság van a szójabab CDPK és a CDPK-1 között.

A BLASTN programot használtuk, hogy összehasonlítsuk a pCDPK-1 nukleotidszekvenciát a különböző adatbázisokban található nukleinsav szekvenciákkal. Más növényi CDPK-gének nukleotidszekvenciája, valamint az ezek által kódolt polipeptidek hossza alapján, a pCDPK-l-ben jelenlévő nukleinsav inszertben vélhetően 560 bp hiányzik az 5' CDPK-1 kódoló szekvenciából és mintegy 130 bp a 3' CDPK-1 kódoló szekvenciából.

2. példa

Teljes hosszúságú cDNS-klón izolálása

Annak érdekében, hogy teljes hosszúságú kiónt nyerjünk, a „cDNS-végek gyors amplifikációja (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) megközelítést használtunk oly módon, hogy polyA+ RNS-t, amelyet dohány sejtekből preparáltunk elicitor indukciót követően, használtunk templátként. A polyA+ RNS-t az 1. példában leírtak szerint preparáltuk.

Egy prímért, amelynek a szekvenciája gac aag gac ggg agt ggg tat (Primer A, a CDPK-1 belsejében található) és egy másik prímért, amelynek a szekvenciája gac tcg agt cga cat cga ttt ttt ttt ttt ttt tt (dTn, adapter-primer) használtunk, hogy amplifikáljuk a CDPK kódoló szekvenciának a 3'végét. A reverz transzkriptáz reakciót a következő reakcióelegyben hajtottuk végre: 2 μΐ lOxRTC puffer, 10 unit Rnasin (Promega, Biotech), 0.5 μg dT₁₇ adapter primer és 10 unit AMV reverz transzkriptáz (Life Sciences), a reakcióelegy össz-térfogata 3.5 μΐ (Frohman, M. in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, mint fent pp 2 8.) A PCR amplifikációs reakciót a következő reakció-elegyben hajtottuk végre: 5 μΐ lOxPCR puffer, 5μ1 DMSO, 5 μΐ lOxdNTP (15 mM mindegyikből), 30 μΐ víz, 1 μΐ adapter-primer (25 pmol, gac tcg agt cga cat eg) , 1 μΐ primer A és 1-5 μΐ eDNS. A ciklus időt Frohman szerint állítottuk be (Frohman, mint fent)

A CDPK kódoló szekvencia 5'-végének megklónozására a reverz transzkriptáz reakciót a fentiek szerint hajtottuk végre, 10 pmol primer B-t (agg ggc tac gta gta agg act) használva a dTi? adapter-primer helyett. A cDNS-terméket terminális transzferáz és dATP használatával meghosszabbítottuk (Frohman szerint, mint fent), majd PCR-rel a fentiek szerint amplifikáltunk 10 pmol dT_i7 adapter-primerrel, 10 pmol adapter primerrel, és 10 pmol primer C-vel (att ctc agg ctt aag gtc cet) . A PCR-t standard körülmények között hajtottuk végre. Back et al. Arch. Biochem. Biophys. 315 523 (1994). Az amplifikált 3' és 5' termékeket tompavég (blunt-end) klónozással pBluescript SK (Stratagene) vektorba vittük be és rutin molekuláris biológiai eljárás alkalmazásával egyesítettük a pCDPK-1 inszerttel annak érdekében, hogy a dohány-CDPK-t kódoló szekvenciának egy teljes hosszúságú cDNS-ét alakítsuk ki.

A teljes hosszúságú cDNS szekvenciáját dideoxinukleotid lánc-lezárásos eljárással határoztuk meg, az 1. példában leírtak alapján.

3. példa

CDPK-homológ RNS indukálása dohány szuszpenziós tenyészetben

A cCDPK-l-ben található DNS-inszertet használtuk próbaként, hogy kövessük az elicitor által kiváltott génexpresszió indukcióját. A Nicotiana tabacum L cv KY14 sejt szuszpenziós tenyészetét parasiticeinnel kezeltük 0, 1, 2, 6, és 12 órán keresztül az 1. példában leírtak szerint. Az össz-RNS-t izoláltuk, majd 1% agarose gélben elektroforetizáltuk. A pCDPK-ból az inszertet random priming mód szerrel radioaktivitással jelöltük, és a gélben szétválasztott RNS-hez hibridizáltuk (Sambrook, J. et al., mint fent). Az elicitor kezelést megelőzően nem volt olyan mRNS, amely a CDPK-l-hez hibridizálódott volna, mig CDPK-hoz hibridizálódó mRNS-t lehetett detektálni 1, és 2 órával az elicitor kezelést követően. 6 és 12 órával az elicitor kezelés után ismét nem lehetett CDPK-hoz hibridizálódó mRNS-t detektálni, jelezvén, hogy a CDPK-génexpresszió szintje 6 órával a kezelés után lecsökkent.

4. példa

Kiméra CDPK-gén kialakítása

A CDPK-gént kialakítottuk: egy kémiailag szintetizált DNS-ből, amely a 6. ábrán bemutatott szójabab CDPK-ban 1156-ig kódolja az aminosavakat, egy kémiailag szintetizált DNS-ből, amely a 6. ábrán bemutatott szójabab CDPK-ban 456508-ig kódolja az aminosavakat, és a pCDPK-1 CDPK inszertjéből. A három DNS-t rutin molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával ligáltuk és így egy kiméra CDPK-kódoló szekvencia keletkezett, amely a szójabab amino-terminális végéről 1-156-ig tartalmazza az aminosavakat, majd a leolvasási keret változatlanul tartásával kapcsolódik a dohány CDPK 1307-ig tartó aminosavaival (3. ábra), ami viszont ugyancsak a leolvasási keret változatlanul tartásával kapcsolódik a szőjabab-CDPK karboxivégének 465-508-ig tartó aminosavaival .

A kiméra kódoló szekvenciát szensz orientációban inszertáltuk egy Agrobaktérium bináris vektorba, amely egy minimális 35S és EAS4-el indukálható regulációs elemet tartalmaz. A regulációs elem, a promoter és a kódoló szekvencia funkcionális kapcsolatát a kapcsolódási régiók DNSszekvenciájának meghatározásával, valamint transzgenikus növényekben végrehajtott expresszióval bizonyítottuk.

5. példa

Transzgenikus növény létrehozása

A transzformált növényi sejtvonalakat az Agrobacterium tumefaciens módosított transzformációs leírása alapján készítettük el. Olyan nukleinsav-konstrukciót készítettünk, amely vagy a 3. példában leírt teljes hosszúságú CDPK cDNS-t tartalmazta vagy pedig a 4. példában leírt kiméra kódoló szekvenciát. A rekombináns konstrukciókat, amely tartalmazza a növényekbe beviendő szekvenciákat A. tumefaciens GV3850 törzsbe E. coli TB1 (pRK2013) baktériummal történő „triparentális pároztatás segítségével vittük be. N. tabacum leveleket a növekedés különböző állapotában lcm²-es darabokra vágtunk és az Agrobacterium sejtek szuszpenziójába mártottuk (kb. 10⁴-10⁵ sejt/ml). 3-10 perc múltán steril vízzel mostuk, hogy eltávolítsuk a felesleges baktérium sejteket és csökkentsük azokat a problémákat, amiket a felesleges baktérium-növekedés okoz a kezelt levél szegmenseken. Egy rövid szárítási idő után (30-60 mp) a kezelt levél szegmenseket antibiotikumok nélkül növényi szövettenyésztő tápfolyadék felületére helyeztük, hogy meggyorsítsuk a szövet fertőzést és a DNS-transzfért a baktériumból a növényi szövetbe. A növényi szövettenyésztő tápfolyadék li terenként tartalmaz: 4.31 g Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (Sigma Chemical Company, St Louis, MO), 2.5 mg benzilamino-purin (feloldva 1 N NaOH-ban), 10 ml 0.1 mg/ml indol-ecetsav-oldat, 30 g szacharóz, 2 ml Gamborg's Vitamin Solution (Sigma) és 8 g agar. A pH-t 5.5 és 5.8 közé állítottuk NaOH-dal. Két nap után a levél szegmenseket átvittük növényi szövettenyésztő tápfolyadékba, amely 300 pg/ml kanamycint, 500 gg/ml mefoxint (Merck, Rahway, NJ) tartalmazott. Kanamycinnel szelektáltunk a transzformált növényi szövetekre, míg mefoxinnel az Agrobacterium ellen szelektáltunk.

Lehetséges, hogy minimálisra csökkentsük a transzformációs eljárás alatt az Agrobactérium sejteknek explantált szövetekre gyakorolt hatását, ha patogénnel indukálható regulációs elemet használunk, mivel az Agrobactérium sejtek a növényi sejtekbe történő bevitelük után maguk is indukálhatják a regulációs elemet. Ennek megfelelően, a biolisztikus eljárás a DNS-t tartalmazó sejtek öngyilkos génjeinek bevitelére az indukálható transzkripciós regulációs elemek regulációs szabályozása alatt egy hasznos alternatív transzformációs eljárásnak bizonyult, mivel nem vonja maga után az Agrobacterium sejtek vagy a gomba eredetű sejtfal emésztő enzimek felhasználását (ami elektroporárációnál szükséges a protoplasztok létrehozására) , amelyek mindegyike a regulációs elem szabályozása alatt a kódoló szekvenciák indukciójához vezethet.

A transzgenikus növényeket lényegében Horsch et al. által leírt módszer szerint regenerálhatjuk (Science 227

1229 (1985).

6. példa

Kiméra CDPK-gén elicitor- és patogén-indukált expressziója transzgenikus dohányban

A 7. példa CDPK konstrukcióinak aktivitását transzgenikus dohány növényeken mértük, amelyeket vagy elicitorral vagy patogénnel kezeltünk. Kontrolként létrehoztunk olyan transzgenikus dohány növényeket, amelyek a karfiolmozaikvirus (CaMV) 353 promóterének a szabályozása alatt GUS riporter gént expresszálnak. Fi magokat a regenerált transzgenikus dohány növényekből olyan tápon csíráztattunk, amely kanamycint (100mg/L) tartalmazott. A létrejövő kanamycinrezisztens növények ezt követően talajba kerülnek és üvegházban növekednek. A növények felét indukciós feltételek mellett teszteltük CDPK-génexpresszióra, azaz az elicitort vagy a cellulázt i'ntercellulárisan alkalmaztuk transzgenikus növényeken. Az elicitort vagy celulázt mechanikus pipettázó berendezéssel mértük. Kontrollként a maradék növényeket olyan oldattal kezeltük, amely nem tartalmazott cellulázt vagy elicitort. Bizonyos kísérletekben a dohány szövetet szikével megsértettük, hogy megkönnyítsük az indukáló vegyület bejutását.

7. példa

CDPK homológ szekvenciák azonosítása

A dohánylevél genomiális DNS-ét Murray és Thompson által leírt módon izoláltuk (Nucleic Acid Res. 8 4321 * * ' * · *· · · ♦ ’··» · · · *

- 38 (1980) . Az alikvotoknak a kívánt restrikciós enzimekkel történő emésztését'követően az emésztett DNS-mintákat 0.8%os agaróz gélen elektroforézissel szétválasztottuk és a mé,ret szerint szeparált DNS-eket nylon membránra vittük át. A DNS-blotokat hibridizáltuk az 1. példában leírt 900bp hoszszúságú CDPK cDNS-inszerttel, amit random priming módszerrel, radioaktivitással jelöltünk. A hibridizációt 60°C-on hajtottuk végre a következő oldatban: 0.25 M Na-foszfát puffer, pH 8.0, 0.7% SDS, 1% marhas zérum-albumin, 1 mM EDTA. A blotot ezután kétszer mostuk 45°C-on 2xSSC, 0.1% SDS-sel, és kétszer 0.2% SSC, 0.1% SDS-sel (IxSSC 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-citrát, pH 7.0). A különböző csíkok relatív hibridizációs intenzitását az autoradiogramról egy videodenzitométer segítségével értékeltük (Milligen/ Biosearch, Ann Arbor, MI).

Annak érdekében, hogy azonosítsuk azokat a polinukleotidokat, amelyek a dohány CDPK-val homológ szekvenciával rendelkeznek, valamint, hogy meghatározzuk a genomonkénti másolatok nyilvánvaló számát, Southern hibridizációs kísérletet végeztünk olyan cél-DNS-t használva, amelyet más növényi fajokból izoláltunk, valamint dohány CDPK próbát. Különböző növényi fajok restrikciós endonukleázzal emésztett genomiális DNS-eit agaróz gélelektroforézissel (0.8%) választottuk el, majd Hybond-N⁺ membránra (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) vittük át. Radioaktivitással jelölt próba fragmentumok, amelyek tartalmazzák pCDPK-1 kódoló szekvenciáját az emésztett genomiális DNS-hez hibridizálódnak. (Sambrook et al. (1989), mint fent). Közepesen szigorú hibridizációs feltételeket használtunk (hibridizáció 4xSScben, 65°C-on, az utolsó mosás IxSSC-vel 65°C-on).

Alternatív módon PCR is végezhető templátként a genomiális cél-DNS-t használva, a primerek pedig a pCDPK kódoló szekvenciának erősen konzervatív régiójából származnak.

8. példa

Egy CDPK kódoló szekvencia környezetében levő genomiális DNS

Az 1. példában leírt cDNS-klónt használtuk hibridizációs próbaként az N. tabacum cv. NK326 XEMBL3 vektorban kialakított genomikus könyvtár vizsgálatára (Clontech, Palo Alto, CA). Az 1. példában leírt dohány CDPK-hoz viszonyítva 70% vagy annál nagyobb szekvencia azonossággal rendelkező genomikus DNS-klónokat rutin szubklónozó eljárás szerint azonosítottuk. A klónozott nukleinsav inszertek nukleotidszekvenciáját rutin szekvenálási eljárás alapján határoztuk meg.

A genomikus DNS-klónok egyikének teljes hosszúságú kódoló szekvenciája van, amely magában foglalja az 1. példában leírt dohány CDPK kódoló szekvenciát. A klón magában foglalja azt a DNS-t is, amely szomszédos az 1. példában leírt kódoló szekvencia 5’ végével. Az ebben a kiónban lévő 5' szomszédos DNS nukleotidszekvencia-vizsgálata feltárt egy feltételezett ATG startkódont, valamint egy vagy több feltételezett regulációs elemet a startkódon előtt és a start kódontól számított 1000 bp-on belül.

Nyilvánvaló, hogy az igényelt oltalmi kör nem korlátozható a részletes példákban bemutatott kiviteli alakokra, ezek csak a találmány szerinti megoldás illusztrálására szolgálnak, és nem a találmány oltalmi körét határozzák meg. A bemutatottakon túl számos egyéb megvalósítási mód is a mellékelt igénypontok által meghatározott oltalmi körbe esik.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 921 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős '

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGGGACCTTA AGCCTGAGAA TTTCCTTTTC AGTGCCGACG

AAAGAGTAAG 60

GCCACCGACT TCGGGCTTAG TGTATTCTAT AAGCCTGGGC GGACATAGTA 120

GGGAGTCCTT ACTACGTAGC CCCTGAGGTA CTTAGGAAGT

TGGGAGTGAC 180

GTATGGAGTG CCGGGGTAAT ACTTTACACC CTTCTTTGTG TTTCATGGCC 240

GACAGTGAGC CTGGGGTAGC CCTTCAAATA CTTCATGGGG

CAAGAGTGAC 3 00

CCTTGGCCTA CCATAAGTGA GAGTGCCAAG GACCTTATAA TGAGCAAGAC 360

CCTAAGAGGA GGCTTACCGC CCATGAGGTA CTTAGGCATC AGACGAGAAT 420

ATAGCCCCTG ACAAGCCTCT TGGGCCTGCC GTACTTAGTA

ATTCAGTGCC 480

ATGAATAAGA TAAAGAAGAT GGCCCTTAGG GTAATAGCCG TGAGGAGGAG 540

ATAGTAGGGC TTAAGGAGAT GTTCAAGATG GACACCGACA

CGTAACCTTC 600 TTCCATCTTA AGCAAGGGCT TAAGAGGGTA GGGAGTCAAC TGAGATAAAG 660

GACCTTATGG ACGCCGCCGA CGTAGACAAT AGTGGGACCA

ACTTCATGGT

AAAAGTTCAC

GTTACGGGCC

GGGCCCCTCC

ACCTTGACTT

GGAAGATGCT

CTTGGATAGT

GGCTTAAGCA

AGAGGCTTAG

ATAGTGGGAC

TTGGGGAGAG

TAGACTATGG

GGAGTTCGTA ACCGCCGCCA TGCCTTCAGT TATCATGACA AGCCCTTGAG GAGTTCGGGG CACCGACAAT GATGGGCAAA

720

TGCATCTTAA 780

AGGACGGGAG

840

TACCTGACAC 900

TAGAT TAT GG

TAAGATAAAG

TGGGTATATA

CAGTCTTGAG

G 921

AGGGAGGACC

GAGGTAGACG

GACATGATAA

ATCTTGTAAG

AGCTTAGGCA

AGGAGGTAGA

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 307 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met 15 1015

Val Lys Ser Lys Alá Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro 20 2530

Gly Gin Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Alá Pro 35 4045

Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Alá 50 5560

Gly Val lie Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala 65 70 7580

Asp Ser Glu Pro Gly Val Alá Leu Gin Ile Leu His Gly Asp Leu Asp 85 9095

Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Alá Lys Asp Leu 100 105110 lie Arg Lys Met Leu Glu Gin Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Alá His 115 120125

Glu Val Leu Arg His Pro Trp lie Val Asp Glu Asn lie Alá Pro Asp 130 135140

Lys Pro Leu Gly Pro Ala Vai Leu Ser Arg Leu Lys Gin Phe Ser Ala 145 150 155160

Met Asn Lys He Lys Lys Met Ala Leu Arg Vai He Ala Glu Arg Leu 165 170175

Ser Glu Glu Glu lie Vai Gly Leu Lys Glu Met Phe Lys Met Asp Thr 180 185190

Asp Asn Ser Gly Thr Vai Thr Phe Phe His Leu Lys Gin Gly Leu Lys 195 200205

Arg Vai Gly Ser Gin Leu Gly Glu Ser Glu lie Lys Asp Leu Met Asp 210 215220

Ala Ala Asp Vai Asp Asn Ser Gly Thr He Asp Tyr Gly Glu Phe Vai 225 230 235240

Thr Ala Ala Met His Leu Asn Lys lie Lys Arg Glu Asp His Leu Vai 245 250255

Ser Ala Phe Ser Tyr His Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr He Glu Vai 260 265270

Asp Glu Leu Arg Gin Ala Leu Glu Glu Phe Gly Vai Pro Asp Thr Ser 275 280285

Leu Glu Asp Met lie Lys Glu Vai Asp Thr Asp Asn Asp Gly Gin lie 290 295300

Asp Tyr Gly 305

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACTTAGG AAGTGTTACG GG 22

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázispár TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTTGACTCCC TACCCTCTT

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 512 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Ala Ala Lys Ser Ser Ser Ser

Leu Lys Ala Alá Trp Val Leu Pro

Val Tyr Glu Val Gly Arg Lys Leu

3540

Phe Glu Cys Thr Arg Arg Alá Ser

5055

Ile Pro Lys Arg Lys Léu Leu Cys

6570

Arg Glu He Gin lie Met His His

Arg lie Glu Gly Thr Tyr Glu Asp

Ser Thr Thr Thr Asn Val Val Thr 1015

Gin Arg Thr Gin Asn Ile Arg Glu 2530

Gly Gin Gly Gin Phe Gly Thr Thr 45

Gly Gly Lys Phe Alá Cys Lys Ser 60

Lys Glu Asp Tyr Glu Asp Val Trp 75 80

Leu Ser Glu His Alá Asn Val Val 90 95

Ser Thr Alá Val His Leu ValMet

100 105 110

Glu Leu Cys Glu Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg lie Vai Gin Lys Gly

115

His Tyr Ser Glu 130

Vai Vai Glu Ala 145

Pro Glu Asn Phe

Ala Thr Asp Phe

180

Cys Asp Vai Vai

195

Lys Leu Tyr Gly 210

Tyr lie Leu Leu 225

Gly lie Phe Arg

Pro Trp Pro Ser

260

Leu Asp Gin Asn 275

His Pro Trp lie

290

Ser Ala Vai Leu

305

Lys Lys Met Ala lie Gly Gly Leu

340

Gly Thr He Thr 355

Lys Arg Vai Gly 370

Asp Ala Ala Asp 385

120

Arg Gin Ala Ala 135

Cys His Ser Leu

150

Leu Phe Asp Thr 165

Gly Leu Ser Vai

Gly Ser Pro Tyr

200

Pro Glu Ser Asp 215

Ser Gly Vai Pro

230

Gin lie Leu Leu

245 lie Ser Asp Ser

Pro Lys Thr Arg

280

Vai Asp Asp Asn 295

Ser Arg Leu Lys 310

Leu Arg Vai lie 325

Lys Glu Leu Phe

Phe Asp Glu Leu

360

Ser Glu Leu Met

375 lie Asp Lys Ser

390

Arg Leu lie Lys

140

Gly Vai Met His 155 lie Asp Glu Asp

170

Phe Tyr Lys Pro 185

Tyr Vai Ala Pro

Vai Trp Ser Ala

220

Pro Phe Trp Ala 235

Gly Lys Leu Asp

250

Ala Lys Asp Leu 265

Leu Thr Ala His lie Ala Pro Asp

300

Gin Phe Ser Ala

315

Ala Glu Arg Leu 330

Lys Met lie Asp 345

Lys Asp Gly Leu

Glu Ser Glu He

380

Gly Thr He Asp

395

125

Thr He Vai Glu

Arg Asp Leu Lys

160

Ala Lys Leu Lys

175

Gly Glu Ser Phe 190

Glu Vai Leu Arg 205

Gly Vai He Leu

Glu Ser Glu Pro

240

Phe His Ser Glu

255 lie Arg Lys Met 270

Glu Vai Leu Arg 285

Lys Pro Leu Asp

Met Asn Lys Leu

320

Ser Glu Glu Glu

335

Thr Asp Asn Ser 350

Lys Asp Gly Leu 365

Lys Asp Leu Met

Tyr Gly Glu Phe

400 lie Ala Ala Thr Vai His Leu Asn Lys Leu Glu Arg Glu Glu Asn Leu 405 410415

Vai Ser Ala Phe Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Tyr lie Thr 420 425430

Leu Asp Glu lie Gin Gin Ala Cys Lys Asp Phe Gly Leu Asp Asp lie 435 440445

His lie Asp Asp Met lie Lys Glu He Asp Gin Asp Asn Asp Gly Gin 450 455460

He Asp Tyr Gly Glu Phe Ala Ala Met Met Arg Lys Gly Asn Gly Gly 465 470 475480

He Gly Arg Arg Thr Met Arg Lys Thr Leu Asn Leu Arg Asp Ala Leu 485 490495

Gly Leu Vai Asp Asn Gly Ser Asn Gin Vai lie Glu Gly Tyr Phe Lys 500 505510

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACAAGGACG GGAGTGGGTA T 21

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

- 47 A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACTCGAGTC GACATCGATT ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT 35

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACTCGAGTC GACATCG

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGGGGCTACG TAGTAAGGAC T

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTCTCAGGC TTAAGGTCCC T 21

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 308 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met

1015

Val Lys Ser Lys Alá Thr Asp Phe Gly Leu Ser Val Phe Tyr Lys Pro

2530

Gly Gin Lys Phe Thr Asp Ile Val Gly Ser Pro Tyr Tyr Val Alá Pro

4045

Glu Val Leu Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Val Trp Ser Alá 50 5560

Gly Val lie Leu Tyr Thr Leu Leu Cys Gly Ala Pro Pro Phe Met Ala

70 7580

Asp Ser Glu Pro Gly Val Alá Leu Gin Ile Leu His Gly Asp Leu Asp

9095

Phe Lys Ser Asp Pro Trp Pro Thr Ile Ser Glu Ser Alá Lys Asp Leu

100 105110 lie Arg Lys Met Leu Glu Gin Asp Pro Lys Arg Arg Leu Thr Alá His

115 120125

Glu Vai Leu Arg His 130

Lys Pro Leu Gly Pro 145

Met Asn Lys He Lys

165

Ser Glu Glu Glu He

180

Thr Asp Asn Ser Gly 195

Lys Arg Vai Gly Ser 210

Asp Ala Ala Asp Vai 225

Vai Thr Ala Ala Met

245

Vai Ser Ala Phe Ser

260

Vai Asp Glu lie Arg 275

Ser Leu Glu Asp Met

290 lie Asp Tyr Gly 305

Pro Trp lie Vai Asp Glu

135

Ala Vai Leu Ser Arg Leu

150 155

Lys Met Ala Leu Arg Vai

170

Vai Gly Leu Lys Glu Met

185

Thr Vai Thr Phe Phe His

200

Gin Leu Gly Glu Ser Glu

215

Asp Asn Ser Gly Thr lie

230 235

His Leu Asn Lys He Lys

250

Tyr His Asp Lys Asp Gly

265

Gin Ala Leu Glu Glu Phe

280

He Lys Glu Vai Asp Thr

295

Asn lie Ala Pro Asp 140

Lys Gin Phe Ser Ala

160 lie Ala Glu Arg Leu

175

Phe Lys Met He Asp 190

Leu Lys Asp Gly Leu 205

He Lys Asp Leu Met 220

Asp Tyr Gly Glu Phe

240

Arg Glu Asp His Leu

255

Ser Gly Tyr lie Glu

270

Gly Vai Pro Asp Thr 285

Asp Asn Asp Gly Gin 300

Claims (30)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Izolált polinukleotid, amely tartalmaz

a) egy 1. azonosító szám szerinti nukleotidszekvenciát;

b) az 1. azonosító szám szerinti nukleotidszekvencia egy RNS analógját;

c) egy a) szerinti vagy a b) szerinti szekvenciával komplementer polinukleotidot tartalmazó nukleinsav szekvenciát; vagy

d) az a) , b) vagy c) szerinti szekvencia egy nukleinsavfragmentjét, amely szigorú körülmények között hibridizál a 3. ábra szerinti polipeptidet kódoló genomiális DNS-sel.

2. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely tartalmazza a 2. ábra szerinti 1-170. nukleotidokat.

3. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely tartalmazza a 2. ábra szerinti 160-560. nukleotidokat.

4. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely tartalmazza a 2. ábra szerinti 550-920. nukleotidokat.

5. Nukleinsav-konstrukció, amely 1. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti nukleinsav-konstrukció, amely funkcionálisan a polinukleotidhoz kapcsolt regulációs elemet is tartalmaz.

7. A 6. igénypont szerinti nukleinsav-konstrukció, amely regulációs elemként indukálható regulációs elemet tartalmaz.

θ.

A 7. igénypont szerinti nukleinsav-konstrukció, amely regulációs elemként növényi patogén hatására indukálódó regulációs elemet tartalmaz.

9. Transzgenikus növény, amely 1. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmazó nukleinsav-konstrukciót tartalmaz .

10. A 9. igénypont szerinti növény, amely a polinukleotidhoz funkcionálisan kapcsolt regulációs elemet is tartalmazó konstrukciót tartalmaz.

11. A 10. igénypont szerinti növény, amely regulációs elemként indukálható regulációs elemet tartalmaz.

12. A 11. igénypont szerinti növény, amely regulációs elemként növényi patogén hatására indukálódó regulációs elemet tartalmaz.

13. A 11. igénypont szerinti növény, amely regulációs elemként elicitor hatására indukálódó regulációs elemet tartalmaz.

14. A 9. igénypont szerinti növény, amely kétszikű.

15. A 14. igénypont szerinti növény, amely a Solanaceae család tagja.

16. A 15. igénypont szerinti növény, amely egy Nicotiana.

17. A 16. igénypont szerinti növény, amely Nicotiana tabacum.

18. Transzgenikus növény, amely egy mintegy 250-550 aminosavból álló, a 3. ábra szerinti aminosav-szekvenciával lényegében azonos aminosav-szekvenciát magába foglaló polipeptidet expresszáló polinukleotidot tartalmaz.

19. A 18. igénypont szerinti növény, amely egy, a 3. ábra szerinti aminosav-szekvenciát magába foglaló polipeptidet expresszáló polinukleotidot tartalmaz.

20. A 18. igénypont szerinti növény, amely kétszikű.

21. A 20. igénypont szerinti növény, amely a Solanaceae család tagja.

22. Eljárás polinukleotid alkalmazására, azzal jellemezve, hogy az eljárás végrehajtása során 1. igénypont szerinti polinukleotidot növényi eredetű DNS-sel vagy RNS-sel hibridizáltatunk.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás végrehajtása során azonosítjuk a növényi eredetű DNS vagy RNS egy, a polinukleotiddal 7 0%-os vagy annál nagyobb szekvenciaegyezést mutató szegmensét.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS- vagy RNS-szegmens legalább egy részét megklónozzuk .

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 70%-os vagy annál nagyobb szekvenciaegyezést mutató szegmenssel együtt az azt szegélyező DNS-t is megklónozzuk.

26. Eljárás növény betegséggel szembeni rezisztenciájának megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy

a) 5. igénypont szerinti nukleinsav-konstrukciót növényi sejtbe juttatjuk; és

b) a sejtből olyan, a polinukleotidot tartalmazó növényt állítunk elő, melyben a polinukleotid expressziója megváltoztatja a növény betegséggel szembeni rezisztenciáját .

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtbe a polinukleotidhoz funkcionálisan kapcsolódó, az expressziót szabályozni képes indukálható regulációs elemet is tartalmazó nukleinsav-konstrukciót juttatunk.

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtbe elicitor vagy növényi patogén által indukálható regulációs elemet tartalmazó nukleinsav-konstrukciót juttatunk.

29. Izolált polipeptid, amely mintegy 250-550 aminosavból áll, és magába foglal egy, a 3. ábra szerinti aminosavszekvenciával lényegében azonos aminosav-szekvenciát.

30. A 29. igénypont szerinti polipeptid, amely a 3. ábrán látható aminosav-szekvenciát tartalmazza.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.