HUP0003327A2 - Szőlőlevél-sodródást okozó vírus (2. típus) fehérjék és alkalmazásuk - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát a szőlőnövény levélsodródást okozó vírusának (2.típus) fehérjéi, a fehérjékkel reagáló ellenanyagok, a fehérjéketkódoló nukleinsavmolekulák, valamint ezek alkalmazásai képezik. Atalálmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerintinukleinsavmolekulákkal transzformált gazdasejtek, a találmány szerintigazdasejteket tartalmazó transzgenikus növények, valamint eljárásoknövények vírusrezisztenssé tételére és a levélsodródást okozó víruskimutatására a találmány szerinti nukleinsavmolekulák és ellenanyagokalkalmazásával. A találmány szerinti megoldás alkalmas vírusrezisztenstranszgenikus növények előállítására és új, hatékonyabb növényvédelmieljárások kidolgozására. Ó

Description

Képviselő: KÖZZÉTÉTELI

Danubia PÉLDÁNY

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

Szőlőlevél-sodródást okozó vírus (2. típus) fehérjék és alkalmazásuk

A találmány tárgyát a szőlőnövény levélsodródást okozó vírusának (2. típus) fehérjéi, a fehérjékkel reagáló ellenanyagok, a fehérjéket kódoló nukleinsav-molekulák, valamint ezek alkalmazásai képezik.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti nukleinsav-molekulákkal transzformált gazdasejtek, a találmány szerinti gazdasejteket tartalmazó transzgenikus növények, valamint eljárások növények vírus-rezisztenssé tételére és a levélsodródást okozó vírus kimutatására a találmány szerinti nukleinsav-molekulák és ellenanyagok alkalmazásával .

A találmány szerinti megoldás alkalmas vírusrezisztens transzgenikus növények előállítására és új, hatékonyabb növényvédelmi eljáeások kidolgozására.

Aktaszámunk: 91044-9259/PÁ

A világ legszélesebb körben termesztett gyümölcsnövényét, a szőlőt (Vitis sp.) az Antarktisz kivételével az Összes kontinensen termesztik. Azonban a fő szőlőtermelő központokat az európai országokban találjuk (beleértve Olaszországot, Spanyolországot és Franciaországot), amelyek a világ szőlőtermelésének körülbelül a 70%-át állítják elő [Mullins és mtsai.: Biology of the Grapevine, Cambridge, Egyesült Királyság, University Press, (1992)]. Az Egyesült Államok - 300.000 hektár szőlőültetvénnyel - a nyolcadik legnagyobb szőlőtermesztő világviszonylatban. Bár a szőlőt sokféle módon használják fel, a termelt szőlő fő részét (közel 80%) bortermelésre használják. A gabonanövényekkel ellentétben a világ szőlőültetvényeit hagyományos szőlőnövény-termesztési változatokkal ültetik be, amelyeket évszázadokon keresztül vegetatív szaporítással tartottak fenn. Számos fontos szőlőnövény vírus és vírus-szerű betegség mint például a szőlőnövény-levélsodródás, parafakéreg kialakulás, és Rupestris szár kipattogzás - kerül átvitelre és terjed a fertőzött, vegetatív módon szaporított anyagok alkalmazása útján. így tehát a tanúsított, vírusmentes anyagok szaporítása a legfontosabb betegség ellenőrző intézkedések egyike. A betegségekkel szembeni ellenálló képesség kifejlesztéséhez a hagyományos nemesitési eljárások nehezen megvalósíthatók a szőlőnövény erősen heterozigóta jellegének és kikereszteződési viselkedésének köszönhetően valamint az öröklődés poligénes mintázatának megfelelően. Továbbá, egy új termesztési változat bevezetését tilthatják a szokások vagy a törvény. Az utóbbi idők biotechnológiai fejlesztései lehetővé tették speciális tulajdonságok bejuttatását - mint például a betegségekkel szembeni ellenálló képesség - egy megalapozott termesztési variánsba annak kertészeti jellemzőinek megváltoztatása nélkül.

Sok növényi patogén - mint például gombák, baktériumok, fitoplazmák, vírusok és nematódák - fertőzhetik meg a szőlőt és az ennek eredményeképpen kialakult betegségek jelentős veszteségeket okozhatnak a termelésben [Pearson és mtsai.: Compendium of Grape Diseases, American Phytopathological Society Press (1988)]. Ezek között a vírusbetegségek jelentenek fő akadályt a szőlőnövény hasznot biztosító termesztése útjában. Már körülbelül 34 vírust izoláltak és jellemeztek szőlőnövényekből. A főbb vírusbetegségeket a következő csoportokba sorolhatjuk: (1) a legyezőszerű levelet okozó nepovírus, más európai nepovírusok és amerikai nepovírusok okozta szőlőnövény degeneráció; (2) a levélsodródást okozó komplex; és (3) a göcsörtös faszerkezetet létrehozó komplex [Martelli (szerk.): Graft Transmissible Diseases of Grapevines. Handbook for Detection and Diagnosis, FAO, Egyesült Nemzetek Szervezete, Róma, Olaszország, (1993)].

A főbb vírusbetegségek közül a szőlőnövény-levélsodródás komplex a legszélesebb körben elterjedt szerte a világban. Goheen szerint [Grape leafroll In: Frazier és mtsai., (szerk.) : Virus Diseases of Small Fruits and Grapevines (A Handbook), University of California, Division of Agricultural Sciences, Berkeley, Kalifornia, Egyesült Államok, 209-212. oldal, (1970); a továbbiakban:

Goheen, (1970)] szőlőnövény-levélsodródás-szerű betegség már az 1850-es években leírásra került a német és a francia irodalomban. Azonban a betegség vírus természetét először Scheu mutatta ki [Scheu: D. D. Weinbau 14 222 (1935); a továbbiakban: Scheu, (1935)]. 1946-ban Hármon és Snyder állapította meg a White Emperor betegség vírustermészetét Kaliforniában [Harmon és mtsai: Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 74 190 (1946)]. Később Goheen és munkatársai bebizonyították [Goheen és mtsai.: Phytopathology 48 51 (1958); a továbbiakban: Goheen, (1958)], hogy a levélsodródás és a White Emperor betegség ugyanaz és csak a levélsodródás név maradt fenn.

A levélsodródás a szőlő súlyos vírusbetegsége és mindenütt előfordul, ahol szőlőt termesztenek. A betegségnek ez a széleskörű elterjedése a beteg vesszők szaporításán keresztül történt meg. Érinti a Vitis nemzetség csaknem az összes termesztett és gyökértörzs variánsát. Bár a betegség nem végzetes, termésveszteséget és a cukortartalom csökkenését okozza. Scheu becslése szerint 1936-ban a Németországban ültetett szőlőnövények összességének a 80% fertőzött volt [Scheu: Mein Winzerbuch, Berlin, Reichsnahrstand-Verlags (1936)]. Sok kaliforniai borszőlőt termelő szőlőskertben a levélsodródás előfordulása (a szabadföldön észlelhető tünetek 1959-ben elvégzett felmérése alapján) megegyezik Scheu eredeti megfigyeléseivel a német szőlőskertekben [Goheen és mtsai.: Amer. J. Enol. Vitic. 10 78 (1959)]. A levélsodródás betegség jelenlegi helyzete nem látszik semmivel sem jobbnak [Goheen: The * · ·· ···· ··· ······ M·· i

American Phytopathological Society 1 47 (1988); a továbbiakban: Goheen, (1988)]. Goheen azt is felbecsülte, hogy a betegség éves szinten a teljes termesztett szőlőmennyiségben körülbelül 5-20% veszteséget okoz [Goheen, (1970) és Goheen, (1988)]. A cukor mennyisége a fertőzött vesszők egyes bogyóiban csak körülbelül fele-kétharmada az egészséges vesszőkről származó bogyókban található cukor mennyiségének [Goheen, (1958)].

A levélsodródás betegség tünetei jelentős mértékben változhatnak a termesztett változattal, a környezettől függően es az időszakkal az éven belül. Vörös vagy sötét színű gyümölcs változatok esetén a bazális, érett levelek tipikus lefelé irányuló felsodródása és az erek közötti vörösödés a legerőteljesebben ősszel fordul elő, de nem jelentkezik tavasszal vagy kora nyáron. A világos színű gyümölcs változatok esetén azonban a tünetek kevésbé feltűnőek, rendszerint lefelé irányuló felsodródás jelentkezik, amit az erek közötti klorozis kísér. Továbbá sok fertőzött gyökértörzs termesztett változat esetén nem is fejlődnek ki a tünetek. Ezekben az esetekben a betegség kimutatása általánosságban egy fás indikátor indexelő vizsgálati eljárással történik, Vitis vivifera cv. Cabernet Franc alkalmazásával [Goheen, (1988) ] .

Mióta Scheu kimutatta, hogy a levélsodródás graft-tal átvihető, vírus etiológiát tételeztek fel [Scheu, (1935)] Számos vírus részecske típust izoláltak levélsodródás betegséget mutató vesszőkből. Ezek magukba foglalnak potyvírus-szerű [Tanne és mtsai.: Phytopathology 67 442 (1977)], izometrikus vírus-szerű [Castellano és mtsai.: Vitis 22 23 (1983); a továbbiakban: Castellano, (1983) valamint Namba és mtsai.: Ann. Phytopathol. Soc. Japan 45 70 (1979)], és closterovírus-szerű [Namba: Ann.

Phytopathol. Soc. Japan 45 497 (1979)] részecskéket. Az utóbbi években azonban 1400-2200 nm tartományba eső hosszú, csavarodó closterovírusokat azonosítottak leggyakrabban a levélsodródás betegséggel (1. ábra), [Castellano, (1983); Faoro és mtsai.: Riv. Patol. Vég., Ser IV., 17 183 (1981); Gugerli és mtsai.: Rev. Suisse Viticult. Arboricult. Hort. 16 299 (1984); a továbbiakban: Gugerli, (1984); Hu és mtsai.: J. Phytopathol. 128 1 (1990); a továbbiakban: Hu, (1990); Milne és mtsai.: Phytopathol. Z. 110 360 (1984); Zee és mtsai.: Phytopathology 77 1427 (1987); a továbbiakban: Zee, (1987); valamint Zimmermann és mtsai.: J. Phytopathol. 130 205 (1990); a továbbiakban: Zimmermann, (1990)]. Ezekre a closterovirusokra mint szőlőnövény-levélsodródáshoz kapcsolódó vírusokra hivatkozunk (GLRaV) Legalább hat szerológiailag megkülönböztethető GLRaV típust mutattak ki (GLRaV-1 - GLRaV-6) levélsodródás betegség által megtámadott vesszőkből (1. táblázat) [Boscia és mtsai.: Vitis 34 171 (1995); a továbbiakban: Boscia, (1995); valamint Martelli: Leafroll, 37-44. oldalak, In: Martelli, (szerk.): Graft Transmissible Diseases of Grapevines, Handbook for Detection and Diagnosis, FAO, Róma, Olaszország, (1993); a továbbiakban: Martelli I]. Ezek közül az első öt megerősítést nyert az alábbi konferencia során: 10^th Meeting of the International Council for the Study of ·:. .:. ··.?·

Virus and Virus Diseases of the Grapevine (ICVG), Volos, Görögország, (1990).

1. táblázat

típus	részecske hossz (nm)	Burokfehérje Mr (x 103)	hivatkozás
GLRaV-1	1400-2200	39	Gugerli, (1984)
GLRaV-2	1400-1800	26	Gugerli, (1984);
			Zimmermann, (1990)
GLRaV-3	1400-2200	43	Zee, (1987)
GLRaV-4	1400-2200	36	Hu, (1990)
GLRaV-5	1400-2200	36	Zimmermann, (1990)
GLRaV-6	1400-2200	36	Gugerli, (1993)

Monoklonális antitestek alkalmazásán keresztül azonban, az eredeti Gugerli által leírt GLRaV-II [Gugerli, (1984)] esetében kimutatták, hogy feltételezhetően legalább két komponens - Ila és Ilb - keveréke [Gugerli és mtsai.: Grapevine Leafroll Associated Virus II Analyzed by Monoclonal Antibodies, 11^th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine, Montreaux, Svájc, 23-24. oldalak, (1993); a továbbiakban: Gugerli, (1993)]. Az újabb kutatások összehasonlító szerológiai vizsgálati eljárások alkalmazásával [Boscia, (1995)] kimutatták, hogy a cv. Chasselas 8/22 Ilb komponense megegyezik a Franciaországból származó GLRaV-2 izolátummal [Zimmermann, (1990)], amely ugyanakkor magába foglalja a szőlőnövény parafakérgességhez kapcsolódó closterovírus izolátumokat is Olaszországból (GCBaV-BA) [Boscia, (1995)] és az Egyesült Államokból (GCBaV-NY) [Namba és mtsai.: Phytopathology 81 964 (1991); a továbbiakban: Namba, (1991)]. A cv. Chasselas 8/22 Ha komponense ideiglenesen a szőlőnövény-levélsodródáshoz kapcsolódó 6. vírus nevet kapta (GLRaV-6). Továbbá a Boscia és munkatársai által előállított GLRaV-2 CA-5 izolátum elleni antiszérumról [Boscia és mtsai.: Phytopathology 80 117 (1990)] kimutatták, hogy mind a GLRaV-2 és a GLRaV-1 elleni antitesteket tartalmaz, előnyben részesítve az utóbbit [Boscia, (1995)].

A GLRaV-2 virionok csavarodó, filament-szerű részecskék, körülbelül 1400-1800 nm hosszal [Gugerli és mtsai.: Rev. Suisse Viticult. Arboricult. Horticult. 16 299 (1984)]. Egy körülbelül 15 kilobázis (kb) nagyságú kettősszálú RNS (dsRNS) izolálható állandó jelleggel a GLRaV-2 fertőzött szövetekből [Goszczynski és mtsai.: Vitis 35 133 (1996)]. A GLRaV-2 burokfehérjéje körülbelül 22-26 kiloDalton (kDa) nagyságú [Zimmermann és mtsai.: J. Phytopathol. 130 205 (1990); Gugerli és Ramel (részletezett összefoglaló): Grapevine Leafroll Associated Virus II Analyzed by Monoclonal Antibodies, 11^th ICVG, Montreux, Svájc, (szerk. Gugerli), Federal Agricultural Research Station of Changins, CH-1260, Nyon, Svájc, 23-24. oldalak, (1993); Boscia és mtsai.: Vitis 34 171 (1995)], ami jelentősen kisebb, mint más GLRaV-k (35-43 kDa) esetében [Zee és mtsai.: Phytopathology 77 1427 (1987); Hu és mtsai.: J.

··:·

Phytopathology 128 1 (1990); Ling és mtsai.: Arch, of

Virology 142 1101 (1997)]. Bár a GLRaV-2-t a Closterovirus nemzetség tagjaként osztályozták részecske morfológia és citopatológia alapján [Martelli: Circular of ICTV-Plant Virus Subcommittee Study Group on Closterolike Viruses, (1996)], ennek molekuláris és biokémiai tulajdonságai nincsenek jól jellemezve.

A closterovirus csoportban számos vírust szekvenáltak meg az utóbbi időkben. A részleges vagy teljes genomi szekvenciák a cékla sárgulást okozó vírus (BYV) esetében [Agranovsky és mtsai.: J. General Virology 72 15 (1991); Agranovsky és mtsai.: Virology 198 311 (1994)], cékla sárgás elsatnyulást okozó vírus (BYSV) esetében [Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996)], citrus tristeza vírus (CTV) esetében [Pappu és mtsai.: Virology 199 35 (1994); Karasev és mtsai.: Virology 208 511 (1995)], fejes saláta fertőző sárgulást okozó vírus (LIYV) esetében [Klaassen és mtsai.: J. General Virology 75 1525 (1994); Klaassen és mtsai.: Virology 208 99 (1995)], apró cseresznye vírus (LChV) esetében [Keim és Jelkmann: Arch. Virology 141 1437 (1996); Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997)] valamint GLRaV-3 esetében [Ling és mtsai.: J. Gén. Virology 79(5) 1289 (1998)] a closterovirusok számos közös jellegzetességét tártak fel, beleertve a HSP70 chaperon hősokk fehérje jelenlétét és a burokfehérje gén duplikátumának jelenlétét [Agranovsky és mtsai.: Adv. in Virus Res. 12 119 (1996); Dolja és mtsai.: Annual Rev. Photopathology 32 261 (1994); Boyko és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA ⁸⁹ 9156 (1992)]. A GLRaV-k genomi szerveződésének jellemzése molekuláris információt biztosíthat azon szerológiailag megkülönböztethető closterovírusok esetében, amelyek hasonló levélsodródási tüneteket okoznak szőlőnövényen.

Számos rövidebb closterovirust (részecske hosszúság 800 nm) izoláltak hasonlóképpen szőlőnövényekből. Ezek közül az egyiket - amelyet szőlőnövény A-vírusnak neveznek (GVA) megtalálták a levélsodródás betegséggel társultan is, bár ez a kapcsolódás nem volt következetes [Agran és mtsai.: Vitis 29 43 (1990); Conti és mtsai.: Phytopathol. Mediterr. 24 110 (1985); valamint Conti és mtsai.: Phytopathology 70 394 (1980)]. A GVA etiológiája nem igazán ismert, azonban úgy tűnik, hogy rendszeresebben társul a göcsörtös fásodáshoz sensu lato [Rosciglione és mtsai.: Rev. Suisse Vitic Arboric. Hortic. 18 207 (1986); a továbbiakban:

Rosciglione, (1986); valamint Zimmermann, (1990)]. Továbbá egy másik rövid closterovirust (800 nm hosszú) - elnevezése szőlőnövény B-vírus (GVB) - izoláltak és jellemeztek parafa-kérgesedéssel fertőzött vesszőkből [Boscia és mtsai.: Arch. Virol. 130 109 (1993); valamint Namba, (1991)].

Ahogyan ezt Martelli feltételezte [Martelli I], a levélsodródási tüneteket okozhatja egynél több vírus is, vagy ez egyszerűen általános növényi fiziológiai válasz is lehet floem-betelepülő vírusok csoportjának az inváziójával szemben. Az utóbbi 15 évben összegyűlt bizonyítékok erősen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a szőlőnövény-levélsodródást egy (vagy egy komplex) hosszú closterovírus okozza

(részecske hossz 1400-2200 nm között).

A szőlőnövény-levélsodródás elsődlegesen fertőzött oltvánnyal és gyökértörzzsel vihető át. Azonban szabadföldi körülmények között a bibortetvek számos fajáról kimutatták, hogy a levélsodródás vektorai [Engelbrecht és mtsai.: Phytophylactica 22 341 (1990); Rosciglione és mtsai.:

Phytoparasitica 17 63 (1989); valamint Tanne:

Phytoparasitica 16 288 (1988)]. A rovarvektorok útján a levélsodródás természetes terjedése a világ különböző részein gyors. Új-Zélandon három szőlőskert megfigyelése azt mutatta, hogy a fertőzött vesszők száma csaknem megduplázódott egyetlen év alatt [Jordan és mtsai.: Spread of Grapevine Leafroll and its Associated Virus in New Zealand Vineyards, 11^th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine, Montreux, Svájc, 113-114. oldalak, (1993)]. Egy szőlőskert 90%-ban fertőzött lett a GLRaV-3 első megfigyelése után 5 évvel. A levélsodródás előfordulása világszerte megnövekedhet, mivel a bibortetvek kémiai úton történő korlátozása nehezebbé válik a hatékony inszekticidek hiánya miatt.

Annak a súlyos kockázatnak a fényében, amit a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus jelent a szőlőskertekben és ennek hatékony kezelési módja hiányában, ezen csapás kivédésének szükségessége továbbra is fennáll. A találmányi gondolat a technika állása szerint fennálló ezen hiány pótlását kívánja szolgálni.

A találmány tárgyát izolált fehérjék és polipeptidek képezik, amelyek megfelelnek szőlőnövény-levélsodródást

okozó vírus (2. típus) fehérjéinek vagy polipeptideinek. A. kódoló RNS- és DNS-molekulák, akár izolált formában vagy expressziós rendszerbe beépítve, gazdasejt, transzgént hordozó Vitis vagy citrus oltvány vagy gyökértörzs termesztési változat, vagy transzgént hordozó Nicotiana növény vagy céklanövény úgyszintén a találmány tárgyát képezi.

Más szempontból a találmány tárgyát képezi egy eljárás szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal (2. típus) szemben mutatott ellenálló képesség átvitelére Vitis oltványba vagy gyökértörzs termesztési változatokba, vagy Nicotiana növényekbe oly módon, hogy a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjének vagy polipeptidnek megfelelő fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS-molekulával a növényt transzformáljuk. A találmány más szempontjai szerint a találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás cékla sárgulást okozó vírussal szemben mutatott ellenálló képesség átvitelére céklanövénybe, és egy eljárás tristeza vírussal szemben mutatott ellenálló képesség átvitelére citrus oltvány vagy gyökértörzs termesztési változatokra, mindkét esetben oly módon, hogy a növényeket vagy termesztési változatokat a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjének vagy polipeptidnek megfelelő fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS molekulával transzformáljuk.

A találmány tárgyát képezi továbbá antitest vagy annak kötő része, vagy olyan próba, amely a fehérjét vagy polipeptidet felismerni képes.

A jelenleg forgalomban levő szőlő termesztési változatok és gyökértörzsek szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus rezisztens transzgént hordozó variánsai lehetővé teszik a vírus fokozottabb mértékű korlátozását, míg megtartják a specifikus termesztési változatok különböző jellemzőit. Továbbá ezek a variánsok lehetővé teszik a GLRaV-2 korlátozását, amelyet akár fertőzött oltványok vagy gyökértörzsek alkalmazásával, akár egy ma még nem jellemzett rovar vektor közvetítésével viszünk át. Az átvitel ez utóbbi módjára vonatkozóan a találmány megkerülő megoldást kínál a peszticidek alkalmazásának növekvő korlátozására, amely korlátozás a rovar fertőzések kémiai szabályozását növekvő mértékben nehezíti. Ezen a módon a találmány alkalmazása a környezetvédelem érdekeit, valamint a szőlőművelés és a borkészítés gazdaságosságát is előre viszi.

Az 1A. és 1B. ábrák a GLRaV-2 kettős-szálú RNS (dsRNS) profil (1A. ábra) és annak Northern-hibridizációs analízisének (1B. ábra) az összehasonlítását mutatják be. Az ÍA. ábrán: az M-sáv a lambda Hindii! DNS—marker; és az 1. sáv: dsRNS mintázat 1%-os agaróz gélben, amit etídium-bromiddal festettünk. Az 1B. ábra a GLRaV-2 izolált nagy molekulatömegű dsRNS Northern-hibridizációját mutatja be olyan próbával, amit ³²P-[α-dATP]-vei jelölt, a GLRaV-2 specifikus TC1 cDNS-klónból előállított cDNS-inszerttel kapunk. Az 1. sáv: GLRaV—2 nagy molekulatömegű dsRNS. 2. sáv: egészséges szőlőnövényből extrahált összes RNS.

A 2. ábra a GLRaV-2 genomi szerveződését és annak szekvenálási stratégiáját mutatja be. A zárt négyszögek olyan ORF-szekvenciákat jelentenek, amelyek a GLRaV-2 következtetett aminosav szekvenciáit kódolják; a számozott vonalak nukleotid koordinátákat jelentenek kilobázisban (kb) megadva, az RNS 5'-terminálisától kezdve. A GLRaV-2 RNS genom alatti vonalak azokat a cDNS—kiónokat jelölik, amelyeket a nukleotid szekvenciák meghatározása során alkalmaztunk.

A 3A-3D. ábrák összehasonlításokat mutatnak be a GLRaV2 ORFla/ORFlb és a BYV között. A 3A-3D. ábrák - sorrendben megfeleltetve - a két papain-szerű proteáz (P-PRO), metiltranszferáz (MT/MTR), helikáz (HEL) és RNS-függő RNS-polimeráz (RdRP) konzervált doménjeit mutatják be. A felkiáltójelek jelölik a vezető papain-szerű proteáz feltételezett katalitikus aminosav maradékait; törtjelek jelölik a feltételezett hasítási helyeket. Az MT, HEL és RdRP domének konzervált részegységeit fölöttük húzott vonalakkal emeljük ki, amelyeket a megfelelő betűkkel jelölünk. Az összevetést a DNASTAR MegAlign program segítségével szerkesztettük.

A 4A. és 4B. ábrák a GLRaV-2, BYV, BYSV és CTV ORFla/ORFlb átfedő régiók nukleotid (4A. ábra) és levezetett aminosav (4B. ábra) szekvenciáinak összevetését mutatják be. Az azonos nukleotidokat és aminosavakat konszenzusban mutatjuk be. A GLRaV-2 vélelmezett +1 leolvasási fázis eltolási helyet (TAGC) és az ennek megfelelő helyeket a BYV (TAGC) és BYSV (TAGC) és CTV (CGGC) szekvenciákban a nukleotid és aminosav szekvenciákon belül aláhúzásokkal emeljük ki.

Az 5. ábra a GLRaV-2 és a BYV HSP7 0 fehérje aminosav szekvenciájának az összevetését mutatja be. A konzervált részegységeket (A és H között) felülvonalazással emeljük ki és a megfelelő betűkkel jelöljük. Az összevetést a DNASTAR

MegAlign programja segítségével végeztük el.

A 6A. ábra a GLRaV-2 burokfehérje (CP) és a burokfehérje duplikátum (CPd) összevetése más closterovirusokkal. A GLRaV-2 CP és CPd aminosav szekvenciákat vetjük össze a BYV, BYSV és CTV CP és CPd szekvenciákkal. A konzervált aminosavakat félkövéren szedtük és jelöljük a konszenzus szekvenciákat. A szekvencia összevetést és a filogenetikus fát a DNASTAR MegAlign programjában a Clustal módszer segítségével szerkesztettük meg.

A 6B. ábra a GLRaV-2 CP és CPd kísérleti filogenetikus fáját mutatja be a következő szekvenciákkal összevetve: BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV és GLRaV-3. Az összevetés elősegítésére az LIYV, LChV és a GLRaV-3 CP és CPd szekvenciákból csak a C-terminális 250 aminosavat vettük. A filogenetikus fa alatti skála a szekvenciák közötti távolságot jelzi. Az egységek a szubsztitúciós események számát jelzik.

A 7. ábra a GLRaV-2, BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV és a GLRaV-3 genomi szerveződésének összehasonlítása. A P-PRO jelöli a papain-szerű proteázt; az MT/MTR jelöli a metiltranszferázt; a HEL jelöli a helikázt; az RdRP jelöli az RNS-függő RNS-polimerázt; a HSP70 jelöli a 70 kDa hősokk fehérjét; CP jelöli a burokfehérjét és CPd jelöli a burokfehérje duplikátumot.

A 8. ábra kísérleti filogenetikus fát mutat be, amely a GLRaV-2 RdRP rokonságát mutatja be a BYV, BYSV, CTV és LIYV szekvenciákkal összevetve. A filogenetikus fát a DNASTAR MegAlign programból a Clustal módszer segítségével szerkesztettük meg.

A 9. ábra a GLRaV-2 HSP90 fehérje aminosav szekvenciájának összevetését mutatja be más closterovirusokkal - mint BYV, BYSV és CTV - szemben. A leginkább konzervált részegységeket (I és II között) a vonalakkal emeljük ki és a megfelelő betűkkel jelöljük.

A 10. ábra összevetést mutat be a GLRaV-2 transzlációra nem kerülő 3'-terminális régiójának nukleotid szekvenciája és a következő closterovirusok között: BYV [Agranovsky és mtsai.: Virology 198 311 (1994); amely publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő]; BYSV [Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996); amely publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő]; és CTV [Karasev és mtsai.: Virology 208 511 (1995); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Bemutatjuk a konszenzus szekvenciákat és jelöljük a 3'-véghez viszonyított távolságot. Aláhúzással jelöltünk egy komplementer régiót, amely képes haj tű-szerű szerkezetet kialakítani.

A HA. és 11B. ábrák - sorrendben megfeleltetve - a pGA482GG/EPT8CP-GLRaV-2 és pGA482G/EPT8CP-GLRaV-2 transzformációs vektorok genetikai térképei. Ahogyan ezt a 11A. és 11B. ábrákon bemutatjuk, a növényi expressziós kazettát (EPT8CP-GLRaV-2) - amely dupla karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S-enhanszert, CaMV 35S-promótert, lucerna mozaik virus (ALMV) RNS4 5'-vezető szekvenciát, GLRaV-2 burokfehérje gént (CP-GLRaV-2) és CaMV 35S 3-végi transzlációra nem kerülő régiót tartalmaz, mint terminátort - a transzformációs vektorba klónoztuk EcoRI restrikciós hely segítségével. A GLRaV-2 CP-t a növényi expressziós vektorba klónoztuk Ncol restrikciós hely segítségével.

A 12. ábra vélelmezett transzgént hordozó növények leveleiből extrahált DNS—molekulák PCR analízisét mutatja be amikor mind a GLRaV-2 CP-génjére és az NPT-II génre specifikus prímeteket alkalmazunk. Egy etídium—bromiddal festett gél az NPT-II génre egy 720 bázispár (bp) nagyságú amplifikált DNS-fragmenst mutat és a CP-gén teljes kódoló szekvenciájára egy 653 bp nagyságú DNS fragmenst mutat. 1. sáv: O174/HaeIII DNS-marker; 2-6. sávok: különböző vonalakból származó transzgént hordozó növények; 7. sáv: a pozitív kontroll GLRaV-2 CP-génje; és 8. sáv: a pozitív kontroll NPT-II génje.

A 13. ábra összehasonlítást mutat be rezisztens (jobb oldali 3 növény) és fogékony (bal oldali 3 növény) transzgént hordozó Nicotiana benthamiana növények között. A növényeket 48 nappal a GLRaV-2-vel történt beoltást követően mutatjuk be.

A 14. ábra transzgént hordozó Nicotiana benthamiana növények Northern-blot analízisét mutatja be. A vélelmezett transzgént hordozó növényekből extrahált teljes RNS 10 μg kisebb részletét denaturáltuk és formaldehidet tartalmazó 1%-os agaróz gélre vittük fel. Az elválasztott RNS-ket Gene Screen Plus membránra átvittük és egy ³²P-jelölt DNS-próbával hibridizáltuk, amely próba a CP-gén szekvencia 3'-végi egyharmadát tartalmazta. Az 1., 3. és 4. sávok RNS expreszszió nélküli nem-transzformált transzgént hordozó növényeknek felelnek meg. A maradék sávok különböző vonalakból származó transzgént hordozó növényeknek felelnek meg: a

2·ζ 14-17. és 22-27. sávok magas RNS expressziós szintet mutató növényeknek felelnek meg, amelyek fogékonyak GLRaV2~re; az összes többi sáv olyan növényeknek felel meg, amelyekben az RNS expressziós szint kimutathatatlan vagy alacsony, és amelyek rezisztensek a GLRaV-2 vírussal szemben.

A találmány tárgyát izolált DNS-molekulák képezik, amelyek egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjéit vagy polipeptidjeit kódolják. A szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) (GLRaV-2) genom jelentős részét már megszekvenálták. A genomon belül nyílt leolvasási fázisok (ORF) sokaságát és egy 3'-végi transzkripcióra nem kerülő régiót (UTR) találunk, amelyek mindegyike a találmány szerinti DNS-molekulákat tartalmazza. A DNSmolekula, amely a GLRaV-2 genom egy jelentős részét képviseli, az 1. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza az alábbiak szerint:

TAAACATTGC GAGAGAACCC CATTAGCGTC TCCGGGGTGA ACTTGGGAAG GTCTGCCGCC	60
GCTCAGGTTA TTTATTTCGG CAGTTTCACG CAGCCCTTCG CGTTGTATCC GCGCCAAGAG	120
AGCGCGATCG TAAAAACGCA ACTTCCACCG GTCAGTGTAG TGAAGGTGGA GTGCGTAGCT	180
GCGGAGGTAG CTCCCGACAG GGGCGTGGTC GACAAGAAAC CTACGTCTGT TGGCGTTCCC	240
CCGCAGCGCG GTGTGCTTTC TTTTCCGACG GTGGTTCGGA ACCGCGGCGA CGTGATAATC	300
ACAGGGGTGG TGCATGAAGC CCTGAAGAAA ATTAAAGACG GGCTCTTACG CTTCCGCGTA	360
GGCGGTGACA TGCGTTTTTC GAGATTTTTC TCATCGAACT ACGGCTGCAG ATTCGTCGCG	420
AGCGTGCGTA CGAACACTAC AGTTTGGCTA AATTGCACGA AAGCGAGTGG TGAGAAATTC	480
TCACTCGCCG CCGCGTGCAC GGCGGATTAC GTGGCGATGC TGCGTTATGT GTGTGGCGGG	540
AAATTTCCAC TCGTCCTCAT GAGTAGAGTT ATTTACCCGG ATGGGCGCTG TTACTTGGCC	600
CATATGAGGT ATTTGTGCGC CTTTTACTGT CGCCCGTTTA GAGAGTCGGA TTATGCCCTC	660
GGAATGTGGC CTACGGTGGC GCGTCTCAGG GCATGCGTTG AGAAGAACTT CGGTGTCGAA	720
GCTTGTGGCA TAGCTCTTCG TGGCTATTAC ACCTCTCGCA ATGTTTATCA CTGTGATTAT	780
GACTCTGCTT ATGTAAAATA TTTTAGAAAC CTTTCCGGCC GCATTGGCGG TGGTTCGTTC	840
GATCCGACAT CTTTAACCTC CGTAATAACG GTGAAGATTA GCGGTCTTCC AGGTGGTCTT	900
CCTAAAAATA TAGCGTTTGG TGCCTTCCTG TGCGATATAC GTTACGTCGA ACCGGTAGAC	960
TCGGGCGGCA TTCAATCGAG CGTTAAGACG AAACGTGAAG ATGCGCACCG AACCGTAGAG	1020
GAACGGGCGG CCGGCGGATC CGTCGAGCAA CCGCGACAAA AGAGGATAGA TGAGAAAGGT	1080
TGCGGCAGAG TTCCTAGTGG AGGTTTTTCG CATCTCCTGG TCGGCAACCT TAACGAAGTT	1140
AGGAGGAAGG TAGCTGCCGG ACTTCTACGC TTTCGCGTTG GCGGTGATAT GGATTTTCAT	1200
CGCTCGTTCT CCACCCAAGC GGGCCACCGC TTGCTGGTGT GGCGCCGCTC GAGCCGGAGC	1260
GTGTGCCTTG AACTTTACTC ACCATCTAAA AACTTTTTGC GTTACGATGT CTTGCCCTGT	1320
TCTGGAGACT ATGCAGCGAT GTTTTCTTTC GCGGCGGGCG GCCGTTTCCC TTTAGTTTTG	1380
ATGACTAGAA TTAGATACCC GAACGGGTTT TGTTACTTGG CTCACTGCCG GTACGCGTGC	1440
GCGTTTCTCT TAAGGGGTTT TGATCCGAAG CGTTTCGACA TCGGTGCTTT CCCCACCGCG	1500
GCCAAGCTCA GAAACCGTAT GGTTTCGGAG CTTGGTGAAA GAAGTTTAGG TTTGAACTTG	1560
TACGGCGCAT ATACGTCACG CGGCGTCTTT CACTGCGATT ATGACGCTAA GTTTATAAAG	1620
GATTTGCGTC TTATGTCAGC AGTTATAGCT GGAAAGGACG GGGTGGAAGA GGTGGTACCT	1680

TCTGACATAA	CTCCTGCCAT	GAAGCAGAAA ACGATCGAAG	CCGTGTATGA	TAGATTATAT	1740
GGCGGCACTG	ACTCGTTGCT	GAAACTGAGC	ATCGAGAAAG	ACTTAATCGA	TTTCAAAAAT	1800
GACGTGCAGA	GTTTGAAGAA	AGATCGGCCG	ATTGTCAAAG	TGCCCTTTTA	CATGTCGGAA	1860
GCAACACAGA	ATTCGCTGAC	GCGTTTCTAC	CCTCAGTTCG	AACTTAAGTT	TTCGCACTCC	1920
TCGCATTCAG	ATCATCCCGC	CGCCGCCGCT	TCTAGACTGC	TGGAAAATGA	AACGTTAGTG	1980
CGCTTATGTG	GTAATAGCGT	TTCAGATATT	GGAGGTTGTC	CTCTTTTCCA	TTTGCATTCC	2040
AAGACGCAAA	GACGGGTTCA	CGTATGTAGG	CCTGTGTTGG	ATGGCAAGGA	TGCGCAGCGT	2100
CGCGTGGTGC	GTGATTTGCA	GTATTCCAAC	GTGCGTTTGG	GAGACGATGA	TAAAATTTTG	2160
GAAGGGCCAC	GCAATATCGA	CATTTGCCAC	TATCCTCTGG	GCGCGTGTGA	CCACGAAAGT	2220
AGTGCTATGA	TGATGGTGCA	GGTGTATGAC	GCGTCCCTTT	ATGAGATATG	TGGCGCCATG	2280

ATCAAGAAGA	AAAGCCGCAT	AACGTACTTA ACCATGGTCA	CGCCCGGCGA	gtttcttgac	2340
GGACGCGAAT	GCGTCTACAT	GGAGTCGTTA GACTGTGAGA	TTGAAGTTGA	TGTGCACGCG	2400
GACGTCGTAA	TGTACAAATT	CGGTAGTTCT TGCTATTCGC	ACAAGCTTTC	AATCATCAAG	2460
GACATCATGA	CCACTCCGTA	CTTGACACTA GGTGGTTTTC	TATTCAGCGT	GGAGATGTAT	2520
GAGGTGCGTA	TGGGCGTGAA	TTACTTCAAG ATTACGAAGT	CCGAAGTATC	GCCTAGCATT	2580
AGCTGCACCA	AGCTCCTGAG	ATACCGAAGA GCTAATAGTG	ACGTGGTTAA	AGTTAAACTT	2640
CCACGTTTCG	ATAAGAAACG	TCGCATGTGT CTGCCTGGGT	ATGACACCAT	ATACCTAGAT	2700
TCGAAGTTTG	TGAGTCGCGT	TTTCGATTAT GTCGTGTGTA	ATTGCTCTGC	CGTGAACTCA	2760
AAAACTTTCG	AGTGGGTGTG	GAGTTTCATT AAGTCTAGTA	AGTCGAGGGT	GATTATTAGC	2820
GGTAAAATAA	TTCACAAGGA	TGTGAATTTG GACCTCAAGT	ACGTCGAGAG	TTTCGCCGCG	2880
GTTATGTTGG	CCTCTGGCGT	GCGCAGTAGA CTAGCGTCCG	AGTACCTTGC	TAAGAACCTT	2940
AGTCATTTTT	CGGGAGATTG	CTCCTTTATT GAAGCCACGT	CTTTCGTGTT	GCGTGAGAAA	3000
ATCAGAAACA	TGACTCTGAA	TTTTAACGAA AGACTTTTAC	AGTTAGTGAA	GCGCGTTGCC	3060
TTTGCGACCT	TGGACGTGAG	TTTTCTAGAT TTAGATTCAA	CTCTTGAATC	AATAACTGAT	3120
TTTGCCGAGT	GTAAGGTAGC	GATTGAACTC GACGAGTTGG	GTTGCTTGAG	AGCGGAGGCC	3180
GAGAATGAAA	AAATCAGGAA	TCTGGCGGGA GATTCGATTG	CGGCTAAACT	CGCGAGCGAG	3240
ATAGTGGTCG	ATATTGACTC	TAAGCCTTCA CCGAAGCAGG	TGGGTAATTC	GTCATCCGAA	3300
AACGCCGATA	AGCGGGAAGT	TCAGAGGCCC GGTTTGCGTG	GTGGTTCTAG	AAACGGGGTT	3360
GTTGGGGAGT	TCCTTCACTT	CGTCGTGGAT TCTGCCTTGC	GTCTTTTCAA	ATACGCGACG	3420
GATCAACAAC	GGATCAAGTC	TTACGTGCGT TTCTTGGACT	CGGCGGTCTC	ATTCTTGGAT	3480
TACAACTACG	ATAATCTATC	GTTTATACTG CGAGTGCTTT	CGGAAGGTTA	TTCGTGTATG	3540

TTCGCGTTTT TGGCGAATCG CGGCGACTTA TCTAGTCGTG TCCGTAGCGC GGTGTGTGCT	3600
GTGAAAGAAG TTGCTACCTC ATGCGCGAAC GCGAGCGTTT CTAAAGCCAA GGTTATGATT	3660
ACCTTCGCAG CGGCCGTGTG TGCTATGATG TTTAATAGCT GCGGTTTTTC AGGCGACGGT	3720
CGGGAGTATA AATCGTATAT ACATCGTTAC ACGCAAGTAT TGTTTGACAC TATCTTTTTT	3780
GAGGACAGCA GTTACCTACC CATAGAAGTT CTGAGTTCGG CGATATGCGG TGCTATCGTC	3840
ACACTTTTCT CCTCGGGCTC GTCCATAAGT TTAAACGCCT TCTTACTTCA AATTACCAAA	3900
GGATTCTCCC TAGAGGTTGT CGTCCGGAAT GTTGTGCGAG TCACGCATGG TTTGAGCACC	3960
ACAGCGACCG ACGGCGTCAT ACGTGGGGTT TTCTCCCAAA TTGTGTCTCA CTTACTTGTT	4020
GGAAATACGG GTAATGTGGC TTACCAGTCA GCTTTCATTG CCGGGGTGGT GCCTCTTTTA	4080
GTTAAAAAGT GTGTGAGCTT AATCTTCATC TTGCGTGAAG ATACTTATTC CGGTTTTATT	4140
AAGCACGGAA TCAGTGAATT CTCTTTCCTT AGTAGTATTC TGAAGTTCTT GAAGGGTAAG	4200
CTTGTGGACG AGTTGAAATC GATTATTCAA GGGGTTTTTG ATTCCAACAA GCACGTGTTT	4260
AAAGAAGCTA CTCAGGAAGC GATTCGTACG ACGGTCATGC AAGTGCCTGT CGCTGTAGTG	4320
GATGCCCTTA AGAGCGCCGC GGGAAAAATT TATAACAATT TTACTAGTCG ACGTACCTTT	4380
GGTAAGGATG AAGGCTCCTC TAGCGACGGC GCATGTGAAG AGTATTTCTC ATGCGACGAA	4440
GGTGAAGGTC CGGGTCTGAA AGGGGGTTCC AGCTATGGCT TCTCAATTTT AGCGTTCTTT	4500
TCACGCATTA TGTGGGGAGC TCGTCGGCTT ATTGTTAAGG TGAAGCATGA GTGTTTTGGG	4560
AAACTTTTTG AATTTCTATC GCTCAAGCTT CACGAATTCA GGACTCGCGT TTTTGGGAAG	4620
AATAGAACGG ACGTGGGAGT TTACGATTTT TTGCCCACGG GCATCGTGGA AACGCTCTCA	4680
TCGATAGAAG AGTGCGACCA AATTGAAGAA CTTCTCGGCG ACGACCTGAA AGGTGACAAG	4740
GATGCTTCGT TGACCGATAT GAATTACTTT GAGTTCTCAG AAGACTTCTT AGCCTCTATC	4800
GAGGAGCCGC CTTTCGCTGG ATTGCGAGGA GGTAGCAAGA ACATCGCGAT TTTGGCGATT	4860
TTGGAATACG CGCATAATTT GTTTCGCATT GTCGCAAGCA AGTGTTCGAA ACGACCTTTA	4920
TTTCTTGCTT TCGCCGAACT CTCAAGCGCC CTTATCGAGA AATTTAAGGA GGTTTTCCCT	4980
CGTAAGAGCC AGCTCGTCGC TATCGTGCGC GAGTATACTC AGAGATTCCT CCGAAGTCGC	5040
ATGCGTGCGT TGGGTTTGAA TAACGAGTTC GTGGTAAAAT CTTTCGCCGA TTTGCTACCC	5100
GCATTAATGA AGCGGAAGGT TTCAGGTTCG TTCTTAGCTA GTGTTTATCG CCCACTTAGA	5160
GGTTTCTCAT ATATGTGTGT TTCAGCGGAG CGACGTGAAA AGTTTTTTGC TCTCGTGTGT	5220
TTAATCGGGT TAAGTCTCCC TTTCTTCGTG CGCATCGTAG GAGCGAAAGC GTGCGAAGAA	5280
CTCGTGTCCT CAGCGCGTCG CTTTTATGAG CGTATTAAAA TTTTTCTAAG GCAGAAGTAT	5340

• » · · *·* «·· ·*« ··· ·* · ·

GTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTGTCACTTG TTTAGCTCTG ACGTTGATGA CAGTTCCGCA	5400
TCTGCAGGGT TGAAAGGTGG TGCGTCGCGA ATGACGCTCT TCCACCTTCT GGTTCGCCTT	5460
GCTAGTGCCC TCCTATCGTT AGGGTGGGAA GGGTTAAAGC TACTCTTATC GCACCACAAC	552 0
TTGTTATTTT TGTGTTTTGC ATTGGTTGAC GATGTGAACG TCCTTATCAA AGTTCTTGGG	5580
GGTCTTTCTT TCTTTGTGCA ACCAATCTTT TCCTTGTTTG CGGCGATGCT TCTACAACCG	564 0
GACAGGTTTG TGGAGTATTC CGAGAAACTT GTTACAGCGT TTGAATTTTT CTTAAAATGT	5700
TCGCCTCGCG CGCCTGCACT ACTCAAAGGG TTTTTTGAGT GCGTGGCGAA CAGCACTGTG	5760
TCAAAAACCG TTCGAAGACT TCTTCGCTGT TTCGTGAAGA TGCTCAAACT TCGAAAAGGG	5820
CGAGGGTTGC GTGCGGATGG TAGGGGTCTC CATCGGCAGA AAGCCGTACC CGTCATACCT TCTAATCGGG TCGTGACCGA CGGGGTTGAA AGACTTTCGG TAAAGATGCA AGGAGTTGAA	5880 5940
GCGTTGCGTA CCGAATTGAG AATCTTAGAA GATTTAGATT CTGCCGTGAT CGAAAAACTC	6000
AATAGACGCA GAAATCGTGA CACTAATGAC GACGAATTTA CGCGCCCTGC TCATGAGCAG	6060
ATGCAAGAAG TCACCACTTT CTGTTCGAAA GCCAACTCTG CTGGTTTGGC CCTGGAAAGG	6120
GCAGTGCTTG TGGAAGACGC TATAAAGTCG GAGAAACTTT CTAAGACGGT TAATGAGATG	6180
GTGAGGAAAG GGAGTACCAC CAGCGAAGAA GTGGCCGTCG CTTTGTCGGA CGATGAAGCC	6240
GTGGAAGAAA TCTCTGTTGC TGACGAGCGA GACGATTCGC CTAAGACAGT CAGGATAAGC	6300
GAATACCTAA ATAGGTTAAA CTCAAGCTTC GAATTCCCGA AGCCTATTGT TGTGGACGAC	6360
AACAAGGATA CCGGGGGTCT AACGAACGCC GTGAGGGAGT TTTATTATAT GCAAGAACTT	6420
GCTCTTTTCG AAATCCACAG CAAACTGTGC ACCTACTACG ATCAACTGCG CATAGTCAAC	6480
TTCGATCGTT CCGTAGCACC ATGCAGCGAA GATGCTCAGC TGTACGTACG GAAGAACGGC	654 0
TCAACGATAG TGCAGGGTAA AGAGGTACGT TTGCACATTA AGGATTTCCA CGATCACGAT	6600
TTCCTGTTTG ACGGAAAAAT TTCTATTAAC AAGCGGCGGC GAGGCGGAAA TGTTTTATAT	6660
CACGACAACC TCGCGTTCTT GGCGAGTAAT TTGTTCTTAG CCGGCTACCC CTTTTCAAGG	6720
AGCTTCGTCT TCACGAATTC GTCGGTCGAT ATTCTCCTCT ACGAAGCTCC ACCCGGAGGT	6780
GGTAAGACGA CGACGCTGAT TGACTCGTTC TTGAAGGTCT TCAAGAAAGG TGAGGTTTCC	6840
ACCATGATCT TAACCGCCAA CAAAAGTTCG CAGGTTGAGA TCCTAAAGAA AGTGGAGAAG	6900
GAAGTGTCTA ACATTGAATG CCAGAAACGT AAAGACAAAA GATCTCCGAA AAAGAGCATT	6960
TACACCATCG ACGCTTATTT AATGCATCAC CGTGGTTGTG ATGCAGACGT TCTTTTCATC	7020
GATGAGTGTT TCATGGTTCA TGCGGGTAGC GTACTAGCTT GCATTGAGTT CACGAGGTGT	7080
CATAAAGTAA TGATCTTCGG GGATAGCCGG CAGATTCACT ACATTGAAAG GAACGAATTG	7140
GACAAGTGTT TGTATGGGGA TCTCGACAGG TTCGTGGACC TGCAGTGTCG GGTTTATGGT	7200

AATATTTCGT ACCGTTGTCC ATGGGATGTG TGCGCTTGGT TAAGCACAGT GTATGGCAAC7260

CTAATCGCCA CCGTGAAGGG TGAAAGCGAA GGTAAGAGCA GCATGCGCAT TAACGAAATT7320

AATTCAGTCG ACGATTTAGT CCCCGACGTG GGTTCCACGT TTCTGTGTAT GCTTCAGTCG7380

GAGAAGTTGG AAATCAGCAA GCACTTTATT CGCAAGGGTT TGACTAAACT TAACGTTCTA7440

ACGGTGCATG AGGCGCAAGG TGAGACGTAT GCGCGTGTGA ACCTTGTGCG ACTTAAGTTT7500

CAGGAGGATG AACCCTTTAA ATCTATCAGG CACATAACCG TCGCTCTTTC TCGTCACACC7560

GACAGCTTAA CTTATAACGT CTTAGCTGCT CGTCGAGGTG ACGCCACTTG CGATGCCATC7620

CAGAAGGCTG CGGAATTGGT GAACAAGTTT CGCGTTTTTC CTACATCTTT TGGTGGTAGT7680

GTTATCAATC TCAACGTGAA GAAGGACGTG GAAGATAACA GTAGGTGCAA GGCTTCGTCG7740

GCACCATTGA GCGTAATCAA CGACTTTTTG AACGAAGTTA ATCCCGGTAC TGCGGTGATT7800

GATTTTGGTG ATTTGTCCGC GGACTTCAGT ACTGGGCCTT TTGAGTGCGG TGCCAGCGGT7860

ATTGTGGTGC GGGACAACAT CTCCTCCAGC AACATCACTG ATCACGATAA GCAGCGTGTT7920

TAGCGTAGTT CGGTCGCAGG CGATTCCGCG TAGAAAACCT TCTCTACAAG AAAATTTGTA7980

TTCGTTTGAA GCGCGGAATT ATAACTTCTC GACTTGCGAC CGTAACACAT CTGCTTCAAT8040

GTTCGGAGAG GCTATGGCGA TGAACTGTCT TCGTCGTTGC TTCGACCTAG ATGCCTTTTC8100

GTCCCTGCGT GATGATGTGA TTAGTATCAC ACGTTCAGGC ATCGAACAAT GGCTGGAGAA8160

ACGTACTCCT AGTCAGATTA AAGCATTAAT GAAGGATGTT GAATCGCCTT TGGAAATTGA8220

CGATGAAATT TGTCGTTTTA AGTTGATGGT GAAGCGTGAC GCTAAGGTGA AGTTAGACTC8280

TTCTTGTTTA ACTAAACACA GCGCCGCTCA AAATATCATG TTTCATCGCA AGAGCATTAA8340

TGCTATCTTC TCTCCTATCT TTAATGAGGT GAAAAACCGA ATAATGTGCT GTCTTAAGCC8400

TAACATAAAG TTTTTTACGG AGATGACTAA CAGGGATTTT GCTTCTGTTG TCAGCAACAT8460

GCTTGGTGAC GACGATGTGT ACCATATAGG TGAAGTTGAT TTCTCAAAGT ACGACAAGTC8520

TCAAGATGCT TTCGTGAAGG CTTTTGAAGA AGTAATGTAT AAGGAACTCG GTGTTGATGA8580

AGAGTTGCTG GCTATCTGGA TGTGCGGCGA GCGGTTATCG ATAGCTAACA CTCTCGATGG8640

TCAGTTGTCC TTCACGATCG AGAATCAAAG GAAGTCGGGA GCTTCGAACA CTTGGATTGG8700

TAACTCTCTC GTCACTTTGG GTATTTTAAG TCTTTACTAC GACGTTAGAA ATTTCGAGGC8760

GTTGTACATC TCGGGCGATG ATTCTTTAAT TTTTTCTCGC AGCGAGATTT CGAATTATGC8820

CGACGACATA TGCACTGACA TGGGTTTTGA GACAAAATTT ATGTCCCCAA GTGTCCCGTA8880

CTTTTGTTCT AAATTTGTTG TTATGTGTGG TCATAAGACG TTTTTTGTTC CCGACCCGTA8940

CAAGCTTTTT GTCAAGTTGG GAGCAGTCAA AGAGGATGTT TCAATGGATT TCCTTTTCGA9000

GACTTTTACC	TCCTTTAAAG	ACTTAACCTC	CGATTTTAAC	GACGAGCGCT	TAATTCAAAA
GCTCGCTGAA	CTTGTGGCTT	TAAAATATGA	GGTTCAAACC	GGCAACACCA	CCTTGGCGTT
AAGTGTGATA	CATTGTTTGC	GTTCGAATTT	CCTCTCGTTT	AGCAAGTTAT	ATCCTCGCGT
GAAGGGATGG	CAGGTTTTTT	ACACGTCGGT	TAAGAAAGCG	CTTCTCAAGA	GTGGGTGTTC
TCTCTTCGAC	AGTTTCATGA	CCCCTTTTGG	TCAGGCTGTC	ATGGTTTGGG	ATGATGAGTA
GCGCTAACTT	GTGCGCAGTT	TCTTTGTTCG	TGACATACAC	CTTGTGTGTC	ACCGTGCGTT
TATAATGAAT	CAGGTTTTGC	AGTTTGAATG	TTTGTTTCTG	CTGAATCTCG	CGGTTTTTGC
TGTGACTTTC	ATTTTCATTC	TTCTGGTCTT	CCGCGTGATT	AAGTCTTTTC	GCCAGAAGGG
TCACGAAGCA	CCTGTTCCCG	TTGTTCGTGG	CGGGGGTTTT	TCAACCGTAG	TGTAGTCAAA
AGACGCGCAT	ATGGTAGTTT	TCGGTTTGGA	CTTTGGCACC	ACATTCTCTA	CGGTGTGTGT
GTACAAGGAT	GGACGAGTTT	TTTCATTCAA	GCAGAATAAT	TCGGCGTACA	TCCCCACTTA
CCTCTATCTC	TTCTCCGATT	CTAACCACAT	GACTTTTGGT	TACGAGGCCG	AATCACTGAT
GAGTAATCTG	AAAGTTAAAG	GTTCGTTTTA	TAGAGATTTA	AAACGTTGGG	TGGGTTGCGA
TTCGAGTAAC	CTCGACGCGT .	ACCTTGACCG	TTTAAAACCT	CATTACTCGG	TCCGCTTGGT

TAAGATCGGC TCTGGCTTGA ACGAAACTGT TTCAATTGGA AACTTCGGGG GCACTGTTAA GTCTGAGGCT CATCTGCCAG GGTTGATAGC TCTCTTTATT AAGGCTGTCA TTAGTTGCGC GGAGGGCGCG TTTGCGTGCA CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA TAGCGTTCAA AGGAATTTCA CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA TATGATCAAT GAACCTTCAG CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC CGCAAATTTG GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA CCGCAACAAT ACTTTTGTTG TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA TGTTGATCGT GCGTTTCTCA CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC TTTGGATATC TCGAATCTGA AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC TTTGAGAGGT GTCGATGGAA GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC GGTGATGCTC CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA TGCTAAGAGT ATGAATGAGA GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC TTCATATCTT CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG ATCGTATCTT

AAGAGTTTCG GATCCTCGGG CTGCCGTGGC

CTCAGGATCT GGGGGGTTGC TACTGATCGA

CAGAAGTTGT CATCAAATCA TTTGCGCTCC

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

94B0

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10080

10140

10200

10260

10320

10380

10440

10500

10560

10620

10680

10740 loeoo

CGTCGGTTGC GCATTATATT CTTCATGCCT

CTGTGCAGCT CACACTGTCG CTATAGCGGA

AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAGGAAG

CATGCCTTTG TACTTAGCCA GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG CCGTGTTTGA 10860

AGGGGAGTAC GTTAAGTGCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTT10920

TGATATAGGA GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT10980

TTCAAGCGTA GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC AAGTGTCACT11040

CACTGGAACT CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA11100

ATTGCATATT AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA GAAAGGCGGA11160

TCGACGAATA CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGATTCAA TTGATATCGC11220

GGATGTGCTA AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCAGTGCC TTACCACCAG ACGAGGATGT11280

CGAATTACTC CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC TGGAAGAAAT11340

ACCTCTCTAG GAGCATAGCA GCACACTCAA GTGAAATTAA AACTCTACCA GACATTCGAT11400

TGTACGGCGG TAGGGTTGTA AAGAAGTCCG AATTCGAATC AGCACTTCCT AATTCTTTTG11460

AACAGGAATT AGGACTGTTC ATACTGAGCG AACGGGAAGT GGGATGGAGC AAATTATGCG11520

GAATAACGGT GGAAGAAGCA GCATACGATC TTACGAATCC CAAGGCTTAT AAATTCACTG11580

CCGAGACATG TAGCCCGGAT GTAAAAGGTG AAGGACAAAA ATACTCTATG GAAGACGTGA 1164 0

TGAATTTCAT GCGTTTATCA AATCTGGATG TTAACGACAA GATGCTGACG GAACAGTGTT11700

GGTCGCTGTC CAATTCATGC GGTGAATTGA TCAACCCAGA CGACAAAGGG CGATTCGTGG11760

CTCTCACCTT TAAGGACAGA GACACAGCTG ATGACACGGG TGCCGCCAAC GTGGAATGTC11820

GCGTGGGCGA CTATCTAGTT TACGCTATGT CCCTGTTTGA GCAGAGGACC CAAAAATCGC11880

AGTCTGGCAA CATCTCTCTG TACGAAAAGT ACTGTGAATA CATCAGGACC TACTTAGGGA11940

GTACAGACCT GTTCTTCACA GCGCCGGACA GGATTCCGTT ACTTACGGGC ATCCTATACG12000

ATTTTTGTAA GGAATACAAC GTTTTCTACT CGTCATATAA GAGAAACGTC GATAATTTCA12060

GATTCTTCTT GGCGAATTAT ATGCCTTTGA TATCTGACGT CTTTGTCTTC CAGTGGGTAA12120

AACCCGCGCC GGATGTTCGG CTGCTTTTTG AGTTAAGTGC AGCGGAACTA ACGCTGGAGG12180

TTCCCACACT GAGTTTGATA GATTCTCAAG TTGTGGTAGG TCATATCTTA AGATACGTAG12240

AATCCTACAC ATCAGATCCA GCCATCGACG CGTTAGAAGA CAAACTGGAA GCGATACTGA12300

AAAGTAGCAA TCCCCGTCTA TCGACAGCGC AACTATGGGT TGGTTTCTTT TGTTACTATG12360

GTGAGTTTCG TACGGCTCAA AGTAGAGTAG TGCAAAGACC AGGCGTATAC AAAACACCTG12420

ACTCAGTGGG TGGATTTGAA ATAAACATGA AAGATGTTGA GAAATTCTTC GATAAACTTC12480

AGAGAGAATT GCCTAATGTA TCTTTGCGGC GTCAGTTTAA CGGAGCTAGA GCGCATGAGG12540

CTTTCAAAAT ATTTAAAAAC GGAAATATAA GTTTCAGACC TATATCGCGT TTAAACGTGC12600

CTAGAGAGTT CTGGTATCTG AACATAGACT ACTTCAGGCA CGCGAATAGG TCCGGGTTAA12660

- 26 - : ; ···, .·

-*· »*· ·** H »

CCGAAGAAGA AATACTCATC CTAAACAACA TAAGCGTTGA TGTTAGGAAG TTATGCGCTG12720

AGAGAGCGTG CAATACCCTA CCTAGCGCGA AGCGCTTTAG TAAAAATCAT AAGAGTAATA12780

TACAATCATC ACGCCAAGAG CGGAGGATTA AAGACCCATT GGTAGTCCTG AAAGACACTT12840

TATATGAGTT CCAACACAAG CGTGCCGGTT GGGGGTCTCG AAGCACTCGA GACCTCGGGA12900

GTCGTGCTGA CCACGCGAAA GGAAGCGGTT GATAAGTTTT TTAATGAACT AAAAAACGAA12960

AATTACTCAT CAGTTGACAG CAGCCGATTA AGCGATTCGG AAGTAAAAGA AGTGTTAGAG13020

AAAAGTAAAG AAAGTTTCAA AAGCGAACTG GCCTCCACTG ACGAGCACTT CGTCTACCAC13080

ATTATATTTT TCTTAATCCG ATGTGCTAAG ATATCGACAA GTGAAAAGGT GAAGTACGTT13140

GGTAGTCATA CGTACGTGGT CGACGGAAAA ACGTACACCG TTCTTGACGC TTGGGTATTC13200

AACATGATGA AAAGTCTCAC GAAGAAGTAC AAACGAGTGA ATGGTCTGCG TGCGTTCTGT13260

TGCGCGTGCG AAGATCTATA TCTAACCGTC GCACCAATAA TGTCAGAACG CTTTAAGACT13320

AAAGCCGTAG GGATGAAAGG TTTGCCTGTT GGAAAGGAAT ACTTAGGCGC CGACTTTCTT13380

TCGGGAACTA GCAAACTGAT GAGCGATCAC GACAGGGCGG TCTCCATCGT TGCAGCGAAA13440

AACGCTGTCG ATCGTAGCGC TTTCACGGGT GGGGAGAGAA AGATAGTTAG TTTGTATGAT13500

CTAGGGAGGT ACTAAGCACG GTGTGCTATA GTGCGTGCTA ΤΑΑΤΆΑΤΑΑΑ CACTAGTGCT13560

TAAGTCGCGC AGAAGAAAAC GCTATGGAGT TGATGTCCGA CAGCAACCTT AGCAACCTGG13620

TGATAACCGA CGCCTCTAGT CTAAATGGTG TCGACAAGAA GCTTTTATCT GCTGAAGTTG13680

AAAAAATGTT GGTGCAGAAA GGGGCTCCTA ACGAGGGTAT AGAAGTGGTG TTCGGTCTAC13740

TCCTTTACGC ACTCGCGGCA AGAACCACGT CTCCTAAGGT TCAGCGCGCA GATTCAGACG13800

TTATATTTTC AAATAGTTTC GGAGAGAGGA ATGTGGTAGT AACAGAGGGT GACCTTAAGA13860

AGGTACTCGA CGGGTGTGCG CCTCTCACTA GGTTCACTAA TAAACTTAGA ACGTTCGGTC13920

GTACTTTCAC TGAGGCTTAC GTTGACTTTT GTATCGCGTA TAAGCACAAA TTACCCCAAC13980

TCAACGCCGC GGCGGAATTG GGGATTCCAG CTGAAGATTC GTACTTAGCT GCAGATTTTC14040

TGGGTACTTG CCCGAAGCTC TCTGAATTAC AGCAAAGTAG GAAGATGTTC GCGAGTATGT14100

ACGCTCTAAA AACTGAAGGT GGAGTGGTAA ATACACCAGT GAGCAATCTG CGTCAGCTAG14160

GTAGAAGGGA AGTTATGTAA TGGAAGATTA CGAAGAAAAA TCCGAATCGC TCATACTGCT14220

ACGCACGAAT CTGAACACTA TGCTTTTAGT GGTCAAGTCC GATGCTAGTG TAGAGCTGCC14280

TAAACTACTA ATTTGCGGTT ACTTACGAGT GTCAGGACGT GGGGAGGTGA CGTGTTGCAA 14 34 0

CCGTGAGGAA TTAACAAGAG ATTTTGAGGG CAATCATCAT ACGGTGATCC GTTCTAGAAT 14 4 00

CATACAATAT GACAGCGAGT CTGCTTTTGA GGAATTCAAC AACTCTGATT GCGTAGTGAA 14 4 60

GTTTTTCCTA GAGACTGGTA GTGTCTTTTG GTTTTTCCTT CGAAGTGAAA CCAAAGGTAG 14 520

AGCGGTGCGA CATTTGCGCA	CCTTCTTCGA AGCTAACAAT TTCTTCTTTG GATCGCATTG	14580
CGGTACCATG GAGTATTGTT	TGAAGCAGGT ACTAACTGAA ACTGAATCTA TAATCGATTC	14640
TTTTTGCGAA GAAAGAAATC	GTTAAGATGA GGGTTATAGT GTCTCCTTAT GAAGCTGAAG	14700
ACATTCTGAA AAGATCGACT	GACATGTTAC GAAACATAGA CAGTGGGGTC TTGAGCACTA	14760
AAGAATGTAT CAAGGCATTC	TCGACGATAA CGCGAGACCT ACATTGTGCG AAGGCTTCCT	14820
ACCAGTGGGG TGTTGACACT	GGGTTATATC AGCGTAATTG CGCTGAAAAA CGTTTAATTG	14880
ACACGGTGGA GTCAAACATA	CGGTTGGCTC AACCTCTCGT GCGTGAAAAA GTGGCGGTTC	14940
ATTTTTGTAA GGATGAACCA	AAAGAGCTAG TAGCATTCAT CACGCGAAAG TACGTGGAAC	15000
TCACGGGCGT GGGAGTGAGA	GAAGCGGTGA AGAGGGAAAT GCGCTCTCTT ACCAAAACAG	15060
TTTTAAATAA AATGTCTTTG	GAAATGGCGT TTTACATGTC ACCACGAGCG TGGAAAAACG	15120
CTGAATGGTT AGAACTAAAA	TTTTCACCTG TGAAAATCTT TAGAGATCTG CTATTAGACG	15180
TGGAAACGCT CAACGAATTG	TGCGCCGAAG ATGATGTTCA CGTCGACAAA GTAAATGAGA	15240
ATGGGGACGA AAATCACGAC	CTCGAACTCC AAGACGAATG TTAAACATTG GTTAAGTTTA	15300
ACGAAAATGA TTAGTAAATA	ATAAATCGAA CGTGGGTGTA TCTACCTGAC GTATCAACTT	15360
AAGCTGTTAC TGAGTAATTA	AACCAACAAG TGTTGGTGTA ATGTGTATGT TGATGTAGAG	15420
AAAAATCCGT TTGTAGAACG	GTGTTTTTCT CTTCTTTATT TTTAAAAAAA AAATAAAAAA	15480
AAAAAAAAAA AAGCGGCCGC		15500

A találmány tárgyát képező másik DNS-molekula (GLRaV-2 ORFla) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 4-7923. nukleotidjait és feltételezhetően egy nagyméretű szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus poliproteint kódol, amely két papain-szerű proteáz, egy metü-transzferáz és egy helikáz jellemző konzervált doménjeit tartalmazza. Ez a DNS-molekula a 2. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ACATTGCGAG AGAACCCCAT TAGCGTCTCC caggttattt atttcggcag tttcacgcag gcgatcgtaa aaacgcaact tccaccggtc gaggtagctc ccgacagggg cgtggtcgac cagcgcggtg tgctttcttt tccgacggtg ggggtgaact tgggaaggtc tgccgccgct CCCTTCGCGT TGTATCCGCG CCAAGAGAGC agtgtagtga AGGTGGAGTG cgtagctgcg aagaaaccta cgtctgttgg cgttcccccg gttcggaacc gcggcgacgt gataatcaca

120

180

240

300

GGGGTGGTGC	ATGAAGCCCT	GAAGAAAATT	AAAGACGGGC	TCTTACGCTT CCGCGTAGGC	360
GGTGACATGC	GTTTTTCGAG	ATTTTTCTCA	TCGAACTACG	GCTGCAGATT CGTCGCGAGC	420
GTGCGTACGA	ACACTACAGT	TTGGCTAAAT	TGCACGAAAG	CGAGTGGTGA GAAATTCTCA	480
CTCGCCGCCG	CGTGCACGGC	GGATTACGTG	GCGATGCTGC	GTTATGTGTG	TGGCGGGAAA	540
TTTCCACTCG	TCCTCATGAG	TAGAGTTATT	TACCCGGATG	GGCGCTGTTA	CTTGGCCCAT	600
ATGAGGTATT	TGTGCGCCTT	TTACTGTCGC	CCGTTTAGAG	AGTCGGATTA	TGCCCTCGGA	660
ATGTGGCCTA	CGGTGGCGCG	TCTCAGGGCA	TGCGTTGAGA	AGAACTTCGG	TGTCGAAGCT	720
TGTGGCATAG	CTCTTCGTGG	CTATTACACC	TCTCGCAATG	TTTATCACTG	TGATTATGAC	780
TCTGCTTATG	TAAAATATTT	TAGAAACCTT	TCCGGCCGCA	TTGGCGGTGG	TTCGTTCGAT	840
CCGACATCTT	TAACCTCCGT	AATAACGGTG	AAGATTAGCG	GTCTTCCAGG	TGGTCTTCCT	900
AAAAATATAG	CGTTTGGTGC	CTTCCTGTGC	GATATACGTT	ACGTCGAACC	GGTAGACTCG	960
GGCGGCATTC	AATCGAGCGT	TAAGACGAAA	CGTGAAGATG	CGCACCGAAC	CGTAGAGGAA	1020
CGGGCGGCCG	GCGGATCCGT	CGAGCAACCG	CGACAAAAGA	GGATAGATGA	GAAAGGTTGC	1080

GGCAGAGTTC	CTAGTGGAGG	TTTTTCGCAT	CTCCTGGTCG	GCAACCTTAA	cgaagttagg	1140
AGGAAGGTAG	CTGCCGGACT	TCTACGCTTT	CGCGTTGGCG	GTGATATGGA	TTTTCATCGC	1200
TCGTTCTCCA	CCCAAGCGGG	CCACCGCTTG	CTGGTGTGGC	GCCGCTCGAG	CCGGAGCGTG	1260
TGCCTTGAAC	TTTACTCACC	ATCTAAAAAC	TTTTTGCGTT	ACGATGTCTT	GCCCTGTTCT	1320
GGAGACTATG	CAGCGATGTT	TTCTTTCGCG	GCGGGCGGCC	GTTTCCCTTT	AGTTTTGATG	1380
ACTAGAATTA	GATACCCGAA	CGGGTTTTGT	TACTTGGCTC	ACTGCCGGTA	CGCGTGCGCG	1440
TTTCTCTTAA	GGGGTTTTGA	TCCGAAGCGT	TTCGACATCG	GTGCTTTCCC	CACCGCGGCC	1500
AAGCTCAGAA	ACCGTATGGT	TTCGGAGCTT	GGTGAAAGAA	GTTTAGGTTT	GAACTTGTAC	1560
GGCGCATATA	CGTCACGCGG	CGTCTTTCAC	TGCGATTATG	acgctaagtt	TATAAAGGAT	1620
TTGCGTCTTA	TGTCAGCAGT	TATAGCTGGA	AAGGACGGGG	TGGAAGAGGT	GGTACCTTCT	1680
GACATAACTC	CTGCCATGAA	GCAGAAAACG	ATCGAAGCCG	TGTATGATAG	ATTATATGGC	1740
GGCACTGACT	CGTTGCTGAA	ACTGAGCATC	GAGAAAGACT	TAATCGATTT	CAAAAATGAC	1800
GTGCAGAGTT	TGAAGAAAGA	TCGGCCGATT	GTCAAAGTGC	CCTTTTACAT	GTCGGAAGCA	1860
ACACAGAATT	CGCTGACGCG	TTTCTACCCT	CAGTTCGAAC	TTAAGTTTTC	GCACTCCTCG	1920
CATTCAGATC	ATCCCGCCGC	CGCCGCTTCT	AGACTGCTGG	AAAATGAAAC	GTTAGTGCGC	1980
TTATGTGGTA	ATAGCGTTTC	AGATATTGGA	GGTTGTCCTC	TTTTCCATTT	GCATTCCAAG	2040
ACGCAAAGAC	GGGTTCACGT	ATGTAGGCCT	GTGTTGGATG	GCAAGGATGC	GCAGCGTCGC	2100
GTGGTGCGTG	ATTTGCAGTA	TTCCAACGTG	CGTTTGGGAG	ACGATGATAA	AATTTTGGAA	2160
GGGCCACGCA	ATATCGACAT	TTGCCACTAT	CCTCTGGGCG	CGT.GTGACCA	CGAAAGTAGT	2220
GCTATGATGA	TGGTGCAGGT	GTATGACGCG	TCCCTTTATG	AGATATGTGG	CGCCATGATC	2280

aagaagaaaa gccgcataac gtacttaacc atggtcacgc ccggcgagtt TCTTGACGGA CGCGAATGCG TCTACATGGA GTCGTTAGAC TGTGAGATTG AAGTTGATGT GCACGCGGAC GTCGTAATGT ACAAATTCGG TAGTTCTTGC TATTCGCACA AGCTTTCAAT CATCAAGGAC ATCATGACCA CTCCGTACTT GACACTAGGT GGTTTTCTAT TCAGCGTGGA GATGTATGAG GTGCGTATGG GCGTGAATTA CTTCAAGATT ACGAAGTCCG AAGTATCGCC TAGCATTAGC ‘ TGCACCAAGC TCCTGAGATA CCGAAGAGCT AATAGTGACG TGGTTAAAGT TAAACTTCCA CGTTTCGATA AGAAACGTCG CATGTGTCTG CCTGGGTATG ACACCATATA CCTAGATTCG AAGTTTGTGA GTCGCGTTTT CGATTATGTC GTGTGTAATT GCTCTGCCGT GAACTCAAAA ACTTTCGAGT GGGTGTGGAG TTTCATTAAG TCTAGTAAGT CGAGGGTGAT TATTAGCGGT AAAATAATTC ACAAGGATGT GAATTTGGAC CTCAAGTACG TCGAGAGTTT CGCCGCGGTT ATGTTGGCCT CTGGCGTGCG CAGTAGACTA GCGTCCGAGT ACCTTGCTAA GAACCTTAGT CATTTTTCGG GAGATTGCTC CTTTATTGAA GCCACGTCTT TCGTGTTGCG TGAGAAAATC AGAAACATGA CTCTGAATTT TAACGAAAGA CTTTTACAGT TAGTGAAGCG CGTTGCCTTT GCGACCTTGG ACGTGAGTTT TCTAGATTTA GATTCAACTC TTGAATCAAT AACTGATTTT GCCGAGTGTA AGGTAGCGAT TGAACTCGAC GAGTTGGGTT GCTTGAGAGC GGAGGCCGAG AATGAAAAAA TCAGGAATCT GGCGGGAGAT TCGATTGCGG CTAAACTCGC GAGCGAGATA GTGGTCGATA TTGACTCTAA GCCTTCACCG AAGCAGGTGG GTAATTCGTC ATCCGAAAAC GCCGATAAGC GGGAAGTTCA GAGGCCCGGT TTGCGTGGTG GTTCTAGAAA CGGGGTTGTT GGGGAGTTCC TTCACTTCGT CGTGGATTCT GCCTTGCGTC TTTTCAAATA CGCGACGGAT CAACAACGGA TCAAGTCTTA CGTGCGTTTC TTGGACTCGG CGGTCTCATT CTTGGATTAC aactacgata atctatcgtt tatactgcga gtgctttcgg aaggttattc gtgtatgttc GCGTTTTTGG CGAATCGCGG CGACTTATCT AGTCGTGTCC GTAGCGCGGT GTGTGCTGTG AAAGAAGTTG CTACCTCATG CGCGAACGCG AGCGTTTCTA AAGCCAAGGT TATGATTACC TTCGCAGCGG CCGTGTGTGC TATGATGTTT AATAGCTGCG GTTTTTCAGG CGACGGTCGG GAGTATAAAT CGTATATACA TCGTTACACG CAAGTATTGT TTGACACTAT CTTTTTTGAG GACAGCAGTT ACCTACCCAT AGAAGTTCTG AGTTCGGCGA TATGCGGTGC TATCGTCACA CTTTTCTCCT CGGGCTCGTC CATAAGTTTA AACGCCTTCT TACTTCAAAT TACCAAAGGA TTCTCCCTAG AGGTTGTCGT CCGGAATGTT GTGCGAGTCA CGCATGGTTT GAGCACCACA GCGACCGACG GCGTCATACG TGGGGTTTTC TCCCAAATTG TGTCTCACTT ACTTGTTGGA AATACGGGTA atgtggctta CCAGTCAGCT ttcattgccg gggtggtgcc tcttttagtt aaaaagtgtg tgagcttaat cttcatcttg cgtgaagata cttattccgg ttttattaag

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

020

4080

4140 ··/

CACGGAATCA GTGAATTCTC TTTCCTTAGT AGTATTCTGA AGTTCTTGAA GGGTAAGCTT GTGGACGAGT TGAAATCGAT TATTCAAGGG GTTTTTGATT CCAACAAGCA CGTGTTTAAA GAAGCTACTC AGGAAGCGAT TCGTACGACG GTCATGCAAG TGCCTGTCGC TGTAGTGGAT GCCCTTAAGA GCGCCGCGGG aaaaatttat AACAATTTTA CTAGTCGACG TACCTTTGGT AAGGATGAAG GCTCCTCTAG CGACGGCGCA TGTGAAGAGT ATTTCTCATG CGACGAAGGT	4200 4260 4320 4380 4440
GAAGGTCCGG GTCTGAAAGG GGGTTCCAGC TATGGCTTCT CAATTTTAGC GTTCTTTTCA CGCATTATGT GGGGAGCTCG TCGGCTTATT GTTAAGGTGA AGCATGAGTG TTTTGGGAAA CTTTTTGAAT TTCTATCGCT CAAGCTTCAC GAATTCAGGA CTCGCGTTTT TGGGAAGAAT AGAACGGACG TGGGAGTTTA CGATTTTTTG CCCACGGGCA TCGTGGAAAC GCTCTCATCG ATAGAAGAGT GCGACCAAAT TGAAGAACTT CTCGGCGACG ACCTGAAAGG TGACAAGGAT GCTTCGTTGA CCGATATGAA TTACTTTGAG TTCTCAGAAG ACTTCTTAGC CTCTATCGAG	4500 4560 4 620 4680 4740 4800
GAGCCGCCTT TCGCTGGATT GCGAGGAGGT AGCAAGAACA TCGCGATTTT GGCGATTTTG GAATACGCGC ATAATTTGTT TCGCATTGTC gcaagcaagt gttcgaaacg acctttattt	4860 4 920
CTTGCTTTCG CCGAACTCTC AAGCGCCCTT ATCGAGAAAT TTAAGGAGGT TTTCCCTCGT aagagccagc tcgtcgctat cgtgcgcgag TATACTCAGA GATTCCTCCG AAGTCGCATG CGTGCGTTGG GTTTGAATAA CGAGTTCGTG GTAAAATCTT TCGCCGATTT GCTACCCGCA	4 980 5040 5100
TTAATGAAGC GGAAGGTTTC AGGTTCGTTC TTAGCTAGTG TTTATCGCCC ACTTAGAGGT	5160
TTCTCATATA TGTGTGTTTC AGCGGAGCGA CGTGAAAAGT TTTTTGCTCT CGTGTGTTTA	5220
ATCGGGTTAA GTCTCCCTTT CTTCGTGCGC ATCGTAGGAG CGAAAGCGTG CGAAGAACTC	5280
GTGTCCTCAG CGCGTCGCTT TTATGAGCGT ATTAAAATTT TTCTAAGGCA GAAGTATGTC	5340
TCTCTTTCTA ATTTCTTTTG TCACTTGTTT AGCTCTGACG TTGATGACAG TTCCGCATCT	5400
GCAGGGTTGA AAGGTGGTGC GTCGCGAATG ACGCTCTTCC ACCTTCTGGT TCGCCTTGCT	5460
AGTGCCCTCC TATCGTTAGG GTGGGAAGGG TTAAAGCTAC TCTTATCGCA CCACAACTTG	5520
TTATTTTTGT GTTTTGCATT GGTTGACGAT GTGAACGTCC TTATCAAAGT TCTTGGGGGT	5580
CTTTCTTTCT TTGTGCAACC AATCTTTTCC TTGTTTGCGG CGATGCTTCT ACAACCGGAC	5640
AGGTTTGTGG AGTATTCCGA GAAACTTGTT ACAGCGTTTG AATTTTTCTT AAAATGTTCG	5700
CCTCGCGCGC CTGCACTACT CAAAGGGTTT TTTGAGTGCG TGGCGAACAG CACTGTGTCA	5760
AAAACCGTTC GAAGACTTCT TCGCTGTTTC GTGAAGATGC TCAAACTTCG AAAAGGGCGA	5820
GGGTTGCGTG CGGATGGTAG GGGTCTCCAT CGGCAGAAAG CCGTACCCGT CATACCTTCT	5880
AATCGGGTCG TGACCGACGG GGTTGAAAGA CTTTCGGTAA AGATGCAAGG AGTTGAAGCG	5940

TTGCGTACCG AATTGAGAAT CTTAGAAGAT TTAGATTCTG CCGTGATCGA AAAACTCAAT	6000
AGACGCAGAA ATCGTGACAC TAATGACGAC GAATTTACGC GCCCTGCTCA TGAGCAGATG	6060
CAAGAAGTCA CCACTTTCTG TTCGAAAGCC AACTCTGCTG GTTTGGCCCT GGAAAGGGCA	6120
GTGCTTGTGG AAGACGCTAT AAAGTCGGAG AAACTTTCTA AGACGGTTAA TGAGATGGTG	6180
AGGAAAGGGA GTACCACCAG CGAAGAAGTG GCCGTCGCTT TGTCGGACGA TGAAGCCGTG	6240
GAAGAAATCT CTGTTGCTGA CGAGCGAGAC GATTCGCCTA AGACAGTCAG GATAAGCGAA	6300
TACCTAAATA GGTTAAACTC AAGCTTCGAA TTCCCGAAGC CTATTGTTGT GGACGACAAC	6360
AAGGATACCG GGGGTCTAAC GAACGCCGTG AGGGAGTTTT ATTATATGCA AGAACTTGCT	6420
CTTTTCGAAA TCCACAGCAA ACTGTGCACC TACTACGATC AACTGCGCAT AGTCAACTTC	6480
GATCGTTCCG TAGCACCATG CAGCGAAGAT GCTCAGCTGT ACGTACGGAA GAACGGCTCA	6540

ACGATAGTGC	AGGGTAAAGA	GGTACGTTTG	CACATTAAGG ATTTCCACGA	TCACGATTTC	6600
CTGTTTGACG	GAAAAATTTC	TATTAACAAG	CGGCGGCGAG	GCGGAAATGT	TTTATATCAC	6660
GACAACCTCG	CGTTCTTGGC	GAGTAATTTG	TTCTTAGCCG	GCTACCCCTT	TTCAAGGAGC	6720
TTCGTCTTCA	CGAATTCGTC	GGTCGATATT	CTCCTCTACG	AAGCTCCACC	CGGAGGTGGT	6780
AAGACGACGA	CGCTGATTGA	CTCGTTCTTG	AAGGTCTTCA	AGAAAGGTGA	GGTTTCCACC	6840
ATGATCTTAA	CCGCCAACAA	AAGTTCGCAG	GTTGAGATCC	TAAAGAAAGT	GGAGAAGGAA	6900
GTGTCTAACA	TTGAATGCCA	GAAACGTAAA	GACAAAAGAT	CTCCGAAAAA	GAGCATTTAC	6960
ACCATCGACG	CTTATTTAAT	GCATCACCGT	GGTTGTGATG	CAGACGTTCT	TTTCATCGAT	7020
GAGTGTTTCA	TGGTTCATGC	GGGTAGCGTA	CTAGCTTGCA	TTGAGTTCAC	GAGGTGTCAT	7080
AAAGTAATGA	TCTTCGGGGA	TAGCCGGCAG	ATTCACTACA	TTGAAAGGAA	CGAATTGGAC	7140

AAGTGTTTGT ATGGGGATCT CGACAGGTTC GTGGACCTGC AGTGTCGGGT TTATGGTAAT	7200
ATTTCGTACC GTTGTCCATG GGATGTGTGC GCTTGGTTAA GCACAGTGTA TGGCAACCTA	7260
ATCGCCACCG TGAAGGGTGA AAGCGAAGGT AAGAGCAGCA TGCGCATTAA CGAAATTAAT	7320
TCAGTCGACG ATTTAGTCCC CGACGTGGGT TCCACGTTTC TGTGTATGCT TCAGTCGGAG	7380
AAGTTGGAAA TCAGCAAGCA ctttattcgc aagggtttga ctaaacttaa CGTTCTAACG	7440
GTGCATGAGG CGCAAGGTGA GACGTATGCG CGTGTGAACC TTGTGCGACT TAAGTTTCAG	7500
gaggatgaac cctttaaatc tatcaggcac ataaccgtcg ctctttctcg tcacaccgac	7560
agcttaactt ataacgtctt agctgctcgt cgaggtgacg ccacttgcga tgccatccag	7620
aaggctgcgg aattggtgaa caagtttcgc gtttttccta catcttttgg tggtagtgtt	7680
ATCAATCTCA ACGTGAAGAA GGACGTGGAA GATAACAGTA GGTGCAAGGC TTCGTCGGCA	7740
CCATTGAGCG TAATCAACGA ctttttgaac gaagttaatc CCGGTACTGC ggtgattgat	7800
TTTGGTGATT TGTCCGCGGA CTTCAGTACT GGGCCTTTTG AGTGCGGTGC CAGCGGTATT	7860
GTGGTGCGGG ACAACATCTC ctccagcaac atcactgatc acgataagca gcgtgtttag	7920

A nagyméretű poliprotein (papain-szerű proteázok, metil-transzferáz és helikáz) a 3 szekvenciának megfelelő aminosav az alábbiak szerint azonosítási szám szerinti szekvenciával rendelkezik

Thr Leu 1

Arg Glu Asn Pro Ile 5

Ser Val

Ser 10

Gly Val Asn Leu Gly 15

Arg

Ser

Alá

Alá

Alá 20

Gin

Val

Ile

Tyr

Phe 25

Gly

Ser

Phe

Thr

Gin 30

Pro

Phe

Alá

Leu

Tyr 35

Pro

Arg

Gin

Glu

Ser 40

Alá

Ile

Val

Lys

Thr 45

Gin

Leu

Pro

Pro

Val 50

Ser

Val

Val

Lys

Val 55

Glu

Cys

Val

Alá

Alá 60

Glu

Val

Alá

Pro

Asp 65

Arg

Gly

Val

Val

Asp 70

Lys

Lys

Pro

Thr

Ser 75

Val

Gly

Val

Pro

Pro 80

Gin

Arg

Gly

Val

Leu 85

Ser

Phe

Pro

Thr

Val 90

Val

Arg

Asn

Arg

Gly 95

Asp

Val

Ile

Thr 100

Gly

Val

Val

His

Glu

105

Alá

Leu

Lys

Lys

110

Lys

Asp

Gly

Lett

Leu

115

Arg

Phe

Arg

Val

Gly 120

Gly

Asp

Met

Arg

Phe 125

Ser

Arg

Phe

Phe

Ser 130

Ser

Asn

Tyr

Gly

Cys 135

Arg

Phe

Val

Alá

Ser 140

Val

Arg

Thr

Asn

Thr Thr Val 145

Trp

Leu Asn Cys 150

Thr

Lys Alá

Ser 155

Gly

Glu

Lys

Phe

Ser 160

Leu

Alá

Alá

Alá

Cys 165

Thr

Alá

Asp

Tyr

Val 170

Alá

Met

Leu

Arg

Tyr 175

Val

Cys

Gly

Gly

Lys 180

Phe

Pro

Leu

Val

Leu 185

Met

Ser

Arg

Val

Ile 190

Tyr

Pro

Asp

Gly

Arg 195

Cys

Tyr

Leu

Alá

His 200

Met

Arg

Tyr

Leu

Cys 205

Alá

Phe

Tyr

Cys

Arg 210

Pro

Phe

Arg

Glu

Ser 215

Asp

Tyr

Alá

Leu

Gly 220

Met

Trp

Pro

Thr

Val 225

Alá

Arg

Leu

Arg

Alá 230

Cys

Val

Glu

Lys

Asn 235

Phe

Gly

Val

Glu

Alá 240

Cys

Gly

Ile

Alá

Leu 245

Arg

Gly

Tyr

Tyr

Thr 250

Ser

Arg

Asn

Val

Tyr 255

His

Cys

Asp

Tyr

Asp 260

Ser

Alá

Tyr

Val

Lys 265

Tyr

Phe

Arg

Asn

Leu 270

Ser

Gly

Arg lie Gly Gly Gly Ser Phe Asp Pro Thr Ser Leu Thr Ser Vai He 275 280285

Thr Vai Lys He Ser Gly Leu Pro Gly Gly Leu Pro Lys Asn He Ala 290 295300

Phe Gly Ala Phe Leu Cys Asp He Arg Tyr Vai Glu Pro Vai AspSer ³⁰⁵ 310 315320

Gly Gly He Gin Ser Ser Vai Lys Thr Lys Arg Glu Asp Ala HisArg

325 330335

Thr Vai	Glu Glu 340	Arg Ala Ala Gly Gly Ser Vai Glu Gin 345	Pro 350	Arg	Gin
Lys Arg	He Asp 355	Glu Lys Gly Cys Gly Arg Vai Pro Ser 360 365	Gly	Gly	Phe
Ser His 370	Leu Leu	Vai Gly Asn Leu Asn Glu Vai Arg Arg 375 380	Lys	Vai	Ala
Ala Gly 385	Leu Leu	Arg Phe Arg Vai Gly Gly Asp Met Asp 390 395	Phe	His	Arg 400
Ser Phe	Ser Thr	Gin Ala Gly His Arg Leu Leu Vai Trp 405 410	Arg	Arg 415	Ser
Ser Arg	Ser Vai 420	Cys Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Ser Lys 425	Asn 430	Phe	Leu
Arg Tyr	Asp Vai 435	Leu Pro Cys Ser Gly Asp Tyr Ala Ala 440 445	Met	Phe	Ser
Phe Ala 450	Ala Gly	Gly Arg Phe Pro Leu Vai Leu Met Thr 455 460	Arg	He	Arg
Tyr Pro 4 65	Asn Gly	Phe Cys Tyr Leu Ala His Cys Arg Tyr 470 475	Ala	Cys	Ala 480
Phe Leu	Leu Arg	Gly Phe Asp Pro Lys Arg Phe Asp lie 485 490	Gly	Ala 495	Phe

Pro Thr Ala Ala Lys Leu Arg Asn Arg Met Vai Ser Glu Leu Gly Glu

500 505sió

Arg Ser Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Glv Vai 515 520525

Phe His Cys Asp Tyr Asp Ala Lys Phe lie Lys Asp Leu Arg Leu Met 530 535

Ser Ala Vai lie Ala Gly Lys Asp Gly Vai Glu Glu Vai Vai ProSer ⁵⁴⁵ 550 555560

Asp He Thr Pro Ala Met Lys Gin Lys Thr He Glu Ala Vai TyrAsp

565 570575

Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Asp Ser Leu Leu Lys Leu Ser He Glu Lys 580 58559Q

Asp Leu lie Asp Phe Lys Asn Asp Val Gin Ser Leu Lys Lys Asp Arg ⁶⁰⁰605

Pro lie Val Lys v.i _Pro Tyr Het Ser Glu Ala Thr Gin Aan Ser ⁶¹⁵620

Leu Thr Arg Phe Tyr Pro Gin Phe Glu Leu Lys Phe Ser His Ser Ser ⁶³⁰ «5

His Ser Asp His Pro Ala Ala Ala Ala Ser Arg Leu Leu Glu Asn Glu ⁶⁴⁵ θ50

Thr Leu Val Arg Leu Cys Gly Asn Ser Val Ser Asp lie Gly Gly Cys ⁶⁶⁵670

Pro Leu Phe His Leu His Ser 675

’ Lys 680

Thr Gin Arg Arg Val 685

His Val Cys

Arg

Pro 690

Val

Let

i Asp

i Gly

’ Lys 695

Asp

Ala

Gin

Arg

Arg 700

Val

Val

Arg

Asp

Leu 705

Gin

Tyr

Ser

Asn

Val 710

Arg

Leu

Gly

Asp

Asp 715

Asp

Lys

lie

Leu

Glu 720

Gly

Pro

Arg

Asn

lie 725

Asp

He

Cys

His

Tyr 730

Pro

Leu

Gly

Ala

Cys 735

Asp

His

Glu

Ser

Ser 740

Ala

Met

Met

Met

Val 745

Gin

Val

Tyr

Asp

Ala 750

Ser

Leu

Tyr

Glu

lie 755

Cys

Gly

Ala

Met

He 760

Lys

Lys

Lys

Ser

Arg 765

He

Thr

Tyr

Leu

Thr 770

Met

Val

Thr

Pro

Gly 775

Glu

Phe

Leu

Asp

Gly 780

Arg

Glu

Cys

Val

Tyr 785

Met

Glu

Ser

Leu

Asp 790

Cys

Glu

He

Glu

Val 7 95

Asp

Val

His

Ala

Asp 800

Val

Val l

Met 1

Tyr

Lys 805

Phe

Gly

Ser ,

Ser

Cys 810

Tyr

Ser

His

Lys

Leu 815

Ser

lie lie Lys Asp He Met Thr Thr Pro Tyr Leu Thr Leu Gly Gly Phe 825 830

Leu Phe Ser Val Glu Met Tyr Glu Val Arg Met Gly Val Asn Tyr Phe 840845

Lys lie Thr Lys Ser Glu Val Ser Pro Ser lie Ser Cys Thr Lys Leu ⁸⁵5860

Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Asn Ser ⁸⁶⁵ 870

Arg Phe Asp Lys Lys Arg Arg Met 885

Tyr Leu Asp Ser Lys Phe Val Ser 900

Asp Val Val Lys Val Lys Leu Pro ⁸⁷⁵880

Cys Leu Pro Gly Tyr Asp Thr He 890395

Arg Val Phe Asp Tyr Val Val Cvs 905

Asn Cys Ser Ala Vai Asn Ser Lys Thr Phe Glu Trp Vai Trp Ser Phe ⁹¹⁵ 920925

He Lys Ser Ser Lys Ser Arg Vai He He Ser Gly Lys He He His ^9J0 93594Q

Lys Asp Vai Asn Leu Asp Leu Lys Tyr Vai Glu Ser Phe Ala Ala Vai ⁹⁵⁰ 955

Met Leu Ala Ser Gly Vai Arg Ser Arg Leu Ala Ser Glu Tyr Leu Ala ⁹⁶⁵ 97097

Lys Asn Leu Ser His Phe Ser Gly Asp Cys Ser Phe lie Glu Ala Thr ⁹⁸⁰ 985990

Ser Phe Vai Leu Arg Glu Lys He Arg Asn Met Thr Leu Asn Phe Asn ⁹⁹⁵ 1000

Glu Arg Leu Leu Gin Leu Vai Lys 1010 1015

Vai Ser Phe Leu Asp Leu Asp Ser 1025 ₁₀₃₀

Ala Glu Cys Lys Vai Ala lie Glu 1045

Ala Glu Ala Glu Asn Glu Lys He 1060

Arg Vai Ala Phe Ala Thr Leu Asp 1020

Thr Leu Glu Ser He Thr Asp Phe 10351040

Leu Asp Glu Leu Gly Cys Leu Arg 10501055

Arg Asn Leu Ala Gly Asp Ser He 1°⁶⁵1070

Ala Ala Lys Leu Ala Ser 1075

Glu lie Vai Vai Asp He Asp Ser Lys Pro 10801085

Ser Pro Lys Gin Vai 1090

Gly Asn Ser Ser Ser Glu Asn Ala Asp Lys Ara

10951100

Gl^Val Gin Arg Pro Gly^Leu Arg Gly Gly Ser^Arg Asn Gly VaiVai

Gly Glu Phe Leu Hi, Phe Vai Vai Asp Ser Ala Leu Arg Leu PheLys ¹¹²⁵ 1130i

Tyr Ala Thr Asp Gin Gin Arg He Lys Ser Tyr Vai Arg Phe LeuAsp ¹¹⁴⁰ 1145 ₁₁₅₀

Ser Ala Vai Ser Phe Leu Asp Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Ser Phelie ¹¹⁵⁵ 1160 ^LeU 1170^{Val LeU G1U} ?i7₅ ^{Tyr 3βΓ CyS Met Phe Ala Phe Leu Ala}

Asn Arg Gly Asp Leu Ser Ser Arg 1185 1190

Lys Glu Val Ala Thr Ser Cys Ala 1205

Val Met He Thr Phe Ala Ala Ala 1220

Val Arg Ser Ala Val Cys Ala Val 11951200

Asn Ala Ser Val Ser Lys Ala Lys 12101215

Val Cys Ala Met Met Phe Asn Ser 12251230 t

Cys

Gly Phe Ser 1235

Gly

Asp

Gly Arg Glu 1240

Tyr

Lys

Ser Tyr He 1245

His

Arg

Tyr

Thr Gin 1250

Vai

Leu

Phe

Asp Thr 1255 lie

Phe

Phe

Glu Asp Ser 1260

Ser

Tyr

Leu 1265

Pro

He

Glu

Vai

Leu 1270

Ser

Ser

Ala

He

Cys 1275

Gly

Ala

He

Vai

Thr 1280

Leu

Phe

Ser

Ser

Gly 1285

Ser

Ser

He

Ser

Leu . 1290

Asn

Ala

Phe

Leu

Leu 1295

Gin lie

Thr

Lys

Gly 1300

Phe Ser

Leu

Glu

Vai 1305

Vai

Vai

Arg

Asn

Vai 1310

Vai Arg

Vai

Thr

His 1315

Gly

Leu

Ser

Thr

Thr . 1320

Ala Thr

Asp

Gly

Vai 1325

He Arg Gly

Vai

Phe 1330

Ser Gin

He

Vai

Ser 1335

His

Leu

Leu

Vai

Gly . 1340

Asn Thr

Gly

Asn

Vai . 1345

Ala Tyr Gin

Ser

Ala 1350

Phe lie

Ala

Gly

Vai 1355

Vai Pro

Leu

Leu

Vai 1360

Lys Lys

Cys

Vai

Ser 1365

Leu

He

Phe

Leu . 1370

Arg Glu

Asp

Thr

Tyr Ser 1375

Gly

Phe lie

Lys His 1380

Gly He Ser Glu Phe 1385

Ser

Phe Leu

Ser Ser 1390

He

Leu

Lys

Phe Leu 1395

Lys

Gly

Lys

Leu Vai 1400

Asp

Glu

Leu

Lys Ser 1405

He

He

Gin

Gly 1410

Vai 1

Phe

Asp

Ser

Asn 141S

Lys

His

Vai

Phe

Lys Glu 1420

Ala

Thr

Gin

Glu 1425

Ala

He

Arg

Thr

Thr 1430

Vai

Met

Gin

Vai

Pro 1435

Vai

Ala

Vai

Vai

Asp 1440

Ala

Leu

Lys

Ser

Ala . 1445

Ala

Gly

Lys lie

Tyr j 1450

Asn

Asn

Phe

Thr

Ser . 1455

Arg

Arg

Thr

Phe

Gly 1460

Lys

Asp

Glu

Gly

Ser , 1465

Ser

Ser

Asp

Gly

Ala I 1470

Cys

Glu

Glu

Tyr

Phe 1475

Ser

Cys

Asp

Glu

Gly I 1480

Glu Gly

Pro

Gly

Leu 1485

Lys

Gly

Gly

Ser

Ser 1490

Tyr

Gly

Phe

Ser

He 1495

Leu

Ala

Phe

Phe

Ser . 1500

Arg

He

Met

Trp

Gly . 1505

Ala

Arg

Arg

Leu

He 1510

Vai

Lys

Vai

Lys

His 1515

Glu

Cys

Phe

Gly

Lys 1520

Leu Phe

Glu

Phe

Leu 1525

Ser Leu

Lys

Leu

His 1530

Glu Phe

Arg

Thr

Arg 1535

Vai

Phe Gly

Lys

Asn . 1540

Arg Thr Asp

Vai

Gly 1545

Vai Tyr Asp

Phe

Leu 1550

Pro Thr

Gly

He Vai Glu 1555

Thr Leu Ser Ser He Glu Glu Cys Asp Gin lie Glu 15601565

Glu Leu Leu Gly Asp Asp Leu Lys Gly Asp Lys Asp Ala Ser Leu Thr

I⁵⁷⁰ 15751580

Asp Met Asn Tyr Phe Glu Phe Ser Glu Asp Phe Leu Ala Ser lieGlu ¹⁵⁸⁵ 1590 1595

Glu Pro Pro Phe Ala Gly Leu Arg Gly Gly Ser Lys Asn lie AlaHe

1605 16101615

Leu Ala He Leu Glu Tyr Ala His Asn Leu Phe Arg He Vai Ala Ser I⁶²⁰ 16251630

Lys Cys Ser Lys Arg Pro Leu Phe Leu Ala Phe Ala Glu Leu Ser Ser

I⁶³⁵ 16401645

Ala Leu He Glu Lys Phe Lys Glu Vai Phe Pro Arg Lys Ser Gin Leu

I⁶⁵⁰ 16551660

Vai Ala He Vai Arg Glu Tyr Thr Gin Arg Phe Leu Arg Ser ArgMet ¹⁶⁶⁵ 16⁷0 1675

Arg Ala Leu Gly Leu Asn Asn Glu Phe Vai Vai Lys Ser Phe AlaAsp

1685 16901695

Leu Leu Pro Ala Leu Met Lys Arg Lys Vai Ser Gly Ser Phe Leu Ala 1100 17051710

Ser Vai Tyr Arg Pro Leu Arg Gly Phe Ser Tyr Met Cys Vai Ser Ala H15 17201725

Glu Arg Arg Glu Lys Phe Phe Ala Leu Vai Cys Leu He Gly Leu Ser I⁷³⁰ 17351740

Leu Pro Phe Phe Vai Arg He Vai Gly Ala Lys Ala Cys Glu GluLeu ¹⁷⁴⁵ 1750 17551760

Vai Ser Ser Ala Arg Arg Phe Tyr Glu Arg He Lys lie Phe LeuArg

1765 17701775

Gin Lys Tyr Vai Ser Leu Ser Asn Phe Phe Cys His Leu Phe Ser Ser 1780 1785

Asp Vai Asp Asp Ser Ser Ala Ser Ala Gly Leu Lys Gly Gly Ala Ser 1795 18001805

Arg Met Thr Leu Phe His Leu Leu Vai Arg Leu Ala Ser Ala Leu Leu ¹⁸¹⁰ 18151820 ?!L^{LeU Gly Trp G1U Gly Leu Lys Leu Leu Leu Ser His His} AsnLeu ¹⁸²⁵ 1830 18351840

Leu Phe Leu Cys Phe Ala Leu Vai Asp Asp Vai Asn Vai Leu lieLys

18^5 18501855

Vai

Leu Gly Gly Leu Ser Phe Phe Vai Gin Pro He I8601865

Phe Ser Leu Phe 1870

Ala Ala Met Leu Leu Gin Pro Asp Arg Phe Val Glu Tyr Ser ¹⁸⁷⁵ 18801885

Glu Lys

Leu Val Thr Ala Phe Glu Phe Phe ¹⁸⁹⁰ 1895

Ala Leu Leu Lys Gly Phe Phe Glu ¹⁹⁰⁵ 1910

Lys Thr Val Arg Arg Leu Leu Arg 1925

Arg Lys Gly Arg Gly Leu Arg Ala 1940

Lys Ala Val Pro Val He Pro Ser ¹⁹⁵⁵ 1960

Leu Lys Cys Ser Pro Arg Ala Pro 1900

Cys Val Ala Asn Ser Thr Val Ser ¹⁹¹⁵1920

Cys Phe Val Lys Met Leu Lys Leu 19301935

Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Gin ¹⁹⁴⁵1950

Asn Arg Val Val Thr Asp Gly Val 1965

Glu Arg Leu Ser Val 1970

Lys Met Gin Gly Val Glu Ala Leu Arg Thr Glu ¹⁹⁷51980

LeuAsg Xie Leu _Glu P Leu Asp Set Ala Val lie Glu Lys Leu Asp ^{1990 1995}2000

Arg Arg Arg Asn Arg Asp Thr Asn Asp Asp Glu Phe Thr Arg Pro Ala ²⁰⁰⁵ 2010

His Glu Gin Hetein Glu Val Thr Thr^he Cys Ser Lys Ala Asn Ser

Ala Gly Leu Ala Leu Glu Arg Ala Val Leu Val Glu Asp Ala lie Lys ²⁰³⁵ 2040 ₂₀₄₅ “50^{LyS Le}“ ^S“ ^{G1U Val} **5 Gly 3« ^U3U 20552060

Thr Thr Ser Glu Glu Val Ala Val Ala Leu Ser Asp Asp Glu Ala Val ²⁰⁷⁰ 2075

Glu Glu He Ser Val Ala Asp Glu Arg Asp Asp Ser Pro Lys Thr Val ²⁰⁸⁵ 20902095

Arg lie Ser Glu Tyr Leu Asn Arg Leu Asn Ser Ser Phe Glu Phe Pro ²¹⁰⁰ 21052110

Lys Pro He Val Val Asp Asp Asn Lys Asp Thr Gly Gly Leu Thr Asn ²¹¹⁵ 21202125

213Q^{Ar9 G1U Phe TyX} 2H5^{Met Gln G1U LeU LeU Phe Glu Ile}

His Ser Lys Leu Cys Thr Tyr Tvr 2145 2150

Asp Arg Ser Val Ala Pro Cys Ser 2165

Lys Asn Gly Ser Thr lie Val Gin 2180

Asp Gin Leu Arg lie Val Asn Phe ²¹⁵⁵2160

Glu Asp Ala Gin Leu Tyr Val Ara 2170

Gly Lys Glu Val Arg Leu His He ²¹⁸⁵2190

- 39 - í : *ϊ·-·'.^:·ί »«· ··· ♦*· ·*♦ · ·

Lys Asp Phe His Asp 2195

His Asp Phe Leu Phe 2200

Asp Gly Lys lie Ser 2205 lie ^{AStl Ar9 Arg Gly Gly Asn Val Leu T}*^{r His As}P Asn Leu Ala ²²¹⁰ 2215 2220

Phe Leu Ala Ser Asn Leu Phe Leu 2225 2230

Phe Val Phe Thr Asn Ser Ser Val 2245

Pro Gly Gly Gly Lys Thr Thr Thr 2260

Ala Gly Tyr Pro Phe Ser Arg Ser 22352240

Asp lie Leu Leu Tyr Glu Ala Pro 22502255

Leu He Asp Ser Phe Leu Lys Val 22652270

Phe Lys Lys Gly Glu Val Ser 2275

Thr Met He Leu Thr Ala Asn Lys Ser 22802285 ^Ser San^{Val G1U Ile LeU LyS LyS Val Glu LyS Glu Val} Ser Asn He ²²⁹⁰ 22952300

Glu ^Cys Gin Lys Arg Lys Asp Lys Arg Ser Pro Lys Lys Ser lieTyr ²³⁰⁵ 2310 231523

Thr He Asp Ala Tyr Leu Met His His Arg Gly Cys Asp Ala AspVal

2325 2330

Leu Phe lie Asp Glu Cys Phe Met Val His Ala Gly Ser Val Leu Ala ²³⁴⁰ 23452350 ^Cys lie Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Val Met lie Phe Gly Asp Ser ²³⁵⁵ 23602365 ^Ar9 ™^{Ι1β HiS Tyr Ile Glu Arg Asn Glu} Leu Asp Lys Cys Leu Tyr ²³⁷⁰ 23752380

Gly ^Asp Leu Asp Arg Phe Val Asp Leu Gin Cys Arg Val Tyr Gly Asn ^{2385 2390} 23952400

He Ser Tyr Arg Cys Pro Trp Asp Val Cys Ala Trp Leu Ser Thr Val

2405 24102415

Tyr Gly Asn Leu lie Ala Thr Val Lys Gly Glu Ser Glu Gly Lys Ser ²⁴²⁰ 24252430

Ser Met Arg He Asn Glu lie Asn Ser Val Asp Asp Leu Val Pro Asp ²⁴³5 2440 ^Val ?«n^{Ser THr Phe LeU CyS Met Leu Gln Ser Glu} Lys Leu Glu lie ²⁴⁵⁰ 24552460

Ser Lys His Phe lie Arg Lys Gly Leu Thr Lys Leu Asn ²⁴⁶⁵ 24702475

Val His Glu Ala Gin Gly Glu Thr

2485

Val Leu Thr

2480

Leu Val Arg 2495

Tyr Ala Arg Val Asn 2490

Leu Lys

Phe Gin Glu Asp Glu

2500

Pro Phe Lys Ser He Arg 2505

His lie Thr 2510

Val Ala Leu Ser Arg His Thr Asp Ser Leu Thr Tyr Asn Vai Leu Ala ^Z515 2520 ₂525

Al« Arg Arg Gl_y Asp _Ala ThX Cys Asp Ala He Gin Lys Ala Ala Gin

Leu val Asn Lys Phe Arg Val Phe Pro Thr Ser Pho Gly _{Gly Ser Val} ²⁵⁵⁰ 2SSS ₂₅₆

He Asn Leu Asn Val Lys L_ys Asp Val Glu Asp Asn Ser Arg Cys L_ys

Ala Ser Ser Ala Fro Leu Ser val Ue Asn Asp Phe Leu Asn Glu

Asn Pro Gly Thr Ala Val He Asp Phe Gly Asp Leu Ser Ala Asp She ^Ser ?fnn^{Gly Pr}° ^{Phe Glu Cys Gly Ala Ser G1}y ^Ile Val Val 9κις

Arg Asp

Asn H. ser Ser Ser Aon He Thr Asp Sis Asp Lys Gin Arg Val és molekulatömege körülbelül 290-300 kDa között van, előnyösen 294 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORFlb) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 79229301. nukleotidjait és egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus RNS-függő RNS-polimerázt (RdRP) kódol. Ez a DNSmolekula a 4. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

AGCGTAGTTC GGTCGCAGGC GATTCCGCGT AGAAAACCTT CTCTACAAGA AAATTTGTAT 60

TCGTTTGAAG CGCGGAATTA TAACTTCTCG ACTTGCGACC GTAACACATC TGCTTCAATG120

TTCGGAGAGG CTATGGCGAT GAACTGTCTT CGTCGTTGCT TCGACCTAGA TGCCTTTTCG180

TCCCTGCGTG ATGATGTGAT TAGTATCACA CGTTCAGGCA TCGAACAATG GCTGGAGAAA240

CGTACTCCTA GTCAGATTAA AGCATTAATG AAGGATGTTG AATCGCCTTT GGAAATTGAC300

GATGAAATTT GTCGTTTTAA GTTGATGGTG AAGCGTGACG CTAAGGTGAA GTTAGACTCT

TCTTGTTTAA CTAAACACAG CGCCGCTCAA AATATCATGT TTCATCGCAA GAGCATTAAT420

GCTATCTTCT CTCCTATCTT TAATGAGGTG AAAAACCGAA TAATGTGCTG TCTTAAGCCT

AACATAAAGT TTTTTACGGA GATGACTAAC AGGGATTTTG CTTCTGTTGT CAGCAACATG

	- 41 -	*· ·* ··· ♦ e· t·· C	• ·*#· «»* · *
CTTGGTGACG ACGATGTGTA	CCATATAGGT GAAGTTGATT	TCTCAAAGTA CGACAAGTCT	600
CAAGATGCTT TCGTGAAGGC	TTTTGAAGAA GTAATGTATA	AGGAACTCGG TGTTGATGAA	660
GAGTTGCTGG CTATCTGGAT	GTGCGGCGAG CGGTTATCGA	TAGCTAACAC TCTCGATGGT	720
CAGTTGTCCT TCACGATCGA	GAATCAAAGG AAGTCGGGAG	CTTCGAACAC TTGGATTGGT	780

AACTCTCTCG	TCACTTTGGG TATTTTAAGT	CTTTACTACG	ACGTTAGAAA	TTTCGAGGCG	840
TTGTACATCT	CGGGCGATGA	TTCTTTAATT	TTTTCTCGCA	GCGAGATTTC	GAATTATGCC	900
GACGACATAT	GCACTGACAT	GGGTTTTGAG	ACAAAATTTA	TGTCCCCAAG	TGTCCCGTAC	960
TTTTGTTCTA	AATTTGTTGT	TATGTGTGGT	CATAAGACGT	TTTTTGTTCC	CGACCCGTAC	1020
AAGCTTTTTG	TCAAGTTGGG	AGCAGTCAAA	GAGGATGTTT	CAATGGATTT	CCTTTTCGAG	1080
ACTTTTACCT	CCTTTAAAGA	CTTAACCTCC	GATTTTAACG	ACGAGCGCTT	AATTCAAAAG	1140
CTCGCTGAAC	TTGTGGCTTT	AAAATATGAG	GTTCAAACCG	GCAACACCAC	CTTGGCGTTA	1200
AGTGTGATAC	ATTGTTTGCG	TTCGAATTTC	CTCTCGTTTA	GCAAGTTATA	TCCTCGCGTG	1260
AAGGGATGGC	AGGTTTTTTA	CACGTCGGTT	AAGAAAGCGC	TTCTCAAGAG	TGGGTGTTCT	1320
CTCTTCGACA	GTTTCATGAC	CCCTTTTGGT	CAGGCTGTCA	TGGTTTGGGA	TGATGAGTAG	1380

Az RNS-függő RNS-polimeráz az 5. azonosítási szám sze rinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával ren delkezik, az alábbiak szerint:

Ser V.l Val Arg Ser Gia Ala Ile Pro Arg Arg Lya Pro Ser Leu Gl„ ¹⁰15

Glu Asn Leu Tyr Ser Phe Glu Alá Arg Asn Tyr Asn Phe Ser Thr Cys ²⁰ 25

Asp Arg Asn Thr Ser Alá Ser Met Phe Gly Glu Ala Met Ala Met Asn

Cys Leu Arg Arg Cys Phe Asp Leu Asp Alá Phe Ser Ser Leu Arg Asp ⁵⁵60

Asp Val Ile Ser Ile Thr Arg Ser Gly He _Glu Gin Trp Leu Glu Lys ^{70 73}80

Arg Thr Pro Ser Gin lie Lys Ala Leu Met Lys Asp Val Glu Ser Pro ⁸⁵ 9095

Leu Glu lie Asp Asp Glu He Cys Arg Phe Lys Leu Met Val L_ys Arg ¹⁰⁰ 105 ₁₁₀

Asp Alá Lys Val Lys Leu Asp Ser Ser Cys Leu Thr Lys His Ser Alá ¹¹⁵ 120125

Ala Gin Asn He Met Phe His Arg Lys Ser He Asn Alá Il_{e Phe} Ser

135

Vai Lys Asn Arg He Met 150 155

Thr Glu Met Thr Asn Arg 170

Pro He Phe Asn Glu ^; 145

Asn He Lys Phe Phe 165

Vai Ser Asn Met Leu 180

Asp Phe Ser Lys Tyr 195

Glu Glu Vai Met Tyr 210

He Trp Met Cys Gly 225

Gin Leu Ser Phe Thr 245 . Thr Trp He Gly Asn 260

I ¹ Tyr Asp Vai Arg Asn 275

Leu He Phe Ser Arg 290

Thr Asp Met Gly Phe 305

Phe Cys Ser Lys Phe 325

Pro Asp Pro Tyr Lys 340

Vai Ser Met Asp Phe 355

Thr Ser Asp Phe Asn 370

Vai Ala Leu Lys Tyr 385

Ser Vai He His Cys

405

Tyr Pro Arg Vai Lys 420

Ala Leu Leu Lys Ser 435

Phe Gly Gin Ala Vai 450

Gly Asp Asp Asp Vai Tyr 185

Asp Lys Ser Gin Asp Ala 200

Lys Glu Leu Gly Vai Asp 215

Glu Arg Leu Ser He Ala

230 ²³⁵

He Glu Asn Gin Arg Lys 250

Ser Leu Vai Thr Leu Gly 265

Phe Glu Ala Leu Tyr He 280

Ser Glu He Ser Asn Tyr 295

Glu Thr Lys Phe Met Ser 310 315

Vai Vai Met Cys Gly His 330

Leu Phe Vai Lys Leu Gly 345

Leu Phe Glu Thr Phe Thr 360

Asp Glu Arg Leu He Gin 375

Glu Vai Gin Thr Gly Asn

390 ³⁹⁵

Leu Arg Ser Asn Phe Leu 410

Gly Trp Gin Vai Phe Tyr 425

Cys Cys Leu Lys Pro 160

Asp Phe Ala Ser Vai 175

His lie Gly Glu Vai 190

Phe Vai Lys Ala Phe

205

Glu Glu Leu Leu Ala

220

Asn Thr Leu Asp Gly 240

Ser Gly Ala Ser Asn 255

He Leu Ser Leu Tyr 270

Ser Gly Asp Asp Ser 285

Ala Asp Asp He Cys 300

Pro Ser Vai Pro Tyr 320

Lys Thr Phe Phe Vai 335

Ala Vai Lys Glu Asp 350

Ser Phe Lys Asp Leu 365

Lys Leu Ala Glu Leu

380

Thr Thr Leu Ala Leu 400

Ser Phe Ser Lys Leu 415

Thr Ser Vai Lys Lys

430

Ser Phe Met Thr Pro

445

Gly Cys Ser Leu Phe Asp 440

Met Vai Trp Asp Asp Glu 455

és molekulatömege körülbelül 50 és körülbelül 54 kDa között van, előnyösen körülbelül 52 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF2) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 9365-9535. nukleotidjait és egy kisméretű, szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus hidrofób fehérjét vagy polipeptidet kódol. Ez a DNS-molekula a 6. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ATGAATCAGG TTTTGCAGTT TGAATGTTTG TTTCTGCTGA ATCTCGCGGT TTTTGCTGTG ACTTTCATTT TCATTCTTCT GGTCTTCCGC GTGATTAAGT CTTTTCGCCA GAAGGGTCAC GAAGCACCTG TTCCCGTTGT TCGTGGCGGG GGTTTTTCAA CCGTAGTGTA G

120

171

A kisméretű hidrofób fehérje vagy polipeptid a 7. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met Asn Gin 1	Val	Leu 5	Gin Phe Glu Cys Leu 10	Phe	Leu Leu	Asn	Leu 15	Alá
Val Phe Alá	Val 20	Thr	Phe Ile Phe Ile Leu 25	Leu	Val Phe	Arg 30	Val	Ile
Lys Ser Phe 35	Arg	Gin	Lys Gly His Glu Alá 40	Pro	Val Pro 45	Val	Val	Arg

Gly Gly Gly Phe Ser Thr Val Val

55 és molekulatömege körülbelül 5 és körülbelül 7 kDa között van, előnyösen körülbelül 6 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF3) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 955111350. nukleotidjait és egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus 70 kDa hősokk fehérjét kódol. Ez a DNS-molekula a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ATGGTAGTTT TCGGTTTGGA CTTTGGCACC ACATTCTCTA CGGTGTGTGT GTACAAGGAT60

GGACGAGTTT TTTCATTCAA GCAGAATAAT TCGGCGTACA TCCCCACTTA CCTCTATCTC120

TTCTCCGATT CTAACCACAT GACTTTTGGT TACGAGGCCG AATCACTGAT GAGTAATCTG180

AAAGTTAAAG GTTCGTTTTA TAGAGATTTA AAACGTTGGG TGGGTTGCGA TTCGAGTAAC240

CTCGACGCGT ACCTTGACCG TTTAAAACCT CATTACTCGG TCCGCTTGGT TAAGATCGGC300

TCTGGCTTGA ACGAAACTGT TTCAATTGGA AACTTCGGGG GCACTGTTAA GTCTGAGGCT360

CATCTGCCAG GGTTGATAGC TCTCTTTATT AAGGCTGTCA TTAGTTGCGC GGAGGGCGCG420

TTTGCGTGCA CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA TAGCGTTCAA480

AGGAATTTCA CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA TATGATCAAT54 0

GAACCTTCAG CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC CGCAAATTTG600

GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA CCGCAACAAT660

ACTTTTGTTG TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA TGTTGATCGT720

GCGTTTCTCA CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC TTTGGATATC780

TCGAATCTGA AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC TTTGAGAGGT840

GTCGATGGAA GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC GGTGATGCTC900

CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA TGCTAAGAGT960

ATGAATGAGA GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC TTCATATCTT1020

CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG ATCGTATCTT AAGAGTTTCG1000

GATCCTCGGG CTGCCGTGGC CGTCGGTTGC GCATTATATT CTTCATGCCT CTCAGGATCT1140

GGGGGGTTGC TACTGATCGA CTGTGCAGCT CACACTGTCG CTATAGCGGA CAGAAGTTGT1200

CATCAAATCA TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAGGAAG CATGCCTTTG1260

TACTTAGCCA GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG CCGTGTTTGA AGGGGAGTAC1320

GTTAAGTGCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTT TGATATAGGA	1380
GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT TTCAAGCGTA	1440
GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC AAGTGTCACT CACTGGAACT	1500
CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA ATTGCATATT	1560
AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA GAAAGGCGGA TCGACGAATA	1620
CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGATTCAA TTGATATCGC GGATGTGCTA	1680
AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCAGTGCC TTACCACCAG ACGAGGATGT CGAATTACTC	1740
CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC TGGAAGAAAT ACCTCTCTAG	1800

A 70 kDa hősokk fehérje feltételezhetően mint dajkafehérje (chaperon protein) működik és a 9. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Gly Gly Thr Val Lys Ser Glu Alá 115120

Phe lie Lys Alá Val Ile Ser Cys 130135

Cys Thr Gly Val Ile Cys Ser Val 145150

Arg Asn Phe Thr Asp Gin Cys Val 165

Tyr Met Ile Asn Glu Pro Ser Alá 180

Ile Gly Lys Lys Ser Alá Asn Leu 195200

Thr Phe Asp Val Ser Ile Ile Ser 210215

Arg Alá Ser Gly Gly Asp Leu Asn 225230

Alá Phe Leu Thr His Leu Phe Ser 245

Thr Leu Asp Ile Ser Asn Leu Lys 260

Glu Ile Val Tyr Thr Leu Arg Gly

275 280

His Leu Pro Gly Leu lie Alá Leu 125

Ala Glu Gly Ala Phe Alá Cys Thr 140

Pro Alá Asn Tyr Asp Ser Val Gin 155160

Ser Leu Ser Gly Tyr Gin Cys Val 170175

Ala Alá Leu Ser Alá Cys Asn Ser 185190

Alá Val Tyr Asp Phe Gly Gly Gly 205

Tyr Arg Asn Asn Thr Phe Val Val 220

Leu Gly Gly Arg Asp Val Asp Arg 235240

Leu Thr Ser Leu Glu Pro Asp Leu 250255

Glu Ser Leu Ser Lys Thr Asp Alá 265270

Val Asp Gly Arg Lys Glu Asp Val 285

Arg Vai Asn Lys Asn He Leu 290 295

Arg Thr Leu Lys He Leu Glu 305 310

Met Asn Glu Ser Ala Arg Vai 325

Ser Ser Tyr Leu Pro Gly Leu 340

Vai Asp Arg He Leu Arg Vai 355

Gly Cys Ala Leu Tyr Ser Ser 370 375

Leu He Asp Cys Ala Ala His 385 390

His Gin He lie Cys Ala Pro 405

Ser Met Pro Leu Tyr Leu Ala 420

Thr Ser Vai Met Leu Pro Tyr Vai Asn 300

Ser Thr Leu Lys Ser Tyr Ala Lys Ser 315320

Lys Cys Asp Leu Vai Leu lie Gly Gly 330335

Ala Asp Vai Leu Thr Lys His Gin Ser 345350

Ser Asp Pro Arg Ala Ala Vai Ala Vai 360365

Cys Leu Ser Gly Ser Gly Gly Leu Leu 380

Thr Vai Ala lie Ala Asp Arg Ser Cys 395400

Ala Gly Ala Pro He Pro Phe Ser Gly 410415

Arg Vai Asn Lys Asn Ser Gin Arg Glu 425430

Vai Ala Vai Phe Glu Gly Glu 435 lie Cys Gly Ala Asn He Arg 450 455

Ser Tyr Ala Pro Vai Thr Phe 465 470

Gly Ala Vai Ser Phe Vai Vai 485

Leu Thr Gly Thr Pro Ala Tyr 500

Arg Ser Vai Arg Glu Leu His 515

Gly Leu Leu Leu His Arg Lys 530 ’ 535

Asp Glu Ala lie Arg Tyr Ala 545 550

Lys Glu Tyr Lys Ser Tyr Ala 565

Vai Glu Leu Leu Leu Gly Lys 580

Arg Leu Glu Glu lie Pro Leu 595

Tyr Vai Lys Cys Pro Lys Asn Arg Lys 440445

Phe Phe Asp lie Gly Vai Thr Gly Asp 460

Tyr Met Asp Phe Ser lie Ser Ser Vai 475480

Arg Gly Pro Glu Gly Lys Gin Vai Ser 490495

Asn Phe Ser Ser Vai Ala Leu Gly Ser 505510 lie Ser Leu Asn Asn Lys Vai Phe Leu 520525

Ala Asp Arg Arg He Leu Phe Thr Lys 540

Asp Ser He Asp He Ala Asp Vai Leu 555560

Ala Ser Ala Leu Pro Pro Asp Glu Asp 570575

Ser Vai Gin Lys Vai Leu Arg Gly Ser 585590 és molekulatömege körülbelül 63 és körülbelül 67 kDa között van, előnyösen körülbelül 65 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF4) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 1127712932. nukleotidjait és egy vélelmezett szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus 90 kDa hősokk fehérjét kódol. Ez a DNS-molekula a 10. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ATGTCGAATT ACTCCTGGGA AAGTCTGTTC AAAAAGTTTT ACGGGGAAGC AGACTGGAAG	60
AAATACCTCT CTAGGAGCAT AGCAGCACAC TCAAGTGAAA TTAAAACTCT ACCAGACATT	120
CGATTGTACG GCGGTAGGGT TGTAAAGAAG TCCGAATTCG AATCAGCACT TCCTAATTCT	180
TTTGAACAGG AATTAGGACT GTTCATACTG AGCGAACGGG AAGTGGGATG GAGCAAATTA	240
TGCGGAATAA CGGTGGAAGA AGCAGCATAC GATCTTACGA ATCCCAAGGC TTATAAATTC	300
ACTGCCGAGA CATGTAGCCC GGATGTAAAA GGTGAAGGAC AAAAATACTC TATGGAAGAC	360
GTGATGAATT TCATGCGTTT ATCAAATCTG GATGTTAACG ACAAGATGCT GACGGAACAG	420
TGTTGGTCGC TGTCCAATTC ATGCGGTGAA TTGATCAACC CAGACGACAA AGGGCGATTC	480
GTGGCTCTCA CCTTTAAGGA CAGAGACACA GCTGATGACA CGGGTGCCGC CAACGTGGAA	540
TGTCGCGTGG GCGACTATCT AGTTTACGCT ATGTCCCTGT TTGAGCAGAG GACCCAAAAA	600
TCGCAGTCTG GCAACATCTC TCTGTACGAA AAGTACTGTG AATACATCAG GACCTACTTA	660
GGGAGTACAG ACCTGTTCTT CACAGCGCCG GACAGGATTC CGTTACTTAC GGGCATCCTA	720
TACGATTTTT GTAAGGAATA CAACGTTTTC TACTCGTCAT ATAAGAGAAA CGTCGATAAT	780
TTCAGATTCT TCTTGGCGAA TTATATGCCT TTGATATCTG ACGTCTTTGT CTTCCAGTGG	840
GTAAAACCCG CGCCGGATGT TCGGCTGCTT TTTGAGTTAA GTGCAGCGGA ACTAACGCTG	900
GAGGTTCCCA CACTGAGTTT GATAGATTCT CAAGTTGTGG TAGGTCATAT CTTAAGATAC	960
GTAGAATCCT ACACATCAGA TCCAGCCATC GACGCGTTAG AAGACAAACT GGAAGCGATA	1020
CTGAAAAGTA GCAATCCCCG TCTATCGACA GCGCAACTAT GGGTTGGTTT CTTTTGTTAC	1080
TATGGTGAGT TTCGTACGGC TCAAAGTAGA GTAGTGCAAA GACCAGGCGT ATACAAAACA	1140
CCTGACTCAG TGGGTGGATT TGAAATAAAC ATGAAAGATG TTGAGAAATT CTTCGATAAA	1200

CTTCAGAGAG AATTGCCTAA	TGTATCTTTG CGGCGTCAGT TTAACGGAGC TAGAGCGCAT	1260
GAGGCTTTCA AAATATTTAA	AAACGGAAAT ATAAGTTTCA GACCTATATC GCGTTTAAAC	1320
GTGCCTAGAG AGTTCTGGTA	TCTGAACATA GACTACTTCA GGCACGCGAA TAGGTCCGGG	1380
TTAACCGAAG AAGAAATACT	CATCCTAAAC AACATAAGCG TTGATGTTAG GAAGTTATGC	1440
GCTGAGAGAG CGTGCAATAC	CCTACCTAGC GCGAAGCGCT TTAGTAAAAA TCATAAGAGT	1500
AATATACAAT CATCACGCCA	AGAGCGGAGG ATTAAAGACC CATTGGTAGT CCTGAAAGAC	1560
ACTTTATATG AGTTCCAACA	CAAGCGTGCC GGTTGGGGGT CTCGAAGCAC TCGAGACCTC	1620
GGGAGTCGTG CTGACCACGC	GAAAGGAAGC GGTTGA	1656

A 90 kDa hősokk fehérje a 11. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met Ser Asn Tyr Ser Trp Glu Ser 15

Ala Asp Trp Lys Lys Tyr Leu Ser 20

Glu Ile Lys Thr Leu Pro Asp Ile 354Q

Lys Lys Ser Glu Phe Glu Ser Alá 5055

Leu Gly Leu Phe Ile Leu Ser Glu 6570

Leu Phe Lys Lys Phe Tyr Gly Glu 1015

Arg Ser lie Ala Alá His Ser Ser 2530

Arg Leu Tyr Gly Gly Arg Val Val 45

Leu Pro Asn Ser Phe Glu Gin Glu 60

Arg Glu Val Gly Trp Ser Lys Leu 75 80

Cys Gly lie Thr Val Glu Glu Alá 85

Ala Tyr Lys Phe Thr Alá Glu Thr 100

Gly Gin Lys Tyr Ser Met Glu Asp 115 '120

Asn Leu Asp Val Asn Asp Lys Met 130135

Ser Asn Ser Cys Gly Glu Leu Ile 145150

Val Alá Leu Thr Phe Lys Asp Arg 165

Alá Asn Val Glu Cys Arg Val Gly 180

Alá Tyr Asp Leu Thr Asn Pro Lys 90 95

Cys Ser Pro Asp Val Lys Gly Glu 105 110

Val Met Asn Phe Met Arg Leu Ser 125

Leu Thr Glu Gin Cys Trp Ser Leu 140

Asn Pro Asp Asp Lys Gly Arg Phe 155160

Asp Thr Ala Asp Asp Thr Gly Alá 170175

Asp Tyr Leu Val Tyr Ala Met Ser 185190 • ··· «·· ··· ··· · r· * «*· « **t

Leu Phe Glu Gin Arg Thr Gin Lys 195zoo

Tyr Glu Lys Tyr Cys Glu Tyr lie ²¹⁰215

Leu Phe Phe Thr Ala Pro Asp Arg ²²⁵230

Tyr Asp Phe Cys Lys Glu Tyr Asn 245

Asn Val Asp Asn Phe Arg Phe Phe 260

Ser Asp Val Phe Val Phe Gin Trp ²⁷5280

Leu Leu Phe Glu Leu Ser Ala Ala 290

Leu Ser Leu lie Asp Ser Gin Val ³⁰⁵310

Val Glu Ser Tyr Thr Ser Asp Pro 325

Leu Glu Ala lie Leu Lys Ser Ser 340

Leu Trp Val Gly Phe Phe Cys Tvr ³⁵5360

Ser Arg Val Val Gin Arg Pro Glv 370375

Gly Gly Phe Glu lie Asn Met Lys ³⁸⁵390

Ser Gin Ser Gly Asn Il_e Ser Leu 205

Arg Thr Tyr Leu Gly Ser Thr Asp 220 lie Pro Leu Leu Thr Gly n_e L_eu 235240

Val Phe Tyr Ser Ser Tyr Lys Ara

250

Leu Ala Asn Tyr Met Pro Leu lie 265

Val Lys Pro Ala Pro Asp Val Arg 285

Glu Leu Thr Leu Glu Val Pro Thr 300

Val Val Gly His lie Leu Arg Tyr 315320

Ala lie Asp Ala Leu Glu Asp Lvs 330335

Asn Pro Arg Leu Ser Thr Ala Gin 345350

Tyr Gly Glu Phe Arg Thr Ala Gin 365

Val Tyr Lys Thr Pro Asp Ser Val 380

Asp Val Glu Lys Phe Phe Asp Lys 395 400

Leu Gin Arg Glu Leu Pro Asn Val 405

Ala Arg Ala His Glu Ala Phe Lys 420

Phe Arg Pro lie Ser Arg Leu Asn 435440

Asn lie Asp Tyr Phe Arg His Ala 45045

Glu lie Leu lie Leu Asn Asn lie 465470

Ala Glu Arg Ala Cys Asn Thr Leu 485

Asn His Lys Ser Asn Ile Gin Ser 500

Asp Pro Leu Val Val Leu Lys Asp ⁵¹⁵520

Ser Leu Arg Arg Gin Phe Asn Gly 410415 lie Phe Lys Asn Gly Asn lie Ser

425430

Val Pro Arg Glu Phe Trp Tyr Leu 445

Asn Arg Ser Gly Leu Thr Glu Glu 460

Ser Val Asp Val Arg Lys Leu Cys

475480

Pro Ser Ala Lys Arg Phe Ser Lys 490495

Ser Arg Gin Glu Arg Arg lie Lys 505510

Thr Leu Tyr Glu Phe Gin His Lys 525

Arg

Ala Gly Trp Gly Ser Arg Ser Thr Arg Asp Leu Gly Ser Arg Ala ⁵³⁰ 535 540

Asp His Ala Lys Gly Ser Gly ⁵⁴³ 550 és molekulatömege körülbelül 61 és körülbelül 65 kDa között van, előnyösen körülbelül 63 kDa.

Egy ismét másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF5) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 12844-13515. nukleotidjait és egy divergálódott burokfehérjét kódol. Ez a DNS-molekula a 12. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ATGAGTTCCA ACACAAGCGT GCCGGTTGGG GGTCTCGAAG CACTCGAGAC CTCGGGAGTC	60
GTGCTGACCA CGCGAAAGGA AGCGGTTGAT AAGTTTTTTA ATGAACTAAA AAACGAAAAT	120
TACTCATCAG TTGACAGCAG CCGATTAAGC GATTCGGAAG TAAAAGAAGT GTTAGAGAAA	180
AGTAAAGAAA GTTTCAAAAG CGAACTGGCC TCCACTGACG AGCACTTCGT CTACCACATT	240
ATATTTTTCT TAATCCGATG TGCTAAGATA TCGACAAGTG AAAAGGTGAA GTACGTTGGT	300
AGTCATACGT ACGTGGTCGA CGGAAAAACG TACACCGTTC TTGACGCTTG GGTATTCAAC	360
ATGATGAAAA GTCTCACGAA GAAGTACAAA CGAGTGAATG GTCTGCGTGC GTTCTGTTGC	420
GCGTGCGAAG ATCTATATCT AACCGTCGCA CCAATAATGT CAGAACGCTT TAAGACTAAA	480
GCCGTAGGGA TGAAAGGTTT GCCTGTTGGA AAGGAATACT TAGGCGCCGA CTTTCTTTCG	540
GGAACTAGCA AACTGATGAG CGATCACGAC AGGGCGGTCT CCATCGTTGC AGCGAAAAAC	600
GCTGTCGATC GTAGCGCTTT CACGGGTGGG GAGAGAAAGA TAGTTAGTTT GTATGATCTA GGGAGGTACT AA '	660

672

A divergálódott burokfehérje a 13. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met Ser Ser Asn Thr Ser Vai Pro 15

Thr Ser Gly Vai Vai Leu Thr Thr 20

Phe Asn Glu Leu Lys Asn Glu Asn 3540

Leu Ser Asp Ser Glu Vai Lys Glu 5055

Phe Lys Ser Glu Leu Ala Ser Thr 6570 lie Phe Phe Leu lie Arg Cys Ala 85

Lys Tyr Vai Gly Ser His Thr Tyr 100

Vai Leu Asp Ala Trp Vai Phe Asn 115120

Tyr Lys Arg Vai Asn Gly Leu Arg 130135

Leu Tyr Leu Thr Vai Ala Pro lie 145150

Ala Vai Gly Met Lys Gly Leu Pro 165

Asp Phe Leu Ser Gly Thr Ser Lys 180

Vai Ser lie Vai Ala Ala Lys Asn 195200

Gly Gly Glu Arg Lys lie Vai Ser 210215

Vai Gly Gly Leu Glu Ala Leu Glu 1015

Arg Lys Glu Ala Vai Asp Lys Phe 2530

Tyr Ser Ser Vai Asp Ser Ser Arg 45

Vai Leu Glu Lys Ser Lys Glu Ser 60

Asp Glu His Phe Vai Tyr His lie 7580

Lys lie Ser Thr Ser Glu Lys Vai 9095

Vai Vai Asp Gly Lys Thr Tyr Thr 105110

Met Met Lys Ser Leu Thr Lys Lys 125

Ala Phe Cys Cys Ala Cys Glu Asp 140

Met Ser Glu Arg Phe Lys Thr Lys 155160

Vai Gly Lys Glu Tyr Leu Gly Ala 170175

Leu Met Ser Asp His Asp Arg Ala 185190

Ala Vai Asp Arg Ser Ala Phe Thr 205

Leu Tyr Asp Leu Gly Arg Tyr 220 és molekulatömege körülbelül 23 és körülbelül 27 kDa között van, előnyösen körülbelül 25 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF6) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 1358414180. nukleotidjait és egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus burokfehérjét kódol. Ez a DNS-molekula a 14. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

A burokfehérje a 15. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

ATGGAGTTGA	TGTCCGACAG	CAACCTTAGC	AACCTGGTGA	TAACCGACGC	CTCTAGTCTA	60
AATGGTGTCG	ACAAGAAGCT	TTTATCTGCT	GAAGTTGAAA	AAATGTTGGT	GCAGAAAGGG	120
GCTCCTAACG	AGGGTATAGA	AGTGGTGTTC	GGTCTACTCC	TTTACGCACT	CGCGGCAAGA	180
ACCACGTCTC	CTAAGGTTCA	GCGCGCAGAT	TCAGACGTTA	TATTTTCAAA	TAGTTTCGGA	240
GAGAGGAATG	TGGTAGTAAC	AGAGGGTGAC	CTTAAGAAGG	TACTCGACGG	GTGTGCGCCT	300
CTCACTAGGT	TCACTAATAA	ACTTAGAACG	TTCGGTCGTA	CTTTCACTGA	GGCTTACGTT	360
GACTTTTGTA	TCGCGTATAA	GCACAAATTA	CCCCAACTCA	ACGCCGCGGC	GGAATTGGGG	420
ATTCCAGCTG	AAGATTCGTA	CTTAGCTGCA	GATTTTCTGG	GTACTTGCCC	GAAGCTCTCT	480
GAATTACAGC	AAAGTAGGAA	GATGTTCGCG	AGTATGTACG	CTCTAAAAAC	TGAAGGTGGA	540
GTGGTAAATA	CACCAGTGAG	CAATCTGCGT	CAGCTAGGTA	GAAGGGAAGT	TATGTAA	597

A burokfehérje a 15. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met 1

: Glu

i Let

i Met

. Sei 5

• Asp Ser Asn

i Let

i Ser 10

’ Asr

i Let

i Val

Ile

Thr 15

Asp

Ala

. Ser

Ser

’ Leu 20

Asn

Gly Val

Asp

Lys 25

Lys

Let

i Leu

i Ser

Alá 30

Glu

Val

Glu

Lys

Met 35

Leu

Val

Gin

Lys

Gly 40

Alá

Pro

Asn

i Glu

Gly 45

Ile

Glu

Val

Val

Phe 50

Gly

Leu

Leu

Leu

Tyr 55

Alá

Leu

Alá

Alá

Arg 60

Thr

Thr

Ser

Pro

Lys 65

Val

Gin

Arg

Alá

Asp 70

Ser

Asp

Val

He

Phe 75

Ser

Asn

Ser

Phe

Gly 80

Glu

Arg

Asn

Val

Val 85

Val

Thr

Glu

Gly

Asp 90

Leu

Lys

Lys

Val

Leu 95

Asp

Gly

Cys

Alá

Pro 100

Leu

Thr

Arg

Phe

Thr 105

Asn

Lys

Leu

Arg

Thr 110

Phe

Gly

Arg

Thr

Phe 115

Thr

Glu

Alá

Tyr

Val . 120

Asp

Phe

Cys

He

Alá 125

Tyr

Lys

His

Lys

Leu 130

Pro i

Gin :

Leu .

Asn

Alá , 135

Alá j

Ma

Glu :

Leu

Gly 140

He

Pro .

Ma

Glu

Asp Ser Tyr Lee Ala Ala Asp Phe Leu Gly Thr Cys Pro Lys

Leu Ser

160

Glu Leu Gin Gin Ser Arg Lys _Met Phe Ala Ser Met Tyr Ala Leu Lys 1 Da π η λ *

170

Thr Glu Gly Gly Val Val Asn Thr Pro Val Ser Asn

Leu Arg Gin Leu 190

185

Gly Arg Arg Glu Val Met 195 és molekulatömege körülbelül 20 és körülbelül 24 kDa között van, előnyösen körülbelül 22 kDa.

Egy másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 0RF7) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 1418014665. nukleotidjait és egy második meghatározatlan szőlőnövény- levélsodródást okozó vírus fehérjét vagy polipeptidet kódol. Ez a DNS—molekula a 16. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ATGGAAGATT ACGAAGAAAA ATCCGAATCG CTCATACTGC TACGCACGAA TCTGAACACT60

ATGCTTTTAG TGGTCAAGTC CGATGCTAGT GTAGAGCTGC CTAAACTACT AATTTGCGGT120

TACTTACGAG TGTCAGGACG TGGGGAGGTG ACGTGTTGCA ACCGTGAGGA ATTAACAAGA180

GATTTTGAGG GCAATCATCA TACGGTGATC CGTTCTAGAA TCATACAATA TGACAGCGAG24 0

TCTGCTTTTG AGGAATTCAA CAACTCTGAT TGCGTAGTGA AGTTTTTCCT AGAGACTGGT300

AGTGTCTTTT GGTTTTTCCT TCGAAGTGAA ACCAAAGGTA GAGCGGTGCG ACATTTGCGC360

ACCTTCTTCG AAGCTAACAA TTTCTTCTTT GGATCGCATT GCGGTACCAT GGAGTATTGT420

TTGAAGCAGG TACTAACTGA AACTGAATCT ATAATCGATT CTTTTTGCGA AGAAAGAAAT480

CGTTAA

A második meghatározatlan szőlőnövény—levélsodródást okozó vírus fehérje vagy polipeptid a 17. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő levezetett aminosav szék—' venciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met Glu 1

Asn Leu

Leu Pro

Glu Val 50

Asn His 65

Ser Alá

Leu Glu

Gly Arg

Phe Phe 130

Leu Thr 145

Arg

Tyr Glu 5

Thr Met 20

Leu Leu

Cys Cys

Thr Val

Glu Glu 85

Gly Ser 100

Val

Asp

Asn

Lys 35

Thr

His

Phe

Thr

Alá 115

Gly Ser

Glu Thr

Glu

Leu

Ile

Asn

Ile 70

Phe

Val

Arg His

His Cys

Glu Ser

150

Lys

Leu

Cys

Arg 55

Arg

Asn

Phe

Leu Arg

120

Gly Thr 135

Ile Ile

Ser Glu Ser 10

Val Val Lys 25

Gly Tyr Leu 40

Glu Glu Leu

Ser Arg Ile

Asn Ser Asp 90

Trp Phe Phe

Leu Ile

105

Thr Phe

Met Glu

Asp Ser

Ser Asp

Arg Val

Thr Arg 60

Ile Gin 75

Cys Val

Leu Arg

Phe Glu

Tyr Cys 140

Phe Cys 155

Leu Arg Thr 15

Ser Val Glu 30

Gly Arg Gly

Leu

Alá

Ser 45

Asp Phe

Tyr Asp

Val Lys

Ser Glu

110

Alá Asn 125

Leu Lys

Glu Glu

Glu Gly

Ser Glu 80

Phe Phe 95

Thr Lys

Asn Phe

Gin Val

Arg Asn 160 és molekulatömege körülbelül 17 és körülbelül 21 kDa között van, előnyösen körülbelül 19 kDa.

Egy ismét másik ilyen DNS-molekula (GLRaV-2 ORF8) magába foglalja az 1. azonosítási szán szerinti szekvencia 14667-15284. nukleotidjait és egy harmadik meghatározatlan szölönövény-levélsodródást okozó virus fehérjét vagy polipeptidet kódol. Ez a DNS-molekula a 18. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alabbiak szerint:

ATGAGGGTTA TAGTGTCTCC TTATGAAGCT GAAGACATTC TGAAAAGATC GACTGACATG

TTACGAAACA TAGACAGTGG GGTCTTGAGC ACTAAAGAAT GTATCAAGGC ATTCTCGACG

ATAACGCGAG ACCTACATTG TGCGAAGGCT TCCTACCAGT GGGGTGTTGA CACTGGGTTA1B0

TATCAGCGTA ATTGCGCTGA AAAACGTTTA ATTGACACGG TGGAGTCAAA CATACGGTTG240

GCTCAACCTC TCGTGCGTGA AAAAGTGGCG GTTCATTTTT GTAAGGATGA ACCAAAAGAG300

CTAGTAGCAT TCATCACGCG AAAGTACGTG GAACTCACGG GCGTGGGAGT GAGAGAAGCG360

GTGAAGAGGG AAATGCGCTC TCTTACCAAA ACAGTTTTAA ATAAAATGTC TTTGGAAATG420

GCGTTTTACA TGTCACCACG AGCGTGGAAA AACGCTGAAT GGTTAGAACT AAAATTTTCA480

CCTGTGAAAA TCTTTAGAGA TCTGCTATTA GACGTGGAAA CGCTCAACGA ATTGTGCGCC540

GAAGATGATG TTCACGTCGA CAAAGTAAAT GAGAATGGGG ACGAAAATCA CGACCTCGAA 600

CTCCAAGACG AATGTTAA

A harmadik meghatározatlan fehérje vagy polipeptid a 19. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő levezetett aminosav szekvenciával rendelkezik, az alábbiak szerint:

Met Arg Val Ile Val Ser Pro Tyr 15

Ser Thr Asp Met Leu Arg Asn Ile 20

Glu Cys lie Lys Alá Phe Ser Thr 3540

Glu Alá Glu Asp Ile Leu Lys Arg 1015

Asp Ser Gly Val Leu Ser Thr Lys 2530 lie Thr Arg Asp Leu His Cys Alá 45

Lys Alá Ser Tyr Gin Trp Gly Val 50 55

Cys Alá Glu Lys Arg Leu Ile Asp 65 70

Alá Gin Pro Leu Val Arg Glu Lys 85

Glu Pro Lys Glu Leu Val Alá Phe 100

Thr Gly Val Gly Val Arg Glu Alá

115120

Thr Lys Thr Val Leu Asn Lys Met 130135

Ser Pro Arg Ala Trp Lys Asn Alá 145iso

Pro Val Lys Ile Phe Arg Asp Leu 165

Asp Thr Gly Leu Tyr Gin Arg Asn 60

Thr Val Glu Ser Asn Ile Arg Leu ⁷⁵80

Val Alá Val His Phe Cys Lys Asp 90

Ile Thr Arg Lys Tyr Val Glu Leu ¹⁰⁵110

Val Lys Arg Glu Met Arg Ser Leu 125

Ser Leu Glu Met Ala Phe Tyr Met 140

Glu Trp Leu Glu Leu Lys Phe Ser ¹⁵5 160

Leu Leu Asp Val Glu Thr Leu Asn 170 175

- 56 Glu Leu Cys Ala Glu Asp Asp Vai His Vai Asp Lys Vai Asn Glu Asn 180 185 190

Gly Asp Glu Asn His Asp Leu Glu Leu Gin Asp Glu Cys 195 200 205 és molekulatömege körülbelül 22 és körülbelül 26 kDa között van, előnyösen körülbelül 24 kDa.

Egy másik, találmány szerinti DNS-molekula (GLRaV-2 3'UTR) magába foglalja az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia 15285-15500. nukleotidjait és a 23. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:

ACATTGGTTA AGTTTAACGA AAATGATTAG

TAAATAATAA

ATCGAACGTG

GGTGTATCTA

CCTGACGTAT

CAACTTAAGC

TGTTACTGAG

TAATTAAACC

AACAAGTGTT

GGTGTAATGT

120

GTATGTTGAT

GTAGAGAAAA

ATCCGTTTGT

AGAACGGTGT

TTTTCTCTTC

TTTATTTTTA

180

ΑΑΑΑΑΑΑΆΑΤ

ΑΑΑΆΑΑΑΑΑΆ

AAAAAAAAGC

GGCCGC

216 találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-molekulák fragmensei is. A szőlőnövény-levélsodródással szembeni ellenálló képességet szőlőnövényekre történő átvitelére képes fragmensek megszerkesztéséhez a megfelelő restrikciós helyeket - ezeket a DNS-molekula szekvencia vizsgálata tárja fel - alkalmazzuk, hogy: (i) interpozont illesszünk be - [Felley és mtsai.: Gene 52 147 (1987) ; amely publikáció teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő] - oly módon, hogy a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus burok polipeptid vagy fehérje lerövidített formáit hozhatjuk létre, amelyekben a Cterminálisról különböző hosszúságú darabok hiányoznak; vagy (ii) a fehérje különböző hosszúságú belső részeit töröljük.

Alternatív módon a szekvencia alkalmazható a kódoló régió bármely részének amplifikálására oly módon, hogy a transzkripciós és transzlációs start szignálokat egyaránt biztosító vektorba klónozható.

Megfelelő DNS-molekuláknak tekinthetők azok, amelyek az 1. azonosítási szám szerinti szekvenciából legalább 15, egymást követő bázisból álló nukleotid szekvenciával rendelkező DNS-molekulával hibridizálni képesek sztringens körülmények között, amelyet 0,9 M nátrium-citrát puffért (SSC) tartalmazó hibridizációs puffer jellemez 37 °C hőmérsékleten, és a kötődés fennmarad az SSC pufferrel, 37 °C-on történő mosás során; és előnyösen olyan körülmények között, amelyet 20% formamidot, 0,9 M fiziológiás sóoldat/0,9 M SSC puffért tartalmazó hibridizációs puffer jellemez 42 °C hőmérsékleten, és a kötődés fennmarad a 0,2x SSC pufferrel, 42 °C-on történő mosás során.

A variánsok úgyszintén (vagy alternatív módon) módosíthatók például nukleotidok deléciójával vagy hozzáadásával, amelyeknek minimális hatása van a kódolt polipeptid tulajdonságaira, szekunder struktúrájára és hidropátiás természetére. így például egy polipeptidet kódoló nukleotidok konjugálhatók egy szignál (vagy vezető) szekvenciához a fehérje N-terminális végén, amely ko-transzlációsan vagy poszt-transzlációsan irányítja a fehérje szállítását. A nukleotid szekvencia megváltoztatható oly módon is, hogy a kódolt polipeptidet egy linkerhez vagy más szekvenciához konjugáljuk a szintézis, tisztítás vagy a polipeptid azonosításának megkönnyítése céljából.

Ά. találmány szerinti fehérjét vagy polipeptidet előnyösen tisztított formában állítjuk elő (előnyösen legalább körülbelül 80%-os, előnyösebben 90%-os tisztaságban) hagyományos módszerek segítségével. Tipikus esetben a találmány szerinti fehérjét vagy polipeptidet lízis és szonikálás segítségével izoláljuk. Mosást követően a lizátum üledékét Trisz-HCl-t tartalmazó pufferben újra szuszpendáljuk. Dialízis során ebből a fehérje oldatból csapadék válik ki. Az oldatot lecentrifugáljuk és az üledéket mossuk, majd a Trisz-HCl-t tartalmazó pufferben újra szuszpendáljuk. A fehérjéket elektroforézis segítségével választjuk el SDS-t tartalmazó 12%-os poliakrilamid gélen.

A találmány szerinti szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNSmolekula beépíthető sejtekbe hagyományos rekombináns DNSmódszerek alkalmazásával. Általánosságban ez magába foglalja a DNS-molekula beillesztését egy expressziós rendszerbe, amelyhez képest a DNS-molekula heterológ (azaz normál körülmények között nem található meg benne). A heterológ DNSmolekulát a helyes szensz irányításban és a korrekt leolvasási fázisban illesztjük be az expressziós rendszerbe vagy a vektorba. A vektor tartalmazza a beillesztett fehérjekódoló szekvenciák transzkripciójához és a transzlációjához szükséges elemeket.

Cohen és Boyer 4,237,224 lajstromszámú US szabadalma amely teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő írja le az expressziós rendszerek előállítását rekombináns plazmidok formájában, restrikciós enzimes hasítást és DNS59 ligázzal történő ligálást alkalmazva. Ezeket a rekombináns plazmidokat ezután transzformálás útján juttatjuk be és egysejtű tenyészetekben replikáljuk, beleértve prokarióta organizmusokat és szövettenyészetben nevelt eukarióta sejteket .

A rekombináns gének vírusokba is bejuttathatok, mint például a vaccinia vírus. Rekombináns vírusok állíthatók elő oly módon, hogy plazmidokat transzfektálunk vírussal fertőzött sejtekbe.

A megfelelő vektorok közé tartoznak - nem korlátozó értelemben véve - a következő vírusvektorok: gtll, gtWES.tb, Charon-4 lambda vektor rendszerek, és az alább következő plazmid vektorok, mint például: pBR322, pBR325, pACYC177, PACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339,pR290, pKC37, pKCIOl, SV 40, pBluescript II SK +/- vagy KS +/- (lásd például: Stratagene Cloning Systems katalógus (1993), Stratagene, La Jolla, Kalifornia; amely hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő), a pQE, pIH821, pGEX, pET sorozatok (lásd például: Studier és mtsai.: Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes, Gene Expression Technology 185 (1990); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő), valamint ezek bármely származéka. A rekombináns molekulák bejuttathatok sejtekbe transzformáció, transzdukció, konjugáció, mobilizáció vagy elektroporáció segítségével. A DNS-szekvenciák a vektorba a technika állása szerint ismert standard klónozó eljárások segítségével klónozhatok, ahogyan ez leírásra került: Maniatis és mtsai.: Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold. Springs Harbor, New York (1982); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.

Gazda-vektor rendszerek széles skálája alkalmazható a fehérjét kódoló szekvencia(szekvenciák) expresszálására. Elsődlegesen a vektor rendszer kompatibilis kell legyen az alkalmazott gazdasejttel. A gazda-vektor rendszerek nem korlátozó értelemben magukba foglalják az alább következőket: bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel vagy kozmid DNSsel transzformált baktériumok; mikroorganizmusok, mint például élesztő vektorokat tartalmazó élesztő; vírussal fertőzött emlős sejtrendszerek (például vaccinia vírus, adenovirus, stb.); és baktériummal fertőzött, vagy részecske bombázással (mint például biolisztikumok) transzformált növényi sejtek. Ezen vektorok expressziós elemei változhatnak erősségükben és specifitásukban. Az alkalmazott gazdavektor rendszertől függően számos megfelelő transzkripciós és transzlációs elem bármelyike alkalmazható.

A különböző genetikai szignálok és feldolgozási események a génexpresszió sok szintjét szabályozzák (mint például a DNS transzkripciója és a hírvivő RNS (mRNS) transzlációja) .

A DNS transzkripciója függ egy promoter jelenlététől, egy olyan DNS-szekvenciától, ami irányítja az RNS-polimeráz kötődését és ezáltal elősegíti a mRNS szintézist. Az eukarióta promóterek DNS szekvenciái különböznek a prokarióta promóterek szekvenciáitól. Továbbá elképzelhető, hogy az eukarióta promótereket és a hozzájuk kapcsolódó genetikai

- 61 szignálokat egy prokarióta rendszer nem ismeri fel, vagy nem működnek egy prokarióta rendszerben és továbbá a prokarióta promótereket nem ismerik fel az eukarióta sejtek és nem működnek eukarióta sejtekben.

Hasonlóképpen a mRNS transzlációja prokariótákban függ a megfelelő prokarióta szignálok jelenlététől, amely szignálok eltérnek az eukariótákban előforduló szignáloktól. A mRNS hatékony transzlációjához prokariótákban szükséges egy riboszóma kötő hely, amit a mRNS-en Shine-Dalgarno (SD) szekvenciának nevezünk. Ez a szekvencia a mRNS egy rövid nukleotid szekvenciája, amely a start kodon - rendszerint AUG, amely a fehérje amino-terminális metioninját kódolja előtt helyezkedik el. Az SD-szekvenciák komplementerek a 16S rRNS (riboszómális RNS) 3'-végével és feltételezhetően oly módon segítik elő a mRNS kötődését a riboszómákhoz, hogy az rRNS-sel duplexet képeznek és ezzel lehetővé teszik a riboszóma megfelelő elhelyezkedését. A génexpresszió maximalizálásának irodalmi összefoglalását lásd: Roberts és Lauer: Methods in Enzymology 68 473 (1979); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanitás részeként tekintendő .

A promóterek változhatnak erősségükben (azaz azon képességükben, hogy elősegítik a transzkripciót). Egy klónozott gén expressziója kiváltására kívánatos erős promótereket alkalmazni annak érdekében, hogy magas szintű transzkripciót érjünk el és ennél fogva a gén magas szintű expresszióját váltsuk ki. Az alkalmazott gazdasejt rendszertől függően számos megfelelő promoter bármelyike alkalmaz ható. így például, amikor E. coli-ban végezzük a klónozást, annak bakteriofágjai vagy plazmidjai, olyan promóterek mint például a T7 fág promoter, lac promoter, trp promoter, recA promoter, riboszómális RNS promoter, a lambda colifág P_R és P_L promóterei, és nem korlátozó értelemben vett más promóterek, mint a lacUV5, ompF, bla, Ipp és más hasonlók alkalmazhatók, hogy a közvetlenül mellettük található DNSszegmensek magas szintű transzkripcióját irányítsák. Továbbá rekombináns DNS vagy más szintetikus DNS módszerekkel előállított hibrid trp-lacUV5 (tac) promoter vagy más E. coli promóterek alkalmazhatók a beillesztett gén transzkripciójának biztosítására.

Olyan bakteriális gazdasejt törzsek és expressziós vektorok választhatók ki, amelyek a promoter működését gátolják, míg specifikus indukcióra nem kerül sor. Egyes operonok esetében specifikus indukálószerek hozzáadása szükséges a beillesztett DNS hatékony transzkripciójához. így például a lac operon indukálható laktóz vagy IPTG (izopropil-tiobéta-D-galaktozid) hozzáadásával. Különböző további operonok - mint például trp, pro, stb. - eltérő szabályozás alá esnek.

Specifikus iniciációs szignálokra hasonlóképpen szükség van gének hatékony transzkripciójához és transzlációjához prokarióta sejtekben. Ezek a transzkripciós és transzlációs iniciációs szignálok változhatnak erősségükben, ahogyan ez - sorrendben megfeleltetve - mérhető a gén specifikus hírvivő RNS mennyiségével és a szintetizált fehérje mennyiségével. A promoter! tartalmazó DNS expressziós vektor tar talmazhatja különböző erős transzkripciós és/vagy transzlációs iniciációs szignálok bármely kombinációját is. így például E. coli-ban végrehajtandó hatékony transzlációhoz szükséges egy Shine-Dalgarno (SD) szekvencia, körülbelül 79 bázis távolságra 5'-irányban az iniciációs kodontól (ATG) - riboszóma kötődési hely biztosítására. így tehát bármely olyan SD-ATG kombináció alkalmazható, amelyet a gazdasejt riboszómák használni képesek. Ilyen kombinációk közé tartoznak - nem korlátozó értelemben véve - a colifág lambda N-génből vagy a cro génből származó SD-ATG kombináció, vagy az E. coli triptofán E, D, C, B vagy A génekből származó kombináció. Továbbá bármely olyan SD-ATG kombináció alkalmazható, amelyet szintetikus nukleotidok beépítését magába foglaló rekombináns DNS vagy más módszerek segítségével állítunk elő.

Miután a fentebb leírtak szerint a különböző szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjéket vagy polipeptideket kódoló DNS-molekulákat expressziós rendszerbe klónoztuk, ezzel beépíthetők lesznek gazdasejtbe. Az ilyen beépítést a fentebb leírtak szerint különböző transzformációs módokon hajthatjuk végre, a vektor/gazdasejt rendszertől függő módon. A megfelelő gazdasejtek nem korlátozó értelemben magukba foglalják a következőket: baktériumok, vírusok, élesztő, emlős sejtek, rovarsejtek, növényi sejtek és más hasonlók.

A találmány tárgyát képezik olyan RNS molekulák is, amelyek a fentebb leírt különböző szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjéket vagy polipeptideket kódolják. A transzkriptumok megszintetizálhatók a találmány szerinti gazdasejtek alkalmazásával, a hagyományos módszerek bármelyikének segítségével. A mRNS transzlálható akár in vitro vagy in vivo. Az alkalmazható sejtmentes rendszerek tipikus esetben tartalmazhatnak búzacsíra vagy retikulocita kivonatokat. Az in vivo transzláció például végrehajtható béka petesejtekbe történő mikroinjekció segítségével .

A találmány egy aspektusa szerint szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) különböző fehérjéit vagy polipeptidjeit kódoló fentebb leírt DNS-molekulákból egyet vagy többet alkalmazunk szőlőnövények transzformálására annak érdekében, hogy a növényekre szőlőnövény-levélsodródással szembeni rezisztenciát vigyünk át. Nem ismert az a mechanizmus, amellyel a rezisztencia átvitele történik. Egy hipotetikus mechanizmus szerint a transzformált növény képes szőlőnövény-levélsodródás vírus (2. típus) fehérjét vagy polipeptidet expresszálni és amikor a transzformált növényt beoltjuk szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal, mint például a GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5 vagy GLRaV-6 vírussal vagy ezek kombinációjával, a expreszszált fehérje vagy polipeptid megakadályozza a vírus DNS transzlációj át.

A találmány ezen aspektusa szerint a találmány tárgyát képező, a növénybe beépített DNS-molekula folyamatosan expresszálható. Alternatív módon eljárva az expressziót szabályozhatja egy promoter, amely szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus jelenléte esetében aktiválódik. Az ezen célra megfelelő promóterek magukba foglalják azokat amelyek szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus bejutására adott válaszként expresszióra kerülő génekből származnak.

A találmány szerinti izolált DNS-molekulák alkalmazhatók szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szembeni rezisztencia átvitelére a szőlőnövények széles skálája esetében. A DNS-molekulák különösen jól alkalmazhatók rezisztencia átvitelére Vitis oltványokra vagy gyökértörzs termesztési variánsok esetében. Az ily módon védhető oltvány termesztési variánsok közé tartoznak az alábbi, általános neveken ismert változatok: asztali- vagy mazsolaszőlők, mint például: Alden, Almeria, Anab-E-Shahi, Őszi Fekete, Beauty Magnélküli, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black Prince, Blackrose, Bronx Magnélküli, Burgrave, Calmeria, Korai Campbell, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier, Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Korai Muskotály, Emerald Magnélküli, Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame Magnélküli, Flame Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia, Júliusi Muskotály, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Laza Periette, Malaga, Monukka, Alexandriai Muskotály, Flame Muskotály, Hamburgi Muskotály, New York-i Muskotály, Niabell, Niagara, Olivette blanche, Ontario, Pierce, Queen, Vörös Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus, Rubint Magnélküli, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson Magnélküli és Thomuscat. Magába foglalja azokat is amelyeket bortermelésre alkalmaznak, mint például: Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao,

Aramon, Baco blanc (22A) , Burger, Cabernet franc, Cabernet, Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay, Chasselas dore, Chenin blanc, Clairette blanche, Korai Burgundi, Zöld Rizling, Szagos Fehér, Fernao Pires, Flora, French Colombard, Fresia, Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Szürke Rizling, Zöld Magyar, Zöld Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia, Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro, Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du Bordelais, Muskotály blanc, Muskotály Ottonel, Muskotály SaintVallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo Lampia, Orange Muskotály, Palomino, Pedro Ximenes, Petit Bouschet, Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot Saint-George, Primitivo di Gioa, Vörös Veltliner, Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubinvörös, Rubint Cabernet, Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese, Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel 5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao, Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepenas, Viognier, Walschriesling, Fehér Rizling és Zinfandel. Az ily módon védhető gyökértörzs termesztési változatok magukba foglalják a következőket: Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616, Couderc 3309, Dog Ridge, Foex 33 EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R #1), Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B, Millardet & de Grasset 420A, Millardet & de Grasset 101-14, Oppenheim 4 (S04), Paulsen 775, Paulsen 1045, Paulsen 1103, Richter 99, Rich

- 67 ·· · ter 110, Riparia Gloire, Ruggeri 225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis rupestris Constantia, Vitis California és Vitis girdiana.

Kiterjedt hasonlóság tapasztalható a GLRaV-2 és más closterovírusok - mint például a tristeza virus és a cékla sárgulást okozó virus - HSP70-rokon szekvencia régiói között. Ennek következtében a GLRaV-2 HSP70-rokon gén úgyszintén alkalmazható, hogy a szőlőtől különböző más transzgént hordozó növényeket vagy termesztési változatokat hozzunk létre - mint például citrus fajok vagy cukorrépa amelyek a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírustól különböző más closterovírusokkal szemben rezisztenciát mutatnak, mint például a tristeza vírussal és a cékla sárgulást okozó vírussal szemben.

A megfelelő citrus termesztési változatok magukba foglalják az alábbiakat: citrom, lime, narancs, grapefruit, pineapple, mandarin és más hasonlók, mint például az alábbiak: Joppa, Máltai Ovál, Parson (Parson Brown), Pera, Pineapple, Queen, Shamouti, Valencia, Tenerife, Imperial Doblefina, Washington Sanguine, Moro, Sanguinello Moscato, Spanyol Sanguinelli, Tarocco, Atwood, Australian, Bahia, Baiana, Cram, Dalmau, Eddy, Fisher, Frost Washington, Gillette LengNavelina, Washington, Satsuma Mandarin, Dancy, Robinson, Ponkan, Duncan, Marsh, Rózsaszín Marsh, Rubintvörös, Vörös Magnélküli, Seville Sima, Orlando Tangelo, Eureka, Lisbon, Meyer Citrom, Rücskös Citrom, Fanyar Narancs, Persian Lime, West Indian Lime, Bearss, Sweet Lime, Troyer Citrange és Citrus Trifoliata. Ezen citrus

- 68 - ::

·· · ·*···· ··· · * termesztési változatok mindegyike alkalmazható tristeza vírussal szemben rezisztens transzgént hordozó citrus növények előállítására.

A cukorrépa gazdaságilag fontos faja a Beta vulgaris L._r amelynek négy fontos termelési változata ismert: cukorrépa, étkezési cékla, marharépa és a mangold (Swiss chard). Ezen cékla termelési változatok mindegyike alkalmazható a fentebb leírtak szerint cékla sárgulást okozó vírussal szembeni rezisztenciával rendelkező transzgént hordozó céklanövények előállítására.

Annak következtében, hogy a GLRaV-2 vírusról ismert, hogy képes dohánynövényeket is megfertőzni (mint például Nicotiana benthamiana) , úgyszintén kívánatos olyan transzgént hordozó dohánynövények előállítása, amelyek rezisztensek szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szemben, mint például a GLRaV-2 vírussal szemben.

A transzformációra alkalmazható növényi szövetek közé tartoznak az alábbiak; levélszövet, gyökérszövet, merisztéma, zigóta és szomatikus eredetű embriók és portokok. Különösen előnyösen alkalmazhatók portok tenyészetekből nyert embriók.

A találmány szerinti expressziós rendszer alkalmazható gyakorlatilag bármely növényi szövet transzformálására megfelelő körülmények között. A találmány szerint transzformált szöveti sejtek in vitro növeszthetők megfelelő táptalajban, hogy átvigyük a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szembeni rezisztenciát. A transzformált sejtek teljes növénnyé regenerálhatok oly módon, hogy a fehérje vagy polipeptid rezisztenciát biztosít a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szemben a teljes transzgént hordozó növényekben. Mindegyik esetben a találmány szerinti rekombináns DNS expressziós rendszerrel transzformált sejteket növesztjük és kiváltjuk a DNS-molekula expresszióját, hogy a fentebb leírt szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus fehérjék vagy polipeptidek egyikét termelje és így szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szembeni rezisztenciát közvetítsen.

Transzgént hordozó növények előállításához a fentebb leírtak szerinti DNS-konstrukciót egy vektorban mikroinjektálhatjuk közvetlenül növényi sejtbe mikropipetták segítségével, hogy a rekombináns DNS-t mechanikai úton átvigyük [Crossway: Mol. Gen. Genetics 202 179 (1985); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő]. A genetikai anyag a növényi sejtbe polietilénglikol segítségével is bevihető [Krens és mtsai.: Nature 296 72 (1982) ; amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő].

A találmányi leírásnak megfelelően egy eljárás lehet növények transzformálására a DNS-molekulával, amikor az ilyen növények szövetét bakteriális eredetű oltóanyaggal érintkeztetjük, amely baktériumot a találmány szerinti gént tartalmazó vektorral transzformáljuk, amely gén szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal szembeni rezisztencia átvitelére képes. Általánosságban ezen eljárás keretében a növényi szövetet baktériumok szuszpenziójával oltjuk be és a szövetet 48-72 órán keresztül regeneráló táptalajon inku

ΊΟ báljuk antibiotikumok nélkül 25-28 °C-on.

Az Agrobacterium nemzetségből származó baktériumok alkalmazhatók növényi sejtek transzformálására. Az ilyen baktériumok megfelelő fajai közé tartoznak az Agrobacterium tumefaciens és az Agrobacterium rhizogenes fajok. Az Agrobacterium tumefaciens (mint például a C58, LBA4404 vagy EHA105 törzsek) különösen jól alkalmazható jól ismert növény transzformáló képessége alapján.

Heterológ genetikai szekvenciák juttathatók be megfelelő növényi sejtekbe az A. tumefaciens Ti-plazmidja vagy az A. rhizogenes Ri plazmidja segítségével. A Ti- vagy Riplazmid a növényi sejtekbe Agrobacterium fertőzés útján vihető át és stabilan beépül a növényi genomba [Schell: Science 237 1176 (1987); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő].

Transzformálás után a transzformált növényi sejteket regenerálni kell.

Tenyésztett protoplasztokból történő növény regenerálás került leírásra a következő irodalmi referenciákban: Evans és mtsai.: Handbook of Plant Cell Cultures I. kötet, MacMillan Publishing Co., New York, (1983) és I.R. Vasil (szerk.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, I. kötet, (1984) és III. kötet, (1986), amelyek teljes egészében a kitanítás részeként tekintendők.

Ismert, hogy gyakorlatilag az összes növény regenerálható tenyésztett sejtekből vagy szövetekből, nem korlátozó jelleggel beleértve az összes főbb cukornád, cukorrépa, gyapot, gyümölcsfa és hüvelyes fajokat.

A regenerációs módok fajról fajra változnak a növények esetében, de általánosságban először transzformált protoplasztok szuszpenzióját vagy explantátumokat tartalmazó Petri-lemezt állítunk elő. Kallusz szövet alakul ki és a kalluszból hajtások indukálhatok, majd ezt követően gyökereztethetők. Alternatív módon embrió kialakulása indukálható a kallusz szövetben. Ezek az embriók - mint természetes úton keletkezett embriók - csíráznak, hogy belőlük növények alakuljanak ki. A tenyésztáptalaj általánosságban különböző aminosavakat és hormonokat tartalmaz, mint például auxin és citokininek. Ugyancsak előnyös módon glutaminsav és prolin adható a táptalajhoz. A hatékony regeneráció függ a táptalajtól, a genotípustól és a tenyészet folyamatától. Amenynyiben ezt a három változót szabályozzuk, a regeneráció általánosságban reprodukálható és megismételhető.

Miután az expressziós kazettát stabil módon beépítettük transzgént hordozó növényekbe, további növényekbe szexuális úton történő keresztezések során átvihető. A számos standard nemesítési eljárás bármelyike alkalmazható a keresztezendő fajoktól függően.

Miután az ilyen típusú transzgént hordozó növényeket előállítottuk, a növények önmagukban termeszthetők hagyományos eljárás szerint, hogy a DNS konstrukció az eredményül kapott növényekben jelen legyen. Alternatív módon transzgént hordozó magokat gyűjtünk a transzgént hordozó növényekről. Ezeket a magokat ezután elültethetjük a talajba és hagyományos eljárásokat alkalmazva neveljük, hogy ezzel transzgént hordozó növényeket állítsunk elő.

Egy patogénekkel szembeni rezisztenciát biztosító génnel történő, növényi sejtek transzformálására szolgáló másik eljárás lehet a gazdasejt részecske bombázása (úgy is ismerjük, mint biolisztikus transzformáció). Ez számos út bármelyikével megvalósítható. Az első módon közömbös vagy biológiailag aktív részecskéket gyorsítunk fel és ezeket a sejtekre irányítjuk. Ezt az eljárást ismertetik Sanford és mtsai.: 4,945,050, 5,036,006 és 5,100,792 lajstromszámú US szabadalmai, valamint Emerschad és mtsai.: Plant Cell Reports 14 6 (1995); a továbbiakban mint: Emerschad, (1995); amely irodalmi hivatkozások mindegyike teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő. Általánosságban ez az eljárás magába foglalja közömbös vagy biológiailag aktív részecskék felgyorsítását és ezek sejtekre irányítását olyan körülmények között, amelyek hatékonyan biztosítják a sejt külső felszínén történő áthatolást és biztosítják, hogy annak belsejében beépülés történjen. Amikor inert részecskéket alkalmazunk, a vektor bejuttatható a sejtbe oly módon, hogy a részecskéket a heterológ DNS-t tartalmazó vektorral bevonjuk. Alternatív módon a célsejtet körülvehet jük a vektorral oly módon, hogy a vektor a sejtbe a részecske nyomán kerül be. Biológiailag aktív részecskék (azaz a vektort és a heterológ DNS-t tartalmazó szárított baktériumsejtek) hasonló módon bejuttathatok növényi sejtekbe.

Miután egy szőlőnövény szövetet, citrusnövény szövetet, céklanövény szövetet vagy dohánynövény szövetet a találmányi leírás szerint transzformálunk, a transzformált szőve tét regeneráljuk, hogy transzgént hordozó növényt hozzunk létre. Általánosságban a regenerálást úgy valósítjuk meg, hogy a transzformált szövetet tenyésztjük a megfelelő növekedés szabályozókat és tápanyagokat tartalmazó táptalajon, hogy lehetővé tegyük a hajtás merisztémák iniciálását. Megfelelő antibiotikumokat adunk a regenerációs táptalajhoz, hogy gátoljuk az Agrobacterium növekedését és szelektáljunk a transzformált sejtek kifejlődésére. A hajtás iniciálását követően lehetővé tesszük, hogy a hajtások szövettenyészetet hozzanak létre és a hajtásokat marker gén aktivitásra szkríneljük. A találmány szerinti DNS molekulákat képessé tehetjük arra, hogy átíródjanak olyan hírvivő RNS-be, amely - bár kódol ugyan egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérjét vagy polipeptidet - nem transzlálódik a fehérjébe. Ezt úgy ismerjük, mint RNS-közvetített rezisztencia. Amikor egy Vitis oltványt vagy gyökértörzs termesztési változatot, vagy citrus, cékla valamint dohány termesztési változatot ilyen DNS-molekulával transzformálunk, a DNS-molekula átírható olyan körülmények között, amelyek hatékonyan fenntartják a hírvivő RNS-t a növényi sejtben alacsony szintű denzitás értékek mellett. Előnyösen 15 és 50 közötti denzitás értékeket választunk Hewlett ScanJet készüléket és Image Analysis Programot alkalmazva.

A találmány szerinti egy vagy több DNS-molekula egy részét és hasonlóképpen más DNS-molekulákat alkalmazhatunk transzgént hordozó szőlőnövényben, citrusnövényben, céklanövényben vagy dohánynövényben a 09/025,635 sorozatszámú US szabadalmi bejelentésnek megfelelően, amely hivatkozás tel jes egészében a kitanítás részeként tekintendő.

A találmány szerinti szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) fehérje vagy polipeptid alkalmazható antitestek vagy azok kötő részeinek termeltetésére vagy próbákként. Az antitestek lehetnek monoklonális antitestek vagy poliklonális antitestek.

A monoklonális antitest termelés megvalósítható a technika állása szerint jól ismert eljárások alkalmazásával. Alapvetően az eljárás során először emlős (például egér) lépéből immunsejteket (limfocitákat) nyerünk, amely emlőst ezt megelőzően a kívánt antigénnel In vivo vagy in vitro immunizáljuk. Az antitestet szekretáló limfocitákat ezután (egér) mielóma sejtekkel vagy transzformált sejtekkel fuzionáljuk, amelyek korlátlanul képesek replikálódni sejtte— nyészetben és ezúton halhatatlan, immunglobulint szekretáló sejtvonalat állítunk elő. Az eredményül kapott fuzionált sejteket vagy hibridómákat tenyésztjük, és a kapott telepeket a kívánt monoklonális antitestek termelésére szkríneljük. Az ilyen antitesteket termelő telepeket klónozzuk és akár in vivo vagy in vitro növesztjük, hogy nagymennyiségű antitestet állítsunk elő. Az ilyen sejtek fúziójának elméleti alapjai és a gyakorlatban alkalmazható eljárások az alábbi irodalmi hivatkozásban kerültek leírásra: Kohler és Milstein: Nature 256 495 (1975); amely teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.

Az emlős limfocitákat az állat (például egér) a találmány szerinti fehérjével vagy polipeptiddel történő in vivo immunizációja során immunizáljuk. Az ilyen immunizációkat szükség szerint megismételjük, fel egészen néhány hetes időtartamokig, hogy az antitestek megfelelő titerét érjük el. Az utolsó antigén gyorsító-injekciót követően az állatokat feláldozzuk és a lépsejteket eltávolítjuk.

Emlős mielóma sejtekkel vagy más olyan fúziós partnerekkel történő fúzió, amelyek képesek korlátozás nélkül replikálódni sejttenyészetben, végrehajtható standard, és a technika állása szerint jól ismert eljárások segítségével, mint például polietilén-glikol (PEG) vagy más fúziós anyagok alkalmazásával [lásd például: Milstein és Kohler: Eur. J. Immunoi. 6 511 (1976); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő]. Ezt a halhatatlan sejtvonalat - amely előnyösen egér eredetű, de származhat más emlős fajok sejtjeiből, nem korlátozó jelleggel beleértve patkány és emberi eredetű sejteket - úgy választjuk ki, hogy bizonyos tápanyagok felhasználásához szükséges enzimekre nézve hiányos legyen, képes legyen gyors növekedésre és jó fúziós képességekkel rendelkezzen. A szakember számára sok ilyen ismert sejtvonal található, és rendszeresen leírásra kerülnek további sejtvonalak is.

Úgyszintén jól ismertek a poliklonális antitestek termelésére szolgáló eljárások. Tipikus esetben ilyen antitestek termeltethetek oly módon, hogy a találmány szerinti fehérjét vagy polipeptidet szubkután bejuttatjuk New Zealand fehér nyulakba, amelyeket ezt megelőzően először véreztettünk, hogy immunizálás előtti szérumot nyerjünk. Az antigének beadhatók injekciós helyenként 100 μΐ teljes térfogatban, hat különböző helyen. Mindegyik beinjektált mennyiség tartalmaz szintetikus felületaktív adjuváns hatású többszörös poliolokat, vagy az SDS-poliakrilamid gél elektroforézis után a fehérjét vagy polipeptidet tartalmazó elporított akrilamid gélt. A nyulakat ezután két hétre az első injekció után véreztetjük és ismétlődően ugyanazon antigén gyorsító injekcióit adjuk be három alkalommal hat hetes időközökben. Szérum mintát veszünk 10 nappal mindegyik gyorsító injekciót követően. Ezt követően a szérumból poliklonális antitesteket nyerünk affinitás kromatográfia segítségével, a megfelelő antigént alkalmazva az antitest megfogására. Végül a nyulakat túlaltatjuk 150 mg/kg pentobarbitállal intravénásán. Ez és más poliklonális antitestek termeltetésére alkalmas eljárások leírásra kerültek: Harlow és mtsai. (szerk.): Antibodies: A Laboratory Manual (1988); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.

A teljes antitestek alkalmazásán túl az ilyen antitestek kötő részei is alkalmazhatók. Ilyen kötő részek közé tartoznak a következők: Fab fragmensek, F(ab^,)₂ fragmensek és Fv fragmensek. Ezek az antitest fragmensek előállíthatok hagyományos eljárások segítségével, mint például proteolitikus fragmentációs eljárások segítségével, ahogyan ez leírásra került a következő publikációban: Goding: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, New York, Academic Press, 98-118. oldalak, (1983); amely teljes egészében a kitanitás részeként tekintendő.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan próbák, amelyek természetes körülmények között megtalálhatók, vagy akár szintetikusan előállíthatok rekombináns DNS eljárások segítségével vagy más biológiai eljárások segítségével. Megfelelő próbáknak tekinthetők az olyan molekulák, amelyek a találmány szerinti monoklonális antitestek által azonosított szőlőnövény-levélsodródást okozó (2. típus) vírus eredetű antigéneket megkötni képesek. Ilyen próbák lehetnek például fehérjék, peptidek, lektinek vagy nukleinsav próbák.

Az antitestek, vagy azok kötő részei vagy a próbák bejuttathatok szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal fertőzött termesztési változat oltványokba vagy gyökértörzs termesztési változatokba. Alternatív módon ezen antitesteknek legalább a kötő részei szekvenálhatók és az ezeket kódoló DNS megszintetizálható. A kódoló DNS-molekula alkalmazható növények transzformálására egy promóterrel együtt, amely a kódolt antitest expresszióját hozza létre amikor a növény szőlőnövény-levélsodródást okozó vírussal fertőződik. Bármelyik esetben az antitest vagy annak kötő része vagy a próba a vírushoz kötődik és segítséget nyújt a szokásos levélsodródási válasz megakadályozásában.

A találmány szerinti GLRaV-2 fehérjék vagy polípeptidek ellen termeltetett antitestek vagy ezen antitestek kötő részei alkalmazhatók egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus kimutatására alkalmas eljárásban szöveti mintában, mint például szőlőnövényből (azaz oltványból vagy gyökértörzsből) származó, vagy dohánynövényből származó szövetben. A kimutatási eljárásban alkalmazható antitestek vagy azok kötő részei magukba foglalják az alább következők ellen tér-

meltetett anyagokat: helikáz, metil-transzferáz, papainszerű proteáz, RNS-függő RNS-polimeráz, 70 kDa hősokk fehérje, 90 kDa hősokk fehérje, burokfehérje, divergált burokfehérje, vagy a találmány szerinti más fehérjék vagy polipeptidek. A mintának az antitesttel mutatott bármely reakcióját vizsgálati rendszer segítségével mutathatjuk ki, amely jelzi a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus jelenlétét a mintában. Különböző vizsgálati rendszerek alkalmazhatók, mint például enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálati módszerek, radioimmun vizsgálati módszerek, gél diffúziós precipitin reakciós vizsgálati módszerek, immundiffúziós vizsgálati módszerek, agglutinációs vizsgálati módszerek, fluoreszcens immunvizsgálati módszerek, protein-A immunvizsgálati módszerek vagy immun-elektroforézises vizsgálati módszerek.

Alternatív módon szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus kimutatható ilyen mintában a DNS—molekula vagy annak frag— mense nukleotid szekvenciáját alkalmazva, amely a találmány szerinti fehérjét vagy polipeptidet kódolja. A nukleotid szekvencia mint próba vihető be egy nukleinsav hibridizációs vizsgálati módszerbe vagy génamplifikációs kimutatási eljárásba (azaz például polimeráz láncreakciós eljárást alkalmazva) . A találmány szerinti nukleinsav próbák alkalmazhatók bármely, a technika állása szerint ismert nukleinsav hibridizációs vizsgálati eljárásban, nem korlátozó értelemben beleértve az alábbiakat: Southern-blot [Southern: J. Mól. Bioi. 98 503 (1975); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő], Northern-blot

- 79 [Thomas: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 5201 (1980); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanitás részeként tekintendő], valamint telep-hibridizációs biottok [Grunstein és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 3961 (1975); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő]. Alternatív módon a próbák alkalmazhatók génamplifikációs kimutatási eljárásban is (mint például polimeráz láncreakció során) [Erlich és mtsai.: Science 252 1643 (1991); amely irodalmi hivatkozás teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő]. A próbával létrejövő bármely reakciót úgy mutatjuk ki, hogy az jelezze szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus jelenlétét a mintában. Az ilyen kimutatás elősegíthető oly módon, hogy a találmány szerinti próbát jelöléssel látjuk el. Megfelelő jelölők közé tartozhatnak a következők: radioaktív vegyület, fluoreszcens vegyület, kemilumineszcenciás vegyület, enzimhatású vegyület, vagy más ezekkel egyenértékű nukleinsav j elölő.

A kimutatás kívánt körének megfelelően elképzelhető olyan próbák alkalmazása is, amelyek nukleotid szekvenciája megfelel az ORF vagy UTR konzervált vagy variábilis régióinak. így például annak érdekében, hogy megkülönböztessük egy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírust a többi rokon vírustól (például más closterovírusoktól) kívánatos, hogy olyan próbákat alkalmazzunk, amelyek az összes szőlőnövénylevélsodródást okozó vírusok között a nagyobb mértékben konzervált szekvenciáknak megfelelő nukleotid szekvenciákat tartalmaznak. Úgyszintén, annak érdekében, hogy különbséget

- 80 tegyünk különböző szőlőnövény-levélsodródást okozó vírusok között (azaz megkülönböztessük a GLRaV-2 vírust a GLRaV-1, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5 valamint GLRaV-6 vírusoktól) kívánatos, hogy olyan próbákat alkalmazzunk, amelyek a különböző szőlőnövény-levélsodródást okozó vírusok között a kisebb mértékben konzervált szekvenciáknak megfelelő nukleotid szekvenciákat tartalmaznak.

A találmány szerinti nukleinsav (DNS vagy RNS) próbák hibridizálnak a komplementer GLRaV-2 nukleinsavhoz sztringens körülmények között. Általánosságban a sztringens körülményeket úgy választjuk meg, hogy a hőmérséklet körülbelül 50 °C-kal alacsonyabb legyen, mint a termális olvadási pont (T_m) a specifikus szekvenciára, meghatározott ionerősségnél és pH értéknél. A T_m az a hőmérséklet (meghatározott ionerősségnél és pH értéknél) amelynél a célszekvencia 50%a hibridizál egy tökéletesen illeszkedő próbához. A T_m függ az oldatban fennálló körülményektől és a próba bázisösszetételétől és a következő képlet segítségével számítható ki:

T_m = 79,8 °C + (18, 5 x log[Na⁺] ) + (58,4 °C x %[G+C]) (820/#bp a duplexben) (0,5 x %formamid)

A nem-specifikus kötődések szabályozhatók a számos ismert módszer bármelyike segítségével, mint például a membrán blokkolása fehérjét tartalmazó oldatokkal, heterológ

RNS, DNS és SDS hozzáadásával a hibridizáló pufferhez, és

- 81 RN-ázzal történő kezeléssel. A mosási körülményeket tipikus esetben a sztringens feltételeknek megfelelő vagy azoknál alacsonyabb szinten választjuk meg. Általánosságban nukleinsav hibridizációs vizsgálati módszerekhez vagy gén amplifikálási kimutatási eljárások során megfelelő sztringens körülményeknek választhatjuk a fentebb leírt körülményeket. Ugyanakkor kevésbé vagy erősebben sztringens körülményeket is választhatunk.

Az alább következő példák csupán a találmány megvalósítási módjainak illusztrálását szolgálják és semmiféleképpen nem a találmány érvényességi körének korlátozását jelentik.

1. példa

Northern-hibridizáció

A kiválasztott kiónok specifitását Northern-hibridizációval igazoltuk. A Northern-hibridizációt GLRaV-2 dsRNS 1 %-os agaróz gében, nem denaturáló körülmények között végzett elektroforézise után végeztük. Az agaróz gélt 0,4 M NaCl tartalmú 50 mM NaOH oldatban történő 30 perces áztatással denaturáltuk, majd 0,5 M NaCl tartalmú 0,1 M TriszHC1 (pH 7,5) oldatban történő további 30 perces áztatással semlegesítettük. Az RNS-t éjszakán át szendvics-blottoltuk Genescreen™ plusz membránra (DuPont NEN Research Product) lOx SSC-pufferben és a gyártó (DuPont, NEN) utasításai sze rint hibridizáltuk.

2. példa

Szekvenálás és komputerrel támogatott nukleotid és aminosav szekvencia analízis

A DNS-inszerteket pBluescript SK+ plazmidban szekvenáltuk T3 és T7 univerzális printereket alkalmazva a terminális régió szekvenciára és további oligonukleotid primereket terveztünk a belső régió szekvencia ismert szekvenciája alapján. A plazmid DNS tisztítását a gyártó által (Applied Biosystems, Inc.) ismertetett módosított mini alkalikus lízis/PEG precipitációs eljárással végeztük. A nukleotid szekvenálást a cDNS mindkét szálán elvégeztük az ABI TaqDyeDeoxy Terminator Cycle szekvenáló reagenskészlet (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával. Az automata szekvenálást ABI373 automatizált szekvenátoron (Applied Biosystems, Inc.) végeztük a Cornell Egyetemen (Geneva, New York).

A GLRaV-2 nukleotid szekvenciáit - sorrendben megfeleltetve - a DNASTAR csomag (Madison, WI) EditSeq és SeqMan programjaival állítottuk össze és analizáltuk. A nukleotid szekvenciákból következtethető aminosav szekvenciákat és az azokat kódoló nyílt leolvasási fázisokat a MapDraw program segítségével származtattuk. Az aminosav szekvenciák többszörös összeillesztését, a konszenzus aminosav szekvenciák azonosítását és filogenetikus fák létrehozását a MegAlign programban található Clustal eljárással végeztük. A további closterovírusok nukleotid és aminosav szekvenciáit az Entrez Program segítségével nyertük, és a nem-redundáns adatbázisokkal végzett szekvencia összehasonlításokat a

National Center for Biotechnology Information-tól származó Blast Programmal történő kereséssel végeztük.

3. példa dsRNS izolálása Számos GLRaV-2 fertőzött Vitis vinifera cv Pinot Noir hajtás - amelyek egy New York állam központi részén található szőlőskertből származtak - szolgált forrásként dsRNS izoláláshoz és cDNS klónozáshoz. dsRNS-t extraháltunk fertőzött szőlőnövények floem szövetéből a Hu és munkatársai által leírt módszer szerint [Hu és mtsai.: J. Phytopathology 128 1 (1990); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. A nagy molekulatömegű dsRNS (körülbelül 15 kb) tisztítását a teljes dsRNS elektroforetikus elválasztásával végeztük el 0,7 % koncentrációjú alacsony olvadáspontú agaróz gélben, majd ezt követően fenol/kloroformos extrahálást végeztünk a Sambrook és munkatársai által leírt eljárás szerint [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] . A dsRNS koncentrációját az etidium-bromiddal festett dsRNS sáv UV fluoreszcens optikai sűrűségének becslése alapján végeztük, ismert koncentrációjú DNS-markerrel öszszehasonlitva.

4. példa cDNS szintézis és klónozás

A cDNS szintézist az eredetileg Jelkmann és munkatársai által leírt, majd Ling és munkatársai által módosított eljárás szerint végeztük [Jelkmann és mtsai.: Phytopathology 79 1250 (1989); Ling és mtsai.: Arch. Virology 142 1101 (1997); amely publikációk teljes egészében a kitanítás részének tekintendők]. Alacsony olvadáspontú agaróz gélből tisztított körülbelül 100 ng nagy molekulatömegű dsRNS-t denaturáltunk 20 mM metil-merkurát-hidroxidban és szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig 350 ng mennyiségű random primerekkel. A cDNS első szálját madár mieloblasztózis vírus (AMV) reverz-transzkriptázzal szintetizáltuk. A cDNS második szálját RNáz-H és E. coli DNS-polimeráz-I alkalmazásával állítottuk elő. A kettős-szálú cDNS tompa végeit T4 DNS-polimerázzal állítottuk elő és EcoRI adapterekkel ligáltuk. A cDNS-t, amelynek a végein EcoRI adapterek találhatók, kináz reakcióval aktiváltuk és Lambda ZAPII/EcoRI előkészített karokba ligáltuk, a gyártó utasításai szerint eljárva (Stratagene). A rekombináns DNS-t ezután in vitro pakoltuk Gigapack®!! pakoló extraktummal (Stratagene). A pakolt fág részecskéket amplifikáltuk és titerét meghatároztuk a gyártó utasításai szerint.

Kétféle próbát alkalmaztunk GLRaV-2 specifikus kiónok azonosítására a klóntárból. Az egyik típust a PCR-reakcióval amplifikált szintetizált cDNS-ből állítottuk elő specifikus EcoRI Uni-Amp™ adapterekhez (Clontech) történő ligálás után; a másik típust DNS-inszertek vagy PCR-termékek képezték korábban már szekvenált klónokból. A cDNS-klóntárból származó kiónokat telep/plakk Screen membránra (NEM Research Product) történő telep-átemelő hibridizációval szelektáltuk a fentebb leírt próba alkalmazásával. A próbát az előkészítés során ³²P[α-dATP]-vei jelöltük az E. coli DNS-polimeráz-I Klenow fragmensének alkalmazásával. Az előhibridizációs, hibridizációs és mosási lépéseket 65 C°-on végeztük a gyártó utasításai szerint (DuPont, NEN Research Product). A szelektált plakkokat rekombináns pBluescriptplazmiddá alakítottuk át in vivo kivágásos eljárással, a gyártó utasításai szerint (Stratagene).

A GLRaV-2 extrém 3'-végét képviselő kiónok előállításához a dsRNS-t poli-adeniláltuk élesztő poli(A)-polimeráz segítségével. A poli(A)-farokkal ellátott dsRNS-t templátként alkalmazva, cDNS-t amplifikáltunk RT-PCR-reakcióval a következő primerek alkalmazásával: oligo(dT)18 és specifikus primerként CP-1/T7R, amely a CP-1 kiónból származott és nukleotid szekvenciája megfelel a 20. azonosító szám szerinti szekvenciának, a következők szerint:

TGCTGGAGCT TGAGGTTCTG C

Az így kapott PCR-terméket (3'-PCR) TA vektorba (Invitrogen) klónoztuk és szekvenáltuk.

Amint az 1A. ábrán bemutatjuk, egy körülbelül 15 kb nagyságú, nagy molekulatömegű dsRNS-t tudtunk ismételten azonosítani GLRaV-2 fertőzött szőlőnövényekben, de nem tudtuk azonosítani az egészséges növényekben. Továbbá számos alacsony molekulatömegű dsRNS-t tudtunk kimutatni fertőzött szövetben. A GLRaV-2 dsRNS kitermelése becslésünk szerint

5-10 ng/15 g floem szövet, amely sokkal alacsonyabb, mint a GLRaV-3 kitermelése [Hu és mtsai.: J. Phytopathology 128 1 (1990); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Csak az alacsony olvadáspontú agaróz gélből tisztított nagy molekulatömegű dsRNS-t alkalmaztuk cDNS szintézisre, klónozásra és a Lambda/ZAP II cDNSklóntár létrehozására.

A cDNS-klóntár szkrínelésére kétféle próbát alkalmaztunk. Az eredeti kiónokat Uni-Amp™ PCR-reakcióval amplifikált cDNS-hez, mint próbához történő hibridizációval azonosítottuk. Ezeknek a kiónoknak a specifitását (például TC-1) - amely kiónok méretüket tekintve 200-1,800 bp között változtak - GLRaV-2 dsRNS-hez történő Northern-hibridizációval igazoltuk, amint azt az 1B. ábrán bemutatjuk. Továbbá, több mint 40 különböző kiónt - amelyek nagysága 800-7500 bp között változott - azonosítottunk, a GLRaV-2 specifikus cDNSklónokból vagy PCR-termékekből előállított próbákkal történő hibridizációt követően. Ezt követően több mint 40 kiónt szekvenáltunk (2. ábra) mindkét szálon.

5. példa

A burokfehérje expressziója E. coli-ban és immun blottolása

Annak meghatározására, hogy az 0RF6 a GLRaV-2 burokfehérje génje, a teljes ORF6 DNS-molekulát PCR-termékből szubklónoztuk és a pMAL-C2 fúziós fehérje expressziós vektorba (New England Biolabs, Inc.) beillesztettük. A PCR reakcióban a CP-96F és CP-96R specifikus primereket alkalmaz tűk, amelyek EcoRI vagy BamHI hasítási helyet tartalmaztak a klónozás elősegítésére. A CP-96F prímért úgy terveztük meg, hogy magába foglalja a CP start kodonját és tartalmazza a 21. azonosító szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát a következők szerint:

CGGAATTCAC CATGGAGTTG ATGTCCGACA G

A CP-96R a CP stop kodonjától 3'-irányban 66 nukleotid távolságban helyezkedik el és tartalmazza a 22. azonosító szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát a következők szerint:

AGCGGATCCA TGGCAGATTC GTGCGTAGCA GTA

A burokfehérjét mint fúziós fehérjét expresszáltuk E. coli maltóz-kötő fehérjével (MBP), a „tac promoter szabályozása és a „lac represszor szupressziója alatt. Az MBPCP fúziós fehérjét 0,3 mM izopropil-p-D-tio-galaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk, és egylépéses affinitás! oszlopon történő elválasztással tisztítottuk a gyártó (New England, Biolabs, Inc.) utasításai szerint. Az MBP-CP fúziós fehérjét vagy a fúziós fehérjéről lehasított burokfehérjét Western-blot segítségével vizsgáltuk GLRaV-2 specifikus antiszérummal (melyet Dr. Charles Greif (INRA, Colmar, Franciaország) volt kedves biztosítani) szemben mutatott reakcióra a Hu és munkatársai által leírt módszer alapján [Hu és mtsai.: J. Phytopathology 128 1 (1990); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] . Ezzel ellentétesen a nem-rekombináns plazmidok vagy a nem-indukált sejtek nem reagáltak a GLRaV-2 elleni antiszérummal.

6. példa

A GLRaV-2 szekvencia analízise és genomi szerveződése

A GLRaV-2 RNS-genomjának összesen 15.500 bp méretű darabját szekvenáltuk meg és letétbe helyeztük a GenBank-nál (katalógusszáma: AF039204). A teljes RNS-genom körülbelül 85 %-át legalább két különböző klón alkalmazásával határoztuk meg. A burokfehérje gén régióban a szekvenciát meghatároztuk és számos különböző, átfedő klón alkalmazásával igazoltuk. A GLRaV-2 genomi szerveződése - amelyet a 2. ábrán mutatunk be - kilenc nyílt leolvasási fázist tartalmaz (mint például ORFla, lb-8).

Az ORFla és ORFlb: A GLRaV-2 ORFla által kódolt termék N-terminális aminosav szekvenciájának az analízise két, feltételezhetően papain-szerű proteáz domént mutatott ki, amelyek jelentős mértékű hasonlóságot mutattak a BYV papain-szerű vezető proteázhoz [Agranovsky és mtsai.: Virology 198 311 (1994); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] . így ez lehetővé tette a feltételezhető GLRaV-2 proteáz katalitikus cisztein és hisztidin aminosavak előrejelzését. A BYV papain-szerű proteáz szekvenciának és a GLRaV-2 proteáz szekvenciának az összevetése során, a BYV Gly-Gly aminosavaknál (588-589. aminosavak) található hasítási hely fedésbe került a GLRaV2 megfelelő alanin-glicin (Ala-Gly) és Gly-Gly dipeptidjével (3A. ábra). Az ezen helynél bekövetkező hasítás egy vezető fehérjét és egy 234 kDa (2090 aminosav) méretű, MT és HEL doméneket magába foglaló C-terminális fragmenst eredményez. Azonban a GLRaV-2-ben a papain-szerű proteáz doméntől 5' -irányban elhelyezkedő régió nem mutatott hasonlóságot a BYV megfelelő régiójával. Továbbá variabilitás figyelhető meg a hasítható kötésnél található aminosavakban (BYV esetében Gly, GLRaV-2 esetében Ala) . A PPRO doménben a hasítási helyet alkotó aminosavban hasonló variabilitást írtak le korábban az LChV vírus esetében [Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] .

Az ORFla/lb által kódolt fehérje levezetett aminosav szekvenciájával végzett adatbázis kutatás jelentős mértékű hasonlóságot tárt fel a többi closterovírus MT, HEL és RdRP doménjeivel. A P-PRO hasítási helytől 3'-irányban található régió jelentős mértékű hasonlóságot mutatott (57,4% azonosság 266 aminosavra kiterjedő összevetésben) a BYV vélelmezett metil-transzferáz doménjével, és tartalmazta az öszszes, pozitív-szálú RNS 1 MT típusú vírusokra jellemző konzervált részegységet (3B. ábra). Az ORFla C-terminális részét helikáz doménként azonosítottuk, amelynek a szekvenciája nagy hasonlóságot mutatott (57,1% azonosság 315 aminosavra kiterjedő összevetésben) mutatott a BYV helikáz doménjével és tartalmazta a pozitív-szálú RNS vírusok Szupercsalád-I helikázra jellemző hét konzervált részegységet (3C. ábra) [Hodgman: Nature 333 22 (1988); Koonin és Dolja: Crit. Rév. in Biochem. and Mól. Bioi. 28 375 (1993); mindkét publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő] .

.:. .:. ... * j.. ··:·

Az ORFlb egy 460 aminosavból álló polipeptidet kódol, amelynek molekulatömege 52.486 Da, a leolvasási fázist váltó helytől számolva. Az RdRP-vel végzett adatbázis keresés jelentős mértékű hasonlóságot mutatott a pozitív-szálú RNS vírusok RdRP-doménjelvei. A BYV és GLRaV-2 RdRP doménjeinek összehasonlítása kimutatta az RdRP nyolc konzervált részegységének jelenlétét (3D. ábra).

Amint a 8. ábrán bemutatjuk, a GLRaV-2 RdRP kísérleti filogenetikai fája a többi closterovírushoz viszonyítva azt mutatja, hogy közeli rokonságban van a BYV, BYSV és CTV monopartite closterovírusokkal.

Closterovírusok esetében a feltételezések szerint egy +1 riboszómális leolvasási fázist váltó mechanizmus játszik szerepet az ORFlb expressziójában, mint az ORFla részvételével alkotott nagyméretű fúziós fehérje [Agranovsky és mtsai.: Virology 198 311 (1994); Karasev és mtsai.: Virology 208 511 (1995); Klaassen és mtsai.: Virology 208 99 (1995); Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996); Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997); a felsorolt összes publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. A BYV átfedő ORFla/lb régiójában a GGGUUUA csúszós szekvenciáról és két haj tű struktúráról (szár-hurok és álcsomó) feltételezzük, hogy +1 leolvasási fázis eltolódást eredményez [Agranovsky és mtsai.: Virology 198 311 (1994); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Ezen jellegzetességek egyike sem konzerválódott a CTV és a BYSV esetében [Karasev és mtsai.: Virology 208 511 (1995); Karasev és mtsai.: Virology 221

199 (1996); mindkét publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő], amelyek esetében feltételezhetően egy terminátor kodonnál vagy egy ritkán előforduló kodonnál bekövetkező riboszómális várakozás látja el ugyanezt a funkciót. A GLRaV-2 RdRP N-terminális régiójának és a helikáz C-terminális régiójának nukleotid szekvenciáját más closterovírusok ugyanazon régióival összehasonlítva jelentős mértékű hasonlóságot fedeztünk fel a BYV, BYSV és CTV vírusokkal összevetve. Amint a 4. ábrán látható, a GLRaV-2 C-terminális helikáz végén a terminátor UAG megfelelt a BYV és BYSV terminátor UAG szekvenciájának és a CTV arginin CGG kodonj ának.

Az ORF2 egy 171 bázispárt (57 aminosavat) tartalmazó kisméretű fehérjét kódol, amelynek molekulatömege 6297 Da. Amint várható volt, a levezetett aminosav szekvencia apoláros aminosavakból álló szakaszt tartalmaz, amelyről feltételezhetjük, hogy transzmembrán hélixet alkot. A BYV, BYSV, CTV, LIYV és LChV vírusokban szintén megtalálható egy kisméretű analóg hidrofób fehérje [Agranovsky és mtsai.: J. General Virology 72 15 (1991); Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996); Pappu és mtsai.: Virology 199 35 (1994); Klaassen és mtsai.: J. General Virology 75 1525 (1994); Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997); a felsorolt összes publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő].

Az ORF3 65.111 Da molekulatömegű, 600 aminosavból álló polipeptidet kódol, amely homológ a HSP70 sejtben megtalálható hősokk fehérjével. A HSP70 nagymértékben konzervált a closterovírusok között és feltételezhetően szerepet játszik ATP-áz aktivitásban és a chaperon aktivitáshoz szükséges fehérje-fehérje kölcsönhatásban [Agranovsky és mtsai.: J. General Virology 78 535 (1997); Agranovsky és mtsai.: Doklady Akademii Nauk. 340 416 (1995); Karasev és mtsai.: FEBS Letters 304 12 (1992); a felsorolt összes publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Amint ez az 5. ábrán látható, a GLRaV-2 teljes ORF3 szekvenciájának összevetése a BYV HSP70 homológjával nyolc konzervált részegység jelenlétét mutatta ki. A HSP70 százalékokban kifejezett hasonlósága a GLRaV-2 és - sorrendben megfeleltetve - a BYV, BYSV, CTV, LIYV és LChV vírusok között az alábbi: 47,8%, 47,2%, 38,6%, 20,9% és 17,7%.

Az 0RF4 551 aminosavat tartalmazó fehérjét kódol, amelynek molekulatömege 63.349 Da. Az ORF4 fehérje termékkel végzett adatbázis kutatás során nem azonosítottunk hasonló fehérjéket, kivéve az alább felsorolt, a closterovirusokban előforduló megfelelőit: BYV (P64), BYSV (P61), CTV (P61), LIYV (P59) és LChV (P61). Erről a fehérjéről úgy gondoljuk, hogy feltételezhetően 90 kDa hősokk fehérje. Amint ez a 9. ábrán látható, két konzervált részegységet amelyek előfordulnak a BYV vírusban [Agranovsky és mtsai.: J. General Virology 72 15 (1991); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] és amelyek előfordulnak a CTV vírusban [Pappu és mtsai.: Virology 199 35 (1994); amely publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő] - azonosítottunk a GLRaV-2 ORF4 szekvenciáj ában.

- 93 Az 0RF5 és az 0RF6 - sorrendben megfeleltetve - 24.803 Da és 21.661 Da molekülatömegű polipeptideket kódolnak. Mindkét ORF start kodonja a transzlációhoz előnyös helyzetben található. Az ORF6 szekvenciát mint a GLRaV-2 burokfehérje gént azonosítottuk más closterovírusokkal való szekvencia összehasonlítás alapján. Az ORF6 fehérje termékének kiszámított molekulatömege (21.662 Da) jó egyezést mutat a korábban SDS-PAGE alapján becsült 22-26 kDa értékkel [Zimmermann és mtsai.: J. Phytopathology 130 205 (1990); Boscia és mtsai.: Vitis 34 171 (1995); mindkét publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő].

A GLRaV-2 ORF6 szekvenciának a levezetett aminosav szekvenciájával végzett adatbázis keresés hasonlóságot mutatott a closterovírusok - BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV és GLRaV-3 - burokfehérjéi között. A nukleotid szinten a legmagasabb százalékos hasonlóságot a BYSV vírus burokfehérjéjével találtuk (34,8%); az aminosav szinten a legmagasabb százalékos hasonlóságot a BYV vírus (32,7%) és BYSV vírus (32,7%) burokfehérjékkel találtuk. Amint ez a 6A. ábrán látható, a GLRaV-2 burokfehérje és burokfehérje duplikátum aminosav szekvenciáinak az összevetése más closterovírusok szekvenciáival kimutatta, hogy a változatlan aminosavak (N. R. G. D.) egyaránt megtalálhatók a GLRaV-2 ORF5 és ORF6 szekvenciákban. Ezen aminosavak közül kettő (R és D) feltételezhetően szerepet játszanak a molekulák stabilizálásában sóhíd kialakításával, és az összes filament-szerű növényi vírus legnagyobb mértékben konzerválódott belső régiójának a megfelelő feltekeredését biztosítva [Dőlj a és mtsai.:

Virology 184 79 (1991); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő].

Az ORF6 burokfehérje génként történő azonosítását fúziós fehérje expresszióját követően Western-blot segítségével is igazoltuk; és a fúziós fehérje a következő részeket tartalmazta: egy 22 kDa 0RF6 CP és egy 42 kDa maltóz-kötő fehérje, amelyet transzformált E. coli termelt a fentebb, az 5. példában leírtak szerint. Amint az a 6B. ábrán látható, a GLRaV-2 burokfehérje és a burokfehérje duplikátum vélelmezett filogenetikai fája más closterovírusokkal összevetve az mutatta, hogy a GLRaV-2 közelebbi rokonságban van a levéltetvek átvihető closterovírusaival (BYV, BYSV és CTV) [Candresse: Closteroviruses and Clostero-like Elongated Plant Viruses, Encyclopedia of Virology, 242-248. oldalak, szerk.: Webster és Granoff, Academic Press, New York (1994); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő], mint a whitefly (LIYV) vagy bibortetű átvihető closterovírusokkal (LChV és GLRaV-3) [Raine és mtsai.: Canadian J. Plant Pathology 8 6 (1986); Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997); Rosciglione és Gugerli: Phytoparasitica 17 63 (1989); Engelbrecht és Kasdorf: Phytophlactica 22 341 (1990); Cabaleiro és Segura, (1997); Petersen és Charles: Plant Pathology 45 509 (1997); a felsorolt összes publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő].

Az ORF7 és az ORF8 szekvenciák - sorrendben megfeleltetve - egy 162 aminosavat tartalmazó, 18.800 Da molekulatömegű, illetve egy 206 aminosavat tartalmazó, 23.659 Da

- 95 ►λ ΙΓ ·α. ^:·<

molekulatömegű polipeptidet kódolnak. AZ 0RF7 és ORF8 szekvenciákkal végzett adatbázis keresés nem mutatott ki jelentős mértékű hasonlóságot semmiféle más fehérjével. Azonban ezek a gének méretben és elhelyezkedésben hasonlók voltak azokhoz, amelyeket más closterovírusok - BYV (P20, P21) , BYSV (P18, P22) és LChV (P21, P27) - szekvenciáiban megfigyeltünk (7. ábra). Azonban nem találtunk konzervált régiókat az 0RF7 vagy ORF8 szekvenciák és az ezeknek megfelelők között a BYV, BYSV és LChV vírusok esetében.

A 3'-terminális transzlációra nem kerülő régió (3'-UTR) 216 nukleotidból áll. A nukleotid szekvencia analízis a GLRaV-2 genom végéhez közel egy hosszú oligo(A) szakaszt mutatott, amely hasonló a BYV és BYSV genomok esetében megfigyelhető szekvenciákhoz [Agranovsky és mtsai.: J. General Virology 72 15 (1991); Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996), mindkét publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. A BYV genom CCC szekvenciával végződik, a BYSV és CTV genom CC szekvenciával végződik; - sorrendben megfeleltetve egy további G vagy A nukleotiddal a BYSV kettős-szálú replikativ formájában [Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő], illetve a CTV esetében [Karasev és mtsai.: Virology 208 511 (1995); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. A GLRaV-2 genom 3 ’-terminálisán CGC szekvencia található. Újabban egy konzervált, 60 nukleotidból álló cis-elemet azonosítottak három monopartite closterovírus 3'-UTR régiójában, amely magába foglalt egy prominens konzervált szár-és-hurok struktúrát [Karasev és mtsai.: (1996)]. Amint ez a 10. ábrán látható, a GLRaV-2 3'-UTR szekvenciájának az összevetése a BYV, BYSV és CTV vírusok megfelelő régióival, ugyanazon 60 nukleotidból álló konzervált szakasz jelenlétét mutatta ki. Ezen a cis-elemen kívül nem találtunk konzervált szekvenciákat a GLRaV-2, BYV, BYSV és CTV vírusok 3'-UTR régióiban.

Az eddig tanulmányozott closterovírusok (azaz BYV, BYSV, CTV, LIYV, LChV és GLRaV-3) látható hasonlóságokat mutatnak a genomi szerveződésükben, amely magában foglalja az olyan replikációhoz társuló géneket, amelyek MT, HEL és RdRP konzervált doménekből állnak és a closterovírusok esetében egyedi, öt génből álló elrendezést mutatnak [Dolja és mtsai.: Annual Rev. Phytopathology 32 261 (1994); Agranovsky: Adv. in Virus Res. 47 119 (1996); Jelkmann és mtsai.: J. General Virology 78 2067 (1997); Ling és mtsai.: J. General Virology 79(5) 1289 (1998); a felsorolt összes publikácó teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] .

A fenti adatok egyértelműen bizonyítják, hogy a GLRaV-2 closterovírus. A GLRaV-2 genomjában két feltételezhetően papain-szerű proteázt azonosítottunk és egy autoproteolítikus hasítási eljárás előre jelezhető. Az MT, HEL és RdRP konzerválódott részegységeket tartalmazó replikációhoz kapcsolódó fehérjéket szintén azonosítottuk, amelyek filogenetikusán szoros rokonságban álltak más closterovírusok replikációhoz kapcsolódó fehérjéivel. A GLRaV-2 vírusban úgyszintén megőrződött egy egyedi gén elrendeződés, amely a következőkből áll: kisméretű hidrofób transzmembrán fehérje, HSP70 homológ, HSP90 homológ, divergálódott CP és CP. Továbbá a GLRaV-2 burokfehérje (0RF6) számított molekulatömege (21.661 Da) jó egyezésben van a többi closterovírus burokfehérjével (22-28 kDa) [Martelli és Bar-Joseph: Closteroviruses: Classification and Nomenclature of Viruses, In: Fifth Report of the International Comittee on Taxonomy of Viruses, szerk.: Francki és mtsai., SpringerVerlag Wein, New York, 345-347. oldalak, (1991); Candresse és Martelli: Genus Closterovírus'’, In: Virus Taxonomy. Report of the International Comittee on Taxonomy of Viruses, szerk.: Murphy és mtsai., Springer-Verlag, New York, 461463. oldalak, (1995); mindkét publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Két ORF a CP-szekvenciához viszonyítva 3'-irányban, méretben és elhelyezkedésben hasonló azokhoz, amelyeket a BYV genomban figyeltek meg. Továbbá, a poli(A)-farok hiánya a GLRaV-2 3'-végén úgyszintén jó egyezésben van a többi closterovírusnál tapasztaltakkal. Mint az összes többi closterovírus esetében, az ORFlb expressziója feltételezhetően egy +1 riboszómális leolvasási fázis eltolás útján történik és a 3'-proximális ORF szekvenciák expressziója valószínűleg szubgenomi RNS-ek egymásba ágyazott sorozatának kialakulása útján történik. Mivel a BYV vírus esetén a leolvasási fázis eltolásban résztvevő csúszós szekvencia, szár-hurok és álcsomó struktúrák a GLRaV-2 esetében hiányoznak, a GLRaV-2 esetében a leolvasási fázis eltolás mechanizmusa ugyanaz lehet, mint amit a CTV esetében javasoltak [Karasev és mtsai.:

Virology 208 511 (1995); amely publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő] és amit a BYSV esetében javasoltak [Karasev és mtsai.: Virology 221 199 (1996); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] .

Összességében a GLRaV-2 közelebbi rokonságban áll a BYV, BYSV és CTV monopartite closterovírusokhoz, mint a GLRaV-3 vírushoz (7. ábra) [Ling és mtsai.: J. General Virology 79 1289 (1998); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő], bár ez utóbbi hasonló levélsodródásos tüneteket okoz szőlőnövényen [Rosciglione és Gugerli: Rev. Suisse Viticult. Arboricult. Horticulture 18 207 (1986); Hu és mtsai.: J. Pytopathology 128 1 (1990); mindkét publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő].

A closterovírusok szétágazó csoportot alkotnak, bonyolult és heterogén genomi szerveződésekkel. Mostanáig a GLRaV-2 az egyetlen closterovírus, amely megfelel a BYV vírus genomi szerveződésének, a Closterovírus nemzetség típusos tagjának. Továbbá a GLRaV-2 genomi eredetű RNS körülbelül azonos méretű, mint a BYV esetében; azonban a GLRaV-2 transzmissziós vektora ismeretlen. A GLRaV-2 genomi szerveződése közelebbi rokonságot mutat a levéltetű átvihető closterovírusokkal - BYV és CTV - mint a whitefly (LIYV) vagy a bibortetű (LChV Is GLRaV-3) átvihető closterovírusokkal. így elképzelhető, hogy a GLRaV-2 átvitelét levéltetvek végzik. A GLRaV-2 vírussal végzett levéltetű átviteli kísérletek szolgáltathatnak olyan információt, amely elősegítheti módszerek kifejlesztését a GLRaV-2 további ellenőrzésére .

Összesen 15.500 nukleotidot, azaz a becsült GLRaV-2 genom több, mint 95%-t klónoztuk és szekvenáltuk. A GLRaV-2 és GLRaV-3 [Ling és mtsai.: J. General Virology 79 1289 (1998); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] az első szőlőlevél sodródással kapcsolatos closterovírusok, amelyeket csaknem teljes mértékben megszekvenáltak. A fenti adatok egyértelműen igazolják a GLRaV-2 beillesztését a Closterovirus nemzetségbe. Továbbá, a GLRaV-2 genomra vonatkozó ismeretek ennek és a rokon GLRaV vírusoknak a jobb megértéséhez vezetnek és a closterovírusok csoportjára vonatkozó alapvető ismeretekhez is hozzájárulnak.

7. példa

A GLRaV-2 CP-génjének konstrukciója növényi expressziós vektorban

GLRaV-2 fertőzött Vitis vinifera cv Pinot Noir szőlőnövényeket - amelyek egy New York állam középső részén található szőlőskertből származtak - alkalmaztunk mint vírus izolátumot, amelyből a GLRaV-2 CP-gént azonosítottuk. A szekvencia információ alapján két oligonukleotid prímért terveztünk meg. A CP-96F szensz primer (21. azonosítási szám szerinti szekvencia) a burokfehérje gén ATG iniciációs kodonjától kezdődik és a CP-96R komplementer primer (22. azonosítási szám szerinti szekvencia) a CP-gén stop kodonjától 56 nukleotid távolságra a 3'-irányban kezdődik. A

- 100 klónozás elősegítésére egy Ncol restrikciós helyet (11 bp a 21. azonosítási szám szerinti szekvenciában és 13 bp a 22. azonosítási szám szerinti szekvenciában) illesztettünk be mindkét primer kezdeténél. A GLRaV-2 burokfehérje gént GLRaV-2 fertőzött szőlőnövényből· extrahált dsRNS-ből amplifikáltuk reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció segítségével (RT-PCR). A PCR-amplifikált CP-terméket alacsony olvadáspontú agaróz gélből tisztítottuk, Ncol-gyel emésztettük és az ugyanezen enzimmel emésztett pEPT8 növényi expressziós vektorba klónoztuk (ahogy a 11. ábrán látható). Szkrínelés után a rekombináns konstrukció irányítottságát a CP-gén belső restrikciós helyének segítségével és a CP-gén közvetlen szekvenálásával ellenőriztük. A lefordítható (szensz) teljes hosszúságú burokfehérje gén rekombináns konstrukciót - pEPT8CP-GLRaV2 - vittük tovább a következő klónozáshoz. A növényi expressziós kazettát - amely megkettőzött karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S-enhanszert, CaMV 35Spromótert, lucerna mozaikvírus (ALMV) RNS4 5'-vezető szekvenciát, GLRaV-2 burokfehérje gént (CP-GLRaV-2) tartalmaz, valamint CaMV 35S 3'-végi transzlációra nem kerülő régiót tartalmaz, mint terminátor - az EcoRI restrikciós enzimmel hasítottuk, alacsony olvadáspontú agaróz gélből izoláltuk, és az ugyanezen restrikciós enzimmel kezelt binér vektorba - pGA482GG vagy pGA482G (a pGA482 vektor származéka, lásd például: /ín és mtsai.: Binary Vectors, In: Plant Molecular Biology Manual, A3 kötet, 1-19. oldalak, szerk.: Gelvin és Schilperot, Kinwer Academic Publishers,

Dordrecht, Hollandia, (1988), amely publikáció teljes égé

- 101 - .·. .i.·.

szében a kitanitás részeként tekintendő) - klónoztuk. Az eredményül kapott rekombináns konstrukciók a következők: pGA482GG/EPT8CP-GLRaV2 - ahogyan ezt a 11A. ábrán bemutatjuk - amely mind neomicin foszfotranszferázt (npt-II) és βglükuronidázt (GUS) tartalmaz a T-DNS belső régiójában és pGA482G/EPT8CP-GLRaV2 - ahogyan ezt a 11B. ábrán bemutatjuk - amely nem tartalmaz GUS-t. Ezeket a rekombináns konstrukciókat külön-külön elektroporáció segítségével ártalmatlanná tett avirulens Agrobacterium tumefaciens C58Z707 törzsbe vittük. A vektort tartalmazó Agrobacterium tumefaciens törzset alkalmaztuk Nicotiana benthamiana felsértett levélkorongok fertőzésére lényegében a Horsch és munkatársai által leírt eljárás szerint [Horsch és mtsai.: Science 277 1229 (1985)], amely publikáció teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.

8. példa

Transzgént hordozó Nicotiana benthamiana növények analízise a GLRaV-2 CP-génjével

NPT-II ELISA: Kéttős-antitest szendvics, enzim kapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárást (DAS-ELISA) alkalmaztunk az npt-II enzim kimutatására NPT-II ELISA reagenskészlet alkalmazásával (5'-prime to 3'-prime, Inc., Boulder, Colorado) .

Közvetett ELISA: GLRaV-2 elleni poliklonális antitesteket - a GLRaV-2-t az E. coli-ban expresszált burokfehérjéből állítottunk elő - alkalmaztunk. A lemezeket az extrakciós pufferben készített homogenizált mintákkal vontuk be

- 102 (1:10, tömeg/térf.; foszfát pufferolt fiziológiás sóoldat, amely 0,05% Tween 20-t és 2% polivinil-pirrolidont tartalmaz) és éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Miután 0,05% Tween 20-t tartalmazó foszfát-pufférőit fiziológiás sóoldattal mostuk (PBST), a lemezeket blokkoló pufferrel (2% BSA-t tartalmazó foszfát-pufférőit fiziológiás sóoldat) blokkoltuk és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáltuk. Az anti-GLRaV-2 IgG-t 2 ug/ml koncentrációban adtuk hozzá PBST-vel történő mosást követően. 30 °C-on inkubáltuk 4 órán keresztül, majd a lemezeket PBST-vel mostuk és a kecskében termelt anti-nyúl alkalikus foszfatáz-IgG konjugátumot (Sigma) 1:10.000 arányú hígításban adtuk hozzá. Az abszorbancia mérést 405 nm-nél végeztük MicroELISA AutoReader segítségével. Továbbá Western-blot kísérleteket is végeztünk a Hu és munkatársai által leközölt eljárás szerint [Hu és mtsai.: J. Phytopathology 128 1 (1990); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] .

PCR-analízis: Genomi eredetű DNS-t extraháltunk feltételezhetően transzgént hordozó és transzgént nem hordozó növények leveleiből Cheung és munkatársai eljárása szerint [Cheung és mtsai.: PCR Methods and Applications 3 69 (1996) ; amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Az extrahált teljes DNS templátként szolgált a PCR reakcióhoz. A GLRaV-2 CP-génhez a CP-96F és CP-96R primereket (sorrendben megfeleltetve a 21. és a 22. azonosítási szám szerinti szekvenciák) és hasonlóképpen az npt-II 5'- és 3'-primereket alkalmaztuk a PCR analízishez.

- 103 Ά PCR-reakciót a következők szerint végeztük: 3 perc 94 °Con egy ciklusban, amelyet 30 ciklus követett az alábbiak szerint: 1 perc 94 °C-on, 1 perc 50 °C-on és 2 perc 30 másodperc 72 °C-on, amelyeket egy további extenzió követett 10 percig 72 °C-on. A PCR-terméket agaróz gélen analizáltuk.

Transzformáció után összesen 42 kanamicin rezisztenciát mutató Nicotiana benthamiana vonalat (R_o) kaptunk, amelyek esetében a levélmintákat NPT-II enzim aktivitásra vizsgáltuk. Ezek közül 37 vonal volt NPT-II pozitív ELISA szerint, amely az összes transzformánsok körülbelül 88%-a. Azonban néhány NPT-II negatív növényt is kaptunk ezen kiválasztott kanamicin rezisztens növények között. Az összes transzgént hordozó növényt üvegházban termesztve önbeporoztuk és az ezen transzgént hordozó vonalakból származó magokat további analízis céljából csíráztattuk.

A GLRaV-2 CP termelődését a transzgént hordozó növényekben közvetett ELISA segítségével mutattuk ki a beoltást megelőzően és az eredmények azt jelezték, hogy a GLRaV-2 CP-gén expressziója nem volt kimutatható az összes vizsgált transzgént hordozó növényben. Ezt az eredményt továbbá Western-blot segítségével is megerősítettük. A GLRaV-2 elleni antitest alkalmazásával a CP termelődése nem volt kimutatható a transzgént hordozó és a transzgént nem hordozó kontroll növényekben. Azonban egy, a várható méretnek megfelelő (körülbelül 22 kDa) fehérje volt kimutatható a GLRaV-2 fertőzött pozitív kontroll növényekben. Ez az eredmény egybeesett az ELISA eredményekkel. A GLRaV-2 CP-génjének jelen

-104- .:.

léte a transzgént hordozó növényekben kimutatható volt a növényi szövetekből extrahált teljes genomi eredetű DNS-ből PCR analízis segítségével (12. ábra). A várt méretnek megfelelő (653 bp) DNS-terméket húsz vizsgált transzgént hordozó vonalból amplifikáltuk, de nem amplifikáltuk transzgént nem hordozó növényekből. Az eredmények azt jelezték, hogy a GLRaV-2 CP-génje megtalálható ezen transzgént hordozó vonalakban, amelyet továbbá a Northern-blot analízis is megerősített.

9. példa

Az RÍ és R2 transzgént hordozó Nicotiana benthamiana növények rezisztensek a GLRaV-2-vel szemben

Transzgént hordozó növények beoltása: 94/970 GLRaV-2 izolátumot - amelyet eredetileg Dél-Afrikában azonosítottak és vittek át szőlőnövényről Nicotiana benthamiana-ra [Goszczynski és mtsai.: Vitis 35 133 (1996); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő] - alkalmaztunk oltóanyagként. A 94/970 izolátum CP-génjét megszekvenáltuk és azonosnak találtuk a konstrukció során alkalmazott CP-génnel. A Nicotiana benthamiana a GLRaV-2 kísérleti gazdanövénye. Az ezen létrejövő fertőzés klorózisos és esetenként nekrotikus léziókat okoz, amelyet szisztémás levélér feltisztulás követ. A levélér feltisztulás levélér nekrózishoz vezet. Végül a fertőzött növény elpusztult, a tetejétől kezdve az alsó részekig.

Az öt-hét leveles állapotban a két legfiatalabb csúcsállású levelet 94/970 GLRaV-2 izolátummal érintkeztettük.

Az oltóanyag előállításához 1,0 g GLRaV-2 fertőzött Nicotiana benthamiana levélszövetet dörzsöltünk el 5 ml foszfát pufferben (0,01 M K₂HPO₄, pH 7,0). A vizsgált növényeket korunddal beporoztuk és az előkészített oltóanyaggal bedörzsöltük. A nem-transzformált növényeket ezzel egyidejűleg a fentiekkel azonos módon beoltottuk. A növényeket a beoltást követően 60 napig minden második nap a tünetek kifejlődésére megfigyeltük. A rezisztens Rí transzgént hordozó növényeket továbbvittük az R₂ generációba további értékelés céljából.

R_o vonalból származó transzgént hordozó utódokat szkríneltünk előzetesen GLRaV-2 elleni rezisztenciára, amelyet 94/970 GLRaV-2 izolátummal történő beoltás követett. A transzgént hordozó növények magoncait (NPT-II pozitív) és transzformálás nélküli kontroll növények magoncait oltottuk be GLRaV-2-vel. Beoltás után a vizsgált növények reakcióit három típusba soroltuk: nagymértékben fogékony (azaz tipikus tüneteket figyeltünk meg a beoltást követően kettő-négy hetes időtartamban); toleráns (azaz nem fejlődtek ki tünetek a korai fázisban és tipikus tünetek a beoltást követően négy-nyolc héttel jelentkeztek); és rezisztens (azaz a növények tünetmentesek maradtak a beoltást követően nyolc héttel). A növények reakciója alapján a rezisztens növényeket tizennégy különböző vonalból nyertük (az 1. táblázatban alább feltüntetve). Ezen tizennégy vonal egyikében sem tudtunk vírust kimutatni a növényekben ELISA segítségével 6 héttel a beoltást követően. Ezzel ellentétben GLRaV-2-t tudtunk kimutatni a tüneteket mutató növényekben közvetett • ···· · · , .:. .:. ...· ·τ

- 106 ELISA segítségével. A további hat vonalban - bár volt néhány növény, amelyekben valamilyen mértékű késleltetést figyeltünk meg a tünetek kifejlődésében - az összes beoltott növény elpusztult a beoltást követően három-nyolc héttel. Az elsődleges szkrínelési eredmények alapján három rezisztens vonalból (1., 4. és 19.) és két fogékony vonalból (12. és 13.) álló öt reprezentatív vonalat választottunk ki a további analízisekhez.

1. táblázat

		vizsgált növények reakciója
vonal száma	száma	HS	T	HR
1. vonal	39	14	3	22
2. vonal	36	7	6	23
3. vonal	38	11	4	23
4. vonal	31	4	5	22
5. vonal	33	6	13	14
6. vonal	36	4	16	16
7. vonal	32	5	9	18
8. vonal	37	22	9	6
9. vonal	36	9	12	15
10. vonal	14	13	1	0
11. vonal	13	11	2	0
12. vonal	17	16	1	0
13. vonal	16	14	0	0
14. vonal	17	17	0	0
15. vonal	32	30	2	0
16. vonal	33	6	13	14
17. vonal	12	0	1	11
19. vonal	15	0	0	15
20. vonal	19	3	0	16
21. vonal	14	1	3	10
kontroll	15	15	0	0

— 107 — ··· ··· ·-♦* ··»·

Vonal száma: Magába foglalja a transzgént hordozó vonalakat és a transzformálás nélküli kontrollt;

Száma: A transzgént hordozó és a transzformálás nélküli növények darabszáma;

HS: Nagymértékben fogékony, tipikus tüneteket figyeltünk meg a beoltást követően kettő-négy héttel;

T: Toleráns, a tüneteket a beoltást követően öt-nyolc héttel figyeltük meg; és

HR: A növények tünetmentesek maradtak a beoltást követően nyolc héttel is.

Az alábbi 2. táblázat mutatja be a tünetek kifejlődését transzgént hordozó növényekben a transzgént nem hordozó kontroll növényekkel összehasonlítva az öt kiválasztott vonalban külön kísérletekben. A transzgént nem hordozó kontroll növények mind fertőzötté váltak a beoltást követően kettő-négy héttel, ami tipikus GLRaV-2 tüneteket mutatott A/ícotiana benthamiana növényeken, beleértve klorózisos és helyi léziókat, amelyeket szisztémás levélér feltisztulás és levélér nekrózis követett a levelekben. A vizsgált vonalak közül három (1., 4. és 19.) valamely mértékű rezisztenciát mutatott, ami vagy a tünetmentességben vagy a tünetek kifejlődésének a késésében nyilvánult meg. Két további vo^nal ~ ¹². és 13. esetében - közel azonos időben fejlődtek ki tünetek, mint a nem transzformált kontroll növények esetében. Fentről lefelé, a fertőzött növények levelei fokozatosan elsárgultak, elfonnyadtak és elszáradtak és végül a teljes növény elpusztult. Függetlenül attól, hogy mikor történt a fertőzés, a végső eredmény azonos volt. A beol- 108 tást követően hat hétre az összes transzgént nem hordozó növény és a fogékony növények elpusztultak. Néhány toleráns növény is pusztulni kezdett. Ezzel ellentétben a tünetmentes növények normális módon virágot hoztak és beporzódtak, éppúgy, mint a beoltatlan egészséges kontroll növények (13. ábra).

2. táblázat

		vizsgált növények reakciója
vonal száma	száma	HS	T	HR
1. vonal	19	5	6	8
4. vonal	15	9	1	5
12. vonal	16	14	2	0
13. vonal	18	13	5	0
19. vonal	13	10	0	3
transzgént nem hordozó	24	23	1	0

Vonal száma: Magába foglalja a transzgént hordozó vonalakat és a transzformálás nélküli kontrollt;

Száma: A transzgént hordozó és a transzformálás nélküli növények darabszáma;

HS: Nagymértékben fogékony, tipikus tüneteket figyeltünk meg a beoltást követően kettő-négy héttel;

T: Toleráns, a tüneteket a beoltást követően öt-nyolc héttel figyeltük meg; és — 109 — *** *“* ··» * *···

HR: A növények tünetmentesek maradtak a beoltást követően nyolc héttel is.

ELISA-t hajtottunk végre a beoltást követően hat hétre a GLRaV-2 replikáció vizsgálatára a növényekben. Feltételezhetően a CP megemelkedett szintje vírus replikációt tükrözött. Az eredmény azt mutatta, hogy az abszorbancia érték a tüneteket mutató növényekben elérte a 0,7-3,2 OD értéket, összehasonlítva a 0,10-0,13 OD értékkel a beoltást megelőzően. Ezzel ellentétben GLRaV-2-t nem tudtunk kimutatni tünetmentes növényekben, amelyek esetében az abszorbancia értéke ugyanaz, vagy közel ugyanaz volt, mint az egészséges, transzformálás nélküli kontroll növények esetében. Az adatok megerősítették, hogy a vírus replikálódott tüneteket mutató növényekben, de nem replikálódott tünetmentes növényekben. A GLRaV-2 replikációja visszaszorult a tünetmentes növényekben. Ez az eredmény arra utalt, hogy feltételezhetően a CP-közvetített ellenálló képesség mellett további mechanizmus vett részt a rezisztencia kialakításában.

Az 1., 4. és 19. transzgént hordozó rezisztens növényvonalból három R2 utódot állítottunk elő és segítségükkel megvizsgáltuk a transzmisszió stabilitását és azt, hogy a rezisztencia fennmarad-e az R₂ nemzedékben. Ezeket az eredményeket alább a 3. táblázatban mutatjuk be. Az NPT-II analízis feltárta, hogy az R₂ nemzedék még szegregálódik. Az R₂ nemzedékben a CP expresszió továbbra is kimutathatatlan. Beoltás után az összes transzgént nem hordozó növény megfertőződött és GLRaV-2 tüneteket mutatott a leveleken 24 nappal a beoltás után. Ezzel ellentétben a beoltott transz- 110 gént hordozó R₂ utódok különböző szintű ellenálló képességet mutattak, a nagymértékben fogékonytól a nagymértékben ellenállóig. A toleráns és a rezisztens sajátosság a növényekben - sorrendben megfeleltetve - mint késés jelentkezett a tünetek kifejlődésében illetve tünetmentességben nyilvánult meg. A beoltás után 6 héttel GLRaV-2 volt kimutatható a toleráns, tüneteket mutató fertőzött növényekben közvetett ELISA segítségével; de nem volt kimutatható tünetmentes növényekben. Ez az eredmény azt jelezte, hogy a vírus replikáció visszaszorult ezekben a rezisztens növényekben, amelyet Western-blot segítségével is megerősítettünk. Ezek a rezisztens növények tünetmentesek maradtak nyolc héttel a beoltást követően és normális módon virágot hoztak és beporzódtak.

3. táblázat

		NPT-II	vizsgált növények reakciója
vonal száma	növ. száma	pozitív/ negatív	HS	T	HR
1/22 vonal	12	12/20	3	3	6
1/30 vonal	11	8/3	7	2	2
1/31 vonal	11	10/1	6	3	2
1/35 vonal	10	10/0	4	6	0
1/41 vonal	8	7/1	2	2	4
4/139 vonal	12	11/1	4	4	3
4/149 vonal	10	7/3	4	5	1

- Ill -

4/152 vonal	10	8/2	9	0	1
4/174 vonal	9	8/1	4	0	4
19/650 vonal	11	10/1	7	0	2
19/657 vonal	12	12/0	6	2	4
19/659 vonal	12	8/4	5	2	5
19/660 vonal	10	8/2	3	6	1
nem-transzfor- mált	12	0/12	12	0	0
CK					........

HS: Nagymértékben fogékony, tipikus tüneteket figyeltünk meg a beoltást követően kettő-négy héttel;

T: Toleráns, a tüneteket a beoltást követően öt-nyolc héttel figyeltük meg; és

HR: A növények tünetmentesek maradtak a beoltást követően nyolc héttel is.

10. példa

Az RNS-közvetített védelem bizonyítéka transzgént hordozó növényekben

Northern-blot analízis: Teljes RNS-t extraháltunk levelekből a beoltást megelőzően Napoli és munkatársai eljárása szerint [Napoli és mtsai.: Plant Cell 2 279 (1990); amely publikáció teljes egészében a kitanitás részének tekintendő] . Az extrahált RNS koncentrációját spektrofotométer segítségével határoztuk meg OD 260 értéknél. Körülbelül 10 μg teljes RNS-t alkalmaztunk mindegyik mintában. Az alkalmazott próba a GLRaV-2 CP-gén 3'-végi egyharmada volt, ame- 112 lyet random módon jelöltünk ³²P (α-dATP)-vei, a DNS polimeráz-I Klenow fragmensét alkalmazva.

A CP-gén szekvencia 3'-végi egyharmadának megfelelő DNS-t alkalmazva egyetlen sávot tudtunk kimutatni Northern hibridizáció segítségével az 5., 12. és 13. vonalak Rí utódaiból származó fogékony növényekből extrahált RNS-ben. Csak kismértékű szignált kaptunk vagy egyáltalán nem kaptunk szignált az 1., 4. és 19. vonalak Rí utódaiból származó transzgént hordozó növények esetében. Ez az RNS nem található meg a transzformálás nélküli kontroll növényekben. A hibridizációs szignál mérete egy körülbelül 0,9 kb nagyságú nukleinsavnak felel meg, amely körülbelül megegyezik a várható mérettel (14. ábra). Az 1., 4. és 19. vonalakban az RNS expresszió állandó szintje úgyszintén alacsony volt az R₂ utódokban. Ezek az adatok jelezték, hogy a 12. és 13. vonalakból származó fogékony növények magas mRNS szinttel rendelkeznek és az 1., 4. és 19. vonalakból származó transzgént hordozó növények alacsony mRNS szinttel rendelkeznek.

11. példa

Transzgént hordozó szőlőnövények transzformációja és analízise a GLRaV-2 CP-génjével

Növényanyag: A következő gyökértörzs termesztési változatokat alkalmaztuk: Couderc 3309 (3309C) {V. riparia x V. rupestris), Vitis riparia 'Gloire de Montpellier' (Gloire), Teleki 5C (5C) (V. berlandieri x V. riparia) , Millardet et De Grasset 101-14 (101-14 MGT) (V. riparia x V. rupestris)

- 113 és Richter 110 (110R) (V. rupestris χ V. berlandieri) . A Gloire kezdeti embriogén kalluszokat Mozsár és Sülé biztosította (Nővényvédelmi Kutatóintézet, Magyar Tudományos Akadémia, Budapest). Az összes többi növényanyagot a New York Állami Mezőgazdasági Kísérleti Állomás egy szőlőskertjéből kaptuk (Geneva, N.Y.). A rügyeket a csoportokból eltávolítottuk és felület-sterilizáltuk 70%-os etanolban, 1-2 percig. A rügyeket (az üvegházból és szabadföldről) 1%-os nátrium-hipokloritba vittük át 15 percre és ezután háromszor leöblítettük steril kétszer-desztillált vízzel. A porzókat aszeptikus módon kimetszettük a virágrügyekből sztereo mikroszkóp segítségével. A virágport mikroszkóp tárgylemezen egy fedőlemez alatt egy csepp acetocarmin hozzáadása mellett összezúztuk, hogy megfigyeljük a citológiai állapotát. Ezt annak érdekében végeztük, hogy meghatározzuk a legkedvezőbb fázist a kallusz indukálásra.

Szomatikus embriogenezis és regenerálás: Porzókat szélesztettünk aszeptikus körülmények között 40-50 porzó / 9 cm Petri-csésze sűrűséggel, amely MSE-táptalajt tartalmazott. A lemezeket 28 °C-on tenyésztettük, sötétben. Kalluszokat iniciáltunk és 60 nap elteltével embriókat indukáltunk és ezt követően hormon-mentes HMG-táptalajra átvittük differenciálás céljából. Ezután torpedó-fázisú embriókat vittünk át a HMG-táptalajról MGC-táptalajra, hogy elősegítsük az embrió csírázást. A tenyészeteket 26-28 °C-on tartottuk fenn, sötétben és friss táptalajra vittük át 3-4 hetes időközökben. A megnyúlt embriókat ezután gyökereztető táptalajra vittük át bébiételes üvegekbe (üvegenként 5-8

- 114 embrió). Az embriókat szövettenyésztő szobában neveltük 25 °C-on 16 órás napi fotóperiódussal (76 :mol. s) a hajtás és gyökér kialakulás indukálására. Miután a növények kifejlesztették a gyökereiket, az üvegházban talajba ültettük őket.

Transzformálás: A transzformálás során alkalmazott eljárásokat a Scorza és munkatársai által leközölt eljárásokból módosítottuk [Scorza és mtsai.: Plant Cell Rpt. 14 589 (1995); amely publikáció teljes egészében a kitanítás részének tekintendő]. Agrobacterium C58Z707 vagy LBA4404 törzsek tenyészeteit növesztettük éjszakán át LB táptalajon 28 °C-on rázó inkubátorban. A baktériumokat centrifugáltuk (5 perc, 3000-5000 ford/perc) és MS folyékony táptalajban újra szuszpendáltuk (OD 1,0 érték, A₆₀₀ nm-nél) . Az embriókkal rendelkező kalluszokat 15-30 perc időtartamra a baktérium szuszpenzióba merítettük, szárazra leitattuk és HMG-táptalajba átvittük acetosyringone (100 μΜ) jelenlétében vagy anélkül. Az embriogén kalluszokat a baktériummal együtttenyésztettük 48 órán keresztül sötétben, 28 °C-on. Ezt követően a növényanyagot cefotaxim-mal (300 mg/1) és carbenicillin-nel (200 mg/1) kiegészített MS folyékony táptalajban 2-3 alkalommal mostuk. A transzgént hordozó embriók kiválasztásához az anyagot HMG-táptalajra átvittük, amely 20 mg/1 vagy 40 mg/1 kanamicint, 300 mg/1 cefotaximet és 200 mg/1 carbenicillin-t tartalmazott. Alternatív módon - az együtt-tenyésztést követően - az embriogén kalluszokat iniciációs MSE-táptalajra vittük át, amely 25 mg/1 kanamicint plusz a fentebb felsorolt antibiotikumokat tar

- 115 talmazta. Az összes növényanyagot folyamatosan sötétben, 28 °C-on inkubáltuk. A szelekciós táptalajon 3 hónapig történő növesztést követően az embriókat kanamicin nélküli HMGvagy MGC-táptalajra átvittük, hogy elősegítsük az embriók elongációját. Ezt követően az embriókat antibiotikum hiányos gyökereztető táptalajra átvittük. Transzformálás nélküli kalluszokat növesztettünk azonos táptalajon kanamicin jelenlétében és hiányában, hogy igazoljuk a kanamicin szelekciós eljárás hatékonyságát.

Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a megelőzőekben ismertetett specifikációk, megvalósítási módok és példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják és nem korlátozó értelemben kerültek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékű módosítás illetve változtatás hajtható végre, és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körön belülinek tekintendők.

- 116 SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15500 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TAAACATTGC GAGAGAACCC CATTAGCGTC TCCGGGGTGA ACTTGGGAAG GTCTGCCGCC

GCTCAGGTTA TTTATTTCGG

AGCGCGATCG TAAAAACGCA GCGGAGGTAG CTCCCGACAG CCGCAGCGCG GTGTGCTTTC ACAGGGGTGG TGCATGAAGC GGCGGTGACA TGCGTTTTTC AGCGTGCGTA CGAACACTAC TCACTCGCCG CCGCGTGCAC AAATTTCCAC TCGTCCTCAT CATATGAGGT ATTTGTGCGC GGAATGTGGC CTACGGTGGC GCTTGTGGCA TAGCTCTTCG GACTCTGCTT ATGTAAAATA GATCCGACAT CTTTAACCTC CCTAAAAATA TAGCGTTTGG TCGGGCGGCA TTCAATCGAG GAACGGGCGG CCGGCGGATC

CAGTTTCACG CAGCCCTTCG

ACTTCCACCG GTCAGTGTAG GGGCGTGGTC GACAAGAAAC TTTTCCGACG GTGGTTCGGA CCTGAAGAAA ATTAAAGACG GAGATTTTTC TCATCGAACT AGTTTGGCTA AATTGCACGA GGCGGATTAC GTGGCGATGC GAGTAGAGTT ATTTACCCGG CTTTTACTGT CGCCCGTTTA GCGTCTCAGG GCATGCGTTG TGGCTATTAC ACCTCTCGCA TTTTAGAAAC CTTTCCGGCC CGTAATAACG GTGAAGATTA TGCCTTCCTG TGCGATATAC CGTTAAGACG AAACGTGAAG CGTCGAGCAA CCGCGACAAA

CGTTGTATCC GCGCCAAGAG TGAAGGTGGA GTGCGTAGCT CTACGTCTGT TGGCGTTCCC ACCGCGGCGA CGTGATAATC GGCTCTTACG CTTCCGCGTA ACGGCTGCAG ATTCGTCGCG AAGCGAGTGG TGAGAAATTC TGCGTTATGT GTGTGGCGGG ATGGGCGCTG TTACTTGGCC GAGAGTCGGA TTATGCCCTC AGAAGAACTT CGGTGTCGAA ATGTTTATCA CTGTGATTAT GCATTGGCGG TGGTTCGTTC GCGGTCTTCC AGGTGGTCTT GTTACGTCGA ACCGGTAGAC ATGCGCACCG AACCGTAGAG AGAGGATAGA TGAGAAAGGT

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

- 117 ......... —. ··:

TGCGGCAGAG TTCCTAGTGG AGGTTTTTCG CATCTCCTGG TCGGCAACCT TAACGAAGTT	1140
AGGAGGAAGG TAGCTGCCGG ACTTCTACGC TTTCGCGTTG GCGGTGATAT GGATTTTCAT	1200
CGCTCGTTCT CCACCCAAGC GGGCCACCGC TTGCTGGTGT GGCGCCGCTC GAGCCGGAGC	1260
GTGTGCCTTG AACTTTACTC ACCATCTAAA AACTTTTTGC GTTACGATGT CTTGCCCTGT	1320
TCTGGAGACT ATGCAGCGAT GTTTTCTTTC GCGGCGGGCG GCCGTTTCCC TTTAGTTTTG	1380
ATGACTAGAA TTAGATACCC GAACGGGTTT TGTTACTTGG CTCACTGCCG GTACGCGTGC	1440
GCGTTTCTCT TAAGGGGTTT TGATCCGAAG CGTTTCGACA TCGGTGCTTT CCCCACCGCG	1500
GCCAAGCTCA GAAACCGTAT GGTTTCGGAG CTTGGTGAAA GAAGTTTAGG TTTGAACTTG	1560
TACGGCGCAT ATACGTCACG CGGCGTCTTT CACTGCGATT ATGACGCTAA GTTTATAAAG	1620
GATTTGCGTC TTATGTCAGC AGTTATAGCT GGAAAGGACG GGGTGGAAGA GGTGGTACCT	1680
TCTGACATAA CTCCTGCCAT GAAGCAGAAA ACGATCGAAG CCGTGTATGA TAGATTATAT	1740
GGCGGCACTG ACTCGTTGCT GAAACTGAGC ATCGAGAAAG ACTTAATCGA TTTCAAAAAT	1800
GACGTGCAGA GTTTGAAGAA AGATCGGCCG ATTGTCAAAG TGCCCTTTTA CATGTCGGAA	I860
GCAACACAGA ATTCGCTGAC GCGTTTCTAC CCTCAGTTCG AACTTAAGTT TTCGCACTCC	1920
TCGCATTCAG ATCATCCCGC CGCCGCCGCT TCTAGACTGC TGGAAAATGA AACGTTAGTG	1980
CGCTTATGTG GTAATAGCGT TTCAGATATT GGAGGTTGTC CTCTTTTCCA TTTGCATTCC	2040
AAGACGCAAA GACGGGTTCA CGTATGTAGG CCTGTGTTGG ATGGCAAGGA TGCGCAGCGT	2100
CGCGTGGTGC GTGATTTGCA GTATTCCAAC GTGCGTTTGG GAGACGATGA TAAAATTTTG	2160
GAAGGGCCAC GCAATATCGA CATTTGCCAC TATCCTCTGG GCGCGTGTGA CCACGAAAGT	2220
AGTGCTATGA TGATGGTGCA GGTGTATGAC GCGTCCCTTT ATGAGATATG TGGCGCCATG	2280
ATCAAGAAGA AAAGCCGCAT AACGTACTTA ACCATGGTCA CGCCCGGCGA GTTTCTTGAC	2340
GGACGCGAAT GCGTCTACAT GGAGTCGTTA GACTGTGAGA TTGAAGTTGA TGTGCACGCG	2400
GACGTCGTAA TGTACAAATT CGGTAGTTCT TGCTATTCGC ACAAGCTTTC AATCATCAAG	2460
GACATCATGA CCACTCCGTA CTTGACACTA GGTGGTTTTC TATTCAGCGT GGAGATGTAT	2520
GAGGTGCGTA TGGGCGTGAA TTACTTCAAG ATTACGAAGT CCGAAGTATC GCCTAGCATT	2580
AGCTGCACCA AGCTCCTGAG ATACCGAAGA GCTAATAGTG ACGTGGTTAA AGTTAAACTT	2640
CCACGTTTCG ATAAGAAACG TCGCATGTGT CTGCCTGGGT ATGACACCAT ATACCTAGAT	2700
TCGAAGTTTG TGAGTCGCGT TTTCGATTAT GTCGTGTGTA ATTGCTCTGC CGTGAACTCA	2760
AAAACTTTCG AGTGGGTGTG GAGTTTCATT AAGTCTAGTA AGTCGAGGGT GATTATTAGC	2820

« - 118 - .:. .	:· ···· u.’. ··;
GGTAAAATAA TTCACAAGGA TGTGAATTTG GACCTCAAGT ACGTCGAGAG TTTCGCCGCG	2880
GTTATGTTGG CCTCTGGCGT GCGCAGTAGA CTAGCGTCCG AGTACCTTGC TAAGAACCTT	2340
AGTCATTTTT CGGGAGATTG CTCCTTTATT GAAGCCACGT CTTTCGTGTT GCGTGAGAAA	3000
atcagaaaca tgactctgaa ttttaacgaa agacttttac agttagtgaa GCGCGTTGCC	3060
TTTGCGACCT TGGACGTGAG TTTTCTAGAT TTAGATTCAA CTCTTGAATC AATAACTGAT	3120
TTTGCCGAGT GTAAGGTAGC GATTGAACTC GACGAGTTGG GTTGCTTGAG AGCGGAGGCC	3180
gagaatgaaa aaatcaggaa TCTGGCGGGA GATTCGATTG cggctaaact cgcgagcgag	3240
ATAGTGGTCG ATATTGACTC TAAGCCTTCA CCGAAGCAGG TGGGTAATTC GTCATCCGAA	3300
AACGCCGATA AGCGGGAAGT TCAGAGGCCC GGTTTGCGTG GTGGTTCTAG AAACGGGGTT	3360
GTTGGGGAGT TCCTTCACTT CGTCGTGGAT TCTGCCTTGC GTCTTTTCAA ATACGCGACG	3420
GATCAACAAC GGATCAAGTC TTACGTGCGT TTCTTGGACT CGGCGGTCTC ATTCTTGGAT	3480
TACAACTACG ATAATCTATC GTTTATACTG CGAGTGCTTT CGGAAGGTTA TTCGTGTATG	3540
TTCGCGTTTT TGGCGAATCG CGGCGACTTA TCTAGTCGTG TCCGTAGCGC GGTGTGTGCT	3600
gtgaaagaag ttgctacctc ATGCGCGAAC GCGAGCGTTT CTAAAGCCAA ggttatgatt	3660
ACCTTCGCAG cggccgtgtg tgctatgatg TTTAATAGCT GCGGTTTTTC AGGCGACGGT	3720
CGGGAGTATA AATCGTATAT ACATCGTTAC ACGCAAGTAT TGTTTGACAC TATCTTTTTT	3780
GAGGACAGCA GTTACCTACC CATAGAAGTT CTGAGTTCGG CGATATGCGG TGCTATCGTC	3840
ACACTTTTCT CCTCGGGCTC GTCCATAAGT TTAAACGCCT TCTTACTTCA AATTACCAAA	3300
GGATTCTCCC TAGAGGTTGT CGTCCGGAAT GTTGTGCGAG TCACGCATGG TTTGAGCACC	3360
ACAGCGACCG ACGGCGTCAT ACGTGGGGTT TTCTCCCAAA TTGTGTCTCA CTTACTTGTT	4020
GGAAATACGG GTAATGTGGC TTACCAGTCA GCTTTCATTG CCGGGGTGGT GCCTCTTTTA	4080
GTTAAAAAGT GTGTGAGCTT AATCTTCATC TTGCGTGAAG ATACTTATTC CGGTTTTATT	4140
AAGCACGGAA TCAGTGAATT CTCTTTCCTT AGTAGTATTC TGAAGTTCTT GAAGGGTAAG	4200
CTTGTGGACG AGTTGAAATC GATTATTCAA GGGGTTTTTG ATTCCAACAA GCACGTGTTT	4260
AAAGAAGCTA CTCAGGAAGC GATTCGTACG ACGGTCATGC AAGTGCCTGT CGCTGTAGTG	4320
GATGCCCTTA AGAGCGCCGC GGGAAAAATT TATAACAATT TTACTAGTCG ACGTACCTTT	4380
GGTAAGGATG AAGGCTCCTC TAGCGACGGC GCATGTGAAG AGTA1TTCTC ATGCGACGAA	4440
GGTGAAGGTC CGGGTCTGAA AGGGGGTTCC AGCTATGGCT tctcaatttt AGCGTTCTTT	4500
TCACGCATTA TGTGGGGAGC TCGTCGGCTT ATTGTTAAGG TGAAGCATGA GTGTTTTGGG	4560
AAACTTTTTG aatttctatc gctcaagctt cacgaattca ggactcgcgt ttttgggaag	4620

- 119 AATAGAACGG ACGTGGGAGT TTACGATTTT TTGCCCACGG GCATCGTGGA AACGCTCTCA4680

TCGATAGAAG AGTGCGACCA AATTGAAGAA CTTCTCGGCG ACGACCTGAA AGGTGACAAG4740

GATGCTTCGT TGACCGATAT GAATTACTTT GAGTTCTCAG AAGACTTCTT AGCCTCTATC4800

GAGGAGCCGC CTTTCGCTGG ATTGCGAGGA GGTAGCAAGA ACATCGCGAT TTTGGCGATT4860

TTGGAATACG CGCATAATTT GTTTCGCATT GTCGCAAGCA AGTGTTCGAA ACGACCTTTA4920

TTTCTTGCTT TCGCCGAACT CTCAAGCGCC CTTATCGAGA AATTTAAGGA GGTTTTCCCT4980

CGTAAGAGCC AGCTCGTCGC TATCGTGCGC GAGTATACTC AGAGATTCCT CCGAAGTCGC5040

ATGCGTGCGT TGGGTTTGAA TAACGAGTTC GTGGTAAAAT CTTTCGCCGA TTTGCTACCC5100

GCATTAATGA AGCGGAAGGT TTCAGGTTCG TTCTTAGCTA GTGTTTATCG CCCACTTAGA5160

GGTTTCTCAT ATATGTGTGT TTCAGCGGAG CGACGTGAAA AGTTTTTTGC TCTCGTGTGT5220

TTAATCGGGT TAAGTCTCCC TTTCTTCGTG CGCATCGTAG GAGCGAAAGC GTGCGAAGAA5280

CTCGTGTCCT CAGCGCGTCG CTTTTATGAG CGTATTAAAA TTTTTCTAAG GCAGAAGTAT534 0

GTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTGTCACTTG TTTAGCTCTG ACGTTGATGA CAGTTCCGCA5400

TCTGCAGGGT TGAAAGGTGG TGCGTCGCGA ATGACGCTCT TCCACCTTCT GGTTCGCCTT5460

GCTAGTGCCC TCCTATCGTT AGGGTGGGAA GGGTTAAAGC TACTCTTATC GCACCACAAC5520

TTGTTATTTT TGTGTTTTGC ATTGGTTGAC GATGTGAACG TCCTTATCAA AGTTCTTGGG5580

GGTCTTTCTT TCTTTGTGCA ACCAATCTTT TCCTTGTTTG CGGCGATGCT TCTACAACCG5640

GACAGGTTTG TGGAGTATTC CGAGAAACTT GTTACAGCGT TTGAATTTTT CTTAAAATGT5700

TCGCCTCGCG CGCCTGCACT ACTCAAAGGG TTTTTTGAGT GCGTGGCGAA CAGCACTGTG5760

TCAAAAACCG TTCGAAGACT TCTTCGCTGT TTCGTGAAGA TGCTCAAACT TCGAAAAGGG5820

CGAGGGTTGC GTGCGGATGG TAGGGGTCTC CATCGGCAGA AAGCCGTACC CGTCATACCT5880

TCTAATCGGG TCGTGACCGA CGGGGTTGAA AGACTTTCGG TAAAGATGCA AGGAGTTGAA5940

GCGTTGCGTA CCGAA.TTGAG AATCTTAGAA GATTTAGATT CTGCCGTGAT CGAAAAACTC6000

AATAGACGCA GAAATCGTGA CACTAATGAC GACGAATTTA CGCGCCCTGC TCATGAGCAG6060

ATGCAAGAAG TCACCACTTT CTGTTCGAAA GCCAACTCTG CTGGTTTGGC CCTGGAAAGG6120

GCAGTGCTTG TGGAAGACGC TATAAAGTCG GAGAAACTTT CTAAGACGGT TAATGAGATG6180

GTGAGGAAAG GGAGTACCAC CAGCGAAGAA GTGGCCGTCG CTTTGTCGGA CGATGAAGCC6240

GTGGAAGAAA TCTCTGTTGC TGACGAGCGA GACGATTCGC CTAAGACAGT CAGGATAAGC6300

GAATACCTAA ATAGGTTAAA CTCAAGCTTC GAATTCCCGA AGCCTATTGT TGTGGACGAC6360

- 120 -

aacaaggata	CCGGGGGTCT	AACGAACGCC	gtgagggagt	TTTATTATAT	GCAAGAACTT	6420
GCTCTTTTCG	AAATCCACAG	CAAACTGTGC	ACCTACTACG	ATCAACTGCG	catagtcaac	6480
TTCGATCGTT	CCGTAGCACC	atgcagcgaa	GATGCTCAGC	TGTACGTACG	gaagaacggc	6540
TCAACGATAG	TGCAGGGTAA	AGAGGTACGT	TTGCACATTA	AGGATTTCCA	cgatcacgat	6600
TTCCTGTTTG	acggaaaaat	TTCTATTAAC	AAGCGGCGGC	GAGGCGGAAA	tgttttatat	6660
CACGACAACC	TCGCGTTCTT	GGCGAGTAAT	TTGTTCTTAG	CCGGCTACCC	CTTTTCAAGG	6720
AGCTTCGTCT	TCACGAATTC	GTCGGTCGAT	ATTCTCCTCT	ACGAAGCTCC	ACCCGGAGGT	6780
GGTAAGACGA	CGACGCTGAT	TGACTCGTTC	TTGAAGGTCT	TCAAGAAAGG	TGAGGTTTCC	6840
ACCATGATCT	TAACCGCCAA	CAAAAGTTCG	CAGGTTGAGA	TCCTAAAGAA	AGTGGAGAAG	6900
gaagtgtcta	ACATTGAATG	CCAGAAACGT	aaagacaaaa	gatctccgaa .	aaagagcatt	6960
TACACCATCG	ACGCTTATTT AATGCATCAC I	CGTGGTTGTG .	atgcagacgt '	rCTTTTCATC	7020

ΟΛΤ^ττ TCATSOTTCA _TGGGGGTAGG GTACTASCTT CCATTCACTT CACOA^ ₇₀₈₀ CATAAAGTAA 1X3ATCTTCCG GCATACCCCG CAGATTCACT ACATTGAAAG GAACGAATTG ₇₁₄₈ OACAAGTCTT TGTATGGGGA TCTCGACAGG TTCGTGGACC TCCAGTGTCG GCTTTATGGT „„ aatatttcgt accgttgtcc atgggatgtg zgggcttggt «vagcacagt _{CTMCCCAAt; 7260}

CTAATCGCCA CCGTGAAGGG TGAAAGCGAA GGTAAGAGCA GCATGCGCAT TAACGAAATT	7320
AATTCAGTCG	ACGATTTAGT	CCCCGACGTG	GGTTCCACGT	TTCTGTGTAT	gcttcagtcg	7380
GAGAAGTTGG	AAATCAGCAA	GCACTTTATT	CGCAAGGGTT	tgactaaact	TAACGTTCTA	7440
ACGGTGCATG	aggcgcaagg	TGAGACGTAT	GCGCGTGTGA	ACCTTGTGCG	ACTTAAGTTT	7500
CAGGAGGATG	AACCCTTTAA	ATCTATCAGG	CACATAACCG	TCGCTCTTTC	TCGTCACACC	7560
GACAGCTTAA	CTTATAACGT	CTTAGCTGCT	CGTCGAGGTG	ACGCCACTTG	CGATGCCATC	7620
CAGAAGGCTG	CGGAATTGGT	GAACAAGTTT	CGCGTTTTTC	CTACATCTTT	TGGTGGTAGT	7680
GTTATCAATC	TCAACGTGAA	GAAGGACGTG	gaagataaca	GTAGGTGCAA	GGCTTCGTCG	7740
GCACCATTGA	GCGTAATCAA	CGACTTTTTG	AACGAAGTTA	ATCCCGGTAC	TGCGGTGATT	7800
gattttggtg	ATTTGTCCGC	GGACTTCAGT .	ACTGGGCCTT	TTGAGTGCGG	TGCCAGCGGT	7860

attgtggtoc gggacaacat ctcctccagc aacatcactg atcacgataa GCAGCCTGTT ₇₉20 TAGCGTAGTT CGGTCGCAGG CGATTCCGCG TAGAAAACCT TCTCTACAAG AAAATTTGTA ₇₉₈₀ TTCGTTTGAA GCGCGGAATT ATAACTTCTC GACTTGCGAC CGTAACACAT CTQCTTCAAT ,_M, ««CGGAGAG GCTAIGGOGA TGAACTGTCT TCGTCGTTGC TTCGACCTAG A1GCCTTTTC ₈₁00 gtccctgcgt gatgatgtca ttagtatcac acgttcaggc atcgaacaat ggctosagaa ₈₁₆₀

- 121 -

ACGTACTCCT AGTCAGATTA	AAGCATTAAT GAAGGATGTT GAATCGCCTT TGGAAATTGA	8220
CGATGAAATT TGTCGTTTTA	AGTTGATGGT GAAGCGTGAC GCTAAGGTGA AGTTAGACTC	8280
TTCTTGTTTA ACTAAACACA	GCGCCGCTCA AAATATCATG TTTCATCGCA AGAGCATTAA	8340
TGCTATCTTC TCTCCTATCT	TTAATGAGGT GAAAAACCGA ATAATGTGCT GTCTTAAGCC	8400
TAACATAAAG TTTTTTACGG	AGATGACTAA CAGGGATTTT GCTTCTGTTG TCAGCAACAT	8460

GCTTGGTCAC GACOMCTst ACCATATACG TCAACTTGAT TTCTCMAOT ACGACMffirc ₈₅₂₀ TOUUautCCT TTCGTOAMO CTTTTGAAGA AGTAATGTAT AAGGAACTCG GTGTTGATGA BSSO

AGAGTTGCTG	GCTATCTGGA	TGTGCGGCGA	GCGGTTATCG	ATAGCTAACA	CTCTCGATGG	8640
TCAGTTGTCC	TTCACGATCG	AGAATCAAAG	GAAGTCGGGA	GCTTCGAACA	CTTGGATTGG	8700
TAACTCTCTC	GTCACTTTGG	GTATTTTAAG	TCTTTACTAC	GACGTTAGAA	ATTTCGAGGC	8760
GTTGTACATC	TCGGGCGATG	ATTCTTTAAT	TTTTTCTCGC	AGCGAGATTT	CGAATTATGC	8820
CGACGACATA	TGCACTGACA	TGGGTTTTGA	GACAAAATTT	ATGTCCCCAA	GTGTCCCGTA	8880
CTTTTGTTCT	AAATTTGTTG	TTATGTGTGG	TCATAAGACG	TTTTTTGTTC	CCGACCCGTA	8940
CAAGCTTTTT	GTCAAGTTGG	GAGCAGTCAA	AGAGGATGTT	TCAATGGATT	TCCTTTTCGA	9000

OACTTTTACC TCCTTTAMG ACTTAACCTC CGATCTIMC GACGAGCGCT TAATTCAAM _S060 gctcgctgaa cttctggctt gg^-caaagc ggcaagacca _CCTTOgcgtt

AAGTGTGATA CATTGTTTGC GTTCGAATTT CCTCTCGTTT AGCftAGTTAT ATCCTCGCOT

GAAGOGATGG CAGGTTTTTT ACACGTCGGT TAAGAAAGCG CTTCTCMG* GTGGGTGTTC

TCTCTTCGAC AOTTTCATOA CCCCTTTTGG TCAGGCTOTC ATGGTTTO ATGATGAGTA SCCCTMCTT GTGCGCAGTG TCTTTGTTCG TGACATACAC CTTOTGTGTC ACCGTGCGTT TATAATGAAT CMGTTTOC AGTTTGAATG mGTTTCTG CTOAATCTCG CGGTTTTMC

TSTGACTTTC ATTTTOOTe TTCTGGTCTT CCGCOTGATT AACTCTTTTC SCCAGAAGGG

TCACGAAGCA CCTOTTCCCG TTGTGCGTGG CGGGGOTm TCAACCCTAC TCTAGTCAAA

AGACGCGCAT ATGGTASTTT TCGGTrrGGA CTOGCACG ACATTCTCTA CGGTGTCaTGT gtacamom ogacsagttt TTTCATTCAA GCAGAMAAT TCGGCOTACA tccccactta

CCTCTATCTC TTCTCCGATT CTAACCACM GACTTTTGGT TACGAGGCCG AATCACTCAT gagtaatctg aaagttaaag gttcctttta tmmattbl aaacgtogg TKGT-recOA rrCGAGTAAC CTCGACGCGT ACCATCACCG TTTAAAACCT CATTACTCGG TCCGCTTGGT

TAAOATCGOC TCAGGCTTGA ACGAAACTCT TTCAATTGGA MCTTCGGGG GCACTGTTAA

GTCTGAGGCT CATCTGCCAG GGTTGATAGC TCTCTTTATT AACGCTGTCA TTAOTTGCGC

- 122 -

GGAGGGCGCG	TTTGCGTGCA CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA	10020
TAGCGTTCAA	AGGAATTTCA CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA	10080
TATGATCAAT	GAACCTTCAG CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC	10140
CGCAAATTTG	GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA	10200

CCGCAACAAT ACTTTTGTTO TGCGAGCTTC TGGAGQCCAT CTAAATCTCG GTCCAAGGGA ₁₀₂₆₀

WTOATCGT gcgtttctca cgcacctctt ctctttmca TCCCTCGAAC CTOACCTCAC ₁₀₃29

TTTGGATATC	TCGAATCTGA	aagaatcttt	ATCAAAAACG	gacgcagaga	TAGTTTACAC	10380
TTTGAGAGGT	GTCGATGGAA	gaaaagaaga	CGTTAGAGTA	aacaaaaaca	TTCTTACGTC	10440
GGTGATGCTC	CCCTACGTGA	ACAGAACGCT	taagatatta	GAGTCAACCT	TAAAATCGTA	10500
tgctaagagt	ATGAATGAGA	gtgcgcgagt	TAAGTGCGAT	TTAGTGCTGA	TAGGAGGATC	10560
TTCATATCTT	CCTGGCCTGG	CAGACGTACT	AACGAAGCAT	CAGAGCGTTG	ATCGTATCTT	10620
AAGAGTTTCG	GATCCTCGGG	CTGCCGTGGC	CGTCGGTTGC	GCATTATATT	CTTCATGCCT	10680
CTCAGGATCT	GGGGGGTTGC	TACTGATCGA	CTGTGCAGCT	CACACTGTCG	CTATAGCGGA	10740

CAGAftGTTGT CATCAAATCA TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAQGAAG _loeoo CATGCCTTTG TACTTAGCCA GCGTCAACAA GAACTCCCAG CGTGAAGTCG CCGTCTTTGA _108£0 AGGGGAGTAC GTTAAGTOCC CTAAGAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTr 10920 TGATATAGGA GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT 10980 TTCAAGCGTA GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGCGTAAGC AAGTGTCACT H040 CACTGGAACT CCAGCGTATA ACTTTTCGTC T_STCOCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA ₁₁₁₀₀

attgcatatt	AGTTTAAATA	ATAAAGTTTT	TCTCGGTTTG	CTTCTACATA	gaaaggcgga	11160
TCGACGAATA	CTTTTCACTA	AGGATGAAGC	GATTCGATAC	gccgattcaa	TTGATATCGC	11220
ggatgtgcta	AAGGAATATA	AAAGTTACGC	ggccagtgcc	TTACCACCAG	ACGAGGATGT	11280
CGAATTACTC	CTGGGAAAGT	CTGTTCAAAA	AGTTTTACGG	GGAAGCAGAC	TGGAAGAAAT	11340
ACCTCTCTAG	GAGCATAGCA	GCACACTCAA	GTGAAATTAA	AACTCTACCA	GACATTCGAT	11400
TGTACGGCGG	TAGGGTTGTA	AAGAAGTCCG	AATTCGAATC	AGCACTTCCT	AATTCTTTTG	11460
AACAGGAATT	AGGACTGTTC	atactgagcg	AACGGGAAGT	GGGATGGAGC	AAATTATGCG	11520
gaataacggt	GGAAGAAGCA	GCATACGATC	TTACGAATCC	CAAGGCTTAT	AAATTCACTG	11580
CCGAGACATG	TAGCCCGGAT	GTAAAAGGTG	aaggacaaaa	ATACTCTATG	GAAGACGTGA	11640
TGAATTTCAT	GCGTTTATCA	aatctggatg	TTAACGACAA	GATGCTGACG	GAACAGTGTT	11700

GGTCGCTGTC CAATTCATGC GGTGAATTGA TCAACCCAGA CGACAAAGGG CGATTCGTGG n_7eo

123 CTCTCACCTT TAAGGACAGA GACACAGCTG ATGACACGGG TGCCGCCAAC GTGGAATGTC 11820

GCGTGGGCGA CTATCTAGTT TACGCTATGT CCCTGTTTGA GCAGAGGACC CAAAAATCGC 11880

AGTCTGGCAA CATCTCTCTG TACGAAAAGT ACTGTGAATA CATCAGGACC TACTTAGGGA 11940

GTACAGACCT GTTCTTCACA GCGCCGGACA GGATTCCGTT ACTTACGGGC ATCCTATACG 12000

ATTTTTGTAA GGAATACAAC GTTTTCTACT CGTCATATAA GAGAAACGTC GATAATTTCA 12060

GATTCTTCTT GGCGAATTAT ATGCCTTTGA TATCTGACGT CTTTGTCTTC CAGTGGGTAA 12120

AACCCGCGCC GGATGTTCGG CTGCTTTTTG AGTTAAGTGC AGCGGAACTA ACGCTGGAGG 12180

TTCCCACACT GAGTTTGATA GATTCTCAAG TTGTGGTAGG TCATATCTTA AGATACGTAG 12240

AATCCTACAC ATCAGATCCA GCCATCGACG CGTTAGAAGA CAAACTGGAA GCGATACTGA 12300

AAAGTAGCAA TCCCCGTCTA TCGACAGCGC AACTATGGGT TGGTTTCTTT TGTTACTATG 12360

GTGAGTTTCG TACGGCTCAA AGTAGAGTAG TGCAAAGACC AGGCGTATAC AAAACACCTG 12420

ACTCAGTGGG TGGATTTGAA ATAAACATGA AAGATGTTGA GAAATTCTTC GATAAACTTC 12480

AGAGAGAATT GCCTAATGTA TCTTTGCGGC GTCAGTTTAA CGGAGCTAGA GCGCATGAGG 12540

CTTTCAAAAT ATTTAAAAAC GGAAATATAA GTTTCAGACC TATATCGCGT TTAAACGTGC 12600

CTAGAGAGTT CTGGTATCTG AACATAGACT ACTTCAGGCA CGCGAATAGG TCCGGGTTAA 12660

CCGAAGAAGA AATACTCATC CTAAACAACA TAAGCGTTGA TGTTAGGAAG TTATGCGCTG 12720

AGAGAGCGTG CAATACCCTA CCTAGCGCGA AGCGCTTTAG TAAAAATCAT AAGAGTAATA 12780

TACAATCATC ACGCCAAGAG CGGAGGATTA AAGACCCATT GGTAGTCCTG AAAGACACTT 12840

TATATGAGTT CCAACACAAG CGTGCCGGTT GGGGGTCTCG AAGCACTCGA GACCTCGGGA 12900

GTCGTGCTGA CCACGCGAAA GGAAGCGGTT GATAAGTTTT TTAATGAACT AAAAAACGAA 12960

AA.TTACTCAT CAGTTGACAG CAGCCGATTA AGCGATTCGG AAGTAAAAGA AGTGTTAGAG 13020

AAAAGTAAAG AAAGTTTCAA AAGCGAACTG GCCTCCACTG ACGAGCACTT CGTCTACCAC 13080

ΑΤΤΑΤΑΤΤΤΤ TCTTAATCCG ATGTGCTAAG ATATCGACAA GTGAAAAGGT GAAGTACGTT 13140

GGTAGTCATA CGTACGTGGT CGACGGAAAA ACGTACACCG TTCTTGACGC TTGGGTATTC 13200

AACATGATGA AAAGTCTCAC GAAGAAGTAC AAACGAGTGA ATGGTCTGCG TGCGTTCTGT 13260

TGCGCGTGCG AAGATCTATA TCTAACCGTC GCACCAATAA TGTCAGAACG CTTTAAGACT 13320

AAAGCCGTAG GGATGAAAGG TTTGCCTGTT GGAAAGGAAT ACTTAGGCGC CGACTTTCTT 13380

TCGGGAACTA GCAAACTGAT GAGCGATCAC GACAGGGCGG TCTCCATCGT TGCAGCGAAA 13440

AACGCTGTCG ATCGTAGCGC TTTCACGGGT GGGGAGAGAA AGATAGTTAG TTTGTATGAT 13500

CTAGGGAGGT ACTAAGCACG GTGTGCTATA GTGCGTGCTA ΤΆΑΤΑΑΤΑΑΑ CACTAGTGCT 13560

-124- -ί. .:.

TAAGTCGCGC AGAAGAAAAC GCTATGGAGT TGATGTCCGA CAGCAACCTT AGCAACCTGG 13620 TGATAACCGA CGCCTCTAGT CTAAATGGTG TCGACAAGAA GCTTTTATCT GCTGAAGTTG 13680 AAAAAATGTT GGTGCAGAAA GGGGCTCCTA ACGAGGGTAT AGAAGTGGTG TTCGGTCTAC 13740 TCCTTTACGC ACTCGCGGCA AGAACCACGT CTCCTAAGGT TCAGCGCGCA GATTCAGACG 13800 TTATATTTTC AAATAGTTTC GGAGAGAGGA ATGTGGTAGT AACAGAGGGT GACCTTAAGA 13860 AGGTACTCGA CGGGTGTGCG CCTCTCACTA GGTTCACTAA TAAACTTAGA ACGTTCGGTC 13920 GTACTTTCAC TGAGGCTTAC GTTGACTTTT GTATCGCGTA TAAGCACAAA TTACCCCAAC 13980 TCAACGCCGC GGCGGAATTG GGGATTCCAG CTGAAGATTC GTACTTAGCT GCAGATTTTC 14040 TGGGTACTTG CCCGAAGCTC TCTGAATTAC AGCAAAGTAG GAAGATGTTC GCGAGTATGT 14100 ACGCTCTAAA AACTGAAGGT GGAGTGGTAA ATACACCAGT GAGCAATCTG CGTCAGCTAG 14160 GTAGAAGGGA AGTTATGTAA TGGAAGATTA CGAAGAAAAA TCCGAATCGC TCATACTGCT 14220 ACGCACGAAT CTGAACACTA TGCTTTTAGT GGTCAAGTCC GATGCTAGTG TAGAGCTGCC 14280 TAAACTACTA ATIrGCGŰTT ACTTACGAGT GTCAGGACGT GGGGAGGTGA CGTGTTGCAA 14340 CCGTGAGGAA TTAACAAGAG ATTTTGAGGG CAATCATCAT ACGGTGATCC GTTCTAGAAT 14400 CATACAATAT GACAGCGAGT CTGCTTTTGA GGAATTCAAC AACTCTGATT GCGTAGTGAA 14460 GTTTTTCCTA GAGACTGGTA GTGTCTTTTG GTTTTTCCTT CGAAGTGAAA CCAAAGGTAG 14520 AGCGGTGCGA CATTTGCGCA CCTTCTTCGA AGCTAACAAT TTCTTCTTTG GATCGCATTG 14 580

CGGTACCATG GAGTATTGTT TGAAGCAGGT ACTAACTGAA ACTGAATCTA TAATCGATTC 14640 TTTTTGCGAA GAAAGAAATC GTTAAGATGA GGGTTATAGT GTCTCCTTAT GAAGCTGAAG 14700 ACATTCTGAA AAGATCGACT GACATGTTAC GAAACATAGA CAGTGGGGTC TTGAGCACTA 14760 AAGAATGTAT CAAGGCATTC TCGACGATAA CGCGAGACCT ACATTGTGCG AAGGCTTCCT 14820 ACCAGTGGGG TGTTGACACT GGGTTATATC AGCGTAATTG CGCTGAAAAA CGTTTAATTG 14880 ACACGGTGGA GTCAAACATA CGGTTGGCTC AACCTCTCGT GCGTGAAAAA GTGGCGGTTC 14940 ATTTTTGTAA GGATGAACCA AAAGAGCTAG TAGCATTCAT CACGCGAAAG TACGTGGAAC 15000 TCACGGGCGT GGGAGTGAGA GAAGCGGTGA AGAGGGAAAT GCGCTCTCTT ACCAAAACAG 15060 TTTTAAATAA AATGTCTTTG GAAATGGCGT TTTACATGTC ACCACGAGCG TGGAAAAACG 15120 CTGAATGGTT AGAACTAAAA TTTTCACCTG TGAAAATCTT TAGAGATCTG CTATTAGACG 15180 TGGAAACGCT CAACGAATTG TGCGCCGAAG ATGATGTTCA CGTCGACAAA GTAAATGAGA 15240 ATGGGGACGA AAATCACGAC CTCGAACTCC AAGACGAATG TTAAACATTG GTTAAGTTTA 15300

- 125 ACGAAAATGA TTAGTAAATA ATAAATCGAA CGTGGGTGTA TCTACCTGAC GTATCAACTT 15360

AAGCTGTTAC TGAGTAATTA AACCAACAAG TGTTGGTGTA ATGTGTATGT TGATGTAGAG 15420

AAAAATCCGT TTGTAGAACG GTGTTTTTCT CTTCTTTATT TTTAAAAAAA AAATAAAAAA 15480

ΑΑΆΑΑΑΑΑΑΑ AAGCGGCCGC 15500

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7920 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACATTGCGAG	AGAACCCCAT	TAGCGTCTCC	GGGGTGAACT	TGGGAAGGTC	TGCCGCCGCT	60
CAGGTTATTT	ATTTCGGCAG	TTTCACGCAG	CCCTTCGCGT	TGTATCCGCG	CCAAGAGAGC	120
GCGATCGTAA	AAACGCAACT	TCCACCGGTC	AGTGTAGTGA	AGGTGGAGTG	CGTAGCTGCG	180
GAGGTAGCTC	CCGACAGGGG	CGTGGTCGAC	AAGAAACCTA	CGTCTGTTGG	CGTTCCCCCG	240
CAGCGCGGTG	TGCTTTCTTT	TCCGACGGTG	GTTCGGAACC	GCGGCGACGT	GATAATCACA	300
GGGGTGGTGC	ATGAAGCCCT	GAAGAAAATT	AAAGACGGGC	TCTTACGCTT	CCGCGTAGGC	360
UU IXiACAi G C	GTTTTTCGAG	ATTTTTUIUA	TCGAACTACG	GCTGCAGATT	CGTCGCGAGC	420
GTGCGTACGA	ACACTACAGT	TTGGCTAAAT	TGCACGAAAG	CGAGTGGTGA	GAAATTCTCA	480
CTCGCCGCCG	CGTGCACGGC	GGATTACGTG	GCGATGCTGC	GTTATGTGTG	TGGCGGGAAA	540
TTTCCACTCG	TCCTCATGAG	TAGAGTTATT	TACCCGGATG	GGCGCTGTTA	CTTGGCCCAT	600
ATGAGGTATT	TGTGCGCCTT	TTACTGTCGC	CCGTTTAGAG	AGTCGGATTA	TGCCCTCGGA	660
ATGTGGCCTA	CGGTGGCGCG	TCTCAGGGCA	TGCGTTGAGA	AGAACTTCGG	TGTCGAAGCT	720
TGTGGCATAG	CTCTTCGTGG	CTATTACACC	TCTCGCAATG	TTTATCACTG	TGATTATGAC	780
TCTGCTTATG	ΤΆΑΑΑΤΑΤΤΤ	TAGAAACCTT	TCCGGCCGCA	TTGGCGGTGG	TTCGTTCGAT	840
CCGACATCTT	TAACCTCCGT	AATAACGGTG	AAGATTAGCG	GTCTTCCAGG	TGGTCTTCCT	900
AAAAATATAG	CGTTTGGTGC	CTTCCTGTGC	GATATACGTT	ACGTCGAACC	GGTAGACTCG	960
GGCGGCATTC	AATCGAGCGT	TAAGACGAAA	CGTGAAGATG	CGCACCGAAC	CGTAGAGGAA	1020

CGGGCGGCCG GCGGATCCGT CGAGCAACCG CGACAAAAGA GGATAGATGA GAAAGGTTGC

1080

- 126 -

GGCAGAGTTC CTAGTGGAGG TTTTTCGCAT CTCCTGGTCG GCAACCTTAA CGAAGTTAGG aggaaggtag ctgccggact tctacgcttt cgcgttggcg gtgatatgga ttttcatcgc TCGTTCTCCA CCCAAGCGGG CCACCGCTTG CTGGTGTGGC GCCGCTCGAG CCGGAGCGTG TGCCTTGAAC TTTACTCACC ATCTAAAAAC TTTTTGCGTT ACGATGTCTT GCCCTGTTCT GGAGACTATG CAGCGATGTT ttctttcgcg gcgggcggcc gtttcccttt agttttgatc ACTAGAATTA GATACCCGAA CGGGTTTTGT TACTTGGCTC ACTGCCGGTA CGCGTGCGCG TTTCTCTTAA GGGGTTTTGA TCCGAAGCGT TTCGACATCG GTGCTTTCCC CACCGCGGCC aagctcagaa accgtatggt ttcggagctt GGTGAAAGAA gtttaggttt GAACTTGTAC ggcgcatata cgtcacgcgg cgtctttcac tgcgattatg ACGCTAAGTT TATAAAGGAT TTGCGTCTTA tgtcagcagt tatagctgga aaggacgggg tggaagaggt ggtaccttct GACATAACTC CTGCCATGAA GCAGAAAACG ATCGAAGCCG TGTATGATAG ATTATATGGC GGCACTGACT CGTTGCTGAA ACTGAGCATC GAGAAAGACT TAATCGATTT CAAAAATGAC gtgcagagtt tgaagaaaga tcggccgatt gtcaaagtgc ccttttacat gtcggaagca acacagaatt cgctgacgcg tttctaccct cagttcgaac ttaagttttc gcactcctcg CATTCAGATC ATCCCGCCGC CGCCGCTTCT AGACTGCTGG AAAATGAAAC GTTAGTGCGC TTATGTGGTA ATAGCGTTTC AGATATTGGA GGTTGTCCTC TTTTCCATTT GCATTCCAAG acgcaaagac gggttcacgt atgtaggcct gtgttggatg gcaaggatgc gcagcgtcgc GTGGTGCGTG ATTTGCAGTA TTCCAACGTG CGTTTGGGAG ACGATGATAA AATTTTGGAA gggccacgca atatcgacat ttgccactat cctctgggcg cgtgtgacca cgaaagtagt GCTATGATGA TGGTGCAGGT GTATGACGCG TCCCTTTATG AGATATGTGG CGCCATGATC AAGAAGAAAA gccgcataac gtacitaacc atggtcacgc ccggcgagtt tcttcacgga CGCGAATGCG TCTACATGGA GTCGTTAGAC TGTGAGATTG AAGTTGATGT GCACGCGGAC GTCGTAATGT acaaattcgg tagttcttgc tattcgcaca agctttcaat catcaaggac atcatgacca ctccgtactt gacactaggt ggttttctat tcagcgtgga gatgtatgag gtgcgtatgg gcgtgaatta cttcaagatt acgaagtccg aagtatcgcc tagcattagc TGCACCAAGC TCCTGAGATA CCGAAGAGCT AATAGTGACG TGGTTAAAGT TAAACTTCCA CGTTTCGATA AGAAACGTCG CATGTGTCTG CCTGGGTATG ACACCATATA CCTAGATTCG aagtttgtga gtcgcgtttt cgattatgtc gtgtgtaatt gctctgccgt GAACTCAAAA

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

I860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

- 127 -

ACTTTCGAGT GGGTGTGGAG tttcattaag TCTAGTAAGT CGAGGGTGAT	TATTAGCGGT	2820
aaaataattc ACAAGGATGT GAATTTGGAC ctcaagtacg TCGAGAGTTT	CGCCGCGGTT	2880
ATGTTGGCCT CTGGCGTGCG CAGTAGACTA GCGTCCGAGT ACCTTGCTAA	gaaccttagt	2940
CATTTTTCGG GAGATTGCTC CTTTATTGAA GCCACGTCTT TCGTGTTGCG	TGAGAAAATC	3000

agaaacatga ctctgaattt taacgaaaga cttttacagt TAGTGAAGCG cgttgccttt	3060
GCGACCTTGG ACGTGAGTTT TCTAGATTTA GATTCAACTC TTGAATCAAT AACTGATTTT	3120
gccgagtgta AGGTAGCGAT TGAACTCGAC GAGTTGGGTT GCTTGAGAGC GGAGGCCGAG	3180
AATGAAAAAA TCAGGAATCT GGCGGGAGAT TCGATTGCGG CTAAACTCGC GAGCGAGATA	3240
GTGGTCGATA TTGACTCTAA GCCTTCACCG AAGCAGGTGG GTAATTCGTC ATCCGAAAAC	3300
GCCGATAAGC GGGAAGTTCA GAGGCCCGGT TTGCGTGGTG GTTCTAGAAA CGGGGTTGTT	3360
GGGGAGTTCC TTCACTTCGT CGTGGATTCT GCCTTGCGTC TTTTCAAATA CGCGACGGAT	3420
CAACAACGGA TCAAGTCTTA CGTGCGTTTC TTGGACTCGG CGGTCTCATT CTTGGATTAC	3480
aactacgata atctatcgtt tatactgcga gtgctttcgg aaggttattc gtgtatgttc	3540

GCGTTTTTGG CGAATCGCGG CGACTTATCT AGTCGTGTCC GTAGCGCGGT GTGTGCTGTG 3600

aaagaagttg ctacctcatg cgcgaacgcg agcgtttcta aagccaaggt tatgattacc	3660
TTCGCAGCGG CCGTGTGTGC TATGATGTTT AATAGCTGCG GTTTTTCAGG CGACGGTCGG	3720
gagtataaat cgtatataca tcgttacacg caagtattgt ttgacactat cttttttgag	3780
gacagcagtt acctacccat agaagttctg agttcggcga tatgcggtgc tatcgtcaca	3840
cttttctcct cgggctcgtc cataagttta aacgccttct tacttcaaat taccaaagga	3900
TTCTCCCTAG AGGTTGTCGT CCGGAATGTT GTGCGAGTCA CGCATGGTTT GAGCACCACA	3960
GCGACCGACG GCGTCATACG TGGGGTTTTC TCCCAAATTG TGTCTCACTT ACTTGTTGGA	4020
aatacgggta atgtggctta ccagtcagct TTCATTGCCG gggtggtgcc tcttttagtt	4080
aaaaagtgtg tgagcttaat cttcatcttg cgtgaagata cttattccgg TTTTATTAAG	4140
cacggaatca gtgaattctc tttccttagt astattctga agttcttgaa gggtaagctt	4200
gtggacgagt tgaaatcgat tattcaaggg gtttttgatt ccaacaagca cgtgtttaaa	4260
gaagctactc aggaagcgat tcgtacgacg gtcatgcaag TGCCTGTCGC rGTAGTGGAT	4320
GCCCTTAAGA GCGCCGCGGG ΆΑΑΑΑΤΤΤΑΤ AACAATTTTA CTAGTCGACG TACCTTTGGT	4380
aaggatgaag gctcctctag cgacggcgca tgtgaagagt atttctcatg CGACGAAGGT	4440
GAAGGTCCGG GTCTGAAAGG GGGTTCCAGC TATGGCTTCT CAATTTTAGC GTTCTTTTCA	4500

128 CGCATTATGT GGGGAGCTCG TCGGCTTATT GTTAAGGTGA AGCATGAGTG TTTTGGGAAA4560

CTTTTTGAAT TTCTATCGCT CAAGCTTCAC GAATTCAGGA CTCGCGTTTT TGGGAAGAAT4620

AGAACGGACG TGGGAGTTTA CGATTTTTTG CCCACGGGCA TCGTGGAAAC GCTCTCATCG4680

ATAGAAGAGT GCGACCAAAT TGAAGAACTT CTCGGCGACG ACCTGAAAGG TGACAAGGAT	4740
GCTTCGTTGA CCGATATGAA TTACTTTGAG TTCTCAGAAG ACTTCTTAGC CTCTATCGAG	4800
GAGCCGCCTT TCGCTGGATT GCGAGGAGGT AGCAAGAACA TCGCGATTTT GGCGATTTTG	4860
GAATACGCGC ATAATTTGTT TCGCATTGTC GCAAGCAAGT GTTCGAAACG ACCTTTATTT	4920
CTTGCTTTCG CCGAACTCTC AAGCGCCCTT ATCGAGAAAT TTAAGGAGGT TTTCCCTCGT	4980
aagagccagc TCGTCGCTAT CGTGCGCGAG TATACTCAGA GATTCCTCCG AAGTCGCATG	5040
CGTGCGTTGG GTTTGAATAA CGAGTTCGTG GTAAAATCTT TCGCCGATTT GCTACCCGCA	5100
TTAATGAAGC GGAAGGTTTC AGGTTCGTTC TTAGCTAGTG TTTATCGCCC ACTTAGAGGT	5160

TTCTCATATA TGTGTGTTTC AGCGGAGCGA CGTGAAAAGT TTTTTGCTCT CGTGTGTTTA	5220
atcgggttaa gtctcccttt cttcgtgcgc ATCGTAGGAG cgaaagcgtg cgaagaactc	5280
GTGTCCTCAG CGCGTCGCTT TTATGAGCGT ATTAAAATTT TTCTAAGGCA GAAGTATGTC	5340
TCTCTTTCTA ATTTCTTTTG TCACTTGTTT AGCTCTGACG TTGATGACAG TTCCGCATCT	5400
GCAGGGTTGA AAGGTGGTGC GTCGCGAATG ACGCTCTTCC ACCTTCTGGT TCGCCTTGCT	5460
AGTGCCCTCC TATCGTTAGG GTGGGAAGGG TTAAAGCTAC TCTTATCGCA CCACAACTTG	5520
TTATTTTTGT GTTTTGCATT GGTTGACGAT GTGAACGTCC TTATCAAAGT TCTTGGGGGT	5580
CTTTCTTTCT TTGTGCAACC AATCTTTTCC TTGTTTGCGG CGATGCTTCT ACAACCGGAC	5640
AGGTTTGTGG AGTATTCCGA GAAACTTGTT ACAGCGTTTG AATTTTTCTT AAAATGTTCG	5700
CCTCGCGCGC CTGCACTACT CAAAGGGTTT TTTGAGTGCG TGGCGAACAG CACTGTGTCA	5760
aaaaccgttc gaagacttct tcgctgtttc GTGAAGATGC tcaaacttcg aaaagggcga	5820
GGGTTGCGTG CGGATGGTAG GGGTCTCCAT CGGCAGAAAG CCGTACCCGT CATACCTTCT	5880
AATCGGGTCG TGACCGACGG GGTTGAAAGA CTTTCGGTAA AGATGCAAGG AGTTGAAGCG	5940

TTGCGTACCG	AATTGAGAAT	CTTAGAAGAT	TTAGATTCTG	CCGTGATCGA	AAAACTCAAT	6000
AGACGCAGAA	ATCGTGACAC	TAATGACGAC	GAATTTACGC	GCCCTGCTCA	TGAGCAGATG	6060
CAAGAAGTCA	CCACTTTCTG	TTCGAAAGCC	AACTCTGCTG	GTTTGGCCCT	GGAAAGGGCA	6120
GTGCTTGTGG	AAGACGCTAT	AAAGTCGGAG	AAACTTTCTA	AGACGGTTAA	TGAGATGGTG	6180

- 129 aggaaaggga gtaccaccag cgaagaagtg gccgtcgctt tgtcggacga TGAAGCCGTG GAAGAAATCT CTGTTGCTGA CGAGCGAGAC GATTCGCCTA AGACAGTCAG GATAAGCGAA TACCTAAATA GGTTAAACTC AAGCTTCGAA TTCCCGAAGC CTATTGTTGT GGACGACAAC AAGGATACCG GGGGTCTAAC GAACGCCGTG AGGGAGTTTT ATTATATGCA AGAACTTGCT CTTTTCGAAA TCCACAGCAA ACTGTGCACC TACTACGATC AACTGCGCAT AGTCAACTTC GATCGTTCCG TAGCACCATG CAGCGAAGAT GCTCAGCTGT ACGTACGGAA GAACGGCTCA ACGATAGTGC AGGGTAAAGA GGTACGTTTG CACATTAAGG ATTTCCACGA TCACGATTTC CTGTTTGACG GAAAAATTTC TATTAACAAG CGGCGGCGAG GCGGAAATGT TTTATATCAC GACAACCTCG CGTTCTTGGC GAGTAATTTG TTCTTAGCCG GCTACCCCTT TTCAAGGAGC TTCGTCTTCA CGAATTCGTC GGTCGATATT CTCCTCTACG AAGCTCCACC CGGAGGTGGT AAGACGACGA CGCTGATTGA CTCGTTCTTG AAGGTCTTCA AGAAAGGTGA GGTTTCCACC ATGATCTTAA CCGCCAACAA AAGTTCGCAG GTTGAGATCC TAAAGAAAGT GGAGAAGGAA GTGTCTAACA TTGAATGCCA GAAACGTAAA GACAAAAGAT CTCCGAAAAA GAGCATTTAC ACCATCGACG CTTATTTAAT GCATCACCGT GGTTGTGATG CAGACGTTCT TTTCATCGAT GAGTGTTTCA tggttcatgc gggtagcgta ctagcttgca TTGAGTTCAC GAGGTGTCAT aaagtaatga tcttcgggga tagccggcag attcactaca ttgaaaggaa cgaattggac AAGTGTTTGT ATGGGGATCT CGACAGGTTC GTGGACCTGC AGTGTCGGGT TTATGGTAAT ATTTCGTACC GTTGTCCATG ggatgtgtgc gcttggttaa gcacagtgta tggcaaccta ATCGCCACCG TGAAGGGTGA AAGCGAAGGT AAGAGCAGCA TGCGCATTAA CGAAATTAAT TCAGTCGACG ATTTAGTCCC CGACGTGGGT TCCACGTTTC TCTGTATGCT TCAGTCGGAG aagttggaaa tcagcaagca ctttattcgc aagggtttga ctaaacttaa cgttctaacg gtgcatgagg cgcaaggtga gacgtatgcg cgtgtgaacc ttgtgcgact taagtttcag gaggatgaac cctttaaatc tatcaggcac ataaccgtcg ctctttctcg tcacaccgac AGCTTAACTT ATAACGTCTT AGCTGCTCGT CGAGGTGACG CCACTTGCGA TGCCATCCAG AAGGCTGCGG AATTGGTGAA CAAGTTTCGC gtttttccta CATCTTTTGG TGGTAGTGTT ATCAATCTCA ACGTGAAGAA GGACGTGGAA GATAACAGTA GGTGCAAGGC TTCGTCGGCA CCATTGAGCG TAATCAACGA CTTTTTGAAC GAAGTTAATC CCGGTACTGC GGTGATTGAT TTTGGTGATT TGTCCGCGGA CTTCAGTACT GGGCCTTTTG AGTGCGGTGC CAGCGGTATT gtggtgcggg acaacatctc ctccagcaac atcactgatc ACGATAAGCA GCGTGTTTAG

6240

6300

6360

6420

6480

6540

6600

6660

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

- 130 Ά 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2639 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Leu Arg Glu Asn Pro Ile 1 5

Ser Ala Ala Alá Gin Val Ile 20

Alá Leu Tyr Pro Arg Gin Glu 35

Pro Val Ser Val Val Lys Val 50 55

Asp Arg Gly Val Val Asp Lys 65 70

Gin Arg Gly Val Leu Ser Phe 85

Val Ile Ile Thr Gly Val Val 100

Gly Leu Leu Arg Phe Arg Val 115

Phe Ser Ser Asn Tyr Gly Cys 130 135

Thr Thr Val Trp Leu Asn Cys 145 150

Leu Ala Ala Ala Cys Thr Alá 165

Cys Gly Gly Lys Phe Pro Leu 180

Asp Gly Arg Cys Tyr Leu Alá 195

Ser Val Ser Gly Val Asn Leu Gly Arg 1015

Tyr Phe Gly Ser Phe Thr Gin Pro Phe 2530

Ser Alá Ile Val Lys Thr Gin Leu Pro 4045

Glu Cys Val Ala Ala Glu Val Alá Pro 60

Lys Pro Thr Ser Val Gly Val Pro Pro 7580

Pro Thr Val Val Arg Asn Arg Gly Asp 9095

His Glu Alá Leu Lys Lys Ile Lys Asp 105110

Gly Gly Asp Met Arg Phe Ser Arg Phe 120125

Arg Phe Val Alá Ser Val Arg Thr Asn 140

Thr Lys Alá Ser Gly Glu Lys Phe Ser 155160

Asp Tyr Val Ala Met Leu Arg Tyr Val 170175

Val Leu Met Ser Arg Val Ile Tyr Pro 185iga

His Met Arg Tyr Leu Cys Alá Phe Tyr 200205

Cys Arg Pro Phe Arg Glu Ser Asp

210 215

Ala Leu Gly Met Trp Pro Thr 220

- 131 .........· ·τ

Val Ala Arg Leu Arg Ala Cys Val Glu Lys Asn Phe Gly Val Glu Ala ²²⁵ 230 235240

Cys Gly lie Ala Leu Arg Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Asn Val TyrHis

245 250255

Cys Asp Tyr Asp Ser Ala Tyr Val Lys Tyr Phe Arg Asn Leu Ser Gly 260 265270

Arg lie Gly Gly Gly Ser Phe Asp Pro Thr Ser Leu Thr Ser Val lie 275 280285

Thr Val Lys lie Ser Gly Leu Pro Gly Gly Leu Pro Lys Asn lie Ala 290 295300

Phe Gly Ala Phe Leu Cys Asp lie Arg Tyr Val Glu Pro Val AspSer ³⁰⁵ 310 315320

Gly Gly lie Gin Ser Ser Val Lys Thr Lys Arg Glu Asp Ala HisArg

325 330335

Thr Val Glu Glu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Glu Gin Pro Arg Gin 340 345350

Lys Arg Xie Asp Glu Lys Gly Cys Gly Arg Val Pro Ser Gly Gly Phe 355 360365

Ser His Leu Leu Val Gly Asn Leu Asn Glu Val Arg Arg Lys Val Ala 370 375380

Ala Gly Leu Leu Arg Phe Arg Val Gly Gly Asp Met Asp Phe His Arg

385 390 395400

Ser Phe Ser Thr Gin Ala Gly His Arg Leu Leu Val Trp Arg Arg Ser

405 410415

Ser Arg Ser Val Cys Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Ser Lys Asn Phe Leu 420 425430

Arg Tyr Asp Val Leu Pro Cys Ser Gly Asp Tyr Ala Ala Met Phe Ser 435 440445

Phe Ala Ala Gly Gly Arg Phe Pro Leu Val Leu Met Thr Arg lie Arg 450 455460

Tyr Pro Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Ala His Cys Arg Tyr Ala CysAla

465 470 475480

Phe Leu Leu Arg Gly Phe Asp Pro Lys Arg Phe Asp lie Gly Alaph»

485 490495

Pro Thr Ala Ala Lys Leu Arg Asn Arg Met Val Ser Glu Leu Gly Glu 500 505510

Arg Ser Leu Gly Leu Asn Leu Tyr Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Gly Val 515 520525

- 132 Phe His Cys Asp Tyr Asp Ala Lys 530 535

Ser Ala Val lie Ala Gly Lys Asp 545 550

Asp lie Thr Pro Ala Met Lys Gin 5S5

Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Asp Ser 580

Asp Leu lie Asp Phe Lys Asn Asp 595600

Pro lie Val Lys Val Pro Phe Tyr 610615

Leu Thr Arg Phe Tyr Pro Gin Phe 625630

His Ser Asp His Pro Ala Ala Ala 645

Thr Leu Val Arg Leu Cys Gly Asn 660

Pro Leu Phe His Leu His Ser Lys 675680

Arg Pro Val Leu Asp Gly Lys Asp 690695

Leu Gin Tyr Ser Asn Val Arg Leu 705710

Gly Pro Arg Asn lie Asp lie Cys 725

His Glu Ser Ser Ala Met Met Met 740

Tyr Glu lie Cys Gly Ala Met lie 755760

Leu Thr Met Val Thr Pro Gly Glu 770775

Tyr Met Glu Ser Leu Asp Cys Glu 785790

Val Val Met Tyr Lys Phe Gly Ser 805 lie lie Lys Asp lie Met Thr Thr 820

Phe lie Lys Asp Leu Arg Leu Met 540

Gly Val Glu Glu Val Val Pro Ser 555seo

Lys Thr lie Glu Ala Val Tyr Asp 570575

Leu Leu Lys Leu Ser lie Glu Lys 585590

Val Gin Ser Leu Lys Lys Asp Arg 605

Met Ser Glu Ala Thr Gin Asn Ser 620

Glu Leu Lys Phe Ser His Ser Ser 635640

Ala Ser Arg Leu Leu Glu Asn Glu 650655

Ser Val Ser Asp lie Gly Gly Cys 665670

Thr Gin Arg Arg Val His Val Cys 685

Ala Gin Arg Arg Val Val Arg Asp 700

Gly Asp Asp Asp Lys lie Leu Glu 715720

His Tyr Pro Leu Gly Ala Cys Asp 730735

Val Gin Val Tyr Asp Ala Ser Leu 745750

Lys Lys Lys Ser Arg lie Thr Tyr 765

Phe Leu Asp Gly Arg Glu Cys Val 780 lie Glu Val Asp Val His Ala Asp 795800

Ser Cys Tyr Ser His Lys Leu Ser 810815

Pro Tyr Leu Thr Leu Gly Gly Phe 825830

133 • Σ· · ·

...... ··/

Leu Phe Ser Val Glu Met Tyr Glu Val Arg Met Gly Val Asn Tyr Phe 835 840845

Lys lie Thr Lys Ser Glu Val Ser Pro Ser lie Ser Cys Thr Lys Leu 850 855860

Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Asn Ser Asp Val Val Lys Val Lys LeuPro

865 870 875880

Arg Phe Asp Lys Lys Arg Arg Met Cys Leu Pro Gly Tyr Asp Thrlie

885 890895

Tyr Leu Asp Ser Lys Phe Val Ser Arg Val Phe Asp Tyr Val Val Cys 900 905910

Asn Cys Ser Ala Val Asn Ser Lys Thr Phe Glu Trp Val Trp Ser Phe 915 920925 lie Lys Ser Ser Lys Ser Arg Val lie lie Ser Gly Lys lie lie His 930 935940

Lys Asp Val Asn Leu Asp Leu Lys Tyr Val Glu Ser Phe Ala AlaVal

945 950 955960

Met Leu Ala Ser Gly Val Arg Ser Arg Leu Ala Ser Glu Tyr LeuAla

965 970975

Lys Asn Leu Ser His Phe Ser Gly Asp Cys Ser Phe lie Glu Ala Thr 980 985990

Ser Phe Val Leu Arg Glu Lys lie Arg Asn Met Thr Leu Asn Phe Asn 995 10001005

Glu Arg Leu Leu Gin Leu Val Lys Arg Val Ala Phe Ala Thr Leu Asp 1010 10151020

Val Ser Phe Leu Asp Leu Asp Ser Thr Leu Glu Ser lie Thr AspPhe

1025 1030 10351040

Ala Glu Cys Lys Val Ala lie Glu Leu Asp Glu Leu Gly Cys LeuArg

1045 10501055

Ala Glu Ala Glu Asn Glu Lys lie Arg Asn Leu Ala Gly Asp Ser Ile 1060 10651070

Ala Ala Lys Leu Ala Ser Glu lie Val Val Asp Ile Asp Ser Lys Pro 1075 10801085

Ser Pro Lys Gin Val Gly Asn Ser Ser Ser Glu Asn Ala Asp Lys Arg 1090 10951100

Glu Val Gin Arg Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ser Arg Asn Gly Val Val

1105 1110 11151120

Gly Glu Phe Leu His Phe Val Val Asp Ser Ala Leu Arg Leu Phe Lys

1125 11301135

- 134 Tyr Ala

Thr Asp Gin Gin Arg lie Lys Ser Tyr Val Arg Phe Leu Asp

1140 1145 Ugo

Ser Ala Val Ser Phe Leu Asp Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Ser Phe lie 1155 11601165

Leu Arg Val Leu Ser Glu Gly Tyr Ser Cys Met Phe Ala Phe Leu Ala 1170 11751180

Asn Arg Gly Asp Leu Ser Ser Arg Val Arg Ser Ala Val Cys AlaVal ¹¹⁸⁵ 1190 1195

Lys Glu Val Ala Thr Ser Cys Ala Asn Ala Ser Val Ser Lys AlaLys

1205 12101215

Val Met lie Thr Phe Ala Ala Ala Val Cys Ala Met Met Phe Asn Ser 1220 12251230

Cys Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Glu Tyr Lys Ser Tyr lie His Arg 1235 12401245

Tyr Thr Gin Val Leu Phe Asp Thr lie Phe Phe Glu Asp Ser Ser Tyr 1250 12551260

Leu Pro lie Glu Val Leu Ser Ser Ala lie Cys Gly Ala lie ValThr ¹²⁶⁵ 1270 12751280

Leu Phe Ser Ser Gly Ser Ser lie Ser Leu Asn Ala Phe Leu LeuGin

1285 12901295 lie Thr Lys Gly Phe Ser Leu Glu Val Val Val Arg Asn Val Val Arg 1300 13051310

Val Thr His Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Asp Gly Val lie Arg Gly 1315 13201325

Val Phe Ser Gin lie Val Ser His Leu Leu Val Gly Asn Thr Gly apn 1330 13351340

Val Ala Tyr Gin Ser Ala Phe lie Ala Gly Val Val Pro Leu LeuVal

I³⁴⁵ 1350 1355136

Lys Lys Cys Val Ser Leu lie Phe lie Leu Arg Glu Asp Th-»- TyrSer

1365 13701375

Gly Phe lie Lys His Gly lie Ser Glu Phe Ser Phe Leu Ser Ser lie 1380 13851390

Leu Lys Phe Leu Lys Gly Lys Leu Val Asp Glu Leu Lys Ser lie lie 1395 14001405

Gin Gly Val Phe Asp Ser Asn Lys His Val Phe Lys Glu Ala Thr Gin 1410 14151420

Glu Ala lie Arg Thr Thr Val Met Gin Val Pro Val Ala Val Val 1425 14301435

Asp 1440

- 135 Ala Leu Lys Ser Ala Ala Gly Lys 1445 lie Tyr Asn Asn Phe Thr Ser Arg 1450 1455

Arg Thr Phe Gly Lys Asp Glu Gly Ser Ser Ser Asp Gly Ala Cys Glu 1460 14651470

Glu Tyr Phe Ser Cys Asp Glu Gly Glu Gly Pro Gly Leu Lys Gly Gly 1475 14801485

Ser Ser Tyr Gly 1490	Phe	Ser	lie Leu Ala Phe Phe Ser Arg	lie	Met	Trp
1495	1500
Gly Ala Arg Arg 1505	Leu	Ile 151(	Val Lys J	Val Lys His Glu Cys 1515	Phe	Gly	Lys 1520
Leu Phe Glu Phe	Leu 152'	Ser	Leu Lys	Leu His Glu Phe Arg 1530	Thr	Arg 153Í	Val
Phe Gly Lys Asn 154 C	Arg t	Thr	Asp Val	Gly Val Tyr Asp Phe 1545	Leu 1550	Pro	Thr
Gly lie Val Glu	Thr	Leu	Ser Ser	lie Glu Glu Cys Asp	Gin	lie	Glu

1555 1560 1565

Glu Leu Leu Gly Asp Asp Leu Lys Gly Asp Lys Asp Ala Ser Leu Thr 1570 15751580

Asp Met Asn Tyr Phe Glu Phe Ser Glu Asp Phe Leu Ala Ser lieGlu

I⁵⁸⁵ 1590 15951600

Glu Pro Pro Phe Ala Gly Leu Arg Gly Gly Ser Lys Asn lie Alalie

1505 16101615

Leu Ala lie Leu Glu Tyr Ala His Asn Leu Phe Arg lie Val Ala Ser 1620 16251630

Lys Cys Ser Lys Arg Pro Leu Phe Leu Ala Phe Ala Glu Leu Ser Ser 1635 16401645

Ala Leu lie Glu Lys Phe Lys Glu Val Phe Pro Arg Lys Ser Gin Leu 1650 16551660

Val Ala lie Val Arg Glu Tyr Thr Gin Arg Phe Leu Arg Ser ArgMet

1665 1670 16751680

Arg Ala Leu Gly Leu Asn Asn Glu Phe Val Val Lys Ser Phe AlaAsp

1685 16901695

Leu Leu Pro Ala Leu Met Lys Arg Lys Val Ser Gly Ser Phe Leu Ala 1700 17051710

Ser Val Tyr Arg Pro Leu Arg Gly Phe Ser Tyr Met Cys Val Ser Ala 1715 17201725

Glu Arg Arg Glu Lys Phe Phe Ala Leu Val Cys Leu lie Gly Leu Ser 1730 17351740

- 136 Leu Pro Phe Phe Val Arg lie Val ¹⁷⁴⁵ 1750

Val Ser Ser Ala Arg Arg Phe Tyr 1765

Gin Lys Tyr Val Ser Leu Ser Asn 1780

Asp Val Asp Asp Ser Ser Ala Ser 1795i8oe

Gly Ala Lys Ala Cys Glu Glu Leu ¹⁷S51760

Glu Arg lie Lys lie Phe Leu Arg ¹⁷⁷⁰1775

Phe Phe Cys His Leu Phe Ser Ser ¹⁷⁸⁵1790

Ala Gly Leu Lys Gly Gly Ala Ser ¹1805

Arg Met Thr 1810

Leu Phe His Leu Leu Val Arg Leu Ala Ser Ala ¹⁸¹⁵1820

Leu Leu

Ser Leu Gly 1825	Trp Glu Gly Leu Lys Leu Leu Leu Ser His His Asn Leu 1830 - 1835 1840
Leu Phe Leu	Cys Phe Ala Leu Val Asp Asp Val Asn Val Leu He Lvs 1845 1850 1B55
Val Leu Gly	Gly Leu Ser Phe Phe Val Gin Pro lie Phe Ser Leu Phe 1860 1865 1870

Ala Ala Met Leu Leu Gin Pro Asp Arg Phe Val 1875i

Glu Tyr Ser Glu Lys 1885

Leu Val Thr Ala Phe Glu Phe Phe Leu Lys Cys Ser Pro Arg Ala Pro ¹⁸⁹⁰ 1835isoO

Ala Leu Leu Lys Gly Phe Phe Glu Cys Val Ala Asn Ser Thr ValSer ^{1905 1910} 1915i

Lys Thr Val Arg Arg Leu Leu Arg Cys Phe Val Lys Met Leu LysLeu ¹⁹²⁵ IS³⁸1935

Arg Lys Gly Arg Gly Leu Arg Ala Asp Gly Arg Gly Leu His Arg Gin ¹⁹⁴⁰ 19«1950

Lys Ala Val Pro Val He Pro Ser Asn Arg Val Val Thr Asp Gly Val ¹⁹⁵⁵ 19601965

Glu Arg Leu Ser Val Lys Met Gin Gly Val Glu Ala Leu Arg Thr Glu ¹⁹⁷⁰ 19751980

Leu Arg lie Leu Glu Asp Leu Asp 1⁹⁸⁵ 1990

Arg Arg Arg Asn Arg Asp Thr Asn 2005

His Glu Gin Met Gin Glu Val Thr 2020

Ser Ala Val He Glu Lys Leu Asn 19952000

Asp Asp Glu Phe Thr Arg Pro Ala 20102015

Thr Phe Cys Ser Lys Ala Asn Ser 20252030

Ala Gly Leu Ala Leu Glu Arg Ala Val Leu Val 2035 2040

Glu Asp Ala lie Lys 2045

- 137 Ser Glu Lys Leu Ser Lys Thr Val Asn Glu Met Val Arg Lys Gly Ser 2050 20552060

Thr Thr Ser Glu Glu Val Ala Val Alá Leu Ser Asp Asp Glu AláVal ²⁰⁶⁵ 2070 20752081

Glu Glu He Ser Val Alá Asp Glu Arg Asp Asp Ser Pro Lys ThrVal ^20B5 20902095

Arg He Ser Glu Tyr Leu Asn Arg Leu Asn Ser Ser Phe Glu Phe Pro ²¹⁰⁰ 21052110

Lys Pro He Val Val Asp Asp Asn Lys Asp Thr Gly Gly Leu Thr Asn 2115 21202125

Ala Val Arg Glu Phe Tyr Tyr Met Gin Glu Leu Alá Leu Phe Glu He 2130 21352140

His Ser Lys Leu Cys Thr Tyr Tyr Asp Gin Leu Arg He Val Asn Phe ²¹⁴⁵ 22-⁵⁰ 21552160

Asp Arg Ser val Alá Pro Cys Ser Glu Asp Alá Gin Leu Tyr Val Arg

2165 21702175

Lys Asn Gly Ser Thr He Val Gin Gly Lys Glu Val Arg Leu His He 2180 21852190

Lys Asp Phe His Asp His Asp Phe Leu Phe Asp Gly Lys Ile Ser Ile ²¹⁹⁵ 22002205

Asn Lys Arg Arg Arg Gly Gly Asn Val Leu Tyr His Asp Asn Leu Alá 2210 22152220

Phe Leu Alá Ser Asn Leu Phe Leu Alá Gly Tyr Pro Phe Ser ArgSer ²²²⁵ 2230 22352240

Phe Val Phe Thr Asn Ser Ser Val Asp He Leu Leu Tyr Glu AláPro

2245 22502255

Pro Gly Gly Gly Lys Thr Thr Thr Leu He Asp Ser Phe Leu Lys Val. 2260 226S2270

Phe Lys Lys Gly Glu Val Ser Thr Met He Leu Thr Alá Asn Lys Ser 2275 22802285

Ser Gin Val Glu Ile Leu Lys Lys Val Glu Lys Glu Val Ser Asn He 2290 22952300

Glu Cys Gin Lys Arg Lys Asp Lys Arg Ser Pro Lys Lys Ser IleTyr ²³⁰⁵ 2310 23152320 ^hr lie Asp Ala Tyr Leu Met His His Arg Gly Cys Asp Alá AspVal

2325 23302335

Leu Phe He Asp Glu Cys Phe Met Val His Alá Gly Ser Val Leu Alá ²³⁴⁰ 23452350

- 138 Cys lie Glu Phe Thr Arg Cys His Lys Val Met lie Phe Gly Asp Ser ²³⁵⁹ 23602365

Arg Gin lie His Tyr lie Glu Arg Asn Glu Leu Asp Lys Cys Leu Tyr ²³⁷θ 23752380

Gly Asp Leu Asp Arg Phe Val Asp Leu Gin Cys Arg Val Tyr Gly Asn ^{2385 239}0 2395240( lie Ser Tyr Arg Cys Pro Trp Asp Val Cys Ala Trp Leu Ser Thr Val

2405 24102415

Tyr Gly Asn Leu He Ala Thr Val Lys Gly Glu Ser Glu Gly Lys Ser 2420 24252430

Ser Met Arg He Asn Glu lie Asn Ser Val Asp Asp Leu Val Pro Asp 2435 24402445

Val Gly Ser Thr Phe Leu Cys Met Leu Gin Ser Glu Lys Leu Glu lie

2450

2455

2460

Ser Lys His Phe lie Arg Lys Gly Leu Thr Lys Leu Asn Val Leu Thr

2465 2470 24752481

Val His Glu Ala Gin Gly Glu Thr Tyr Ala Arg Val Asn Leu Val Arg

2485 24902495

Leu Lys Phe Gin Glu Asp Glu Pro Phe Lys Ser lie Arg His lie Thr

2500

2505

2510

Val Ala Leu Ser Arg His Thr Asp Ser Leu Thr Tyr Asn Val Leu Ala 2515 25202525

Ala Arg Arg Gly Asp Ala Thr Cys Asp Ala He Gin Lys Ala Ala Glu 2530 25352540

Leu Val Asn Lys Phe Arg Val Phe Pro Thr Ser Phe Gly Gly SerVal

2545 2550 25552561 lie Asn Leu Asn Val Lys Lys Asp Val Glu Asp Asn Ser Arg CysLys

2565 25702575

Ala Ser Ser Ala Pro Leu Ser Val lie Asn Asp Phe Leu Asn Glu Val 2580 25852590

Asn Pro Gly Thr Ala Val lie Asp Phe Gly Asp Leu Ser Ala Asp Phe 2595 26002605

Ser Thr Gly Pro Phe Glu Cys Gly Ala Ser Gly lie Val Val Arg Asp 2610 26152620

Asn lie Ser Ser Ser Asn lie Thr Asp His Asp Lys Gin Arg Val

2625

2630

2635

- 139 -

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1380 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁNÓ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCGTAGTTC	ggtcgcaggc gattccgcgt agaaaacctt ctctacaaga aaatttctat	60
TCGTTTGAAG	CGCGGAATTA	TAACTTCTCG	ACTTGCGACC	GTAACACATC	TGCTTCAATG	120
TTCGGAGAGG	CTATGGCGAT	GAACTGTCTT	CGTCGTTGCT	TCGACCTAGA	TGCCTTTTCG	ISO
TCCCTGCGTG	ATGATGTGAT	TAGTATCACA	CGTTCAGGCA	TCGAACAATG	GCTGGAGAAA	240
CGTACTCCTA	GTCAGATTAA	AGCATTAATG	AAGGATGTTG	AATCGCCTTT	GGAAATTGAC	300
GATGAAATTT	GTCGTTTTAA	GTTGATGGTG	AAGCGTGACG	CTAAGGTGAA	gttagactct	360
TCTTGTTTAA	CTAAACACAG	CGCCGCTCAA	AATATCATGT	TTCATCGCAA	GAGCATTAAT	420

GCTATCTTCT CTCCTATCTT AAAAACCGAA TAATGTGCTG aacatmact tttttacgga gatgactaac agggawttg _CTTmTTCT cagcaacatg

CTTGGTGACG ACGATGTGTA CCATATAGCT GAAGTTOATT TCTCAAAGTA CGACAACTCT 600 caagatoctt tcgtgaaggc ttttgaagaa gtaatgtata aggaactcgg tgitgmgaa880

GAGTTCCTGG CTATCTGGAT GTGCGGCGAG CGGWATCOA TAGCTAACAC TCTOGATGGT720

CAGTTOTCCT tcacgatcga gaatcaaagg aagtcgggag otcgaacac ttogattcgt780

AACTCTCTCG TCACTTTGGG 1ATTTTAAST CmACTACG ACGTTAGAAA TTTCGAGOCO8«

TT6TACATCT CGGGCGA1GA TTCTTtAATT TTTTCTOTCA GCCAGATTTC GAATTATGCC

GACGACATA7 gcactgacat GGGTTTTGAG acaaaattta tgtccccaag TGTCCGCTAC980

TTTTGTTCTA AATTTCTTGT 7ATOTGTGGT CATAAGACCT TCTTOSTTCC CGACCCGTAC1020 aagctttttg tcaaottsgc agcagtcam gaggatgttt caatsgattt CCTTTTCSAG1080

ACTTOTACCT CCTTTAAAGA CTTAACCTCC GATTTTAACG ACGAGCCCTT AATTCAAAAC1140 ctcgctoaac ttotggcttt maatmgag cttcaaaccg gcaacaccac otggcgtta1200

AGTGTGATAC ATTGTTTGCG TTCGAATTTC CTCTCGTTTA GGAAGTTATA TCCTCGCGTG1280

AAGGGA7GGC aggtttttta cacgtcggtt aagaaagcgc ttctcaagag tgggtgwt1320

CTCTTCGACA GTTTCATGAC CCCTT7TGGT CAGGCTGTCA TGGTTTGGGA TGATGAGTAG13

- 140 -

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 459 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val val hrg ser sm Λ1, Ha Pro irg Arg _Lrs p_{ro s}„ Leu Gin ^{S 10}15

Glu Asn Leu Tyr Ser Ph. Glu Alá Arg Asn Tyr Asn Phe Ser Thr Cys ²⁵30

Asp Arg Asn Thr Ser Alá Ser Met Phe Gly Glu Ala Met Ala Met Asn ⁴⁰45

Cys Leu Arg Arg Cys Phe Asp Leu Asp Alá Phe Ser Ser Leu Arg Asp ⁵⁵50

Asp Val Ile Ser _{Ile T}hr _{Ser Gly χχβ} ^{70 75}80

Arg Thr Pro Ser Gin He Lys Ala Leu Met Lys Asp Val Glu Ser Pro ⁸⁵ 9095

Leu Glu lie Asp Asp Glu lie Cys Arg Phe Lys Leu Met Val Lys Arg XUO i ne ¹⁰⁵110

Asp Alá Lys Val Lys Leu Asp Ser Ser Cys Leu Thr Lys His Ser Alá 120 !/' *“ ^{Ile Met Phe} “· **« ^L1” n· *la He Phe ser ¹³⁵140

Pro He Phe Asn Glu Val Lys Asn Arg He Met Cys Cys Leu Lys Pro ¹⁵⁰ 155

Asn He Lys Phe Phe Thr Glu Met Thr Asn Arg Asp Phe Alá Ser Val ¹⁶⁵ 170175

Val ser Asn Met Leu Gly Asp Asp Asp Val Tyr His He Gly Glu Val ^{180 185}190

Asp Phe Ser Lys Tyr Asp Lys Ser Gin Asp Ala Phe Val Lys Alá Phe ¹⁹⁵ 200

Glu Glu Val Met Tyr Lys Glu Leu Gly Val Asp Glu Glu Leu Leu Alá xxu oi e·**·* ²¹⁵220 lie Trp Met Cys Gly Glu Arg Leu Ser lie Alá Asn Thr Leu Asp Gly

141 ²²⁵ 230

Gin Leu Ser Phe Thr Ile Glu Asn 245

Thr Trp He Gly Asn Ser Leu Val 260 ²35 240

Gin Arg Lys Ser Gly Ala Ser Asn ²⁵⁰ 255

Thr Leu Gly He Leu Ser Leu Tyr

Tyr Asp Val Arg Asn Phe Glu Ala ²⁷⁵280

Leu He Phe Ser Arg Ser Glu Ile 290

Thr Asp Met Gly Phe Glu Thr Lys ³⁹⁹310

Phe Cys Ser Lys Phe Val Val Met 325

Pro Asp Pro Tyr Lys Leu Phe Val 340

Val Ser Met Asp Phe Leu phe Glu 355360

Thr Ser Asp Phe Asn Asp Glu Arg 370375

Vei Ala Leu Lys Tyr Glu Val óin ³⁸⁵390

Ser Val Ile His Cys Leu Arg Ser 405

Tyr Pro Arg Val Lys Gly Trp Gin 420

Ala Leu Leu Lys Ser Gly Cys Ser ⁴³⁸ 440

Phe Gly Gin Ala Val Met Val Trp ⁴⁵⁰ 455

Leu Tyr He Ser Gly Asp Asp Ser 285

Ser Asn Tyr Ala Asp Asp He Cys 300

Phe Met Ser Pro Ser Val Pro Tyr

Cys Gly His Lys Thr Phe Phe Val 330 _33g

Lys Leu Gly Ala Val Lys Glu Asp ³⁴⁵ 350

Thr Phe Thr Ser Phe Lys Asp Leu 365

Leu He Gin Lys Leu Ala Glu Leu 380

Thr Gly Asn Thr Thr Leu Ala Leu ³⁹⁵400

Asn Phe Leu Ser Phe Ser Lys Leu ⁴³⁹415

Val Phe Tyr Thr Ser Val Lys Lys ⁴²⁹430

Leu Phe Asp Ser Phe Met Thr Pro 445

Asp Asp Glu

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 171 bázispár TÍPUSA: nukleinsav Hány SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

- 142 A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAATCAGG TTFTGCAGTT TGAATGTTTG TTTCTGCTGA ATCTCGCGGT TTTTGCTGTG60

ACTTTCATTT TCATTCTTCT GGTCTTCCGC GTGATTAAGT CTTTTCGCCA GAAGGGTCAC120

GAAGCACCTG TTCCCGTTGT TCGTGGCGGG GGTTTTTCAA CCGTAGTGTA G171

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 56 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Asn Gin Val Leu Gin Phe ¹ 5

Val Phe Ala Val Thr Phe He 20

Lys Ser Phe Arg Gin Lys Gly 35

Gly Gly Gly Phe Ser Thr Val

Glu Cys Leu Phe Leu Leu Asn Leu Alá ¹⁰15

Phe Ile _Leu Leu Val Phe Arg val He ²⁵30

His Glu Alá Pro Val Pro Val Val Arg ⁴⁰45

Val

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1800 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

- 143

ATGGTAGTTT TCGGTTTGGA CTTTGGCACC ACATTCTCTA CGGTGTGTGT GTACAAGGAT 60 GGACGAGTTT TTTCATTCAA GCAGAATAAT TCGGCGTACA TCCCCACTTA CCTCTATCTC120

TTCTCCGATT CTAACCACAT GACTTTTGGT TACGAGGCCG AATCACTGAT GAGTAATCTG180

AAAGTTAAAG GTTCGTTTTA TAGAGATTTA AAACGTTGGG TGGGTTGCGA TTCGAGTAAC240

CTCGACGCGT ACCTTGACCG TTTAAAACCT CATTACTCGG TCCGCTTGGT TAAGATCGGC300

TCTGGCTTGA ACGAAACTGT TTCAATTGGA AACTTCGGGG GCACTGTTAA GTCTGAGGCT360

CATCTGCCAG GGTTGATAGC TCTCTTTATT AAGGCTGTCA TTAGTTGCGC GGAGGGCGCG420

TTTGCGTGCA CTTGCACCGG GGTTATTTGT TCAGTACCTG CCAATTATGA TAGCGTTCAA480

AGGAATTTCA CTGATCAGTG TGTTTCACTC AGCGGTTATC AGTGCGTATA TATGATCAAT540

GAACCTTCAG CGGCTGCGCT ATCTGCGTGT AATTCGATTG GAAAGAAGTC CGCAAATTTG600

GCTGTTTACG ATTTCGGTGG TGGGACCTTC GACGTGTCTA TCATTTCATA CCGCAACAAT660

ACTTTTGTTG TGCGAGCTTC TGGAGGCGAT CTAAATCTCG GTGGAAGGGA TGTTGATCGT720

GCGTTTCTCA CGCACCTCTT CTCTTTAACA TCGCTGGAAC CTGACCTCAC TTTGGATATC780

TCGAATCTGA AAGAATCTTT ATCAAAAACG GACGCAGAGA TAGTTTACAC TTTGAGAGGT840

GTCGATGGAA GAAAAGAAGA CGTTAGAGTA AACAAAAACA TTCTTACGTC GGTGATGCTC900

CCCTACGTGA ACAGAACGCT TAAGATATTA GAGTCAACCT TAAAATCGTA TGCTAAGAGT960

ATGAATGAGA GTGCGCGAGT TAAGTGCGAT TTAGTGCTGA TAGGAGGATC TTCATATCTT1020

CCTGGCCTGG CAGACGTACT AACGAAGCAT CAGAGCGTTG ATCGTATCTT AAGAGTTTCG1080

GATCCTCGGG CTGCCGTGGC CGTCGGTTGC GCATTATATT CTTCATGCCT CTCAGGATCT1140

GGGGGGTTGC TACTGATCGA CTGTGCAGCT CACACTGTCG CTATAGCGGA CAGAAGTTGT1200

CATCAAATCA TTTGCGCTCC AGCGGGGGCA CCGATCCCCT TTTCAGGAAG CATGCCTTTG1260

TACTTAGCCA GGGTCAACAA GAACTCGCAG CGTGAAGTCG CCGTGTTTGA AGGGGAGTAC1320

GTTAAGTGCC CTAAfiAACAG AAAGATCTGT GGAGCAAATA TAAGATTTTT TGATATAGGA1380

GTGACGGGTG ATTCGTACGC ACCCGTTACC TTCTATATGG ATTTCTCCAT TTCAAGCGTA1440

GGAGCCGTTT CATTCGTGGT GAGAGGTCCT GAGGGTAAGC AAGTGTCACT CACTGGAACT1500

CCAGCGTATA ACTTTTCGTC TGTGGCTCTC GGATCACGCA GTGTCCGAGA ATTGCATATT1560

AGTTTAAATA ATAAAGTTTT TCTCGGTTTG CTTCTACATA GAAAGGCGGA TCGACGAATA1620

CTTTTCACTA AGGATGAAGC GATTCGATAC GCCGA.TTCAA TTGATATCGC GGATGTGCTA1680

AAGGAATATA AAAGTTACGC GGCCASTGCC TTACCACCAG ACGAGGATGT CGAATTACTC1740

CTGGGAAAGT CTGTTCAAAA AGTTTTACGG GGAAGCAGAC TGGAAGAAAT ACCTCTCTAG1800

- 144 A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 599 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Val Val Phe Gly Leu Asp Phe 15

Val Tyr Lys Asp Gly Arg Val Phe 20

Tyr Ile Pro Thr Tyr Leu Tyr Leu ³540

Phe Gly Tyr Glu Alá Glu Ser Leu ⁵⁰55

Ser Phe Tyr Arg Asp Leu Lys Arg ⁶⁵70

Leu Asp Alá Tyr Leu Asp Arg Leu BS

Val Lys He Gly ser Gly Leu Asn 100

Gly Gly Thr Val Lys Ser Glu Alá 3-35i

Phe He Lys Alá Val He Ser Cys 3-3 0

Cys Thr Gly Val He Cys Ser Val ¹⁴⁵150

Arg Asn Phe Thr Asp Gin Cys Val 165

Tyr Met He Asn Glu Pro Ser Alá 180

He Gly Lys Lys Ser Alá Asn Leu 355

Thr Phe Asp Val Ser He Ile Ser ²¹⁰215

Gly Thr Thr Phe Ser Thr Val Cys 10 ₁₅

Ser Phe Lys Gin Asn Asn Ser Alá 25 30

Phe Ser Asp Ser Asn His Met Thr 45

Met Ser Asn Leu Lys Val Lys Gly 60

Trp Val Gly Cys Asp Ser Ser Asn ⁷⁵' 80

Lys Pro His Tyr Ser Val Arg Leu ⁹⁰95

Glu Thr Val Ser Ile Gly Asn Phe 3°5no

His Leu Pro Gly Leu He Alá Leu 125

Ala Glu Gly Ala Phe Alá Cys Thr 140

Pro Alá Asn Tyr Asp Ser Val Gin 355

Ser Leu Ser Gly Tyr Gin Cys Val ¹⁷⁰175

Ala Alá Leu Ser Alá Cys Asn Ser 185

Alá Val Tyr Asp Phe Gly Gly Gly 205

Tyr Arg Asn Asn Thr Phe Val Val 220

Arg Alá Ser Gly Gly Asp Leu Asn Leu Gly Gly Arg Asp Val Asp Arg ^{230 2}35

- 145 Ala Phe Leu Thr His Leu Phe Ser Leu. Thr Ser Leu Glu Pro Asp Leu 245 250255

Thr Leu Asp He Ser Asn Leu Lys Glu Ser Leu Ser Lys Thr Asp Ala 260 265270

Glu lie Vai Tyr Thr Leu Arg Gly Vai Asp Gly Arg Lys Glu Asp Vai 275 280285

Arg Vai Asn Lys Asn lie Leu Thr Ser Vai Met Leu Pro Tyr Vai Asn 290 295300

Arg Thr Leu Lys lie Leu Glu Ser Thr Leu Lys Ser Tyr Ala LysSer ³⁰⁵ 310 315320

Met Asn Glu Ser Ala Arg Vai Lys Cys Asp Leu Vai Leu He GlyGly

325 330335

Ser Ser Tyr Leu Pro Gly Leu Ala Asp Vai Leu Thr Lys His Gin Ser 340 345

Vai Asp Arg lie Leu Arg Vai Ser Asp Pro Arg Ala Ala Vai Ala Vai 355 360365

Gly Cys Ala Leu Tyr Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ser Gly Gly Leu Leu 370 375380

Leu He Asp Cys Ala Ala His Thr Vai Ala He Ala Asp Arg SerCys ³⁸⁵ 390 395400

His Gin lie He Cys Ala Pro Ala Gly Ala Pro He Pro Phe SerGly

405 410415

Ser Met Pro Leu Tyr Leu Ala Arg Vai Asn Lys Asn Ser Gin Arg Glu 420 425430 ^Val Ala Vai Phe Glu Gly Glu Tyr Vai Lys Cys Pro Lys Asn Arg Lys 435 440445

He Cys Gly Ala Asn lie Arg Phe Phe Asp He Gly Vai Thr Gly Asp 450 455460

Ser Tyr Ala Pro Vai Thr Phe Tyr Met Asp Phe Ser He Ser SerVai ⁴⁸⁵ 470 475480

Gly Ala Vai Ser Phe Vai Vai Arg Gly Pro Glu Gly Lys Gin VaiSer

485 490495

Leu Thr Gly Thr Pro Ala Tyr Asn Phe Ser Ser Vai Ala Leu Gly Ser 500 505510

Arg Ser Vai Arg Glu Leu His He Ser Leu Asn Asn Lys Vai Phe Leu 515 520525

Gly Leu Leu Leu His Arg Lys Ala Asp Arg Arg He Leu Phe Thr Lys 530 535540

- 146 .:. .:. ...· -.. -r

Asp Glu Ala lie Arg Tyr Ala Asp Ser lie Asp He Ala Asp Vai Leu

545 550 555560

Lys Glu Tyr Lys Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Pro Pro Asp GluAsp

565 570575

Vai Glu Leu Leu Leu Gly Lys Ser Vai Gin Lys Vai Leu Arg Gly Ser 580 585590

Arg Leu Glu Glu He Pro Leu 595

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1656 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGTCGAATT ACTCCTGGGA AAGTCTGTTC AAAAAGTTTT ACGGGGAAGC AGACTGGAAG	60
AAATACCTCT ctaggagcat agcagcacac tcaagtgaaa ttaaaactct accagacatt	120
CGATTGTACG GCGGTAGGGT TGTAAAGAAG TCCGAATTCG AATCAGCACT TCCTAATTCT	180
TTTGAACAGG AATTAGGACT GTTCATACTG agcgaacggg AAGTGGGATG GAGCAAATTA	240
TGCGGAATAA CGGTGGAAGA AGCAGCATAC GATCTTACGA ATCCCAAGGC TTATAAATTC	300
ACTGCCGAGA CATGTAGCCC GGATGTAAAA GGTGAAGGAC AAAAATACTC TATGGAAGAC	360
GTGATGAATT TCATGCGTTT ATCAAATCTG GATGTTAACG ACAAGATGCT GACGGAACAG	420
TGTTGGTCGC TGTCCAATTC ATGCGGTGAA TTGATCAACC CAGACGACAA AGGGCGATTC	480
GTGGCTCTCA CCTTTAAGGA CAGAGACACA GCTGATGACA CGGGTGCCGC CAACGTGGAA	540
TGTCGCGTGG GCGACTATCT AGTTTACGCT ATGTCCCTGT TTGAGCAGAG GACCCAAAAA	600
TCGCAGTCTG GCAACATCTC TCTGTACGAA AAGTACTGTG AATACATCAG GACCTACTTA	660
GGGAGTACAG ACCTGTTCTT CACAGCGCCG GACAGGATTC CGTTACTTAC GGGCATCCTA	720
TACGATTTTT GTAAGGAATA CAACGTTTTC TACTCGTCAT ATAAGAGAAA CGTCGATAAT	780
TTCAGATTCT TCTTGGCGAA TTATATGCCT TTGATATCTG ACGTCTTTGT CTTCCAGTGG	840

- 147 «·· ·····< ···*

GTAAAACCCG	CGCCGGATGT	TCGGCTGCTT	TTTGAGTTAA	GTGCAGCGGA	ACTAACGCTG	900
GAGGTTCCCA	CACTGAGTTT	gatagattct	CAAGTTGTGG	TAGGTCATAT	CTTAAGATAC	960
GTAGAATCCT	ACACATCAGA	TCCAGCCATC	GACGCGTTAG	aagacaaact	GGAAGCGATA	1020
CTGAAAAGTA	GCAATCCCCG	TCTATCGACA	gcgcaactat	GGGTTGGTTT	CTTTTGTTAC	1080
TATGGTGAGT	TTCGTACGGC	TCAAAGTAGA	GTAGTGCAAA	GACCAGGCGT	atacaaaaca	1140
CCTGACTCAG	TGGGTGGATT	TGAAATAAAC	ATGAAAGATG	TTGAGAAATT	CTTCGATAAA	1200

CTTCAGAGAG	1 AATTGCCTAA	TGTATCTTTG	CGGCGTCAGT	TTAACGGAGC	TAGAGCGCAT	1260
GAGGCTTTCA	AAATATTTAA	aaacggaaat	ataagtttca	GACCTATATC	GCGTTTAAAC	1320
GTGCCTAGAG	AGTTCTGGTA	TCTGAACATA	GACTACTTCA	GGCACGCGAA	TAGGTCCGGG	1380
TTAACCGAAG	aagaaatact	CATCCTAAAC	AACATAAGCG	TTGATGTTAG	GAAGTTATGC	1440
GCTGAGAGAG	CGTGCAATAC	CCTACCTAGC	GCGAAGCGCT	TTAGTAAAAA	TCATAAGAGT	1500
aatatacaat	CATCACGCCA	AGAGCGGAGG	ATTAAAGACC	CATTGGTAGT	CCTGAAAGAC	1560
ACTTTATATG	AGTTCCAACA	CAAGCGTGCC	GGTTGGGGGT	CTCGAAGCAC	TCGAGACCTC	1620
GGGAGTCGTG	CTGACCACGC	gaaaggaagc	GGTTGA			1656

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 551 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Ser Asn Tyr Ser Trp Glu Ser Leu Phe Lys Lys Phe Tyr Gly Glu 35 1015

Alá Asp Trp Lys Lys Tyr Leu Ser Arg Ser He Ala Alá His Ser Ser 20 2530

Glu He Lys Thr Leu Pro Asp He Arg Leu Tyr Gly Gly Arg Val Val 35 4045

Lys Lys Ser Glu Phe Glu Ser Alá Leu Pro Asn Ser Phe Glu Gin Glu 50 5560

- 148 Leu Gly Leu Phe lie Leu Ser Glu 65 70

Cys Gly lie Thr Val Glu Glu Ala 85

Ala Tyr Lys Phe Thr Ala Glu Thr 100

Gly Gin Lys Tyr Ser Met Glu Asp 115120

Asn Leu Asp Val Asn Asp Lys Met 130135

Ser Asn Ser Cys Gly Glu Leu 11« ¹⁴⁵150

Val Ala Leu Thr Phe Lys Asp Arg 165

Ala Asn Val Glu Cys Arg Val Gly 180

Leu Phe Glu Gin Arg Thr Gin Lys 195200

Tyr Glu Lys Tyr Cys Glu Tyr lie ²¹⁰215

Leu Phe Phe Thr Ala Pro Asp Arg ²²⁵230

Tyr Asp Phe Cys Lys Glu Tyr Asn 245

Asn Val Asp Asn Phe Arg Phe Phe 260

Ser Asp Val Phe Val Phe Gin Trp ²⁷⁵280

Leu Leu Phe Glu Leu Ser Ala Ala ²⁹⁰295

Leu Ser Leu lie Asp Ser Gin Val ³⁰⁵310

Val Glu Ser Tyr Thr Ser Asp Pro 325

Leu Glu Ala lie Leu Lys Ser Ser 340

Leu Trp Val Gly Phe Phe Cys Tyr ³⁵5 360

Arg Glu Val Gly Trp Ser Lys Leu 7580

Ala Tyr Asp Leu Thr Asn Pro Lys 9095

Cys Ser Pro Asp Val Lys Gly Glu 105no

Val Met Asn Phe Met Arg Leu Ser 125 ’

Leu Thr Glu Gin Cys Trp Ser Leu 14 0

Asn Pro Asp Asp Lys Gly Arg Phe

155Igo

Asp Thr Ala Asp Asp Thr Gly Ala 170

Asp Tyr Leu Val Tyr Ala Met Ser ¹⁸⁵190

Ser Gin Ser Gly Asn lie Ser Leu 205

Arg Thr Tyr Leu Gly Ser Thr Asp 220 lie Pro Leu Leu Thr Gly lie Leu 235240

Val Phe Tyr Ser Ser Tyr Lys Arg ²⁵⁰255

Leu Ala Asn Tyr Met Pro Leu lie 265270

Val Lys Pro Ala Pro Asp Val Arg 285

Glu Leu Thr Leu Glu Val Pro Thr 300

Val Val Gly His lie Leu Arg Tyr 315320

Ala lie Asp Ala Leu Glu Asp Lys ³³⁰335

Asn Pro Arg Leu Ser Thr Ala Gin ³⁴⁵350

Tyr Gly Glu Phe Arg Thr Ala Gin 365

- 149 Ser Arg Vai Vai Gin Arg Pro Gly Vai Tyr Lys Thr Pro Asp Ser Vai 370 375

Gly Gly Phe Glu lie Asa Met Lys Asp Vai Glu Lys Phe Phe AspLys ³⁸⁵ 390 395

Leu Gin Arg Glu Leu Pro Asn Vai Ser Leu Arg Arg Gin Phe AsnGly

405 410415

Ala Arg Ala His Glu Ala Phe Lys He Phe Lys Asn Gly Asn He Ser 420 425430

Phe Arg Pro He Ser Arg Leu Asn Vai Pro Arg Glu Phe Trp Tyr Leu 435 440445

Asn He Asp Tyr Phe Arg His Ala Asn Arg Ser Gly Leu Thr Glu Glu 450 455460

Glu lie Leu He Leu Asn Asn lie Ser Vai Asp Vai Arg Lys LeuCys ⁴⁶⁵ 470 475

Ala Glu Arg Ala Cys Asn Thr Leu Pro Ser Ala Lys Arg Phe SerLys

485 490495

Asn His Lys Ser Asn lie Gin Ser Ser Arg Gin Glu Arg Arg lie Lys 500 505510

Asp Pro Leu Vai Vai Leu Lys Asp Thr Leu Tyr Glu Phe Gin His Lys 515 520525

Arg Ala Gly Trp Gly Ser Arg Ser Thr Arg Asp Leu Gly Ser Arg Ala 530 535540

Asp His Ala Lys Gly Ser Gly 545550

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 672 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAGTTCCA	ACACAAGCGT GCCGGTTGGG GGTCTCGAAG CACTCGAGAC	CTCGGGAGTC	60
GTGCTGACCA	CGCGAAAGGA AGCGGTTGAT AAGTTTTTTA ATGAACTAAA	AAACGAAAAT	120
TACTCATCAG	TTGACAGCAG CCGATTAAGC GATTCGGAAG TAAAAGAAGT	GTTAGAGAAA	180
AGTAAAGAAA	GTTTCAAAAG CGAACTGGCC TCCACTGACG AGCACTTCGT	CTACCACATT	240
ATATTTTTCT	TAATCCGATG TGCTAAGATA TCGACAAGTG AAAAGGTGAA	GTACGTTGGT	300
AGTCATACGT	ACGTGGTCGA CGGAAAAACG TACACCGTTC TTGACGCTTG	GGTATTCAAC	360
ATGATGAAAA	GTCTCACGAA GAAGTACAAA CGAGTGAATG GTCTGCGTGC	GTTCTGTTGC	420
GCGTGCGAAG	ATCTATATCT AACCGTCGCA CCAATAATGT CAGAACGCTT	TAAGACTAAA	480
GCCGTAGGGA	TGAAAGGTTT GCCTGTTGGA AAGGAATACT TAGGCGCCGA	CTTTCTTTCG	540
GGAACTAGCA	AACTGATGAG CGATCACGAC AGGGCGGTCT CCATCGTTGC	AGCGAAAAAC	600
GCTGTCGATC	GTAGCGCTTT CACGGGTGGG GAGAGAAAGA TAGTTAGTTT	GTATGATCTA	660
GGGAGGTACT	AA		672

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 686 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Ser Ser Asn 1

Thr Ser Gly Val 20

Phe Asn Glu Leu 35

Leu Ser Asp Ser 50

Thr Ser Val Pro 5

Val Leu Thr Thr

Lys Asn Glu Asn 40

Glu Val Lys Glu 55

Val Gly Gly Leu 10 ’

Arg Lys Glu Alá 25

Tyr Ser Ser Val

Val Leu Glu Lys 60

Glu Alá Leu Glu 15

Val Asp Lys Phe 30

Asp Ser Ser Arg 45

Ser Lys Glu Ser

- 151 -

Phe 65	Lys	Ser Glu	Leu Alá 70	Ser Thr	Asp Glu His Phe Val 75	Tyr His	He 80
He	Phe	Phe Leu	He Arg 85	Cys Alá	Lys He Ser Thr Ser 90	Glu Lys 95	Val
Lys	Tyr	Val Gly 100	Ser His	Thr Tyr	Val Val Asp Gly Lys 105	Thr Tyr 110	Thr
Val	Leu	Asp Alá 115	Trp Val	Phe Asn 120	Met Met Lys Ser Leu 125	Thr Lys	Lys
Tyr	Lys 130	Arg Val	Asn Gly	Leu Arg 135	Ala Phe Cys Cys Alá 140	Cys Glu	Asp
Leu 145	Tyr	Leu Thr	Val Alá 150	Pro He	Met Ser Glu Arg Phe 155	Lys Thr	Lys 160
Alá	Val	Gly Met	Lys Gly 165	Leu Pro	Val Gly Lys Glu Tyr 170	Leu Gly 175	Alá
Asp	Phe	Leu Ser 180	Gly Thr	Ser Lys	Leu Met Ser Asp His 185	Asp Arg 190	Alá
Val	Ser	He Val 195	Ala Alá	Lys Asn 200	Alá Val Asp Arg Ser 205	Alá Phe	Thr

Gly Gly Glu Arg Lys He Val

210 215

Ser Leu Tyr Asp Leu Gly Arg Tyr

220

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 597 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGAGTTGA	TGTCCGACAG	CAACCTTAGC AACCTGGTGA TAACCGACGC	CTCTAGTCTA	60
AATGGTGTCG	ACAAGAAGCT	TTTATCTGCT GAAGTTGAAA AAATGTTGGT	GCAGAAAGGG	120
GCTCCTAACG	AGGGTATAGA	AGTGGTGTTC GGTCTACTCC TTTACGCACT	CGCGGCAAGA	180
ACCACGTCTC	CTAAGGTTCA	GCGCGCAGAT TCAGACGTTA TATTTTCAAA	TAGTTTCGGA	240
GAGAGGAATG	TGGTAGTAAC	AGAGGGTGAC CTTAAGAAGG TACTCGACGG	GTGTGCGCCT	300
CTCACTAGGT	TCACTAATAA	ACTTAGAACG TTCGGTCGTA CTTTCACTGA	GGCTTACGTT	360

- 152 GACTTTTGTA TCGCGTATAA GCACAAATTA CCCCAACTCA ACGCCGCGGC GGAATTGGGG420

ATTCCAGCTG AAGATTCGTA CTTAGCTGCA GATTTTCTGG GTACTTGCCC GAAGCTCTCT480 gaattacagc AAAGTAGGAA GATGTTCGCG AGTATGTACG CTCTAAAAAC TGAAGGTGGA540

GTGGTAAATA CACCAGTGAG CAATCTGCGT CAGCTAGGTA GAAGGGAAGT TATGTAA597

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 198 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

^Met Glu Leu Met Ser Asp Ser Asn 15

Alá Ser Ser Leu Asn Gly Val Asp 20

Glu Lys Met Leu Val Gin Lys Gly 3540

Val Phe Gly Leu Leu Leu Tyr Alá ⁵⁰55

Lys Val Gin Arg Alá Asp Ser Asp ⁶⁵70

Glu Arg Asn Val Val Val Thr Glu 85

Gly Cys Alá Pro Leu Thr Arg Phe 100

Arg Thr Phe Thr Glu Alá Tyr Val ¹¹⁵120

Lys Leu Pro Gin Leu Asn Ala Alá .

¹³⁰135

Leu Ser Asn Leu Val He Thr Asp 10

Lys Lys Leu Leu Ser Alá Glu Val 2530

Ala Pro Asn Glu Gly He Glu Val 45

Leu Ala Alá Arg Thr Thr Ser Pro 60

Val He Phe Ser Asn Ser Phe Gly ⁷³ 80

Gly Asp Leu Lys Lys Val Leu Asp

Thr Asn Lys Leu Arg Thr Phe Gly ¹⁰⁵ 110

Asp Phe Cys II e Alá Tyr Lys His 125

Ma Glu Leu Gly He Pro Alá Glu 140

Asp Ser Tyr Leu Ala Alá Asp Phe Leu Gly ¹⁴⁵150

Glu Leu Gin Gin Ser Arg Lys Met Phe Alá

165170

Thr Cys Pro Lys Leu Ser ¹⁵⁵ 160

Ser Met Tyr Alá Leu Lys 175

Thr Glu Gly Gly Val

180

Val Asn Thr Pro Val Ser Asn Leu Arg Gin Leu

185

Gly Arg Arg Glu Val Met 195

- 153 . » ·♦· · » * .:. .:..., - r

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;

HOSSZA: 486 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: cDNS

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGAAGATT	ACGAAGAAAA ATCCGAATCG	CTCATACTGC	TACGCACGAA	TCTGAACACT	60
ATGCTTTTAG	TGGTCAAGTC	CGATGCTAGT	GTAGAGCTGC	CTAAACTACT	AATTTGCGGT	120
TACTTACGAG	TGTCAGGACG	TGGGGAGGTG	ACGTGTTGCA	ACCGTGAGGA	attaacaaga	180
GATTTTGAGG	GCAATCATCA	TACGGTGATC	CGTTCTAGAA	TCATACAATA	TGACAGCGAG	240
TCTGCTTTTG	AGGAATTCAA	CAACTCTGAT	TGCGTAGTGA	AGTTTTTCCT	AGAGACTGGT	300
AGTGTCTTTT	GGTTTTTCCT	TCGAAGTGAA	ACCAAAGGTA	GAGCGGTGCG	ACATTTGCGC	360
ACCTTCTTCG	aagctaacaa	TTTCTTCTTT	GGATCGCATT	GCGGTACCAT	GGAGTATTGT	420
TTGAAGCAGG	TACTAACTGA	AACTGAATCT	ATAATCGATT	CTTTTTGCGA	AGAAAGAAAT	4r80
CGTTAA						486

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 161 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

- 154 Met Glu Asp Tyr Glu Glu Lys Ser Glu Ser Leu lie Leu Leu Arg Thr 15 1015

Asn Leu Asn. Thr Met Leu Leu Val Val Lys Ser Asp Ala Ser Val Glu 20 2530

Leu Pro Lys Leu Leu lie Cys Gly Tyr Leu Arg Val Ser Gly Arg Gly 35 4045

Glu Val Thr Cys Cys Asn Arg Glu Glu Leu Thr Arg Asp Phe Glu Gly 50 5560

Asn His His Thr Val Ile Arg Ser Arg lie lie Gin Tyr Asp SerGlu

70 7580

Ser Ala Phe Glu Glu Phe Asn Asn Ser Asp Cys Val Val Lys PhePhe

9095

Leu Glu Thr Gly Ser Val Phe Trp Phe Phe Leu Arg Ser Glu Thr Lys 100 105110

Gly Arg Ala Val Arg His Leu Arg Thr Phe Phe Glu Ala Asn Asn Phe 115 120125

Phe Phe Gly Ser His Cys Gly Thr Met Glu Tyr Cys Leu Lys Gin Val 130 135140

Leu Thr Glu Thr Glu Ser lie lie Asp Ser Phe Cys Glu Glu Arg Asn 145 150 155160

Arg

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 618 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAGGGTTA TAGTGTCTCC TTATGAAGCT GAAGACATTC TGAAAAGATC	GACTGACATG	60
TTACGAAACA TAGACAGTGG GGTCTTGAGC ACTAAAGAAT GTATCAAGGC	ATTCTCGACG	120
ATAACGCGAG ACCTACATTG TGCGAAGGCT TCCTACCAGT GGGGTGTTGA	CACTGGGTTA	180
TATCAGCGTA ATTGCGCTGA AAAACGTTTA ATTGACACGG TGGAGTCAAA	CATACGGTTG	240

- 155 -

GCTCAACCTC	TCGTGCGTGA	aaaagtggcg	GTTCATTTTT	gtaaggatga	ACCAAAAGAG	300
CTAGTAGCAT	TCATCACGCG	aaagtacgtg	GAACTCACGG	gcgtgggagt	GAGAGAAGCG	360
GTGAAGAGGG	aaatgcgctc	TCTTACCAAA	acagttttaa	ataaaatgtc	TTTGGAAATG	420
GCGTTTTACA	TGTCACCACG	AGCGTGGAAA	AACGCTGAAT	ggttagaact	aaaattttca	480
CCTGTGAAAA	TCTTTAGAGA	TCTGCTATTA	GACGTGGAAA	cgctcaacga	attgtgcgcc	540
GAAGATGATG	TTCACGTCGA	CAAAGTAAAT	gagaatgggg	acgaaaatca	cgacctcgaa	600
CTCCAAGACG	AATGTTAA					618

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 686 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: protein

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Arg Vai lie Vai Ser Pro Tyr Glu Ala Glu Asp lie Leu Lys Arg 15 iois

Ser Thr Asp Met Leu Arg Asn lie Asp Ser Gly Vai Leu Ser Thr Lys 20 2530

Glu Cys lie Lys Ala Phe Ser Thr lie Thr Arg Asp Leu His Cys Ala 35 4045

Lys Ala Ser Tyr Gin Trp Gly Vai Asp Thr Gly Leu Tyr Gin Arg Asn SO 5560

Cys Ala Glu Lys Arg Leu lie Asp Thr Vai Glu Ser Asn He ArgLeu

70 7580

Ala Gin Pro Leu Vai Arg Glu Lys Vai Ala Vai His Phe Cys LysAsp so95

Glu Pro Lys Glu Leu Vai Ala Phe He Thr Arg Lys Tyr Vai Glu Leu 100 105110

Thr Gly Vai Gly Vai Arg Glu Ala Vai Lys Arg Glu Met Arg Ser Leu 115 120125

Thr Lys Thr Vai Leu Asn Lys Met Ser Leu Glu Met Ala Phe Tyr Met

130 135140

- 156 Ser Pro Arg Ala Trp Lys Asn Alá Glu Trp Leu Glu Leu Lys Phe Ser

145 150 155160

Pro Val Lys Ile Phe Arg Asp Leu Leu Leu Asp Val Glu Thr LeuAsn

165 170175

Glu Leu Cys Alá Glu Asp Asp Val His Val Asp Lys Val Asn Glu Asn 180 185190

Gly Asp Glu Asn His Asp Leu Glu Leu Gin Asp Glu Cys 195 200205

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 21 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TGCTGGAGCT TGAGGTTCTG C

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 31 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGGAATTCAC CATGGAGTTG ATGTCCGACA G

- 157 A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS.· cDNS

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCGGATCCA TGGCAGATTC GTGCGTAGCA GTA 33

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 216 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: CDNS

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACATTGGTTA AGTTTAACGA	AAATGATTAG TAAATAATAA ATCGAACGTG	GGTGTATCTA	60
CCTGACGTAT CAACTTAAGC	TGTTACTGAG TAATTAAACC AACAAGTGTT	GGTGTAATGT	120
GTATGTTGAT GTAGAGAAAA	ATCCGTTTGT AGAACGGTGT TTTTCTCTTC	TTTATTTTTA	180

ΑΆΑΑΑΑΑΑΆΤ ΑΑΑΆΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAAGC GGCCGC

216

Claims (78)

1. - 158 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált fehérje vagy polipeptid, amely megfelel a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus (2. típus) egy fehérjéjének vagy polipeptidének.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely poliprotein, RNS-függő RNS-polimeráz, hősokk fehérje 70, hősokk fehérje 90, divergálódott burokfehérje vagy burokfehérje.
3. 3. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely poliprotein.
4. 4. A3, igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 3. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
5. 5. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely körülbelül 50 kDa és körülbelül 54 kDa közé eső molekulatömegű RNS-függő RNS-polimeráz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 5. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
7. 7. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely körülbelül 63 kDa és körülbelül 67 kDa közé eső molekulatömegű hősokk fehérje 70.
8. 8. A 7. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 9. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.

   - 159 -
9. 9. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely körülbelül 61 kDa és körülbelül 65 kDa közé eső molekulatömegű hősokk fehérje 90.
10. 10. A 9. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 11. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
11. 11. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely körülbelül 20 kDa és körülbelül 24 kDa közé eső molekulatömegű burokfehérje.
12. 12. A 11. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 15. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
13. 13. A 2. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely körülbelül 23 kDa és körülbelül 27 kDa közé eső molekulatömegű divergálódott burokfehérje.
14. 14. A 13. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 13. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 7. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 17. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tartalmaz egy 19. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát.

    - 160 -
18. 18. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely tisztított.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti izolált fehérje vagy polipeptid, amely rekombináns.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti fehérjét vagy polipeptidet kódoló izolált RNS-molekula.
21. 21. A 20. igénypont szerinti izolált RNS-molekula, amely poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódol.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti fehérjét vagy polipeptidet kódoló izolált DNS-molekula.
23. 23. A 22. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódol.
24. 24. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely helikáz, papain-szerű proteáz és metil-transzferáz konzervált régióit tartalmazó poliproteint kódol.
25. 25. A 24. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 3. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
26. 26. A 25. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 2. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciájú.

    - 161 • ···· ··· .:. .:. ...· „·.. ··:·
27. 27. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely körülbelül 50 kDa és körülbelül 54 kDa közé eső molekulatömegű RNS-függő RNS-polimerázt kódol.
28. 28. A 27. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely az 5. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
29. 29. A 28. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 4. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
30. 30. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely körülbelül 63 kDa és körülbelül 67 kDa közé eső molekulatömegű hősokk fehérje 70-et kódol.
31. 31. A 30. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 9. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
32. 32. A 31. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
33. 33. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely körülbelül 61 kDa és körülbelül 65 kDa közé eső molekulatömegű hősokk fehérje 90-et kódol.
34. 34. A 33. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 11. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy po-

    - 162 .:. .:. ...· j.. ·τ

    1ipept idet kódol.
35. 35. A 34. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 10. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
36. 36. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely körülbelül 20 kDa és körülbelül 24 kDa közé eső molekulatömegű burokfehérjét kódol.
37. 37. A 36. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 15. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
38. 38. A 37. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 14. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
39. 39. A 23. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely körülbelül 23 kDa és körülbelül 27 kDa közé eső molekulatömegű divergálódott burokfehérjét kódol.
40. 40. A 39. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 13. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
41. 41. A 40. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 12. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.

    - 163 .:. .:. ...· j.. ··:·
42. 42. A 22. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 7. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
43. 43. A 42. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 6. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
44. 44. A 22. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 17. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
45. 45. A 44. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 16. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
46. 46. A 22. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 19. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
47. 47. A 46. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 18. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.
48. 48. A 22. igénypont szerinti izolált DNS-molekula, amely a 23. azonosítási szám szerinti szekvenciának megfelelő nukleotid szekvenciát tartalmazó fehérjét vagy polipeptidet kódol.

    - 164 -
49. 49. 22. igénypont szerinti DNS-molekulát a DNS-molekulához képest heterológ vektorban tartalmazó expressziós rendszer.
50. 50. A 49. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódoló DNS-molekulát tartalmaz.
51. 51. A 22. igénypont szerinti heterológ DNS-molekulával transzformált gazdasejt.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti gazdasejt, amely Agrobacterium vitis vagy Agrobacterium tumefacíens.
53. 53. Az 51. igénypont szerinti gazdasejt, amely szőlőnövénysejt, citrusnövénysejt, céklanövénysejt vagy dohánynövénysej t.
54. 54. Az 51. igénypont szerinti gazdasejt, amely poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódoló heterológ DNS-molekulával lett transzformálva
55. 55. 22. igénypont szerinti DNS-molekulát tartalmazó transzgént hordozó növénytermesztési változat.
56. 56. Az 55. igénypont szerinti transzgént hordozó növénytermesztési változat, amely szőlőnövény-termesztési változat, citrusnövény-termesztési változat, céklanövénytermesztési változat vagy dohánynövény-termesztési válto zat .

    - 165 .:. .:. . ·τ
57. 57. Az 55. igénypont szerinti transzgént hordozó növénytermesztési változat, amely poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódoló transzgént tartalmaz.
58. 58. Eljárás szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus elleni rezisztencia átvitelére Vitis oltványra vagy gyökértörzs-termesztési változatra, vagy Nicotiana termesztési változatra, azzal jellemezve, hogy:

    Vitis oltványt vagy gyökértörzs-termesztési változatot vagy Nicotiana termesztési változatot 22. igénypont szerinti DNS-molekulával transzformálunk.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódoló DNS-molekulával transzformálunk.
60. 60. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szőlőnövény-levélsodródást okozó vírusként GLRaV-2 vírus elleni rezisztenciát viszünk át.
61. 61. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Agrobacterium-közvetített transzformálást hajtunk végre.
62. 62. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformálás során:

    részecskéket gyorsítunk fel szőlőnövény vagy dohánynövénysejtekre irányítva, a részecskéknek a sejt belsejébe történő behatolását biztosító körülmények között; és

    - 166 ··· ··· ··· «φβ 9 t a DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektort juttatunk be a sejt belsejébe.
63. 63. Eljárás céklasárgulást okozó vírus elleni rezisztencia átvitelére céklatermesztési változatra, azzal jellemezve, hogy:

    céklatermesztési változatot a 22. igénypont szerinti DNS-molekulával transzformálunk.
64. 64. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét kódoló DNS-molekulával transzformálunk.
65. 65. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Agrobacterium-közvetített transzformálást hajtunk végre .
66. 66. A 63. igénypont szerinti eljárás, továbbá azzal jellemezve, hogy a transzformálás során:

    részecskéket gyorsítunk fel céklanövénysejtekre irányítva a részecskéknek a sejt belsejébe történő behatolását biztosító körülmények között; és a DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektort juttatunk be a sejt belsejébe.
67. 67. Eljárás tristeza vírus elleni rezisztencia átvitelére citrusoltvány-termesztési változatra vagy gyökértörzstermesztési változatra, azzal jellemezve, hogy:

    citrusoltvány-termesztési változatot vagy gyökértörzstermesztési változatot a 22. igénypont szerinti DNS-mole kulával transzformálunk.

    - 167 *·* ··» ·♦-* w* · **t*
68. 68. A 67. igénypont szerinti eljárás továbbá azzal jellemezve, hogy poliproteint, RNS-függő RNS-polimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehér jet vagy burokfehérjét kódoló DNS-molekulával transzformálunk.
69. 69. A 67. igénypont szerinti eljárás, továbbá azzal jellemezve, hogy Agrobacterium-közvetített transzformálást hajtunk végre.
70. 70. A 67. igénypont szerinti eljárás, továbbá azzal jellemezve, hogy a transzformálás során:

    részecskéket gyorsítunk fel citrusnövénysejtekre irányítva a részecskéknek a sejt belsejébe történő behatolását biztosító körülmények között; és a DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektort juttatunk be a sejt belsejébe.
71. 71. Az 1. igénypont szerinti fehérjét vagy polipeptidet felismerő antitest vagy annak kötő része, vagy próba.
72. 72. A 71. igénypont szerinti antitest vagy annak kötő részé, vagy próba, amely poliproteint, RNS-függő RNSpolimerázt, hősokk fehérje 70-et, hősokk fehérje 90-et, divergálódott burokfehérjét vagy burokfehérjét ismer fel.
73. 73. Eljárás szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus kimutatására mintában, azzal jellemezve, hogy:

    az 1. igénypont szerinti fehérjét vagy polipeptidet felismerő antitestet vagy annak kötő részét előállítjuk;

    a mintát az antitesttel vagy annak kötő részével érintkeztetjük; és

    vizsgálati rendszer alkalmazásával egy, a szőlőnövénylevélsodródást okozó vírus mintában való jelenlétét jelző reakciót kimutatunk.
74. 74. A 73. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálati rendszerként enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárást, radioimmun vizsgálati eljárást, gél diffúziós precipitin reakciós vizsgálati eljárást, immundiffúziós vizsgálati eljárást, agglutinációs vizsgálati eljárást, fluoreszcens immunológiai vizsgálati eljárást, protein-A immunológiai vizsgálati eljárást és/vagy immunelektroforézis vizsgálati eljárást alkalmazunk.
75. 75. Eljárás szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus kimutatására mintában, azzal jellemezve, hogy:

    próbaként a 22. igénypont szerinti DNS-molekula nukleotid szekvenciáját állítjuk elő nukleinsav hibridizációs vizsgálati eljáráshoz;

    a mintát a próbával érintkeztetjük; és egy, a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus mintában való jelenlétét jelző reakciót kimutatunk.
76. 76. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav hibridizációs vizsgálati eljárásként dotblot hibridizációt, szöveti lenyomat készítést, Southernhibridizációt és/vagy Northern-hibridizációt hajtunk végre.
77. 77. Eljárás szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus kimutatására mintában, azzal jellemezve, hogy:

    próbaként a 22. igénypont szerinti DNS-molekula nukleotid szekvenciáját állítjuk elő génamplifikációs kimutatási élj áráshoz;

    - 169 -

    a mintát a próbával érintkeztetjük; és egy, a szőlőnövény-levélsodródást okozó vírus mintában való jelenlétét jelző reakciót kimutatunk.
78. 78. A 77. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy génamplifikációs kimutatási eljárásként polimerázláncreakciót és/vagy immun-befogásos polimeráz-láncreakciót hajtunk végre.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

    dr. Pethő Árpád szabadalmi ügyvivő