HU220611B1

HU220611B1 - Nukleozidok foszfolipidszármazékai, ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények és az előállításukra szolgáló eljárások

Info

Publication number: HU220611B1
Application number: HU9300468A
Authority: HU
Inventors: Dieter Herrmann; Herbert Leinert; Alfred Mertens; Harald Zilch
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1990-08-20
Filing date: 1991-08-14
Publication date: 2002-03-28
Also published as: JP3032576B2; ZA916542B; RU2104282C1; KR930701470A; MX9100676A; JPH06500543A; TW207544B; NZ239422A; HUT62910A; HU9300468D0; RO115163B1; CZ287942B6; CZ18093A3; KR970011307B1

Abstract

A találmány tárgyát nukleozidok új, (I) általános képletű foszfolipid-származékai, ezek tautomerjei és fiziológiásan elviselhető sóiképezik, mely képletben R1 jelentése egyenes vagy elágazó láncú,telített vagy telítetlen 8–15 szénatomos szénhidrogénlánc; R2jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen 8–15szénatomos szénhidrogénlánc; R3 jelentése hidrogénatom vagyhidroxilcsoport; R4 és R5 jelentése hidrogénatom vagy közülük az egyikhalogénatomot, hidroxilcsoportot vagy azidocsoportot jelent, és ezentúlmenően R3 és R4 egy további kötést jelenthet a C–2’ és C–3’szénatomok között; n jelentése 0, 1 vagy 2; B jelentése (1–4)általános képletű csoport, ahol R6 hidrogénatom vagy 1–4 szénatomosalkilcsoport; R7, R8 és R9 jelentése hidrogénatom; és R10 jelentéseaminocsoport, mely adott esetben (1–6 szénatomos alkil)-fenil-(1–6szénatomos)-alkil-csoporttal helyettesített. A találmány a fentivegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre és mindezekelőállítására is vonatkozik. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát nukleozidok új foszfolipidszármazékai, ezek tautomerjei, továbbá fiziológiai szempontból elviselhető szervetlen vagy szerves savakkal vagy bázisokkal képzett sói, és ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint mindezek előállítási eljárása képezi.

A nukleozidok ezen új foszfolipid-származékait az I általános képlet szemlélteti, melyben Rj jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen 8-15 szénatomos szénhidrogénlánc;

R₂ jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen 8-15 szénatomos szénhidrogénlánc;

R₃ jelentése hidrogénatom vagy szénhidrogénlánc;

R₄ és R₅ jelentése hidrogénatom vagy közülük az egyik halogénatomot, hidroxilcsoportot vagy azidocsoportot jelent, és ezen túlmenően R₃ és R₄ egy további kötést jelenthet a C-2’ és C-3’ szénatomok között;

n jelentése 0,1 vagy 2;

B jelentése 1-4 általános képletű csoportok valamelyikét jelenti, mely képletekben R₆ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

R₇ jelentése hidrogénatom;

R_g jelentése hidrogénatom;

Ríj jelentése hidrogénatom; és

R₁₀ jelentése aminocsoport, mely adott esetben (1-6 szénatomos alkil)-fenil-(l -6 szénatomos)-alkil-csoport helyettesítőt hordozhat.

Minthogy az 1 általános képletű vegyületek aszimmetriás szénatomokat tartalmaznak, ezen vegyületek valamennyi optikailag aktív formája és ezek racém elegyei is a jelen találmány tárgyát képezik.

A J. Bioi. Chem., 265, 6112 (1990) irodalmi helyen le van írva bizonyos liponukleotidok előállítása és alkalmazásuk vírusellenes gyógyszerként. Ezen a helyen azonban csak ismert nukleozidokhoz, mint például az AZT-hez és a DDC-hez kapcsolt és a zsírsavszerkezeti részben dimirisztoil-foszfatidil- és dipalmitoil-foszfatidil-maradékkal rendelkező liponukleotidok vizsgálata és szintetizálása került ismertetésre.

A J. Med. Chem., 33, 1380 (1990) irodalmi helyen tioéter-lipideknek citidin-difoszfáttal való nukleozidkonjugátumait ismertetik, melyeknek tumorellenes hatásuk van és így az onkológia területén találhatnak alkalmazást.

A Chem. Pharm. Bull, 36, 209 (1988) irodalmi helyen leukémiaellenes aktivitással rendelkező 5’-(3-SNfoszfatidilj-nukleozidok vannak leírva és ezek előállítása enzimatikus szintézissel történik a megfelelő nukleozidokból és foszfokolinokból kiindulva, transzferázaktivitással rendelkező foszfolipáz-D jelenlétében.

Liponukleotidoknak enzimatikus szintézisét ismertetik egyebek között a Tetrahedron Lett., 28, 199 (1987) és a Chem. Pharm. Bull, 36, 5020 (1988) irodalmi helyeken.

A jelen találmány szerinti vegyületek ugyancsak értékes farmakológiai tulajdonságokat mutatnak. így különösen alkalmasak olyan fertőzések gyógyítására és megelőzésére, melyeket DNS-vírusok, mint például a Herpes simplex-vírus, a Cytomegalovírus, a Papovavírusok, a Varicella zoster-vírus vagy az Epstein-Barrvírus, vagy pedig RNS-vírusok, így a Togavírusok, de különösen a retrovírusok, így a HTLV-I és -II Onkovírusok, a Visna lenti vírusok, valamint a HIV-1 és -2 emberi immunhiány-vírus (Humanes-Immunschwáche-Vírus) okoz(nak).

Különösen alkalmasnak látszanak az I általános képletű vegyületek a retrovirális HIV-fertőzések klinikai manifesztációinak kezelésére embereknél, így a tartósan fennálló és generalizált lymphadenopathiának (nyirokcsomó-megbetegedés, PGL), az előrehaladott stádiumban levő AIDS-rokon komplexumnak (ARC) és az AIDS teljes klinikai tünetképeinek kezelésére.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az I általános képletű vegyületek a DNS-, illetve az RNS-vírusok szaporodását a vírusspecifikus DNS-, illetőleg RNS-transzkripció fokozatában gátolják. Az anyagok a reverz transzkriptáz enzim gátlása útján befolyásolni képesek a retrovírusok szaporodását (lásd Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1911, 1986, illetve Natúré, 325, 773, 1987). Terápiás szempontból különös érdekessége van a HIVvírusra gyakorolt gátlóhatásnak, ez a vírus az AIDSnéven ismert immunhiány-megbetegedés kórokozója. Az AIDS kezelésére ma még csak a 3’-azido-3’-dezoxi-timidin (DE-A-3608606) van engedélyezve AIDS-ben szenvedő betegeknél. Mégis a 3’-azido-3’dezoxi-timidinnek toxikus mellékhatásai vannak a csontvelőre, ami a kezelt betegek 50%-ánál vérátömlesztéseket tesz szükségessé. Az I általános képletű vegyületeknek ilyen hátrányos tulajdonságuk nincs, vírusellenes hatásukat anélkül fejtik ki, hogy farmakológiai értelemben releváns dózisokban citotoxikus hatásuk lenne.

A jelen találmány szerinti vegyületeket és az ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítményeket másféle gyógyszerhatóanyagokkal kombinálva is lehet használni a fentiekben megnevezett fertőzések kezelésére és megelőzésére. Az ilyen további gyógyszereket tartalmazó készítményekre, melyek HIV-fertőzések kezelésére vagy megelőzésére, vagy a nevezett betegséget kísérő megbetegedések kezelésére és megelőzésére szolgálnak, példaképpen az alábbiakat nevezzük meg: 3’-azido-3’-dezoxi-timidin, 2’,3’-didezoxi-nukleozidok, mint például a 2’,3’-didezoxi-citidin, a 2’,3’-didezoxiadenozin és a 2’,3’-didezoxi-inozin, továbbá aciklikus nukleozidok (például Acyclovir), interferonok, mint például az A-interferon, renális kiválasztásgátlók, mint például a Probenicid, még továbbá a nukleozidtranszport-inhibitorok, így például a Dipyridamol, valamint az immunmodulátorok, így például az Interleukin II, vagy pedig a stimuláló faktorok, így például a granulocita/makrofág kolóniastimuláló faktor. A jelen találmány szerinti vegyületeket és az egyéb gyógyszerhatóanyagokat beadhatjuk egyenként és egyidejűleg, vagy adott esetben egy vagy két különálló formulázásban, vagy pedig különböző időpontokban.

Az I általános képletű vegyületek lehetséges sóiként mindenekelőtt a foszfátcsoport alkálifém-, alkáliföldfém- és ammóniumsói jönnek tekintetbe. Az alkálifémsók közül a lítium-, a nátrium- és a káliumsók elő2

HU 220 611 Β1 nyösek. Alkáli földfémekkel képezett sóként főleg a magnézium- és a kalciumsók jönnek tekintetbe. Ammóniumsóként a találmány szerinti sók között olyanokat értünk, melyek ammóniumiont tartalmaznak, amely legfeljebb négyszeresen 1-4 szénatomos alkilcsoporttal és/vagy aralkilcsoporttal, előnyösen benzilcsoporttal helyettesítve lehet. Emellett a helyettesítők azonosak vagy egymástól eltérőek lehetnek.

Az I általános képletű vegyületek tartalmazhatnak bázisos csoportokat, különösen aminocsoportokat, melyeket erre alkalmas savakkal, savaddíciós sókká alakíthatunk át. Erre a célra a következő savak jönnek tekintetbe: sósav, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, fümársav, borostyánkősav, borkősav, citromsav, tejsav, maleinsav és metánszulfonsav.

Az I általános képletben R, előnyösen egy 10-14 szénatomos egyenes szénláncú alkilcsoportot jelent.

Rí különösen decil-, undecil-, dodecil-, tridecilvagy tetradecilcsoportot jelent.

R₂ előnyösen 10-14 szénatomos egyenes szénláncú alkilcsoportot jelent. R₂ különösen decil-, undecil-, dodecil-, tridecil- vagy tetradecilcsoportot jelent.

R₃ és R₄ előnyösen egy-egy hidrogénatomot jelent vagy a két szimbólum közül az egyik előnyösen hidroxilcsoportot vagy azidocsoportot vagy egy halogénatomot, így fluor-, klór-, bróm- vagy jódatomot jelent.

Különösen előnyösek azok a vegyületek, melyekben R₃ és R₄ hidrogénatomot jelentenek, míg R₅ azidocsoport vagy fluoratom, illetve R₅ hidrogénatom és egyúttal R₃/R₄ egy további kötést jelent a C-2’ és a C-3’ szénatomok között.

Az I általános képletű vegyületekben lévő B szimbólummal jelzett bázisokban az R₆ helyettesítő jelentése előnyösen hidrogénatom, metil-, etil-, propil- vagy butilcsoport. Különösen előnyös, ha R₆ hidrogénatomot, metil- vagy etilcsoportot és R₇ hidrogénatomot jelent.

R₁₀ előnyösen aminocsoportot jelent, ami egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált lehet valamilyen (1-6 szénatomos alkil)-fenil-( 1 -6 szénatomos)-alkilcsoporttal, ahol az alkilcsoport előnyösen metil-, etil-, propil- vagy butilcsoport lehet.

Az oltalmi igényben szereplő I általános képletű liponukleotidokban a kapcsolódó nukleozidok előnyös képviselőit az alábbiakban soroljuk fel :

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-3 ’-azido-uridin

-2’,3 ’-didezoxi-inozin

-2 ’ ,3 ’ -didezoxi-citidin

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-adenozin

-3’-dezoxi-timidin

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-2 ’,3 ’-didehidro-N⁶-(o-metil-benzil)adenozin

-3 ’-dezoxi-3 ’-fluor-timidin

-2’,3 ’-didezoxi-3 ’-fluor-adenozin

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-2 ’ ,3 ’-didehidro-citidin

-3 ’-dezoxi-2 ’,3 ’-didehidro-timidin

-3 ’-dezoxi-3 ’ -azido-timidin.

Az I általános képletű vegyületeket úgy állíthatjuk elő, hogy

a) valamely II általános képletű vegyületet, ahol R_bR₂ és n a megadott jelentésű, egy III általános képletű vegyülettel, melyben

R₃’jelentése hidrogénatom vagy szakember számára jól ismert oxigénatom-védő csoporttal védett hidroxilcsoport, míg

R₄’ és R₅’ egy-egy hidrogénatom vagy egyikük oxigénatom-védő csoporttal védett hidroxilcsoport, halogénatom vagy azidocsoport, vagy R₄’ és R_s’ közül az egyik szakember számára jól ismert oxigénatom-védő csoporttal védett hidroxilcsoportot jelent, vagy R₃’ és R₄’ együtt egy további kötést képvisel, és

B a már megadott jelentésű, foszfor-triklorid-oxid vagy valamilyen foszforsav-észter és egy tercier nitrogénbázis, mint például piridin vagy trietil-amin jelenlétében egy inért oldószerben, mint például toluolban reagáltatunk, és a bekövetkezett hidrolízis után adott esetben a nukleozidkémiában szokásos eljárásoknak megfelelően a védőcsoportot lehasítjuk, vagy

b) valamely IV általános képletű vegyületet, ahol R_b

R₂ és n a fentiekben megnevezett jelentésű, egy III általános képletű vegyülettel, melyben R₃’, R₄’, R₅’ és B jelentése a már megadott jelentésű, foszfolipáz-D jelenlétében valamilyen inért oldószerben, így például kloroformban, továbbá egy alkalmas puffer jelenlétében reagáltatunk, és a végbement reakció után adott esetben a nukleozidkémiában szokásos eljárásoknak megfelelően az oxigénatom védőcsoportját lehasítjuk.

A II általános képletű vegyületek és a IV általános képletű vegyületek előállítását a Lipids, 22, 947 (1987) irodalmi helyen és a DE-A-3039629 számú közrebocsátást iratban ismertetik.

A III általános képletű vegyületek előállítását például az EP-A 0 286 028 és WO 90/08147 számú közrebocsátási iratokban írják le.

Az I általános képletű vegyületekhez hasonló vegyületeket ismertet az EP-A-0350287 számú közrebocsátási irat, de ebben csak glicerin-1,2-diészterek vannak leírva.

Azokat a gyógyszerkészítményeket, melyek vírusfertőzések kezelésére szolgálnak és I általános képletű vegyületeket tartalmaznak, folyékony vagy szilárd alakban enterálisan vagy parenterálisan alkalmazhatjuk. Itt a szokásos beadási formák, így például a tabletták, a kapszulák, a drazsék, a szirupok, az oldatok vagy a szuszpenziók jönnek tekintetbe. Injekciós közegként előnyösen vizet alkalmazunk, amely az injekciós oldatoknál szokásos segédanyagokat, így stabilizálószereket, oldásközvetítőket és puffereket tartalmaz. Ilyen jellegű segédanyagok például a tartarátpuffer és a citrátpuffer, az etanol, a komplexképzők, így az etilén-diamin-tetraecetsav és ennek nem toxikus sói, a nagy molekulatömegű polimerek, így a folyékony poli(etilénoxid), a viszkozitás szabályozása céljából. Az injekciós oldatok számára szükséges folyékony hordozóanyagoknak sterilnek kell lenniök és azokat előnyösen ampullákba töltjük le. A szilárd hordozóanyagok közül példaképpen a keményítőféleségeket, a laktózt, a mannitot, a

HU 220 611 Bl metil-cellulózt, a talkumot, a nagy diszperzitású kovasavféleségeket, a magasabb molekulatömegű zsírsavakat, így a sztearinsavat, továbbá a zselatint, az agaragart, a kalcium-foszfátot, a magnézium-sztearátot, az állati és a növényi zsírokat, valamint a nagy molekulatömegű szilárd polimereket, így a polietilénglikolokat stb. említjük meg. Az orális beadásra alkalmas készítmények kívánt esetben ízjavító anyagokat vagy édesítőszereket is tartalmazhatnak.

Az adagolás különféle tényezőktől, így az alkalmazás módjától, a kezelt egyed fajtájától, annak életkorától és egyéni állapotától függhet. A találmány szerinti vegyületeket szokásosan naponta és testtömegkilogrammonként 0,1-100 mg, előnyösen 0,2-80 mg mennyiségben alkalmazzuk. Előnyös, ha ezt a napi dózist 2-5 részadagra felosztjuk, mimellett minden egyes beadáskor 1-2 tablettát adunk be, 0,5-500 mg hatóanyagtartalommal. Ezek a tabletták retardáltak (azaz késleltetett felszívódásúak) is lehetnek, miáltal a beadások száma napi 1-3 alkalomra csökken. A retardált tablettákban a hatóanyag-tartalom 2-1000 mg közötti lehet. A hatóanyag beadása tartós infúzióval is lehetséges, amikor is normális körülmények között napi 5-1000 mg elegendő.

A jelen találmány értelmében a példákban név szerint megnevezett, valamint a szabadalmi igénypontokban a szubsztituensek kombinált értelemben vett jelentésével jellemzett valamennyi vegyületen túlmenően, előnyösen az alábbiakban felsorolt I általános képletű vegyületek jönnek tekintetbe:

1. (3’-dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-szulfinil-2-decil-oxi)-propil-észter

2. (3’-dezoxi-3’-azido-timidin)-5’-foszforsav-(3-dodecil-szulfonil-2-decil-oxi)-propil-észter

3. (2’,3’-didezoxi-citidin)-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

4. (2’,3’-didezoxi-inozin)-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

5. (2’,3’-didezoxi-adenozin)-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

6. (3’-dezoxi-timidin)-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

7. (3 ’-dezoxi-2 ’,3 ’-didehidro-timidin)-5 ’-foszforsav(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

8. (3 ’-dezoxi-3 ’-fluor-timidin)-5 ’-foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

9. [2 ’,3 ’-didezoxi-2 ’ ,3 ’-didehidro-N⁶-(o-metil-benzil)-adenozin]-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto2-decil-oxi)-propil-észter

10. (2’,3’-didezoxi-2’,3’-didehidro-citidin)-5’-foszforsav-(3-decil-merkapto-2-dodecil-oxi)-propilészter

11. (2 ’ ,3 ’-didezoxi-3 ’ -fluor-adenozin)-5 ’-foszforsav(3-undecil-merkapto-2-dodecil-oxi)-propil-észter

12. (2’,3’-didezoxi-3’-azido-uridin)-5’-foszforsav-(3decil-szulfonil-2-dodecil-oxi)-propil-észter

13. (2’,3’-didezoxi-citidin)-5’-foszforsav-(3-decil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

14. (2 ’ ,3 ’-didezoxi-inozin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-dodecil-oxi)-propil-észter

15. (3’ -dezoxi-3 ’ -azido-timidin)-5 ’ -foszforsav-(3-tetradecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

16. (3’ -dezoxi-3 ’ - azido-timidin)-5 ’ -foszforsav-(3 -pentadecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

17. (2 ’ ,3 ’-didezoxi-inozin)-5 ’-foszforsav-(3-tridecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

18. (2 ’ ,3 ’-didezoxi-inozin)-5 ’ -foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-oktil-oxi)-propil-észter.

1. a) példa (3 '-Dezoxi-3 '-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter ml abszolút éterben feloldunk 1,25 g (3 mmol)

3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi-l-propanolt és 1,2 ml (8,6 mmol) trietil-amint, majd az oldathoz nitrogénatmoszféra alatt, 0 °C hőmérsékleten hozzácsepegtetünk 0,42 ml (4,5 mmol) foszfor-triklorid-oxidot (POC1₃). Az elegyet 45 percig tovább keveijük, majd hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, és ezt követően 15 ml abszolút éter és 20 ml abszolút toluol elegyében oldva 800 mg (3 mmol) 3’-dezoxi-3’-azido-timidint (AZT) adunk hozzá cseppenként. A reakcióelegyet ezután 6 órán át keverés és visszafolyatás közben forraljuk (DC-kontroll).

Lehűlés után az elegyhez 50 ml vizet adunk, majd az egészet 2 órán át erőteljesen keveijük, ezt követően a szerves fázist elválasztjuk, nátrium-szulfát felett szárítjuk és forgó bepárlóberendezésben bepároljuk. A maradékot „Kieselgel 60” szilikagélen végzett preparatív oszlopkromatografálásnak vetjük alá tisztítás végett. Eluálószerként diklór-metán-metanol (9:1) elegyet használunk. A kitermelés 540 mg (az elméletinek 24%-a). Olvadáspont =187 °C (zsugorodás), 220-223 °C (barnás elszíneződés közben bomlás), ³¹P-NMR=0,59 ppm.

1. b) példa (3 ’-Dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter A Chem. Pharm. Bull, 36, 5020 (1988) irodalmi fonásműben levő előírással analóg módon 2 mmol AZT-t és 5000 egységnyi (U) foszfolipáz D-t felszuszpendálunk 4 ml nátrium-acetát-puffer-kalcium-klorid elegyben, ehhez hozzáadunk 160 ml kloroformban oldott 6 mmol 3-dodecil-merkapto-2-decil-oxipropil-l-foszforsav-monokolin-észtert, és az egész elegyet 8 órán át 45 °C hőmérsékletre melegítjük. Ezután nátrium-szulfát felett szárítjuk, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A kapott maradékot az 1. a) példában leírt módon oszlopkromatografálással tisztítjuk. A kitermelés 51 %-os. A tennék azonosnak bizonyult az 1. a) példa termékével (olvadáspont, DC, Ή- és ³¹P-NMR).

2. példa (3 ’-Dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3undecil-merkapto-2-undecil-oxi)-propil-észter A fent nevezett vegyületet az 1. a) példában leírtakkal analóg módon állítjuk elő, 27%-os kitermeléssel. Olvadáspont=218-222 °C (bomlás).

HU 220 611 Bl

3. példa [2 ’,3 ’-Didezoxi-2 ’,3 ’-didehidro-N⁶-(o-metil-benzil)-adenozin]-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto2-decil-oxi)-propil-észter ml abszolút piridinben levő 680 mg (1,37 mmol) foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propilésztert 337 mg (1 mmol) 2’,3’-didezoxi-2’,3’-didehidro-N⁶-(o-metil-benzil)-adenozinnal elegyítünk, majd ehhez 1,37 g (6,7 mmol) DCC-t adunk, és az egészet 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük (DCkontroll). Ezután a piridint vákuumban eltávolítjuk, a kapott maradékot éterben szuszpendáljuk, és az oldatlan karbamidot szűréssel elkülönítjük. Ezt követően a szűrletből az oldószert elpárologtatjuk, majd a kapott anyagot „Kieselgel 60”-on végzett oszlopkromatografálással tisztítjuk, melynek során eluálószerként diklór-metán-metanol (95:5) elegyet használunk. A kitermelés 220 mg (az elméletire számítva 26%-os), R_f=0,68 [metilén-diklorid-metanol-víz (13:5:0,8) eleggyel],

4. példa (3 '-Dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 '-foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

A 3. példában leírtakkal analóg módon 350 ml abszolút piridinben 13,5 g foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észterből, 5,4 g AZT-ből és 27 g DCC-ből 30 órán át tartó és szobahőmérsékleten történő keveréssel, továbbá a fentiekben leírt módon végzett tisztítással előállítjuk a megfelelő liponukleotidot. A kitermelés 62%-os [az analitikai adatok azonosak az 1. a) példában megadottakkal].

5. példa (3 ’-Dezoxi-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter

A 3. példában leírtakkal analóg módon 40 ml abszolút piridinben levő 1,3 g foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észterből, 500 mg 3’-dezoxi-timidinból és 2,6 g DCC-ből kiindulva szobahőmérsékleten végzett 24 órás keveréssel és ezt követő kromatográfiás tisztítással megkapjuk a megfelelő liponukleotidot. A kitermelés 51%-os. R_f=0,45 [metilén-diklorid-metanol-víz (12:5:0,8) elegy].

6. példa (2 ',3 ’-Didezoxi-inozin)-5 ’-foszforsav-(3-dodeciT merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter ml abszolút piridinben levő 1,3 g foszforsav-(3dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észterből, 500 mg 2’,3’-didezoxi-inozinból és 2,6 g DCC-ből kiindulva a 3. példával analóg módon történő eljárással szobahőmérsékleten végzett 40 órás keverés és kromatográfiás tisztítás után 61%-os kitermeléssel állítjuk elő a nevezett liponukleotidot. R_f=0,38 [metilén-diklorid-metanol-víz (13:5:0,8) eleggyel],

A fenti példákban foglalt szintézis-előírások szerint állítottuk elő az előzőekben előnyösként felsorolt vegyületeket is. Ezek közül egyesek vizsgálati eredményeit tartalmazza az alábbi 1. táblázat.

1. táblázat

A vegyülctszám jelzése	Olvadáspont °C	R_rérték	³¹P-NMR
1.	170-715, bomlik	0,57*
2.	228-230, bomlik	0,64*	1,63 ppm
3.	202-205, bomlik	0,55*	3,69 ppm
4.	300 felett, bomlik	0,49*
6.	hab	0,46*
8.	hab	0,66**	-0,71 ppm
9.	hab	0,53*
15 .	155-156	0,29***

DC-futtatószer: * izopropanol/butil-acetát/víz 10/6/4 ** diklór-metán/metanol/víz 6,5/2,5/0,4 *** etil-acetát/metanol 3/1

Az R_rértékek meghatározásánál az álló fázis minden esetben 20 χ 20 cm-es, F₂₅₄ fluoreszcens indikátortartalmú Merck 60 szilikagéllel bevont lemez volt (gyártó: Merck KG, Darmstadt, Németo., Type Silica Gél 60 F₂₅₄, katalógusszám: 105 715).

7. példa

Timidin-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-deciloxi)-propil-észter

A 3. példában leírtakkal analóg módon 3,6 g foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észtert, 2,6 g timidint és 13 g DCC-t reagáltatunk 190 ml piridinben 20 °C-on 24 órán át, mialatt keverjük a reakcióelegyet. A terméket a 3. példában leírtak szerint izoláljuk. A cím szerinti terméket 21% kitermeléssel kapjuk hab formájában.

R_f=0,15 (etil-acetát/metanol=3:1).

Farmakológiai vizsgálatok

Kísérleti protokoll

Az alábbiakban leírt kísérletekben a találmány szerinti A-E jelű vegyületeket hasonlítottuk össze az AZT-vel és a technika állásában legközelebb álló G jelű vegyülettel [lásd EP-A 0 350 287 irat és Hostetler et al.: J. Bioi. Chem., 265, (1990)] hatékonyságban és toxicitásban. Néhány más, szerkezetileg eltérő, találmány szerinti éter-lipid-AZT konjugátumot is teszteltünk in vitro és in vivő, hogy információkat kapjunk az in vitro eredmények alapján az in vivő becslésre. Az alábbi 2. táblázatban felsorolt vegyületeket vizsgáltuk, ahol -X-R] az I általános képletben megfelel -S(O)_nR]-nek, -Y-R₂ megfelel -O-R₂-nek, és a nukleozidmaradék megfelel az la általános képletnek.

HU 220 611 Β1

2. táblázat

Vegyület	-X-R,	-y-r₂	Nukleozid
A	-SC_I2H₂₅	O-C₁₀H₂₁	AZT
B	-SOC₁₂H₂₅	-O-C₁₀H₂₁	AZT
C	-SO₂C\|₂H₂5	-O-C₁₀H₂₁	AZT
D	-SC_hH₂₃	-O-C₁₀H₂₃	AZT
E	-SC₁₂H_2J	-O-C₁₀H₂₁	FLT
G (EP-A 0350287)	-CO₂-Ci₅H₃₁	-CO₂-C₎₅H₃₁	AZT

AZT=3 ’ -azido-3 ’-dczoxi-timidin FLT=3 ’ -dezoxi-3 ’ -fluor-timidin

MÓDSZEREK

HIV-ellenes aktivitás vizsgálata in vitro MT2 sejtvonalon

A nem fertőzött sejteket különböző koncentrációkban inkubáltuk a tesztvegyületekkel három párhuzamos kísérletben. Két órával a HÍV-1 fertőzés után a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. A vírusinokulumot eltávolítottuk. A sejteket ezután komplett tápközegben 2xl0⁵ sejt/ml koncentrációban reszuszpendáltuk. Ebből a sejtszuszpenzióból 100 μΐ-t három párhuzamos próbában tovább inkubáltunk olyan komplett tápközegben, amely a tesztvegyületeket tartalmazta. 7 nappal a fertőzés után az MT2-sejtek életképességét, ami a vírusindukált citopátiás hatás mérésére alkalmas, MTT-tetrazólium festési módszerrel határoztuk meg. Ebből meghatároztuk a tesztvegyületek 50%-os gátló koncentrációját, azaz az IC₅₀-et.

CFU- GM-assay

CFU-GM vizsgálatokat végeztünk Seidl és Krejal által leírtak szerint (Seidl H. J. és Krejal L.: Blut, 47, 139-145,1983). Balb/c egerekből nyert csontvelősejteket (1 χ 10⁵ sejt/ml) Iscove-féle kiegészített tápközegben tenyésztettünk, amely 0,8% metil-cellulózt, 20% lószérumot, 10 ⁴ M α-tioglicerint és optimális térfogatú (12,5 vagy 25 μΐ) endotoxinnal aktivált egérszérumot tartalmazott, melyet állatonként 50 pg endotoxint (Salmonella abortus equi; Sigma, Deisenhofen, Németo.) iv. injekcióban kapott Balb/c egerekből gyűjtöttünk 4 órával az injekció beadása után. Hatnapos inkubálás után a kolóniákat (telepeket) megfestettük 2(p-jód-fenil)-3-(p-nitro-fenil)-5-fenil-tetrazólium-klorid-hidráttal (INT, Sigma) 24 órán át, majd egy automata képfeldolgozó processzorral (Artek 982 B, Biosys GmbH, Karben, Németo.) megszámoltuk azokat. Ebből meghatároztuk az 50%-os toxikus koncentrációt, a TC₅₀-et.

In vivő Friend-vírus leukémia (FVL) modell

Nőnemű, 7-9 hetes Balb/c egereket (melyek az Iffa Credótól származtak, Belgium) a vizsgálat 0. napján beoltottunk állatonként 0,2 ml 1:10 hígítású (PBS-sel) leukémiát okozó Friend-vírussal, és ip. kezeltünk a +3. naptól kezdve a +13. napig naponta a vizsgálandó vegyületekkel (dózistartomány: 12,5-50 mg/kg/nap) vagy a placebóval (PBS). Kísérletenként 10 állatot használtunk (n=10). A +14. napon az állatokat leöltük. A +13. napon, azaz a terápia befejezése után nyolc különböző hematológiai paramétert vizsgáltunk meg rutin alapon. Az állatok leölése után a lépüket megmértük és/vagy ezeknek az FLV-fertőzött Balb/c egereknek a plazmájában az RT-aktivitást meghatároztuk. A normál, nem fertőzött és nem kezelt Balb/c egerek léptömege normálisan 0,1-0,2 g. Normál esetben nincs RTaktivitás az ilyen állatokban.

EREDMÉNYEK

In vitro eredmények

3. táblázat

HIV-ellenes aktivitás (MT2-assay)

Vegyület	MT2-IC_s0 [μΜ]
Kontroll I (PBS)	-
AZT	0,056
A	0,4
B	2,6
C	3,2
D	0,7
E	0,33
G	>11,1
Kontroll II (PBS)	-

A 3. táblázatból látható, hogy az igényelt A-E vegyületek nagyobb HIV-ellenes aktivitással rendelkeznek, mint a legközelebbi technika állását képviselő G vegyület.

4. táblázat

HIV-ellenes aktivitás (MT2-assay), csontvelő-toxicitás (CFU-GM-assay) és szelektivitási indexek

Vegyü- let	MT2-IC_S0 [μΜ]	CFU-GM-TC₅₀ [μΜ]	CFU-GM TC₅₀
MT2 IC₅₀
AZT	0,056	0,71	12,6
A	0,4	>130,2	>325,5
G	>11,1	1,25	<0,11

A 4. táblázat bemutatja a HIV-ellenes aktivitást (MT2-assay), a csontvelőőssejt-toxicitást (CFU-GMassay) és a szelektivitási indexeket az AZT-re, A és G jelű vegyületre in vitro. Az eredményekből látható, hogy az A vegyület sokkal magasabb szelektivitási indexszel rendelkezik, mint az AZT és a G jelű vegyület, ha a HIV-ellenes aktivitást egy releváns toxieitási rendszerre, azaz granulocita/makrofág őssejtek kolóniaképzésére vonatkoztatjuk. Az A vegyületnek ez a többi vegyülethez viszonyított magas szelektivitása jobb anti-HIV hatására és/vagy csökkent sejttoxieitására vezethető vissza. Az A vegyület ebben a CFU-GM rendszerben semmiféle toxieitást nem mutatott a legmagasabb vizsgált koncentrációban, azaz 100 pg/ml-ben (130,2 μΜ)

HU 220 611 Bl sem. Előnyösen az A vegyületnek legalább 2959-szer magasabb a G vegyülethez viszonyított differenciál szelekti vitási indexe.

5. táblázat:

Az igényelt AZT- és FLT-konjugátumok hatékonysága FVL modellben

Vegyület	Lép tömege (g)	Trombociták (χ10⁵/μ1)
Kontroll (PBS)	1,774	206
AZT	1,834	201
A	0,538	568
B	0,612	649
C	1,032	419
D	0,354	629
E	0,145	403
G	1,677	215
Kontroll II (PBS)	1,995	282

Az 5. táblázatban az átlagos léptömegeket és trombocitaszámot adjuk meg. A léptömegek a Friend-vírussal történt fertőzés utáni +14. napon összhangban vannak a virémiával és egy könnyen mérhető paramétert jelentenek. Az összes eddig vizsgált tesztben azt találtuk, hogy a perifériás vérben a trombociták száma nagyon kényelmesen mérhető, és szintén a betegség egyik paramétere, ami durván egyenes arányban áll a léptömeggel, illetve a virémiával. Az 5. táblázat azt mutatja, hogy az igényelt AZT- és FLT-konjugátumok aktívok a Friend-vírus-leukémia modellben, és még hatékonyabbak, mint a technika állásából ismert AZT vagy G jelű vegyület.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) általános képletű vegyületek, mely képletben R, jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen 8-15 szénatomos szénhidrogénlánc;

R₂ jelentése egyenes vagy elágazó láncú, telített vagy telítetlen 8-15 szénatomos szénhidrogénlánc;

R₃ jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport;

R4 és R₅ jelentése hidrogénatom vagy közülük az egyik halogénatomot, hidroxilcsoportot vagy azidocsoportot jelent, és ezen túlmenően R₃ és R₄ egy további kötést jelenthet a C-2’ és C-3’ szénatomok között;

n jelentése 0,1 vagy 2;

B jelentése (1-4) általános képletű csoport, mely képletekben

R₆ hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

R₇ jelentése hidrogénatom;

R₈ jelentése hidrogénatom;

R₉ jelentése hidrogénatom; és

R₁₀ jelentése aminocsoport, mely adott esetben (1-6 szénatomos alkil)-fenil-(l-6 szénatomos)-alkil-csoport helyettesítőt hordozhat, továbbá ezen vegyületek tautomerjei, valamint fiziológiai szempontból elviselhető szervetlen és szerves savakkal, vagy bázisokkal képzett sói.
2. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, melyekben Rj jelentése 10-14 szénatomos alkilcsoport.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületek, melyekben R₂ jelentése 8-12 szénatomos alkilcsoport.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyületek, melyekben az (la) általános képletű csoport

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-3 ’-azido-uridin,

-2’,3 ’-didezoxi-inozin,

-2’,3 ’-didezoxi-citidin,

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-adenozin,

-3 ’-dezoxi-timidin,

-2’,3’-didezoxi-2’,3’-didehidro-N⁶-(o-metil-benzil)adenozin,

-3 ’-dezoxi-3 ’-fluor-timidin,

-2’ ,3 ’-didezoxi-3 ’-fluor-adenozin,

-2 ’ ,3 ’-didezoxi-2 ’ ,3 ’ -didehidro-citidin,

-3 ’-dezoxi-2 ’,3 ’-didehidro-timidin vagy

-3 ’-dezoxi-3 ’-azido-timidin maradékot jelent.
5. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, ahol Rí dodecilcsoportot, R₂ decilcsoportot és az (la) általános képletű csoport 2’,3’-didezoxi-2’,3’-didehidro-N⁶-(ometil-benzil)-adenozin-, -3 ’-dezoxi-3 ’-azido-timidin, -3’-dezoxi-timidin vagy -2’,3’-didezoxi-inozin-maradékot jelent.
6. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyület, melyet az alábbi csoportból választunk ki:

(3 ’-dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (3’-dezoxi-3’-azido-timidin)-5’-foszforsav-(3-undecil-merkapto-2-undecil-oxi)-propil-észter [2’,3’-didezoxi-2’,3’-didehidro-N⁶-(o-metilbenzil)-adenozin]-5’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto2-decil-oxi)-propil-észter (3 ’-dezoxi-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (2’,3’-didezoxi-inozin)-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (3 ’-dezoxi-2 ’ ,3 ’-didehidro-timidin)-5 ’-foszforsav(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (3 ’-dezoxi-3 ’-fluor-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-decil-oxi)-propil-észter (3’-dezoxi-3’-azido-timidin)-5’-foszforsav-(3-dodecil-szulfinil-2-decil-oxi)-propil-észter (3 ’-dezoxi-3 ’-azido-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-szulfonil-2-decil-oxi)-propil-észter (2’,3’-didezoxi-citidin)-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (2’,3’-didezoxi-inozin)-5’-foszforsav-(3-dodecilmerkapto-2-decil-oxi)-propil-észter (3 ’-dezoxi-timidin)-5 ’-foszforsav-(3-dodecil-merkapto-2-decil-oxi)-propil-észter.
7. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletű vegyületek - a képletben R,, R₂, R₃, R₄, R₅, n és B jelentése az 1. igénypontban megadott - és fiziológiai szempontból elviselhető sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

HU 220 611 Bl

a) valamely (II) általános képletű vegyületet, ahol

R_b R₂ és n jelentése a tárgyi körben megadott, egy (III) általános képletű vegyülettel, melyben

R’₃ jelentése hidrogénatom vagy oxigénatom-védő csoporttal védett hidroxilcsoport, és

R’₄ és R’j jelentése egy-egy hidrogénatom vagy egyikük oxigénatom-védő csoporttal védett hidroxilcsoport, halogénatom vagy azidocsoport, vagy R’₃ és R’₄ együttesen egy további kötést jelent, és

B jelentése a tárgyi körben megadott, foszfor-triklorid-oxid vagy valamely foszforsav-észter és egy tercier nitrogénbázis jelenlétében inért oldószerben reagáltatunk, és adott esetben az oxigénatomot védő csoportot lehasítjuk, vagy

b) valamely (IV) általános képletű vegyületet, ahol

R_b R₂ és n jelentése a tárgyi körben megadott, egy (III) általános képletű vegyülettel, melyben R’₃, R’₄, R’₅ és B jelentése a fenti, foszfolipáz-D jelenlétében inért oldószerben egy alkalmas puffer jelenlétében reagáltatunk, és adott esetben az oxigénatomot védő csoportot lehasítjuk, majd az a) vagy b) eljárás bármelyikével kapott vegyületet kívánt esetben fiziológiai szempontból elviselhető szervetlen vagy szerves savval, vagy bázissal sóvá alakítjuk.
8. A 7. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy tercier bázisként piridint vagy trietil-amint, inért oldószerként toluolt alkalmazunk.
9. A 7. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy inért oldószerként kloroformot alkalmazunk.
10. Gyógyszerkészítmény vírusfertőzések kezelésére, amely legalább egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletű vegyületet, valamint adott esetben egyéb, előzőekkel szinergizmust nem mutató hatóanyagot tartalmaz a szokásos hordozóanyagokkal és egyéb segédanyagokkal együtt.
11. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely további - az (I) általános képletű vegyülettel szinergizmust nem mutató - vírusellenes hatóanyagot tartalmaz.
12. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet adott esetben egyéb - az (I) képletű vegyietekkel szinergizmust nem mutató - hatóanyaggal és a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott hordozó- és egyéb segédanyagokkal együtt gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.