HU231162B1 - Kiméra fertőző DNS-klónok, kiméra sertés cirkovírusok, és alkalmazásuk - Google Patents

Description

Kiméra fertőző DNS-klónok, kiméra sertés cirkovírusok, és alkalmazásuk

A találmány tárgyát viráísí vakcinák képezik, amelyek megvédik a sertéseket a PCV2 által okozott virális fertőzéstől vagy elválasztás után multi szisztémás sorvadás szindrómától (PMWS). A sertés cirko vírust (PCV) eredetileg sejttenyészet szennyeződéseként izolálták PK-15 sertésvese-sejtvonalból [L Tischer és mtsai., „A very small porcine virus with circular síngle-stranded DNA”, Nature 295, 64-66. old. (1982); 1. Tischer és mtsai., „Characterization of papovavirus and picomavirus-like particles in permanent pig kidney ceil lines”, Zentralbl. Bakteriül. Hyg. Otg. A., 226(2), 153-167. old. (1974)]. A PCV egy kis ikozahedrális buroktalan virus, amely 1,76 kB méretű egyszálú cirkuláris DNS-genomot tartalmaz. A PCV-t a Circovíridae családjába sorolták be, amely három másik állati cirkovírust [csirke anémia vírust (CAV), papagáj csőr és toll betegség vírusát (PBFDV) és a nemrégiben felfedezett galamb cirkovírust (CoCV)], és három növényi cirkovírust (banán csomós tető vírus, kókusz levélrothadás vírus és lóhere földalatti satnyaság vírusa) [M. R. Bassami és mtsai., „Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus”, Virology 249, 453-459. old. (1998); J. Mankertz és mtsai., „Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)”, Virus Genes 16, 267-276. old. (1998); A. Mankertz és mtsai., „Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”, Arch. Virol. 145, 2469-2479. old. (2000); B. M. Meehan és mtsai., „Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses”, J. Gen. Virol. 78, 221-227. old. (1997); B. M. Meehan és mtsai., ’’Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs”, J. Gen. Virol. 79, 2171-2179. old. (1998); D. Todd és mtsai., „Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes, Arch. Virol. 117, 129-135. old. (1991)]. A három korábban felismert állati cirkovírusnak (PCV, CAV és PBFDV) nincsen nukleotid-szekvencia homológiája vagy közös antigén-determinánsai egymással [M. R. Bassami és mtsai., 1998, mint fent; D. Todd és mtsai., 1991, mint fent). Az újonnan felfedezett CoCV genomja körülbelül 40% nukleotidszekvencia azonosságot mutatott a PCV-vel [A. Mankertz és mtsai., „Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”. Arch. Virol. 145, 2469-2479. old. (2000)]. Nemrégiben egy új, cirkuláris genomú humán cirkovírust azonosítottak transzfúziót követő hepatitiszes személyekből, amelyet transzfúzió által transzmitták vagy TT vírusnak (TTV) neveztek el [H. Miyata és mtsai., „Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus”, J. Virol. 73, 3582-3586. old. (1999); T. Nishizawa és mtsai., „A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241, 92-97. old. (1997)]. Ezenfelül egy humán TTV-szerü minivírust (TLMV) azonosítottak normái véradókból [P. Biagini és mtsai., „Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates”, J. Gen. Virol. 82, 379-383. old. (2001); K. Takahashi és mtsai., „Identification of a new human DNA virus (TTV-like mint virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus”, Arch. Virol. 145, 979-993. old. (2000)], és három új cirkovírust — amelyeket SEN vírusként (SENV) ismerünk — is felfedeztek poszt-transzfúziós hepatitiszben szenvedő emberekben [T. Umemura és mtsai., „SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis”, Hepathology 33, 1303-1311. old. (2001)]. A humán TTV és TLMV genomiális szerveződése hasonló a CAV-éhoz (P. Biagini és mtsai., 2001, mint fent; H. Miyata és mtsai., 1999, mint fent; K. Takahashi és mtsai., 2000, mint fent). Habára PCV elleni ellenanyagokat megtalálták különféle állatfajokban, mint például emberekben, egerekben,

124659-14095 LT/An

-2s zár vasmarhában és sertésekben [G. M. Allan és mtsai, „Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus’’, Vet. Immunol. Immunopatho). 43, 357-371. old. (1994); G. C. Dulac és A. Afshar, „Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs”. Can. J. Vet. Res. 53, 431-433. old. (1989); S. Edwards és J. J.

Sands, „Evidence of circovirus infection in British pigs”, Vet. Rec. 134, 680-681. old. (1994); J. C. Harding és E. G. Clark, „Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)”, Swine Health and Production 5, 201-203. old. (1997); R. K. Hines és P. D. Lukert, „Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States”, Swine Health and Production 3, 71-73. old. (1995); G. P. Nayar és mtsai., „Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease andfrom aborted bovine fetuses”, Can. Vet. J. 40, 277-

278.old. (1999); I. Tischer és mtsai., „Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms”, Arch. Virol. 140, 737-743. old. (1995); 1. Tischer és mtsai., „Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle”, Arch. Virol. 140, 1427-1439. old. (1995)], keveset tudunk a PCV patogenezisével kapcsolatban ezekben az állatfajokban. Sertések kísérletes megfenözése a PK-15 sejtekből származó PCV-vel nem eredményezett klinikai betegséget, és ily módon ezt a vírust nem tekinthetjük patogénnek sertésekben [G. M. Allan és mtsai., „Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetai material”, Vet. Microbiol. 44, 49-64. old. (1995); I. Tischer és mtsai., „Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus”, Arch. Virol. 91, 271-276. old. (1986)]. A szennyezett PK-15 sejtvonalból származó nem-patogén PCV-t 1-es típusú sertés cirkovírusnak vagy PCV 1-nek nevezték el.

Az elválasztás utáni multiszisztémás sorvadás! szindróma (PMWS) — amelyet először 1991-ben írták le (J. C. Harding és E. G. Clark, 1997, mint fent) —, elválasztott malacok komplex betegsége, amely egyre szélesebb körben kezd elterjedni. A sert és tenyésztő-ipar potenciális komoly gazdasági fenyegetettsége miatt sürgőssé vált vakcina kifejlesztése PCV2 ellen, amely a PMWS elsődleges kórokozó ágense. A PMWS főleg 518 hetes sertésekre hat. A PMWS klinikai jelei közé tartozik az előrehaladó tömegvesztés, zavart légzés, gyors légzés, vérszegény ség, hasmenés és sárgaság. A mortalitási arány 1% és 2% között változhat, és akár 40%-ig is felmehet bizonyos komplikált esetekben az Egyesült Királyságban [M, Muirhead, „Sources of information on PMWS/PDNS”, Vet. Rec. 150, 456. old. (2002)]. A PMWS-re jellemző mikroszkopikus sérülések közé tartozik a granulómás interstíciális tüdőgyulladás, limfadenopátia, hepatitisz és nefritisz [G. M. Allan és J. A. Ellis, „Porcine circoviruses: a review, J. Vet. Diagn. Invest. 12, 3-14. old, (2000); J. C. Harding és E. G. Clark, 1997, mint fent]. Találtak már PMWS-t sertésekben Kanadában, az Amerikai Egyesült Államokban [G. M. Allan és mtsai., „Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes”, Vet. Rec. 142, 467-468. old. (1998); G. M. Allan és mtsai., „Isolation of porcine circovirus-!ike viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe”, J. Vet. Diagn. Invest. 10, 3-10. old. (1998); G. M. Allan és J. A. Ellis, 2000, mint fent; J. Ellis és mtsai., „Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome”,

Can. Vet. J. 39,44-51. old. (1998); A. L. Hamel és mtsai., „Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs”, J. Virol. 72, 5262-5267. old. (1998); M, Kiupel és mtsai., „Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana”, Vet. Pathol. 35, 303-307. old. (1998); R. Larochelle és mtsai., „Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in W Quebec as determined by PCR”, Vet. Rec. 145, 140-142. old. (1999); B. M. Meehan és mtsai., 1998, mint fent;l.

Morozov és mtsai., „Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic

CN

-3wasting syndrome”, J. Clin. Microbiol. 36, 2535-2541. old. (1998)], a legtöbb európai országban [G. M. Allan és mtsai., „Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe”, J. Vet. Diagn. Invest. 10, 3-10. old. (1998); G. M. Allan és J. A. Ellis, 2000, mint fent; S. Edwards és J. J. Sands, 1994, mint fent; S. Kennedy és mtsai., „Porcine circovirus infection in Northern Ireland”, Vet. Rec. 142, 495496. old. (1998); A. Mankertz és mtsai., „Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France”, Virus Res. 66, 65-77. old. (2000); C. Rosell és mtsai., „identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome”, Vet. Rec. 146, 40-43, old. (2000); P. Spillane és mtsai., „Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland”, Vet. Rec. 143, 511 -512.old. (1998); G. J. Wellenbergés mtsai., „Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands”, Vet. Quart. 22, 167-172. old. (2000)] és Ázsia bizonyos országaiban [C. Choi és mtsai., „Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction”, J. Vet. Diagn. Invest. 12, 151-153.old. (2000); A. Onuki és mtsai., „Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan”, J. Vet. Med. Sci. 61, 1119-1123. old. (1999)]. A PMWS potenciálisan komoly gazdasági hatású lehet a világ sertéstenyésztő iparában.

A PMWS elsődleges kórokozója a PCV patogenikus törzse, amelyet 2-es típusú sertés cirkovírusnak vagy PCV2-nek neveznek [G. M. Allan és mtsai., „Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes”, Vet. Rec. 142, 467-468. old. (1998); G. M. Allan és mtsai., „Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe”, J. Vet. Diagn. Invest. 10, 3-10. old. (1998); G. M. Allan és mtsai., „Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland”, Vet. Microbiol. 66, 115-123. old. (1999); G. M. Allan és J. A. Ellis, 2000, mint fent; J. Ellis és mtsai., 1998, mint fent; A. L. Hamel és mtsai., 1998, mint fent; B. M. Meehan és mtsai., 1998, mint fent;I. Morozov és mtsai., 1998, mint fent]. Meghatározták a PMWS-sel kapcsolatos PCV2 teljes genotniális szekvenciáját [M. Fenaux és mtsai., „Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR- restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2”, J. Clin. Microbiol. 38, 2494-2503. old. (2000); A. L. Hamel és mtsai., 1998, mint fent; J. Mankertz és mtsai., 1998, mint fent; B. M. Meehan és mtsai., 1997, mint fent; B.M. Meehan és mtsai., 1998, mint fent; I. Morozov és mtsai., 1998, mint fent].

A PCVi mindenütt jelen van sertésekben, de nem patogenikus azok számára. Ezzel szemben a genetikailag rokonságban álló PCV2 patogén, és PMWS-t okoz sertésekben. Szekvenciaelemzések feltárták, hogy a PMWS-sel kapcsolatos PCV2 csak körülbelül 75% nukleotid-szekvencia azonosságot mutat a nempatogén PCVl-el. A nem-patogén PCV! és a patogén PCV2 ORF2 génje kódolja a fő immunogén vitális kapszid fehérjét [P. Nawagitgul és mtsai., „Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2) -based ELISA for the detection of antibodies to PCV”, Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunoi. I, 33-40. old. (2002); P. Nawagitgul és mtsai., „Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein”, J. Gen. Virol. 81,2281 -2287. old. (2000)].

A kezdeti próbálkozások klinikai PMWS reprodukálására hagyományos sertésekben PCV2 fertőzéssel sikertelenek voltak [M. Balasch és mtsai., „Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome”, J. Comp. Pathol. 121, 139-148.

-4old. (1999); M. Fenaux és mtsai., „Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions”, J. Virol. 76, 541-551. old. (2002)]. A klinikai PMWS kísérletes reprodukálása gnotobiotikus sertésekben és hagyományos sertésekben természetben előforduló PMWS-ben szenvedő sertésekből származó homogén izátumokkal és sejttenyészetben szaporított PCV2-vel kevert eredményeket hozott. Reprodukálták a klinikai PMWS-t gnotobiotikus (SPF) sertésekben és kolosztrumot nem kapott és császármetszéssel született sertésekben, amelyek együtt voltak fertőzve PCV2-vel és sertés parvovírussal (PPV) [G. M. Allan és rntsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by coinfection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 12), 1-11. old. (1999); S.

Krakowka és mtsai., „Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus”, Vet. Pathol. 37, 254-263. old. (2000)], és PCV2-vel oltott gnotobiotikus setésekben, amikor azok immunrendszere aktiválva volt kürtöcsiga hemocianinnal és inkomplett Freund-féle adjuvánssal [S. Krakowka és mtsai., „Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)”, Vet. Pathol. 38, 3 l-42.old. (2001)].

A klinikai PMWS-t reprodukálták császármetszéssel született / kolosztrumot nem kapott (CD/CD) sertésekben is, amelyek csak PCV2-vel voltak oltva [P. A. Hamis és mtsai., „Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Vet. Pathol. 38, 528-539. old. (2001)], és hagyományos sertésekben, amelyek 20 együtt voltak fertőzve PCV2-vel és vagy sertés parvovírussal (PPV), vagy sertés reproduktív és respiratórikus szindróma vírusával (PRRSV) [A. Rivora és mtsai., „Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2”, J. Virol. 76, 3232-3239. old. (2002)]. A PRRSV/PCV2 együttes fertőzés esetében a PMWS jellegzetes patológiás tüneteit — mint például limfoid depléció, granulómás gyulladás és nekrotizáló hepatitisz — a PCV2 indukálja, és nem pedig a PRRSV [P, A.

Harms és mtsai., 2001, mint fent). Azonban a klinikai PMWS nem volt reprodukálható egyedül PCV2-vel fertőzött gnotobiotikus sertésekben [G.M. Allan és mtsai., „Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication”, Arch. Virol. 145, 2421-2429. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation”, J. Vet. Med. 47, 81-94. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 121, I-11. old. (1999); M. Balasch és mtsai., 1999, mint fent; J. Ellis és mtsai., „Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets”, J. Vet. Diagn, Invest. 11,314. old. (1999); S. Kennedy és mtsai., „Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 122, 9-24. old. (2000); S. Krakowka és mtsai., 2001, mint fent; S. Krakowka és mtsai., 2000, mint fent; R. M. Pogranichnyy és mtsai., „Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection”, Viral. Immunol. 13, 143-153. old. (2000)]. Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott vírus-oltványok vagy természetben előforduló PMWS-ben szenvedő sertésekből származó szöveti homogénizátumok, vagy PK-15 sejttenyészetekben szaporított vírusok voltak [G.M. Allan és mtsai.,

-5„Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication”, Arch. Virol. 145, 24212429. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: imnumostaining of cryostat sections and virus isolation”, J. Vet. Med. 47, 8194. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 121, l-ll. old. (1999); M. Balasch és mtsai., 1999, mint fent; J. Ellis és mtsai., 1999, mint fent; S. Kennedy és mtsai., 2000, mint fent; S, Krakowka és mtsai., 2001, mint fent; S. Krakowka és mtsai., 2000, mint fent; R. M. Pogranichnyy és mtsai., 2000, mint fent]. Mivel a szöveti homogénizátumok tartalmazhatnak más közönséges sertés ágenseket is, mint például PPV-t és sertés reproduktív és respiratórikus szindróma vírust (PRRSV) is [G.M. Allan és mtsai., „Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication”, Arch. Virol. 145, 2421-2429. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 121, l-Il. old. (1999); G. M. Allan és J. A. Ellis, 2000, mint fent; J. A. Ellis és mtsai., „Coinfection by porcine ctrcoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome”, J. Vet. Diagn. Invest. 12,21-27. old. (2000); C. Resell és mtsai., 2000, mint fent], és mivel a PCV2 szaporítására alkalmazott ATCC PK-15 sejtvonal perzisztensen fertőzve volt PCVl-el (G. C. Dulac és A. Afshar, 1989, mint fent), az ezekben a vizsgálatokban reprodukált klinikai betegség és patológiás sérülések nem feltétlenül csak a PCV2 fertőzésnek tulajdoníthatók [G.M. Allan és mtsai., „Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication”, Arch. Virol. 145, 24212429. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation”, J. Vet. Med. 47, 8194. old. (2000); G. M. Allan és mtsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus”, J. Comp. Pathol. 121, 1-11. old. (1999); G. M. Allan és J. A. Ellis, 2000, mint fent; J. A. Ellis és mtsai., 2000, mint fent].

Λ klinikai PMWS-t reprodukálták PCV2-vel oltott CD/CD sertésekben is, amelyek vakcináivá voltak Mycoplasma hyopneumoniae-val [G. M. Allan és mtsai., „Immunostimulation, PCV- 2 and PMWS”, Vet. Rec. 147, 171-172. old. (2000)]. Két nemrégiben terepen végzett vizsgálatban [G. M. Allan és mtsai., „Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome; a field trial”, Pig J. 48, 34-41. old. (2001 )és S. C. Kyriakis és mtsai., „The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome”, J. Comp, Pathol. 126, 38-46, old, (2002)] tesztelték a Mycoplasma hyopneumoniae vakcina immunmodulácíós hatását a PMWS kialakulására endemikus kondákban, és a PMWS esetek szignifikáns csökkenését mutatták ki a vakcinálatlan csoportokban a vakcináit állatokhoz viszonyítva. Azonban egy másik nemrégiben végzett vizsgálatban hagyományos SPF malacok alkalmazásával szabályozott laboratóriumi körülmények között nem tudtak reprodukálni ilyen hatást, ami azt sugallja, hogy a vakcinálás M. hyopneumoniae-^ potenciálisan befolyásolhatja a klinikai PMWS kialakulását, de egyértelműen másodlagos szerepű a PCV2 fertőzéshez képest. Ezen és más vizsgálatok alapján a PCV2-t mindazonáltal a PMWS elsődleges, de nem kizárólagos kórokozójának tekintik.

-6Α PCV2 biológiailag tiszta formáját tartalmazó fertőző virus törzs tény eszet hiánya megakadályozta a PCV2 patogenezisének és a PCV2 citológiai szerepének megértését a PMWS-ben. A PPV és lehetséges módon a PRRSV elleni vakcinálásról nem mutatták ki konzisztensen, hogy megakadályozzák a PMWS kialakulását PCV2-vel fertőzött sertésekben. Ennek következtében nehéz volt olyan biztonságos, de egyben hatásos vakcinát találni, amely specifikusan a PMWS-t célozza. Mindenkeppen szükség van tehát az ál lat gyógyászati szakterületen hatékony, biztonságos vakcina előállítására PCV2 fertőzések és PMWS ellen.

A 6 287 856. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat (Poet és mtsai.) és a WO 99/45956. számú nemzetközi közzétételi irat tárgyát papagáj csőr és toll betegség vírusból (BFDV) — amely egy madárfajokat megfertőző cirkovírus — és sertés cirkovírusból (PCV) származó nukleinsavak képezik. A szabadalom csupasz DNS-t vagy mRNS-t tartalmazó vakcina-készítményeket javasol, és feltár PCV eukaríóta sejtekben történő tranziens expresszálására szolgáló nukleínsav-vektort, amely a humán citomegalo vírus azonnali vagy korai gén enhanszeréből vagy promóteréből származó cis:-hatású transzkripciós vagy transzlációs szabályozó szekvenciát tartalmaz, működőképesen kapcsolva az adott szekvenciájú nukleinsavhoz. Azonban mivel a PCV DNS csupán a PK-15 sejtvonalbó! származik, az valószínűleg csak az I. Tischer és mtsai. által közel 30 évvel ezelőtt felfedezett (1974, mint fent) PCVl-et tartalmazza, és ezáltal nem valószínű, hogy hatásos lenne PCV2 vagy PCV2 által okozott fertőzések elleni immunválasz kiváltására. Nyílt leolvasási fázisokat tartalmazó vektorok által termelt rekombináns fehérjék alegység-vakcináit is javasolják a szabadalomban, de a PCV-ből származó nyílt leolvasási fázisok nincsenek jól jellemezve és egymástól megkülönböztetve. Mivel a PCV DNS forrása a PK-15 sejt, a PCV1 nyílt leolvasási fázisait tartalmazó vektorokról termeltetett fehérjéknek nem lehetnek megbízható immunológiai tulajdonságaik PCV2 ellen, ha egyáltalán vannak.

A 6 217 883. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Allan és mtsai.) és a 2 781 159B. számú francia szabadalmi irat tárgyát öt PCV törzs izolálása képezi Kanadában, Kaliforniában és Franciaországban (Brittany) PMWS-sel fertőzött sertésekből származó tüdő és ganglion mintákból, és azok alkalmazása legalább egy sertés parvovirus antigénnel együtt immunogenikus készítményekben. Az. ORF1ORF13 PCV2 nyílt leolvasási fázisok (ORF) által kódolt fehérjéket ismertetnek nagy vonalakban a szabadalomban, de nincs példa semmilyen specifikus fehérjére, amely immunogenikus tulajdonságú. A találmány tárgyát képezik továbbá DNS-plazmid, lineáris DNS-molekula és rekombináns vírus vektorok, amelyek tartalmazzák és expresszálják ín vívó a PCV-antigént kódoló nukleínsav-molekulát. Számos további irodalmi hely— mint például a 6 391 314 BE; 6 368 601 Bl. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Íratok; 2 769 321.; 2 769 322. számú francia szabadalmi iratok; WO 01/96377 A2.; WO 00/01409.; WO 99/18214.; WO 00/77188; WO 00/77216 Λ2.; WO 01/16330 A2; WO 99/29871. számú nemzetközi közzétételi iratok, stb. — is ismerteti PCV1 vagy PCV2 polipeptidek vagy különféle törzsek polipeptidjeít kódoló nukleinsavak beadását.

Azonban a nem-patogén PCV1 nem lehet hasznos PCV2 fertőzések ellen, és a szakterületen ismertetett patogén PCV2 törzsek — még legyengítve is — valószínűleg korlátozott értékűek az élő vírusok virulens állapotba történő szokásos visszaalakulási hajlama miatt. Tehát továbbra is szükség van a szakterületen élő, fertőző, nem-patogén antigénre sertések oltásához PCV2 súlyos fertőzése vagy az általa okozott PMWS esetén, amely hatékony, és biztonságos marad állatgyógyászati vakcinákban. Ezeket a célokat a találmány szerinti új kiméra sertés cirkovírus konstrukciókkal teljesítjük be, amelyek az I. Tischer és mtsai. által majdnem 30 évvel ezelőtt izolált nem-patogén PCVI genomiális gerincén alapulnak. A találmány szerinti új kiméra sertés

1825 37 3

-7 cirkovírus képes kielégíteni a hosszú ideje fennálló igényt azáltal, hogy egyedi módon és előnyösen megtartja a PCV1 nem-patogén fenotípusát, de specifikus immunválaszt vált ki a patogén PCV2 ellen.

A találmány tárgyát vitális vakcinák képezik, például DNS vakcinák, élő vakcinák, módosított élő vakcinák, inaktivált vakcinák vagy legyengített vakcinák, amely megvédik a sertést PCV2 által okozott virális fertőzéstől vagy elválasztás után multiszisztémás sorvadás szindrómától (PMWS), amely nem toxikus, fiziológiailag elfogadható hordozót, egy vagy több adjuvánst és az alábbiak bármelyikének immunogenikus mennyiségéttartalmazza:

(a) kiméra sertés cirkovírus nukleinsav-molekula (PCVI-2), amely olyan nem-patogén PCVl-et kódoló nukleinsav-molekulát tartalmaz, amely patogén PCV2 immunogenikus 2-es nyílt leolvasási fázis (ORF2) gént tartalmaz a PCV1 nukleinsav-molekula ORF2 génje helyett;

(b) a 2. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotid-szekvenciájú kiinéra nukleinsav-molekula, annak komplementer szála, vagy olyan nukleotid-szekvencia, amely legalább 95%-ban homológ a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvenciával;

(c) a plazmid vagy virális vektor, amely kiméra sertés cirkovírus (PCVI-2) nukleinsav-molekulát, annak komplementer szálát, vagy olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, amely legalább 95%-ban homológ a 2. azonosítószámú szekvencia szerinti nukleotid-szekvenciával; és (d) PCVI-2 kiméra sertés nukleinsav-molekulábÖ! előállított kiméra sertés cirkovírus, ahol a nempatogén PCV1 ORF2 kapszidgénje helyettesítve van patogén PCV2 ORF2 kaszidgénjével; és, adott esetben legalább egy további sertés antigén immunogenikus mennyiségét.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti virális vakcina, sertés PCV2 által okozott virális fertőzés vagy elválasztás utáni multiszisztémás sorvadás szindróma (PMWS) elleni megvédésében történő alkalmazásra.

Az élő, genetikailag aviruiens kiméra vírusokat a nem-patogén PCV1 genomiális szerkezetekből állítjuk elő, amelyekben egy patogén PCV2 törzs immunogenikus génje helyettesíti a PCV1 génjét, tipikusan ugyanabban a pozícióban. A leírás ismertet biológiailag funkcionális plazmidokat, virális vektorokat és hasonlókat, amelyek tartalmazzák az ismertetett rekombináns nukleinsav-molekulákat, a DNS-t tartalmazó vektorral transzfektált megfelelő gazdasejtek, és az immunogenikus polipepiid expressziós termékek. A találmány tárgyát képezi továbbá új eljárás sertések védelmére virális fertőzés vagy PCV2 által okozott elválasztás utáni multi szisztémás sorvadás szindróma (PMWS) ellen, amely szerint ilyen védelemre szoruló sertésnek olyan vakcina immunológiailag hatásos mennyiségét adjuk be, amely tartalmazza például a plazmidba klónozott kimérát, a kiméra DNS-klónbó! származó kiméra vírust, a találmány szerinti DNS-röl expresszált polipeptid-terméket, stb.. A leírás ismerteti továbbá új fertőző PCV2 molekuláris DNS és PCV reciprok kiméra DNS-klónjait, amelyek alkalmazhatók kísérletes modellekként az új aviruiens virális vakcinák előállításában vagy jellemzésében.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat;

A találmány hátterét és az eltérését a technika állásától tovább részletezzük alább a mellékelt ábrákra való hivatkozással.

Az I. ábrán fertőző PCV2 molekuláris DNS-klón előállítását mutatjuk be. A teljes PCV2 genom amplifíkálására alkalmazott láncindító-pár relatív pozícióját a nyilak jelölik (reverz láncindító: PCVSAC2, elülső

-8εlεsrετ iáncindító; PCVSAC2). A PCR-rel amplifikált PCV2 genomíális DNS-t SacII restrikciós enzimmel emésztjük, és tisztítjuk. A megtisztított és SacII-vei emésztett genomíális DNS-t ősszel igáljuk, kon kátém ereket előállítva. Az Össze ligáit konkatemereket gé I el ektrofo réz issei elválasztjuk, a PCV2 tandem genom-dimerjét megtisztítjuk, és pSK vektorba klónozzuk, amelyet előre megemésztettünk SacII enzimmel, így molekuláris PCV2 DNS-klónt 5 állítunk elő.

A 2A. és 2B. ábrákon azt mutatjuk be, hogy a klónozott PCV2 plazmid-DNS fertőző, amikor PK-15 sejtekbe transzferáljuk in vitro. A 2A. ábrán PCV2 antigén immunfluoreszcenciás vizsgálati eljárással (IFA) történő detektálását mutatjuk be a klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált PK-15 sejtekben. A PCV2 intenzív immunológiai jelölését láthatjuk a sejtmagban, és kisebb mértékben a transzfektált sejtek 10 citoplazmájában. A 2B. ábrán vakkal transzfektált PK-15 sejteket mutatunk be.

A 3A. ábrán PCV2 DNS-sel intralimfoid úton oltott sertések tüdejét mutatjuk be 21 nappal az oltás után (DPI). A tüdők gumiszerüek, nem esnek össze, és barnás-vörösen pettyezettek. A tracheobronchiális nyirokcsomók kifejezetten megnagyobbodottak és barnák (nyilak). A 3B. ábrán kontroll sertés normális tüdejének mikroszkopikus metszetét mutatjuk be (25X nagyítás). A 3C. ábrán a 3A. ábrán bemutatott sertés 15 tüdejének a mikroszkópos metszetét mutatjuk be. Figyeljük meg a peribronchioláris limfohisztiocitíkus gyulladást és a gyenge nekrotikus bronchiolitiszt (25X nagyítás). A 3D, ábrán a 3A. ábrán bemutatott tüdő immunhisztokémiai festését mutatjuk be. Figyeljük meg a PCV2-t a makrofágokban (nyilak) és a fibroblasztszerű sejtekben (nyílhegyek) és a légutak körül (64X nagyítás).

A 4A. ábrán kontrol sertésből származó normális nyirokcsomót mutatunk be. Figyeljük meg a jól20 definiált limfoid follikulusokat (nyilak)(25X nagyítás). A 4B. ábrán a 3A. ábrán bemutatott sertésből származó tracheobronchiális nyirokcsomó mikroszkópos metszetét mutatjuk be, amely 21 nappal korábban volt oltva intralimfoid úton a klónozott PCV2 genomíális DNS-sel. A limfoid follikulusok rosszul definiáltak, gyengeközepes limfoid depléció van, és gyenge multifokális granulómás gyulladás (25X nagyítás). A 4C. ábrán a 4B. ábrán bemutatott nyirokcsomó mikroszkopikus metszetét mutatjuk be nagyobb nagyításban és egy follikulusra 25 fókuszálva. Figyeljük meg a rosszul definiált follikulust a makrofágokkai és afollikuláris limfocitákat helyettesítő óriás sejtekkel (nyilak) (64X nagyítás). A 4D. ábrán PCV2 antigén immun hisztokémiai detektálását mutatjuk be a 4B. ábrán bemutatott nyirokcsomóban makrofágokban (nyilak) és óriás sejtekben (kis nyílhegyek), és dendrikus-szerü sejtekben (nagy nyílhegyek) a follikulusokban (64X nagyítás).

Az 5. ábrán kiméra PCV1-2 (PCV1/PCV2) DNS-klón előállítását mutatjuk be, amely a patogén PCV2 30 immunogén ORF2 kapszidgénjét hordozó PCVl genomot tartalmaz. A dimerizált DNS-klónt alkalmazzuk PK15 sejtek in vitro transzfektálására a PCV2 ORF2 fehérjéjét expresszáló élő kiméra vírus előállítása érdekében, és in vivo állatkísérletekhez az aktivitás megerősítésére.

A 6. ábrán a fertőző PCVl, PCV2, kiméra PCV1-2 és reciprok kiméra PCV2-1 molekuláris DNSklónok előállítását és szerveződését mutatjuk be. A PCV2 DNS-klónt két teljes hosszúságú lineáris PCV2 35 genomnak a Binescript SK vektorba (pSK) történő tandem bel igái ásával állítjuk elő korábban leírt általános eljárások alkalmazásával (M. Fenatix és mtsai., 2002, mint fent). A PCVl DNS-klónt két teljes hosszúságú lineáris PCVl genom pSK vektorba történő tandem beligálásával állítjuk elő. A kiméra PCV1-2 DNS-klónt a PCVl ORF2 kapszid-génjének a PCV2-ével való helyettesítésével állítjuk elő a pSK vektorban található nempatogén PCVl genomíális gerincben. A reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónt a patogén PCV2 ORF2 kapszid40 génjének a nem-patogén PCVl-ével való helyettesítésével állítjuk elő a pSK vektorban található patogén PCV2

-9genomiális gerincben. Mindkét kiméra-klón dimer a pSK vektorban. A nyilak a PCVl, PCV2, PCVl-2 és PCV2-1 virémia fertőzött állatokban való detektálására szolgáló PCR-láncindítók relatív elhelyezkedését jelölik.

A 7A-7J. ábrákon azt mutatjuk be, hogy a PCV1, PCV2, kíméra PCVl-2 és reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónok fertözőek, és a megfelelő virális antigéneket expresszálják, amikor in vitro transzfektálva vannak 5 PK-15 sejtekbe. A bal oldalon (7A., 7C., 7E., 7G. és 71. ábra) a PCV1 ORF2 elleni monoklonális ellenanyaggal végzett festést mutatunk be. A jobb oldalon (7B., 7D., 7F., 7H. és 7J. ábra) PCV2 elleni ellenanyaggal végzett festést mutatunk be. A 7A. és 7B. ábrákon vakon transzfektált PK-15 sejteket mutatunk be. A 7C. és 7D. ábrákon PCV1 DNS-klónnal transzfektált PK-15 sejteket mutatunk be. A 7E. és 7F. ábrákon PCV2 DNS-klónnal transzfektált PK-15 sejteket mutatunk be. A 7G. és 7F. ábrákon kiméra PCVl-2 DNS-klónnal transzfektált PK10 15 sejteket mutatunk be. A 71. és 7J. ábrákon reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónnal transzfektált PK-15 sejteket mutatunk be.

A S. ábrán a klónozott PCV2 molekuláris DNS teljes hosszúságú DNS-szekvenciáját mutatjuk be (amely az 1. azonosítószámú szekvenciának felel meg).

A 9. ábrán a klónozott kiméra PCVl-2 molekuláris DNS teljes hosszúságú DNS-szekvenciáját mutatjuk 15 be (amely a 2. azonosítószámú szekvenciának felel meg).

A 10. ábrán a klónozott kiméra PCVl-2 DNS immunogenikus ORF2 kapszid-génjének DNSszekvenciáját mutatjuk be (amely a 3. azonosítószámú szekvenciának felel meg).

All. ábrán a klónozott kiméra PCV1 -2 DNS immunogenikus ORF2 kapszid-génjének feltételezett aminosav-transzlációját mutatjuk be (amely a 4. azonosítószámú szekvenciának felel meg).

A találmány tárgyát fertőző molekuláris és kiméra sertés cirkovírus (PCV) nukleinsav-molekulák, a kíméra nukleinsav-molekulákból származó élő kiméra vírusok és állatgyógyászati vakcinák képezik sertések védelmére PCV2 által okozott virális fertőzés és elválasztás utáni muitiszisztémás sorvadás szindróma (PMWS) ellen. A leírás ismertet továbbá immunogenikus polipeptid expressziós termékeket, amelyek vakcinákként alkalmazhatók.

A PCV új avirulens, fertőző kiméra DNS-molekulája (PCVl-2) fertőző, nem-patogén PCVl-et tartalmaz, amely patogén PCV2 immunogenikus nyílt leolvasási fázis (ORF) génjét tartalmazza az ORF gén helyett a PCV1 genomban. A fertőző kiméra PCVl-2 DNS-klón előnyösen a PCV2 DNS immunogenikus kapszid-génjét (ORF2) tartalmazza a fertőző, nem-patogén PCV1 DNS klón genomiális gerincébe klónozva. Általában a PCV2 DNS kapszid-génje helyettesíti a PCVl DNS ORF2 génjét a nem-patogén PCV1 genomiális 30 szerkezetben, de a találmány tárgykörébe tartozik, hogy különféle pozícionál is permutációkat állíthatunk elő génsebészeti úton más avirulens vagy legyengített kiméra DNS-klónok előállítására. A PCVl és PCV2 közötti reciprok kiméra fertőző PCV2-1 DNS-klónt mutatjuk be kontrollként a találmány szerinti kiméra PCVl-2 klón elemzéséhez, és azt a PCV2 kapszid-génjének a helyettesítésével állítjuk elő a PCVl-ével a fertőző patogén PCV2 DNS-klón gerincében. Amellett, hogy kísérletes modell, a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klón 35 alkalmazható lehet specifikusan célzott vakcinák előállítására.

A PCV2 találmány szerint klónozott genomiális DNS-éröl kimutatjuk, hogy in vitro és in vivo fertőző, amikor PK-15 sejtekbe van transzfektálva és be van adva sertéseknek. A fertőző PCV2 DNS-klón PMWS-re jellemző patológiás sérüléseket okoz sertésekben, lehetővé téve a klinikai betegség javított jellemzését és a vírus eloszlásának megértését a szöveti sejtekben. Ez az új, könnyen reprodukálható patogén ágens alkalmas 40 megfelelő vakcinálási program ki fejlesztés éré PMWS megelőzésére sertésekben.

- 10Az új kiméra PCVl-2 DNS-klón ezenfelül fertőző PK-15 sejtek in vitro transzfektálásakor és sertéseknek történő in vivo beadáskor. A transzferált PK-15 sejtekben a kiméra PCVl-2 DNS-klón expresszálja a PCV2 kapszíd-antigént (a PCV2 irnrnunogenikus kapszid fehérjéjét), míg a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klón a PCVl kapszíd-antigént expresszálja, amelyet immunfluoreszcens vizsgálati eljárással (IFA) mutatunk ki PCV! 5 vagy PCV2 kapsz íd-ant igenre specifikus ellenanyagok alkalmazásával. PCV2-re specifikus ellenanyagra történő szerokonverziót detektálunk a fertőző PCV2 klónnal, valamint a a kiméra PCVl-2 klónnal oltott sertésekben. A PCV2-re specifikus ellenanyagokra történő szerokonverzió detektálása megalapozza azt, hogy a kiméra PCVl-2 DNS-klón indukálja a PCV2-re specifikus ellenanyagot a fertőzött sertésekben, és ennek következményeképpen az oltott sertések PCV2 fertőzésekkel szembeni védelmére hat.

Az alábbi példákban részletesebben ismertetjük a kiméra DNS-klónok iminunogenitásának és patogenitásának az értékelését oltott sertésekben. Alapvetően a PCV2 ORF2 elleni ellenanyagokra történő szerokonverziót detektálunk a PCV2 DNS-klónnal (3. csoport) és a kiméra PCV 1-2 DNS-klónnal (4. csoport) oltott sertésekben. A PCVl klónnal és a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónnal (sorrendben a 2. és az 5. csoport) oltott összes sertés szerokon vertál a PCVl ellenanyagra. Az egyes csoportok kiválasztott sertéseiből visszanyert 15 vírusokat részlegesen megszekvenáljuk, és igazoljuk, hogy autentikus, az oltásra alkalmazott fertőző DNSklónok. A makroszkopikus és mikroszkopikus sérülések a PCV2 DNS-klónnal oltott állatok különféle szöveteiben szignifikánsan súlyosabbak, mint a PCVl, kiméra PCV 1-2 és kiméra PCV2-1 DNS-klónokkal oltott állatokban találhatók.

Meglepő és előnyös módon a nem-patogén PCVl genomiális gerincbe klónozott, a patogén PCV2 20 itnmunogenikns kapszid-génjét (ORF2) tartalmazó fertőző kiméra PCVl-2 DNS-klón specifikus ellenanyagválaszt indukál a patogén PCV2 kapszid-antigén ellen, míg egyedi módon megtartja a PCVl nein-patogén természetét sertésekben. A kiméra PCVl-2 fertőző DNS-klónnal oltott állatokban enyhe fertőzés alakul ki, amely a PCVl-el oltott állatokéra emlékeztet, míg szerokon vertálnak a patogén PCV2 ORF2 kapszid fehérjéje elleni ellenanyagra. A PCVl-el és kiméra PCVl-2-vel oltott állatokban a virémia átlagos hossza rövidebb, 25 sorrendben 0,625 hét és 1 hét, mint a patogén PCV2-vel oltott állatokban, amelyekben körülbelül 2,12 hét. A detektálható kiméra PCVl-2 virémia hiánya bizonyos oltott állatokban nem befolyásolja a PCV2 ORF2 kapszid fehérje elleni ellenanyagra történő szerokonverziót a PCV!-2-vel oltott sertésekben (4. csoport). Az eredmények azt mutatják, hogy még ha a kiméra PCV 1-2 virémia rövid vagy detektálhatatlan is bizonyos állatokban, a kiméra PCV 1-2 vírus képes ellenanyag-választ indukálni a PCV2 ORF2 kapszid fehérje ellen. A kiméra PCV 1-2 30 fertőző DNS-klón speciális képessége specifikus immunválasz indukálására a patogén PCV2 irnrnunogenikus ORF2 kapszid fehérje ellen és nem-patogénnek való megmaradása sertésekben a kiméra PCV 1-2 kiónt különösen alkalmassá teszi génsebészeti úton módosított élő legyengített vakcinának és más típusú vakcinának.

A találmány szerinti új, tisztított és izolált nukleinsav-tnolekulák tartalmazzák a klónozott kiméra PCV 1-2 DNS 2. azonosítószámú szekvencia szerinti teljes hosszúságú DNS-szekvenciáját, amelyet a 9. ábrán 35 mutatunk be, és letétbe helyeztünk az ‘American Type Culture Collection’ intézetben a PTA-3912 szabadalmi letéti szám alatt; annak komplementer szálát (azaz reverz és ellentétes bázispárok) vagy a kiméra nukleotidszek véne iával legalább 95% homológiát mutató nukleotid-szekvenciát (azaz a teljes gén szignifikáns aktív részletét). A szakterületen jól ismert hagyományos eljárásokat alkalmazhatunk a komplementer szálak vagy a ri’) magas homológiát mutató nukleotid-szekvenciák előállítására, például a szakterületen ismert szokásos vagy 40 magas sztringensségü hibridizációs módszereket. A klónozott kiméra PCVl-2 DNS irnrnunogenikus kapszid- it génjének DNS-szekvenciáját tartalmazó tisztított és izolált nukleinsav-molekulát mutatunk be továbbá a 3. azonosítószámú szekvencián és a 10. ábrán.

A kiméra nukleinsav-molekulákat tartalmazó megfelelő sejtek egyedi módon élő, fertőző kiméra sertés cirkovírusokat termelnek. A leírásban bemutatunk kiméra DNS-klónból PK-15 sejtek ín vitro és in vivo 5 transzfektálásával előállított élő, fertőző kiméra vírusokat. A klónozott kiméra PCV 1-2 DNS egy előnyös példája 2, azonosítószámú szekvencia szerinti és 9. ábrán bemutatott nukleotid-szekvencia. A találmány szerint elképzelhető továbbá, hogy a kiméra vírus a komplementer szálról vagy magas homoiógiájú, a kiméra nukleotidszekvenciával legalább 95%-ban homológ nukleotid-szekvenciákról keletkezik.

A találmány oltalmi körébe tartoznak biológiailag funkcionális plazmidok, vitális vektorok és hasonlók, 10 amelyek tartalmazzák a találmány szerinti új rekombináns nukleinsav-molekulákat, a kiméra és molekuláris DNS-klónokat tartalmazó vektorral transzfektáit megfelelő gazdasejtek, és az ímmunogenikus polipeptid expressziós termékek. Egy különösen előnyös ímmunogenikus fehérjének az aminosav-szekvencíáját a 4. azonosítószámú szekvencián és a 11. ábrán mutatjuk be. Annak biológiailag aktív variánsai is a találmány tárgyát képezik. Az átlagos tudású szakember számára nyilvánvaló, hogy indokolatlan megterhelés nélkül 15 hogyan módosítson, szubsztituáljon, deletáljon, stb. aminosav(ak)at a polipeptid-szekvenciában, és állítson elő biológiailag aktív variánsokat, amelyek megtartják a szülői szekvenciával azonos, vagy lényegében azonos aktivitást.

A találmány szerinti ímmunogenikus polipeptid-termékek előállítási eljárása az alábbi lépéseket tartalmazhatja: alkalmas tápanyag-ellátási körülmények között prokarióta vagy eukarióta sejteket tenyésztünk, 20 amelyek transzferálva vannak a találmány szerinti új rekombináns nukleinsav-molekulákkal oly módon, hogy lehetővé váljon a polipeptid-termékek expressziója, és izoláljuk a nukleínsav-molekulák által expresszált kívánt polipeptid-termékeket a szakterületen ismert szokásos eljárások alkalmazásával. A találmány tárgykörébe tartozik az, hogy az ímmunogenikus fehérjéket más módszerekkel is előállíthatjuk, mint például biokémiai szintézissel vagy hasonlókkal.

A kiméra virális és molekuláris DNS-klónok vakcinái, és azok alkalmazási eljárásai is a találmány oltalmi körébe tartoznak. Beoltott sertéseket védünk meg súlyos virális fertőzéstől és PCV2 által okozott PMWS-töl. Az új eljárás virális fertőzés vagy PMWS elleni védelemre szoruló sertéseket véd meg azáltal, hogy a sertésnek immunológíaílag hatásos mennyiségű találmány szerinti vakcinát adunk be, mint például kiméra PCV1-2 DNS, a klónozott kiméra vírus, a kiméra PCV1-2 DNS-t tartalmazó plazmid vagy virális vektor, a 30 polipeptid expressziós termékek, a rekombináns PCV2 DNS, stb. immunológíaílag hatásos mennyiségét tartalmazó vakcinát. Más antigének, mint például PRRSV, PPV, más fertőző sertés ágensek és immunstimulánsok is beadhatók egyidejűleg a sertésnek, hogy virális fertőzések elleni széles spektrumú védelmet biztosítsunk,

A vakcinák például a fertőző kiméra PCV1-2 DNS-t, a klónozott PCV kiméra DNS-genomot megfelelő 35 plazmidon vagy vektoron, mint például pSK vektoron, avirulens, élő kiméra vírust, inaktivált kiméra vírust, stb. tartalmazzák együtt nem toxikus, fízioógiásan elfogadható hordozóval, és adott esetben egy vagy több adjuvánssal. A vakcina tartalmazhatja a találmány szerinti fertőző PCV2 molekuláris DNS-klónt is. A fertőző kiméra PCV 1-2 DNS, a fertőző kiméra virális genomot tartalmazó plazmid és az élő kiméra vírus előnyös, és az élő kiméra vírus a legelőnyösebb. A találmány szerinti avirulens élő virális vakcina előnyös a hagyományos 40 virális vakcinákkal szemben, amelyek vagy legyengített élő vírusokat alkalmaznak, amelyek kockáztatják a

- 12virulens állapotra történő visszaalakulást, vagy sejttenyészetben szaporított elölt egész vírust, amely nem indukál elégséges ellenanyag-immunválaszt a virális betegségelleni védelemhez.

Az adjuváns, amelyet a találmány szerinti vakcinában található, olyan anyag, amely fokozza a sertés immunológiai válaszát a vakcinára. Általában az adjuvánst egyidöben és ugyanazon a helyen adhatjuk be, mint a 5 vakcinát, vagy eltérő időben, például megerősítő oltásként. Az adjuvánsok előnyösen beadhatók a sertésnek különböző módon és helyen, mint a vakcina beadásának a módja vagy helye. Az alkalmas adjuvánsok nem korlátozó példái közé tartozik az alumínium-hidroxid (alum), immunstimuláns komplexek (ISCOMS), nemionos blokk-kopolimerek vagy kopolimerek, citokinek (mint például IL-1, 1L-2, IL-7, IFN-α, 1FN-0, IFN-γ, stb.), szaponinok, monofoszforil-lipid-A (MLA), muramil-dipeptidek (MDP) és hasonlók. Más alkalmas adjuvánsok 10 közé tartozik például az alumínium-kálium-szulfát, E. co/í-ból izolált hölabilis vagy höstabil enterotoxin, koleratoxin vagy annak B-alegysége, diftéria-toxin, tetanusz-toxin, pertusszisz-toxin, Freund-féle inkomplett vagy komplett adjuváns, stb. Toxin-alapú adjuvánsok, mint például diftéria-toxin. tetanusz-toxin és pertusszisz-toxin inaktivá [hatók az alkalmazást megelőzően, például formaldehides kezeléssel.

A vakcinák továbbá tartalmazhatnak további antigéneket is a fertőző kíméra PCV DNS-kIónok 15 immunológiai aktivitásának elősegítésére, mint például sertés reproduktív és respiratórikus szindróma vírust (PRR.SV), sertés parvovírust (PPV), egyéb fertőző sertés ágenseket és immunstimulánsokat.

A találmány szerinti vakcinák nem korlátozódnak semmilyen adott típusra vagy előállítási eljárásra. A klónozott virális vakcinák nem korlátozó példái közé tartoznak fertőző DNS-vakcinák (azaz plazmidők, vektorok vagy DNS-nek sertésekbe közvetlenül történő beinjektálására szolgáló más hagyományos hordozók 20 alkalmazásával), élő vakcinák, módosított élő vakcinák, inaktivált vakcinák, alegység vakcinák, legyengített vakcinák, gén sebészeti úton módosított vakcinák, stb. Ezeket a vakcinákat a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő.

Az élő virális vakcina általában a legelőnyösebb vakcina annyiban, hogy az összes lehetséges immunválasz aktiválódik a vakcina recipíensében, beleértve szisztémás, lokális, humorális és sejtközvetített 25 immunválaszokat. Egy elölt vakcina azonban csak humorális immunválaszt képes indukálni. Jóllehet a legelőnyösebbek, azonban az élő virális vakcináknak számos hátránya van, mint például élő járulékos virális ágensekkel való szennyeződés potenciális kockázata, vagy annak a veszélye, hogy a vírus visszaalakul virulenssé az alkalmazás során. Figyelemreméltó, hogy a találmány szerinti egyedi kíméra PCV 1-2 DNS felülkerekedik ezeken a hátrányokon. A patogén PCV2-böl csak az immunogenikus gének alkalmazásával a kiméra DNS olyan 30 élő, replíkálódó kiméra vírust hoz létre, amely nem-patogén, de mégis az élő virális vakcinák teljes, jótékony immunválaszát váltja ki a patogén PCV2 vírus elten. A kiméra víruson alapuló élő virális vakcinának kis esélye lehet — ha egyáltalán van — a patogén fenotípusra való visszaalakulásra. Ily módon a nem-patogén PCV1 szerkezetén alapuló új kiméra vírusnak nagy előnye van bármilyen rekombináns PCV2 DNS-vírussal szemben, bármilyen élő, legyengített PCV2 vakcinával szemben, vagy bánnilyen más típusú vakcinával szemben, amelyek 35 csupán a PCV2-re alapoznak a PCV2 fertőzések elleni immunitás kialakításában.

Habár az élő virális vakcina a legelőnyösebb, más típusú vakcinákat is alkalmazhatunk sertések beoltására az új kiméra vírussal és más találmány szerinti antigénekkel. Inaktivált virális vakcinák előállításához például a vírust szaporítását a fertőző kiónból a szakterületen ismert vagy a leírásban ismertetett eljárások P alkalmazásával végezzük. A vírus inaktiválását azután optimalizáljuk a szakember számára általánosan ismert r m 40 protokollok alkalmazásával, LA

- 13 Inaktívak virális vakcinákat előállíthatunk a klónozott PCV DNS-ből származó kiméra vírus kezelésével inaktiváló ágensek, mint például formalin, vagy hidrofób oldószerek, savak, stb. alkalmazásával, ultraibolya vagy* röntgen sugárzással történő besugárzással, melegítéssel, stb. Az inaktiválást a szakterületen ismert módon hajtjuk végre. Például a kémiai inaktiválás folyamán a vírust tartalmazó megfelelő vírusmintát 5 vagy szérummintát kezelünk elegendő időn keresztül elegendő mennyiségű vagy koncentrációjú inaktiváló ágenssel elegendően magas (vagy alacsony, az inaktiváló ágenstő függően) hőmérsékleten vagy pH-η a vírus inaktiválása érdekében. A hővel történő inaktiválást olyan hőmérsékleten és annyi ideig végezzük, amely elegendő a vírus inaktiváláshoz. A besugárzással történő inaktiválást fény vagy más energiaforrás alkalmazásával végezzük, annyi időn keresztül, amely elegendő a vírus inaktiválásához. A vírust inaktiváltnak 10 tekintjük, ha képtelen a fertőzésre érzékeny sejtek megfertőzésére.

Az alegység vakcinák előállítása tipikusan különbözik a módosított élő vakcina vagy inaktiváit vakcina előállításától. Egy alegység vakcina előállítását megelőzően azonosítani kell a vakcina védő vagy antígenikus komponenseit. Az ilyen védő vagy antígenikus komponensek közé tartoznak a virális kapszid fehérjék bizonyos amínosav-szegmensei vagy fragmensei, amelyek különösen erős védő vagy immunológiai választ váltanak ki 15 sertésekben; maguk az egyedi vagy csoportos virális kapszid fehérjék, azok oligomerjei, és a virális kapszid fehérjék magasabb rendű asszociációi, amelyek vírus alrészeket vagy ilyen alrészek azonosítható részeit vagy egységeit alkotják; oligoglikozidok, glikolipidek vagy glíkoproteínek, amelyek a vírus felszínén vagy a felszín közelében találhatók, vagy olyan virális alrészekben, mint például a vírushoz kapcsolódó íípopproteinek vagy lípid csoportok, stb. Előnyösen kapszid fehérjét, mint például az ORF2 gén által kódolt fehérjét alkalmazzuk az 20 alegység vakcina antígenikus komponenseként, A fertőző DNS-klón által kódolt más fehérjéket is alkalmazhatunk. Ezek az immunogenikus komponensek könnyen azonosíthatók a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Ha egyszer azonosítottuk, a vírus védő vagy antígenikus részleteit (azaz az „alegységet”) azt követően megtisztítjuk és/vagy klónozzuk a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. Az alegység vakcina előnyös az élő víruson alapuló más vakcinákhoz képest, mivel az alegység, mint például a vírus nagyon tiszta 25 alegysége kevésbé toxikus, mint a teljes vírus.

Ha az alegység vakcinát rekombináns genetikai módszerekkel állítjuk elő, a klónozott alegység, mint például az ORF2 (kapszid) gént expresszióját optimalizálhatjuk a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával [lásd például Maniatis és mtsai., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA (1989)]. Ha az alkalmazott alegység a vírus intakt szerkezeti egységét 30 képezi, mint például a teljes kapszid fehérje, annak a vírusból történő izolálására szolgáló eljárást optimalizálni kell. Mindenesetre az inaktivációs protokoll optimalizálása után optimalizálhatjuk az alegység-tisztítási eljárást a gyártást megelőzően.

Patogén kiónokból származó legyengített vakcinák előállításához a szövettenyészethez adaptálódott élő patogén PCV2-t először le kell gyengíteni (nem-patogénné vagy ártalmatlanná tenni) a szakterületen ismert 35 eljárások alkalmazásával, tipikusan sejttenyészeteken keresztüli sorozatos passzál ássál. A patogén ki ón ok legyengítését elvégezhetjük géndelécióval vagy virális termelést befolyásoló génmutációkkal is. Azután a legyengített PCV2 vírusokat további kiméra PCV 1-2 vírusok előállítására alkalmazhatjuk, amelyek megtartják a PCVl nem-patogén fenotípusát, de megváltozhatjuk a PCV2 genomból származó immunogén tulajdonságuk erősségét rekombináns technológia alkalmazásával.

- 14182537 3

A legelőnyösebb vakcinában élő kiméra vírus DNS-klónt alkalmazunk, előnyösen azt a kiónt, amely a PCV2 immunogenikus génjeit tartalmazza a nem-patogén PCV1 gerincébe klónozva. Előnyösen az élő kiméra vírus, amelyik a természetben avirulens, génsebészeti úton módosítva nem igényel időt felemésztő legyengitési eljárásokat. A vírus egyedi módon élő, de nem-patogén replikálódó vírusként szolgál, amely PCV2 elleni 5 immunogén fehérjéket termel a vírus replikációja során, amelyek azután az immunválaszok teljes skáláját kiválthatják a patogén PCV2 ellen.

További előny, hogy a találmány szerinti előnyös kiméra vírus genetikailag stabil vakcinát biztosít, amelyet könnyebb előállítani, tárolni és bejuttatni, mint a más típusú legyengített vakcinákat. A kiméra vírusokon alapuló avirulens vagy legyengített vakcinákat általában legalább olyan biztonságosnak tartják, ha 10 nem biztonságosabbnak, mint a hagyományosan módosított élő vakcinákat [J. Arroyo és mtsai., „Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)”, J. Virol. 75(2), 934-942. old. (2001); F. Guirakhoo és mtsai., „Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates”, J. Virol. 74(12), 5477-5485. old. (2000); S. Tang és mtsai., „Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation 15 between genetic stability and immunogenicity”, J. Virol. 71(10), 7841-7850. old. (1997)]. Például a Japán enkefalitisz vírus (JEV) elleni ChimeriVax-JE vakcináról — amely az YFV17D sárgaláz vírus vakcina génsebészeti úton módosított származéka, amelyben az YFV17D prM és E szerkezeti fehérjéit helyettesítették a legyengített JEV SA14-14-2 törzs megfelelő génjeivel— kimutatták, hogy genetikailag stabil hosszú időn keresztül végzett passzálások után mind in viiro, mind in vivo (J. Arroyo és mtsai., 2001, mint fent). Egy másik 20 kiméra vírus vakcináról — a ChimeriVax-D} a 2-es típusú Dengue vírus ellen, amely egy legyengített kiméra sárgaláz (YF)-dengue 2-es típus (dengue-2) vírus ·— szintén kimutatták, hogy nem változott 18 passzálás után Vero sejtekben (F. Guirakhoo és mtsai., 2000, mint fent).

Egy másik előnyös találmány szerinti vakcinában megfelelő plazmidokat alkalmazunk a nem-patogén ki inéra DNS-klónok sertésekbe történő bejuttatására. Az élő vagy elölt, sejttenyészetben szaporított teljes vírust 25 alkalmazó hagyományos vakcinával ellentétben a találmány tárgya sertések közvetlen beoltása a fertőző kiméra virális genomot tartalmazó plazmid-DNS-sel.

További génsebészeti úton módosított vakcinákat, amelyek előnyösek a találmány szerint, a szakterületen ismert módszerekkel állítunk elő. Ilyen módszerek nem korlátozó példát közé tartozik a rekombináns DNS további manipulálása, a rekombináns fehérjék aminosav-szekvenciáinak módosítása vagy 30 szubsztitúciója, és hasonlók,

Rekombináns DNS technológián alapuló, génsebészeti úton módosított vakcinákat például sertésekben erős vagy védő immunválasz indukálásáért felelős fehérjéket (például az ORF3, ORF4, stb. eredetű fehérjéket) kódoló vírális gének alternatív részleteinek az azonosításával állítunk elő. Az ilyen azonosított géneket vagy immundomináns fragmenseket klónozhatjuk szokásos fehérjeexpressziós vektorokba, mint például bakulovírus 35 vektorba, és alkalmazhatjuk azokat megfelelő gazdasejtek megfertőzésére [lásd például O’Reilly és mtsai., „Bactilovirus Expression Vectors: A Lab Manual”, kiad.: Freeman & Co. (1992)]. A gazdasejteket tenyésztjük, ily módon expresszáltatjuk a kívánt vakcina-fehérjéket, amelyeket megtisztíthatunk a kívánt mértékben, és kiszerelhetjük azokat megfelelő vakcina-termékbe.

Ha a kiónok megtartanak bármiféle természetes képességet betegség okozására, meg lehet találni azokat 40 a nukleotid-szekvenciákat a virális genomban, amelyek a virulenciáért felelősek, és génsebészeti úton

- 15avirulenssé módosítani a vírust például helyspecifikus mutagenezis útján. Helyspecifikus mutagenezissel képesek vagyunk egy vagy több nukleotid addícíonálására, deletálására vagy megváltoztatására [lásd például Zoller és mtsaL, DNA 3, 479-488. old. (1984)], Megszintetizálunk egy oligonukleotidot, amely tartalmazza a kívánt mutációt, és anelláljuk egyszálú virális DNS egy részletéhez. Az eljárásból kapott hibrid molekulát 5 baktériumok transzformálására alkalmazzuk. Azután az izolált kétszálú DNS-t — amely tartalmazza a megfelelő mutációt — alkalmazzuk teljes hosszúságú DNS előállítására az utóbbi restrikciós fragmenséhez történő ligálással, amelyet azt követően alkalmas sejttenyészetbe transzfektálunk. A genom beligálását átvitelre alkalmas vektorba szakember számára ismert bármilyen szokásos módszerrel elvégezhetjük. A vektor gazdasejtekbe történő transzfektálását virális utódok előállítása érdekében bármilyen hagyományos eljárással végrehajthatjuk, 10 mint például kalcium-foszfát vagy DEAE-dextrán közvetített transzfekcióval, elektroporációval, protoplasztfúzióval és más jól ismert módszerekkel [például Sambrook és mtsai., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], A megkiónozott vírus azután mutatja a kívánt mutációt. Más megoldásképpen két oligonukleotidot szintetizálhatunk meg, amelyek tartalmazzák a megfelelő mutációt. Ezeket anellálhatjuk kétszálú DNS-t kialakítva, amelyet beinzertáIhatunk a virális DNS-be, hogy teljes 15 hosszúságú DNS-t állítsunk elő.

Génsebészeti úton módosított fehérjéket, amelyek alkalmazhatók vakcinákban, expresszáltathatunk például rovarsejtekben, élesztősejtekben vagy emlőssejtekben, A génsebészeti úton módosított fehérjéket — amelyeket hagyományos eljárások alkalmazásával megtisztíthatunk vagy izolálhatunk —· közvetlenül beolthatjuk sertésekbe, hogy PCV2 által okozott virális fertőzés vagy elválasztás utáni multíszisztémás sorvadás szindróma 20 (PMWS) elleni védelmet váltsunk ki.

Egy rovarsejt-vonalat (mint például Hl-LIFE) transzformálhatunk olyan vektorral, amely a vírusból származó vagy a virális genomból kimásolt nukleinsav-molekuIákat tartalmaz, amelyek a vírus egy vagy több immundomináns fehérjéjét kódolja. A transzfer-vektor lehet például linearizáit bakulovírus DNS és a kívánt polinukleotidokat tartalmazó plazmid. A gazdasejt-vonalat együtt transzfektálhatjuk a linearizáit bakulovírus 25 DNS-sel és plazmiddal annak érdekében, hogy rekombináns bakulovírust állítsunk elő.

Más megoldásképpen PMWS-ben szenvedő sertésekből származó DNS-t, amely egy vagy több kapszid fehérjét, a fertőző PCV2 molekuláris DNS-klón vagy a klónozott PCV kiméra DNS-genomot kódol, beinzeHálhatjuk élő vektorokba, mint például himlövírusba vagy adenovírusba, és vakcinaként alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti vakcinák immunológiailag hatásos mennyiségét beadjuk virális fertőzés vagy 30 PMWS elleni védelemre szoruló sertésnek. Az immunológiai hatásos mennyiséget vagy az immunogenikus mennyiséget, amellyel a sertés beoltjuk, könnyen meghatározhatjuk vagy egyszerűen megbírálhatjuk rutin teszteléssel. A hatásos mennyiség olyan, amellyel elégséges vakcinára adott immunológiai választ érünk el, hogy megvédj ük a PMWS-t okozó vírussal találkozó sertést. Előnyösen a sertést olyan mértékben védjük meg, amelyben a virális betegség egy vagy mindegyik káros fiziológiás tünete vagy hatása szignifikánsan csökken, 35 enyhül, vagy teljesen megszűnik.

A vakcinát beadhatjuk egyetlen dózisban vagy ismételt dózisokban. Az adagolás lehet például a fertőző kíméra DNS-genomot tartalmazó plazmid-DNS 1 és 1000 pg közötti dózisa (a vakcina immunológiai aktív komponense koncentrációjának függvényében), de nem tartalmazhatja a vírus-alapú antigén olyan mennyiségét, • A '' amely elegendő káros reakció vagy a virális fertőzés fiziológiai tüneteinek kiváltásához. Ismertek a 40 szakterületen eljárások aktív antigenikus ágensek alkalmas dózisainak a meghatározására vagy titrálására sertés ίΛ cc

-16tömege, az antigén koncentrációja és más tipikus faktorok alapján. Előnyösen a fertőző kiméra vitális DNSklónt vakcinaként alkalmazzuk, vagy élő kiméra vírust hozhatunk létre in vitro, és azután az élő kiméra vírust alkalmazhatjuk vakcinaként. Ebben az esetben 100-200 pg klónozott kiméra PCV DNS-t vagy körülbelül 10000 egység 50% szövettenyészet-fertőző dózis (TC1D₅o) élő kiméra vírust adhatunk be sertésnek.

Előnyösen a vakcinát olyan sertésnek adjuk be, amely nem találkozott még a PCV vírussal. A kiméra

PCV 1-2 fertőző DNS-klónt tartalmazó vakcinát vagy annak más antigenikus formáját kényelmesen beadhatjuk intranazlisan, transzdermálisan (azaz a bőr felszínén alkalmazhatjuk szisztémás abszorpció céljából), parenterálisan, stb. A beadás parenterális útjának nem korlátozó példái közé tartozik az intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális, intradermális (azaz a bőr alá injektálva vagy másképpen odajuttatva) utak és 10 hasonlók. Mivel az oltás intramuszkuláris és intradermális útjai sikeresek voltak virális fertőző DNS-klónokat alkalmazó más vizsgálatokban [E. E. Sparger és mtsai., „Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone”, Virology 238, 157-160. old. (1997); L. Willems és mtsai., „In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep”. Virology 189, 775-777. old. (1992)], ezek az utak a legelőnyösebbek, a beadás praktikus intranazális útja mellett. Habár kevésbé kényelmes, a találmány 15 tárgykörébe tartozik, hogy a vakcinát az intralimfoid úton adjuk be a sertésnek. A beadás egyedi, nagyon előnyös útja szerint közvetlenül a PCV1-2 kimérát tartalmazó plazmid-DNS-t adjuk be a sertésnek intramuszkulárisan, intradermalisan, intralimfoid úton, stb.

Amikor folyadékként adjuk be, a találmány szerinti vakcinát vizes oldatként, szirupként, elixírként, tinktúraként és hasonlóként szerelhetjük ki. Az ilyen kiszerelések ismertek a szakterületen, és azokat tipikusan az 20 antigén és más tipikus adalékanyagok megfelelő hordozóban vagy oldószerrendszerben történő feloldásával állítjuk elő. Megfelelő hordozók és oldószerek nem korlátozó példái közé tartozik a víz, sóoldat, etano), etilénglikol, glicerin, stb. Tipikus adalékanyagok például az engedélyezett festékek, ízanyagok, édesítőszerek és antimikrobiális tartósítószerek, mint például timerozá! (nátrium-etil-merkuri-tioszalicilát). Az ilyen oldatok lehetnek stabilizáltak, például részlegesen hidrolizált zselatin, szerbitől vagy sejttenyésztő tápközeg 25 hozzáadásával, és lehetnek puffereitek hagyományos eljárások és szakterületen ismert reagensek alkalmazásával, mint például nátrium-hidrogénfoszfát, nátrium-dihídrogénfoszfát, kálium-hidrogénfoszfát, káhum-dihidrogénfoszfát, és hasonlók alkalmazásával.

A folyékony kiszerelések lehetnek továbbá szuszpenziók és emulziók is, amelyek szuszpendáló vagy emulgeáló ágenseket tartalmaznak más szokásos kiszerelő anyagokkal együtt. A folyékony kiszerelések ezen 30 típusait hagyományos eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő. Szuszpenziókat például kolloid malom alkalmazásával állíthatunk elő. Emulziókat például homogénizátor alkalmazásával állíthatunk elő.

Test folyadék-rend szerekbe történő injektálásra tervezett parenterális kiszerelések megfelelő izotonitást és pH-pufferelést igényelnek, a megfelelő sertés testfolyadékok szintjéhez viszonyítva. Az izotonitást szükség szerint megfelelően beállíthatjuk nátrium-kloriddal és más sókkal. Megfelelő oldószereket, mint például etanolt 35 és propilénglikolt alkalmazhatunk az alkotóelemek kiszerelésben való oldékonyságának és a folyékony készítmény stabilitásának növelésére. A találmány szerinti vakcinában alkalmazható adalékanyagok további nem korlátozó példái közé tartozik a dextróz, hagyományos antioxidánsok, és hagyományos komplexképzö ágensek, mint például etíléndiamin-tetraecetsav (EDTA). A parenterális adagolási alakokat sterilizálni is kell az alkalmazást megelőzően.

325 :

- 1718 2 5 3 7 3

A találmány egy másik megvalósítási módja új eljárás PCVl-2 fertőző, nem-patogén kiméra nukleinsav-molekulájának előállítására, amely szerint eltávolítjuk fertőző nem-patogén PCVl-et kódoló nukleinsav-molekula nyílt leolvasási fázisát (ORF), ugyanabba a pozícióba behelyettesítjük fertőző patogén PCV2-t kódoló nukleinsav-molekula immunogeníkus ORF gént, és visszanyerjük a kiméra nukleinsav5 molekulát, A nukleinsav-molekula tipikusan DNS. Egy előnyös eljárás szerint a nem-patogén PCVI DNS ORF2 génjét helyettesítjük a találmány szerinti PCV2 fertőző patogén molekuláris DNS-ének immunogeníkus ORF2 kapszid-génjével. A találmány tárgykörébe tartozik, hogy más ORF pozíciókat vagy azok immunogeníkus fragmenseit is kicserélhetjük a PCV1 és PCV2 DNS között, hogy előállítsuk a találmány szerinti eljárások szerinti kiméra DNS-klónokat.

Azután a rekombtnáns nukleinsav-molekulát alkalmazzuk a találmány szerinti élő, fertőző, replikálódó kiméra vírus előállítására, amely előnyösen megtartja a PCVI nem-patogén természetét, de a patogén PCV2 immunogeníkus ORF2 fehérjéjét expresszálja, és komplett immunválaszt hoz létre a patogén PCV2 ellen. Előnyősén a PCVl-2 DNS-klón génsebészeti úton módosított avírulens, élő vakcinaként szolgál PCV2 fertőzés és PMWS ellen sertésekben.

A találmány szerinti módon fertőző PCV2 DNS-klónt állítunk elő, oly módon, hogy biológiailag tiszta és homogén fertőző vírus-törzsteny észetet hozhassunk létre patogénitási vizsgálatok céljára, és nem-patogén kiméra vakcina kifejlesztéséh ez, A klinikai betegség lefolyását, a vírus eloszlását és a PCV2 fertőzéssel kapcsolatos patológiás sérüléseket határozottabban jellemezzük ezen molekuláris DNS-klón és a molekuláris klónból származó biológiailag tiszta és homogén fertőző PCV2 vírus-törzstenyészet alkalmazásával, mint ami 20 múltban volt elérhető, ami alkalmazható a találmány szerinti előnyös vakcina-termékek ki fejlesztésére.

A PCV2 molekuláris kiónt a teljes PCV2 genom két példányának pKS vektorba történő tandem beligálásával hozzuk létre. A szakirodalomban feltárt egyetlen példányban lévő genomma! éles ellentétben a találmány szerinti eljárásokkal előállított fertőző PCV2 DNS-klón a PCV2 genom két teljes példányát tartalmazza tandem ismétlődésben összeligálva. A genom két példányának tandem történő összeligálása 25 cirkuláris genomot eredményez, ami utánozza a PCV2 szokásos cirkuláris genomját. A genom tandem helyzetben lévő két példányának a fertőző PCV2 DNS-klónban az az előnye, hogy maximalizálja replikációt, amikor a fertőző DNS-klónt in vitro és in vivo transzfektáÍjuk. Ily módon a találmány szerinti klón eredményesebben és hatékonyabban működik, mint a korábbi egyetlen példányban megtalálható genom.

Állatok megfertőzése a molekuláris virális kiónnal rendkívül hasznos a virális replikáció és a gazdában 30 való virulencia genetikai determinánsainak tanulmányozásához. A 2-es típusú sertés cirkovírust (PCV2) okolták az elválasztás utáni tnultísziszténiássorvadás szindróma (PMWS) kórokozó ágenseként. A PMWS egy komplex betegség szindróma sertésekben, és több tényező játszhat szerepet a PMWS klinikai megjelenésében. Azonban a PCV2 biológiailag tisztaformája előállításának a nehézsége — a beteg sertések szöveti homogénizátumaiban megtalálható más közönséges sertés ágensek jelenléte miatt -— megakadályozta a kizárólag csak a PCV2 35 fertőzésnek tulajdonítható klinikai betegség és a patológiás sérülések egyértelmű jellemzését. Ez az első alkalom, hogy előállítottuk PCV2 fertőző molekuláris DNS-klónját és alkalmaztuk azt a PCV2 fertőzéssel kapcsolatos betegség és patológiás sérülések jellemzésére, a sertések közvetlen in vivo transzfektáiásával a molekuláris klónnal.

A molekuláris klónból származó homogén élő PCV2 vírus-törzstenyészetröl kimutatjuk, hogy fertőző in 40 vitro, amikor PK.-15 sejtekbe transzferáljuk azt. A klónozott PCV2 genomíális DNS akkor is fertőző, amikor

- 18közvetlenül injektáljuk be specifikus patogén-mentes (SPF) sertések májába és felszíni csípő nyirokcsomóiba. A klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel oltott állatokban fertőzés alakul ki, és olyan betegség, amely hasonlít a homogén, fertőző PCV2 élő vírus törzstenyészet intranazális oltásával indukálthoz. PCV2-re specifikus ellenanyagra való sze rokon verziót detektálunk a sertések többségében az oltott csoportban 35 nappal az oltást 5 követően (DPI).

A kiméra PCVl-2 DNS-klónnal oltott sertésekben kialakuló virémia kezdete és hossza hasonló a nempatogén PCVl DNS-klónnal oltott sertésekéhez, míg a PCV2 kiónnal oltott sertésekben a virémia korábban megjelenik és tovább tart. A 14. oltás utáni nappal kezdődően és körülbelül 2-4 héten keresztül virémiát detektálunk a PCV2-vel oltott állatok többségében. Hasonlóképpen a 35. oltás utáni napon felboncolt oltott 10 sertések többsége szerokon vertált PCV2-elíenanyagokra. PCV2 antigént detektálunk a oltott sertések különféle szöveteiben és szerveiben. A makroszkopikus sérülések a tüdőkre és a nyirokcsomókra korlátozódnak, és szisztematikusan megnagyobbodott barnás színű nyirokcsomók jellemzik, és nem összeesett tüdők, és enyhe többgócos barnás színű konszolidáció. A nem-patogén PCVl-el és kiméra PCVl-2-vel oltott sertések nyirokcsomóit befolyásoló makroszkopikus sérülések enyhék és csak néhány állatra korlátozódnak, míg a 15 patogén PCV2-vel oltott sertések mindegyikében közepes-súlyos duzzadás és elszíneződés van a nyirokszövetekben (9. táblázat). A statisztikai elemzés kimutatja, hogy a makroszkopikus sérülések értékei a kiméra PCVl-2vel oltott állatok nyirokcsomóiban hasonlóak a nem-patogén PCVl-el oltott sertésekéivel. 21 DPI a PCV2-el oltott sertésekben olyan makroszkopikus sérülések vannak, amelyek statisztikusan súlyosabbak, mint a PCVl-el és a kiméra PCVl-2-vel oltott sertésekben. Hisztopatoiógiás sérüléseket és PCV2-re specifikus 20 antigént detektálunk az oltott (fertőzött) sertések számos szövetében és szervében, mint például agyában, tüdejében, szívében, veséjében, mandulájában, nyirokcsomóikban, lépében, csípő belében és májában. A PMWS-hez hasonló hisztopatológiai sérüléseket reprodukálunk több szövetben és szervben a PCV2 molekuláris DNS-klónnal, valamint a molekuláris ki ónból in vitro előállított fertőző vírussal. Mikroszkopikusan — mind a 21. oltás utáni napon, mind a 49. oltás utáni napon — a kiméra PCVl-2-vel oltott állatokban statisztikusan kevesebb mikroszkopikus sérülés van, mint a PCV2-vel oltott állatokban. A kiméra PCV]-2-ve! oltott sertések nyirokcsomóinak mikroszkopikus sérülés-értékei hasonlóak a nem-patogén PCVl-hez, a reciprok kiméra PCV21-hez és az oltatlan kontrollokhoz. Közepes-súlyos mikroszkopikus sérüléseket találunk a patogén PCV2-vel oltott állatok több szövetében, mint például tüdő, máj, nyirok, lép, agy, szív, vese és mandula szöveteiben. Azonban a kiméra PCVl-2-vel oltott állatokban enyhe-közepes mikroszkopikus sérülések vannak, csak a máj, 30 nyirokcsomó és vese szövetekben (lásd az alábbi 10. táblázatot).

Nincs figyelemreméltó klinikai jele a PMWS-nek a kontroliban vagy bármelyik oltott sertésben. Habár a PMWS jellegzetes klinikai tüneteit nem figyeljük meg a klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel (amely a fertőző PCV2 DNS-klón) vagy a biológiailag tiszta PCV2 fertőző vírus törzstenyészettel, a PCV2 egyértelműen felelős az alábbi szemléltető példákban reprodukált PMWS-szerű hisztopatológiai sérülésekért. Általában úgy vélik, 35 hogy a PCV2 az elsődleges, de nem egyedüli patogén ágens, amely felelős a klinikai PMWS kialakulásáért.

A leírás határozottabban jellemzi a klinikai lefolyást és a kizárólag a PCV2 fertőzésnek tulajdonítható patológiai sérüléseket. Az alábbi szemléltető példákban bemutatott adatok azt mutatják, hogy a könnyen reprodukálható, klónozott PCV2 genomiális DNS alkalmas a fertőző vírus helyettesítésére a PCV2 patogenezis és immunizációs vizsgálatok céljára. Míg a PCV2-ről kimutatjuk, hogy esszenciális a PMWS kialakulásához, 40 más faktorok és ágensek, mint például a PRRSV, PPV, stb. is szükségesek [ehetnek, hogy indukáljuk a PMWS iN W r4

- 19előrehaladott eseteivel kapcsolatos klinikai tüneteket és sérüléseket. Azonban azt tudva, hogy a PCV2 egy kulcsfontosságú faktor, a találmány szerinti új fertőző, replikálódó virális kiónt tovább módosíthatjuk vagy génsebészeti úton manipulálhatjuk, hogy elérjük a kívánt optimális immunológiai hatást az immunológia és molekuláris genetika szakterületén járatos szakember számára ismert eljárások alkalmazásával.

A találmány szerinti PCV2 fertőző DNS-klón elérhetősége lehetővé teszi génsebészeti úton módosított legyengített vakcina kifejlesztését PCV2 fertőzés és PMWS megelőzésére sertésekben. Ismert, hogy a PCV2 a nyirokcsomókban, tüdőkben és májban replikálódik a természetes fertőzés folyamán, és az egyik fő patogenikus hatás az immunrendszer megzavarása a nyirok szerkezetek leontása révén [S. Krakowka és mtsai., 2001, mint fent; G. M. Allan és J. A. Ellís, 2000, mint fent; S. Kennedy és mtsai., 2000, mint fent; G. J. Wellenberg és 10 mtsai., 2000, mint fent; G. M. Allan és mtsai., „Experimental reproduction of severe wasting disease by coinfection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus’’, J. Comp. Pathol. 121, 1-11. old. (1999); J. Ellis és mtsai., „Reproduction of lesions of postweaning multisysteinic wasting syndrome in gnotobiotic piglets”, J. Vet. Diagn. Invest. 11,3-14. old. (1999); J. C. Harding és E. G. Clark, 1997, mint fent]. Ezen új fertőző PCV2 molekuláris DNS-klón alkalmazásával határozottabban jellemezhetjük a kizárólag a PCV2 fertőzésnek 15 tulajdonítható klinikai betegséget, patológiai sérüléseket és víruseloszlást.

A találmány szerinti PCV2, PCV1, kiméra PCV 1-2 és reciprok kiméra PCV2-1 fertőző DNS-klónok hozzáférhetősége miatt jobban megértjük a PCV gének közötti szerkezeti és funkcionális összefüggéseket. Will és mtsai. [„Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees”. Nature 299, 740-742. old. (1982)] először demonstrálták a klónozott hepatitisz B vírus DNS alkalmazásának a lehetőségét csimpánzok megfertőzésére 20 közvetlen in vivő oltással. Ez a megközelítési módot azóta alkalmazták számos más vírus virális replikációjának és patogenezisének tanulmányozására [T. W. Dubensky és mtsai., „Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice”, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 81, 7529-7533. old. (1984); R, Girones és mtsai., „Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1846-1849. old. (1989); N. L. Letvin és mtsai., „Risks of handling HIV”, 25 Nature 349, 573. old. (1991); C. Seeger és mtsai., „The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal.”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5849-5852. old. (1984); E. E. Sparger és mtsai., „Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone”, Virology 238, 157160. old. (1997); R. Sprengel és mtsai., „Homologous recombination between hepadnavíraí genomes following in vivo DNA transfection: implications for studies of viral infectivity”, Virology 159,454-456. old. (1987); Η. T. 30 Will és mtsai., 1982, mint fent; L. Willems és mtsai., „In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep”, Virology 189, 775-777. old. (1992)].

A fertőző PCV2 molekuláris DNS-klón előállítása, és a fertőzés demonstrálása klónozott PCV2 plazmid-DNS sertések májába és nyirokcsomóiba történő közvetlen beinjektálásával a találmány szerint előnyös a PCV2 tanulmányozására. Ez a in vivő transzfekciós rendszer elősegíti a PCV2 gének szerkezeti és funkcionális 35 összefüggéseinek a tanulmányozását in vitro előállított rekombinánsok plazmid alkalmazásával, hogy teszteljük a PCV2 különböző régióinak vagy génjeinek a szerepét a vírus replikációjában és patogenezisében a gazdában. A PCV2 replikációját és patogenczisét tanulmányozhatjuk in vivo anélkül, hogy fertőző vírus törzstenyészeteket kellene előállítani PCV2 sejttenyészetben történő szaporításával. Ez előnyös, mivel a sorozatos sejttenyészetben végzett passzáiásokkal virális variánsok szelektálódhatnak ki. A klónozott PCV2 genomiális DNS élő vírus 40 helyetti alkalmazásának egy másik előnye annak viszonylagos egyszerűsége az oltási dózis meghatározására.

.82

-2018 2 5 3 7 3

Állat oltására alkalmazott klónozott PCV2 DNS mennyiségét könnyen meghatározhatjuk spektrofotométerrel, míg az élő PCV2 vírus dózisának meghatározásához fertőzési titrálásokat kell végezni sejttenyészetekben, és a fertőzés megerősítését IFA-val. Állatok közvetlen oltása klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel eliminálja a más endemikus sertés ágensek szöveti homogén izátumokban való jelenlétével kapcsolatos problémákat az 5 állatkísérletekben.

A találmány szerint az immunogenikus ORF2 kapszid gént felcseréltük a patogén PCV2 és a nempatogén PCVl között, hogy előállítsuk a kiméra PCVl-2 DNS-klón egyedi szerkezetét. Meglepő és előnyös módon a kiméra PCVl-2 fertőző klón replikálódott, expresszálta az immunogenikus ORF2 kapszid-antigént in vitro és in vivo, és specifikus ellenanyag-választ indukált PCV2 ORF2 ellen, de megtartotta a PCVl nemit) patogén természetét. A kiméra PCVl-2 fertőző DNS-klón képes erős immunválaszt indukálni PCV2 ellen, míg csak korlátozott fertőzést indukál enyhe patológiás sérülésekkel, amelyek hasonlítanak a nem-patogén PCVl által okozottakhoz. Vakcina-fejlesztés esetében a klónozott DNS viszonylag egyszerű tárolása és stabilitása és a PCV2 plazmid-DNS és kiméra PCVl-2 DNS-klón nagyléptékű rekombínáns termelésének gazdaságossága vonzó lehetőséget biztosit élő, fertőző virális DNS-vakcina vagy génsebészeti úton módosított legyengített 15 virális vakcinák bejuttatására sertésekbe. Tehát a találmány szerinti kiméra PCVl-2 fertőző DNS-klón hasznos vakcina-jelölt PCV2 fertőzés és PMWS ellen.

Nyilvánvaló, hogy a leírás szerinti értelemben alkalmazott minden tudományos és műszaki kifejezés alatt ugyanazt értjük, mint amit az átlagos szakember általában ért alatta. A találmány céljaira a „fertőző” kifejezés alatt azt értjük, hogy a vírus replikálódik sertésekben, függetlenül attól, hogy a vírus okoz-e bármilyen 20 betegséget, vagy sem. „SPF” alatt specifikus patogén-mentes sertéseket értünk. A „gnotobiotikus” kifejezés alatt csiramentes sertéseket értünk. A „PCV2 plazmid-DNS”, „PCV2 genomíális DNS” és „PCV2 molekuláris DNS” kifejezéseket felcserélhető módon alkalmazzuk, és ugyanazt a klónozott nukleotid-szekvenciát értjük alattuk.

A fertőző PCV1/PCV2 kiméra DNS-klón (törzs neve: „PCVl-2 kiméra”), a fertőző PCV2 molekuláris DNS-klón (törzs neve: „PCV2 klón”) és a biológiailag tiszta homogén PCV2 törzstenyészet — amely a PCV2 25 egy lowa-i mintájából származik, és amelyet súlyos PMWS-ben szenvedő sertésből izoláltunk, és a 40895. számú izolátumként azonosítottuk (törzs neve: „PCV2 #40895”) — letétbe van helyezve a Budapesti Szerződés szerint az ‘American Type Culture Collection’ intézetnél (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U. S. A). A találmány szerinti DNS-szekvenciák egy 6490 bp méretű plazmidban találhatók pBluescript SK(+) vektorba (pSK, Stratagene Inc., La Jolla, CA) klónozva és Escherichia coli DHSa 30 kompetens sejtekbe transzformálva. A fertőző kiméra PCV1-2 DNS-klónt („kiméra 1 -es típusú (PCVl) és 2-es típusú (PCV2) sertés cirkovírus fertőző DNS-klón”) és a fertőző PCV2 molekuláris DNS-klónt („2-es típusú sertés cirkovírus (PCV2) fertőző DNS-klónja”) tartalmazó plazmidokat letétbe helyeztük az ATCC-nél 2001. december 7-én, és azok sorrendben a PTA-3912 és PTA-3913 szabadalmi letéti számokat kapták. Nyilvánvaló, hogy más plazmidok is — amelyek könnyedén előállíthatók helyspecífikus mutagenezis és a leírásban 35 ismertetett módszerek alkalmazásával — is a találmány oltalmi körébe tartoznak. A 40895. számú izolátum biológiailag tiszta és homogén PCV2 mintáját („2-es típusú sertés cirkovírus (PCV2)”) szintén letétbe helyeztük az ATCC-nél 2001. december 7-én, és az a PTA-3914 szabadalmi letéti számokat kapta. A 40895. számú PCV2 izolátum genomíális (nukleotid-) szekvenciáját letétbe helyeztük a Genbank adatbázisban, és teljes mértékben nyilvánosan hozzáférhető 2000, július 23. óta az AF264042. hozzáférési szám alatt.

-21 Az alábbi példákkal demonstráljuk a találmány bizonyos megvalósítási módjait. Azonban nyilvánvaló, hogy ezek a példák csak a szemléltetést szolgálják és nem tekinthetők a találmány feltételeinek és oltalmi körének szempontjából teljes meghatározónak. Nyilvánvaló, hogy amikor tipikus reakciókörülményeket (például hőmérséklet, reakcióidő, stb.) adtunk meg, a megadott tartományok alatti és feletti körülmények is 5 alkalmazhatók, habár általában kevésbé kényelmesen. A példákat szobahőmérsékleten (körülbelül 23-28 °C) és légköri nyomáson hajtjuk végre. A leírásban említett minden rész és százalék tömeg alapján van, és minden hőmérsékletet Celsius fokban fejezünk ki, hacsak másképpen nem határozzuk meg.

A találmány további megértését szolgálják az alábbi nem korlátozó példák.

1. példa

PCVl szennyeződéstől mentes PK-15 sejtvonal előállítása

A PCV2 izolátum forrása természetben előforduló PMWS-ben szenvedő sertés lépszövete volt (40895. számú PCV2 , amit „40895. számú izolátumnak” nevezünk) (M. Fenaux és mtsai., 2000, mint fent). PCV2-re specifikus ellenanyag alkalmazásával immunhisztokémia festéssel (IHC) igazoltuk a PCV2 antigén jelenlétét a ! 5 szövetben. A lépszövetet -80 °C-on tároltuk fel használásig.

Az ‘American Type Culture Collection’ intézettől megvásárolt PK-15 sejtvonal (ATCC hozzáférési szám: CCL-33) perzisztensen fertőzött PCVl-el (G. C. Dulac és A. Afshar, 1989, mint fent). Mivel a PK-15 sejteknek csak egy szubpopulációja perzisztensen fertőzött, előállítottunk egy PCVl szennyeződéstől mentes PK-15 sejtvonalat végponti hígítással. A protokoll a következő volt: PK-15 sejteket tenyésztettünk MÉM 20 tápközegben Earle-féle sókkal és L-glutarninnal (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), kiegészítve 10% magzati borjú szérummal (FBS) és IX antibiotikumokkal (Life Technologies, Inc.), Konfluens egysejtű sejtrétegeket tripszinizáltunk, és a sejteket azután sorozatban hígítottuk olyan végpontig, ahol 0,2 mi-ben egy sejt volt. A végponti hígítást 96-méröhelyes mikrotiterlemezekre szélesztettük, és hagytuk nőni egy sejtből kiinduló egysejtes réteggé. Az egyes sejtekből származó sejteket teszteltük PCVl DNS-re PCR-RFLP vizsgálati eljárás 25 alkalmazásával, amely képes PCVl és PCV2 detektálására és megkülönböztetésre (M. Fenaux és mtsai., 2000, mint fent). A mérőhelyekből származó PCVI-re PCR-RFLP-vel negatívnak tesztelt PK-15 sejteket azután fel szaporítottuk. A PCVl-mentes PK-15 sejtek sejtvonalat szubkul túráztuk öt passzáláson keresztül, és negatívnak találtuk PCVl DNS-re PCR-rel minden egyes passzálás után.

PCVl szennyeződésre negatív négy sejtvonalat állítottunk elő az ATCC-töl származó perzisztensen 30 fertőzött PK-15 sejtek végponti hígításával. A sejtvonalak negatívak maradtak PCVl-re PCR alkalmazásával a további Öt passzálás során. A sejt vonalak egyikét azt követően felszaporítottuk, és kimutattuk róla, hogy képes PCV2 replikációjának biztosítására, amikor a sejteket transzfektáltuk a PCV2 molekuláris DNS-klónnal (2. ábra) és fertőztük PCV2 vírussal. A klónozott sejteket tovább alkalmaztuk PCV2 molekuláris DNS-klón in vitro transzfektálására, hogy biológiailag tiszta PCV2 fertőző vírus törzstenyészetet állítsunk elő oltási 35 állatkísérletekhez.

2. példa

A PCV2 fertőző DNS-klón előállítása

A PCV2 molekuláris DNS-klón előállításához egy pár PCR-láncindítót terveztünk a 40895. számú PCV2 izolátum publikus szekvenciája szerint (M. Fenaux és mtsai., 2000, mint fent): elülső láncindító, F40 PCVSAC2 (5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT- 3’, 5. azonosítószámú szekvencia), és reverz

-22láncindító, R-PCVSAC2 (5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’, 6. azonosító számú szekvencia). Ez a láncindító-pár amplifikálja a PCV2 teljes genomját egy átfedő régióval, amely az egyedi Sacll restrikciós enzimhelyet tartalmazza (1. ábra). A DNS-t a QIAamp DMA Minikit reagenskészlet (Qiagen, Inc., Valencia, CA) alkalmazásával tisztítottuk meg természetben előforduló PMWS-ben szenvedő sertés lépszöveti mintájából (40895. számú izolátum) (M. Fenaux és mtsai., 2000, mint fent). Az extrahált DNS-t PCR-rel amplifikáituk AmpHTaq Go/r/polimeráz (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) alkalmazásával. A PCR-reakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti enzimaktiválási lépés 95 °C-on 9 percen keresztül, majd 35 ciklus denaturálás 94 °C-on l percen keresztül, anellálás 48 °C-on 1 percen keresztül, lánchosszabbítás 72 °C-on 3 percen keresztül, és végső lánchosszabbítás 72 °C-on 7 percen keresztül. A várt méretű PCR-terméket gélelektroforézissei elválasztottuk, és a ‘glassmilk’ eljárással tisztítottuk meg Geneclean reagenskészlettel (Bio 101, Inc., La Jolla, CA).

A PCV2 genom tandem dimerjét tartalmazó molekuláris DNS-klón előállításához a teljes PCV2 genomot tartalmazó PCR-terméket először az advanTAge plazmidvektorba (Clontech, Palo Alto, CA) ligáltuk. Kompetens E. coli DH5a sejteket transzformáltunk. A rekombináns plazmidot restrikciós enzimes emésztéssel igazoltuk. A teljes hosszúságú PCV2 genomiális DNS-t kivágtuk az advanTAge vektorból Sacll restrikciós enzimes emésztéssel. A megemésztett PCV2 genomiális DNS-t T4 DNS-ligázzal ligáltuk 37 °C-on csak 10 percen keresztül, ami előnyben részesíti a tandem dímerek keletkezését. A tandem dimereket azt követően pBluescript SK(+) vektorba (pSK) (Stratagene Inc. , La Jolla, CA) klónoztuk (l. ábra). A PCV2 genom tandem dimerjeit (amit a leírásban PCV2 molekuláris DNS-klónnak nevezünk) tartalmazó rekombináns plazmidokat PCR-rel, restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással igazoltuk. A rekombináns plazmid DNS-koncentrációját spektrofotometrikusan határoztuk meg.

Közelebbről a PCV2 teljes genomját (40895. számú izolátum) PCR-rel amplifikáituk, előállítva a fertőző PCV2 molekuláris DNS-klónt. A teljes PCV2 genom két példányát ligáltuk tandem a pSK vektorba, előállítva a PCV2 molekuláris DNS-klónt (l. ábra). A PCV2 molekuláris DNS-klón fertözőképességét PK-15 sejtek in vitro transzfektálásával határoztuk meg. A PCV2-re specifikus ellenanyaggal végzett IFA megerősítette, hogy a molekuláris DNS-klón fertőző ín vitro, és hogy körülbelül a PK-15 sejtek 10-15%-a transzfektálódott. PCV2-re specifikus antigén jelölödését láthatjuk IFA-val a sejtmagban, és kisebb mértékben a transzfektált sejtek citoplazmújában (2. ábra). Az üres pSK vektorral vakon transzfektált sejtek negatívak maradtak PCV2 antigénre.

3. példa

In ví/ro transzfektálás PCV2 molekuláris DNS-klónnaL és biológiailag tiszta és homogén PCV2 fertőző vírus törzsien vészét előállítása

A molekuláris DNS-klón in vitro fertőzőképességének tesztelésére PCVl szennyeződéstől mentes PK15 sejteket tenyésztettünk 8-méröhelyes LabTek kamrás lemezeken. Amikor a PK-15 sejtek elérték a 85% konfluenciát, a sejteket transzfektáltuk a molekuláris DNS-klónnal Lipofectamine Plus reagenssel a gyártó által biztosított protokoll szerint (Life Technologies, Inc.). Üres pSK vektorral vakon transzfektált sejteket alkalmaztunk kontrollként. Három nappal a transzfektálás után a sejteket rögzítettük 80% acetont és 20% metanolt tartalmazó oldattal 4 °C-on 20 percen keresztül, és PCV2-re specifikus nyúl poíiklonális antiszérumot alkalmazó immunfluoreszcens vizsgálati eljárást hajtottunk végre a molekuláris DNS-klón in vitro fertőzök épességének meghatározására (lásd alább).

Cl ο»

-23 Az oltási állatkísérletekre szolgáló, biológiailag tiszta és homogén PCV2 fertőző vírus törzstenyészet előállításához PCV1 szennyeződéstől mentes PK-15 sejteket tenyésztettünk T-25 tenyésztő edényekben, és transzfektáltuk azokat a PCV2 molekuláris DNS-klónnal. A PK-15 sejteket körülbelül 85% konfluenciáig tenyésztettük a T-25 edényekben. A sejteket egyszer megmostuk steril PBS-pufferrel a transzfektálás előtt. Az 5 egyes transzfektálás! reakciókhoz 12 pg PCV2 plazmid-DNS-t kevertünk össze a T-25 edényekben 16 μΐ Plus Reagenssel 0.35 ml MÉM tápközegben. Üres pSK vektorral vakon transzfektált sejteket tartalmazó edényt alkalmaztunk negatív kontrollként. 15 PERC szobahőmérsékleten végzett inkubáiás után 50 μΐ, 0,35 ml MÉM tápközegben meghígított Lipofectamine Reagenst adtunk a keverékhez, és szobahőmérsékleten inkubáltuk további 15 percen keresztül. A transzfektálási keveréket azután hozzáadtuk a PK-15 sejtek sejteket 2,5 ml friss 10 MÉM tápközegben tartalmazó T-25 edényhez. 37 °C-on 3 órán keresztül történő inkubáiás után a tápközeg helyettesítettük friss MÉM tápközeggel, amely 2% FBS-t és IX antibiotikumokat tartalmazott. A transzfektált sejteket 3 nappal a transzfektálás után gyűjtöttük be, és -80 °C-on tároltuk felhasználásig. A vírus törzstenyészet fertőző literét IFA-val határoztuk meg (lásd alább).

Alapvetően biológiailag tiszta és homogén PCV2 fertőző törzstenyészetet állítottunk elő PK-15 15 sejteknek a PCV2 molekuláris DNS-klónnal történő transzfektálásával. Az in vitro transzfektálással előállított PCV2 virionok fertözőképesek voltak, mivel a transzfektált sejti izátumokat sikeresen alkalmaztuk PK-15 sejtek transzfektáiására. Ily módon a PCV2 molekuláris DNS-klón képes fertőző PCV2 virionok előállításra, amikor in vitro transzferáljuk. A transzfektált sejtekből előállított homogén PCV2 vírus törzstenyészet fertőző literét 1 x !0^4,5 TCID₅₍/ml értékűnek határoztuk meg. Ezt a vírus törzstenyészetet alkalmaztuk a 2. csoportban található 20 sertések oltására. Az üres pSK vektorral vakon transzfektált sejtek lizátumai képtelenek voltak PK-15 sejtek megfertőzésére.

4. példa

Vírustitrálás immunfluoreszcens vizsgálati eljárás alkalmazásával

A homogén PCV2 vírus törzstenyészet fertőző literének meghatározásához PK-15 sejtek tenyésztettünk 25 8-mérőhelyes LabTek kamrás lemezeken. A vírus törzstenyészetet 10-szeresen sorozathígítottuk MÉM tápközegben, és minden egyes hígítást PK-15 sejtek egysejtes rétegére oltottunk a LabTek kamrás lemezek 10 mérőhelyén. Nem oltott sejteket tartalmazó mérőhelyeket alkalmaztunk kontrollként. A fertőzött sejteket három nappal az oltás után rögzítettük 80% acetont és 20% metanolt tartalmazó oldattal 4 °C-on 20 percen keresztül. A sejtek PBS-pufferrel végzett mosása után a fertőzött sejteket 1:1000 arányban meghígított PCV2-re specifikus 30 nyúl políklonális ellenanyaggal inkubáltuk [S. D. Sorden és mtsai., „Development of a polyclonal-antibodybased immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin- fixed, paraffinembedded tissue”, J, Vet. Diagn. Invest. 11, 528-530. old. (1999)] 37 °C-on 1 órán keresztül. A sejteket azután három alkalommal megmostuk PBS-pufferrel, és inkubáltuk másodlagos, FITC-cel jelzett kecske anti-nyúl-lgGvel (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) 37 °C-on 45 percen keresztül. A lemezek PBS35 pufferrel végzett háromszori mosása után a lemezeket fluoromount-G reagenssel borítottuk, lefedtük fedőlemezzel, és megvizsgáltuk fluoreszcens mikroszkóp alatt. Kiszámítottuk az 50%-os szövettenyészeti fertőző dózist ml-enként (TClD_S0/ml). Kezdetben a sejteket a PCV2 genom egyetlen példányát tartalmazó plazmid-konstrukcióval transzfektáltuk, de a fertőző PCV2 titer az egyetlen genomot tartalmazó konstrukciókkal sokkal alacsonyabb, mint a tandem genomot tartalmazókkal. Tehát a PCV2 dimer formáját tartalmazó plazmidpr 40 konstrukciót alkalmaztuk in vitro és in vivo transzfekciós kísérletekhez.

Cl 0?

5. példa

Sertések in vivo transzfektálása a PCV2 molekuláris DNS-klónnal, és sertések kísérleti oltása a homogén PCV2 fertőző vírus törzstenvészettel

Negyven négyhetes specifikus patogén-mentes (SPF) sertést véletlenszerűen négy, 10 állatot tartalmazó csoportba osztottunk szét. Az oltást megelőzően az SPF sertéseket teszteltük PCV, PTTSV, PPV és sertés hepatitisz E vírus elleni ellenanyagokra. Az 1. csoportban található sertéseket nem oltottuk be, és azok negatív kontrollként szolgáltak. A 2. csoportban található sertéseket inttanazálisan oltottuk körülbelül 1,9 x 10⁵ TCID₅₀ PCV2 fertőző vírus törzstenyészettel, amely a PCV2 molekuláris DNS-klónból származott. A 3. csoportban található sertések közvetlen intrahepatikus injekciót kaptak a PCV2 molekuláris DNS-klónját tartalmazó plazmid-DNS-sel. Mindegyik sertést Összesen 200 pg rekombináns plazmid-DNS-sel (a klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel) oltottuk be ultrahanggal irányított módszer alkalmazásával, a máj hat különböző helyére. A 4. csoportban található sertéseket összesen 200 pg rekombináns PCV2 plazmid-DNS-sel oltottuk be közvetlenül a felszíni csípő nyirokcsomókba, és mindegyik nyirokcsomó két különálló injekciót kapott. Az állatokat naponta megfigyeltük a betegség klinikai tüneteire. Szérummintát gyűjtöttünk minden egyes állattól a 0., 7., 14., 21., 28. és 35. oltás utáni napon (DPI). A 21. oltás utáni napon öt sertés véletlenszerűen kiválasztottunk mindegyik csoportból, és felboncoltuk. Az egyes csoportokban megmaradó öt állatot a 35. oltás utáni napon boncoltuk fel. Különféle szöveteket és szerveket gyűjtöttünk a boncolás során, és dolgoztunk fel hisztológiai elemzéshez és immunhisztokémia festéshez (lásd alább).

Az eredményeket az alábbi 1. táblázatban mutatjuk be. A 2., 3. és 4, csoportban mindegyik oltott sertés negatív volt PC V2-el len anyag okra a 0. napon. Az oltatlan 1. csoportban két sertésnek detektálható anyai PCV2ellenanyaga volt a 0. napon. Az anyai ellenanyag elfogyott a két malacban a 7. napra. Nem detektáltunk szerokon verziót PCV2-ellenanyagra a 10 oltatlan kontroll sertés egyikében sem. A 2. csoportban a PCV2 fertőző vírussal intranazálisan oltott sertések közül 1 malac szerokon vert ált PCV2-ellenanyagra a 21. oltás utáni napra.

A 35. napra a megmaradt öt 2. csoportbeli sertés közül 4 szerokonvertált. A 3. és 4. csoportbeli transzfektáit állatok sze rokon verziója először a 28. napon jelent meg. A 35. napra a 3. csoportban öt megmaradt setés közül 5, és a 4. csoportban megmaradt öt sertés közül 3 szerokonvertált PC V2-el lenanyagra.

Teszteltük a PPV ellenanyagokat a 3. és a 21. napon minden sertés esetében, és a 35. napon a megmaradt sertések esetében. A mindenütt előforduló PPV sertés ágens elleni anyai ellenanyagokat detektáltunk 30 az SPF malacokban. A PPV Hl ellenanyag-titere szignifikánsan csökkent egy kivételével az összes malacban a 3. naptól (az átlagos titer 1: 2665) a 21. napig (az átlagos titer l: 246), jelezve, hogy az ezekben a malacokban detektált ellenanyag passzív eredetű volt. Egy malac esetében a PPV Hl titer kissé emelkedett 1:32-röl a 3. napon 1:64-re a 21. napon, ami valószínűleg tesztelési variációnak tekinthető. Az összes sertéstől a 0., 21. és 35. oltás utáni napon gyűjtött széni mm imákat tovább teszteltük PPV DNS-re publikált PCR vizsgálati eljárás alkalmazásával [J. M. Soucie és mtsai., „Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factorVIII concentrate”, Transfusion 40, 708-711. old. (2000)]. Nem detektáltunk PPV virémiát egyik sertésben egyik napon sem, tovább mutatva azt, hogy a sertések nem voltak PPV-vel megfertőzve.

£CLSC8T

1, Táblázat. Szerokonverzió PCV2-re specifikus ellenanyagokra a PCV2 élő vírussal oltott, vagy klónozott PCV2 plazmid-DNS-sel közvetlenül injektált sertésekben

Napok az oltás után

Csoport	Oltóanyag	Oltás útja	0	7	14	21	28	35
1	Nincs		2/10a	0/10	0/10	0/10	0/5	0/5
2	PCV2 élő virus’1	Intranazális	0/10	0/10	0/10	1/10	1/5	4/5
3	PCV2 DNSC	Intrahepatikus	0/10	0/10	0/10	0/10	1/5	5/5
4	PCV2 DNSC	Intralimfoid	0/10	0/10	0/10	0/10	1/5	3/5

“ PC V2-e! lenanyagot mértünk ELlSA-val, pozitívok száma / teszteltek száma.

^b Biológiailag tiszta és homogén PCV2 vírus törzs tény észetet állítottunk elő PK-15 sejtek transzfektálásával 5 PCV2 molekuláris DNS-klónnal.

^c Klónozott PCV2 genomiális DNS pSK plazmidban.

6. példa

PCR-RFLP elemzések

A PCV2 molekuláris DNS-klónnal transzfektált sertésekben és PCV2 fertőző virális törzstenyészettel fertőzött sertésekben a PCV2 virérnia mérésére különböző napokon gyűjtött szérummintákat teszteltünk PCV2 DNS jelenlétére korábban ismertetett PCV-RFLP általános vizsgálati eljárások alkalmazásával (M. Fenaux és mtsai., 2000, mint fent). Virális DNS-t extraháltunk 50 μΐ szérummíntából a DNAzoF reagens alkalmazásával a gyártó által biztosított protokoll alkalmazásával (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Az extrahált 15 DNS-t újra felszuszpendáltuk DNáz-, RNáz- és p rote máz-mentes vízben, és teszteltük PCV2 DNS jelenlétére PCR-RFLP alkalmazásával (ugyanott). Kiválasztott állatok PCR-termékeit megszekvenáltuk, hogy igazoljuk a sertéseket megfertőző vírus eredetét.

Szérummintákat gyűjtöttünk az összes kontroll és oltott állattól a 0., 7., 14., 21., 28. és 35. oltás utáni napon, és megvizsgáltuk azokat PCV2 virémiára a PCV2 DNS jelenlétének detektálásával (ugyanott). Az 20 eredményeket az alábbi 2. táblázatban mutatjuk be. Nem detektáltunk PCV2 DNS-t az oltatlan kontroll sertések

1. csoportjában egyik napon sem. Virémiát detektáltunk a 2. csoportból származó sertésekben a 14. napon 7/10 sertésben és a 35. napon 8/10 sertésben. A virérnia csak néhány napig tartott, mivel a PCV2 DNS nem volt detektálható a 28. napon, és a 2, csoport öt megmaradt sertésében sem a 35. napon. A 3. csoportban a sertések esetében — amelyeket in trahepat ikusan oltottunk PCV2 molekuláris DNS-klónnal — 8/10 sertés volt virémiás a 25 14. napon, és 9/10 sertésnek volt detektálható vírémiája a 35. napon. A 4. csoportba tartozó sertéseket PCV2 molekuláris DNS-klónnal oltottuk a nyirokcsomókba. 2/10 sertés volt virémiás a 4. csoportból 14. napon, és 8/10 a 21. napon. Az eredmények azt mutatják, hogy a PCV2 molekuláris DNS-klón fertőző, amikor közvetlenül az SPF sertések májába vagy a felszíni csípő nyirokcsomóiba injektáljuk. A kiválasztott állatokból származó PCRtermékeket megszekvenáltuk. A kiválasztott állatokból származó amplifikált PCR-termékek szekvenciája azonos 30 volt a PCV2 molekuláris DNS-klón megfelelő régiójával.

1825 37 3

2. Táblázat. Virérnia (PCV2 DNS) detektálása oltott és kontroll sertések szérumában PCR alkalmazásával Napok az oltás után

Csoport Oltóanyag Oltás útja 0 7 14 21 28 35 Összes

l	Nincs		0/10a	0/10	0/10	0/10	0/5	0/5	0/10
2	PCV2 élő vírus11	Intranazális	0/10	0/10	7/10	5/10	0/5	0/5	8/10
3	PCV2 DNSC	Intrahe patikus	0/10	0/10	8/10	6/10	3/5	3/5	9/10
4	PCV2 DNSC	Intralimfoid	0/10	0/10	2/10	8/10	2/5	0/5	8/10

” 10 sertés mindegyik csoportban, pozitívok száma! teszteltek száma.

^b biológiailag tiszta és homogén PCV2 vírus törzstenyészetet állítottunk elő PK-15 sejtek transzfektálasával PCV2 molekuláris DNS-klónnal.

^c Klónozott PCV2 genomiális DNS pSK plazmidban.

7. példa

Klinikai kiértékelés

A sertéseket lemértük a 0. napon és boncolás idején. A végbélben mért testhőmérsékleteket és klinikai légzési értékeket — amely 0 és 6 között változik (0 = normál, 6 = súlyos) [P. G. Halbur és mtsai., „Comparison 10 of the pathogenicity of two U. S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus”, Vet. Pathol. 32, 648-660. old. (1995)] —minden másnap rögzítettük a 0. és 35. nap között. A klinikai tüneteket szintén naponta feljegyeztük, beleértve a központi idegrendszeri betegség, májbetegség (ikterusz), vázizom-rendszeri betegség jeleit, és a test állapotának a változásait.

Az általános patológia és hisztopatológia értékeléséhez minden csoportból öt sertést véletlenszerűen 15 kiválasztottunk, és felboncoltunk a 21. és a 35.napon. A boncoló csoport nem ismerte a sertések fertőzöttségi állapotát a boncoláskor. Komplett boncolást végeztünk minden sertésen. Minden sertés esetében feljegyeztük a szemmel látható tüdögyulladásos tüdő becsült százalékát egy korábban leirt értékelési rendszer alapján (ugyanott). Az értékelési rendszer azon a megbecsült térfogaton alapul, amellyel az egyes tüdölebenyek hozzájárulnak a teljes tüdőhöz: a jobb koponyái lebeny, a jobb középső lebeny, a bal koponyái lebeny koponyái 20 része és a bal koponyái lebeny farki része egyenként 10%-át képviseli a teljes tüdötérfogatnak, a melléklebenyek 5%-át, és a jobb és bal farki lebenyek egyenként 27,5%-ot képviselnek. Más sérüléseket — mint például a nyirokcsomók megnagyobbodását — külön feljegyeztünk. Metszeteket vettünk hisztopatológtaí elemzéshez a orrjáratból, tüdőkből (több metszet)(ugyanott), szívből, agyból, nyirokcsomókból (tracheobronchiálís, csípő, mezenterikus, szubinguinális), mandulából, csecsemőmirigyből, májból, epehólyagból, lépböl, Ízületekből, 25 vékonybélből, vastagbélből, hasnyálmirigyből és veséből. A szöveteket vak vizsgálattal vizsgáltuk meg, és a tüdő, nyirokcsomó és máj sérüléseinek szubjektív értékelését végeztük el. A tüdőértékek O-tól (normális) 3-ig (súlyos limfohisztiocitikus interstíciális tüdőgyulladás) változtak. A májértékek O-tól (normális) 3-ig (súlyos limfohisztiocitikus hepatitisz) változtak. A nyirokcsomó-értékek a follikulusok limfoid depléciójának becsült értékén alapultak 0 (normális, vagy nincs limfoid depléció) és 3 (súlyos limfoid depléció vagy a follikulusok 30 hisztiocitikus helyettesítése) között változtak.

A szerológiai protokoll magában foglalta a 11-12 napos korban történő érkezéskor! vérvételt, és a vérvételt minden sertéstől a 0., 7., 14., 21., 28. és 35. oltás utáni napon. A PRRSV elleni ellenanyagokat Herd Check PRRSV ELISA alkalmazásával vizsgáltuk (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). A PPV elleni szérumellenanyagokat hemagglutinin-gátlási (Hl) vizsgálati eljárással detektáltuk [H. S. Joo és mtsai., „A standardized 35 haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody”, Aust. Vet. J. 52, 422-424.old. (1976)]. A PCV2 elleni szérum-ellenanyagokat módosított közvetett ELISA alkalmazásával detektáltuk, amely a PCV2

-27rekombináns ORF2 fehérjéjén alapul [P. Nawagítgul és mtsai., „Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2) -based ELISA for the detection of antibodies to PCV”, Immunol. Clin. Diagn. Lab. Immunol. I, 33-40. old. (2002)]. Részlegesen megtisztított PCV2 antigént állítottunk elő Hi Five sejtekből (invitrogen, Carlsbad, CA), amelyek a PCV2 ORF2 fő kapszid fehérjéjét 5 tartalmazó rekombináns bakulovírussal voltak megfertőzve [P. Nawagítgul és mtsai., „Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein”, J. Gen, Virol. 81, 2281-2287. old. (2000)]. A vad típusó bakulovírussal megfertőzött Hi Five sejtek lizátumait hasonló módon elkészítettük, és negatív kontroll antigénként szolgáltak. Immulon 2 HB polisztirol mikrőliterlemezeket (Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA) vontunk be pozitív és negatív antigének optimális koncentrációjával 4 °C-on 36 órán keresztül. 100 pl, 1:100 10 arányban 5% tej hígító-pufferben (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) meghígított szérummintát adtunk minden egyes mérőhelyhez. A szérum mintákat négy párhuzamosban teszteltük: 2 mérőhely a negatív kontroll antigénnel és 2 párhuzamos mérőhely a PCV2 antigénnel. A pozitív és negatív kontroll szérumokat minden egyes mikrotiterlemezre felvittük. A szérumokat 37 °C-on inkubáltuk 30 percen keresztül, és azután 5 alkalommal megmostuk 0,1% Tween-20-at tartalmazó 0,1 M PBS pufferrel. Peroxidázza! jelzett másodlagos 15 anti-sertés-IgG-t (Sigma Co., St. Louis, MO) mkubáltunk 37 °C-on 30 percen keresztül. A lemezeket ismét megmostuk, és inkubáltuk 2,2’-azÍno-di-(3-etilbenztiazolin-6-szulfonát)-tai (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) 37 °C-on 15 percen keresztül a szín előhívása érdekében. Az optikai denzitást (OD) 405 nm-en olvastuk le. Az egyes tesztelt és kontroll szérumok korrigált OD-értékét a negatív antigént tartalmazó mérőhelyek átlagos OD-értékének a PCV2-antígént tartalmazó párhuzamos mérőhelyéből történő levonásával számítottuk ki. Az 20 adatokat normalízáltuk a tesztelt szérumminta (S) korrigált OD-értékének az elosztásával a pozitív kontroll szérumminta (P) értékével, és S/P arányként ábrázoljuk. A <0,12, 0,12-0,2 és >0,2 S/P értékű mintákat sorrendben negatívnak, bizonytalannak és pozitívnak tekintjük.

A klinikai kiértékelés eredménye alapján egyik kontroll és oltott sertés sem mutatta a klinikai PMWS-re hasonlító betegség nyilvánvaló tüneteit. Nem volt különbség a négy csoport között a tömeggyarapodásban vagy 25 az átlagos végbél hő mérsék létben. Az 1. csoportban található kontroll sertések normálisak maradtak végig a kísérlet folyamán. Enyhe tranziens respiratórikus betegséget figyeltünk meg a PCV2 DNS-sel transzfektált és a PCV2 vírussal fertőzött csoportokban található sertések többségében a 8-14. napok között. Ezt enyhe légzési rendellenesség (diszpnea. 1-2 klinikai értékkel) kísérte egy-két napon keresztül az egyes sertések esetében, és 56 napon keresztül a csoportra vonatkoztatva.

Nem voltak megfigyelhetők makroszkopikus sérülések a kontroli sertésekben a boncoláskor. A három oltott csoportban található sertések makroszkopikus sérülései a tüdőkre és a nyirokcsomókra korlátozódtak (lásd az alábbi 3. táblázatot). A sérülések hasonlítottak a PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált és a PCV2 vírussal fertőzött sertések csoportjai esetében. A tüdők nem estek össze, és véletlenszerű, mutifokális, közepesen elhatárolható barnás-lila területeket tartalmaztak a tüdő 0-2%-án (3. ábra) a 21. napon, és a tüdő 0-13%-án a 35.

napon. A nyirokcsomók szisztematikusan megnagyobbodtak a normális méret 2-5-szörösére, kemények és barnák voltak (3. ábra), mind a 2L, mind a 35. napon mindhárom, PCV2-vel oltott csoport sertései esetében.

A mikroszkópos vizsgálat a máj kivételével nem mutatott ki sérüléseket egyik szövetben sem a kontroll sertések esetében. 10 kontroll sertés közül 8 esetében nagyon enyhe multifokális limfoplazmacitikus gyulladást figyeltünk meg elsősorban a máj periportális régióiban, amint az gyakran megfigyelhető normális sertésekben, és normális háttérnek tekinthető (P. G. Halbur és mtsai., 2001, mint fent).

-28Α PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált két csoportban (intrahepatikus és intralimfoid) és a PCV2 vírussal fertőzött csoportban (intranazális) hasonlóak voltak a sérülések az agyban, tüdőben, szívben, vesében, nyirokszövetekben (mandula, nyirokcsomók, lép), csípöbélben és májban (lásd az alábbi 4, táblázatot). Agysérüléseket figyeltünk meg 23/30 sertésben a három oltott csoportban, amelyeket enyhe-közepes 5 multifokális limfoplazmacitikus meningoenkefalitisznek jellemeztünk perivaszkuláris megjelenéssel és gliózissal. Tüdösérüléseket figyeltünk meg 28/30 PCV2-vel oltott sertésben, amelyeket enyhe-közepes peribronchioláris-limfoplazmacítikus és hísztiocitikus bronchiointerstíciális tüdőgyulladásnak jellemeztünk (3C. ábra). A 21. napon felboncolt, PCV2 vírussal fertőzött 2. csoport egyik sertése, és a 35. napon felboncolt, a PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált két csoportból való egy-egy sertés esetében ulceratív és proliferatív 10 bronchiolitíszt figyeltünk meg fíbropláziával, és granulómás gyulladást a bronchusok lamina propria és peribronchiolárís régióiban. Enyhe multifokális limfoplazmacitikus miokarditiszt is megfigyeltünk a PCV2-vel oltott 30 sertés közül 18 esetében. 14/30 PCV2-ve! oltott sertés esetében enyhe-közepes multifokális limfoplazmacitikus interstíciális nefritiszt figyeltünk meg. Nem figyeltünk meg sérüléseket a csecsemőmirigyben. Enyhe-közepes limfoid depléciót (4B. ábra) és a follikulusok hísztiocitikus helyettesítését figyeltük meg a 15 PCV2-vel fertőzött sertéseknél 8/30 esetben a mandulában, 7/30 esetben a lépben és 26/30 esetben a nyirokcsomókban. Közepes granulómás limfadenitiszt figyeltünk meg óriás sejtekkel (4C. ábra) a 21. napon a PCV2 vírussal intranazálísan oltott 3 sertésben, és egy-egy sertésben a 35. napon a PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált csoportokban. Enyhe limfoplazmacitikus és hísztiocitikus enterokolitiszt figyeltünk meg 3/5 sertés esetében a PCV2 vírussal fertőzött csoportban, 3/5 sertés esetében a PCV2 plazmid-DNS-sel íntrahepatikusan transzfektált csoportban, és 1/5 sertés esetében a PCV2 plazmid-DNS-sel intralimfoid úton transzfektált csoportban a 35. oltás utáni napon. A PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált csoportok egy-egy sertése esetében enyhe limfoid depléciót figyeltünk meg hísztiocitikus helyettesítéssel és kisszámú óriás sejttel a Peyerplakkokban. Enyhe-közepes limfoplazmacitikus hepatitiszt figyeltünk meg 29/30 PCV2-vel oltott sertés esetében. Kis számú, szétszórt egyedi nekrotikus hepatocitát figyeltünk meg limfohisztiocítikus gyulladással körülvéve egy-egy sertés esetében a PCV2 plazmid-DNS-sel transzfektált csoportokban a 21. oltás utáni napon, A többi szövet sérülései jelentéktelenek voltak.

A tüdő, máj és nyirokcsomók mikroszkopikus sérüléseit publikált értékelési rendszer alapján értékeltük (4. táblázat) (P. G. Halbur és mtsai., 2001, mint fent; P.G. Halbur és mtsai., 1995, mint fent). Nem volt elfogadott értékelési rendszer a többi szövet és szerv esetében. A PCV2-vel oltott három csoportba tartozó 30 sertések tüdejének és nyirokcsomóinak az átlagos sérülés-értékei statisztikailag különböztek az l. csoportba tartozó kontroll sertésekéitől. A PCV2-vel oltott három csoportba tartozó sertések májának sérti lés-érté kei nem különböztek statisztikailag a kontroll sertésekéitől.

3. Táblázat. A tüdő és nyirokcsomók makroszkopikus sérülései kontroll és PCV2-vel oltott sertésekben

Csoport	Oltóanyag	Oltás útja	21 DPI	35 DPI
Nyirokcsomók	Tüdő	Nyirokcsomók	Tüdő
1	Nincs		0/51	0/5	0/5	0/5
2	PCV2 élő vírusb	Intranazális	5/5	1/5 (0-1 )c	5/5	4/5 (0-5)
3	PCV2 DNSd	Intrahepatikus	2/5	2/5 (0-2)	5/5	2/5 (0-13)

-294 PCV2DNS^d Intralimfoid 4/5 5/5(0-1) 3/5 1/5(0-9) ^a Minden csoportból öt sertést fel boncoltunk a 21, oltás utáni napon, és a megmaradt öt sertést felboncoltuk a 35. oltás utáni napon. Pozitívak száma / teszteltek száma.

^b biológiailag tiszta és homogén PCV2 vírus törzstenyészetet állítottunk elő PK-15 sejtek transzfektálásávai PCV2 molekuláris DNS-klónnal.

^c Sérülést tartalmazók száma / teszteltek száma (a tüdőnek makroszkopikusan látható tüdőgyulladás által érintett területének becsült százaléka, 0-100%) ^d Klónozott PCV2 genomiális DNS pSK plazmidban.

1825 37 3

Μ m Lfl n »

-ω

8. példa

Immunhisztokómia

Elvégeztük a PCV2-re specifikus antigén immunhisztokémiaí (1HC) detektálását a 21. és 35. oltás utáni napon elvégzett boncoláskor összegyűjtött mindegyik szöveten. Nyúl poliklonális PCV2-specifikus antiszérumot 5 alkalmaztunk az IHC-ben, és a korábban leírt általános eljárásokat (S. D. Sorden és mtsai., 1999, mint fent).

A PCV2 antigén detektálásához és szöveti eloszlásának vizsgálatához elvégeztük a PCV2 antigén 1HC festését a 21. és 35. oltás utáni napon felboncolt mindegyik sertés agyán, tüdején, onjáratain, szívén, veséjén, manduláján, nyirokcsomóin, lépén, csecsemőmirigyén, csípőbelén, máján, epehólyagján és hasnyálmirigyén. A kontroll sertésekből származó mindegyik szövet negatív volt PCV2 antigénre. A PCV2-vel oltott három 10 csoportban a PCV2 antigén szöveti eloszlása hasonló volt (lásd az alábbi 5. táblázatot). Az agyban a PCV2 antigént elsősorban a mononukleáris sejtekben, fibroblaszt-szerű sejtekben és endotéliális sejtekben találtuk meg az agy hártyában és az érhártya-fonatban, és kevésbé gyakran az endotéliális sejtekben és perivaszkuláris mononukleáris sejtekben a nagyagyban és a kisagyban. A tüdőkben a PCV2 antigént az alveoláris és szeptális makrofágokban és fibroblaszt-szerü sejtekben detektáltuk a lamina propria-ban és a iégutakban (3D. ábra). A 15 szívben a PCV2 antigént az elszórt makrofágokban és endotéliális sejtekben detektáltuk. A vesékben a PCV2 antigént a tubuláris endotéliális sejtekben és az interstíciumban található mononukleáris sejtekben detektáltuk, A nyirokszövetekben (nyirokcsomók, lép, mandula és Peyer-plakkok) a PCV2 antigént elsősorban a makrofágokban és dendrikus-szerü sejtekben, és a föllikutusokban található óriás sejtekben detektáltuk (4D. ábra). Detektáltunk PCV2 antigént a vékonybél lamina propria-ban található makrofágokban is. A májban a 20 PCV2 antigént mononukleáris sejtekben és Kupffer-sejtekben detektáltuk. Nem detektáltunk PCV2 antigént az orrjáratokban, csecsemőmirigyben vagy epehólyagban.

m m )/1 ΓΜ 09 H

9. példa

A nem-patogén PCVl fertőző DNS-klón előállítása

Λ PCVl fertőző DNS-klón előállítására alkalmazott eljárás lényegében megegyezik a leírásban a PCV2-re ismertetettel. Egy PCR-láncindító-párt — KPNPCVI.U (7. azonosítószámú szekvencia) és KPNPCVLL (8. azonosítószámú szekvencia), lásd az alábbi 6. táblázatot — terveztünk meg a PCVl közzétett szekvenciája alapján. Ez a lánc indító-pár amplifíkálja a PCVl teljes genomját egy átfedő régióval, amely az egyedi Kpnl restrikciós enzimhelyet tartalmazza. A PCVl vírus DNS-ét a szennyezett ATCC PK-15 sejtvonalból extraháltuk, amelyet az ‘American Type Culture Collection’ intézettől szereztünk be (ATCC hozzáférési szám: CCL-33). A PCVl DNS-t a PCVl-el perzisztensen fertőzött ATCC PK-15 sejtekből extraháltuk a QIAmp DMA minikit reagenskész let alkalmazásával (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Az extrahált DNS-t PCR-rel amplifikáltuk AmpliTaq Gold polimeráz (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) alkalmazásával. A PCRreakcíó az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti lépés 95 °C-on 10 percen keresztül, majd 35 ciklus denaturálás 94 °C-on 1 percen keresztül, anellálás 48 °C-on 1 percen keresztül, lánchosszabbitás 72 °C-on 2 percen keresztül, és végső lánchosszabbítás 72 °C-on 7 percen keresztül. A várt méretű PCR-terméket gélelektroforézissel elválasztottuk, és a ‘glassmilk’ eljárással tisztítottuk meg Geneclean reagens készlet alkalmazásával (BiolOl, Inc., La Jolla, CA). A teljes PCVl genomot tartalmazó megtisztított PCR-terméket először az advanTAge plazmidvektorba ligáitok (Clontech, Palo Alto, CA). Escherichia coli DH5a kompetens sejteket alkalmaztunk a transzformáláshoz. A rekombináns plazmidot restrikciós enzimes emésztéssel igazoltuk. A teljes hosszúságú PCVl genomíális DNS-t kivágtuk az advanTAge vektorból Kpnl restrikciós enzimes emésztéssel. A teljes hosszúságú PCVl genomíális DNS-t beligáltuk a pBluescript SK(+) (pSK) vektorba (Stratagene, La Jolla, CA) T4 DNS-ligázzal 37 °C-on éjszakán keresztül. A teljes hosszúságú PCVl genomot tartalmazó rekombináns plazmidokat Qiagen plasmid mini kit reagenskészlet (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával izoláltuk, és restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással igazoltuk. A teljes hosszúságú PCVl genomíális DNS-t kivágtuk a pSK vektorból Kpnl emésztéssel, és dimerízáltuk, hogy előállítsuk a PCVl fertőző DNS-klónt, amint azt a 2. példában bemutattuk a PCV2 fertőző klón esetében. Ezeket a tandem dimereket azért csináltuk, mert a dimerizált tandem DNS-klónokról előnyösen azt találtuk, hogy hatékonyabbak sejtek transzfektálására és fertőző virionok létrehozására. A PCVl DNS tandem dimerjének előállításához a megemésztett PCVl genomíális DNSt T4 DNS-ligázzal ligáltuk 37 °C-on csak 10 percen keresztül, ami előnyben részesíti a tandem dimerek keletkezését. A tandem dimereket azt követően pBluescript SK(+) (pSK) vektorba ligáltuk (Stratagene, La Jolla, CA). A PCVl genom tandem dimerjeit (amelyeket a leírásban „PCVl DNS-klónnak” nevezünk) tartalmazó rekombináns plazmidokat PCR-rel, restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással igazoltuk. A rekombináns plazmid DNS-koncentrációját spektrofotometrikusan határoztuk meg.

ΙΛ

E co ‘Ο <0 co rn ω n co

CO «

1> N

ΙΛ

Ό oo co co ,g a

s:

CO

CO

CO co

V)

V1

CO β ββ (Λ ΕΛDO •β β*β ίΛ 'β 'CO =Q •β 'β

3Q

Q ·« '75 30 <u ίθ 'β 'CO ;O •Λ <υ ‘Ο

ΕΛ

ν) *Λ <υ rt t/j •ce β C« ‘03 ‘β t/5 ‘75 oo Z 0

CM (Λ Z Q tZ) z

CM

N (Λ cm o N co

Ξ •λ

N

E

N t/j ‘O o c: 8

0 u

0 :2

CM u

CM ‘U

CM u

*<υ

CM '8 o

Φ c o N co .2

N

V) .S

E

E

ΙΛ “O

Q N co

E «

M

Ε 'β Ν ίΛ

E co N

0 t u

N CO <n

Ó

O C o N 75 ο

O c o N 75

E

VI '2 v: O

Ö

N co « N un

E 13 w Ό

0

Ε

-C3 Ν

O c o N β

E

-Λ N <u N

E 13

O C o £ ¢/1 o C O N

C o o o o

Ο αί

Ο

X oi O i o, on

CŰ

X Q. un 'S 42

Q ίΟ 0 iu <u

Nested.Orf.PCV2 < 5’-TTGTAACAAAGGCCACAGC-’3 (25. azonosítószámú szekvencia) PCV2 és PCVl-2 detektálása

Nested.Gen.PCV2 > 5’-GTGTGATCGATATCCATTGACTG-’3 (26. azonosítószámú szekvencia) PCV2ésPCV2-í detektálása

A láncindító irányítottsága.

10. példa

A PCV1 DNS-klón fertőzőképességének az értékelése vírtisszennyezödéstöl mentes PK-15 sejtekbe történő transzferálva

A PCV1 molekuláris DNS-klón fertözőképességét PK-15 sejtek in vitro transzferáiásával határoztuk meg. A PCVl-re specifikus monoklonális ellenanyaggal (Dr. Gordon Allan, Belfast, U. K. ajándéka) végzett IFA megerősítette, hogy a PCV1 molekuláris DNS-klón fertőző PK-15 sejtekben. PCVl-re specifikus antigén jelölődését láthatjuk IFA-val a sejtmagban, és kisebb mértékben a transzferált sejtek citoplazmájában. Az üres pSK vektorral vakon transzferált sejtek negatívak maradtak PCV1 antigénre.

11. példa

Kiméra PCVl-2 virális DNS-klón előállítása

Kiméra vírust állítottunk elő a nem-patogén PCV1 és a PMWS-sel kapcsolatos PCV2 között, a fertőző PCV1 és PCV2 DNS-klónok alkalmazásával. A kiméra PCVl-2 DNS-klón előállításához a nem-patogén PCV1 ORF2 kapszid-génjét eltávolítottak a fertőző PCV1 DNS-klónból, és helyettesítettük a patogén PCV2 immunogeníkus ORF2 kapszid-génjéve! a PCVI genom gerincében (lásd az 5. és 6. ábrát). Két pár PCRláncindítót terveztünk. A PCV2 ORF2 első láncindító-párját (PsiI-5, 11. azonosítószámú szekvencia és Acll-6, 12. azonosítószámú szekvencia) a lánc indítók 5’ végen található pontmutációval terveztük az AclI és Psil restrikciós helyek létrehozásához a PCV2 ORF2 génjének az amplifikálására, és azt szegélyező Psil és AclI restrikciós enzimhelyek pontmutációval történő beépítésére. A PCV2 ORF2 amplifikálására szolgáló PCRreakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti lépés 95 ’C-on 9 percen keresztül, majd 38 ciklus denaturálás 95 °C-on 1 percen keresztül, anellálás 48 °C-on 1 percen keresztül, lánchosszabbítás 72 °C-on 1 percen keresztül, és végső lánchosszabbítás 72 °C-on 7 percen keresztül.

PCR-láncindítók egy második párját (HpaI-2, 9, azonosítószámú szekvencia és NarI-3, 10. azonosítószámú szekvencia) a pSKí- vektor és az abban található PCVI genom-inzert amplifikálására terveztük. Pontmutációkat építettünk be a PCR-láncindítók 5’ végére, hogy létrehozzuk a szegélyező NarI és Hpal restrikciós enzimhelyeket. Ez a Iá ne indító-pár amplifikálta a pSK+ vektort és az abba inzertált PCV1 genomiális DNS-t az ORF2 kapszid-gén nélkül, azaz a PCV1 genomot a PCV1 ORF2 nélkül (pSK-PCVl AORF2) a PCVÍ fertőző DNS-klón PCR-templátként történő alkalmazásával. A PCR-reakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti lépés 95 ^DC-on 9 percen keresztül, majd 38 ciklus denaturálás 95 °C-on 1 percen keresztül, anellálás 50 °C-on 1 percen keresztül, lánchosszabbítás 72 °C-on 3,5 percen keresztül, és végső lánchosszabbítás 72 °C-on 7 percen keresztül, A PCV2 ORF2 PCR-terrnéket megemésztettük AclI és Psil enzimekkel, hogy e[távolítsuk a beépített pontmutációkat. A pSK-PCVl AORF2 terméket (a pSK vektor-PCVl genom PCR-temék a PCV1 ORF2 génje nélkül) megemésztettük Narl és Hpal enzimekkel, hogy eltávolítsuk a PCR-rel beépített pontmutációkat. Az utóbbi emésztés az AclI és Psil restrikciós enzimekkel megemésztett PCV2 ORF2 PCRtermékkel komplementer ragadós és tompa végeket eredményezett. A megemésztett PCV2 ORF2 terméket és az ORF2-deletált pSK-PCVl terméket összeligáltuk T4 DNS-ligázzal, hogy létrehozzuk a kiméra PCVI-2 genomiális DNS-klónt, amelyben a PCV1 ORF2 génje helyettesítve van a PCV2 ORF2 génjével. Ha egyszer a két PCR-terméket megemésztettük és újraligáltuk, a klónozás elősegítésére PCR-rel beépített minden tn pont mutációt eltávolítottunk a kapott kiméra klónból. Escherichia coli DH5a kompetens sejteket transzformáltunk. A kiméra DNS-klónt tartalmazó rekombináns plazmidokat izoláltuk, és PCR-rel, restrikciós

-361825 ?

enzimes emésztéssel és részleges DNS-szekvenálással igazoltuk. A teljes hosszúságú kiméra PCV]-2 genomot kivágtuk a pSK+ vektorból (a rekombináns plazmidból) KpnI emésztéssel. Azután a kiméra DNS-genomot dímerizáltuk egy rövid, 10 perces ligálási reakcióval T4 DNS-ligázzal, ami előnyben részesíti a lineáris dinietek kialakulását, igY előállítva a PCV 1-2 kíméra fertőző DNS-klónt (6. ábra). A kiméra virális genom két példányát 5 tartalmazó rekombináns plazmidokat PCR-rel, restrikciós enzimes emésztéssel és DNS-szekvenálással igazoltuk.

12. példa

A kiméra PCV 1-2 DNS-klón in vitro fertözöképesséeének az értékelése

A kiméra PCV DNS-klón (nem-patogén PCV] a PCV2 immunogenikus kap szid-génj ével) 10 életképességét PK-15 sejtekben teszteltük. Amikor PK-15 sejteket transzfektáltunk a kiméra virális DNSklónnal, a PCV2 ORF2 kapszidra specifikus virális antigént detektáltunk IFA-val körülbelül 2 nappal a transzfektálás után. Nem detektáltunk PCV1 kapszid-antigént a transzfektált sejtekben. Ez a kísérlet azt mutatta, hogy a kiméra DNS-klón fertőző in vitro, replikálódik PK-15 sejtekben, és termeli a PCV2 immunogenikus kapszid fehérjéjét.

13. példa

Reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klón előállítása

A reciprok PCV2-1 kiméra DNS-klón előállításához a PCV2 ORF2 kapszid-génjét helyettesítjük a nem-patogén PCV 1-ével a patogén PCV2 genom gerincében (6. ábra). Két PCR-láncindító-párt terveztünk: A 20 Bgl-II-ORF2 (13, azonosítószámú szekvencia) és Sph-1-ORF2 (14. azonosítószámú szekvencia) pár amplifikálja a PCV1 ORF2 gént és szegélyező Bglll és SpHJ restrikciós enzimhelyeket épít be pontmutációval. A második PCR-láncindító-pár, Bgl-II-PCV2 (15. azonosítószámú szekvencia) és SpH-l-PCV2 (16. azonosítószámú szekvencia) amplifikálta a pSK vektort és a PCV2 genomot az ORF2 gén nélkül (pSK-PCV2 AORF2) a PCV2 fertőző DNS-klónt PCR-templátként történő alkalmazásával, és szegélyező Bglll és Sphl restrikciós 25 enzimhelyeket épített be pontmutációval. A pSK-PCV2 AORF2 terméket és a PCVl ORF2 PCR-terméket megemésztettük Bglll és SPhl restrikciós enzimekkel, komplementer ragadós és tompa végeket létrehozva, és össze]igáltuk azokat. E. coli sejtekbe történő transzformálás után az autentikus rekombináns plazmidokat izoláltuk, és enzimes emésztéssel és részleges DNS-szekvenálással igazoltuk azokat. A teljes hosszúságú reciprok kíméra PCV2-1 genomot kivágtuk a rekombináns plazmidból Sacll emésztéssel, és dímerizáltuk a leírás 30 szerint, előállítva a reciprok kiméra PCV2-1 fertőző ki ónt.

14. példa

PK-15 sejtek sejtek in vitro transzfektálása PCVL PCV2, PCV 1-2 és PCV2-1 DNS-klónokkal

A PCV2 klón in vitro és in vivo fertözöképességét bemutattuk a fenti 3-5. példákban. A PCVl és a két 35 kiméra klón in vitro fertözöképességének tesztelésére I. péida szerint előállított PCVl-szennyeződéstől mentes PK-15 sejteket tenyésztettünk 8-mérőhelyes LabTek kamrás lemezeken (Nalge Nunc Int., Denmark). Amikor a PK-15 sejtek elérték a 80% konfluenciát, a sejteket transzfektáltuk PCVl, PCV2, PCV1-2 és PCV2-1 DNSklónokkal Lipofectamine Plus reagenssel a gyártó által biztosított protokoll szerint (Life Technologies, (ne.). Üres pSK vektorral vakon transzfektált sejteket alkalmaztunk kontrollként. Három nappal a transzfektálás után a 40 sejteket rögzítettük 80% acetont és 20% metanolt tartalmazó oldattal 4 °C-on 20 percen keresztül. A

-37fertözőképesség és vírusreplikáció bizonyítékát PCV1 és PCV2-I DNS-klónokkal transzfektált sejtekben közvetett ímmunfluoreszcens vizsgálati eljárással (IFA) igazoltuk PCV1 ORF2 kapszid-gén elleni monoklonális ellenanyag alkalmazásával, amely Dr. G. M. Allan ajándéka volt [G. M. Allan és mtsai., „Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus”, Vet. Immunol. 5 Immunopathol. 43, 357-371. old. (1994)]. A rögzített sejteket megmostuk foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS), és 1:20 arányban meghígított PCVI monoklonális ellenanyaggal inkubáltuk 37 °C-on 1 órán keresztül. A sejteket azután három alkalommal megmostuk PBS-pufferrel, és inkubáltuk fluoreszcein-izotíocianáttal (FITC) jelzett kecske anti-egér-immunglobulin-G-vel (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md) 37 °C-on 45 percen keresztül. A PBS-pufferrel végzett háromszori mosása után a lemezeket jhioromount-G reagenssel 10 borítottuk, lefedtük fedölemezzel, és megvizsgáltuk fluoreszcens mikroszkóp alatt. A PCV2-vel és a kiméra PCV 1-2 DNS-klónnal transzfektált sejtek fertözöképességét IFA-val igazoltuk PCV2-re specifikus ellenanyag alkalmazásával, amint a 4. példában bemutattuk.

A PCVI, a kiméra PCV 1-2 DNS és a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónok fertözöképességét PK-15 sejtek transzfektálásával bizonyítottuk. A teljes PCVI genom két azonos példányát ligáltuk tandem a pSK 15 vektorba, előállítva a PCVI DNS-klónt (6. ábra). A kiméra PCV 1-2 DNS-klónban a PCVI ORF2 kapszid-génje helyettesítve van a patogén PCV2-ével a nem-patogén PCVI genom gerincén. A reciprok kiméra PCV2-1 DNSklónban a PCV2 ORF2 kapszid-génje helyettesítve van a nem-patogén PCVI-ével a patogén PCV2 genom gerincén. Ha fertőző in vitro, a kiméra PCVI-2 DNS-klón termeli a PCV2 ORF2 kapszid-antigénjét, és a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klón termeli a PCVI ORF2 kapszid-antigent a transzfektált PK-15 sejtekben. Az 20 eredmények azt mutatták, hogy a PCVI, a kiméra PCV 1-2 és a reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónok mindegyike meglepő módon fertőzőnek mutatkozott, amikor transzferáltuk PK-15 sejtekbe, és expresszálták a megfelelő virális kapszid-antigéneket, amint demonstráltuk a PCVI-re vagy PCV2-re specifikus ellenanyagokat alkalmazó IFA-val. A PCVI ORF2 elleni monoklonális ellenanyagokat és a PCV2 elleni ellenanyagokat alkalmazó IFA igazolta, hogy a PCVI DNS és a PCV 1-2 DNS-klónok fertözöek. A PCVI ORF2-re specifikus 25 monoklonális ellenanyagot alkalmazó IFA azt mutatta, hogy a PCV 1-2 kiméra DNS-klón szintén fertőző volt. A transzfektált PK-15 sejtek körülbelül 10-20%-a pozitív volt a kapszid-antigénre és a PCV2 antigénre, és expresszált PCVI ORF2 antigént a transzfektált sejtek sejtmagjában (7. ábra).

15. példa

Sertések kísérleti oltása PCVI, PCV2, kiméra PCV 1-2 és reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónokkal

A kiméra DNS-klónok immunogenitásának és patogénitásának értékelésére negyven 4-6 hetes specifikus patogén-mentes (SPF) sertést véletlenszerűen szétosztottunk öt, egyenként 8-8 állatot tartalmazó csoportba. Az oltást megelőzően az állatokat teszteltük PCV, PTTSV, PPV és sertés hepatitisz E vírus elleni ellenanyagokra. Ezenfelül oltás előtti szérummintákat teszteltünk PCR-rel PCVI és PCV2 nukleinsavra, hogy igazoljuk azt, hogy a sertések nem fertőzöttek természetes úton egyik vírussal sem. A PCVI, PCV2, PCV1-2 és PCV2-1 DNS-klónok mindegyikét a klónozott plazmid-DNS közvetlen injektálásával oltottuk be a sertések felszíni csípői nyirokcsomójába. Az 1. csoportban található sertések foszfát-pufferelt sóoldatot (PBS-puffer) kaptak, és negatív kontrolként szolgáltak. A 2. csoportban található sertések mindegyikét a felszíni csípői nyirokcsomóba oltottuk 200 pg fertőző PCVI DNS-klónnal. A 3. csoportban található sertések mindegyikét 200 pg fertőző PCV2 DNS-klónnal oltottuk be. A 4. csoportban található sertések mindegyike 200 pg fertőző kiméra

SCSI

-38 _?25 '

PCV 1-2 DNS-klón oltását kapta. Az 5. csoportban található sertések mindegyike 200 gg fertőző reciprok kiméra PCV2-1 DNS-klónt kapott. Mindegyik állatot naponta megfigyeltük a betegség klinikai tüneteire. Szérummintát gyűjtöttünk minden egyes állattól a -2., 7., 14., 21., 28., 35., 42. és 49. oltás után napon (DPI). A 21. oltás utáni napon minden csoportból négy véletlenszerűen kiválasztott állatot felboncoltunk. Az egyes csoportokban 5 megmaradó négy állatot a 49. oltás utáni napon boncoltuk fel. Különféle szöveteket és szerveket gyűjtöttünk a boncolás folyamán, amint korábban ismertettük a 7. példában, és feldolgoztuk azokat hisztológiai vizsgálathoz.

Megvizsgáltuk a PCVl, PCV2 és kiméra fertőző DNS-klónok immunogenitását a sertésekben. A -2. (0.), 7., 14., 21., 28., 35., 42. és 49. oltás utáni napokon a kontroll és oltott állatoktól levett szérummintákat elemeztük PCVl, PCV2, PCV1-2 és PCV2-1 virémiára a klón-speciflkus DNS-szekvenciák PCR-es 10 detektálásával, anti-PCVl ellenanyagra IFA-val és anti-PCV2 ORF2 ellenanyagra ELISA-val. Az oltást megelőzően a -2. napon mind az öt csoport állatait egyaránt negatívnak teszteltük PCR-rel PCVl és PCV2 DNSre.

A negatív kontroll állatok egyaránt negatívak voltak PCVl és PCV2 virémiára a vizsgálat folyamán (lásd az alábbi 7. táblázatot). Az oltatlan kontroll csoportban öt sertésben volt detektálható anyai PCV2 15 ellenanyag a -2. napon, és két sertésben volt detektálható anyai PCVl ellenanyag a 7. oltás utáni napon (lásd az alábbi 8. táblázatot). A PCV l és PCV2 elleni anyai ellenanyagok eltűntek ezekből a malacokból a 21. oltás utáni napra. Nem detektáltunk szerokon verziót sem PCVl-re, sem PCV2-re a 8 oltatlan kontroll sertés egyikében sem a vizsgálat folyamán.

A PCVl-el oltott csoportban először a 7. oltás utáni napon detektáltunk virémiát (7. táblázat), és 20 utoljára a 35. oltás utáni napon. A PCVl fertőző DNS-klónnal oltott 8 állat közül 5 volt pozitív PCVl virémiára. A folyamatos PCVl virémia átlagos hossza 0,625 hét volt. A 21. oltás utáni napra a PCVl-el oltott csoport mindegyik állata szerokon vert ált PCVl-re, és pozitív maradt PCVl elleni ellenanyagra a vizsgálat végéig, a 49. oltás utáni napig.

A PCV2 DNS-klónról kimutattuk, hogy fertőző sertésekben. A PCV2 DNS-klónnal oltott csoportban 25 először a 7. oltás utáni napon detektáltunk virémiát (7. táblázat). A 21. oltás utáni napra a 3. csoport összes PCV2-vel oltott állata pozitív volt PCV2 virémiára. A PCV2 virémia átlagos hossza 2,12 hét volt. A PCV2-vel oltott csoportban két sertésben volt detektálható szintű anyai PCV2 ellenanyag a 7. oltás utáni napon (8. táblázat), és az anyai ellenanyag elfogyott a két malacban a 14. napra. A PCV2-re történő szerokonverziót — PCV2-re specifikus ELISA-val detektálva — először a 35. oltás utáni napon detektáltuk. A 42. oltás utáni napra 30 az összes PCV2 fertőző DNS-klónnal oltott sertés szerokonvertált PCV2-re.

A PCV2-1 kiméra fertőző DNS-klónnal oltott 4. csoportban található sertésekben először a 14. oltás utáni napon detektáltunk a kiméra vírusra specifikus virémiát (7. táblázat). A hét oltott állat közül négy virémiás lett PCVI-2-re a 14. és 42. oltás utáni nap között. A kiméra PCVI-2 virémia átlagos hossza 1 hét volt. Egy sertésben volt detektálható anyai PCV2 ellenanyag a 7, és 14. oltás utáni napon, de az anyai ellenanyag elfogyott 35 a 21. oltás utáni napra (8. táblázat). A PCV2 ORF2-re specifikus ellenanyagra történő szerokonverzió először a 28. oltás utáni napon következett be. A 49. oltás utáni napra az összes kiméra PCV 1-2 fertőző DNS-klónnal oltott sertés szerokonvertált PCV2 ORF2-re specifikus ellenanyagra.

A reciprok kiméra PCV2-1 kiónnal oltott sertésekben nem detektáltunk PCV2-1 kiméra vírusra specifikus virális DNS-t a szérummimákban (7. táblázat). Azonban a 21. oltás utáni napra az 5. csoport összes 40 állata szerokonvertált PCVl ellenanyagra. Az egyes csoportokból kiválasztott sertésekből származó amplifíkált

-39PCR-terrnékeket megszekvenáitunk, és igazoltuk, hogy azok autentikusak a megfelelő fertőző kiónokra, amelyeket az egyes csoportok oltására alkalmaztunk.

7, Táblázat. Virérnia detektálása oltott és kontroll sertések szérumában beágyazott PCR alkalmazásával
Csoport	Oltóanyag	DPI	Összes
-2	7	14	21	28	35	42	49
1	PBS’	0/8b	0/8	0/8	0/8	0/4	0/4	0/4	0/4	0/8
2	PCV1 DNS'	0/8	1/8	1/8	2/8	0/4	2/4	0/4	0/4	5/8
3	PCV2 DNS'	0/8	3/8	6/8	7/8	1/4	2/4	2/4	0/4	8/8
4	PCV 1-2 DNS'	0/7	0/7	1/7	m	2/4	2/4	2/4	0/4	4/7
5	PCV2-1 DNS'	0/8	0/8	0/8	0/8	0/4	0/4	0/4	0/4	0/8

Foszfát-pufferelt sóoldat (PBS) negatív kontrollként alkalmazva ^b 8 sertés mindegyik csoportban, pozitívok száma / teszteltek száma ' Klónozott genomiálís PCV vagy kiméra PCV DNS pSK plazmidban

182537 3

C*) r> (*ϊ L/l CM CO ri

16. példa Klinikai kiértékelés

A sertéseket lemértük a 0. napon és boncolás idején. A végbélben mért testhőmérsékleteket és klinikai légzési értékeket — amely 0 és 6 között változik (0 = normál, 6 = súlyos) [P. G. Halbur és mtsai., „Comparison of the pathogenicity of two U. S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus”, Vet. Pathol. 32, 648-660. old. (1995)] — minden másnap rögzítettük a 0. és 49. nap között. A klinikai tüneteket szintén naponta feljegyeztük, beleértve a központi idegrendszeri betegség, májbetegség (ikterusz), vázizom-rendszeri betegség jeleit, és a test állapotának a változásait. Két személy végezte az összes klinikai kiértékelést.

Egyik kontroll vagy oltott sertés sem mutatta teljesen kifejlődött klinikai PMWS nyilvánvaló tüneteit. Nem voltak különbségek a csoportok között a tömeggyarapodásban vagy az átlagos végbélhőmérsékletben. A PCVl-2-vel oltott 3. csoportba tartozó egyik sertés elpusztult az oltás utáni 3. napon. A boncolás és klinikai értékelés után nem detektáltunk patogén ágenst, és a halál nem volt kapcsolatos az oltási eljárással vagy a kiméra PCVl-2 vírussal.

17. példa Makroszkopikus patológia és hisztopatológia

Minden csoportból négy sertést felboncoltunk a 21. és 49. oltás utáni napon. A boncoló csoport nem ismerte a sertések fertőzöttségi állapotát a boncoláskor. Komplett boncolást végeztünk minden sertésen. Minden sertés esetében feljegyeztük a szemmel látható tüdögyuiladásos tüdő becsült százalékát egy korábban leírt értékelési rendszer alapján (P. G. Halbur és mtsai., 1995, mint fent). Más sérüléseket — mint például a nyirokcsomók megnagyobbodását — külön feljegyeztünk. Metszeteket vettünk hisztopatológiai elemzéshez a orrjáratból, tüdőkből (hét metszet)(ugyanott), szívből, agyból, nyirokcsomókból (tracheobronchíális, csípő, mezenterikus, szubinguinális), mandulából, csecsemőmirigyből, májból, epehólyagból, lépböl, ízületekből, vékonybélből, vastagbélből, hasnyálmirigyből és veséből. A szöveteket vak vizsgálattal vizsgáltuk meg, és a tüdő, nyirokcsomó és máj sérüléseinek szubjektív értékelését végeztük el, amint a 7. példában leírtuk. A tüdöértékek O-tól (normális) 3-ig (súlyos limfohisztolitikus interstíciális tüdőgyulladás) változtak. A májértékek O-tól (normális) 3-ig (súlyos limfohisztolitikus hepatitisz) változtak. A nyirokcsomó-értékek a follikulusok limfoid depléciójának becsült értékén alapultak 0 (normális vagy nincs limfoid depléció) és 3 (súlyos limfoid depléció vagy a follikulusok hisztiocitikus helettesítése) között.

A PCVl, PCV2 kiméra PCVl-2 és reciprok kiméra PCV2-1 fertőző DNS-klónok sertésekben való patogenitásának meghatározásához először a makroszkopikus sérüléseket vizsgáltuk meg. Az eredményeket az alábbi 9. táblázatban mutatjuk be. Az oltatlan 1. kontroll csoportból származó állatok nyirokcsomói normálisak voltak a 21. és 49. oltás utáni napon ís. A négy oltott csoportból származó sertéseknek különböző mértékű, csak a nyirokcsomókra korlátozódó makroszkopikus sérülései voltak. A PCVl-el oltott 2. csoportban található sertésekben a nyirokcsomók nagyjából normálisak voltak a 21. oltás utáni napon, azonban enyhe-közepes duzzadást és elszíneződést detektáltunk a 49. oltás utáni napon. A 3. csoportban található PCV2-vel oltott mindegyik sertésnek a normálisnak 2-5-szörösére megnagyobbodott nyirokcsomói voltak, amelyek kemények es bamas színűek voltak a 21. és 49. oltás utáni napon egyaránt. A kiméra PCVl-2-vel oltott állatok nyirokcsomói enyhe-közepes mértékben duzzadtak és elszínezÖdöttek voltak a 21, és 49, oltás utáni napon is 7

-42közül 5 sertésben. Az 5. csoportban található, PCV2-1 klónnal oltott sertésekben 8 közül 1 állatban enyhe duzzadás és elszíneződés volt a nyirokcsomókban a 21. oltás utáni napon. A kiméra PCV1-2 kiónnal oltott sertésekben a nyirokcsomók makroszkopikus sérüléseinek az átlagos értékei nem különböztek statisztikailag az l., 2. és 5, csoportokétól, de statisztikailag különböztek a patogén PCV2-vel oltott 3. csoportbeli sertésektől, a 5 21. és 49. oltás utáni napon egyaránt. Az átlagos makroszkopikus limfoid értékek a 49. oltás utáni napon nem különböztek statisztikailag egymástól a PCV1, PCV2 és PCV 1-2 klónokkal oltott álaltokban, de statisztikailag különböztek az 1. és 5. csoport átlagos makroszkopikus sérülés-értékeitől.

Ez követően megvizsgáltuk a mikroszkopikus sérüléseket. Az eredményeket az alábbi 10. táblázatban mutatjuk be. Nem detektáltunk mikroszkopikus sérüléseket sem az oltatlan 1, kontroll csoportban, sem a 10 PCV 1-el oltott 2. csoportban egyik oltás utáni napon sem. Enyhe-közepes peribronchioláris limfoplazmacítikus és hisztiocitikus bronchointerstíciális tüdőgyulladásként jellemzett mikroszkopikus tüdősérüléseket figyeltünk meg 8 közül 1 PCV2-vel oltott sertésben. Nem figyeltünk meg mikroszkopikus sérüléseket a tüdőkben a PCV12-vel és PCV2-l-el oltott állatokban. Nem figyeltünk meg sérüléseket egyik oltott sertés csecsemőmirigyében sem. Enyhe multifokális limfoplazmacítikus miokarditiszt figyeltünk meg 8 közül 2 sertésben a PCV2-vel oltott 15 csoportban, A PCVl-2-vei és PCV2-l-el oltott állatok szívszövetei mentesek voltak mikroszkopikus sérülésektől. Enyhe multifokális limfoplazmacítikus interstíciális nefritiszt figyeltünk meg 8 közül 4 sertésben a PCV2-vel oltott csoportban, 7 közül 2 PCVl-2-vel oltott sertésben, és 8 közül 1 PCV2-l-el oltott sertésben. Enyhe-közepes limfoid depléciót és follikulusok hisztiocitikus helyettesítését figyeltük meg 8 közül 5 sertés mandulájában, 8 közül 3 sertés lépőben és 8 közül 8 sertés nyirokcsomóiban a PCV2-vel oltott csoportban. A 20 kiméra PCV]-2-vel oltott állatokban enyhe limfoid depléciót és follikulusok hisztiocitikus helyettesítését figyeltük meg 7 közül 2 sertés nyirokcsomóiban, de nem detektáltuk ezt sem a lépben, sem a mandulában. Nem figyeltünk meg limfoid depléciót és follikulusok hisztiocitikus helyettesítését a reciprok kiméra PCV2-l-el oltott állatok nyirokcsomóiban, lépőben vagy mandulájában. Enyhe-közepes limfoplazmacítikus hepatitiszt figyeltünk meg 8 közül 7 PCV2-vel oltott sertés esetében. Enyhe-közepes limfoplazmacítikus hepatitiszt 25 figyeltünk meg 7 közül 2 kiméra PCVl-2-vel oltott sertés esetében. Nem figyeltünk meg limfoplazmacítikus hepatitiszt a reciprok kiméra PCV2-l-e! oltott sertésekben. A többi szövet sérülései jelentéktelenek voltak.

A tüdő, máj és nyirokcsomók mikroszkopikus sérüléseit publikált értékelési rendszer alapján értékeltük (P. G. Halbur és mtsai., 1995, mint fent). Az eredményeket az alábbi 10. táblázatban mutatjuk be. A kiméra PCVl-2-vel oltott 4. csoportbeli sertésekből származó nyirokcsomókban lévő sérülések átlagos értékei 30 hasonlítottak a 1„ 2. és 5. csoportéihoz, de statisztikailag különböztek a patogén PCV2-vel oltott 3. csoportbeli sertésektől, a 21. és 49. oltás utáni napon egyaránt. A kiméra PCVl-2-vel oltott csoportból származó átlagos mikroszkopikus májsérülés értékek a 21, oltás utáni napon statisztikailag különböztek a PCV2-vel oltott 3. csoportbeli állatokétól, de hasonlítottak az 1., 2, és 5, csoportbeli sertésekéhez a 21. oltás utáni napon. A 49. oltás utáni napon a 4. csoportbeli, kiméra PCV 1-2-vel oltott sertések átlagos mikroszkopikus májsérülés értékei 35 nem különböztek statisztikailag az 1., 2., 3. és 5. csoportba tartozó sertésekétől. Nem volt elfogadott értékelési rendszer a többi szövet vagy szerv esetében.

-439. Táblázat. Nyirokcsomók makroszkopikus sérülései a kontroll és oltott sertésekben

Csoport	Oltóanyag’	DPIb
21	49
1	PBS	0/4 (0,0)	0/4 (0,0)
2	PCV1 DNS	0/4 (0,0)	4/4(1,5)
3	PCV2 DNS	4/4 (2,5)	4/4 (2,25)
4	PCV 1-2 DNS	2/3 (0,66)	3/4(1,25)
5	PCV2-1 DNS	1/4(0,25)	0/4 (0,0)

³ Foszfát-puffereit sóoldat (PBS) negatív kontrollként alkalmazva. Az oltóanyagok pSK piazmidba klónozott genomiális PCV vagy kiméra PCV DNS voltak.

^b Minden csoportból négy sertést felboncoltunk a 21. oltás utáni napon, és a megmaradt négy sertést a 49. oltás utáni napon boncoltuk fel; pozitívak száma / teszteltek száma.

Sérültek száma / teszteltek száma (a nyirokcsomó-megnagyobbodás súlyosságának becsült értéke)

1825 37 3 δ

-A

Μ r*. m LA η w »4

Szív

0/4

o

Tt o

3? Φ

2

δ

δ

δ

0/4

φ

ο

__

>

v

£

Ζ

*5

u

öO

ΤΓ

^Τ

τΓ

’tJ'

^>

δ

N

<

o

δ

δ

δ

Ο

δ

ο

δ

δ

ω

^cz

ez

CU

O

3

2

,<υ

Φ

3 ez

_o

Ό

CD E

73 _Ű

Ε Lzi

JZ 3

δ

rn ez

!φ N ez *O

SO a. éz U

0/4

δ

o

o

δ

δ

δ

ο

δ

0/4

vagy

Έ c o X

üT íj ClO N

OJ CL CJ N :O

N Ο Φ c

PCV

3 o ex Rí

íO Xí δ

Φ

δ íd

:Q

&}

ÍZ

3

ez

o

-C

:3

HM

r

'S3

ez

X X

ε

eim

c 'CÖ

3 Cd

δ

3 OJ

qj (Λ Ό £

*o g o

0/4

o

o

δ

δ

δ

δ

δ

φ

0/4

o c V

3 rZ »C0

Έ E)

y? ÍJ a

J/T

ez

0Ό

‘O

o

ÜJ ez

o

E

o

*o

N 30

'Cd 3

'Z

o

Φ

Φ

U

N

Tt

ez

O

*—·

C

c«

CM

3

O

S3

ÍZ

ΪΞ

N

o'

'CD

Ό

o

Λ

E

tí

•4—»

-X

1

g

a •Ü

d·

Tf·

^Τ

X> Ό

o ez

4J

td

CD E

C

o

δ

δ

o

γ*Ί

δ

δ

δ

ο

ο

Q

bS

E

a o

aj tZ

I

Φ

N‘

'4J

ÍJ

;Φ

X cd eZ

a a

C 6

,C

a -C

5 12

E ez _o ÍJ

X ό E o

o

o

o

o

δ

δ

δ ΓΏ

(Μ

ο

ο

lg pSK

E cd £ ölj íj

ÍJ vT

c o ez

a o “Ö δ Ό

X

IZ CJ

o

o

δ

o'

—

δ

θ'

δ

θ'

E

sd

'Cd

E

cj tZ

X o

ΤΓ

*T

it

ς^“

’τί'

c Rí

cd

g

£

o

'U o

o

δ

δ

©

if

rr

—

δ

δ

“2

<z ‘ŰJ

o c:

c o

ej X

u Ό tZ

Z

0 Z1

C Q

δ*

c o'

o

Έ

c

a

Λί hV

Λ;

‘oh 12 Q

Ό

o

o

o

VÁ

?

Í? Γ4

δ

(ο1

azva

g s

E Ό =O

'Q E Ό

.Έ :p

E

o'

o'

δ

δ

ο

ο'

θ'

δ

φ

£

Έ

'«*

E

Q. q

s

5

'-t

τ^-

Γ*Ί

Tj-

Jg

ÍZ

g

£

Ή

o

o

δ

δ

'Φ

---_

—

—

δ

δ

03

1S

«

*cd

ez

o

'5b

50

'5b

♦3

S

-o

12

<

^-1^,

ir^K

‘U

CN

o

o

o

«

SO *o

co o'

o^ o'

o δ

<o o'

Φλ Ο*

•ζτ Γ1 ί“ι.

φ^ ο

ο δ

Ο δ

0,0

olll

a

E tz

E <z

E .tz

N

3

it

Tf

re

3

3

LE íZ

le <z

2 ez

S

o

o

o

δ

δ

δ

φ

Φ

δ

O

O

O

O

'3

Έ

OD

0Λ

ö£l

t-

Q

cd

cd

cd

K

·

___

-

Φ

rS

o

s

'Cd

S-

O'

ο

»

Φ

__

φ

__

φ

on áj

cd

cd

cd

Q

rs

<N

γί

ΓΜ

ΓΊ

't

c

tÜJ

E

£

E

sd

'Cd

CC

ez

N

N

N

CŰ tx

t o

tZ

tz ,Χ

cZ X

ez

o

üj

o

ΕΛ

ΕΛ

nj

üB 'OÍ

τ

73

7>

π

CC

V)

ζ

ζ

$3

E

E

ÖŰ 03

Z a

Ζ Q

ο ΓΜ

Ű

SÓOi

c Έ

ez O

ez a> ^—>

ez 2

3 Cd

ο

A

-ÍZ

-D

Λ

íd

cd

'Φ

ΐΛ

>

>

>

o

E

£

E

g

CC

u

Ο

υ

υ

,ϊί

o p

’Λ

'Cd

'Λ

o

X

X

X

a.

0-

uff

o tz

tz

N ez

N ez

Q.

O

,x

X

cd

01

E

íS

3 iV

>·

>

φ a

N ez

-Ö 3

’n

E

E

o ez o

—

rq

cp

»r>

'Fo

is

Φ X

o íX

o X

Χί

18. példa Szerológia

Vért gyűjtöttünk mindegyik sertéstől a -2,, 7., 14., 21., 28., 35., 42. és 49. oltás utáni napokon, A

PRRSV elleni szérutn-ellenanyagokat Herd Check PRRSV EUSA alkalmazásával vizsgáltuk (IDEXX 5 Laboratories, Westbrook, MA). A PPV elleni szérum-ellenanyagokat hemagglutinin-gátlási (Hl) vizsgálati eljárással detektáltuk [H. S. Joo és mtsai., „A standardized haem agglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody”, Aust. Vet. J, 52, 422-424.old. (1976)]. A PCV2 elleniszérum-ellenanyagokat módosított közvetett ELISA alkalmazásával detektáltuk, amely a PCV2 rekombináns ORF2 kapszid-fehérjéjén alapul, amint fent ismertettük [lásd még P. Nawagitgul és mtsai,, „Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based 10 and recombinant capsid protein (ORF2) -based ELISA for the detection of antibodies to PCV”, Immunol Clin.

Diagn. Lab. Immunol. I, 33-40. old. (2002)]. A PCV1 elleni szérum-ellenanyagokat közvetetett immun fluoreszcens vizsgálati eljárással (IFA) detektáltuk. PCV 1-el megfertőzött PK-15 sejtek sejteket tenyésztettünk 8-méröhelyes LabTek kamrás lemezeken. Amikor a fertőzött PK-15 sejtek elérték a körülbelül 95-100% konfluenciát, a megfertőzött sejteket rögzítettük 80% acetont és 20% metanolt tartalmazó oldattal 4 15 °C-on 20 percen keresztül A rögzített sejteket megmostuk egyszer PBS-pufferrel 100 pl, PBS-ben 1:10 arányban meghígított sertésszérum-min Iákat adtunk a kamrákba, és inkubáltuk I órán keresztül 37 °C-on. A sejteket azután megmostuk három alkalommal PBS-seí, és inkubáltuk 45 percen keresztül 37 °C-on FITC-cel jelzett kecske anti-sertés másodlagos ellenanyaggal. A lemezeket azután három alkalommal megmostuk PBS-sel, fluoromount-G reagenssel borítottuk, lefedtük fedő le ni ezzel, és megvizsgáltuk fluoreszcens mikroszkóp alatt. A 20 pozitív kontroll sejtek esetében a PCVl-el fertőzött sejteket hígított PCV 1-specifikus rnonoklonálís ellenanyaggal (Dr. G. M. Allan ajándéka) inkubáltuk, majd inkubáltuk FiTC-cel jelzett kecske anti-egér IgG-vel (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md). A negatív kontrolihoz PCVl-el fertőzött sejteket inkubáltunk 1:10 arányban meghígított, PCVl és PCV2 ellenanyagtól mentes sertés szérummal, majd FITC-cel jelzett kecske anti-sertés-lgG-vei inkubáltuk (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md).

19. példa

PCR-es detektálás

A PCVl, PCV2, kiméra PCV 1-2 és reciprok kiméra PCV2-1 virérnia beoltott sertések szérumában való detektálására különböző oltás utáni napokon gyűjtött szerűm mintákat teszteltünk PCR-rel. A virális DNS-t 100 30 μΙ szérummintából extraháltuk DNAzol reagens alkalmazásával a gyártó protokollja szerint (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Az extrahált DNS-t újra felszuszpendákuk DNáz-, RNáz- és proteináz-mentes vízben. A PCVl, PCV2, kiméra PCVI-2 és reciprok kiméra PCV2-1 klónspecifikus genomiális szekvenciáinak amplífikálásához két készlet beágyazott PC R-lánc indító-párt terveztünk (6. táblázat, fent). A beágyazott láncindítók első készletét publikált PCVl szekvenciák alapján terveztük. A Gen.PCVl (20. azonosítószámú 35 szekvencia) és Orf.PCVl (19. azonosítószámú szekvencia) láncindítók egy 400 bp hosszúságú fragmenst amplifikáltak a PCVl genom jelenlétében. A nested.Gen.PCVl (22. azonosító számú szekvencia) és nested.Orf.PCVl (21, azonosítószámú szekvencia) beágyazott láncindítók egy 220 bp hosszúságú fragmenst amplifikáltak.

124659-14095 LT/An

-46Α PCV2 virémia detektálásához a Gen.PCV2 (24. azonosítószámú szekvencia) és Orf.PCV2 (23. azonosítószámú szekvencia) PCV2 láncindítók egy 900 bp hosszúságú fragmenst amplifikáltak PCV2 jelenlétében a PCR első menetében. A nested.Gen.PCV2 (26. azonosítószámú szekvencia) és nested.Orf.PCV2 (25. azonosítószámú szekvencia) láncindítók egy 600 bp hosszúságú fragmenst amplifikáltak a beágyazott PCR5 ben.

A kiméra PCV1-2 virémia detektáláshoz a PCR-reakció első menetében a PCV 1-specifikus Gen.PCVl (20. azonosítószámú szekvencia) és a PCV2 OR F2-specifikus Orf.PCV2 (23. azonosító számú szekvencia) lánc indítókat alkalmaztuk egy 580 bp hosszúságú kiméra fragmens amplifikáiására. A beágyazott PCR-hez a PCV 1-specifikus nested.Gen.PCVl (22. azonosítószámú szekvencia) és a PCV2 ORF2-specifikus 10 nested.Orf.PCV2 (25. azonosító számú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 370 bp hosszúságú kiméra fragmens amplifikáiására.

A reciprok kiméra PCV2-1 virémia detektáláshoz a PCR-reakció első menetében a PCV2-specifikus Gen.PCV2 (24. azonosítószámú szekvencia) és a PCV1 ORF2-specifikus Orf.PCVl (19. azonosítószámú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 700 bp hosszúságú kiméra fragmens amplifikáiására. A beágyazott 15 PCR-hez a PCV2-specifikus nested.Gen.PCV2 (26, azonosítószámú szekvencia) és a PCV1 ORF2-specifikus nested.Orf.PCVi (21. azonosítószámú szekvencia) láncindítókat alkalmaztuk egy 460 bp hosszúságú kiméra fragmens amplására. Az összes PCR-paraméter lényegében azonos volt, 38 ciklus denaturálás 94 °C-on 1 percen keresztül, aneHálás 45 °C-on 1 percen keresztül és lánchosszabbítás 72 ^DC-on 1,5 percen keresztül. A negatív kontroll sertésekből származó szérummintákat PCR-RFLP diagnosztikai vizsgálati eljárással teszteltük, amely 20 képes detektálni és megkülönböztetni a PCVl-et és PCV2-t, amint korábban leírták [M. Fenaux és mtsai., „Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with post weaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCRrestriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2”, J. Clin. Microbiol. 38, 2494-2503. old. (2000)]. Az egyes csoportokból kiválasztott állatok PCR25 termékeit megszekvenáltuk, hogy igazoljuk a sertéseket megfertőző vírus eredetét.

20. példa

Immunhisztokémia (IHC)

A PCV2-re specifikus antigén IHC detektálását a 21. és 49. oltás utáni napon felboncolt sertésekből 30 gyűjtött nyirokcsomó-szöveteken hajtottuk végre. PCV2 elleni nyúl poliklonális antiszérumot alkalmaztuk az IHC-ben, korábban leírt általános eljárások szerint [S. D. Sorden és mtsai., „Development of a polyclonalantibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin- fixed, paraffm-embeddedtissue”, J. Vet. Diagn. Invest. 11, 528-530. old. (1999)].

A PCV2-re specifikus antigén IHC-festődése alapján az oltatlan kontroliból, PCVl-e! és PCV2-1-el 35 oltott sertésekből származó limfoid szövetek negatívak voltak PCV2 antigénre. PCV2 antigént detektáltunk a PCV2-vel oltott csoportban 8 közül 7 állat limfoid szöveteiben. Szintén detektáltunk PCV2 antigént a kiméra PCV 1-2-vel oltott csoport 7 sertése közül 1 limfoid szövetében.

A fentiekben a találmány előnyös megvalósítási módjainak a részletes leírását mutattuk be szemléltetésként, és nem korlátozó szándékkal. Egyértelmű, hogy az ezen a kitanításon alapuló szakember 40 számára nyilvánvaló mindenmás módosítás, eltérés és ekvivalens a találmány igényel oltalmi körébe tartozik.

Claims (25)

1. Rekombináns 1-es típusú sertés cirkovírus, amely 2-es típusú sertés cirkovírus 2-es nyílt leolvasási

5 fázis (ORF2) kapszidfehérjét kódol (PCVl-2), ahol a rekombináns PCVl patogén PCV2 ORF2 kapszidgénjét tartalmazza a PCVl nukleinsav-molekula ORF2 kapszidgénje helyett.

2. Az 1. igénypont szerinti PCVl-2 vírus, ahol a PCVl-2 vírus a SEQ ID NO: 2. nukleotidszekvenciával legalább 95%-ban homológ nukleotid-szekvenciából áll.

3. A 2. igénypont szerinti PCV1-2 vírus, ahol a PCV1-2 vírus a SEQ 1D NO: 2. szerinti nukleotid-

10 szekvenciából vagy komplementeréből áll.

4. Az 1. igénypont szerinti PCVl-2 vírus, ahol a PCVl-2 vírus inaktivált.

5. Vakcina, amely 4. igénypont szerinti inaktivált PCV1-2 vírust tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti vakcina, amely továbbá adjuvánst is tartalmaz.

7. Az 5. igénypont szerinti vakcina, amely továbbá szuszpendálószert is tartalmaz.

15

8. Az 5. igénypont szerinti vakcina, amely továbbá legalább egy további sertés antigént is tartalmaz.

9. A 8. igénypont szerinti vakcina, ahol a további sertés antigén fertőző sertés ágens.

10. Az 5. igénypont szerinti vakcina, ahol az inaktivált PCV1-2 vírus fiziológiásán elfogadható hordozóban vagy oldószerrendszerben van felszuszpendálva.

11. Az 5. igénypont szerinti vakcina, amely továbbá tartósítószert is tartalmaz.

20

12. Az 5-11. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, sertés PCV2 fertőzés vagy PCV2 által okozott elválasztás utáni multiszisztémás sorvadás szindróma (PMWS) elleni immunizálására történő alkalmazásra.

13. A 12. igénypont szerinti vakcina alkalmazásra, amely alkalmazás magában foglalja a vakcina egy dózisban vagy ismételt dózisokban történő beadását.

14. A 13. igénypont szerinti vakcina alkalmazásra, amely magában foglalja a vakcina egy dózisban

25 történő beadását.

15. A 12. igénypont szerinti vakcina alkalmazásra, amely magában foglalja a vakcina intranazális, transzdermális vagy parenterális beadását.

16. A 15. igénypont szerinti vakcina alkalmazásra, ahol a parenterálisan beadott vakcina intramuszkulárisan, intravénásán, intraperitoneálisan vagy intradermálisan van beadva.

30

17. A 16. igénypont szerinti vakcina alkalmazásra, amely magában foglalja a vakcina intramuszkuláris beadását.

18. Eljárás az 5-11. igénypontok bármelyike szerinti vakcina előállítására, amely magában foglalja a következő lépéseket:

(a) a PCVl genomjában az ORF2 gén helyettesítését az PCV2 ORF2 génjével, fertőző kiméra PCVl-2 35 nukleinsav-molekulát állítva elő;

(b) sejtek megfertőzését az (a) lépésbeli fertőző kiméra nukleinsav-molekulával, a PCV2 ORF2 kapszidfehérjét expresszáló rekombináns PCVl-2 vírust hozva létre; és (c) a (b) lépésbeli élő rekombináns PCVl-2 vírus inaktiválását.

Λ ft «Síi Μ

124659-14095 LT/AN

SZTNH-100285003

19. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol a (c) lépés az élő rekombináns PCVl-2 vírus inaktiválószerrel történő inaktiválását foglalja magában.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja szuszpendálószer, emulgeálószer, adjuváns, legalább egy további sertés antigén, vagy ezek kombinációjának a hozzáadását is.

5

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, ahol a további sertés antigén fertőző sertés ágens.

22. Eljárás az 5-11. igénypontok bármelyike szerinti vakcina előállítására, amely magában foglalja a következő lépéseket:

(a) sejtek megfertőzését sertés cirkovírus (PCVl-2) fertőző kiméra nukleinsav-molekulával, amely olyan nem-patogén PCVl-et kódoló nukleinsav-molekulát tartalmaz, amely patogén PCV2 ORF2 génjét 10 tartalmazza a PCV1 nukleinsav-molekula ORF2 génje helyett, PCV2 ORF2 kapszidfehérjét expresszáló élő rekombináns PC V1 -2 vírust állítva elő; és (b) az (a) lépésbeli élő rekombináns PCVl-2 vírus inaktiválását.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a (b) lépés az élő rekombináns PCVl-2 vírus inaktiválószerrel történő inaktiválását foglalja magában.

15

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, amely továbbá magában foglalja szuszpendálószer, emulgeálószer, adjuváns, legalább egy további sertés antigén, vagy ezek kombinációjának a hozzáadását is.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, ahol a további sertés antigén fertőző sertés ágens.